WO2010146204A2 - Cepa cect 7462 de bacillus pumilus y método para incrementar sus efectos entomopatógenos - Google Patents

Cepa cect 7462 de bacillus pumilus y método para incrementar sus efectos entomopatógenos Download PDF

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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus

Definitions

  • the present invention relates to the field of biotechnology, specifically to a new bacterial strain of Bacillus pumilus (CECT 7462 or B. pumilus TCC), in addition to a method to increase its entomopathogenic effects by subjecting it to exposures at temperatures below its temperature optimal growth
  • CECT 7462 or B. pumilus TCC Bacillus pumilus
  • compositions that include the original strain or already treated by the method of the invention, and / or its crystalline structures, and its uses for the biological control of pests or bioinsecticide production. It also refers to any plasmid obtainable from the strain containing nucleotide sequences, or to the sequences themselves, which give rise to entomopathogenic proteins, as well as to the use of the strain for the production of enzymes of industrial interest.
  • Ceratitis capitata or fly of the Mediterranean fruit is one of the most widespread pests worldwide, and is considered one of the most destructive pests in fruits and vegetables. This pest generates the loss of whole crops of products of high agri-food interest.
  • the present invention relates to a new strain of Bacillus pumilus, as well as a method to significantly increase its entomopathogenic effects and the strains thus obtained. It also refers to a composition containing the original strain, or already treated by the method of the invention, and / or its crystalline structures for use as a bioinsecticide or for pest control. It also refers to any plasmid that encodes sequences, or to the sequences themselves, that give rise to entomopathogenic proteins obtainable from the strain, treated or not, and to the use of the strain for the production of enzymes of industrial interest.
  • the genus Bacillus is recognized as a group of potential agents for the control of insect populations due to the toxic effects that many of its representatives have on various species of insects.
  • the toxicity of several strains of the species B. pumilus on the individuals of the Mediterranean fruit fly (C. capitata) is initially analyzed. These studies show that there is a mild toxicity of the various strains studied on individuals of that species. This toxicity is similar by all strains when they are fed to C. capitata larvae along with the diet directly after cultivation. Surprisingly, when these strains are maintained 96 hours at 4 0 C mixed with the diet of C. larvae. capitata, there is an increase of up to 70% in the induced death in said larvae by the CECT 7462 strain (or Bacillus pumilus CBT). On the other hand, the rest of the strains do not show significant effects on their toxicity on C. capitata, and they maintain or increase very slightly the toxicity shown without cold pretreatment.
  • the CECT 7462 strain of the present invention therefore, can be used to control pests of the Mediterranean fruit fly.
  • the use of natural strains with high entomopathogenic activity, as with the strain of the present invention, contributes to the correct development of the crops, avoiding the losses caused by the pest, so that it helps the agronomic development of the regions that suffer them .
  • its use allows greater availability of these food resources for the population. Therefore, the development and use of these organisms represents a good future option for the development of agricultural areas.
  • a first aspect of the present invention is a bacterial strain, the strain CECT 7462 of B. pumilus classified by comparison of the 16S RNA sequence with those existing in the database of genetic sequences of the National Institute of Health of United States (NIH), that is, from the GenBank database.
  • NASH National Institute of Health of United States
  • This is a Gram positive sporulant bacillus whose proposed taxonomic designation includes strain CECT 7462 within the Eubacteria kingdom, phylum Firmicutes, Bacilli class, Bacillales order, Bacillaceae family, Bacillus genus, B. pumilus species.
  • the strain CECT 7462 can be cultivated but not limited to, in LB medium (Luria-Bertani) liquid at a temperature of 3O 0 C under aerobic conditions and agitation at 250 rpm. It can also be grown but not limited to solid medium LB at 3O 0 C and aerobic conditions.
  • the maintenance conditions of said strain are, but not limited to, by a sterile solution at 40% glycerol and freezing at -8O 0 C, or by culture plates with solid LB medium at 4 0 C.
  • Another aspect of Ia The present invention refers to a composition comprising the bacterial strain CECT 7462.
  • strain refers to a genotypic variant of a species, and whose population of organisms descends from a single organism or from a single cell.
  • entomopathogen means any organism, element or effect that causes damage to the insects on which it acts, resulting in poor development and / or in the death of the insect.
  • the temperature is one of the most important and has demonstrated greater effectiveness in this regulation.
  • temperature is a fundamental regulatory factor in many bacterial species to determine what conditions they are in and which are the genes to be expressed.
  • the results of the present invention show that the application of low temperatures to strain CECT 7462 generates an increase in its pathogenicity in diptera insects of the species C. capitata, which seems to indicate that the low temperatures are a trigger element of the entomopathogenic activity of B. pumilus CBT on said diptera.
  • the entomopathogenic activity of the microorganism reaches its maximum level after incubation at 4 0 C, but this entomopathogenic activity is also enhanced when the treatment is carried out at a temperature of -2O 0 C.
  • Another aspect of the present invention relates to a method, hereinafter method of the invention, to increase the pathogenicity of the strain CECT 7462 comprising exposing the strain at temperatures below 25 0 C.
  • the strain CECT 7462 is exposed to temperatures below 15 0 C.
  • the exposure is carried out at temperatures equal to or below 4 0 C.
  • the exposure is carried out at a temperature below - 8 0 C.
  • the strains are exposed to temperatures equal to or less than -2O 0 C.
  • the exposure of the CECT 7462 strain is carried out at temperatures between 2 0 C and 6 0 C.
  • the exposure of the CECT 7462 strain at low temperatures is carried out at temperatures between -18 0 C and -22 0 C.
  • the exposure time of the CECT 7462 strain at low temperatures can be an important element in terms of generating the entomopathogenic activity of the microorganism and its virulence, since it has a high activity level after 96 hours of exposure, and maintains, at least in part, that entomopathogenic activity at least up to 168 hours of exposure indicating that there are incubation ranges that in turn provide ranges of activity. Therefore, in a preferred embodiment of the method of the present invention, exposure to low temperatures is carried out for at least 24 hours. In a more preferred embodiment, exposure to low temperatures is carried out for at least 48 hours. In an even more preferred embodiment, exposure to low temperatures is carried out for at least 96 hours. In an even more preferred embodiment, exposure to low temperatures is carried out for at least 132 hours. In a particular embodiment, the exposure is carried out for at least 168 hours.
  • sporulation is a mechanism of resistance of some microorganisms against stress situations that can cause them damage.
  • the exposure of microorganisms of the genus Bacillus to stress generating elements results in the formation of sporulated forms as well as crystalline structures.
  • Adverse temperatures are one of these triggers for the formation of resistance forms, and also for the formation of crystalline structures in B. pumilus.
  • the temperature is capable of modifying the activity of various metabolic pathways or producing structural transformations in already synthesized substances, which would explain the ability of exposure to low temperatures to activate the entomopathogenic activity of the structures crystallines formed in the sporulation of strain CECT 7462. Therefore, another aspect of the present invention refers to the crystalline structures obtainable from strain CECT 7462 by the method of the invention. Another aspect refers to a composition comprising the activated bacterial strain or the crystalline structures obtainable by the method of the invention.
  • crystalline structure refers to the crystalline inclusions that are found in some strains of the genus Bacillus, and that are formed by proteins with entomopathogenic activity.
  • Entomopathogenic microorganisms of the genus Bacillus such as Bacillus thuringiensis or Bacillus popilliae, often have pathogenicity against more than one species of insects and, in some cases, have activity against various orders of insects. This is mainly due to the ability of these microorganisms to generate toxins (Cry proteins and Cyt proteins) that in some cases have entomopathogenic activity against several pests.
  • toxins Cry proteins and Cyt proteins
  • strain CECT 7462 The entomopathogenic effect of strain CECT 7462 on individuals of C. capitata, a species belonging to the Diptera order, is shown in the results of the present invention.
  • Another aspect refers to the use of the crystalline structures obtainable from the strain CECT 7462 for the control Biological pest.
  • Another aspect refers to a composition comprising the strain treated or not by the method of the invention, or the crystalline structures for the biological control of pests.
  • a preferred embodiment of this aspect refers to the use of the strain, of the crystalline structures, or of said composition for the biological control of pests, where the pest is produced by organisms belonging to some of the orders of the list that comprises although without be limited to Lepidoptera, Coleoptera, Himenoptera, Hemiptera, Homoptera, Mallophaga, Orthoptera, Thysanoptera, Neuroptera, Isoptera, Trichoptera, Dermaptera, Siphonaptera or Diptera.
  • the pest is from organisms of the Diptera order.
  • the pest is from the Mediterranean fruit fly (C. capitata).
  • fertilizer refers to a situation in which an organism or a group of them belonging to the same or to different species generate damage to human interests, generally crops, crops or species of interest agricultural.
  • compositions for pest control is leading to the integration of microorganisms or parts thereof into bioinsecticides, since they offer better results than the direct application of the microorganism or parts thereof on the culture. Therefore, the bioinsecticides can contain either the strain or parts thereof, as for example but without limiting toxins, as an active compound, in addition to other compounds independent of the organism. These bioinsecticides are those that are finally applied to plantations to avoid losses caused by pests.
  • another aspect of the present invention refers to the use of strain CECT 7462 or a composition that comprises for the production of bioinsecticides.
  • Another aspect of the present invention refers to the use of the strain obtained by the method of the invention, or the crystalline structures for the production of bioinsecticides.
  • the bioinsecticide acts on at least one organism of the orders of the list comprising Lepidoptera, Coleoptera, Hymenoptera, Hemiptera, Homoptera, Mallophaga, Orthoptera or Diptera.
  • the bioinsecticide acts on organisms of the Diptera order.
  • the bioinsecticide is directed to the Mediterranean fruit fly (C. capitata).
  • bioinsecticide refers to insecticides that contain as active ingredient a compound obtained from natural matter such as plants, animals or microorganisms.
  • active component refers to the compound that produces the desired biological effects when applying the composition in which it is on the culture or the target organism.
  • Another aspect of the invention refers to the isolated nucleotide sequences of strain CECT 7462 that encodes at least one entomopathogenic protein.
  • plasmids are not always present in bacteria.
  • the present invention shows the existence of plasmids within strain CECT 7462, which could present the genes that They confer entomopathogenicity to the strain. Therefore, another aspect of the invention relates to plasmids obtainable from strain CECT 7462 that comprise at least one nucleotide sequence that encodes an entomopathogenic protein.
  • strains of the genus Bacillus there are many enzymes that are produced at an industrial level from strains of the genus Bacillus. For example, there is industrial production of proteases derived from Bacillus amyloliquefaciens or Bacillus subtillis.
  • many of the strains of B. pumilus described produce enzymes that have industrial interest due to their high applicability in industries such as food, detergent production or tissue processing.
  • the strain CECT 7462 has a high production of some of these enzymes as proteases or catalase.
  • another aspect of the present invention refers to the use of strain CECT 7462 treated or not treated by the method of the invention, for the production of enzymes.
  • the enzymes produced are proteases.
  • the enzyme produced is catalase.
  • Proteins in the present description are understood as all those enzymes capable of catalyzing a reaction that fragments proteins or peptides by breaking the peptide bonds between amino acids into smaller parts. These enzymes are selected but not limited to, from the list comprising serine proteases, threonine proteases, cysteine proteases, aspartyl proteases, metalloproteases, glutamyl proteases or mixed proteases.
  • Catalase is understood in the present invention as the enzyme, whose EC number (Enzyme Commission number) is 1.11.1.6, and is capable of catalyze the decomposition of hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) in water (H 2 O) and oxygen (O 2 ).
  • Figure 1 Shows the cumulative mortality (mean ⁇ SD) of C. capitata larvae at 4 (white bars), 10 (gray bars) and 15 days (black bars) caused by cultures of B. pumilus CBT (strain CECT 7462 ), B. pumilus M1, B. pumilus M2 with and without cold treatment.
  • the data is the mean ⁇ SD.
  • n 48.
  • the significant differences between ⁇ . Pumilus CBT and its controls were evaluated by an ANOVA after 15 days of starting the experiment (P ⁇ 0.01).
  • Figure 2 Shows images of the culture of B. pumilus TCC in sporulation medium T3, observed at the Transmission Electron Microscope.
  • Fig. 2A Image of the culture of 58 h, with spores and crystalline structures in the middle.
  • Fig. 2B detail of a crystal.
  • Fig. 2C cell showing a crystalline structure inside (74 h culture).
  • FIG. 1 Electrophoresis in agarose gel (0.8%), of DNA extracted from several strains.
  • Lane 1 Molecular weight marker (250 base pairs at 12 kilobases); Streets 2, 3 and 4: B. pumilus CBT (different extractions) Street 5: 8. Pumilus M1; Lane 6: B. pumilus M2; Lane 7: B. thuringiensis IPS 78/11 (plasmid cure).
  • Figure 4 Shows digestion halos by extracellular protease activity (determined with casein) of various bacterial strains after 24 h from the beginning of the assay.
  • the strains are from left to right: Bacillus pumilus M2, Bacillus pumilus TCC, Bacillus pumilus M1, Burkholderia cepacia, Escherichia coli, Pseudomonas putida, Bacillus subtilis and Bacillus cereus.
  • the plates were used for the bioassay immediately after mixing the bacterial cultures with the larval diet, while the other was maintained for 96 hours at 4 0 C.
  • the results of the bioassays are shown in Figure 1.
  • the C. capitata larvae showed high percentage of plaque mortality in those bioassays with CECT 7462 that remained 96 hours at 4 0 C, while in those without cold treatment, they showed low toxicity.
  • the toxicity of strains B. pumilus M1 and M2 did not exceed 40% at best, indicating that the toxicity of CECT 7462 seems to be a unique characteristic of this strain and not a characteristic shared with other strains of B. pumilus ; strains B. pumilus M1 and M2 were used as negative controls.
  • Table 1 Mortality at 10 days (mean ⁇ SD) of C. capitata larvae caused by CECT 7462 or its controls B. pumilus M1 or sporulation medium T3.
  • B. pumilus like any species of the genus Bacillus, has two cell types depending on the environment. When there is an excess of nutrients, The cells are in the vegetative phase, while when the nutrients are depleted or there is an adverse agent in the environment, the cell produces a form of resistance known as the spore. In order to make a morphological characterization of each of the growth phases of strain CECT 7462, a culture of B. pumilus was monitored through electron microscopy.
  • a single colony was resuspended in 2 ml of T3 sporulation medium and incubated for 72 h at 30 ° C.
  • the culture was heated 10 min. at 7O 0 C to eliminate vegetative cells.
  • 50 ml of T3 medium were inoculated with 500 ⁇ l of a heat treated pre-circle, in order to synchronize the culture.
  • the culture was maintained at 3O 0 C under agitation at 240 rpm and volumes of 500 ⁇ l were periodically removed at 0 h, 6 h, 11 h, 25 h, 29 h, 33 h, 36 h, 48 h, 58 h and 74 h. All these samples were fixed and stained to be observed under the transmission electron microscope (MET).
  • MET transmission electron microscope
  • the crystalline structures observed in the sporulated culture of CECT 7462 resemble the protein crystals produced by B. thuringiensis when sporula, and they are responsible for their entomopathogenic activity. Given this similarity, it was decided to purify the crystals observed using the same Cry protein purification protocol of B. thuringiensis (Thomas and Ellar, 1983. FEBS Lett .; 154: 362-368). For this, 500 ml of sporulated culture was prepared, 72 h at 3O 0 C at 240 rpm, in T3 sporulation medium. Subsequently, 1 M of NaCl was added, and it was incubated 12 hours at 4 0 C.
  • bacterial toxins including those with insecticidal properties of the Cry toxin type, are plasmid coding (from Maagd et al., 2003. Annu. Rev. Genet; 37: 409-433; DeNap and Hergenrother, 2005. Org Biomol. Chem .; 3: 959-966).
  • plasmids and / or megaplasmids extrachromosomal elements
  • strains CECT 7462, B. pumilus M1, B. pumilus M2, B. thuringiensis IPS 78/11 were grown in 3 ml of LB medium overnight, and then a 1: 50 dilution was made in 50 ml of LB. The cultures were kept under stirring at 3O 0 C and 240 rpm to an optical density at 600 nm between 0.5 to 1.1.
  • the vegetative cells were centrifuged at 20,200 xg for 15 minutes at 4 0 C and each pellet resuspended in 20 ml of TES buffer (30 mM Tris base, 5 mM EDTA, 50 mM NaCI; pH 8.0 adjusted with 3M HCI) previously cooled .
  • TES buffer (30 mM Tris base, 5 mM EDTA, 50 mM NaCI; pH 8.0 adjusted with 3M HCI
  • the pellet was resuspended in 2 ml of lysis buffer (20% sucrose (w / v), 2 mg / ml lysozyme and 1 ⁇ l / ml RNase from a stock solution 10 mg / ml in buffer TES) and incubated at 37 0 C for 90 minutes or until the formation of more than 90% of spheroplasts was achieved and monitored under microscope.
  • the spheroplast suspension was supplemented with 3 ml of 8% SDS (w / v) TES buffer and incubated at 68 0 C for 10 minutes.
  • an agarose gel electrophoresis was performed with 0.5 ⁇ g / ml ethidium bromide; for this, 10 ⁇ L of the DNA solution was mixed with 2 ⁇ l of loading buffer, and deposited in a 0.8% agarose gel well (w / v) in TBE buffer and migrated at 100 V for 120-180 minutes A Molecular Weight Marker of 250 bp at 12 kb (Stratagene, No. Cat. 201115) was used.
  • EXAMPLE 6 Assay of extracellular protease activity using casein.
  • Table 2 Results of the protease activity in LB-agar plates supplemented with Casein or milk powder at 24 or 48 hours. Measures of halos in mm.
  • EXAMPLE 7 Assay of extracellular protease activity using powdered milk.
  • Catalase activity was tested in strains CECT 7462, B. pumilus M1 and B. thuringiensis 78/11. To do this, an isolated colony was taken from each strain with a sowing handle, and subsequently immersed in a solution of 3% H 2 O 2 . (Barbosa et al., 2004. App. Environ. Microbe /; 71: 968-978). The production of bubbles (O 2 ) in the solution was interpreted as positive for the Catalan activity (Table 3).

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Abstract

La presente invención se refiere a una nueva cepa bacteriana de Bacillus pumilus (CECT 7462 o B. pumilus TCC). Dicha cepa se puede tratar con exposiciones a bajas temperaturas para incrementar sus efectos entomopatógenos. Además se refiere a composiciones que incluyan la cepa original o ya tratada por el método de la invención, y/o sus estructuras cristalinas, y a sus usos para el control biológico de plagas o producción de bioinsecticidas. También se refiere a cualquier plásmido obtenible a partir de la cepa que contenga secuencias nucleotídicas, o bien a las propias secuencias, que den lugar a proteínas entomopatógenas, así como al uso de la cepa para la producción de enzimas de interés industrial.

Description

Cepa CECT 7462 de Bacillus pumilus y método para incrementar sus efectos entomopatógenos.
La presente invención se refiere al campo de Ia biotecnología, específicamente a una nueva cepa bacteriana de Bacillus pumilus (CECT 7462 o B. pumilus TCC), además de a un método para incrementar sus efectos entomopatógenos al someterla a exposiciones a temperaturas inferiores a su temperatura óptima de crecimiento. Además se refiere a composiciones que incluyan Ia cepa original o ya tratada por el método de Ia invención, y/o sus estructuras cristalinas, y a sus usos para el control biológico de plagas o producción de bioinsecticidas. También se refiere a cualquier plásmido obtenible a partir de Ia cepa que contenga secuencias nucleotídicas, o bien a las propias secuencias, que den lugar a proteínas entomopatógenas, así como al uso de Ia cepa para Ia producción de enzimas de interés industrial.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
Ceratitis capitata o mosca de Ia fruta del Mediterráneo, constituye una de las plagas más extendidas a nivel mundial, y es considerada una de las plagas más destructivas en frutas y verduras. Esta plaga genera Ia pérdida de cosechas enteras de productos de elevado interés agroalimentario.
Debido a ello, a nivel internacional, se ha desarrollado legislación en torno a los procedimientos de control de los productos provenientes de países que sufren esta plaga. Uno de los mecanismos que se han postulado para evitar Ia expansión de Ia plaga es el sometimiento a cuarentena a los productos cuyo origen se encuentra en países con este problema. Estos periodos de cuarentena generan en muchas ocasiones grandes pérdidas económicas. Además de Ia elevada destructividad de Ia plaga de C. capitata, este organismo presenta dificultades para su control. Esto se debe fundamentalmente a que los métodos existentes no son totalmente efectivos. La mayoría de los métodos llevados a cabo se basan en el uso de compuestos químicos que no permiten un control de Ia plaga que minimice las perdidas económicas, sino que simplemente provocan una pequeña reducción de las mismas sin llegar a ser totalmente efectivos en su control. Además el uso de compuestos químicos de síntesis lleva aparejado, en multitud de casos, Ia posibilidad de producir algún problema de impacto ambiental y fenómenos de resistencia de insectos.
Estos tratamientos químicos se realizan fundamentalmente de dos formas, bien mediante Ia fumigación aérea de los cultivos con Ia consiguiente inespecificidad del tratamiento y su dificultad de alcanzar todas las áreas del mismo, o bien mediante el uso de insecticidas para el tratamiento del suelo. Ambos tratamientos presentan como dificultad añadida Ia inespecificidad de su acción con respecto al organismo a erradicar, produciendo daño sobre especies que pueden no tener ningún efecto nocivo sobre los cultivos, y que son esenciales para mantener el equilibrio ecológico.
Otra desventaja que presentan estos tratamientos con productos químicos es Ia aparición de resistencias en las poblaciones sobre las que se aplica. En Ia actualidad es fácil encontrar poblaciones de insectos con una mayor tolerancia a altas concentraciones de insecticidas de Ia que presentaban antes del uso de estos compuestos sobre los cultivos. Esto se observa por ejemplo en poblaciones de C. capitata recogidas en lugares donde se han realizado tratamientos con el insecticida organofosforado Malatión. Los individuos de poblaciones de zonas tratadas son entre 6 y 201 veces más resistentes que ejemplares de laboratorio, y entre 2 y 30 veces más resistentes que ejemplares recogidos en campos donde no se ha usado este insecticida (Magaña et al. 2007. J. Econ. Entorno/.; 100: 1836-1843).
Debido a estos problemas que presentan los insecticidas de síntesis, a nivel internacional, cada vez se restringe más su uso. Un claro ejemplo es
Ia eliminación del insecticida Malatión por parte de Ia Unión Europea, en verano de 2007, de Ia lista de elementos autorizados para el control de plagas. Este insecticida organofosforado era, en ese momento, el compuesto más utilizado para el control de Ia plaga de C. capitata. Estas restricciones hacen por Io tanto cada vez más complejo el control de esta plaga por parte de los agricultores.
Para tratar de solucionar Ia aparición de plagas en cultivos sin Ia utilización de compuestos químicos, se han realizado muchas aproximaciones en Io que se conoce con el nombre de control biológico. Una estrategia seguida ha sido Ia introducción en el habitat de individuos estériles que evitasen Ia reproducción y propagación del organismo que representa una plaga. Esta aproximación permite el control sobre Ia población mediante una reducción del tamaño poblacional de Ia especie problema, pero normalmente va acompañado de otros sistemas de control para Ia eliminación de Ia plaga.
Otra de las soluciones que se han puesto en marcha para el control biológico de plagas, es el uso de organismos naturales con actividad entomopatógena. Uno de los ejemplos más claros de este desarrollo es el organismo Bacillus thuringiensis, ampliamente estudiado para el control de plagas de ciertos insectos (Roh et al. 2007. J Microbio! Biotechnol.; 17:547- 559). Para este control se está utilizando tanto el microorganismo completo como partes del mismo (normalmente las proteínas Cry o los cristales que forman, o las proteínas Cyt) tanto de forma independiente, como en composiciones que los incluyan (WO2006042404). Existe por tanto una necesidad de controlar Ia población de C. capitata en cultivos debido a los grandes perjuicios económicos que genera. Este control se ha de realizar de forma que se resuelvan las limitaciones y los inconvenientes que generan los actuales controles químicos de Ia plaga.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a una nueva cepa de Bacillus pumilus, así como a un método para aumentar de forma significativa sus efectos entomopatógenos y las cepas así obtenidas. También se refiere a una composición que contenga Ia cepa original, o ya tratada por el método de Ia invención, y/o sus estructuras cristalinas para su uso como bioinsecticida o para el control de plagas. También se refiere a cualquier plásmido que codifique secuencias, o bien a las propias secuencias, que den lugar a proteínas entomopatógenas obtenibles a partir de Ia cepa, tratada o no, y al uso de Ia cepa para Ia producción de enzimas de interés industrial.
El género Bacillus es reconocido como un grupo de agentes potenciales para el control de poblaciones de insectos debido a los efectos tóxicos que presentan muchos de sus representantes sobre diversas especies de insectos.
En Ia presente invención se analiza inicialmente Ia toxicidad de varias cepas de Ia especie B. pumilus sobre los individuos de Ia Mosca de Ia fruta del Mediterráneo (C. capitata). Mediante estos estudios se demuestra que existe una leve toxicidad de las diversas cepas estudiadas sobre los individuos de dicha especie. Esta toxicidad es similar por parte de todas las cepas cuando se suministran a larvas de C. capitata junto a Ia dieta de forma directa tras su cultivo. Sorprendentemente, cuando estas cepas se mantienen 96 horas a 40C mezcladas con Ia dieta de las larvas de C. capitata, se produce un aumento de hasta un 70% en Ia muerte inducida en dichas larvas por parte de Ia cepa CECT 7462 (o Bacillus pumilus TCC). Por su parte, el resto de las cepas no presentan efectos significativos en su toxicidad sobre C. capitata, y mantienen o aumentan muy levemente Ia toxicidad mostrada sin el pretratamiento con frío.
La cepa CECT 7462 de Ia presente invención, por Io tanto, puede ser utilizada para controlar plagas de Ia mosca de Ia fruta del Mediterráneo. El uso de cepas naturales con alta actividad entomopatógena, como ocurre con Ia cepa de Ia presente invención, contribuye al correcto desarrollo de los cultivos, evitando las pérdidas producidas por Ia plaga, de forma que se ayuda al desarrollo agronómico de las regiones que las sufren. Además, su uso permite una mayor disponibilidad de estos recursos alimentarios para Ia población. Por ello, el desarrollo y uso de estos organismos representa una buena opción de futuro para el desarrollo de zonas agrícolas.
En este sentido, un primer aspecto de Ia presente invención es una cepa bacteriana, Ia cepa CECT 7462 de B. pumilus clasificada por comparación de Ia secuencia de RNA 16S con las existentes en Ia base de datos de secuencias genéticas del Nacional Institute of Health de Estados Unidos (NIH), es decir, de Ia base de datos GenBank. Se trata de un bacilo esporulante Gram positivo cuya designación taxonómica propuesta incluye Ia cepa CECT 7462 dentro del reino Eubacteria, phylum Firmicutes, clase Bacilli, orden Bacillales, familia Bacillaceae, género Bacillus, especie B. pumilus. La cepa CECT 7462 puede ser cultivada aunque sin limitarse, en medio LB (Luria-Bertani) liquido a una temperatura de 3O0C en condiciones aerobias y agitación a 250 r.p.m. También puede ser cultivada aunque sin limitarse en medio sólido LB a 3O0C y condiciones aerobias. Las condiciones de mantenimiento de dicha cepa son, pero sin limitarse, mediante una solución estéril al 40% de glicerol y congelando a -8O0C, o mediante placas de cultivo con medio LB sólido a 40C. Otro aspecto de Ia presente invención se refiere a una composición que comprende Ia cepa bacteriana CECT 7462.
El término "cepa" tal como se entiende en Ia presente invención hace referencia a una variante genotípica de una especie, y cuya población de organismos que desciende de un único organismo o de una sola célula.
En Ia presente invención se entiende por "entomopatógeno" todo aquel organismo, elemento o efecto que provoca daño en los insectos sobre los que actúa, derivando en el mal desarrollo y/o en Ia muerte del insecto.
Es conocido que Ia regulación de muchos genes, así como Ia actividad de diversas moléculas en bacterias, se encuentra fuertemente influenciada por las condiciones ambientales a las que se encuentran expuestas en cada momento. En las bacterias patógenas, Ia regulación en función del ambiente en el que se encuentren se convierte en un elemento indispensable debido a las condiciones únicas que ofrece el hospedador para el ciclo vital de estas bacterias. Esta regulación es fundamental a Ia hora de expresar los genes de virulencia así como muchos otros genes, y de regular Ia actividad de sus productos, ya que su expresión en momentos inadecuados puede conllevar Ia muerte del individuo, Ia detención del ciclo vital o una desventaja adaptativa frente a otras especies.
Entre los factores ambientales reguladores de estos genes y de Ia actividad de sus productos, se encuentran aunque sin limitarnos, temperatura, pH, osmolaridad, tensión de oxígeno, concentración de metales o humedad.
Dentro de estos factores, Ia temperatura es uno de los más importantes y que ha demostrado mayor eficacia en esta regulación. De esta forma Ia temperatura es un factor regulador fundamental en muchas especies bacterianas para determinar en qué condiciones se encuentran y cuales son los genes que han de expresar. En este sentido, los resultados de Ia presente invención muestran que Ia aplicación de bajas temperaturas a Ia cepa CECT 7462 generan en Ia misma un aumento de su patogenicidad en insectos dípteros de Ia especie C. capitata, Io que parece indicar que las bajas temperaturas son un elemento desencadenante de Ia actividad entomopatógena de B. pumilus TCC sobre dicho díptero. En los ejemplos se muestra que Ia actividad entomopatógena del microorganismo alcanza su máximo nivel tras Ia incubación a 40C, pero esta actividad entomopatógena también se encuentra potenciada cuando el tratamiento se realiza a una temperatura de -2O0C. Esto indica que Ia incubación de β. pumilus TCC a temperaturas inferiores a Ia óptima de cultivo (3O0C), que genere un estrés en el organismo, Ie proporciona Ia capacidad entomopatógena en mayor o menor medida. Por Io tanto esto parece indicar que las temperaturas inferiores a (3O0C) presentan un efecto activador de Ia actividad entomopatógena. Por ello Ia exposición a bajas temperaturas, inferiores a Ia óptima de crecimiento, sería un método de tratamiento para conseguir incrementar Ia entomopatogenicidad de Ia cepa CECT 7462 de B. pumilus.
Por todo ello otro aspecto de Ia presente invención se refiere a un método, de ahora en adelante método de Ia invención, para incrementar Ia patogenicidad de Ia cepa CECT 7462 que comprende exponer Ia cepa a temperaturas inferiores a 250C. En una realización preferida, Ia cepa CECT 7462 es expuesta a temperaturas inferiores a 150C. En una realización más preferida Ia exposición se realiza a temperaturas iguales o inferiores a 40C. En una realización aún más preferida Ia exposición se realiza a una temperatura inferior a -80C. En una realización particular de Ia invención las cepas son expuestas a temperaturas iguales o inferiores a -2O0C.
Como se demuestra en los ejemplos de Ia invención 40C y -2O0C son dos temperaturas óptimas en torno a las cuales tratar Ia cepa de Ia invención si se pretende maximizar sus efectos entomopatógena. Por ello en una realización preferida del método de Ia invención Ia exposición de Ia cepa CECT 7462 se realiza a temperaturas de entre 20C y 60C. En otra realización preferente Ia exposición de Ia cepa CECT 7462 a bajas temperaturas se realiza a temperaturas de entre -180C y -220C.
En los ejemplos de Ia presente invención también se pone de manifiesto que el tiempo de exposición de Ia cepa CECT 7462 a bajas temperaturas puede ser un elemento importante en cuanto a Ia generación de Ia actividad entomopatógena del microorganismo y a su virulencia, ya que presenta un alto nivel de actividad tras 96 horas de exposición, y mantiene, al menos en parte, esa actividad entomopatógena al menos hasta las 168 horas de exposición indicando que existen rangos de incubación que proporcionan a su vez rangos de actividad. Por todo ello en una realización preferida del método de Ia presente invención, Ia exposición a bajas temperaturas se realiza durante al menos 24 horas. En una realización más preferida Ia exposición a bajas temperaturas se realiza durante al menos 48 horas. En una realización aún más preferida Ia exposición a bajas temperaturas se realiza durante al menos 96 horas. En una realización aún más preferida Ia exposición a bajas temperaturas se realiza durante al menos 132 horas. En una realización particular, Ia exposición se realiza durante al menos 168 horas.
Gracias a estas exposiciones a bajas temperaturas, se obtienen a partir de Ia cepa CECT 7462, factores de virulencia cuyos efectos nocivos sobre Ia especie C. capitata están potenciados. De cualquier modo y a pesar de partir de un mismo genotipo, por las condiciones de estrés a las que se somete a Ia cepa inicial se puede dar lugar microorganismos que tras el tratamiento, muestran distintos niveles de actividad entomopatógena por Ia activación o no, bien de factores transcripcionales, bien de rutas metabólicas. Por ello, otro aspecto de Ia presente invención se refiere a las cepas obtenibles por el método de Ia invención.
En los ejemplos mostrados en Ia presente invención se demuestra Ia aparición de cristales en los cultivos de CECT 7462 cuando esos cultivos se llevan a cabo en medio de esporulación T3 (Travers et al., 1987. Appl Environ Microbio/.; 53: 1263-1266). Estos cristales son morfológicamente similares a los producidos por B. thuringiensis, los cuales presentan efectos entomopatógenos ya que están formados por las toxinas Cry. Además, el aislamiento de estos cristales mediante el mismo método usado para el aislamiento de las proteínas Cry de B. thuringiensis da lugar a una banda en un gradiente de sacarosa a Ia misma altura que dichas toxinas. Todo esto parece inferir que los cristales producidos por B. pumilus podrían tener una naturaleza similar a los de B. thuringiensis, por Io que parece posible que sean los responsables de Ia entomopatogenicidad de Ia cepa.
Además, es conocido que Ia esporulación es un mecanismo de resistencia de algunos microorganismos frente a situaciones de estrés que pueden generarles un daño. La exposición de microorganismos del género Bacillus a elementos generadores de estrés da lugar a Ia formación de formas esporuladas así como de estructuras cristalinas. Las temperaturas adversas son uno de estos factores desencadenantes de Ia formación de formas de resistencia, y también de Ia formación de estructuras cristalinas en B. pumilus. Por otro lado, es conocido que en múltiples ocasiones Ia temperatura es capaz de modificar Ia actividad de diversas rutas metabólicas o producir trasformaciones estructurales en sustancias ya sintetizadas, Io que explicaría Ia capacidad de Ia exposición a bajas temperaturas para activar Ia actividad entomopatógena de las estructuras cristalinas formadas en Ia esporulación de Ia cepa CECT 7462. Por todo ello, otro aspecto de Ia presente invención se refiere a las estructuras cristalinas obtenibles a partir de Ia cepa CECT 7462 por el método de Ia invención. Otro aspecto se refiere a una composición que comprenda Ia cepa bacteriana activada o las estructuras cristalinas obtenibles por el método de Ia invención.
El término "estructura cristalina" tal como se entiende en Ia presente invención, se refiere a las inclusiones cristalinas que se encuentran en algunas cepas del género Bacillus, y que se encuentran formadas por proteínas con actividad entomopatógena.
Los microorganismos entomopatógenos del género Bacillus, como por ejemplo Bacillus thuringiensis o Bacillus popilliae, presentan en multitud de ocasiones patogenicidad frente a más de una especie de insectos y, en algunos casos, presentan actividad frente a diversos órdenes de insectos. Esto se debe fundamentalmente a Ia capacidad de estos microorganismos de generar toxinas (proteínas Cry y proteínas Cyt) que presentan en algunos casos actividad entomopatógena frente a varias plagas. Existen especies de Bacillus thuringiensis que generan cristales con actividad frente diversas combinaciones de órdenes, como por ejemplo Lepidoptera y Díptera, Coleóptera e Hymenoptera, Díptera y Coleóptera, Hemiptera e Hymenoptera, e incluso Díptera, Coleóptera y Lepidoptera.
En los resultados de Ia presente invención se muestra el efecto entomopatógeno de Ia cepa CECT 7462 sobre los individuos de C. capitata, especie perteneciente al orden Díptera.
Por todo ello, otro aspecto de Ia invención se refiere al uso de Ia cepa
CECT 7462 tratada o no con el método de Ia invención para el control biológico de plagas. Otro aspecto se refiere al uso de las estructuras cristalinas obtenibles a partir de Ia cepa CECT 7462 para el control biológico de plagas. Otro aspecto se refiere a una composición que comprenda Ia cepa tratada o no por el método de Ia invención, o las estructuras cristalinas para el control biológico de plagas. Una realización preferida de este aspecto se refiere al uso de Ia cepa, de las estructuras cristalinas, o de dicha composición para el control biológico de plagas, donde Ia plaga es producida por organismos pertenecientes a alguno de los órdenes de Ia lista que comprende aunque sin limitarse a Lepidoptera, Coleóptera, Himenoptera, Hemiptera, Homoptera, Mallophaga, Orthoptera, Thysanoptera, Neuroptera, Isoptera, Trichoptera, Dermaptera, Siphonaptera o Díptera. En una realización más preferida Ia plaga es de organismos del orden Díptera. En una realización aún más preferida Ia plaga es de Ia mosca de Ia fruta del Mediterráneo (C. capitata).
El termino "plaga" tal como se entiende en Ia presente invención hace referencia a una situación en Ia que un organismo o un conjunto de ellos pertenecientes a Ia misma o a diferentes especies generan un daño a intereses humanos, generalmente cultivos, cosechas o especies de interés agrícola.
El desarrollo de composiciones para el control de plagas está llevando a Ia integración de los microorganismos o partes de los mismos en bioinsecticidas, ya que ofrecen mejores resultados que Ia aplicación directa del microorganismo o partes de los mismos sobre el cultivo. Por ello los bioinsecticidas pueden contener bien Ia cepa o bien partes de Ia misma, como por ejemplo aunque sin limitarse toxinas, como compuesto activo, además de otros compuestos independientes del organismo. Estos bioinsecticidas son los que finalmente se aplican sobre las plantaciones para evitar las pérdidas producidas por plagas.
Por todo ello, otro aspecto de Ia presente invención se refiere al uso de Ia cepa CECT 7462 o una composición que Ia comprenda para Ia producción de bioinsecticidas. Otro aspecto de Ia presente invención se refiere al uso de Ia cepa obtenida por el método de Ia invención, o las estructuras cristalinas para Ia producción de bioinsecticidas. En una realización preferida de este aspecto de Ia invención, el bioinsecticida actúa sobre al menos un organismo de los órdenes de Ia lista que comprende Lepidoptera, Coleóptera, Himenoptera, Hemiptera, Homoptera, Mallophaga, Orthoptera o Díptera. En una realización más preferida de este aspecto de Ia invención, el bioinsecticida actúa sobre organismos del orden Díptera. En una realización aún más preferida el bioinsecticida va dirigido a Ia mosca de Ia fruta del Mediterráneo (C. capitata).
En Ia presente descripción el término "bioinsecticida" hace referencia a insecticidas que contienen como ingrediente activo un compuesto obtenido de materia natural como plantas, animales o microorganismos.
El término "componente activo" según se entiende en Ia presente invención hace referencia al compuesto que produce los efectos biológicos deseados al aplicar Ia composición en Ia que se encuentra sobre el cultivo o el organismo diana.
En las diversas cepas del género Bacillus que presentan genes codificantes para elementos entomopatógenos, los genes que dan lugar a proteínas con capacidad insecticida como las proteínas Cry, se encuentran bien en estructuras extracromosomales como los plásmídos, bien integrados en su cromosoma. Por ello otro aspecto de Ia invención se refiere a Ia secuencias nucleotídicas aisladas de Ia cepa CECT 7462 que codifica para al menos una proteína entomopatógena.
Por otra parte, los plásmidos no se encuentran siempre presentes en las bacterias. En Ia presente invención se muestra Ia existencia de plásmidos dentro de Ia cepa CECT 7462, los cuales podrían presentar los genes que Ie confieren la entomopatogeneicidad a Ia cepa. Por Io tanto otro aspecto de Ia invención se refiere a los plásmidos obtenibles a partir de Ia cepa CECT 7462 que comprenden al menos una secuencia nucleotídica que codifica para una proteína entomopatógena.
En Ia actualidad existen multitud de enzimas que son producidas a nivel industrial a partir de cepas del género Bacillus. Por ejemplo existe producción industrial de proteasas derivadas de Bacillus amyloliquefaciens o Bacillus subtillis. Además, muchas de las cepas de B. pumilus descritas producen enzimas que tienen interés industrial debido a su alta aplicabilidad en industrias como Ia alimentaria, Ia producción de detergentes o el procesamiento de tejidos. En Ia presente invención se demuestra que Ia cepa CECT 7462 presenta una elevada producción de algunas de estas enzimas como proteasas o catalasa.
Por ello, otro aspecto de Ia presente invención se refiere al uso de Ia cepa CECT 7462 tratada o no por el método de Ia invención, para Ia producción de enzimas. En una realización preferida de este aspecto las enzimas producidas son proteasas. En otra realización preferida de este aspecto de Ia invención Ia enzima producida es Ia catalasa.
Se entiende por "proteasas" en Ia presente descripción, todas aquellas enzimas capaces de catalizar una reacción que fragmente proteínas o péptidos por ruptura de los enlaces peptídicos entre aminoácidos en partes más pequeñas. Estas enzimas se seleccionan aunque sin limitarse, de Ia lista que comprende serin-proteasas, treonin-proteasas, cistein-proteasas, aspartil-proteasas, metalo-proteasas, glutamil-proteasas o proteasas mixtas.
Se entiende por "catalasa" en Ia presente invención Ia enzima, cuyo número EC (Enzyme Commission number) es 1.11.1.6, y es capaz de catalizar la descomposición de peróxido de hidrógeno (H2O2) en agua (H2O) y oxígeno (O2).
A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Muestra Ia mortalidad acumulativa (media ± DE) de larvas de C. capitata a los 4 (barras blancas), 10 (barras grises) y 15 días (barras negras) causada por cultivos de B. pumilus TCC (cepa CECT 7462), B. pumilus M1 , B. pumilus M2 con y sin tratamiento de frío. Los datos son Ia media ± DE. n=48. Las diferencias significativas entre β. pumilus TCC y sus controles fueron evaluados mediante un ANOVA después de 15 días de iniciado el experimento (P < 0.01 ).
Figura 2. Muestra imágenes del cultivo de B. pumilus TCC en medio de esporulación T3, observado al Microscopio Electrónico de Transmisión. Fig. 2A: Imagen del cultivo de 58 h, con esporas y estructuras cristalinas en el medio. Fig. 2B: detalle de un cristal. Fig. 2C: célula mostrando una estructura cristalina en su interior (cultivo de 74 h).
Figura 3. Electroforesis en gel de agarosa (0.8%), del ADN extraído de varias cepas. Calle 1 : Marcador peso molecular (250 pares de bases a 12 kilobases); Calles 2, 3 y 4: B. pumilus TCC (distintas extracciones) Calle 5: 8. pumilus M1 ; Calle 6: B. pumilus M2; Calle 7: B. thuringiensis IPS 78/11 (curada de plásmido).
Figura 4. Muestra halos de digestión por actividad proteasa extracelular (determinada con caseína) de diversas cepas bacterianas transcurridas 24 h desde el comienzo del ensayo. Las cepas son de izquierda a derecha: Bacillus pumilus M2, Bacillus pumilus TCC, Bacillus pumilus M1 , Burkholderia cepacia, Escherichia coli, Pseudomonas putida, Bacillus subtilis y Bacillus cereus.
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar Ia naturaleza de Ia presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a Ia invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran Ia invención sin limitar el campo de aplicación de Ia misma.
EJEMPLO 1. Comparación de Ia toxicidad de CECT 7462 con otras cepas de B. pumilus frente larvas de C. capitata
La toxicidad de Ia cepa CECT 7462 (o TCC) frente a larvas de Ia mosca de Ia fruta del Mediterráneo, C. capitata se manifiesta cuando Ia bacteria se somete a bajas temperaturas. Para determinar si este efecto de Ia toxicidad frente a esta plaga es una característica de Ia cepa TCC o es un comportamiento general de esta especie se llevó a cabo el siguiente experimento con Ia cepa TCC, y las cepas de B. pumilus cepa 15 y cepa 17, proporcionadas por el grupo de Ia Dra. Calvo (Instituto del Agua, Universidad de Granada) (Uad et al., 2007. XXI Congreso Nacional de Microbiología. Sevilla. Spain), y nombradas en nuestros experimentos de ahora en adelante como M1 y M2 respectivamente. Se realizó un ensayo de toxicidad en dos condiciones distintas. En un caso se usaron las placas para el bioensayo inmediatamente después de mezclar los cultivos bacterianos con Ia dieta de larva, mientras que Ia otra fue mantenida durante 96 horas a 40C. Los resultados de los bioensayos se muestran en Ia Figura 1. Las larvas de C. capitata mostraron alto porcentaje de mortalidad en las placas de aquellos bioensayos con CECT 7462 que permanecieron 96 horas a 40C, mientras que en las que no tuvieron tratamiento de frío, mostraron una toxicidad baja. La toxicidad de las cepas B. pumilus M1 y M2 no superó el 40% en el mejor de los casos, indicando que Ia toxicidad de CECT 7462 parece ser una característica única de esta cepa y no una característica compartida con otras cepas de B. pumilus; las cepas B. pumilus M1 y M2 fueron usadas como controles negativos.
EJEMPLO 2. Relación de las bajas temperaturas con Ia toxicidad
Que Ia exposición del cultivo a bajas temperaturas, aumente Ia toxicidad de Ia cepa CECT 7462 induce a plantearse si este efecto se da únicamente a una temperatura de 40C o es Ia exposición general a bajas temperaturas Ia que provoca el aumento en Ia entomopatogenia hacia C. capitata. Con el fin de discernir cual de estas hipótesis es Ia correcta, se incubaron los cultivos durante 4 y 7 días, en los matraces de crecimiento, a dos diferentes temperaturas, 40C y -2O0C. Después de exponer los cultivos esporulados a estas temperaturas, fueron mezclados con Ia dieta de larvas y usados directamente en los bioensayos. En estos experimentos las larvas fueron colocadas en Ia dieta, tan pronto como Ia placa de bioensayo fue preparada. Los resultados de estos experimentos mostraron que 10 días después de iniciado el bioensayo, los cultivos de CECT 7462 que fueron mantenidos durante 96 horas a 40C y -2O0C causaron mayor mortalidad en larvas de C. capitata, alcanzando más del 90% y 80% respectivamente, mientras los cultivos de B. pumilus M1 y medio T3 no alcanzaron el 40% (Tabla 1 ).
Tabla 1 : Mortalidad a los 10 días (media ± DE) de larvas de C. capitata causada por CECT 7462 o sus controles B. pumilus M1 o medio de esporulación T3.
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Al comparar estos resultados con Ia mortalidad causada por cultivos de CECT 7462 que no fueron mantenidos a bajas temperaturas, se puede sugerir que Ia toxicidad de esta cepa se incrementa cuando los cultivos son expuestos a bajas temperaturas, demostrando definitivamente que las bajas temperaturas son las responsables del aumento de Ia toxicidad.
EJEMPLO 3. Observación de un cultivo de CECT 7462 bajo Microscopía Electrónica de Transmisión (MET).
B. pumilus, como cualquier especie del género Bacillus, posee dos tipos celulares dependiendo del ambiente. Cuando hay un exceso de nutrientes, las células se encuentran en fase vegetativa, mientras que cuando los nutrientes se agotan o existe algún agente adverso en el medio, Ia célula produce una forma de resistencia conocida con el nombre de espora. Con objeto de hacer una caracterización morfológica de cada una de las fases de crecimiento de Ia cepa CECT 7462, se realizó un seguimiento de un cultivo de B. pumilus a través de microscopía electrónica.
Una única colonia fue resuspendida en 2 mi de medio de esporulación T3 e incubada durante 72 h a 30° C. El cultivo se calentó 10 min. a 7O0C para eliminar células vegetativas. Posteriormente 50 mi de medio T3 se inocularon con 500 μl de un preinóculo tratado con calor, con objeto de sincronizar el cultivo. El cultivo se mantuvo a 3O0C en agitación a 240 rpm y se fue retirando periódicamente volúmenes de 500 μl a 0 h, 6 h, 11 h, 25 h, 29 h, 33 h, 36 h, 48 h, 58 h y 74 h. Todas estas muestras se fijaron y tiñeron para ser observadas al microscopio electrónico de transmisión (MET). Hasta las 11 horas el 90 % de Ia población presentó el aspecto típico de una célula vegetativa, presentando una longitud de entre 1 ,80- 1 ,95 mieras y un diámetro de 0,5 mieras. A partir de Ia hora 25 se observó Ia producción de esporas en el interior de Ia célula madre y a Ia hora 36 Ia liberación de esporas del esporangio. En las micrografías de 58 h y 74 h se observaron cuerpos geométricos con un tamaño similar al de una espora (Figura 2, flechas blancas) que recuerdan a las estructuras cristalinas tan frecuentes y características de B. thuringiensis. Dichas estructuras se observaron tanto en el medio (Figura 2A y 2B) como en el interior de Ia bacteria (Figura 2C).
EJEMPLO 4. Purificación de cristales producidos por CECT 7462
Las estructuras cristalinas observadas en el cultivo esporulado de CECT 7462 se asemejan a los cristales proteicos que produce B. thuringiensis cuando esporula, y que son responsables de su actividad entomopatógena. Dada esta similitud se decidió realizar una purificación de los cristales observados utilizando el mismo protocolo de purificación de proteínas Cry de B. thuringiensis (Thomas y Ellar, 1983. FEBS Lett.; 154:362-368). Para ello se preparó 500 mi de cultivo esporulado, 72 h a 3O0C a 240 rpm, en medio de esporulación T3. Posteriormente se Ie añadió 1 M de NaCI, y se incubó 12 horas a 40C. Para obtener un precipitado del cultivo se centrifugó 20 min. a 35.000 x g y posteriormente se realizaron tres lavados en 150 mi de PBS (Dulbecco and Vogt, 1954. J. Exp. Medie; 99:167-182). El precipitado resultante fue resuspendido en 2 mi de H2O MiIIi-Q. Seguidamente se preparó un gradiente de sacarosa usando tres soluciones cuyas concentraciones fueron 2,3 M, 2,1 M y 1 ,97 M. La suspensión bacteriana resuspendida en agua MiIIi-Q fue depositada sobre el gradiente y centrifugada 16 h a 54.000 x g. Tras Ia centrifugación se pudo observar una banda en Ia fracción de 2,1 M de sacarosa, en Ia parte superior del límite de Ia fracción de 2,3 M de sacarosa. Dicha banda se extrajo para su posterior purificación. Con el objetivo de eliminar Ia sacarosa, Ia banda seleccionada fue diluida 1 :4 en PBS y centrifugada a 35.000 x g. El pellet resultante se lavó con 20 mi de PBS usando las mismas condiciones de centrifugación. Finalmente, el pellet obtenido se resuspendió en 500 μl de MiIIi-Q. La muestra fue conservada a -2O0C.
La presencia de una banda en Ia misma fracción que en Ia que aparecen las toxinas Cry cuando son purificadas, indica que los cristales observados en el cultivo de CECT 7462 (Figura 2A) podrían tener una naturaleza similar a dichas toxinas. EJEMPLO 5. Detección de elementos extracromosómicos en CECT 7462
Frecuentemente las toxinas bacterianas, incluidas las que poseen propiedades insecticidas del tipo de las toxinas Cry, son de codificación plasmídica (de Maagd et al., 2003. Annu. Rev. Genet; 37:409-433; DeNap and Hergenrother, 2005. Org. Biomol. Chem.; 3:959-966). Con el fin de comprobar Ia posible presencia de estos elementos extracromosómicos (plásmidos y/o megaplásmidos) en Ia cepa CECT 7462, se siguió Ia metodología propuesta por Reyes-Ramírez y Ibarra (2008) (Reyes- Ramírez, and Ibarra. 2008. Appl. Environ. Microbio!.; 74:125-129) para Ia detección del patrón de plásmidos de B. thuringiensis, con algunas modificaciones. Brevemente, las cepas CECT 7462, B. pumilus M1 , B. pumilus M2, B. thuringiensis IPS 78/11 se cultivaron en 3 mi de medio LB durante toda Ia noche, y después se hizo una dilución 1 :50 en 50 mi de LB. Los cultivos se conservaron en agitación a 3O0C y 240 rpm hasta una densidad óptica a 600 nm de entre 0,5 a 1 ,1. Las células vegetativas fueron centrifugadas a 20.200 x g durante 15 minutos a 40C y cada pellet resuspendido en 20 mi de buffer TES (Tris base 30 mM, EDTA 5 mM, NaCI 50 mM; pH 8,0 ajustado con HCI 3M) previamente enfriado. Tras centrifugar las células bajo las mismas condiciones, el pellet fue resuspendido en 2 mi de buffer de lisis (20% sacarosa (p/v), 2 mg/ml lisozima y 1 μl/ml de RNasa a partir de una solución stock 10 mg/ml en buffer TES) e incubada a 370C durante 90 minutos o hasta que Ia formación de más del 90% de esferoplastos fue alcanzada y monitorizada bajo microscopio. La suspensión de esferoplastos fue suplementada con 3 mi de SDS al 8% (p/v) en buffer TES e incubada a 680C durante 10 minutos. Luego se añadieron 1 ,5 mi de acetato sódico 3M (pH 4,8) y Ia suspensión se incubó a -2O0C durante 30 minutos. La suspensión fue centrifugada a 20.200 x g durante 20 minutos a 40C o hasta que el sobrenadante quedó completamente translúcido. Dos volúmenes de etanol absoluto (frío previamente) fueron añadidos al sobrenadante e incubado toda Ia noche a -2O0C. El ADN fue centrifugado a 20.200 x g durante 20 minutos a 40C. Cada pellet fue resuspendido en 100 μl_ de Tris-EDTA (pH 8,0) (Tris-HCI 10 mM, EDTA 1 mM) y fue conservado a -2O0C hasta su posterior uso.
Con el fin de separar y visualizar el posible patrón de plásmidos para cada cepa analizada se realizó una electroforesis en gel de agarosa con 0,5 μg/ml de bromuro de etidio; para ello, 10 μL de Ia solución de ADN fue mezclada con 2 μl de tampón de carga, y depositada en un pocilio de gel de agarosa 0,8% (p/v) en tampón TBE y migró a 100 V durante 120-180 minutos. Se utilizo un Marcador de Peso Molecular de 250 bp a 12 kb (Stratagene, No. Cat. 201115).
En el gel de agarosa se observaron dos bandas, una por encima de Ia banda del ADN cromosómico, y otra de aproximadamente 6 kb en los carriles de CECT 7462 (Figura 3), indicando que esta cepa posee un megaplásmido y un plásmido. Estas bandas no se observaron en las cepas control, B. pumilus M1 , B. pumilus M2 y B. thuringiensis IPS 78/11. Dado que existe un plásmido y un megaplásmido presente en CECT 7462 y no en los controles M1 y M2, postulamos que el factor de virulencia podría estar presente en alguno de estos elementos extracromosomales.
EJEMPLO 6. Ensayo de Ia actividad proteasa extracelular utilizando caseína.
Diez microlitros de un cultivo líquido de 24 horas en LB (Medio Luria-
Bertani) se colocaron sobre placas de LB-agar suplementado con caseína al 2% (Barbosa et al., 2004. App. Environ. Microbio!.; 71 :968-978). Junto con CECT 7462 se usaron otras 8 especies bacterianas, tanto Gram negativas como positivas (Tabla 2).
Tabla 2: Resultados de Ia actividad proteasa en placas LB-agar suplementadas con Caseína o leche en polvo a las 24 o 48 horas. Medidas de los halos en mm.
Figure imgf000024_0001
Las placas se incubaron a 370C durante 24 y 48 horas, tiempos en los que se midieron los halos aparecidos (Figura 4). Posteriormente, se registró Ia distancia existente desde el borde de Ia colonia al extremo más alejado del halo (Tabla 2). CECT 7462 presentó el halo mayor en el ensayo, indicando que Ia producción de proteasa extracelular es superior que Ia de las otras cepas ensayadas.
EJEMPLO 7. Ensayo de Ia actividad proteasa extracelular utilizando leche en polvo.
Diez microlitros de un cultivo líquido de 24 horas en LB se colocaron sobre placas de LB-agar suplementado con leche en polvo al 2 % (Zaliha et al., 2007. J. Ind Microbiol. Biotechnol.; 34:509-517). Las placas se incubaron a 370C durante 24 y 48 horas, tiempos en los que se midieron los halos aparecidos. Posteriormente se registró Ia distancia existente desde el borde de Ia colonia al extremo más alejado del halo (Tabla 2).
EJEMPLO 8. Ensayo de actividad catalasa.
La actividad catalasa se ensayó en las cepas CECT 7462, B. pumilus M1 y B. thuringiensis 78/11. Para ello se tomó una colonia aislada de cada cepa con asa de siembra, y posteriormente se sumergió en una solución de H2O2 al 3%. (Barbosa et al., 2004. App. Environ. Microbio/.; 71 :968-978). La producción de burbujas (O2) en Ia solución fue interpretada como positivo para Ia actividad catalasa (Tabla 3).
TABLA 3: Actividad Catalasa de las diversas cepas testadas. (+): Formación de burbujas de oxígeno. ND: ensayo no determinado.
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Claims

REIVINDICACIONES
1. Cepa bacteriana CECT 7462 de Bacillus pumilus.
2. Composición que comprende Ia cepa bacteriana según Ia reivindicación 1.
3. Método para incrementar Ia patogenicidad de Ia cepa CECT 7462 de B. pumilus que comprende exponer Ia cepa a temperaturas inferiores a 250C.
4. Método para incrementar Ia patogenicidad según Ia reivindicación 3 donde Ia exposición se realiza a temperaturas inferiores a 150C.
5. Método para incrementar Ia patogenicidad según Ia reivindicación 4 donde Ia exposición se realiza a temperaturas iguales o inferiores a 40C.
6. Método para incrementar Ia patogenicidad según Ia reivindicación 5 donde Ia exposición se realiza a temperaturas inferiores a -80C.
7. Método para incrementar Ia patogenicidad según Ia reivindicación 6 donde Ia exposición se realiza a temperaturas iguales o inferiores a -2O0C.
8. Método para incrementar Ia patogenicidad de Ia cepa CECT 7462 de B. pumilus según cualquiera de las reivindicaciones 3 ó 4 donde Ia exposición se realiza entre 20C y 60C.
9. Método para incrementar Ia patogenicidad de Ia cepa CECT 7462 de
B. pumilus según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6 donde Ia exposición se realiza entre -180C y -220C.
10. Método para incrementar Ia patogenicidad según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 9 donde el tiempo de exposición es de, al menos, 24 horas.
11. Método para incrementar Ia patogenicidad según Ia reivindicación 10 donde el tiempo de exposición es de, al menos, 48 horas.
12. Método para incrementar Ia patogenicidad según Ia reivindicación 11 donde el tiempo de exposición es de, al menos, 96 horas.
13. Método para incrementar Ia patogenicidad según Ia reivindicación 12 donde el tiempo de exposición es de, al menos, 132 horas.
14. Método para incrementar Ia patogenicidad según Ia reivindicación 13 donde el tiempo de exposición es de, al menos, 168 horas.
15. Cepa bacteriana obtenible a partir de Ia cepa CECT 7462 por el método según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 14.
16. Estructuras cristalinas obtenibles a partir de Ia cepa según Ia reivindicación 15.
17. Composición que comprende Ia cepa bacteriana o las estructuras cristalinas según cualquiera de las reivindicaciones 15 o 16.
18. Uso de Ia cepa bacteriana según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 15 para el control biológico de plagas.
19. Uso de las estructuras cristalinas según Ia reivindicación 16 para el control biológico de plagas.
20. Uso de Ia composición según cualquiera de las reivindicaciones 2 o 17 para el control biológico de plagas.
21. Uso de Ia cepa bacteriana, de las estructuras cristalinas o de Ia composición, según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, donde Ia plaga es de organismos pertenecientes a alguno de los órdenes de Ia lista que comprende: Lepidoptera, Coleóptera, Himenoptera, Hemiptera, Homoptera, Mallophaga, Orthoptera o
Díptera.
22. Uso de Ia cepa bacteriana, de las estructuras cristalinas o de Ia composición según Ia reivindicación 21 , donde Ia plaga es de organismos pertenecientes al orden Díptera.
23. Uso de Ia cepa bacteriana, de las estructuras cristalinas o de Ia composición según Ia reivindicación 22, donde Ia plaga es de mosca de Ia fruta del Mediterráneo (C. capitata).
24. Uso de Ia cepa bacteriana o Ia composición que Ia comprende según cualquiera de reivindicaciones 1 ó 2, para Ia producción de bioinsecticidas.
25. Uso de Ia cepa bacteriana, de las estructuras cristalinas o de Ia composición según cualquiera de reivindicaciones 15 a 17, para Ia producción de bioinsecticidas.
26. Uso de Ia cepa bacteriana, de las estructuras cristalinas o de Ia composición según Ia reivindicación 25, donde el bioinsecticida actúa sobre al menos un organismos perteneciente a alguno de los órdenes de Ia lista comprende: Lepidoptera, Coleóptera, Himenoptera, Hemiptera, Homoptera, Mallophaga, Orthoptera o
Díptera.
27. Uso de Ia cepa bacteriana, de las estructuras cristalinas o de Ia composición según Ia reivindicación 26, donde el organismo sobre el que actúa es del orden Díptera.
28. Uso de Ia cepa bacteriana, de las estructuras cristalinas o de Ia composición según Ia reivindicación 27, donde el organismo del orden Díptera es Ia mosca de Ia fruta del Mediterráneo (C. capitata).
29. Secuencia nucleotídica aislada de Ia cepa CECT 7462 que codifica para una proteína entomopatógena.
30. Plásmido obtenible a partir de Ia cepa CECT 7462 que comprende al menos una secuencia nucleotídica que codifica para una proteína entomopatógena.
31. Uso de Ia cepa bacteriana según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 15 para Ia producción de enzimas.
32. Uso de Ia cepa bacteriana según Ia reivindicación 30 donde Ia enzima es una proteasa o Ia catalasa.
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