CN114958682A

CN114958682A - 仁诺吉伯克霍尔德氏菌在制备诱导植物或其种子产生系统抗性的产品中的应用

Info

Publication number: CN114958682A
Application number: CN202210699707.0A
Authority: CN
Inventors: 曹鸿一; 梁锏文; 孙玉婷; 康品; 刘仁燕; 王科晶; 王琳; 朱瑞娟
Original assignee: Moon Guangzhou Biotech Co ltd
Current assignee: Moon Guangzhou Biotech Co ltd
Priority date: 2022-06-20
Filing date: 2022-06-20
Publication date: 2022-08-30

Abstract

本发明公开了仁诺吉伯克霍尔德氏菌在制备诱导植物或其种子产生系统抗性的产品中的应用，涉及生物技术领域。本发明提出并验证了保藏号为GDMCC No：61156的仁诺吉伯克霍尔德氏菌能够诱导植物或其种子产生系统抗性，比如，对诱导植物或其种子对线虫产生系统抗性，提升植物对线虫的防御能力，抗线虫侵入；同时，可诱导植物抑制线虫的发育和繁殖，从多方面达到防治线虫的功效。

Description

仁诺吉伯克霍尔德氏菌在制备诱导植物或其种子产生系统抗性的产品中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及仁诺吉伯克霍尔德氏菌在制备诱导植物或其种子产生系统抗性的产品中的应用。

背景技术

诱导系统抗性(induce systemic resistance,ISR)又称植物免疫，是指植物在物理化学或生物的诱导因子刺激下，通过激活植物自身的免疫系统并调节自身的新陈代谢，从而使植物本身产生能抵抗病害和逆境的性能。由于具有抗菌谱广、对环境友好安全、不易产生抗药性、作用时间长久等优点，ISR及与之相关的植物免疫诱抗剂(又称植物抗病激活剂)正成为农药开发中的新研究热点。专利CN105112340B中公开了一株苏云金芽孢杆菌Sneb1076对大豆种子具有诱导抗性活性，可诱导大豆在种子萌发期和生长期产生对大豆胞囊线虫的抗性；又如赵丹研究发现了5株可诱导番茄抗南方根结线虫的生防菌株，即蜡样芽孢杆菌Sneb560、枯草芽孢杆菌Sneb815、恶臭假单胞菌Sneb821、荧光假单胞菌Sneb825、变形斑沙雷氏菌Sneb851(赵丹，假单胞菌诱导番茄抗根结线虫的机理研究，沈阳农业大学.2018)。

虽然，关于生防菌株诱导植株对线虫产生系统抗性的研究正逐渐增多，但涉及的生防菌属仍主要集中在芽孢杆菌属Bacillus和假单胞菌属Pseudomonas。这可能是由于ISR的产生与诱导因子(活菌体、培养液、菌体提取物或病毒等)、宿主植物有关，并且在特定情况下还依赖于侵袭宿主的病原体种类；且诱导抗性的产生与否与诱导因子、植株和病害之间的关系目前并无规律可循，无法预期特定菌属的哪些菌株能有效诱导何种植株对何种病原体产生系统抗性(“ISR meets SAR outside:additive action of the endophyteBacillus pumilus INR7 and the chemical inducer,benzothiadiazole,on inducedresistance against bacterial spot in field-growth pepper”“Induced SystemicResistance and Promotion of Plant Growth by Bacillus spp.”)。

伯克霍尔德菌属(Burkholderia)是变形菌纲的beta分支，由60多种物种组成，栖息在不同的生态位。一些伯克霍尔德菌种类具有丰富的功能，如促进作物生长，作为潜在的生物防治产品，也可用于土壤或地下水的生物修复处理。此外，一些伯克霍尔德菌还可分泌多种具有蛋白溶解、脂溶和溶血活性的胞外酶和嗜铁素。伯克霍尔德菌属下物种Burkholderia rinojensis是2013年通过正式发表认定的物种，其发现时间较短，相关研究更是非常有限，通过PubMed检索发现，仅有五篇文献，涉及的主题包括：Burkholderiarinojensis用于杀虫和杀螨；罗米地辛对伯克霍尔德氏菌(Burkholderia rinojensis)生物农药除草活性的贡献；而检索专利库发现，专利CN103261398A中公布了一株伯克霍尔德氏菌(Burkholderia rinojensis)A396菌株(模式菌株)，其对脊椎动物无已知的致病性，且对真菌、线虫等具有农药活性，可利用该菌株及其天然代谢产物防治多种昆虫、真菌病害、杂草和线虫。专利CN113980877A中也公开了一株仁诺吉伯克霍尔德氏菌(Burkholderiarinojensis)菌株M928，其对根结线虫、黄瓜立枯病等具有良好防效，其防效亦与M928产生的高活性代谢产物如细胞毒素、脂肽类抗生素等有关。目前关于伯克霍尔德氏菌属防治线虫的作用机理研究仍聚焦在具有杀线虫活性的代谢产物对线虫的直接毒杀这一方面。

经过检索发现专利WO0051435A1中提及具有促生和诱导植物产生系统抗性的组合物，组合物中的植物根际促生菌(PGPR)能诱导植物对特定病原菌产生系统抗性，实施例中公开的数据仅显示枯草芽孢杆菌菌株GB03、解淀粉芽孢杆菌菌株IN937a和几丁质组合物(LS213)能诱导番茄植株对致病疫霉(Phytophthora infestans)病原菌产生抗性以及诱导黄瓜植株对丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)病原菌产生抗性，对于线虫活性的控制是通过包含有几丁质的组合物来发挥作用，并无实际实验数据以及机理分析验证伯克霍尔德菌属下菌株能直接诱导植株产生抗性。

化药杀虫具有易引起环境污染，残留毒性，且维持时间效果短的缺陷；通过研究微生物菌株诱导植株对特定病原体产生系统抗性的能力，尤其是研究伯克氏菌属下物种Burkholderia rinojensis诱导植株对线虫产生系统抗性的能力，一方面为Burkholderiarinojensis的深入研究与应用提供支撑，另一方面为更好将ISR对于线虫的防治防效的作用机制应用在实际农作物生产过程中，带来不引起诸如环境污染，残留毒性，同时维持长时间的防治效果等有重要意义。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供仁诺吉伯克霍尔德氏菌在制备诱导植物或其种子产生系统抗性的产品中的应用。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明实施例提供了仁诺吉伯克霍尔德氏菌(Burkholderiarinojensis)和/或其代谢物在制备诱导植物或其种子产生系统抗性的产品中的应用，所述仁诺吉伯克霍尔德氏菌的保藏号为GDMCC No：61156。

第二方面，本发明实施例提供了仁诺吉伯克霍尔德氏菌和/或其代谢物在诱导植物或其种子产生系统抗性中的应用，所述仁诺吉伯克霍尔德氏菌的保藏号为GDMCC No：61156。

第三方面，本发明实施例提供了一种诱导植物或其种子产生系统抗性的产品，其包括：仁诺吉伯克霍尔德氏菌、仁诺吉伯克霍尔德氏菌培养液、仁诺吉伯克霍尔德氏菌发酵液和仁诺吉伯克霍尔德氏菌上清液中的至少一种，以及其他用于诱导植物或其种子产生系统抗性的试剂；其中，所述仁诺吉伯克霍尔德氏菌的保藏号为GDMCC No：61156。

第四方面，本发明实施例提供了一种诱导植物或种子产生系统抗性、促进植物根系发育的方法，对植物或种子施用如前述实施例所述的产品。

第五方面，本发明实施例提供了仁诺吉伯克霍尔德氏菌和/或其代谢物在制备杀虫的产品中的应用。

本发明具有以下有益效果：

本申请的发明人提出并验证了保藏号为GDMCC No：61156的仁诺吉伯克霍尔德氏菌能够诱导植物或其种子产生系统抗性，比如，诱导植物或其种子对线虫产生系统抗性，提升植物对线虫的防御能力，抵抗线虫侵入；同时，其可诱导植物抑制线虫的发育和繁殖，从多方面达到防治线虫的功效。另一方面，M928对植株根系发育的促进作用，提升了线虫侵入根系的难度，从而提高了根系对线虫的物理防御能力。

此外，M928发酵时间短，能快速产品化，经济、社会效益显著。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为M928菌株24h发酵液及其上清液对植株根系的影响；

图2为M928诱导番茄植株对根结线虫产生系统抗性的裂根试验设计示意图；

图3为裂根试验中各处理组植株根系发育效果图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

为测试伯克霍尔德氏菌属下不同物种菌株间的杀线虫效果，发明人从慕恩生物自有菌株库内选出了除M928(保藏号为GDMCC No：61156)之外的伯克霍尔德氏菌属下另外27株菌株进行防线虫能力体外测试，这27株菌株分别是Burkholderia cepacia 11株，Burkholderia vietnamiensis 10株，Paraburkholderia tropica 5株，Paraburkholderiabannensis 1株。测试结果表明，除M928菌株之外的其他27株菌株对线虫的24h体外致死率仅为50％左右，远远低于M928菌株的杀线虫能力。

申请人根据现有报道及在该领域积累的相关经验，初步判定M928菌株的高效防治线虫能力是多种作用机制共同作用的结果。即，其除了与已公开的M928能分泌高杀线虫活性代谢产物有关之外，还存在其他作用机理的协同增效。为进一步确认其可能存在的防治线虫的作用机制而开展研究，并提出本发明：伯克氏菌M928具有诱导植株对根结线虫产生系统抗性的能力，该机制能提升植株对线虫的防御能力，抗线虫侵入；同时可诱导植株抑制线虫的发育与繁殖，从而多方面达到防治根结线虫的功效。同时，在裂根试验中进一步验证了M928具有促进植株根系发育和植株生长的作用。

进一步对M928进行的基因组序列进行分析发现，M928具有杀虫蛋白序列，是M928对线虫毒力作用的一个因素，M928不仅可以获得嗜铁素等代谢产物，具有诱导植物产生ISR的作用机制，还能够代谢产生防治线虫的杀虫蛋白；多种作用机理表明，M928对防治线虫具有协同增效的作用机制，具有显著的防治效果，经实验验证以及农户的大田使用验证，M928对线虫具有突出的防治效果。

具体地，本发明实施例提供了仁诺吉伯克霍尔德氏菌及其代谢物在制备诱导植物或其种子产生系统抗性的产品中的应用，所述仁诺吉伯克霍尔德氏菌的保藏号为GDMCCNo：61156，菌株的具体信息可参照专利名称为“一种复配微生物菌剂及其制备方法”，申请公布号为“CN 113980877 A”的专利。

相对于其他伯克霍尔德氏菌，M928能够更加有效地诱导植物或其种子产生系统抗性。

在一些实施例中，所述系统抗性包括：植物或其种子对线虫、细菌性病害和真菌性病害中的至少一种所产生的抗性。

优选地，所述线虫包括根结线虫(Meloidogyne spp.)和秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)中的至少一种。

优选地，所述根结线虫包括南方根结线虫(M.incognita)，北方根结线虫(M.hapla)，花生根结线虫(M.arenaria)和爪哇根结线虫(M.javanica)中的至少一种。

本文所述的“植物”包括各种阶段的植物，各个阶段包括种子萌发期、幼苗生长期、壮苗发育期、成苗开花期和种子形成期，在一些实施例中，植物可以是树苗，在另一些实施例中也可以指生长发育后的植株。

在一些实施例中，所述植物包括蔬菜和果树，具体包括但不限于小白菜，葫芦科作物(比如黄瓜、丝瓜、西瓜、哈密瓜等)，豆科(芸豆，豆角等)，茄科(番茄、茄子等)，葡萄和火龙果中的至少一种。

在一些实施例中，所述产品的类型为试剂或试剂盒。在一些实施例中，所述产品还包括使用说明书，说明书中限定的步骤可以同后续任意实施例所述的诱导植物或其种子产生系统抗性的方法。

M928菌株相较于化学杀线剂有着显著的促进根系生长的作用，具有良好的护根养根效果。在一些实施例中，所述产品包括：植物免疫诱抗剂、种子免疫诱抗剂、拌种剂、浸种剂、种子包衣剂、促根剂、生物农药和生物肥料中的至少一种。所述产品剂型选自悬浮剂、水分散粒剂、颗粒剂、粉剂和原药中的任意一种。可选地，所述粉剂为可湿性粉剂。

在一些实施例中，所述制备包括以下步骤：培养和/或发酵所述仁诺吉伯克霍尔德氏菌，以获得仁诺吉伯克霍尔德氏菌培养液和/或仁诺吉伯克霍尔德氏菌发酵液。

在一些实施例中，所述培养和/或所述发酵的时间为12～72h，具体可以为12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h、26h、28h、30h、32h、34h、36h、38h、40h、42h、44h、46h、48h、50h、52h、54h、56h、58h、60h、62h、64h、66h、68h、70h、72h中的任意一种或任意两种之间的范围。在一些实施例中，所述培养和/或所述发酵的时间为24～72h；更优选为24h，每毫升发酵液中有效活菌数为(1.2～3.0)×10⁹。培养和发酵的温度为20～35℃，具体可以为20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、35℃中的任意一种或任意两种之间的范围，优选为28℃。

在一些实施例中，所述仁诺吉伯克霍尔德氏菌培养液和/或仁诺吉伯克霍尔德氏菌发酵液中的有效活菌数为12～30亿/mL。

在一些实施例中，所述仁诺吉伯克霍尔德氏菌培养液和/或仁诺吉伯克霍尔德氏菌发酵液的OD₆₀₀＝1。

本发明实施例提供并验证了一种合适的培养条件，在短时培养(24h)时，仁诺吉伯克霍尔德氏菌即可产生足够多的杀线虫活性物质，且其活性物质能在基本脱离活菌的状态下发挥理想的生防效果，适于工业化。

需要说明的是，本发明对培养和/或发酵仁诺吉伯克霍尔德氏菌的培养基没有特殊限定，可选用现有对应菌株的培养基，只要适用于仁诺吉伯克霍尔德氏菌生长的培养基，均可达到本文所述的技术效果。

在一些实施例中，所述制备还包括：对所述仁诺吉伯克霍尔德氏菌培养液和/或所述仁诺吉伯克霍尔德氏菌发酵液进行离心，以获得上清液；

在一些实施例中，所述离心的条件为：7000～9000rpm，1～20min。离心的转速具体可以为7000rpm、7200rpm、7400rpm、7600rpm、7800rpm、8000rpm、8200rpm、8400rpm、8600rpm、8800rpm、9000rpm中的任意一种或任意两种之间的范围，优选为8000rpm。离心的时间具体可以为1min、2min、4min、6min、8min、10min、12min、14min、16min、18min、20min中的任意一种或任意两种之间的范围，优选为10min。

本发明实施例还提供了仁诺吉伯克霍尔德氏菌和/或其代谢物在诱导植物或其种子产生系统抗性中的应用，所述仁诺吉伯克霍尔德氏菌的保藏号为GDMCC No：61156。

在一些实施例中，所述植物或其种子以及系统抗性如前述任意实施例所述，不再赘述。

在一些实施例中，所述诱导植物或其种子产生系统抗性的方法包括：采用目标试剂对植物进行：直接浇灌、浸根处理、对其种子进行拌种和对种子进行包衣处理中的至少一种处理；其中，所述目标试剂包括：仁诺吉伯克霍尔德氏菌、仁诺吉伯克霍尔德氏菌培养液、仁诺吉伯克霍尔德氏菌发酵液、仁诺吉伯克霍尔德氏菌上清液、含仁诺吉伯克霍尔德氏菌的产品、含仁诺吉伯克霍尔德氏菌培养液的产品、含仁诺吉伯克霍尔德氏菌发酵液的产品和含仁诺吉伯克霍尔德氏菌上清液的产品中的至少一种。

在一些实施例中，所述仁诺吉伯克霍尔德氏菌培养液、仁诺吉伯克霍尔德氏菌发酵液或对应的上清液由如前述任意实施例所述的培养、发酵或离心制备获得。

本文中的“拌种”是植物种苗处理的一种方法，在实际应用中有狭义和广义两种意义上的拌种：狭义的拌种是指将种子与农药或微肥等在一起拌和，使种子表面均匀地沾上一层农药或微肥的方法；广义的拌种除上述内容外，还包括浸种、闷种、浸根、蘸根等种苗处理方法。

在一些实施例中，对植物的种子进行包衣处理时，所述目标试剂包括含仁诺吉伯克霍尔德氏菌发酵液的产品，所述含仁诺吉伯克霍尔德氏菌发酵液的产品包括体积比为1：(8～10)的仁诺吉伯克霍尔德氏菌发酵液和常规种衣剂；可选地，该体积比具体可以为1：8、1：8.5、1：9、1：9.5、1：10中的任意一种或任意两种之间的范围，优选为1：9。

在一些实施例中，进行包衣处理时，所述种衣菌剂和种子的体积质量比为1：(40～60)，该质量比具体可以为1：40、1：42、1：44、1：46、1：48、1：50、1：52、1：54、1：56、1：58、1：60中的任意一种或任意两种之间的范围，优选为1：50。

本发明实施例还提供了一种诱导植物或其种子产生系统抗性的产品，其包括：仁诺吉伯克霍尔德氏菌、仁诺吉伯克霍尔德氏菌培养液、仁诺吉伯克霍尔德氏菌发酵液和仁诺吉伯克霍尔德氏菌上清液中的至少一种，以及其他用于诱导植物或其种子产生系统抗性的试剂；其中，所述仁诺吉伯克霍尔德氏菌的保藏号为GDMCC No：61156。可以理解的是，系统抗体、植物或其种子、发酵液、培养液和上清液均可同前述任意实施例所述，不再赘述。

在一些实施例中，当产品为诱导种子产生系统抗性的产品时，所述其他用于诱导植物或其种子产生系统抗性的试剂包括常规种衣剂。

本发明实施例对常规种衣剂的种类没有特殊限定，本领域技术人员可基于技术常识进行选择。

本发明实施例还提供了前述实施例所述的仁诺吉伯克霍尔德氏菌(Burkholderiarinojensis)M928和/或其代谢物在制备用于杀虫的产品中的应用。

在一些实施例中，所述虫是指农业害虫，用于杀虫的产品可以为防治农业害虫的药物。虫优选为线虫目昆虫，进一步优选为秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)、南方根结线虫(M.incognita)、北方根结线虫(M.hapla)，花生根结线虫(M.arenaria)和爪哇根结线虫(M.javanica)中的至少一种。

优选地，所述代谢物包括杀虫蛋白，所述杀虫蛋白包括氨基酸序列如SEQ ID No.1～13所示蛋白中的至少一种。在一些实施例中，所述制备包括：从仁诺吉伯克霍尔德氏菌(Burkholderia rinojensis)的代谢物中提取前述实施例所述的杀虫蛋白。

本发明实施例提供了一种杀虫蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.1～13中任一项所示。本发明实施例提供的杀虫蛋白对于秀丽隐杆线虫和根结线虫具有很高的毒性，具有显著的防治效果。根结线虫的具体指代同前述任意实施例所述，不再赘述。

本发明实施例还提供了一种分离的核酸，其编码如前述实施例所述的杀虫蛋白。

本发明实施例还提供了一种载体，其含有如前述实施例所述的分离的核酸。在一些实施例中，载体为表达载体。“表达载体”指一种DNA构建物，它含有的DNA序列与能使DNA在合适宿主中表达的合适的控制序列操作性相连。这些控制序列包括实现转录的启动子、控制该转录的任选的操纵子序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列，以及控制转录和翻译终止的序列。载体可以是质粒、噬菌体颗粒、或简单地是潜在的基因组插入物。在某些场合，“质粒”和“载体”有时可互换使用，因为质粒是目前最常用的载体形式。一旦转化到合适宿主中，该载体能不依赖于宿主基因组进行复制和起作用，或在一些情况下，其本身整合入基因组中。

本发明实施例还提供了一种宿主细胞，其含有前述实施例所述的载体。

在一些实施例中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。可作为宿主进行表达的哺乳动物细胞表达系统是本领域中已知的，其包括许多从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的无限增殖细胞系，包括但不局限于，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、海拉细胞、乳仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(如Hep G2)和其它许多细胞系。

本发明实施例还提供了如前述实施例所述的杀虫蛋白的制备方法，其包括培养前述实施例所述的宿主细胞，以获得所述杀虫蛋白；或，培养M928，提取获得所述杀虫蛋白。

本发明实施例还提供前述实施例所述的杀虫蛋白、分离的核酸、载体或宿主细胞在制备用于杀虫的产品中的应用。

本发明提供的杀虫蛋白及其编码基因，生物活性测定表明上述杀虫蛋白、杀虫基因对农业害虫，尤其是对于秀丽隐杆线虫和根结线虫具有很高的毒性。表明上述杀虫蛋白及其编码基因可用于农业害虫的防治。

本发明实施例还提供了一种组合物，其活性成分包括氨基酸序列如SEQ ID No.1～13中至少一项所示的蛋白。

在一些实施例中，所述活性成分还可以包括其他现有用于杀虫的成分，比如，市售的杀虫剂。在另一些实施例中，所述组合物还可以包括前述任意实施例所述的：分离的核酸、载体、宿主细胞、仁诺吉伯克霍尔德氏菌、仁诺吉伯克霍尔德氏菌发酵液和仁诺吉伯克霍尔德氏菌上清液中的至少一种。

本发明实施例还提供了前述实施例所述的分离的核酸在转化植物中的应用。

此外，本发明实施例还提供了前述任意实施例所述的杀虫蛋白或前述任意实施例所述的载体或前述任意实施例所述载体或前述任意实施例所述的宿主细胞在生物防治中的应用。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

M928菌株发酵液的制备。

取M928菌株经活化、接种后，用LB液体培养基将种子液OD₆₀₀值调至1.0。将OD₆₀₀为1的1mL种子液接种于LB液体培养基，在28℃摇床，200rpm，振荡培养，获得发酵培养物。培养时间分别为24h，48h和72h。(LB液体培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 5g，补水至1L，分装200mL培养基于500mL三角瓶中，121℃高压蒸汽灭菌20分钟)。

实施例2

M928发酵液上清液的制备。

将实施例1中制备的M928菌株发酵液经8000rpm离心10min后，获得菌株发酵液上清液。

实施例3

M928菌株发酵液对根结线虫的体外致死效果。

实验共设置4个实验组，分别为发酵液处理组，上清液处理组，阳性对照组和空白对照组。

取实施例1和2中培养24h的M928菌株发酵液(OD₆₀₀＝1.0)及其上清液，分别作为发酵液处理组和上清液处理组处理液；阳性对照组的处理液为5％阿维菌素乳油，加1500倍量清水稀释，空白对照组为清水。每个处理5个孔，重复3次。分别向24孔细胞培养板中加入450μL处理液和50μL线虫悬浮液(100条线虫二龄幼虫)，室温下静置。24h时，在体视显微镜下观察并记录二龄幼虫的死亡情况，并计算校正死亡率。判断标准：僵直不动的为死虫，弯曲蠕动的为活虫。24h时，用1mol/mL NaOH溶液刺激各处理中的线虫后，计数仍然僵直或者无变化的线虫数，并计算24h校正死亡率。校正死亡率(％)＝(处理组线虫死亡率-对照组线虫死亡率)/(1-对照组线虫死亡率)×100％。

表1 M928菌株24h发酵液及其上清液杀线虫效果

试验/处理	发酵液-24h	上清液-24h	阿维菌素	无菌水对照
					重复1	100.00％	100.00％	100.00％	1.00％
重复2	100.00％	98.20％	100.00％	0.00％
					重复3	100.00％	99.10％	100.00％	0.50％
校正死亡率(％)	100.00％	99.10％	100.00％	-

M928菌株24h发酵液及其上清液对根结线虫毒力效果见表1，M928菌株24h发酵液及其上清液与阿维菌素对根结线虫都有较好的致死效果。M928菌株24h发酵液和阿维菌素稀释液处理根结线虫二龄幼虫24h后，根结线虫校正死亡率为100％；其对应上清液处理根结线虫二龄幼虫24h后，根结线虫校正死亡率为99.10％。结果表明M928菌株24h发酵液和上清液均具有对根结线虫二龄幼虫强毒杀作用，M928菌株短时发酵(24h)后便可分泌具有杀线虫活性的胞外代谢产物，适于工业化应用。

实施例4

伯克氏菌M928菌株对黄瓜根结线虫的盆栽体内实验防治效果及对根系的促生效果。

实施例3已验证M928菌株短时培养后(24h)的发酵液和上清液在体外具有理想的杀线虫能力，为确保其作用到植株体内时仍具有理想防治效果，特设定8个实验组，分别为3个发酵液处理组，3个上清液处理组，阳性对照组和空白对照组。取实施例1和实施例2中三组不同培养时间(24h、48h、72h)的M928菌株发酵液(OD₆₀₀＝1.0)和M928菌株上清液分别作为3个发酵液处理组和3个上清液处理组的处理液，阳性对照组的处理液为阿维菌素，5％阿维菌素乳油加1500倍量清水稀释，空白对照组为清水。每个处理10株苗，重复3次，即每个实验组共30株黄瓜苗。试验数据用Excel 2019和SPSS 22.0软件进行基本计算和统计分析，差异显著性分析采用Duncan's新复极差法，显著水平设置为P<0.05。

将黄瓜种子(品种：粤秀3号)播种到灭菌的基质土中育苗。至第一片真叶长出时，移苗至装有灭菌基质土的塑料钵(7cm*7cm*10cm)中，待黄瓜幼苗长至两片真叶，在幼苗土壤中浇灌15mL相应的处理液，1天后，接种根结线虫二龄幼虫，每株接种300条，在室温下正常管理，并在接种线虫30天后检测根结数量，计算各处理组对根结线虫的防治效果。试验数据用Excel 2019和SPSS 22.0软件进行基本计算和统计分析，差异显著性分析采用Duncan's新复极差法，显著水平设置为P<0.05。

防治效果计算公式：根结减退率(％)＝(对照根结数-处理根结数)/对照根结数×100％。

表2不同处理根结数量及防治效果

处理	根结数(个/株)	根结减退率
			水	80.17±18.00a	-
阿维菌素	27.33±2.74b	65.25％
			发酵液-24h	33.33±10.76b	58.93％
上清液-24h	27.61±6.79b	64.37％
			发酵液-48h	36.94±14.31b	53.02％
上清液-48h	29.11±16.71b	63.16％
			发酵液-72h	39.50±32.20b	54.70％
上清液-72h	27.61±12.00b	66.17％

通过表2所示试验结果可以看出，一方面，M928菌株发酵液及上清液在体内仍具有理想的防治根结线虫的效果，且其防效(根结减退率为53.02-66.17％)与阳性对照组相比(根结减退率65.25％)无显著差异(P＜0.05)，说明在统计学上，M928菌株发酵液及含有其发酵代谢物的上清液均可达到与化学杀线剂相同的防治效果。另一方面，M928菌株不同培养时间的发酵液和上清液处理组之间，在根结数和根结减退率的表现上无显著差异(P＜0.05)，进一步验证了M928菌株在短时间内(24h)即可产生足够多的杀线虫活性物质，且该物质在可在基本脱离活菌(上清液组)的状态下稳定发挥效果。因此，在工业应用上，将M928培养时间缩短至24h，大大缩减了生产所需时间，极大提高了生产效率和工业产值，社会经济效益显著。

由图1可知，M928菌株(培养24h)处理的植株根系不仅根结少且长势旺盛，而阿维菌素处理的植株根系上虽然根结较少，但根系明显不及M928处理的植株发达，说明M928菌株在生长过程中不但会不断产生杀线虫活性代谢产物，还会分泌丰富的营养物质，在保护植株根系不受线虫侵染的同时促进植株根系发育，而化药的痛点恰恰就在于无法兼顾防病和促进根系生长两个方面。

实施例5

裂根法证明M928菌株可以诱导番茄植株对线虫产生系统抗性。

基于实施例3-4的发现，M928菌株发酵液及其代谢产物均具有较高杀线虫活性，但其具体作用机制尚不明了，为进一步确认其除了具备代谢产物防治线虫的机制外，可能存在的其他防治线虫的作用机制而设计了本实施例。该实施例证明了M928菌株发酵液具有诱导作物产生根结线虫系统抗性的能力。

实验设置发酵液处理组和空白对照组。取实施例1中M928菌株24h发酵液(OD₆₀₀＝1.0)，加50倍量清水稀释，作为发酵液处理组，空白对照组为清水。每个处理10株苗，重复3次，每组共30株番茄苗。试验数据用Excel 2019和SPSS 22.0软件进行基本计算和统计分析，差异显著性分析采用Duncan's新复极差法，显著水平设置为P<0.05。

将番茄种子(新星101)播种到育苗盘，置于28℃温室中，待番茄长出两片真叶后，将番茄幼苗根系平均分为两部分(即为挑战根系(左)和应答根系(右))，分别植入两个相邻的盆中。待番茄幼苗移栽7d后，对挑战根系进行浇灌处理，每盆浇灌100mL处理液。浇灌处理24h后在应答根系幼苗根系附近打1个2cm深的小孔，加入虫卵悬浮液，每株接种3000个卵(图2)。接种虫卵40天后，观察记录植株根系的根结数，并计算根结减退率，以此评价供试处理诱导植物产生的根结线虫抗性。

表3 M928发酵液对番茄诱导抗性盆栽测试结果

通过表3所示试验可以看出，清水对照组接种线虫一侧根系的根结数为233.73个/株，M928菌株发酵液处理根结数为129.78个/株，相较于清水对照组显著降低(P＜0.05)。此组实验中，M928发酵液直接浇灌于挑战根系侧，与接种线虫的应答根系完全分开，而其应答根系侧相较对照组的根结减退率仍然可达44.47％，证明了M928发酵液可通过诱导番茄植株对根结线虫产生系统抗性而发挥防治线虫的作用。

此外，通过图3所示实验照片不难看出，浇灌M928发酵液一侧的番茄根系(挑战根系)明显比清水处理及同一番茄植株的应答根系生长更加旺盛。

实施例6

种子包衣试验验证M928诱导植株对线虫产生系统抗性的能力及诱导稳定性。

为验证M928诱导系统抗性的能力及诱导稳定性，进一步对黄瓜种子进行包衣处理进行试验，并以未经包衣的黄瓜种子和LB液体培养液包衣的黄瓜种子为对照，每组处理10颗种子，试验重复三次。

常规种衣剂制备：

常规种衣剂配方：蔗糖5％，PVPK30 10％，PEG 3％，分散剂MF 2％，聚乙二醇5％。各组分按照质量分数进行配比。

试验用种衣菌剂的制备：

取50mL离心管，先按上述比例加入PVPK30和少量水，振荡溶解，再按比例加入其它试剂，溶解完全，定容，即得所需常规种衣剂。再按1：9(v/v)的比例取M928菌株24h发酵液(OD₆₀₀＝1.0)和常规种衣剂混匀后制得种衣菌剂。

种子包衣验证试验：

将黄瓜种子进行表面消毒处理后，用无菌水冲洗3-5次，将制备好的种衣菌剂按照1：50(v/w)进行种子包衣处理，无菌条件下晾干种子后，将种子播种到离心管中(1颗/管)，以未经包衣的黄瓜种子和LB液体培养液包衣的黄瓜种子为对照组，至黄瓜长出1片真叶时，在植株根系附近打出1-2cm的小孔，每株接种2000个根结线虫卵，温室中培养，按时浇水。接种14天后，调查植株地上部鲜重、地上部干重和病情等级。

病情等级分级指标(参考NYT 1857.8-2010黄瓜主要病害抗病性鉴定技术规程)：

病情等级	症状描述
		0	没有根结
1	0％<有根结的根数占总根系<10％
		2	10％≤有根结的根数占总根系<25％
3	25％≤有根结的根数占总根系<50％
		4	50％≤有根结的根数占总根系<75％
5	75％≤有根结的根数占总根系≤100％

表4种子包衣测试结果

通过表4所示结果可知，与未包衣处理和仅用培养基对种子进行包衣处理的实验组相比，M928发酵液对种子进行包衣处理后，可显著降低植株病情指数，防治效果可达5385％。进一步验证了M928菌株诱导植株对线虫产生系统抗性的能力、诱导的稳定性、及该作用机制的长效性。另外，M928菌株发酵液进行包衣处理的种子，其植株发育情况较好，植株干重增长率高达9913％。而在实际应用中，防治根结线虫的最根本目的在于缓解作物发病情况，保证作物的质量和产量，从这一角度而言，M928发酵液有着化学药剂难以企及的促生、保质、增产效果，同时又因为具备防治线虫的多重作用机制，从而保证了其防治线虫的高效性、稳定性和持久性。

实施例7：基因组测序和杀虫蛋白分析

采用高通量Illumina测序技术对仁诺吉伯克霍尔德氏菌(Burkholderiarinojensis)M928菌株的基因组DNA进行Paired-End测序，对样品500bp文库依次采用下列步骤对原始数据进行处理：1)截取read1的1bp-90bp，截取read2的1bp-90bp；2)去除质量值连续≤20的碱基数达到一定程度的reads(默认40％，设置为20个；3)去除含N的碱基数目总和达到一定比例的reads(默认10％，设置为4bp)；4)去除adapter污染(默认adapter序列与read序列有15bp的overlap，设置为15bp)；5)去除duplication污染；6)过滤小片段污染。拼接获得的相互部分重叠的基因组连续片段。逐步把它们拼接形成序列更长的重叠群，直到得到完整序列的过程称为重叠群组装，对处理后的reads数据进行组装，经多次调整后得到最优的组装结果。

获得仁诺吉伯克霍尔德氏菌(Burkholderia rinojensis)M928菌株的基因组序列。基因组序列进一步使用RAST软件(https：//rast.nmpdr.org/)和本地blast注释(设置参数evalue＜1e-5，identity＞40，coverage＞40)，M928菌株基因组中具有杀虫潜力的基因如表5所示，发现多个杀虫蛋白(杀虫基因)，包括氨基酸序列SEQ NO.1、SEQ ID NO.2。

通过对仁诺吉伯克霍尔德氏菌(Burkholderia rinojensis)物种下的已知的菌株的基因组序列进行分析(NCBI上能获取的基因组序列)及蛋白预测，本发明涉及的杀虫蛋白序列并未在该物种的其他菌株(如A396模式菌株)中发现，表明M928具备杀虫蛋白序列，M928的杀虫蛋白表达使得其具有相对于物种下的其他菌株更优的对线虫毒杀作用。

表5杀虫蛋白

MNID

qseqid

sseqid

gene

pident

M928中的基因id

蛋白长度

M928

M928_02011

P9WQB7

ahpC

4837

＞M928_02011 Alkyl hydroperoxide reductase C

182

M928

M928_02012

Q0AKM4

ahpD

40.698

＞M928__02012 Alkyl hydroperoxide reductase AhpD

175

M928

M928_02264

Q6DUC1

dmpA

41.441

＞M928_02264 Beta-peptidyl aminopeptidase BapA

360

M928

M928_01888

Q2SWD9

hfq

98.734

＞M928_01888 RNA-bining protein Hfq

80

M928

M928_01679

Q5F9R5

hfq

58.929

＞MN217651_01679 RNA-binding protein Hfq

189

M928

M928_01003

Q939D2

katG

86.951

＞M928_01003 Catalase-peroxidase

728

M928

M928_02317

P76077

paaA

66.34

＞M928_02317 1，2-phenylacetyl-CoA epoxidase，subunit A

332

M928

M928_02318

P76078

paaB

64.516

＞M928_02318 1，2-phenylacetyl-CoA epoxidase，subunit B

94

M928

M928_02319

P76079

paaC

45.174

＞M928_02319 1，2-phenylacetyl-CoA epoxidase，subunit C

267

M928

M928_02320

P76080

paaD

48.521

＞M928_02320 Putative 1，2-phenylacetyl-CoA epoxidase，subunit

182

M928

M928_02321

P76081

paaE

45.938

＞M928_02321 1，2-phenylacetyl-CoA epoxidase，subunit E

395

M928

M928_00504

P04739

pilA

45.833

＞M928_00504 hypothetical protein

198

M928

M928_00582

Q9KD10

sodA

52.764

＞M928_00582 Superoxide dismutase[Fe]

192

杀虫蛋白氨基酸序列SEQ ID NO.1如下所示：

MSNKGQLLQDPFLNALRKEHVPVSIYLVNGIKLQGNIESFDQYVVLLRNTVTQMVYKHAISTVVPARPVNFHPDAETASS；

杀虫蛋白氨基酸序列SEQ ID NO.2如下所示：

MSTEAKCPFNHTANSGSSNKDWWPNQLNLNILHRHSSLSDPMDKDFDYAEAFKKLDFAALKRDLNALMTLSQDWWPADFGHYGGLFIRMAWHSAGTYRTADGRGGAGSGQQRFAPLNSWPDNGNLDKARRLLWPIKQKYGRNISWADLMILAGNVALESMGFKTFGFAGGRPDTWEPDDVYWGAEKIWLELSGGPNTRYTGDRVLENPLAAVQMGLIYVNPEGPDGNPDPVAAARDIRETFARMAMNDEETVALIAGGHTFGKTHGAGPASNVGPEPEAAPLEAQGLGWKSRYGTGKGADAITSGLEVVWTTTPTQWSNDYFAHLFGYEWELTKSPAGAHQWVAKGADAVIPDPFDPSKKRLPTMLTTDLSLRFDPAYEKIARRFYENPDQFADAFARAWFKLTHRDMGPRARYLGPEVPAEQLLWQDPIPAVDHALIDEQDIAALKGKILASGLSVSQLVSTAWASASTFRGSDKRGGVNGARIRFSPQKDWEVNQPAQLGNVLETLEGIRTAFNDAQTGGKKVSLADLIVLAGGAGVEQAAKNAGHDVKVPFAPGRMDASQAQTDVAAMAVLEPLADGFRNYVKGKYTIPAETLLVDKAQLLTLTAPEMTVLVGGLRVLGANVGQSRHGVFTDRPEALTNDFFVNLLDMGTEWKPASAANDVYEGRDRATGQVKWTGTRVDLVFGSHSQLRALAEVYGSTDAQAKFVRDFVAAWNKVMNLDRFDLA；

杀虫蛋白氨基酸序列SEQ ID NO.3如下所示：

MAHTLPPLPYAEDALVPHISLETIQYHYGKHHQTYVTNLNNLIPGTEFENLSLEEIVKKSSGGVFNNAAQIWNHTFFWNSLSPNGGGAPTGALGDAINAKWGSYDAFKEAFTKAAVGTFGSGWAWLVKKADGSLDIVSTSNAATPLTTADKPLLTIDVWEHAYYIDYRNARPKFVEAFWNIVNWDFAAKNFA；

杀虫蛋白氨基酸序列SEQ ID NO.4如下所示：

MKTVGDKLEAFTVVAAKPGFNNHEENGQSAFETITEASFPGKWKIIYFYPKDFTFVCPTEIVEFAKLTKQFEERDAILLGGSSDNEFVKLAWRREHKDLNKLNHYSFGDVKGELIDQLGVRDKEAGVALRATFVVDPDNTIQHVSINNLNVGRNTDEILRILDGLQTDELCPCNRAVGGSTL；

杀虫蛋白氨基酸序列SEQ ID NO.5如下所示：

MEFIDSIKARIPDYAKDIRLNLDGTISRSSLEGNDAVGVALAAAFAAKSTVLVKAIREAGVLSPEETNAALTAAALMGMNNAWYPYVEMADDADLKTQRAELRMGAYASHGGVDKRRFEMYALAASIVGKCHFCVQSHYALLKSEQGMTVTQLRDVGRIASVINAAAQVIAAEGE；

杀虫蛋白氨基酸序列SEQ ID NO.6如下所示：

MHDGSTLFGASRGGVLPAGPRGTIADVLGVTVGHSTLDDGPVQTGVTVVKPHPGDVYRSKVPAGAAVINGFGKSVGLVQIDELGVLDTPIALTNTFGVGAVSQAQIRAAIAANPQIGRDWPTVNPLVCECNDGYLNDIQALAVTVAHYDEACRAASRDVARGAVGAGRGMSCFDLKGGIGSASRIAVAAERPYTVGALVLANFGRLSMLTLGGVPVGRIAAGRAAAARSVPPEQGSIIMLLATDAPLDARQLTRLARRAAVGLARTGSVYGHGSGDIALAFSTAYTIAHDARHVALPALLADGMLDPLFLAAAESVEHAIVDALLQAVTVVGRDGHVRHALRDAIPDLDSLLDAASATRS；

杀虫蛋白氨基酸序列SEQ ID NO.7如下所示：

MYTQSLDIPGNVAPLDAAADLPEQARFDAVIAADGKIEPQDWMPDAYRKTLVRQISQHAHSEVVGMLPEGNWISRAPSLKRKAILLAKVQDEAGHGLYLYSAAETLGVSRDALIDALHAGKAKYSSIFNYPTPTWADVGVIGWLVDGAAIMNQIPLCRCTYGPYARAMIRVCKEESFHQRQGFDALLSMMKGSDAQRAMVQQAVNRWWWPVLMMFGPSDADSVHSNQSAKWGIKRITNDDLRQKFVDATVEQAKVLGVTLPDPDLKWDEARGHYDYGVIDWEEFWRVVNGDGPCNKERLATRVKAHEDGAWVREAALAHEAKRRARAEQRAA；

杀虫蛋白氨基酸序列SEQ ID NO.8如下所示：

MNNEWPIWEVFVRSKQGLDHKHCGSLHAADASMALRMARDVYTRRQEGVSIWVVPSAAITASDPNEKAELFEPAGDKIYRHPTFYTLPDEVNHM；

杀虫蛋白氨基酸序列SEQ ID NO.9如下所示：

MTITPEHLSYVLRLADNALILGQRNAEWCGHGPILEEDIALTNMSLDLIGQARMLYSHAADLERRLTGHSKTEDDYAYFRTEREFANFTLAELPHYGPVSGNAHADKDYAVTIVRNFLYTTLMLHVWTALESSADATLAAIAAKSVKETRYHVHHAREWLVRLGDGTDESHRRAQAALDYLMPYTRECFAADQVDNAIAARGIGPAPASLEAAWRADVNDALAEATLAPPSPAQHVTTGKQGEHSEHMGYLLAEMQSLARQHPGATW；

杀虫蛋白氨基酸序列SEQ ID NO.10如下所示：

MSVPTAASAPHRADPLLARAWDVLEAVPDPEIPVVSIRELGILRDVRRADDGLLEVVITPTYSGCPAMSQIAEDIAAAMQQAGLPPHRVETVLAPAWTTDWITQEARDKLRAYGIAPPVGQCGDAAPRENVVRFVPRPVAAPACPRCGSARTERLAQFASTACKALYRCVDCREPFDYFKPY；

杀虫蛋白氨基酸序列SEQ ID NO.11如下所示：

MKQPPRSLCSLGGAKPPHPPEADPSLTAARRGPAAIPQFHPLRIRDVRPETADAVTVSFEVPPELRDAYRFTQGQFVTLKVHIDGEEMRRSYSICVGTTDYDRDGELRIGIKRVRGGRFSNFAFDTLKPGHTIDVMTPDGRFFTHLNAEHGKEYVAFSGGSGITPVLAIIKTTLELEPRSTFTLIYGNRSVDAIMFAEELEDLKNRYMNRFVLYHVLSDDVQDVELFNGVLDQAKCAAFLDTLLPADSIDEAFICGPAPMMDAAEAALEAAGVPRTKVHVERFGTPLPQAGAPAVEITDATPAADLEIVLDGKKRKLRLPYEGVSLLDVGLRAGLALPYACKGGVCCTCRAKVLEGEVRMEKNYTLEAQEVKDGFVLTCQCHPVSDKVVVSFDER；

杀虫蛋白氨基酸序列SEQ ID NO.12如下所示：

MANPAESHPQNDFINSARKERKRVEIYLVNGIRLTGCIESFDQYLVMLRTPVGLQGIYKRAISTIQLDTGGSRPGGGGGSRGPRTGGGPGGGRSGGREGGGHGPYGSHGGPRGDGGYASREPRGDGGYAPREPRGDGGYAPREPRESYGAPRDTGEPSGAPSTPAEPRSGNSNGPVIVTRRRRIVPDSQ；

杀虫蛋白氨基酸序列SEQ ID NO.13如下所示：

MFEAFSVSLFRRLAAGMRDARRPALRWPSGGFTLIELMIVLAIVGVVAAYAVPAYQDYVARSRVGEGLALAAPARLVVADNVASGADLAGGYSAPVATRNVESVTIDDETGQISVVFTARVAAAGANTLVLVPSAPDKADTPTARVALKKGVTQAGAIAWECFAAGKTASSLPAPGAGPLPTAAATLPAKYAPAECRA。

实施例8：杀虫蛋白对根结线虫毒性测定

将本发明实施例7中的杀虫基因克隆表达及制备纯化，将表达得到的杀虫蛋白溶于PBS缓冲液中，然后稀释成8个浓度进行生物活性测定，将表达得到的杀虫蛋白分别对秀丽隐杆线虫、南方根结线虫、北方根结线虫、花生根结线虫和爪哇根结线虫进行毒性测定；根据实施例3的方式获得杀虫蛋白对根结线虫的体外致死效果，经过实验发现，本发明的杀虫蛋白对根结线虫幼虫有很好的杀虫活性，校正死亡率达到60％～100％。

本发明提供的杀虫蛋白及其杀虫基因，生物活性测定表明上述杀虫蛋白、杀虫基因对秀丽隐杆线虫和根结线虫具有很高的毒性。表明上述杀虫蛋白和杀虫基因可用于农业害虫的防治。

对M928进行的基因组序列进行分析，发现M928含有杀虫蛋白的基因，表达杀虫蛋白，是M928对线虫毒力作用的一个因素。经研究发现，M928不仅可以产生嗜铁素等代谢产物，还具备诱导植物或其种子产生ISR的作用机制，此外，M928代谢物中含有具备高毒力的杀虫蛋白，多种作用机理协同增效，使得M928能够有效地防治线虫，其效果显著优于其他大多数同种菌对于线虫的防治效果，经实验验证以及农户的大田使用验证，M928对线虫具有突出的防治效果。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 慕恩（广州）生物科技有限公司

<120> 仁诺吉伯克霍尔德氏菌在制备诱导植物或其种子产生系统抗性的产品中的应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 80

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ser Asn Lys Gly Gln Leu Leu Gln Asp Pro Phe Leu Asn Ala Leu

1 5 10 15

Arg Lys Glu His Val Pro Val Ser Ile Tyr Leu Val Asn Gly Ile Lys

20 25 30

Leu Gln Gly Asn Ile Glu Ser Phe Asp Gln Tyr Val Val Leu Leu Arg

35 40 45

Asn Thr Val Thr Gln Met Val Tyr Lys His Ala Ile Ser Thr Val Val

50 55 60

Pro Ala Arg Pro Val Asn Phe His Pro Asp Ala Glu Thr Ala Ser Ser

65 70 75 80

<210> 2

<211> 728

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Ser Thr Glu Ala Lys Cys Pro Phe Asn His Thr Ala Asn Ser Gly

1 5 10 15

Ser Ser Asn Lys Asp Trp Trp Pro Asn Gln Leu Asn Leu Asn Ile Leu

20 25 30

His Arg His Ser Ser Leu Ser Asp Pro Met Asp Lys Asp Phe Asp Tyr

35 40 45

Ala Glu Ala Phe Lys Lys Leu Asp Phe Ala Ala Leu Lys Arg Asp Leu

50 55 60

Asn Ala Leu Met Thr Leu Ser Gln Asp Trp Trp Pro Ala Asp Phe Gly

65 70 75 80

His Tyr Gly Gly Leu Phe Ile Arg Met Ala Trp His Ser Ala Gly Thr

85 90 95

Tyr Arg Thr Ala Asp Gly Arg Gly Gly Ala Gly Ser Gly Gln Gln Arg

100 105 110

Phe Ala Pro Leu Asn Ser Trp Pro Asp Asn Gly Asn Leu Asp Lys Ala

115 120 125

Arg Arg Leu Leu Trp Pro Ile Lys Gln Lys Tyr Gly Arg Asn Ile Ser

130 135 140

Trp Ala Asp Leu Met Ile Leu Ala Gly Asn Val Ala Leu Glu Ser Met

145 150 155 160

Gly Phe Lys Thr Phe Gly Phe Ala Gly Gly Arg Pro Asp Thr Trp Glu

165 170 175

Pro Asp Asp Val Tyr Trp Gly Ala Glu Lys Ile Trp Leu Glu Leu Ser

180 185 190

Gly Gly Pro Asn Thr Arg Tyr Thr Gly Asp Arg Val Leu Glu Asn Pro

195 200 205

Leu Ala Ala Val Gln Met Gly Leu Ile Tyr Val Asn Pro Glu Gly Pro

210 215 220

Asp Gly Asn Pro Asp Pro Val Ala Ala Ala Arg Asp Ile Arg Glu Thr

225 230 235 240

Phe Ala Arg Met Ala Met Asn Asp Glu Glu Thr Val Ala Leu Ile Ala

245 250 255

Gly Gly His Thr Phe Gly Lys Thr His Gly Ala Gly Pro Ala Ser Asn

260 265 270

Val Gly Pro Glu Pro Glu Ala Ala Pro Leu Glu Ala Gln Gly Leu Gly

275 280 285

Trp Lys Ser Arg Tyr Gly Thr Gly Lys Gly Ala Asp Ala Ile Thr Ser

290 295 300

Gly Leu Glu Val Val Trp Thr Thr Thr Pro Thr Gln Trp Ser Asn Asp

305 310 315 320

Tyr Phe Ala His Leu Phe Gly Tyr Glu Trp Glu Leu Thr Lys Ser Pro

325 330 335

Ala Gly Ala His Gln Trp Val Ala Lys Gly Ala Asp Ala Val Ile Pro

340 345 350

Asp Pro Phe Asp Pro Ser Lys Lys Arg Leu Pro Thr Met Leu Thr Thr

355 360 365

Asp Leu Ser Leu Arg Phe Asp Pro Ala Tyr Glu Lys Ile Ala Arg Arg

370 375 380

Phe Tyr Glu Asn Pro Asp Gln Phe Ala Asp Ala Phe Ala Arg Ala Trp

385 390 395 400

Phe Lys Leu Thr His Arg Asp Met Gly Pro Arg Ala Arg Tyr Leu Gly

405 410 415

Pro Glu Val Pro Ala Glu Gln Leu Leu Trp Gln Asp Pro Ile Pro Ala

420 425 430

Val Asp His Ala Leu Ile Asp Glu Gln Asp Ile Ala Ala Leu Lys Gly

435 440 445

Lys Ile Leu Ala Ser Gly Leu Ser Val Ser Gln Leu Val Ser Thr Ala

450 455 460

Trp Ala Ser Ala Ser Thr Phe Arg Gly Ser Asp Lys Arg Gly Gly Val

465 470 475 480

Asn Gly Ala Arg Ile Arg Phe Ser Pro Gln Lys Asp Trp Glu Val Asn

485 490 495

Gln Pro Ala Gln Leu Gly Asn Val Leu Glu Thr Leu Glu Gly Ile Arg

500 505 510

Thr Ala Phe Asn Asp Ala Gln Thr Gly Gly Lys Lys Val Ser Leu Ala

515 520 525

Asp Leu Ile Val Leu Ala Gly Gly Ala Gly Val Glu Gln Ala Ala Lys

530 535 540

Asn Ala Gly His Asp Val Lys Val Pro Phe Ala Pro Gly Arg Met Asp

545 550 555 560

Ala Ser Gln Ala Gln Thr Asp Val Ala Ala Met Ala Val Leu Glu Pro

565 570 575

Leu Ala Asp Gly Phe Arg Asn Tyr Val Lys Gly Lys Tyr Thr Ile Pro

580 585 590

Ala Glu Thr Leu Leu Val Asp Lys Ala Gln Leu Leu Thr Leu Thr Ala

595 600 605

Pro Glu Met Thr Val Leu Val Gly Gly Leu Arg Val Leu Gly Ala Asn

610 615 620

Val Gly Gln Ser Arg His Gly Val Phe Thr Asp Arg Pro Glu Ala Leu

625 630 635 640

Thr Asn Asp Phe Phe Val Asn Leu Leu Asp Met Gly Thr Glu Trp Lys

645 650 655

Pro Ala Ser Ala Ala Asn Asp Val Tyr Glu Gly Arg Asp Arg Ala Thr

660 665 670

Gly Gln Val Lys Trp Thr Gly Thr Arg Val Asp Leu Val Phe Gly Ser

675 680 685

His Ser Gln Leu Arg Ala Leu Ala Glu Val Tyr Gly Ser Thr Asp Ala

690 695 700

Gln Ala Lys Phe Val Arg Asp Phe Val Ala Ala Trp Asn Lys Val Met

705 710 715 720

Asn Leu Asp Arg Phe Asp Leu Ala

725

<210> 3

<211> 192

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Ala His Thr Leu Pro Pro Leu Pro Tyr Ala Glu Asp Ala Leu Val

1 5 10 15

Pro His Ile Ser Leu Glu Thr Ile Gln Tyr His Tyr Gly Lys His His

20 25 30

Gln Thr Tyr Val Thr Asn Leu Asn Asn Leu Ile Pro Gly Thr Glu Phe

35 40 45

Glu Asn Leu Ser Leu Glu Glu Ile Val Lys Lys Ser Ser Gly Gly Val

50 55 60

Phe Asn Asn Ala Ala Gln Ile Trp Asn His Thr Phe Phe Trp Asn Ser

65 70 75 80

Leu Ser Pro Asn Gly Gly Gly Ala Pro Thr Gly Ala Leu Gly Asp Ala

85 90 95

Ile Asn Ala Lys Trp Gly Ser Tyr Asp Ala Phe Lys Glu Ala Phe Thr

100 105 110

Lys Ala Ala Val Gly Thr Phe Gly Ser Gly Trp Ala Trp Leu Val Lys

115 120 125

Lys Ala Asp Gly Ser Leu Asp Ile Val Ser Thr Ser Asn Ala Ala Thr

130 135 140

Pro Leu Thr Thr Ala Asp Lys Pro Leu Leu Thr Ile Asp Val Trp Glu

145 150 155 160

His Ala Tyr Tyr Ile Asp Tyr Arg Asn Ala Arg Pro Lys Phe Val Glu

165 170 175

Ala Phe Trp Asn Ile Val Asn Trp Asp Phe Ala Ala Lys Asn Phe Ala

180 185 190

<210> 4

<211> 182

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Met Lys Thr Val Gly Asp Lys Leu Glu Ala Phe Thr Val Val Ala Ala

1 5 10 15

Lys Pro Gly Phe Asn Asn His Glu Glu Asn Gly Gln Ser Ala Phe Glu

20 25 30

Thr Ile Thr Glu Ala Ser Phe Pro Gly Lys Trp Lys Ile Ile Tyr Phe

35 40 45

Tyr Pro Lys Asp Phe Thr Phe Val Cys Pro Thr Glu Ile Val Glu Phe

50 55 60

Ala Lys Leu Thr Lys Gln Phe Glu Glu Arg Asp Ala Ile Leu Leu Gly

65 70 75 80

Gly Ser Ser Asp Asn Glu Phe Val Lys Leu Ala Trp Arg Arg Glu His

85 90 95

Lys Asp Leu Asn Lys Leu Asn His Tyr Ser Phe Gly Asp Val Lys Gly

100 105 110

Glu Leu Ile Asp Gln Leu Gly Val Arg Asp Lys Glu Ala Gly Val Ala

115 120 125

Leu Arg Ala Thr Phe Val Val Asp Pro Asp Asn Thr Ile Gln His Val

130 135 140

Ser Ile Asn Asn Leu Asn Val Gly Arg Asn Thr Asp Glu Ile Leu Arg

145 150 155 160

Ile Leu Asp Gly Leu Gln Thr Asp Glu Leu Cys Pro Cys Asn Arg Ala

165 170 175

Val Gly Gly Ser Thr Leu

180

<210> 5

<211> 175

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Met Glu Phe Ile Asp Ser Ile Lys Ala Arg Ile Pro Asp Tyr Ala Lys

1 5 10 15

Asp Ile Arg Leu Asn Leu Asp Gly Thr Ile Ser Arg Ser Ser Leu Glu

20 25 30

Gly Asn Asp Ala Val Gly Val Ala Leu Ala Ala Ala Phe Ala Ala Lys

35 40 45

Ser Thr Val Leu Val Lys Ala Ile Arg Glu Ala Gly Val Leu Ser Pro

50 55 60

Glu Glu Thr Asn Ala Ala Leu Thr Ala Ala Ala Leu Met Gly Met Asn

65 70 75 80

Asn Ala Trp Tyr Pro Tyr Val Glu Met Ala Asp Asp Ala Asp Leu Lys

85 90 95

Thr Gln Arg Ala Glu Leu Arg Met Gly Ala Tyr Ala Ser His Gly Gly

100 105 110

Val Asp Lys Arg Arg Phe Glu Met Tyr Ala Leu Ala Ala Ser Ile Val

115 120 125

Gly Lys Cys His Phe Cys Val Gln Ser His Tyr Ala Leu Leu Lys Ser

130 135 140

Glu Gln Gly Met Thr Val Thr Gln Leu Arg Asp Val Gly Arg Ile Ala

145 150 155 160

Ser Val Ile Asn Ala Ala Ala Gln Val Ile Ala Ala Glu Gly Glu

165 170 175

<210> 6

<211> 360

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Met His Asp Gly Ser Thr Leu Phe Gly Ala Ser Arg Gly Gly Val Leu

1 5 10 15

Pro Ala Gly Pro Arg Gly Thr Ile Ala Asp Val Leu Gly Val Thr Val

20 25 30

Gly His Ser Thr Leu Asp Asp Gly Pro Val Gln Thr Gly Val Thr Val

35 40 45

Val Lys Pro His Pro Gly Asp Val Tyr Arg Ser Lys Val Pro Ala Gly

50 55 60

Ala Ala Val Ile Asn Gly Phe Gly Lys Ser Val Gly Leu Val Gln Ile

65 70 75 80

Asp Glu Leu Gly Val Leu Asp Thr Pro Ile Ala Leu Thr Asn Thr Phe

85 90 95

Gly Val Gly Ala Val Ser Gln Ala Gln Ile Arg Ala Ala Ile Ala Ala

100 105 110

Asn Pro Gln Ile Gly Arg Asp Trp Pro Thr Val Asn Pro Leu Val Cys

115 120 125

Glu Cys Asn Asp Gly Tyr Leu Asn Asp Ile Gln Ala Leu Ala Val Thr

130 135 140

Val Ala His Tyr Asp Glu Ala Cys Arg Ala Ala Ser Arg Asp Val Ala

145 150 155 160

Arg Gly Ala Val Gly Ala Gly Arg Gly Met Ser Cys Phe Asp Leu Lys

165 170 175

Gly Gly Ile Gly Ser Ala Ser Arg Ile Ala Val Ala Ala Glu Arg Pro

180 185 190

Tyr Thr Val Gly Ala Leu Val Leu Ala Asn Phe Gly Arg Leu Ser Met

195 200 205

Leu Thr Leu Gly Gly Val Pro Val Gly Arg Ile Ala Ala Gly Arg Ala

210 215 220

Ala Ala Ala Arg Ser Val Pro Pro Glu Gln Gly Ser Ile Ile Met Leu

225 230 235 240

Leu Ala Thr Asp Ala Pro Leu Asp Ala Arg Gln Leu Thr Arg Leu Ala

245 250 255

Arg Arg Ala Ala Val Gly Leu Ala Arg Thr Gly Ser Val Tyr Gly His

260 265 270

Gly Ser Gly Asp Ile Ala Leu Ala Phe Ser Thr Ala Tyr Thr Ile Ala

275 280 285

His Asp Ala Arg His Val Ala Leu Pro Ala Leu Leu Ala Asp Gly Met

290 295 300

Leu Asp Pro Leu Phe Leu Ala Ala Ala Glu Ser Val Glu His Ala Ile

305 310 315 320

Val Asp Ala Leu Leu Gln Ala Val Thr Val Val Gly Arg Asp Gly His

325 330 335

Val Arg His Ala Leu Arg Asp Ala Ile Pro Asp Leu Asp Ser Leu Leu

340 345 350

Asp Ala Ala Ser Ala Thr Arg Ser

355 360

<210> 7

<211> 332

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Met Tyr Thr Gln Ser Leu Asp Ile Pro Gly Asn Val Ala Pro Leu Asp

1 5 10 15

Ala Ala Ala Asp Leu Pro Glu Gln Ala Arg Phe Asp Ala Val Ile Ala

20 25 30

Ala Asp Gly Lys Ile Glu Pro Gln Asp Trp Met Pro Asp Ala Tyr Arg

35 40 45

Lys Thr Leu Val Arg Gln Ile Ser Gln His Ala His Ser Glu Val Val

50 55 60

Gly Met Leu Pro Glu Gly Asn Trp Ile Ser Arg Ala Pro Ser Leu Lys

65 70 75 80

Arg Lys Ala Ile Leu Leu Ala Lys Val Gln Asp Glu Ala Gly His Gly

85 90 95

Leu Tyr Leu Tyr Ser Ala Ala Glu Thr Leu Gly Val Ser Arg Asp Ala

100 105 110

Leu Ile Asp Ala Leu His Ala Gly Lys Ala Lys Tyr Ser Ser Ile Phe

115 120 125

Asn Tyr Pro Thr Pro Thr Trp Ala Asp Val Gly Val Ile Gly Trp Leu

130 135 140

Val Asp Gly Ala Ala Ile Met Asn Gln Ile Pro Leu Cys Arg Cys Thr

145 150 155 160

Tyr Gly Pro Tyr Ala Arg Ala Met Ile Arg Val Cys Lys Glu Glu Ser

165 170 175

Phe His Gln Arg Gln Gly Phe Asp Ala Leu Leu Ser Met Met Lys Gly

180 185 190

Ser Asp Ala Gln Arg Ala Met Val Gln Gln Ala Val Asn Arg Trp Trp

195 200 205

Trp Pro Val Leu Met Met Phe Gly Pro Ser Asp Ala Asp Ser Val His

210 215 220

Ser Asn Gln Ser Ala Lys Trp Gly Ile Lys Arg Ile Thr Asn Asp Asp

225 230 235 240

Leu Arg Gln Lys Phe Val Asp Ala Thr Val Glu Gln Ala Lys Val Leu

245 250 255

Gly Val Thr Leu Pro Asp Pro Asp Leu Lys Trp Asp Glu Ala Arg Gly

260 265 270

His Tyr Asp Tyr Gly Val Ile Asp Trp Glu Glu Phe Trp Arg Val Val

275 280 285

Asn Gly Asp Gly Pro Cys Asn Lys Glu Arg Leu Ala Thr Arg Val Lys

290 295 300

Ala His Glu Asp Gly Ala Trp Val Arg Glu Ala Ala Leu Ala His Glu

305 310 315 320

Ala Lys Arg Arg Ala Arg Ala Glu Gln Arg Ala Ala

325 330

<210> 8

<211> 94

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Met Asn Asn Glu Trp Pro Ile Trp Glu Val Phe Val Arg Ser Lys Gln

1 5 10 15

Gly Leu Asp His Lys His Cys Gly Ser Leu His Ala Ala Asp Ala Ser

20 25 30

Met Ala Leu Arg Met Ala Arg Asp Val Tyr Thr Arg Arg Gln Glu Gly

35 40 45

Val Ser Ile Trp Val Val Pro Ser Ala Ala Ile Thr Ala Ser Asp Pro

50 55 60

Asn Glu Lys Ala Glu Leu Phe Glu Pro Ala Gly Asp Lys Ile Tyr Arg

65 70 75 80

His Pro Thr Phe Tyr Thr Leu Pro Asp Glu Val Asn His Met

85 90

<210> 9

<211> 267

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Met Thr Ile Thr Pro Glu His Leu Ser Tyr Val Leu Arg Leu Ala Asp

1 5 10 15

Asn Ala Leu Ile Leu Gly Gln Arg Asn Ala Glu Trp Cys Gly His Gly

20 25 30

Pro Ile Leu Glu Glu Asp Ile Ala Leu Thr Asn Met Ser Leu Asp Leu

35 40 45

Ile Gly Gln Ala Arg Met Leu Tyr Ser His Ala Ala Asp Leu Glu Arg

50 55 60

Arg Leu Thr Gly His Ser Lys Thr Glu Asp Asp Tyr Ala Tyr Phe Arg

65 70 75 80

Thr Glu Arg Glu Phe Ala Asn Phe Thr Leu Ala Glu Leu Pro His Tyr

85 90 95

Gly Pro Val Ser Gly Asn Ala His Ala Asp Lys Asp Tyr Ala Val Thr

100 105 110

Ile Val Arg Asn Phe Leu Tyr Thr Thr Leu Met Leu His Val Trp Thr

115 120 125

Ala Leu Glu Ser Ser Ala Asp Ala Thr Leu Ala Ala Ile Ala Ala Lys

130 135 140

Ser Val Lys Glu Thr Arg Tyr His Val His His Ala Arg Glu Trp Leu

145 150 155 160

Val Arg Leu Gly Asp Gly Thr Asp Glu Ser His Arg Arg Ala Gln Ala

165 170 175

Ala Leu Asp Tyr Leu Met Pro Tyr Thr Arg Glu Cys Phe Ala Ala Asp

180 185 190

Gln Val Asp Asn Ala Ile Ala Ala Arg Gly Ile Gly Pro Ala Pro Ala

195 200 205

Ser Leu Glu Ala Ala Trp Arg Ala Asp Val Asn Asp Ala Leu Ala Glu

210 215 220

Ala Thr Leu Ala Pro Pro Ser Pro Ala Gln His Val Thr Thr Gly Lys

225 230 235 240

Gln Gly Glu His Ser Glu His Met Gly Tyr Leu Leu Ala Glu Met Gln

245 250 255

Ser Leu Ala Arg Gln His Pro Gly Ala Thr Trp

260 265

<210> 10

<211> 182

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Met Ser Val Pro Thr Ala Ala Ser Ala Pro His Arg Ala Asp Pro Leu

1 5 10 15

Leu Ala Arg Ala Trp Asp Val Leu Glu Ala Val Pro Asp Pro Glu Ile

20 25 30

Pro Val Val Ser Ile Arg Glu Leu Gly Ile Leu Arg Asp Val Arg Arg

35 40 45

Ala Asp Asp Gly Leu Leu Glu Val Val Ile Thr Pro Thr Tyr Ser Gly

50 55 60

Cys Pro Ala Met Ser Gln Ile Ala Glu Asp Ile Ala Ala Ala Met Gln

65 70 75 80

Gln Ala Gly Leu Pro Pro His Arg Val Glu Thr Val Leu Ala Pro Ala

85 90 95

Trp Thr Thr Asp Trp Ile Thr Gln Glu Ala Arg Asp Lys Leu Arg Ala

100 105 110

Tyr Gly Ile Ala Pro Pro Val Gly Gln Cys Gly Asp Ala Ala Pro Arg

115 120 125

Glu Asn Val Val Arg Phe Val Pro Arg Pro Val Ala Ala Pro Ala Cys

130 135 140

Pro Arg Cys Gly Ser Ala Arg Thr Glu Arg Leu Ala Gln Phe Ala Ser

145 150 155 160

Thr Ala Cys Lys Ala Leu Tyr Arg Cys Val Asp Cys Arg Glu Pro Phe

165 170 175

Asp Tyr Phe Lys Pro Tyr

180

<210> 11

<211> 395

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

Met Lys Gln Pro Pro Arg Ser Leu Cys Ser Leu Gly Gly Ala Lys Pro

1 5 10 15

Pro His Pro Pro Glu Ala Asp Pro Ser Leu Thr Ala Ala Arg Arg Gly

20 25 30

Pro Ala Ala Ile Pro Gln Phe His Pro Leu Arg Ile Arg Asp Val Arg

35 40 45

Pro Glu Thr Ala Asp Ala Val Thr Val Ser Phe Glu Val Pro Pro Glu

50 55 60

Leu Arg Asp Ala Tyr Arg Phe Thr Gln Gly Gln Phe Val Thr Leu Lys

65 70 75 80

Val His Ile Asp Gly Glu Glu Met Arg Arg Ser Tyr Ser Ile Cys Val

85 90 95

Gly Thr Thr Asp Tyr Asp Arg Asp Gly Glu Leu Arg Ile Gly Ile Lys

100 105 110

Arg Val Arg Gly Gly Arg Phe Ser Asn Phe Ala Phe Asp Thr Leu Lys

115 120 125

Pro Gly His Thr Ile Asp Val Met Thr Pro Asp Gly Arg Phe Phe Thr

130 135 140

His Leu Asn Ala Glu His Gly Lys Glu Tyr Val Ala Phe Ser Gly Gly

145 150 155 160

Ser Gly Ile Thr Pro Val Leu Ala Ile Ile Lys Thr Thr Leu Glu Leu

165 170 175

Glu Pro Arg Ser Thr Phe Thr Leu Ile Tyr Gly Asn Arg Ser Val Asp

180 185 190

Ala Ile Met Phe Ala Glu Glu Leu Glu Asp Leu Lys Asn Arg Tyr Met

195 200 205

Asn Arg Phe Val Leu Tyr His Val Leu Ser Asp Asp Val Gln Asp Val

210 215 220

Glu Leu Phe Asn Gly Val Leu Asp Gln Ala Lys Cys Ala Ala Phe Leu

225 230 235 240

Asp Thr Leu Leu Pro Ala Asp Ser Ile Asp Glu Ala Phe Ile Cys Gly

245 250 255

Pro Ala Pro Met Met Asp Ala Ala Glu Ala Ala Leu Glu Ala Ala Gly

260 265 270

Val Pro Arg Thr Lys Val His Val Glu Arg Phe Gly Thr Pro Leu Pro

275 280 285

Gln Ala Gly Ala Pro Ala Val Glu Ile Thr Asp Ala Thr Pro Ala Ala

290 295 300

Asp Leu Glu Ile Val Leu Asp Gly Lys Lys Arg Lys Leu Arg Leu Pro

305 310 315 320

Tyr Glu Gly Val Ser Leu Leu Asp Val Gly Leu Arg Ala Gly Leu Ala

325 330 335

Leu Pro Tyr Ala Cys Lys Gly Gly Val Cys Cys Thr Cys Arg Ala Lys

340 345 350

Val Leu Glu Gly Glu Val Arg Met Glu Lys Asn Tyr Thr Leu Glu Ala

355 360 365

Gln Glu Val Lys Asp Gly Phe Val Leu Thr Cys Gln Cys His Pro Val

370 375 380

Ser Asp Lys Val Val Val Ser Phe Asp Glu Arg

385 390 395

<210> 12

<211> 189

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 12

Met Ala Asn Pro Ala Glu Ser His Pro Gln Asn Asp Phe Ile Asn Ser

1 5 10 15

Ala Arg Lys Glu Arg Lys Arg Val Glu Ile Tyr Leu Val Asn Gly Ile

20 25 30

Arg Leu Thr Gly Cys Ile Glu Ser Phe Asp Gln Tyr Leu Val Met Leu

35 40 45

Arg Thr Pro Val Gly Leu Gln Gly Ile Tyr Lys Arg Ala Ile Ser Thr

50 55 60

Ile Gln Leu Asp Thr Gly Gly Ser Arg Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser

65 70 75 80

Arg Gly Pro Arg Thr Gly Gly Gly Pro Gly Gly Gly Arg Ser Gly Gly

85 90 95

Arg Glu Gly Gly Gly His Gly Pro Tyr Gly Ser His Gly Gly Pro Arg

100 105 110

Gly Asp Gly Gly Tyr Ala Ser Arg Glu Pro Arg Gly Asp Gly Gly Tyr

115 120 125

Ala Pro Arg Glu Pro Arg Gly Asp Gly Gly Tyr Ala Pro Arg Glu Pro

130 135 140

Arg Glu Ser Tyr Gly Ala Pro Arg Asp Thr Gly Glu Pro Ser Gly Ala

145 150 155 160

Pro Ser Thr Pro Ala Glu Pro Arg Ser Gly Asn Ser Asn Gly Pro Val

165 170 175

Ile Val Thr Arg Arg Arg Arg Ile Val Pro Asp Ser Gln

180 185

<210> 13

<211> 198

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 13

Met Phe Glu Ala Phe Ser Val Ser Leu Phe Arg Arg Leu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Met Arg Asp Ala Arg Arg Pro Ala Leu Arg Trp Pro Ser Gly Gly Phe

20 25 30

Thr Leu Ile Glu Leu Met Ile Val Leu Ala Ile Val Gly Val Val Ala

35 40 45

Ala Tyr Ala Val Pro Ala Tyr Gln Asp Tyr Val Ala Arg Ser Arg Val

50 55 60

Gly Glu Gly Leu Ala Leu Ala Ala Pro Ala Arg Leu Val Val Ala Asp

65 70 75 80

Asn Val Ala Ser Gly Ala Asp Leu Ala Gly Gly Tyr Ser Ala Pro Val

85 90 95

Ala Thr Arg Asn Val Glu Ser Val Thr Ile Asp Asp Glu Thr Gly Gln

100 105 110

Ile Ser Val Val Phe Thr Ala Arg Val Ala Ala Ala Gly Ala Asn Thr

115 120 125

Leu Val Leu Val Pro Ser Ala Pro Asp Lys Ala Asp Thr Pro Thr Ala

130 135 140

Arg Val Ala Leu Lys Lys Gly Val Thr Gln Ala Gly Ala Ile Ala Trp

145 150 155 160

Glu Cys Phe Ala Ala Gly Lys Thr Ala Ser Ser Leu Pro Ala Pro Gly

165 170 175

Ala Gly Pro Leu Pro Thr Ala Ala Ala Thr Leu Pro Ala Lys Tyr Ala

180 185 190

Pro Ala Glu Cys Arg Ala

195

Claims

1.仁诺吉伯克霍尔德氏菌(Burkholderia rinojensis)和/或其代谢物在制备诱导植物或其种子产生系统抗性的产品中的应用，其特征在于，所述仁诺吉伯克霍尔德氏菌的保藏号为GDMCC No：61156。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述系统抗性包括：植物或其种子对线虫、细菌性病害和真菌性病害中的至少一种所产生的抗性；

优选地，所述线虫包括根结线虫(Meloidogyne spp.)和秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)中的至少一种；

3.根据权利要求1～2任一项所述的应用，其特征在于，所述植物包括黄瓜和番茄中的至少一种；

优选地，所述产品的类型为试剂或试剂盒；

优选地，所述产品包括：植物免疫诱抗剂、种子免疫诱抗剂、拌种剂、种子包衣剂、浸种剂、促根剂、生物农药和生物肥料中的至少一种；

优选地，所述产品剂型选自悬浮剂、水分散粒剂、颗粒剂、粉剂和原药、混悬液中的任意一种；

更优选地，所述粉剂为可湿性粉剂。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述制备包括以下步骤：培养和/或发酵所述仁诺吉伯克霍尔德氏菌，以获得仁诺吉伯克霍尔德氏菌培养液和/或仁诺吉伯克霍尔德氏菌发酵液；

优选地，所述培养和/或所述发酵的时间为12～72h，温度为20～35℃；

优选地，所述培养和/或所述发酵的时间为24～72h，培养和/或发酵的温度为25～30℃；

优选地，所述仁诺吉伯克霍尔德氏菌培养液和/或仁诺吉伯克霍尔德氏菌发酵液中的有效活菌数为12～30亿/mL；

优选地，所述仁诺吉伯克霍尔德氏菌培养液和/或仁诺吉伯克霍尔德氏菌发酵液的OD₆₀₀＝1；

优选地，所述制备还包括：对所述仁诺吉伯克霍尔德氏菌培养液和/或所述仁诺吉伯克霍尔德氏菌发酵液进行离心，以获得上清液；

优选地，所述离心的条件为：离心转速为7000～9000rpm，离心时间为1～20min。

5.仁诺吉伯克霍尔德氏菌和/或其代谢物在诱导植物或其种子产生系统抗性中的应用，其特征在于，所述仁诺吉伯克霍尔德氏菌的保藏号为GDMCC No：61156。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述系统抗性包括：植物或其种子对线虫、细菌性病害和真菌性病害中的至少一种产生的抗性；

优选地，所述诱导植物或其种子产生系统抗性的方法包括：采用目标试剂对植物进行：直接浇灌、浸根处理、对其种子进行拌种和对种子进行包衣处理中的至少一种处理；其中，所述目标试剂包括：仁诺吉伯克霍尔德氏菌、仁诺吉伯克霍尔德氏菌培养液或仁诺吉伯克霍尔德氏菌发酵液、仁诺吉伯克霍尔德氏菌上清液、含仁诺吉伯克霍尔德氏菌的产品、含仁诺吉伯克霍尔德氏菌培养液的产品、含仁诺吉伯克霍尔德氏菌上清液的产品和含仁诺吉伯克霍尔德氏菌发酵液的产品中的至少一种；

优选地，所述仁诺吉伯克霍尔德氏菌培养液或仁诺吉伯克霍尔德氏菌发酵液由如权利要求4所述的培养和/或发酵制备获得；

优选地，对植物的种子进行包衣处理时，所述目标试剂包括含仁诺吉伯克霍尔德氏菌发酵液的产品，所述含仁诺吉伯克霍尔德氏菌发酵液的产品包括体积比为1：(8～10)的仁诺吉伯克霍尔德氏菌发酵液和常规种衣剂；

优选地，进行包衣处理时，所述种衣菌剂和种子的体积质量比为1：(40～60)。

7.一种诱导植物或其种子产生系统抗性的产品，其特征在于，其包括：仁诺吉伯克霍尔德氏菌、仁诺吉伯克霍尔德氏菌培养液、仁诺吉伯克霍尔德氏菌上清液和仁诺吉伯克霍尔德氏菌发酵液中的至少一种，以及其他用于诱导植物或其种子产生系统抗性的试剂；其中，所述仁诺吉伯克霍尔德氏菌的保藏号为GDMCC No：61156。

8.根据权利要求7所述的诱导植物或其种子产生系统抗性的产品，其特征在于，所述系统抗性包括：植物或其种子对线虫、细菌性病害和真菌性病害中的至少一种所产生的抗性；

优选地，所述根结线虫包括南方根结线虫(M.incognita)，北方根结线虫(M.hapla)，花生根结线虫(M.arenaria)和爪哇根结线虫(M.javanica)中的至少一种；

优选地，当诱导种子产生系统抗性时，所述其他用于诱导种子产生系统抗体的试剂包括常规种衣剂；

优选地，所述产品为植物免疫诱抗剂、种子免疫诱抗剂、种子包衣剂、拌种剂、浸种剂、促根剂生物农药或生物肥料。

9.一种诱导植物或种子产生系统抗性、促进植物根系发育的方法，其特征在于，对植物或种子施用如权利要求3、4、7或8所述的产品。

10.仁诺吉伯克霍尔德氏菌和/或其代谢物在制备杀虫的产品中的应用；

优选地，所述代谢物包括杀虫蛋白，所述杀虫蛋白包括氨基酸序列如SEQ ID No.1～13所示蛋白中的至少一种；

优选地，所述虫为农业害虫；

优选地，所述虫包括根结线虫(Meloidogyne spp.)和秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)中的至少一种；