FR2511869A1

FR2511869A1 - Composition pharmaceutique pour le traitement de l'atherosclerose

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Publication number: FR2511869A1
Application number: FR8214732A
Authority: FR
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1981-08-27
Filing date: 1982-08-27
Publication date: 1983-03-04
Also published as: GB2105192A; AU8770282A; DE3232031A1; JPS5865224A; IT1153185B; IT8223020A0; BE894228A

Abstract

NOUVELLE COMPOSITION PHARMACEUTIQUE POUR LE TRAITEMENT DE SUJETS ARTERIOSCLEROTIQUES OU SUSCEPTIBLES DE CONTRACTER CETTE MALADIE, CETTE COMPOSITION ETANT CONSTITUEE PAR UN MELANGE D'AU MOINS DEUX CONSTITUANTS CHOISI DANS UN GROUPE DIFFERENT PARMI LES GROUPES SUIVANTS: INHIBITEUR DE LA TRYPTOPHANE HYDROXYLASE, INHIBITEUR DE LA DECARBOXYLASE PERIPHERIQUE, AGENT DE BLOCAGE DE LA FIXATION DE LA SEROTONINE, AGENT DE BLOCAGE DU STOCKAGE DE LA SEROTONINE, AGENT DE BLOCAGE DES RECEPTEURS DE LA SEROTONINE.

Description

Le schéma le plus généralement accepté (Ross et al. New England Journal

of Medicine, 295, 369-377 et 420-425, 1976 et Friedman et al, Prog Hemostasis and Thrombosis, 4, 249-278, 1978) pour le processus de l'athérogénèse fait intervenir des 5 dommages hémodynamiques, immunologiques ou métaboliques du revê- tement endothélial d'un vaisseau sanguin qui ont pour effet d'ex- poser la couche de muscle lisse sous-jacente aux éléments du sang. Dans ce schéma, les plaquettes en circulation adhèrent à la paroi du vaisseau sanguin endommagée en libérant les granules qu'elles 10 contiennent Ce phénomène apparait comme étant essentiel à l'initia- tion de l'étape suivante du processus athérogénique, qui est la migration des cellules de muscle lisse de la couche médiane du vaisseau sanguin o elles se situent habituellement, dans l'intima artériel (couche interne du vaisseau) et leur prolifération 15 ultérieure Ces cellules de muscle lisse intimal synthétisent une substance extra-cellulaire et bibent des lipides de manière à produire les cellules ayant l'aspect de mousse présentes dans les vaisseaux san- guins athérosclérotiques C'est cette surcroissance des cellules de muscle lisse, simultanément avec l'augmentation de la substance extra- 20 cellulaire et des lipides, qui rétrécit l'ouverture du vaisseau sanguin en compromettant ainsi l'écoulement sanguin et, partant, en provoquant une tendance accrue du sang à coaguler et à obstruer le vaisseau affecté Des mesures pour la prophylaxie et le traite- ment de l'athérogénèse consistaient , dans le passé, à réduire les 25 facteurs de risques de la maladie, par exemple à réduire la pression sanguine chez les sujets hypertensifs, à traiter les diabétiques et à réduire les taux de cholestérol élevés chez les sujets hyper- cholestérolémiques. Etant donné que l'accumulation locale des cellules de 30 muscle lisse dans l'intima artériel est la cause essentielle du développement des lésions athérosclérotiques, l'une des mesures très importantes pour la prophylaxie et le traitement de l'artério- sclérose consiste à supprimer la prolifération des cellules de muscle lisse Les plaquettes sanguines sont les supports probables 35 du messager de la prolifération des cellules de muscle lisse Une fois que le revêtement endothélial du vaisseau sanguin a été endom- magé, les plaquettes tapissent la surface dénudée en libérant les granules qu'elles contiennent dans le réseau sanguin et dans la paroi du vaisseau La sérotonine, le calcium, l'adénosine-triphosphate

2 et l'adénosine-diphosphate sont libérés par les corps denses des plaquettes Les granules alpha des plaquettes libèrent la bêtathromboglobuline, le facteur I Vplaquettaire, le fibrinogène plaquettaire et le facteur de croissance plaquettaire Les fonctions 5 de ces divers composés ne sont pas bien connues, bien qu'il appa- raisse qu'ils sont importants à l'hémostase et au repérage du vaisseau endommagé Le facteur de croissance plaquettaire a été présenté par certains comme étant un mitogène pour les cellules de muscle lisse En raison de la nature dudit facteur de crois- 10 sance, il n'a pas été possible de déterminer le rôle joué par cette molécule dans la stmulation de la prolifération des cellules de muscle lisse in vivo Jusqu'à ce jour, le rôle de la sérotonine plaquettaire dans la stimulation de la prolifération des cellules de muscle lisse, n'est pas connu ou n'a pas été 15 démontré Il a maintenant été trouvé que la sérotonine est un agent activant puissant de la prolifération des muscles lisses dans la culture de cellules et qu'il joue un rôle important en intervenant sur la prolifération des muscles lisses après lésion 20 vasculaire in vivo L'un des objets de la présente invention est d'intervenir sur ce signe biologique de la prolifération des muscles lisses dans l'intima des vaisseaux sanguins de manière à contrôler l'état de l'artériosclérose Cette invention peut en particulier être mise en oeuvre quand l'hypertension, une artério- 25 sclérose existante, la chirurgie vasculaire associée à une proli- fération accélérée des muscles lisses et au risque d'occlusion vasculaire, ou un état diabétique augmentent de manière signifi- cative le risque du développement de l'artériosclérose. Par conséquent, la présente invention consiste dans 30 l'utilisation d'agents, pris isolément ou en combinaison, dans le but d'inhiber l'activité de prolifération des cellules de muscle lisse de la sérotonine dans les vaisseaux sanguins ; de limiter et de s'opposer à la progression de l'artériosclérose résultant de la prolifération des cellules de muscle lisse ; et d'empêcher 35 le développement de la maladie quand il y a un risque élevé de développement de cet état pathologique Plus particulièrement, la présente invention propose une méthode et des compositions pharmaceutiques utiles pour le traitement de l'artériosclérose et pour limiter la progression de l'artériosclérose résultant de la prolifération des cellules de muscle lisse vasculaire.

3 Plus particulièrement encore, la présente invention con- siste en une méthode d'inhibition de la prolifération des cellu- les de muscle lisse au niveau d'un vaisseau sanguin ayant subi une lésion, d'un mammifère ainsi que des compositions pharmaceu- 5 tiques destinées à être mises en oeuvre dans cette méthode, cette dernière consistant à administrer audit mammifère un agent de régulation de la sérotonine, à une dose efficace pour inhiber la prolifération du muscle lisse Le terme "agent" utilisé icienglobe à la fois la notion d'agent simple ou d'agents 10 combinés. Dans le but d'intervenir sur le signe de la prolifération des-:cellules de muscle lisse, diverses méthodes et agents peuvent être utilisés pour réduire l'activité biologique de la sérotonine libérée par les plaquettes dans les vaisseaux sanguins Les métho- 15 des utilisées pour réduire la sérotonine dans les vaisseaux sanguins peuvent englober, considérées isolément ou en combinaison, l'uti- lisation d'un régime maigre ou pauvre en tryptonhane, qui décroît la quantité du précurseur de sérotonine disponible en vue de la transformation en sérotonine, ou l'administration orale, parenté- 20 rale ou par toute autre voie d'un agent ou d'agents qui intervien- nent sur, bloquent, inhibent ou diminuent tout précurseur de la sérotonine ou la sérotonine elle-même dans le sang Le régime et/ ou l'agent ou les agents anti-sérotonine peuvent être utilisés en combinaison avec d'autres médicaments connus ou d'autres trai- 25 tements connus des états artériosclérotiques En général, les types d'antagonistes de la sérotonine appropriés, mis en oeuvre isolément ou en combinaison avec des médicaments anti-plaquettaires, des agents anti-hypertensifs, des techniques d'abaissement du taux de lipides ou d'autres traitements médicaux ou médicaments, englobent, 30 de manière non limitative : les agents de blocage des récepteurs de la sérotonine, les agents de blocage du stockage de la séroto- nine, les agents de blocage de la fixation de la sérotonine, et les agents ou régimes qui inhibent la synthèse de la sérotonine ou qui limitent la disponibilité du précurseur tryptophanique de 35 la sérotonine. L'activité de la sérotonine dans le sang peut être réduite par un régime artificiel, comme indiqué précédemment, régime très pauvre en ou exempt de tryptophane, acide aminé essentiel néces- saire à la synthèse de la sérotonine Ceci peut être réalisé

4 par un régime à base de mais, qui est pauvre en tryptophane, ou par utilisationd'unmélange d'amino-acides artificiel exempt de tryptophane Toutefois, en raison des effets secondaires indé sirables résultant de l'absence d'un acide aminé essentiel, l'uti- 5 lisation d'agents anti-sérotonine est préférée dans le cadre de la présente invention. Un premier groupe d'agents pouvant être utilisés pour inhiber la prolifération des cellules de muscle lisse sont ceux qui entravent la transformation de la tryptophane en sérotonine, 10 en particulier les inhibiteurs de-la tryptophane hydroxylase (par exemple, la p-chloro-phénylalanine) et les inhibiteurs de l'acide aminé aromatique décarboxylase (par exemple, le Carbidopa) La sérotonine est synthétisée dans les cellules en- térochromaffines intestinales et dans le système nerveux central 15 et est fixée par les plaquettes sanguines par l'intermédiaire d'un système de fixation spécifique et stockée dans les organelles plaquettaires connues sous le nom de corps denses La première enzyme et la plus spécifique dans ce processus est la tryptophane hydroxylase Cette enzyme est le composé limitant la vitesse 20 de synthèse de la sérotonine et le blocage de l'activité de cette enzyme provoque la diminution de la quantité de sérotonine produite Les inhibiteurs dela tryptophane hydroxylase, tels que la p-chloro-phénylalanine, réduisent ainsi la quantité de séroto- nine disponible pouvant agir au niveau de la paroi du vaisseau 25 sanguin et être utiles pour le traitement de l'athérosclérose. La seconde enzyme impliquée dans la synthèse de la sérotonine est la 5-hydroxytryptophane décarboxylase Les agents qui bloquent de manière sélective l'activité de cette enzyme diminuent également la production de la sérotonine et sont, de ce fait, utiles 30 dans le traitement de l'athérosclérose Le Carbidopa est un exemple typique de médicament de cette catégorie. Un second groupe d'agents anti-sérotonine qui peuvent être utilisés sont constitués par les agents de blocage de la fixation de la sérotonine, comme par exemple la fluoxétine ou 35 l'amitriptyline,qui empêchent la fixation de la sérotonine par les plaquettes Après synthèse de la sérotonine plaquettaire dans les cellules entérochromaffines intestinales, celle-ci est libérée dans le sang o elle est rapidement amenée dans les plaquettes sanguines par l'intermédiaire d'un système de transport spécifique

5 ou encore elle est dégradée par la mono-amine oxydase, enzyme présente en tous points C'est pourquoi l'inhibition du système de transport de la sérotonine plaquettaire conduit à l'épuisement fonctionnel des réserves de sérotonine plaquettaire et par suite 5 moins de sérotonine est disponible pour agir au niveau de la paroi du vaisseau sanguin Il s'ensuit que les agents de blocage de la fixation de la sérotonine existants, tels que l'amitriptyline (Elavil) ou la fluoxétine, constituent des agents utiles pour la prophylaxie et le traitement de l'artériosclérose. 10 Les agents qui agissent sur le stockage de la sérotonine peuvent également être utilisés pour épuiser les stocks de séro- tonine plaquettaire dans les corps denses La tétrabénazine et les médicaments de la classe de l'alcaloïde Rauwolfia, tels que la réserpine (Serpasil, Raurine, Reserpoid, etc ), agissent 15 sur le stockage de la sérotonine de manière à épuiser efficace- ment la sérotonine contenue dans les plaquettes Il a été cons- taté que la réserpine, utilisée en combinaison avec la méthiothépine, agent de blocage des récepteurs de la sérotonine, peut réduire de manière prononcée la prolifération des muscles lisses, 20 après lésion vasculaire expérimentale. Les agents de blocage des récepteurs de la sérotonine, tels que la méthiothépine, la métergoline, la méthysergide, la cyproheptadine et plus spécialement la pizotyline ( 4-ll-méthyl-4pipéridylidènej-9, 10-dihydro-4 H-benzo l 4,5 l cyclohepta 25 l 1,2-bl thiophène) constituent le groupe préféré utilisé pour agir spécifiquement sur la sérotonine, ce groupe inhibant l'action de prolifération de la sérotonine sur les cellules de muscle lisse Les agents de blocage des récepteurs de la sérotonine constituent la voie 30 d'accès la plus spécifique et la plus efficace pour limiter l'aptitude de la sérotonine libérée par les plaquettes à stimuler la prolifération des cellules de muscle lisse La sérotonine libérée agit au niveau de récepteurs spécifiques présents à la surface des cellules de muscles lisses et cette interaction peut 35 être bloquée par les antagonistes de la sérotonine, tels que ceux mentionnés ci-dessus ainsi que les butyrophénones telles que la spiropéridole et l'halopéridole ; et autres agents tels que la cinansérine et la miansérine La pizotyline et la méthiothépine se sont montrées particulièrement efficaces pour

6 empêcher la prolifération des cellules de muscles lisses après lésionr vasculaire expérimentale. En plus des catégories des antagonistes de la sérotonine citées précédemment, des agents qui agissent comme inhibiteurs de 5 l'activation plaquettaire diminuent l'agrégation plaquettaire et l'adhésion plaquettaire au niveau des parois endommagées d'un vaisseau sanguin, en diminuant ainsi la libération de sérotonine. Des exemples d'agents agissant de cette manière sont : ( 1) les agents qui agissent pour augmenter l'AMP cyclique plaquettaire, 10 soit en favorisant sa synthèse, par exemple la prostacycline ou la prostaglandine E 1 et leurs analogues, soit en diminuant sa dégradation, par exemple les inhibiteurs de la phosphodiestérase, la sulfinepyrazone ou la dipyridamole ; ( 2) les agents qui dimi- nuent la synthèse de la thromboxane A 2 plaquettaire, par exemple 15 les inhibiteurs de la cyclooxygénase tels que l'aspirine ou l'indométhacine ou les inhibiteurs de la thromboxane synthétase, tels que les imidazoles ; et ( 3) les agents qui bloquent l'afflux de calcium vers les plaquettes, c'est-à-dire les agents de bloca- ge du cheminement du calcium, tels que la vérapamil L'utilisation 20 des agents entrant dans ce groupe, dans le but d'inhiber l'interac- tion plaquette/paroi vasculaire et, partant, de diminuer la prolifération des cellules du muscle lisse, est déjà connue dans l'état antérieur de la technique Cependant, ces agents sont uti- les en combinaison avec des composés destinés spécifiquement au blocage de l'action de la sérotonine, comme par exemple la pizo- 25 tyline et la méthiothépine. Chacune des mesures anti-sérotonine ci-dessus peut être mise en oeuvre isolément ou en combinaison avec une autre voie d'inter- vention anti-sérotonine déjà décrite ou en combinaison avec des médicaments antiplaquettaires ou d'autres thérapies médicales 30 appropriées, telles que les agents anti-hypertensifs, les techni- ques d'abaissement du taux de lipides, etc Selon l'un des aspects de la présente invention, de nouvelles compositions pharmaceutiques sont produites, ces dernières comprenant au moins deux antagonistes de la sérotonine choisis dans un groupe différent parmi ceux 35 définis ci-dessus L'administration d'une combinaison d'agents, chachacun d'eux agissantavecunespécificité relative au niveau d'un site différent dans le processus qui va de l'absorption de la trypto- phane à l'action de la sérotonine sur le récepteur du muscle lisse,

7 augmente la possibilité de réaliser une inhibition maximum de l'action de la sérotonine En outre, la spécificité relative de l'intervention est augmentée et les doses administrées de chacun des agents peuvent être réduites au maximum pour éviter les effets 5 secondaires indésirables bien connus de l'homme de l'art La mesure préférée consiste à utiliser un agent de blocage des récep- teurs de la sérotonine, seul ou en combinaison avec un ou plusieurs agents anti-sérotonine choisis parmi les inhibiteurs de la synthè- se de la sérotonine, les agents de blocage du stockage de la 10 sérotonine, les agents de blocage de la fixation de la sérotonine ou les inhibiteurs des plaquettes sanguines, en particulier les agents de blocage du stockage de la sérotonine et les inhibiteurs de la fonction plaquettaire. Bien que les agents pharmaceutiques spécifiques énoncés 15 ci-dessus sont connus dans l'état antérieur de la techniques, ils n'ont jamais été utilisés pour la prophylaxie et le traitement de l'artériosclérose consistant à inhiber la prolifération des cellules de muscle lisse et ils n'ont jamais été utilisés en combinaision pour de tels traitements D'autres agents de blocage 20 des récepteurs de la sérotonine pouvant être utilisés dans le cadre de la présente invention sont par exemple la kétansérine, la désipramine, l'imipramine, la chlorimipramine, le protriptylène, la dibenzépine, l'amitriptyline, la doxépine, le prothiadène, la pirandamine, le spirobenzofurane, le ciclazindol, le néfopam, le 25 deximafène, la dalédaline, l'amédaline, la quipazine, la trazodone, la zimélidine, la tofénacine, le fénétazole et le fenflurame. D'autres composés possédant une activité antagoniste de la séro- tonine et qui peuvent être utilisés sont : ll-amino-l,5-méthano1,2,5,6-tétrahydrobenzocine ; l-méthylamino-4-phényl-l,2,3,4-tétrahydronaphtylène ; 6-cyano-l,3-dihydro-3-diméthylaminopropyl-3(p-fluorophényl)-isobenzofurane; 4-benzyl-l-( 2-benzofurancarbonyl)pipéridide, 1,4-éthano-4-phényl-cyclohexylamine, alcoold -(p-chlorophényl 2-méthylaminométhylbenzylique; " -( 2-méthylaminoéthyl)-2méthoxy ou 4-trifluorométhylphénylbenzyl éther ou p-anisyl-(lméthyl-4-phényl-3-pipécolinyl)-éther. Les inhibiteurs de la synthèse,de la fixation et du stockage de la sérotonine seront de préférence administrés par voie orale à des doses suffisantes pour provoquer une baisse des niveaux de la sérotonine dans les plaquettes La dose effec-

8 tive et efficace de médicament utilisée à cet effet est détermi- née en contrôlant la teneur en sérotonine plaquettaire sensible- ment comme décrit par Rao, et al (An Improved Method for the Ex- traction of Endogenous Platelet Serotonin, J Lab Clin Med , 5 87, No 1, 129 137, 1976). Les inhibiteurs de la fonction plaquettaire ont été utilisés chez l'homme et la dose effective de l'inhibiteur à employer peut être déterminée en contrôlant l'inhibition de l'agrégation ex vivo sensiblement comme décrit par R Friedman et E Burns ("Role of 10 Platelet in the proliferative response of the Injured Artery" ; Prog Hemostasis and Thrombosis; 4, 249-278, 1978). Les agents de blocage des récepteurs de la sérotonine ont égale- ment été utilisés chez l'homme et la dose effective à utiliser peut également être déterminée en contrôlant l'agrégation plaquet- 15 taire ex-vivo en réponse à la sérotonine et en détenminant la quantité de l'agent de blocage des récepteurs de la sérotonine nécessaire pour bloquer cet effet D'autres méthodes pour contrô- ler la sérotonine, la fixation de la sérotonine ou l'inhibition de la fixation de la sérotonine dans les plaquettes sanguines 20 sont décrites par Wielosz, et al (Naunyn-Schniedeberg's Arch. Pharmacol 296, 59-65, 1976) ; O Lingjaerde (Adv Biosci, 31, 161-167, 1981); Tuomisto (J Pharm Pharmac , 26, 92-100 ; 1974); Richter, et al (J Pharm Pharmac , 26, 763-770, 1974) ; et Tuomisto, et al (Clin Pharmacol Ther , 63, No 11, 25 1714-1718, 1974). Dans le but de démontrer l'efficacité des antagonistes de la sérotonine en tant qu'inhibiteurs de la prolifération des cellules de muscle lisse après lésion vasculaire (et. ainsi en tant qu'agents efficaces pour l'amélioration du déve- 30 loppement des athéromes) on a utilisé, parmi d'autres, l'expé- rimentation suivante. La mise en oeuvre d' antagonistes de la sérotonine pour empêcher et prévenir les lésions artériosclérotiques est indiquée in vivo essentiellement en accord avec la procédure de déendothélialisation de Tiell, et al (Influence of the Pituitary on Arterial Intima Proliferation in the Rat, Circulation Research, Vol 42, No 5, 644-149, May 1978).

9 Des rats mâles Sprague-Dawley pesant 300 à 360 grammes sont nourris à volonté avec un aliment de laboratoire pour rongeurs de composi- tion constante et abreuvés à volonté avec de l'eau pendant deux semaines avant le début du test Pendant deux jours avant la 5 dé-endothélialisation et pendant les quatorze jours suivants jusqu'au jour du sacrifice des animaux, ces derniers reçoivent soit un placebo, soit 1 à 200 mg par kilogramme et par jour de composé à tester Le jour de la dé-endothélialisaton, le médi- cament est administré par voie intraveineuse à une dose corres- 10 pondant au dixième de la dose par voie orale La dé-endothélia- lisation est réalisée sur les aortes des animaux anesthésiés, par cathétérisme au moyen d'une poche d'air Les animaux sont pesés quotidiennement à partir du jour de 1 ' admiirrtrati on du mîdicamert et leur comportement est N o t é trois à quatre heures après 15 l'administration du composé à tester Quatorze jours après-le cathété-ri -me, on réalise une fixation par perfusion de tout le corps, à 370 C, au moyen de glutaraldéhyde tamponné à 3 % dans du cacodylate de sodium 0,15 M à p H 7,4 sous une pression hydro- statique de 90 à 100 mm L'aorte est prélevée, découpé en dix 20 segments de même dimension et après un séjour supplémentaire de deux heures dans le glutaraldéhyde tamponné , les dix segments sont traités avec du tétroxyde d'osmium à 1 %, puis séchés, imprégnés de résine de Squer, puis soumis à cuisson Les segments sont ensuite colorés au moyen de bleu de Stevenal et de flichsin' 25 basique et les surfaces endommagées sont déterminées au moyen d'un microscope standard du type Zeiss et d'un analyseur d'images Videoplan équipé d'un ordinateur (voir les résultats dans les exemples). Pour le traitement de la prophylaxie de l'athérosclérose 30 les inhibiteurs de la synthèse de la sérotonine, les agents de blocage de la fixation, du stockage et des récepteurs de la séro- tonine, ainsi que les agents anti-plaquettaires peuvent être - administrés par voie orale ou par voie parentérale, tels quels ou un mélange avec des véhicules pharmaceutiques conventionnels. 35 Ils peuvent être administrés par voie orale sous la forme de comprimés, de poudre dispersable, de granules, de capsules, de sirops et d'élixirs, et par voie parentérale sous forme de solu- tions, par exemple de solutions aqueuses injectables stériles. Les compositions à usage oral peuvent contenir un ou plusieurs

10 additifs conventionnels tels que agents sucrants, agents aromatisants, agents colorants ou agents de conservation, dans le but d'obtenir des préparations ayant une bonne présentation et agréa- bles au goût Les comprimés peuvent contenir l'ingrédient actif 5 en mélange avec des excipients pharmaceutiquement acceptables conventionnels, par exemple des diluants inertes tels que le car- bonate de calcium, le carbonate de sodium, le lactose et le talc, des agents de granulation et de désintégration, par exemple l'amidon et l'acide alginique, des liants, par exemple le stéarate 10 de magnésium, l'acide stéarique et le talc Les comprimés peuvent être enrobés par des techniques connues dans le but de retarder la désintégration et l'absorption dans l'appareil gastro-intestinal et ainsi permettre une action ininterrompue pendant une longue durée De la même manière, les suspensions, sirops et élixirs 15 peuvent contenir l'ingrédient actif en mélange avec n'importe lesquels des excipients conventionnels utilisés pour la prépara- tion de telles compositions, par exemple des agents de mise en suspension tels que la méthylcellulose, la tragacanthe et l'algi- nate de sodium ; les agents mouillants tels que la lécithine, 20 le polyoxyéthylène stéarate et le polyoxyéthylène sorbitan mono- oléate ; et des conservateurs tels que le p-hydroxybenzoate d'éthyle. Les capsules peuvent contenir l'ingrédient actif seul ou en mé- lange avec un diluant solide inerte, par exemple le carbonate de calcium, le phosphate de calcium et le kaolin Les compositions 25 injectables sont préparées conformément aux méthodes connues dans l'art antérieur Ces préparations pharmaceutiques peuvent contenir jusqu'à environ 90 % d'ingrédient actif en combinaison avec le véhicule ou l'additif. La quantité efficace d'antagoniste de la sérotonine em- 30 ployé pour le traitement de l'artériosclérose varie largement en fonction du composé particulier utilisé, du mode d'administration et de la gravité de l'état pathologique à traiter La dose optimale est aisément déterminée par les méthodes décrites ci-dessus La dose devra être suffisante pour réduire la prolifération des cel- 35 lules de muscle lisse d'au moins 20 % et de préférence de 40 à 95 % En général, des résultats satisfaisants dans le traitement de l'artérosclérose sont obtenus quand un agent de blocage des récepteurs de la sérotonine est administré à une dose journalière d'environ 2 mg à environ 200 mg,de préférence de 15 à 50 mg par kilo-

11 gramme de poids corporel, de préférence par voie orale une fois par jour, ou sous forme permettant une libération ininterrompue. Pour la plupart des mammifères, la dose journalière totale peut aller d'environ 1 mg à environ 1000 mg,depréfèrence de 5 à 200 mg. 5 les formes à dose unitaire appropriéespour l'usage interne contien- nent environ 1 mg à ernvron 500 mg de principe actif en mélange intime avec un véhicule solide ou liquide pharmaceutiquement acceptable. Les exemples ci-après illustrent l'invention sans toute- fois en constituer une limitation. 10 Exemple 1 Des cellules de muscle lisse prélevées sur 1 média aortique bovin, sont développées comme décrit par Coughlin et al (Platelet-Dependent Stimulation of Prostacyclin Synthesis by Plate- let Derived Growth Factor, Nature, 288, p p 600-602, 1980). 15 Des cellules sont ensemencées à raison de 10 5 cellules par cuve de culture tissulaire de 35 mm dans le milieu de Eagle modifié par Dulbelcco contenant 10 % de sérum de veau ; on les laisse ensuite croître pendant 24 heures Le milieu contenant le sérum est ensuite éliminé et les cellules sont maintenues 20 au repos pendant 24 heures dans le milieu 199 Les cultures ainsi reposées sont ensuite incubées 72 heures dans le milieu 199 en présence ou non du mitogène à tester Après cette période d'incu- batbn de 72 heures, les cellules sont recueillies aux fins de comptage au moyen du compteur de Coulter. 25 Le tableau I ci-après montre qu'un nombre plus important de cellules de muscle lisse sontçprésentes dans les cultures trai- tées avec 10 -5 mole de sérotonine Cet effet est observé à la fois en présence et en l'absence de 2 % de plasma humain pauvre en plaquettes connu pour permettr une meilleure msnif 4station 30 de l'activité mitogénique Le facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF) , un mitogène connu pour les cellules de muscle lisse, se montre également actif dans ce système. TABLEAU I Nombre de cellules/Plaque 35 (xl O-5) Traitement Pas de plasma Plasma Témoin 6,60 0,20 5,75 0,14 Sérotonine 8,34 l 0,43 12,19 + 0,13 ( 10-5 M)

12 TABLEAU I (suite) PDGF 9,65 0,29 14,24 + 0,04 ( 8 ng/ml) Sérotonine + 10,51 + 0,27 14,36 + 0,14 5 PDGF ( 8 ng/ml) Moyenne + E T (n= 6) Exemple 2 10 Des cellules de muscle lisse sont ensemencées et mainte- nues au repos comme décrit dans l'exemple 1 Les cultures sont ensuite traitées par la sérotonine, le PDGF ou la cyproheptadine, un agent de blocage des récepteurs de la sérotonine Les cultures sont incubées pendant 96 heures-dans le milieu 199 contenant 15 2,5 % de plasma pauvre en plaquettes et le médicament à tester. Les résultats sont rassemblés dans le tableau II ci-après. Cet exemple montre que la sérotonine augmente le nombre de cellules de muscle lisse présent à la fin du test et que cette augmentation est atténuée par l'agent de blocage des récepteurs 20 de la sérotonine, à savoir la cyproheptadine La sérotonine provoque des augmentations du nombre de cellules du mus- cle lisse qui viennent s'ajouter à celles provoquées par de faibles concentrations de PDGF et ces augmenta- tions induites par la sérotonine sont égalementatténuées par la 25 cyproheptadine Le sérum de veau foetal, qui est connu pour favori- ser au maximum la prolifération des cellules de muscle lisse, est utilisé à titre de témoin positif Des résultats similaires sont obtenus en utilisant les agents de blocage des récepteurs de la sérotonine constitués par lamétergoline et la méthiothé- 30 pine D'autres agents de blocage des récepteurs de la sérotonine, tels que le pizotyline, la méthysergide, la spiropéridole et la miansérine conduisent à des résultats similaires. TABLEAU II Nombre de cellules/plaque 35 Traitement (xl O 10-5) % Maximum* Témoin 5,0 0,19 O Sérotonine 10-5 M 7,68 0,12 33 Sérotonine + Cyproheptadine 10 6 M 5,87 + 0,15 10

PDGF 0,5 ng/ml PDGF 0,5 ng/ml + Sérotonine 5 PDGF 0,5 ng/ml + Sérotonine + Cyproheptadine PDGF 4,0 ng/ml PDGF 4,0 ng/ml + Sérotonine 10 10 PDGF 4,0 ng/ml + Sérotonine + Cyproheptadine 1 % de sérum de veau foetal 5 % de sérum de 15 veau foetal 10 % de sérum de veau foetal BASMC P 3 Moyenne * % Maximum = 13

TABLEAU II (suite) 8,11 + 0,23 10,40 + 0,06 9,57 10,66 + _+ 0,14 0,16 12,01 + 0,09 11, 1 + 0,07 8,24 + 0,20 11,16 + 0,11 12,86 + 0,11 + E T (n= 6) 2,5 % 39 68 58 72 89 77 40 78 100 96 heures d'incubation (valeur obtenue avec le groupe de traitement-valeur obtenue avec le groupe témoin) 20 (valeur obtenue avec 10 % de sérum de veau foetal-valeur obtenue avec le grou- pe témoin x 100) Exemple 3 Dans cet essai, la stimulation de l'incorporation de 3 H-thymidine est utilisée comme indice de l'aptitude d'un 25 composé à favoriser la prolifération des cellules de muscle lisse Des cellules de muscle lisse sont ensemencées dans 96- supports Linbro de cuves (diamètre de 5 mm/cuve) et on les laisse croître pendant 72 heures Ces cellules sont ensuite main- tenues au repos pendant 24 heures dans le milieu 199 puis elles 30 sont incubées avec 200 pl de milieu 199 contenant 2,5 % de plasma pauvre en plaquettes, 3 H-thymidine ( 5 p CI/ml) et le composé à tester ou un témoin Après environ 36 heures, les cellules sont lavées avec une solution saline, fixées au moyen de 'CA à 10 %, lavées à l'eau, lysées avec 1 % de SDS et le lysat 35 est soumis au comptage de 3 H Cette procédure permet à l'opéra- teur de déterminer la quantité de 3 H-thymidine fixée par les cellules de muscle lisse et incorporée dans le DNA Ce processus se produit dans la mesure o les cellules prolifèrent et par suite est utilisé pour tester l'aptitude des substances à stimu- ler la prolifération cellulaire.

14 Les données répertoriées dans le tableau III et obtenues dans ce test, montrent que la sérotonine stimule la prolifération des cellules de muscle lisse, comme cela est indiqué par l'incor- poration accrue de H-thymidine, d'une manière dépendante de 5 la dose En outre, ces résultats montrent que l'agent de blocage des récepteurs de la sérotonine, la cyproheptadine (cypro,10 7 M) atténue cette réponse à la sérotonine Le facteur de croissance dérivé des plaquettes ( 1 ng/ml) connu pour stimuler la proliféra- tion des cellules de muscle lisse est également montré comme 10 augmentant l'incorporation de la thymidine. TABLEAU III CPM**/cuve Traitement (xl O ) % Augmentation Témoin 90,0 7,2 O 15 1 % de FCS 290,3 25,9 222 Sérotonine 10 -7 M 139,8 11,9 55 Sérotonine 10-6 M 306,4 3,1 240 Sérotonine 10-7 M + + Cypro 85,9 6,5 -4 Sérotonine 10-6 M + 20Cypro 237,4 23,8 163 Facteur de croissance dérivé des plaquettes 454,7 28,3 405 25 Moyenne + E T (n= 4) FCS = Sérum de veau foetal ** coups par minute Des résultats similaires sont obtenus quand la cyprohep- 30 tadine est remplacée par d'autres agents de blocage des récepteurs de la sérotonine tels que la pizotyline. Exemple 4 Cet exemple démontre que les interventions qui ont pour but de réduire l'activité de la sérotonine dans les vaisseaux 35 sanguins dans tout l'animal, permettent une réduction extraor- dinaire de la prolifération des cellules de muscle lisse après l é S on vasculaire Des aortes de rats sont débarrassées de leur endothélium en introduisant un catnéter muni d'une poche

gonflée à son extrémité et en le déplaçant tout le long du vaisseau sanguin Chez les animaux, ce type d'endommagement vasculaire est considéré par Goldberg et al (Vascular Smooth Muscle Cell Kinetics : A New Assay for Studying Patterns of 5 Cellular Proliferation In Vivo, Science, 205, 920-922, 1979), comme stimulant la formation de lésions vasculaires ressemblant à celles de l'athérosclérose humaine 48 heures après l'endommage- ment Les rats sont soumis à une injection intraveineuse de 3 H- thymidine qui est incorporé dans le DNA des cellules de muscle 10 14 sse en prolifération Une heure plus tard, l'activité spécifique du DNA des cellules de muscle lisse aortique est déterminée et utilisée comme indice de la prolifération des cellules de muscle lisse dans la paroi vasculaire endommagée Les résultats obtenus sont répertoriés dans le tableau IV ci-après. 15 Le pré-traitement des animaux avec un agent de blocage des récepteurs de la sérotonine, à savoir la méthiothépine ( 10 mg/kg i p , b i d ) conduit à une inhibition marquée de la prolifération des cellules de muscle lisse induite par l'endomma- gement D'autres agents de blocage des récepteurs de la sérotonine, 20 tels que la pizotyline, la cyproheptadine, la méthysergide, la métergoline ou la miansérine conduisent à des résultat similaires. En ajoutant de la réserpine aux aliments du régime, substance qui épuise lesstocks de sérotonine de la plaquette (pré-traitement durant une semaine à raison de 0,25 mg/kg i p q d ), il est possi- 25 ble d'atteindre des réductions encore plus poussées de la prolifé- ration des cellules de muscle lisse Ces résultats montrent que les substances qui agissent en réduisant l'activité de la sérotonine dans les vaisseaux sanguins empêchent la prolifération des cellules de muscle lisse dans tout l'animal après endommagement vasculaire 30 et que leur utilisation empêche ou prévient les lésions vasculai- res qui se produisent dans l'athérosclérose. TABLEAU IV Activité spécifique du DNA des cellules de muscle lisse aortique après endommagement vasculaire expérimental : effet des 35 traitements anti-sérotonine.

16 - Activité spécifique (CPM/pg DNA) Témoin Traitement à la méthiothépine 5 Traitement à la méthio- thépine + réserpine 91,6 13,7 18,1 + 5,3 2,8 + 1,3 Les groupes expérimentaux diffèrent de manière significative des témoins (p L 0,01) Les valeurs représentées correspondent à moyenne + erreur standard (N). 10 (** coups par minute) Quand le test ci-dessus est répété,les activitésspécifiqus ci-après (% du témoin) du DNA des cellules de muscle lisse après endommagement vasculaire et traitement anti-sérotonine sont mises en évidence. Activité spécifique Nombre Erreur standard(%) d'animaux Pas de traitement 100 15 7 Traitement par le véhicule 92 21 5 Traitement à la réserpine 68 12 4 20 Traitement à la méthiothépine*23 4 10 Traitement à la métniothépine et à la réserpine* 10 3 8 * Statistiquement différent des témoins (p L 0,01). Quand l'expérience ci-dessus est réalisée en mettant en 25 oeuvre diverses quantités de méthiothépine, les activités spécifi- ques ci-après, fonction de la dose, sont mises en évidence Nmb 'Nombre Activité spécifique Erreur standard(%) d'animaux Véhicule 100 16 7 30 Méthiothépine 0,3 mg/kg 51 5 5 Méthiothépine 1,0 mg/kg 24 4 6 Méthiothépine 3,0 mg/kg 23 7 6 Méthiothépine 10,0 mg/kg 35 20 7 6

Exemple 5 Cet exemple démontre la réduction de la dimension des lésions vasculaires obtenue par mise en oeuvre de la pizotyline, un agent de blocage des récepteurs de la sérotonine. Des rats mâles Sprague-Dawley pesant 300 à 360 grammes sont chacun marqués à l'oreille, mis en cage et laissés au repos ( 8) ( 6) ( 4) 15 25 1 1869 17 pendant deux semaines avant le début du test pour qu'ils s'accli- matent Les animaux disposent à volonté d'eau et d'aliment de laboratoire pour rongeurs de composition constante (Ralston Purina). Pendant deux jours préalablement à la dé-endothélialisation, 5 et durant 14 jours après cette dernière, de la pizotyline à une dose de 0,25 mg/kg et un placebo sont administrés par gavage dans une solution saline physiologique à neuf animaux traités et dix- neuf animaux témoins Tous les animaux sont soumis à une administration journalière entre 8 heures et 10 heures Le jour de la 10 dé-endothélialisation chirurgicale, la substance a tester est administrée par voie intraveineuse(veine fémorale) à une dose correspondante au dixième de la dose orale dans le but d'établir des niveaux optima de composés dans le sang La durée minimum s'écoulant entre l'administration et l'insertion du cathéter est de cinq minutes. 15 Les animaux sont pesés journalièrement au moment de l'administration et leur comportement est noté trois à quatre heures après l'adminis- tration Les animaux sont examinés individuellement pendant environ une minute pour déceler tout signe et symptôme puis sont replaces dans leur cage. 20 Le jour de la dé-endothélialisation, les animaux sont anesthésiés par inhalation d'éther et le cathétérisme est effectué selon la procédure suivante : l'artère fémorale gauche est mise à nu et du chlorhydrate de lidocaine est appliqué localement pour désensibiliser et dilater le vaisseau sanguin LA poc Le fixce à l'extré- 25 mité du catflt'r -rt déplacée vers la région d la croé aort je le oonitionnement de la poche éta nt marqx ^-sr la parti xterni du cathter la poche etarnt ensuite gonflée au moyen d'une pression d'air d'environ 900 mm Hg jusqu'à atteirndre un diamètre maximum prédéterminé Le cathéter gonflé est tire par son autre extrémité 30 vers la bifurcation des artères iliaques, puis il est dégonflé. Cette opération est répétée trois fois, le cathéter étant soumis à des rotations en vue d'assurer une dé-erndothélialisation symé- trique du vaisseau Le cathéter dégonflé est ensuite retiré, cette opération étant suivie par la ligature de l'artère et l'obturaiton 35 de la surface. Le quatorzième jour suivant la dé-endothélialisation, on procède à des fixations par perfusion de tout le corps (coeur battant) sur les animaux anesthésiés et héparinisés en utilisant approximativement 200 ml de glutaraldéhyde tamponné à 3 % dans du

18 cacodylate de sodium 0,15 M à ur p H de 7,4 sous une pression hydrostatique de 90 à 100 mm à 370 C Le site d'introduction du cathé- ter est une ponction dans le ventricule gauche et l'insertion est réalisée dans la crosse aortique L'écoulement est collecté par 5 aspiration sous vide au niveau de l'oreillette droite L'aorte est ensuite prélevée et découpée en dix segments-de dimensions égales (No 1-6 thoraciques, No 7-10 abdominaux) Les segments sont soumis à un séjour supplémentaire de deux heures dans le glutaraldéhyde tamponné à 3 %, puis sont lavés avec le tampon et 10 soumis à une post-fixation au moyen de tétraoxyde d'osmium à 1 % pendant 18 heures à 40 C Après la post-fixation,les segments sont imprégnés de résine de Spurr et soumis à cuisson à 700 C. Les segments 2, 3, 8 et 9 sont découpés longitudinalement sur une épaisseur de 0,5 p Une coloration polychromatique en deux 15 étapes mettant en oeuvre le bleu de Stevenel ( 2 % de K Mn O 4, 1,3 % de bleu de méthylène) et de la fuchsinebasique ( 1 %) est utilisée pour permettre une différenciation hystologique des composants nucléaires, cytoplasmiques et extra-cellulaires (y compris les composants néo-intimaux) Les lésions des segments 2 20 vasculaires sont enregistrés en exprimant la surface de leur section en pm, en utilisant un microscope standard du type Zeiss et un analyseur d'images Videoplan équipé d'un ordinateur, les valeurs étant normalisées à un micromètre en longueur Les lésions montrant un re-endothélialisation sont incluses dans l'analyse Les valeurs 25 correspondant aux segments thoraciques et abdominaux ne sont pas accumulées étant donné qu'il existe une preuve significative indi- quant une différence dans la vitesse de re-croissance des cellules endothéliales qui modifie les dimensions des lésions Les valeurs de surface de section des lésions sont répertoriées dans le tableau 30 V ci-après. TABLEAU V Surface moyenne des lésions en micromètrescarréschez les animaux témoins et les animaux traités 35 Thoraciques Abdominales Témoin 50 283 1 60 310 3 Pizotyline 11 834 8 27 135 4

19 Les animaux traités par la pizotyline montrent nettement une formation réduite des lésions au niveau des segments thoraciques avec une réduction moyenne de 77 % par rapport aux surfaces de lésions des témoins La formation des lésions au niveau des seg- 5 ments abdominaux est réduite de 55 % d'une manière toute aussi nette. Des résultats analogues sont obtenus avec les agents suivants aux doses indiquées : ~ 10 ~ Agent Dose (mg/kg) 10 Métergoline 3,5 Cyproheptadine 25,0 Méthysergide 46,0 Spiropéridol 4,6 15 Kétansérine 8,0 Miansérine 50,0 Pipampérone 20,0 Exemples 5 et 6 20 Comprimés et capsules appropriés à l'administration orale Les comprimés et capsules contenant les ingrédients réper- toriés ci-après sont préparés par mise en oeuvre des techniques conventionnelles et sont utiles pour la prévention de la prolifé- ration des cellules de muscle lisse à des doses de un comprimé ou 25 une capsule par jour. Ingrédient Poids (mg) Comprimé Capsule Pizotyline 25 25 Tragacanthe 10 30 Lactose 197,5 - Amidon de mais 25 - Talc 15 - Stéarate de magnésium 2,5 - De la même manière, les comprimés et capsules utiles pour 35 la prévention de la prolifération des cellules de muscle lisse peuvent être préparés en utilisant 10 mg de méthiothépine et 0,5 mg de réserpine en lieu et place de la pizotyline.

Claims

REVENDICATIONS

1 Médicament-destiné à inhiber la prolifération des cellules de muscle lisse, caractérisé en ce qu'il est constitué par un mélange d'au moins deux constituants choisis dans un groupe 5 différent parmi les groupes suivants : inhibiteur de la tryptophane hydroxylase, inhibiteur de la décarboxylase périphérique, agent de blocage de la fixation de la sérotonine, agent de blocage du stockage de la sérotonine, agentde blocage des récepteurs de la sérotonine. 10

2 Médicament selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il contient la méthiothépine et la réserpine.

3 Médicament selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il contient la cyproheptadine et la réserpine.

4 Médicament selon larevendication 1, caractérisé en ce 15 qu'il comprend une substance innibitrice des plaquettes.

5 Médicament selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend de la réserpine en tant qu'ingrédient actif en combinaison avec un agent de blocage des récepteurs de la séro- tonine. 20

6 Médicament selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'agent de blocage des récepteurs de la sérotonine est choisi dans le groupe comprenant la pizotyline, la méthiothépine, la métergoline, la cyproheptadine, la méthylsergide, le spiropéri- dol, la miansérine et leurs combinaisons. 25

7 Médicament selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend un agent de blocage des récepteurs de la sérotonine et au moins un agent choisi parmi les suivants : inhibiteur de la tryptophane hydroxylase, inhibiteur de la décarboxylase périphéri- que, agent de blocage de la fixation de la sérotonine, agent de 30 blocage du stockage de la sérotonine.

8 Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle contient une quantité efficace du médicament selon l'une quelconque des revendications précédentes en association avec un véhicule phar- maceutiquement acceptable.