WO2010143529A1 - 多能性幹細胞を胸腺上皮へ分化誘導する方法 - Google Patents

多能性幹細胞を胸腺上皮へ分化誘導する方法 Download PDF

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WO2010143529A1
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culture
cell
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thymic
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健一 磯部
雄太 稲見
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国立大学法人名古屋大学
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    • C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor

Definitions

  • the present invention relates to a method for inducing differentiation of pluripotent stem cells into a specific cell lineage. Specifically, the present invention relates to a method for inducing differentiation of pluripotent stem cells into thymic epithelial progenitor cells or medullary thymic epithelial cells.
  • Immunity is a mechanism that protects individuals from external attack by microorganisms and destruction from inside by cancer.
  • Representative of such cells responsible for immunity are phagocytic cells and lymphocytes, and these cells migrate throughout the body via blood vessels and lymphatic vessels.
  • Phagocytes are composed of neutrophils and macrophages, and these are mobilized to the invasion site of antigen.
  • one lymphocyte forms an antibody or a receptor that binds to only one antigen, one individual has more than 10 6 types of lymphocytes corresponding to the number of antigens.
  • the immune system consists of central lymphoid tissues such as the thymus and bone marrow, where lymphocytes and phagocytic cells are generated and differentiated, and peripheral lymphoid tissues such as the spleen and lymph nodes where the cells produced there move and gather. Lymphocytes that gather in peripheral tissues include thymus-derived T cells and bone marrow-derived B cells.
  • the immune system is triggered by signal exchange between cells triggered by antigen stimulation, and these signal exchanges between cells are macrophages and T cells that have incorporated the antigen as a foreign substance, resulting in activated T and B cells, activity It occurs between activated lymphocytes and phagocytes (references 34, 37).
  • T cells are involved in both cellular immunity that destroys virus-infected cells and humoral immunity that helps B cells that produce specific antibodies, which are the main role in bacterial defense. T cells also circulate throughout the body through blood vessels and lymphatic vessels. T cells have TCR, which is a receptor that recognizes antigens and MHC molecules. There is only one type of TCR per T cell, and T cells can handle myriad antigen presentations. Must have. There are roughly two types of T cells: cells with CD4 protein on the cell surface and cells with CD8 protein. Helper T cells composed of naive Th, Th1, Th2, etc. with CD4 on the cell surface recognize antigen-presenting cells and regulate the functions of other immune cells by producing and releasing cytokines.
  • Th2 controls humoral immunity through B cell-mediated antibody production, and Th1 has a killing effect by releasing cytokines against macrophage-engaged bacteria.
  • Killer T cells with CD8 protein on the cell surface are responsible for cell-mediated immunity that prevents further infection by destroying whole cells infected with the virus.
  • T cells are differentiated on thymic stromal cells, which are composed of various cells such as thymic epithelial cells, fibroblasts, macrophages, and dendritic cells.
  • thymic stromal cells which are composed of various cells such as thymic epithelial cells, fibroblasts, macrophages, and dendritic cells.
  • thymic epithelium the thymic epithelium occupies most of the matrix.
  • the stroma itself can be divided histologically into two areas, cortex and medulla.
  • T cells differentiate through several different phenotypes. It can be divided into DN (Double Negative), DP (Double Positive), and SP (Single Positive) based on the difference in the expression of CD4 and CD8. Furthermore, at the DN stage, there are four further stages due to the difference in the expression of CD44 and CD25. It can be divided into DNs 1-3 and 4 (pre-DP). Thymic T cells at different stages of differentiation are located in spatially different regions of the mature thymus, and thymic T cells and thymic epithelial cells are closely related to T cell differentiation from thymic transfer It has been known.
  • thymic T cells of DP In the cortical region of the thymus, positive differentiation is performed in which cells that recognize their own MHC survive after differentiation from thymic progenitor cells to thymic T cells of DP. In the medulla region, differentiation of thymic T cells from DP to SP and subsequent negative selection in which only thymic cells that do not recognize self-antigens survive (Negative Selection), and immune tolerance to self cells is established. And messy gene expression in medullary thymic epithelial cells (mTEC) suggests that it plays an important role in the induction of immune tolerance.
  • mTEC medullary thymic epithelial cells
  • bone marrow stromal cells transfected with delta 1 (Dll1) which is a Notch-ligand
  • Dll1 delta 1
  • OP9 OP9
  • thymic epithelial cells which are important cells in T cell differentiation, leads to elucidation of immune functions related to the thymus.
  • immune function declines with age, but this is due to changes in T cell composition and ability, and due to changes in sex hormones androgens and estrogens, the thymus itself becomes adolescent. It is known that when it passes, it begins to atrophy rapidly. It is expected to provide important findings for the elucidation of the causal relationship between such atrophy (aging) of the thymus and the decline in immune function including T cell composition, and the mechanism of thymus development and immune tolerance.
  • thymic epithelial cells can be regenerated using iPS cells (Induced pluripotent stem ⁇ ⁇ cells) created from the self, treatment of DiGeorge syndrome and normal T cells that cannot produce normal thymus due to genetic disease
  • iPS cells Induced pluripotent stem ⁇ ⁇ cells
  • Clinical applications such as cell differentiation and transplantation can also be expected.
  • Non-Patent Document 1 reports on factors involved in thymus development (Non-Patent Documents 1 to 5) are listed.
  • an object of the present invention is to provide means for inducing differentiation of pluripotent stem cells into thymic epithelial progenitor cells or medullary thymic epithelial cells aiming at thymic regeneration.
  • thymus was derived from two germ layers (cortex derived from ectoderm, medulla derived from endoderm), but it was reported that no clear relationship was found between differentiation of ectoderm and thymus The thymus was proven to be derived from the endoderm. Subsequent studies have also shown that thymic early organogenesis is closely linked to the parathyroid glands, both of which develop from organ primordia originating from the third pharyngeal sac, the endoderm, around mouse E11 I understood it.
  • the primordium at this stage contains progenitor cells to the thymus and parathyroid gland and was found to be divided into thymic and parathyroid regions from the point of gene expression.
  • the fact that the thymus originated from the endoderm revealed that cortical thymic epithelial cells (cTEC) and medullary thymic epithelial cells (mTEC) in the thymus are derived from the same endoderm.
  • cTEC cortical thymic epithelial cells
  • mTEC medullary thymic epithelial cells
  • the endoderm consists of the visceral endoderm, which forms the outer and inner layers of the anterior gastrulation, and the upper blastoderm, which is derived from the inner cell mass of the blastocyst.
  • the endoderm replaces the yolk sac near the extraembryonic body. Also, during gastrulation, blastocyst cells enter through the section behind the primitive streak and form definitive endoderm.
  • the definitive endoderm differentiates into gut formation and internal organs associated with the intestine such as the liver and pancreas.
  • the thymus was thought to originate from the definitive endoderm and this differentiation method was investigated.
  • Differentiation methods into these two endoderm using ES cells are already known, and specific factors are not required for differentiation into the proximal endoderm, and they can be induced by increasing the cell concentration.
  • an induction method using activin A (AA) which is known as a mesoderm inducing factor in the early stage of development, is known. It is also known that activin A can be induced in all three germ layers at different concentrations. Induction of differentiation into definitive endoderm using activin A is mediated through endomesoderm, and it has also been demonstrated that it is similar to differentiation into definitive endoderm via embryonic primitive streak ( Non-patent documents 1, 2).
  • FGF Fibroblast Growth Factor
  • FGF10 Fibroblast Growth Factor 7 and FGF10 are released from the mesenchymal tissue surrounding the thymic primordia and are deeply related to thymic development (Non-patent literature) 4
  • BMP4 is expressed in the thymic primordium, and it has been confirmed that the thymus is dysplastic in BMP (bone morphogenesis protein) 4 deficient mice (Non-patent literature) 5)
  • Induction of differentiation into thymic epithelial progenitor cells based on a unique viewpoint, referring to the fact that thymic dysplasia has been confirmed in FGF8-deficient mice (Non-patent Document 6). Tried.
  • Non-patent Document 7 RANK ligand and CD40 were suggested as important factors for development of medullary thymus region and self-tolerance, and it was reported that RANK ligand is important for the construction of early medullary thymic epithelial cells.
  • Non-patent Document 7 In order to promote differentiation into medullary thymic epithelial cells, it was decided to add RANK ligand. As a result, differentiation into medullary thymic epithelial cells was confirmed.
  • the present invention is mainly based on the above results.
  • a method for inducing differentiation of pluripotent stem cells into thymic epithelial progenitor cells or medullary thymic epithelial cells A first induction step for differentiating pluripotent stem cells into definitive endoderm cells; A second induction step of differentiating from definitive endoderm cells to thymic epithelial progenitor cells or medullary thymic epithelial cells by using FGF8, FGF7, FGF10, BMP4 and lithium chloride in combination, In the second induction step, following the first culture under the condition where FGF8 is added to the medium and FGF7 and FGF10 are not added, the second culture is performed under the condition where FGF7 and FGF10 are added to the medium and FGF8 is not added.
  • a method of culturing [2] The method according to [1], wherein the first induction step is a step of culturing cells under conditions in which activin and lithium chloride are added to the medium. [3] The method according to [2], wherein the concentration of lithium chloride in the medium is about 5 mM. [4] The method according to any one of [1] to [3], wherein the first culture is a step of culturing cells under conditions in which FGF8 and lithium chloride are added to the medium. [5] The method according to any one of [1] to [3], wherein the first culture is a step of culturing cells under conditions where FGF8, lithium chloride and activin are added to the medium.
  • the second induction step includes a third culture under a condition in which RANK ligand or CD40 ligand is added to the medium, and medullary thymic epithelial cells are induced by the culture, any of [1] to [7] The method according to claim 1.
  • ES cells were cultured for 4 days in serum-free medium SF-O3 supplemented with activin A (10 ng / ml) and analyzed by flow cytometry. There were 13.2% of cells (endomesoderm) positive for both E-cadherin and PDGFR- ⁇ (left). On the other hand, 25.3% of the cells (definitive endoderm) were positive for both E-cadherin and CXCR4 (right). Examination of conditions for inducing differentiation into definitive endoderm (using ES cells). The effect of combining activin A and LiCl was analyzed by flow cytometry. The induction efficiency to the endomesoderm changes depending on the concentration of LiCl.
  • D7 After 7 days of culture (D7), the cells are cultured in a serum-free medium supplemented with FGF7, FGF10, BMP10 and LiCl. Changes in gene expression by RT-PCR. Cells were collected on day 0 (D0), day 4 (D4), day 7 (D7), day 9 (D9), day 12 (D12) and day 15 (D15), and RT- The expression state of various genes was analyzed by PCR. Flow cytometry results using cells on day 14 of culture. Two cell populations (top, 12% and 58%) were observed. EpCAM1 and MTS24 are expressed in a small cell population (12%). Protocol for inducing differentiation into medullary thymic epithelial cells.
  • Cells were collected on the 0th day (D0), 4th day (D4), 12th day (D12) and 16th day (D16) of culture, and the expression state of various genes was analyzed by RT-PCR. Gene expression analysis by real-time PCR. Cells were collected on the 0th day (D0), 12th day (D12) and 16th day (D16) of culture, and the expression states of Pax1, FoxN1 and K5 were examined. Protocol of differentiation induction method to thymic epithelial progenitor cells (improved method). Incubate in serum-free medium supplemented with activin A and LiCl until day 4 of culture (D4).
  • the cells are cultured in a serum-free medium supplemented with FGF8, LiCl and activin A.
  • the cells are cultured in a serum-free medium supplemented with FGF7, FGF10, BMP10 and LiCl.
  • H.E stained image showing changes in cell groups induced to differentiate by the improved method.
  • the scale bar is 200 ⁇ m. Changes in gene expression of cells induced to differentiate by an improved method (RT-PCR results).
  • AA Activin A
  • Bmp4 bone morphogenetic protein 4
  • Bmps bone morphogenetic proteins
  • cad11 cadherin 11
  • cTEC cortical thymic epithelial cell
  • Dll1 delta-like 1
  • Dll4 delta-like 4
  • DN double negative
  • DP double positive
  • EB Embryoid Body
  • E-cad (ECD) E-cadherin
  • ES cell embryonic stem cell
  • Eya1 eyes absent 1 homologue
  • FCM Flow cytometry
  • Fgf10 fibroblast growth factor 10
  • Fgf7 fibroblast growth factor 7
  • Fgf8 fibroblast growth factor 8
  • Fgfr2-IIIb Fgf receptor 2 isoform IIIb
  • Fgfs fibroblast growth factors
  • FoxN1 forkhead box N1
  • FTOC fetal thymic organ culture
  • Gcm2 gliotanib
  • the present invention provides a method for inducing differentiation of pluripotent stem cells into thymic epithelial progenitor cells or medullary thymic epithelial cells (hereinafter also referred to as “differentiation induction method of the present invention”).
  • pluripotent stem cell refers to a cell having the ability to differentiate into various tissues and organs. Examples of pluripotent stem cells are ES cells (embryonic stem cells), EG cells (embryonic germ cells) and iPS cells (artificial pluripotent stem cells).
  • the pluripotent stem cell is preferably a human cell.
  • Pluripotent stem cells can be prepared according to a known method. For example, for the production of ES cells, Strelchenko N., et al. Reprod Biomed Online. 9: 623-629, 2004; Klimanskaya I., et al. Nature 444: 481-485, 2006; Chung Y., et al. Cell Stem Cell 2: 113-117, 2008; Zhang X., et al Stem Cells 24: 2669-2676, 2006; Wassarman, PM et al. Methods in Enzymology, Vol.365, 2003, etc. Regarding the production of iPS cells, Takahashi K., et al.
  • ES cells can be obtained from Center for Stem Cell Medicine, Institute for Regenerative Medicine, Kyoto University, WiCell Research Institute (Madison, USA), ES Cell International Pte Ltd (Singapore), and the like.
  • iPS cells can be provided from Kyoto University or RIKEN BioResource Center.
  • iPS cells produced by Dr. Yamanaka et al. Have excellent characteristics such as being able to solve ethical problems associated with conventional pluripotent stem cells (ES cells, etc.). Therefore, iPS cells are preferably employed as pluripotent stem cells.
  • Thymic epithelial progenitor cells refer to proliferating cells that are destined to differentiate into thymic epithelial cells (ie, differentiate into thymic epithelial cells when placed in an appropriate environment).
  • the “medullary thymic epithelial cell” is an epithelial cell constituting the medulla of the thymus.
  • the cells that make up the cortical region of the thymus are called cortical thymic epithelial cells (cTEC).
  • “Inducing differentiation” means acting to differentiate along a specific cell lineage. In the present invention, differentiation is induced into thymic epithelial progenitor cells or further differentiated medullary thymic epithelial cells.
  • the differentiation induction method of the present invention comprises two stages of induction, ie, a step of differentiating pluripotent stem cells into definitive endoderm cells (first induction step), FGF8, FGF7, FGF10, BMP4 and lithium chloride (LiCl). ) In combination with a thymic epithelial progenitor cell or a further differentiated medullary thymic epithelial cell (second induction step).
  • first induction step a step of differentiating pluripotent stem cells into definitive endoderm cells
  • FGF8 FGF7 FGF10
  • BMP4 lithium chloride
  • LiCl lithium chloride
  • pluripotent stem cells are cultured and differentiated into definitive endoderm cells.
  • pluripotent stem cells are cultured under conditions that induce differentiation into definitive endoderm cells.
  • iPS cells with few ethical problems are preferably used as pluripotent stem cells, other pluripotent stem cells such as ES cells can also be used.
  • the definitive endoderm is formed via the mesendoderm.
  • the aim is to differentiate the definitive endoderm via the endomesoderm into thymic epithelial progenitor cells.
  • pluripotent stem cells are cultured in a medium to which, for example, activin (preferably activin A) and lithium chloride (LiCl) are added so as to differentiate into endomesoderm.
  • activin concentration is, for example, 1 ng / ml to 100 ng / ml, preferably 5 ng / ml to 30 ng / ml.
  • concentration of LiCl is, for example, 0.5 to 30 mM.
  • the concentration of LiCl is preferably 2 to 10 mM, more preferably about 5 mM.
  • the period of the first induction step is, for example, 2 to 7 days, preferably 3 to 5 days, and more preferably 4 days.
  • the culture conditions are not particularly limited except that the culture conditions described above are satisfied.
  • a culture condition of “use a medium not containing serum” is employed as an additional culture condition.
  • a serum-free medium supplemented with activin and LiCl is preferably used. Use of a serum-free medium increases the efficiency of differentiation induction.
  • FGF8, FGF7, FGF10, BMP4 and LiCl are used together to differentiate from definitive endoderm cells to thymic epithelial progenitor cells or medullary thymic epithelial cells.
  • this process is characterized in that five types of factors (FGF8, FGF7, FGF10, BMP4, and LiCl) are used in combination.
  • FGF8 is added to the medium and FGF7 and FGF10 are not added (first culture)
  • FGF7 and FGF10 are added to the medium and FGF8 is not added.
  • the lower culture (second culture) is performed.
  • differentiation into the pharyngeal endoderm proceeds by the action of FGF8, and in the second culture, differentiation further proceeds by the action of FGF7 and FGF10, resulting in thymic epithelial progenitor cells.
  • LiCl is preferably added to the medium throughout the entire culture period of the second induction step. This can promote differentiation.
  • BMP4 is preferably added to the medium during the second culture. Thus, BMP4 should be added when differentiation has progressed to some extent. Thereby, differentiation into thymic epithelium can be determined and differentiation can be promoted.
  • LiCl has the same action as Wnt, which is known to increase the expression of FoxN1, an important gene in thymic development.
  • FGF7 and FGF10 are factors released from the mesenchymal tissue around the thymic primordia and are closely related to thymic development.
  • BMP4 which is also a bone morphogenetic factor, is expressed in the thymic primordium, and thymic dysplasia has been reported in BMP4-deficient mice.
  • thymic hypoplasia has been reported in FGF8-deficient mice.
  • these factors are used in combination according to the unique combination and use period as defined above, and pluripotent stem cells differentiated into definitive endoderm cells in the first induction step are induced to differentiate into thymic epithelium.
  • FGF8 0.4 ng / ml to 40 ng / ml (2 ng / ml to 20 ng / ml)
  • FGF7 2 ng / ml to 200 ng / ml (10 ng / ml to 100 ng / ml)
  • FGF10 0.5 ng / ml to 50 ng / ml (2.5 ng / ml to 25 ng / ml)
  • BMP4 1 ng / ml to 100 ng / ml (5 ng / ml to 50 ng / ml)
  • LiCl 0.5 mM to 30 mM (2 mM to 10 mM)
  • the culture period of the first culture is, for example, 2 to 7 days, preferably 2 to 4 days, and more preferably 3 days.
  • the culture period of the second culture is, for example, 4 to 20 days, preferably 6 to 15 days, and more preferably 7 to 10 days.
  • the culture conditions are not particularly limited except that the culture conditions described above are satisfied.
  • the second induction step preferably employs a culture condition of “use a medium not containing serum” as an additional culture condition. Use of a serum-free medium increases the efficiency of differentiation induction.
  • the culture is performed under the condition where RANK ligand or CD40 ligand is added to the medium (third culture).
  • This third culture is performed to induce differentiation and induce medullary thymic epithelial cells. It is more preferable to use a medium supplemented with LiCl in addition to RANK ligand or CD40 ligand. Therefore, in a preferred embodiment, the cells are cultured using a serum-free medium supplemented with RANK ligand or CD40 ligand and LiCl.
  • One or more factors FGF7, FGF10, BMP4 added to the medium during the second culture may be used in combination.
  • RANK ligand and CD40 ligand are not exclusive and may be used in combination.
  • the concentration of RANK ligand or CD40 ligand added is, for example, 1 ng / ml to 100 ng / ml, preferably 5 ng / ml to 15 ng / ml.
  • the culture period of the third culture is, for example, 2 to 20 days, preferably 3 to 15 days, and more preferably 4 to 10 days.
  • RANK and CD40 ligands are important factors for the development of the medullary region and the construction of self-tolerance in the thymus (Ref. 18). By using these, medullary thymic epithelial cells are selectively generated from thymic epithelial progenitor cells. Can be made.
  • the RANK ligand is preferably used in the present invention.
  • the first culture is performed under the condition of adding FGF8, LiCl and activin.
  • FGF8 LiCl and activin.
  • target cells can be obtained efficiently.
  • the use of this condition and the use of the third culture are not mutually exclusive. That is, also in this embodiment, the third culture may be performed.
  • the cell population obtained through the first induction step or a part thereof is subjected to the second induction step without being selected.
  • the second induction step may be performed.
  • the selection of definitive endoderm cells may be performed, for example, with a flow cytometer (cell sorter) using a cell surface marker as an index.
  • Thymic epithelial progenitor cells are obtained by the second induction step. That is, thymic epithelial progenitor cells are recognized as at least part of the cell population.
  • a thymic epithelial progenitor cell can be confirmed by the expression of Pax1, Pax9, Eya1, Six1, etc., for example.
  • the third culture is also carried out following the first culture and the second culture, further differentiated medullary thymic epithelial cells are obtained. That is, medullary thymic epithelial cells are recognized as at least a part of the cell population.
  • the cell population is a state in which thymic epithelial progenitor cells and medullary thymic epithelial cells are mixed.
  • a medullary thymic epithelial cell can be confirmed, for example, by the fact that keratin 5 is expressed but keratin 8 is not expressed (K5 +, K8-) and FoxN1 is expressed.
  • a cell population consisting only of the target cells (thymic epithelial progenitor cells and / or medullary thymic epithelial cells) or a cell population that contains the target cells in a high ratio (high purity), it is characterized by the target cells.
  • the cultured cell population may be selected and sorted using a typical cell surface marker as an index.
  • the cells may be seeded at a cell density of about 1 ⁇ 10 4 cells / cm 2 to 1 ⁇ 10 6 cells / cm 2 .
  • cells are cultured two-dimensionally using a culture dish or the like, but three-dimensional culture using a gel-like culture substrate or the like may be performed.
  • BSA bovine serum albumin
  • KSR serum substitutes
  • reducing agents 2-mercaptoethanol, etc.
  • SF-03 Sudo Junyaku Co., Ltd.
  • culture conditions such as the culture temperature may be those generally employed in animal cell culture. That is, for example, it may be cultured in an environment of 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • TRIzol Reagent invitrogen
  • Glycogen Roche
  • cDNA was synthesized using High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits (Applied Biosystems) according to the attached protocol.
  • PCR was performed using Takara Ex Taq (TaKaRa). The used primers are as follows.
  • ⁇ -actin Fw forward
  • ⁇ -actin Rv reverse
  • FoxN1 Fw actcttcccaaagcccatct: SEQ ID NO: 3
  • FoxN1 Rv agcaatggggtctttcctct: SEQ ID NO: 4
  • Pax1 Fw gcagccggctacctatctc: SEQ ID NO: 5
  • Pax1 Rv ggcagtccgtgtaagctacc: SEQ ID NO: 6
  • Pax3 Fw ctgcactcaagggactcctc: SEQ ID NO: 7
  • Patxc Pax9 Fw
  • the ECCD2 monoclonal antibody was labeled by standard methods using allophycocyanin (APC).
  • APC allophycocyanin
  • Biotinylated anti-mouse EpCAM antibody was purchased from BioLegend (California, USA).
  • MTS24 was provided by Boyd, RL (Monash Immunology and Stem Cell Laboratories, Monash University, Australia).
  • ES cells were provided by Dr. Sakurai (Kyoto University).
  • IPS (APS0001) cells were purchased from Riken Cell Bank. These cells were maintained using 2 mM L-glutamine (GIBCO) and 0.1 mM Non-Essential MEM (GIBCO), 50 units / ml-50 mg / ml penicillin-streptomycin (GIBCO), 0.1 mM 2-mercaptoethanol (Sigma Aldrich ), 10 3 units / ml LIF (15% FBS / KNOCKOUT DMEM (invitrogen) medium containing leukemia inhibitory factor) .Cells were passaged once every two days.
  • a culture dish coated with 0.1% Gelatin from porcine skin (Type A) (SIGMA) / DW was used.
  • SIGMA porcine skin
  • a culture dish coated with 0.1% Gelatin from porcine skin (Type A) (SIGMA) / DW was used.
  • cells were stored in liquid nitrogen and used as early as possible after thawing culture for the experiments, and were collected by dissociating the cells with 0.25% Trypsin-EDTA (GIBCO) at the time of passage. After the treatment, the supernatant was removed and 4 ⁇ 10 5 cells were seeded on a 10 cm culture dish.
  • B Reagent used for differentiation induction
  • serum-free SF-03 (Sanko Junyaku) containing 0.2% BSA was used.
  • Factors used for differentiation induction were activin A (R & D systems), FGF8b (R & D systems), FGF7 (R & D systems), FGF10 (R & D systems), BMP4 (R & D systems), LiCl (Sigma Aldrich) and 2-mercaptoethanol.
  • a culture dish coated with collagen type IV (Nitta gelatin) was used. Cell number upon induction of differentiation was 2 ⁇ 10 5 / 10cm dish.
  • Tissue analysis Preparation of frozen section
  • the transplanted collagen sponge was recovered after 3 weeks, embedded in OCT compound (Sakura), and solidified with liquid nitrogen.
  • a frozen microtome for light microscopy (CW3050-4, common equipment) was used to prepare a frozen section having a thickness of 5 ⁇ m and attached to a slide glass (MATSUNAMI) with an APS coat.
  • Another method is a monolayer culture method, which is simply a method of culturing cells on a culture dish. Since this method has a two-dimensional (planar) structure, unlike EB, it is considered that a factor acts uniformly on all cells, and it is possible to increase the efficiency of inducing differentiation into specific cells. In addition, the single layer culture method has little interaction with surrounding cells, and by changing the factors added to the medium, the factors necessary for the developmental stage can be determined, which is also useful as a developmental research tool. it is conceivable that. Therefore, the monolayer culture method was adopted in this experiment.
  • inducers include Nordal, activin, and BMP, which are known from early blastocyst to late gastrulation embryo.
  • activin a method for inducing mesendoderm by activin A is actually known (references 2 and 8).
  • BMP an induction system to mesoderm using BMP4 is known.
  • lithium suppresses the activity of GSK-3b and stimulates the canonical Wnt pathway (Wnt- ⁇ -catenin pathway) via ⁇ -catenin, which is also known as an early development pathway (Reference 28). ).
  • activin A (10 ng / ml) alone differentiated into endoderm and definitive endoderm (FIG. 1).
  • FIG. 1 it was examined whether the difference in differentiation efficiency was caused by the difference in cell concentration during differentiation induction.
  • activin A concentration was 10 ng / ml
  • the cell concentration per area was The lower the cell, the more efficiently differentiated, and as the cell concentration increased, the proportion of cells in the endoderm and definitive endoderm decreased (results not shown).
  • LiCl alone did not differentiate into endoderm and definitive endoderm (results not shown), but when activin A (10 ng / ml) and LiCl were used together, differentiation into endomesoderm was promoted, The optimal LiCl concentration was 5 mM ( Figure 2). Under this condition, the cell group of the inner mesoderm increased about 1.6 times compared with the case of activin A alone (13.2%) (FIGS. 1 and 2). Also when iPS cells were used, endoderm cell groups were efficiently induced by the combined use of activin A (10 ng / ml) and LiCl (5 mM) (FIG. 3). When serum was added to a serum-free medium containing activin A, differentiation into endomesoderm and definitive endoderm did not occur (results not shown). From this result, it was suggested that the component contained in the serum works to suppress activin A.
  • Wnt stimulation involved in early development is a factor that determines the position of the dorsal side.
  • activin and Nordal are induced to differentiate the inner mesoderm.
  • the failure to induce in the cells is considered to be correct embryologically.
  • the differentiation into endomesoderm was promoted by induction with both activin A and LiCl when the endomesoderm was induced by activin. It suggests that there is some relationship.
  • NCCs neural crest cells
  • Reciprocal signals between endoderm and mesenchymal cells control primordial positioning and outgrowth, and cascades including patterning are expected.
  • signal pathways including FGFs, Wnt, BMPs, and SHH, which are major developmental signal pathways, are involved in thymic development, the details have not been elucidated.
  • FGF8 is expressed in pharyngeal sac endoderm at E10.5, and this expression is presumably a signal to surrounding NCC mesenchymal cells.
  • FGFR2-IIIb is expressed in TEC from about E13.5, and is thought to receive FGF7 and FGF10 signals released by surrounding cells (reference documents 24, 27, 29).
  • the expression of FGFR2-IIIb was also detected in the mesenchymal cells in E14 as a result of RT-PCR.
  • BMP4 also currently supports models that promote both FoxN1 and FGFR2-IIIb expression and promote TEC reactivity to FGF7 and FGF10 signals from mesenchymal cells.
  • the Wnt signal has also been suggested to have a function in the differentiation of TEC itself and the differentiation of thymic T cells (Reference Documents 11 and 16). Wnt induces FoxN1 expression, and is thought to promote TEC differentiation through regulation and regulation of FoxN1 expression through both autocrine and paracrine mechanisms. It is known that the interaction with the mesenchyme-derived mesenchymal tissue is important for thymic differentiation, so both ES cells and iPS cells are induced into the inner mesoderm and only the endoderm is not removed. We tried to regenerate thymus by inducing differentiation while mixing them.
  • FGF8 expression was confirmed in the second, third, and fourth pharyngeal sac in E9.5, and expression was also confirmed in several other sites (such as the head).
  • the function of FGF8 is thought to induce mesenchymal cells around the third pharyngeal sac, but differentiation was induced by FGF8 in consideration of the possibility of acting on self by the autocrine mechanism.
  • Activin A (10 ng / ml) and LiCl (5 mM) were added, and after induction of differentiation into endoderm and definitive endoderm, FGF8 (4 ng / ml) and LiCl (5 mM) was added and cultured for 3 days.
  • BMP4 is not expressed in the E9.5 third pharyngeal sac endoderm, but expression has been confirmed from E10.5 to the anterior part of the third pharyngeal sac (Reference 4).
  • Noggin a BMP4 inhibitor
  • Noggin a BMP4 inhibitor
  • FGF7 and FGF10 are known to be involved in thymic primordium development, and expression of FGF7 and FGF10 was confirmed by RT-PCR results in mesenchymal cells around the thymic primordium in E13.5 Has been.
  • FGFR2-IIIb which is a receptor for FGF7 and FGF10, has been confirmed to be expressed at the thymic primordia site at E13.5, which is the same period, and FGFR2-IIIb is activated by stimulation with FGF7 and FGF10.
  • the expression of FGF7 and FGF10 occurs after the formation of thymic primordia from the pharyngeal sac where FGF8 is expressed. After culturing in a medium supplemented with FGF8 and LiCl (Day 4 (D4) -7) On the first day (D7)), BMP4, FGF7, FGF10 and LiCl were subsequently added and cultured.
  • IPS cells were used to examine the relationship between the concentration of each factor added and differentiation induction.
  • culture was carried out on the 7th day (D7) to the 12th day (D12) while changing only the concentration of FGF10 (2 to 20 ng / ml) and keeping other factors constant.
  • FGF10 2 to 20 ng / ml
  • the optimum concentration of FGF10 was 5 ng / ml.
  • the same experiment was carried out by changing only the concentration of BMP4 (1 to 10 ng / ml) and keeping the other factors constant.
  • Dll1 and Dll4 (reference document 33), which are required for thymocyte differentiation, was weakly expressed even when undifferentiated, but the expression of Dll4 slightly increased from day 7 of culture (D7) ( Results not shown).
  • Other factors known for thymic development include Tbx1 involved in developmental stage, p63 involved in stem cell maintenance, FGFR2 as a receptor for FGFs, and K5 as a marker for thymic medulla (Refs. 9, 10, 16) Expression also increased according to differentiation induction (FIG. 5).
  • the expression of Nanog decreased with time, suggesting that differentiation is progressing (FIG. 5), and the expression of Nanog and Oct3 / 4 did not disappear completely, and the expression of p63 increased.
  • stem cells other than ES cells When the differentiation-induced cells were subcultured in serum-containing medium, colonies appeared and were considered to be holoclones because they grew, and this cell also expressed genes related to the thymus. Not shown). From these results, it was suggested that epithelial stem cells can be recovered from cells containing mature cells with low proliferation ability by passage of differentiated cells. In addition, observation of the subcultured cells and the results of FCM showed that not only completely uniform cells but also some cell groups were mixed.
  • GSC the marker gene of endomesoderm
  • EpCAM1 which is a surface marker of thymic epithelial cells
  • MTS24 expression which is known to regulate the subpopulation of thymic epithelial progenitor cells in the early developmental stage
  • Thymic epithelial progenitor cells are precursor cells of cortical thymic epithelial cells (cTEC) and medullary thymic epithelial cells (mTEC). Therefore, an attempt was made to differentiate thymic epithelial progenitor cells generated by the above differentiation induction method into medullary thymic epithelial cells.
  • RANK ligand and CD40 ligand were reported as important factors in the development of medullary region and self-tolerance in the thymus, and it was suggested that RANK ligand is more important in the construction of early thymic medulla region (Reference 18). Therefore, in order to induce differentiation into medullary thymic epithelial cells, the cells were cultured in a medium supplemented with RANK ligand (10 ng / ml) and LiCl (5 mM) from day 12 of culture (FIG. 7).
  • E-cad positive cells and PDGFR- ⁇ positive cells were densely present at different sites.
  • the E-cad positive cell group is a cell derived from the endoderm system, and the PDGFR- ⁇ positive cell group can be considered to be a cell derived from the mesoderm (reference documents 33 and 34). It was suggested that at least endoderm cells and mesodermal cells differentiated by the method, and each formed a population.
  • the cell group obtained by adding activin A from the fourth day of culture (D4) to the seventh day of culture (D7) will be referred to as A + cell group, and the cell group without activin A added is the A ⁇ cell group. I decided to call it.
  • this A + cell group strongly expressed the target gene (FIG. 12).
  • FGF7, FGF10, BMP4 and LiCL from the seventh day of culture (D7) and continuing the culture for seven days, the expression of many genes related to thymic development increases, and FoxN1 is a marker for thymic epithelial cells. Also significantly increased (FIG. 12).
  • the addition of activin A induces most cell groups to endoderm cell groups, with the result that no factor from other cells is present in the medium (ie, added FGF7, FGF10, It is thought that the differentiation progressed efficiently in the direction of thymic epithelial cells.
  • thymic epithelial progenitor cells or medullary thymic epithelial cells can be prepared in vitro. These cells can be used as a therapeutic material for thymic disorders. It is also expected that a thymus-like tissue / organ is constructed using cells obtained by the method of the present invention and used as an educational organ for T cells.

Abstract

　多能性幹細胞を胸腺上皮前駆細胞又は髄質胸腺上皮細胞へと分化誘導する手段を提供することを課題とする。多能性幹細胞を胚体内胚葉系細胞へと分化させる第１誘導工程と、FGF8、FGF7、FGF10、BMP4及び塩化リチウムを併用することによって、胚体内胚葉系細胞から胸腺上皮前駆細胞又は髄質胸腺上皮細胞へと分化させる第２誘導工程とを行い、多能性幹細胞を胸腺上皮前駆細胞又は髄質胸腺上皮細胞へ分化誘導する。第２誘導工程では、培地にFGF8を添加し且つFGF7及びFGF10は添加しない条件下での第１培養に続いて、培地にFGF7及びFGF10を添加した条件下での第２培養を行う。

Description

多能性幹細胞を胸腺上皮へ分化誘導する方法
　本発明は多能性幹細胞を特定の細胞系譜へ分化誘導する方法に関する。詳しくは、多能性幹細胞を胸腺上皮前駆細胞又は髄質胸腺上皮細胞へ分化誘導する方法に関する。本出願は、２００９年６月９日に出願された日本国特許出願第２００９－１３８６５６号に基づく優先権を主張するものであり、当該特許出願の全内容は参照により援用される。
　免疫は微生物などによる外からの攻撃や、がんによる内からの破壊から個体を守る仕組みである。このような免疫を司る細胞の代表が食細胞とリンパ球であり、これらの細胞は血管やリンパ管を介して体全体に移動している。食細胞は好中球やマクロファージなどで構成されており、これらは抗原の侵入部位に動員される。また、１つのリンパ球は1つの抗原にのみ結合する抗体やレセプターを形成することから、抗原の数に見合った106を超える種類のリンパ球が一の個体に備わっていることとなる。免疫系はリンパ球や食細胞が発生・分化する胸腺や骨髄などの中枢リンパ組織と、そこで産生された細胞が移動して集まる脾臓やリンパ節などの末梢リンパ組織からなる。末梢組織に集まるリンパ球には胸腺由来のT細胞と骨髄由来のB細胞がある。免疫系の働きは、抗原の刺激を引き金として細胞間のシグナル交換によって起き、こうした細胞間のシグナル交換は抗原を異物として取り込んだマクロファージとT細胞、その結果活性化するT細胞とB細胞、活性化リンパ球と食細胞の間で起こる（参考文献３４、３７）。
　T細胞はウイルス感染細胞を破壊する細胞性免疫と、細菌防御の主役である特異的な抗体産生をするB細胞を助ける体液性免疫の両方に関与する。また、T細胞も血管とリンパ管を通って全身を循環している。そして、T細胞には抗原やMHC分子を認識する受容体であるTCRが存在し、このTCRは1つのT細胞に1種類しかなく、T細胞も無数の抗原提示に対応するため、無数のレパートリーを持っていなければならない。T細胞には大まかに分けて細胞表面にCD4のタンパクを有する細胞とCD8のタンパクを有する細胞の2種類がある。細胞表面にCD4を有するナイーブThやTh1、Th2などから構成されるヘルパーT細胞は抗原提示細胞を認識し、サイトカインを産出・放出することによって、他の免疫細胞の働きを調節する。Th2はB細胞を介した抗体産生による体液性免疫を司り、Th1はマクロファージの貪食した細菌に対してサイトカインを放出して殺作用を示す。細胞表面にCD8タンパクを有するキラーT細胞は、ウイルスに感染した自己の細胞をまるごと破壊することによって更なる感染を防ぐ細胞性免疫を司る。
　これらT細胞の分化やレパートリーをつくりだしている器官が胸腺である（１、３６、３７）。T細胞の分化は胸腺のストローマ上でおこなわれ、このストローマは胸腺上皮細胞や繊維芽細胞、マクロファージ、樹状細胞などのさまざまな細胞から構成されている。しかし、胸腺特異的な機能は主に胸腺上皮が担っており、マトリックスの大部分を胸腺上皮が占めている。このストローマ自体を組織学的に２つの領域である皮質（cortex）と髄質（medulla）に分けることができる。
　T細胞はいくつかの異なる表現型を通り分化する。CD4とCD8の発現の違いからDN（Double Negative）、DP（Double Positive）、SP（Single Positive）に分けることができ、さらにDNの段階では、CD44とCD25の発現の違いからさらに４つの段階であるDN1～3そして４（pre-DP）に分けることができる。異なる分化段階にある胸腺T細胞は成熟した胸腺において空間的に異なる領域に存在しており、胸腺への移入から胸腺T細胞と胸腺上皮細胞がT細胞への分化に密接に関係していることが知られている。
　胸腺の皮質領域では、胸腺前駆細胞からDPの胸腺T細胞までの分化後、自己のMHCを認識する細胞が生き残る正の選択（Positive Selection）が行われる。そして、髄質領域では胸腺T細胞のDPからSPへの分化とその後に自己抗原を認識しない胸腺細胞だけが生き残る負の選択（Negative Selection）が行われ、自己の細胞に対する免疫寛容が成立する。そして、髄質胸腺上皮細胞（mTEC）で乱雑な遺伝子発現が起きていることは免疫寛容の誘導にとって重要な役割を担っていることを示唆する。また、in vitroの研究では、T細胞系統になる予定のマウス胎児肝臓造血前駆細胞からCD4＋CD8＋であるDP段階への連続分化がNotch-ligandであるデルタ１（Dll1）を遺伝子導入した骨髄ストローマ細胞であるOP9との共培養で実現した（参考文献１７）。しかし、成熟したSPのT細胞への分化については、胸腺組織を用いた培養でしか実現していない。
　T細胞の分化において重要な細胞である胸腺上皮細胞を再生することは、胸腺が関係する免疫機能の解明に繋がる。例えば、加齢に伴う免疫機能の低下が知られているが、この原因としてT細胞の構成や能力の変化があり、また、性ホルモンであるアンドロゲンやエストロゲンの変化によって、胸腺自体が思春期を過ぎると急激に萎縮をはじめることが知られている。このような胸腺の萎縮（老化）とT細胞の構成を含む免疫機能の低下の因果関係、そして、胸腺の発達、免疫寛容を起こす機構の解明に重要な知見をもたらすことが期待される。さらに、自己から作製したiPS細胞（Induced pluripotent stem cells：人工多能性幹細胞）を用いて胸腺上皮細胞を再生できれば、遺伝子疾患によって正常な胸腺をつくることができないDiGeorge症候群の治療やT細胞の異常による自己免疫疾患の治療、また、T細胞の再構成をin vitroで効率よく行い、減少したT細胞のレパートリーを移植する方法、さらにはin vitroで微生物もしくは微生物感染細胞や腫瘍細胞を攻撃できるT細胞に分化させ、移植する治療などの臨床応用も期待できる。
　尚、多能性幹細胞の分化誘導法に関する文献（特許文献１）を以下に示す。また、胸腺の発達に関与する因子に関する報告（非特許文献１～５）を列挙する。
特表２００８－５０９６７６号公報
ShinsukenTada,(2005) Characterization of mesendoderm: a diverging point of the definitive endoderm and mesoderm in embryonic stem cell differentiation culture, Development, 132: 4363-4374 Peter S. Klein, (1993) A molecular mechanism for the effect of lithium on development. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8455-8459 Gina Balciunaite, (2002) Wnt glycoproteins regulate the expression of FoxN1, the gene defective in nude mice, Nature Immunology, 3. 11: 1102-1108 William E. Jenkinson, (2003), Differential Requirement for Mesenchyme in the Proliferation and Maturation of Thymic Epithelial Progenitors, J. Exp. Med, 198. 2: 325-332 Conrad C. Bleul, (2005) BMP Signaling Is Required for Normal Thymus Development, The Journal of Immunology, 175: 5213-5221 Deborah U. Frank . et al.(2002) An Fgf8 mouse mutant phenocopies human 22q11 deletion syndrome. Development, 129: 4591-4603. Taishin Akiyama, (2008) The Tumor Necrosis Factor Family Receptors RANK and CD40 Cooperatively EsTablish the Thymic Medullary Microenvironment and Self-Tolerance, Immunity, 29: 423-437
　上記の通り、胸腺を再生することは、各種胸腺障害に対する有効な治療法の確立を可能とし、さらには、胸腺の萎縮と老化に伴う免疫機能低下の関係性や胸腺の発達に必要な因子の解明にも繋がり、その意義は大きい。しかしながら、現在までのところ、iPS細胞等の多能性幹細胞を用いて胸腺の再生に成功したという報告はない。
　そこで本発明は、胸腺の再生を目指し、多能性幹細胞を胸腺上皮前駆細胞又は髄質胸腺上皮細胞へと分化誘導する手段を提供することを課題とする。
　近年まで、胸腺は二胚葉由来（皮質が外胚葉由来、髄質が内胚葉由来）であると考えられていたが、外胚葉と胸腺の分化には明らかな関連性が見つからなかったことが報告され、胸腺が内胚葉由来であることが証明された。また、その後の研究によって、胸腺の初期器官形成は副甲状腺と密に連携しており、この両方の器官はマウスのE11あたりで内胚葉である第3咽頭嚢から生じた器官原基から発達することがわかった。この段階の原基は胸腺と副甲状腺への前駆細胞を含んでおり、遺伝子発現の点から胸腺と副甲状腺の領域に分けられることが判明した。胸腺が内胚葉から生じた事実から、胸腺における皮質胸腺上皮細胞(cTEC)と髄質胸腺上皮細胞(mTEC)は同じ内胚葉由来であることが解明された。しかし、胸腺の形成・発達に関しては解明すべき事項が依然として多い。
　以上の背景の下、本発明者らは上記課題を解決すべく、ES細胞及びiPS細胞を用いて胸腺上皮の再生を試みた。内胚葉は前原腸胚の外と中の層を構成する近位（Visceral）内胚葉と胚盤胞の内部細胞塊由来である胚盤葉上層から成っており、原腸形成を行う前に、内胚葉は胚体外の卵黄嚢の近くに置き換わる。また、原腸胚形成時に胚盤胞細胞は原始線条（Primitive Streak）の後ろの区分を通って進入し、胚体（definitive）内胚葉を形成する。胚体外の近位内胚葉の運命とは対照的に、胚体内胚葉は消化管の形成や肝臓や膵臓のような腸と関連した内臓に分化する。胸腺は胚体内胚葉から発生していると考え、この分化方法を調べた。ES細胞を用いたこの2つの内胚葉への分化方法がすでに知られており、近位内胚葉への分化には特定の因子を必要とせず、細胞濃度を密にすることで誘導できる。そして胚体内胚葉への分化に関しては、発生初期における中胚葉誘導因子として知られているアクチビンＡ(AA)を用いる誘導方法が知られている。また、アクチビンＡは異なる濃度によって3胚葉全てに誘導ができることも知られている。アクチビンＡを用いた胚体内胚葉への分化誘導は内中胚葉を介したものであり、発生学上の原始線条を介した胚体内胚葉への分化と同様であることも証明されている（非特許文献１、２）。
　そこで、内中胚葉及び胚体内胚葉を経由して胸腺上皮前駆細胞へと分化誘導させる戦略を取ることにした。具体的には胚体内胚葉への分化誘導（第１誘導工程）の後、胸腺上皮前駆細胞へと分化誘導させる（第２誘導工程）という、２段階の培養によって多能性幹細胞を胸腺上皮へと分化誘導することにした。検討の結果、アクチビンだけを使うのではなく、Wntシグナル系であるWnt-βカテニン経路を刺激することができる塩化リチウム（LiCl）を併用することによって、胚体内胚葉誘導効率を上げることに成功した。また、効率的な分化誘導を可能にする、LiClの最適な添加濃度を見出すこともできた。次に、(1)胸腺の発達では、Wntは胸腺で重要な遺伝子であるFoxN1の発現を増加させ、LiClを用いてもFoxN1遺伝子の発現増加が確認されていること（非特許文献３）、(2) FGF（Fibroblast Growth Factor：線維芽細胞増殖因子）7とFGF10は胸腺原基周囲の間充組織から放出され、胸腺の発達と深く関わりがあることが示唆されていること（非特許文献４）、(3) BMP4は胸腺原基になる部位で発現があり、BMP（bone morphogenesis protein：骨形成因子）4欠損マウスでは胸腺が形成不全を起こすことが確認されていること（非特許文献５）、(4) FGF8欠損マウスにおいて、胸腺の形成不全を起こすことが確認されていること（非特許文献６）を参考にしつつ、独自の視点に基づき、胸腺上皮前駆細胞への分化誘導を試みた。試行錯誤の末、FGF8の存在下での培養に続いてFGF7及びFGF10の存在下で培養するという培養法を採用した。また、LiClを全培養工程に加えることにし、BMP4を培養後半（FGF7とFGF10を添加する際）に添加することにした。そして、細胞の経時的な変化をRT-PCRで調べた結果、胸腺上皮前駆細胞への分化が確認された。続いて、髄質胸腺領域の発達と自己寛容の構築に重要な因子としてRANKリガンドとCD40が示唆され、初期の髄質胸腺上皮細胞の構築に、RANKリガンドの重要であるとの報告（非特許文献７）に注目し、髄質胸腺上皮細胞への分化を促すために、RANKリガンドを添加することにした。その結果、髄質胸腺上皮細胞への分化が確認された。本発明は主として以上の成果に基づく。
　［１］多能性幹細胞を胸腺上皮前駆細胞又は髄質胸腺上皮細胞へ分化誘導する方法であって、
　多能性幹細胞を胚体内胚葉系細胞へと分化させる第１誘導工程と、
　FGF8、FGF7、FGF10、BMP4及び塩化リチウムを併用することによって、胚体内胚葉系細胞から胸腺上皮前駆細胞又は髄質胸腺上皮細胞へと分化させる第２誘導工程と、を含み、
　前記第２誘導工程において、培地にFGF8を添加し且つFGF7及びFGF10は添加しない条件下での第１培養に続いて、培地にFGF7及びFGF10を添加し且つFGF8は添加しない条件下での第２培養を行う、方法。
　［２］第１誘導工程が、培地にアクチビン及び塩化リチウムを添加した条件下で細胞培養する工程である、［１］に記載の方法。
　［３］培地中の塩化リチウムの濃度が約5mMである、［２］に記載の方法。
　［４］第１培養が、培地にFGF8及び塩化リチウムを添加した条件下で細胞培養する工程である、［１］～［３］のいずれか一項に記載の方法。
　［５］第１培養が、培地にFGF8、塩化リチウム及びアクチビンを添加した条件下で細胞培養する工程である、［１］～［３］のいずれか一項に記載の方法。
　［６］第２培養が、培地にFGF7、FGF10、BMP4及び塩化リチウムを添加した条件下で細胞培養する工程である、［１］～［５］のいずれか一項に記載の方法。
　［７］第１誘導工程及び第２誘導工程に使用される培地が血清を含まない、［１］～［６］のいずれか一項に記載の方法。
　［８］第２誘導工程が、培地にRANKリガンド又はCD40リガンドを添加した条件下での第３培養を含み、該培養によって髄質胸腺上皮細胞が誘導される、［１］～［７］のいずれか一項に記載の方法。
　［９］多能性幹細胞が胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞である、［１］～［８］のいずれか一項に記載の方法。
胚体内胚葉への分化誘導条件の検討。アクチビンA（10 ng/ml）を添加した無血清培地SF-O3でES細胞を４日間培養し、フローサイトメトリーで解析した。E-カドヘリンとPDGFR-αの両方が陽性の細胞群（内中胚葉）は13.2%存在した（左）。一方、E-カドヘリンとCXCR4の両方が陽性の細胞群（胚体内胚葉）は25.3%存在した（右）。 胚体内胚葉への分化誘導条件の検討（ES細胞を使用）。アクチビンAとLiClを併用した場合の効果をフローサイトメトリーで解析した。LiClの濃度によって内中胚葉への誘導効率が変化する。 胚体内胚葉への分化誘導条件の検討（iPS細胞を使用）。アクチビンAとLiClを併用した場合の効果をフローサイトメトリーで解析した。アクチビンAとLiClの併用によって、効率的に内中胚葉ヘ分化する（左）。 胸腺上皮前駆細胞への分化誘導法のプロトコル。培養４日目（D4）まではアクチビンAとLiClを添加した無血清培地で培養する。培養４日目（D4）～培養７日目（D7）はFGF8とLiClを添加した無血清培地で培養する。そして、培養７日目（D7）以降はFGF7、FGF10、BMP10及びLiClを添加した無血清培地で培養する。 RT-PCRによる遺伝子発現の変化。培養０日目（D0）、４日目（D4）、７日目（D7）、９日目（D9）、１２日目（D12）及び１５日目（D15）に細胞を回収し、RT-PCRで各種遺伝子の発現状態を解析した。 培養１４日目の細胞を用いたフローサイトメトリーの結果。二つの細胞集団（上段、12%と58%）を認めた。小細胞集団（12%）にEpCAM1とMTS24が発現している。 髄質胸腺上皮細胞への分化誘導法のプロトコル。培養４日目（D4）まではアクチビンAとLiClを添加した無血清培地で培養する。培養４日目（D4）～培養７日目（D7）はFGF8とLiClを添加した無血清培地で培養する。培養７日目（D7）～培養１２日目（D12）はFGF7、FGF10、BMP10及びLiClを添加した無血清培地で培養する。培養１２日目（D12）以降はRANKリガンドとLiClを添加した無血清培地で培養する。 RT-PCRによる遺伝子発現の変化。培養０日目（D0）、４日目（D4）、１２日目（D12）及び１６日目（D16）に細胞を回収し、RT-PCRで各種遺伝子の発現状態を解析した。 リアルタイムPCRによる遺伝子発現解析。培養０日目（D0）、１２日目（D12）及び１６日目（D16）に細胞を回収し、Pax1、FoxN1及びK5の発現状態を調べた。 胸腺上皮前駆細胞への分化誘導法（改良法）のプロトコル。培養４日目（D4）まではアクチビンAとLiClを添加した無血清培地で培養する。培養４日目（D4）～培養７日目（D7）はFGF8、LiCl及びアクチビンAを添加した無血清培地で培養する。そして、培養７日目（D7）以降はFGF7、FGF10、BMP10及びLiClを添加した無血清培地で培養する。 改良法で分化誘導された細胞群の変化を示すH.E染色像。アクチビンAを添加しないで得られた細胞群（A-細胞群）とアクチビンAを添加して得られた細胞群（A+細胞群）の培養7日目の形態を比較した。スケールバーは200μm。 改良法で分化誘導した細胞の遺伝子発現の変化（RT-PCRの結果）。培養０日目（D0）、７日目（D7）、１０日目（D10）及び１４日目（D14）に細胞を回収し、RT-PCRで各種遺伝子の発現状態を解析した。D14の細胞に胸腺上皮マーカーFoxN1の強い発現を認める。また、K5、Aire、Pax１などの発現も認められる。
（略号）
　本明細書では必要に応じて以下の略号を使用する。AA：Activin A、Bmp4：bone morphogenetic protein 4、Bmps：bone morphogenetic proteins、cad11：cadherin 11、cTEC：cortical thymic epithelial cell（皮質胸腺上皮細胞）、Dll1：delta-like 1、Dll4：delta-like 4、DN：double negative、DP：double positive、EB：Embryoid Body（胚様体）、E-cad（ECD)：E-cadherin、ES cell：embryonic stem cell（胚性幹細胞）、Eya1：eyes absent 1 homologue、FCM：Flow cytometry、Fgf10：fibroblast growth factor 10、Fgf7：fibroblast growth factor 7、Fgf8：fibroblast growth factor 8、Fgfr2-IIIb：Fgf receptor 2 isoform IIIb、Fgfs：fibroblast growth factors、FoxN1：forkhead box N1、FTOC：fetal thymic organ culture（胎児胸腺器官培養）、Gcm2：glial cells missing homologue 2、GSC：goosecoid、Hoxa3：homeobox A3、iPS cell：induced pluripotent stem cell、K5：cytokeratin 5、K8：cytokeratin 8、KGF：keratinocyte growth factor、mTEC：medullary thymic epithelial cell（髄質胸腺上皮細胞）、NCC：neural crest cell（神経冠細胞）、Pax1：paired box gene 1、Pax3：paired box gene 3、Pax9：paired box gene 9、PDGFR：platelet-derived growth factor receptor(血小板由来成長因子受容体)、RFTOC：reaggregate fetal thymic organ culture、RT-PCR：Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction、Shh：sonichedgehog homologue、Shh：Sonic hedgehog、Six1：sine oculis-related homeobox 1 homologue、SP：single positive、Tbx1：T-box1、TCR：：Tcell receptor（T細胞受容体）、TEC：Thymic epithelial cell（胸腺上皮細胞）、TEPC：Thymic epithelial progenitor cell（胸腺上皮前駆細胞）
　本発明は多能性幹細胞を胸腺上皮前駆細胞又は髄質胸腺上皮細胞へ分化誘導する方法（以下、「本発明の分化誘導法」とも呼ぶ。）を提供する。本明細書において「多能性幹細胞」とは、様々な組織・器官に分化できる能力を持つ細胞をいう。多能性幹細胞の例はES細胞（胚性幹細胞）、EG細胞（胚性生殖細胞）及びiPS細胞（人工多能性幹細胞）である。多能性幹細胞は好ましくはヒトの細胞である。
　多能性幹細胞は公知の方法に従って作製することができる。例えばES細胞の作製についてはStrelchenko N., et al. Reprod Biomed Online. 9: 623-629, 2004；Klimanskaya I., et al. Nature 444: 481-485, 2006；Chung Y., et al. Cell Stem Cell 2: 113-117, 2008；Zhang X., et al Stem Cells 24: 2669-2676, 2006；Wassarman, P.M. et al. Methods in Enzymology, Vol.365, 2003等が参考になる。また、iPS細胞の作製についてはTakahashi K., et al. Cell 131: 861-872, 2007；Yu J., et al. Science 318: 1917-1920, 2007.；Park IH., et al. Nature 451: 141-146, 2007等が参考になる。多能性幹細胞の中には公共の保存機関から入手可能なものもある。例えば、ヒトES細胞については京都大学再生医科学研究所付属幹細胞医学研究センター、WiCell Research Institute（マディソン、米国）、ES Cell International Pte Ltd（シンガポール）などから入手可能である。また、iPS細胞については国立大学法人京都大学又は独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンターから提供を受けることができる。
　近年、山中博士らによって作製されたiPS細胞は、従来の多能性幹細胞（ES細胞など）が抱える倫理的問題などを解決できる等、優れた特性を備える。そこで、好ましくは多能性幹細胞としてiPS細胞を採用する。
　「胸腺上皮前駆細胞」とは、胸腺上皮細胞へと分化することが運命づけられた（即ち、適切な環境下におかれると胸腺上皮細胞へと分化する）増殖性細胞をいう。また、「髄質胸腺上皮細胞」とは胸腺の髄質を構成する上皮細胞である。胸腺の皮質領域を構成する細胞は皮質胸腺上皮細胞（cTEC）と呼ばれる。
　「分化誘導する」とは、特定の細胞系譜に沿って分化するように働きかけることをいう。本発明では、胸腺上皮前駆細胞又は更に分化が進んだ髄質胸腺上皮細胞へと分化誘導する。
　本発明の分化誘導法は２段階の誘導工程、即ち、多能性幹細胞を胚体内胚葉系細胞へと分化させる工程（第１誘導工程）と、FGF8、FGF7、FGF10、BMP4及び塩化リチウム（LiCl）を併用することによって、胚体内胚葉系細胞から胸腺上皮前駆細胞又は更に分化が進んだ髄質胸腺上皮細胞へと分化させる工程（第２誘導工程）を含む。以下、各工程の詳細を説明する。
（第１誘導工程）
　この第１誘導工程では多能性幹細胞を培養し、胚体内胚葉系細胞へと分化させる。換言すれば、胚体内胚葉系細胞への分化を誘導する条件下で多能性幹細胞を培養する。多能性幹細胞として好ましくは倫理的問題の少ないiPS細胞が用いられるが、ES細胞など他の多能性幹細胞を用いることもできる。
　過去に報告されたように（Development (2005) 132, Shinsuken Tada et al.）、発生初期には２つの内胚葉、即ち後に消化管と付属器官を形成する胚体内胚葉（definitive endoderm）と、後に卵黄嚢の上皮を形成することになる近位内胚葉（Visceral endoderm）への分化が可能である。胚体内胚葉は内中胚葉（mesendoderm）を経由して形成される。本発明では、胸腺は前腸にある咽頭から発生することを考慮し、内中胚葉を経由する胚体内胚葉から胸腺上皮前駆細胞へ分化させることを目指す。そのために第１誘導工程では、内中胚葉へ分化するように例えばアクチビン（好ましくはアクチビンＡ）と塩化リチウム（LiCl）を添加した培地で多能性幹細胞を培養する。この場合のアクチビン濃度は例えば1 ng/ml～100 ng/ml、好ましくは5 ng/ml～30 ng/mlとする。同様にLiClの濃度は例えば0.5 mM～30 mMとする。誘導効率を向上させるため、LiClの濃度は好ましくは2 mM～10 mM、更に好ましくは約5 mMとする。
　内中胚葉から胚体内胚葉へは自然に（特別の誘導がなくても）分化することが知られている。従って、例えば上記の培養条件下（アクチビンとLiClを添加した培地を用いた培養）での培養を継続することによって胚体内胚葉系細胞が生ずることになる。
　第１誘導工程の期間（培養期間）は例えば２日～７日、好ましくは３日～５日、更に好ましくは４日である。
　多能性幹細胞が内中胚葉を経由して胚体内胚葉に分化する限り、以上で説明した培養条件を満たすこと以外、培養条件は特に限定されない。但し、好ましくは追加の培養条件として「血清を含まない培地を使用する」という培養条件を採用する。この態様の場合、好ましくは、アクチビンとLiClが添加された無血清培地を使用することになる。無血清培地を使用すると分化誘導の効率が高まる。
（第２誘導工程）
　この工程では、FGF8、FGF7、FGF10、BMP4及びLiClを併用することによって、胚体内胚葉系細胞から胸腺上皮前駆細胞又は髄質胸腺上皮細胞へと分化させる。このように当該工程は５種類の因子（FGF8、FGF7、FGF10、BMP4及びLiCl）を組み合わせて使用することに特徴を有する。但し、これらの因子は全てが同時に使用されるのではなく、添加順序が重要である。具体的には、本発明では培地にFGF8を添加し且つFGF7及びFGF10は添加しない条件下での培養（第１培養）を行った後、培地にFGF7及びFGF10を添加し且つFGF8は添加しない条件下での培養（第２培養）を行う。理論に拘泥する訳ではないが、第１培養ではFGF8の作用によって咽頭部内胚葉への分化が進み、第２培養ではFGF7及びFGF10の作用によって更に分化が進み、胸腺上皮前駆細胞が生ずることになる。LiClについては、第２誘導工程の全培養期間を通して培地に添加しておくことが好ましい。これによって分化を促進できる。BMP4については第２培養の際に培地に添加しておくことが好ましい。このようにBMP4は分化がある程度進んだ段階で添加するとよい。これによって、胸腺上皮への分化を決定づけるとともに分化を促進することができる。尚、LiClは、胸腺の発達において重要な遺伝子であるFoxN1の発現を増加させることが知れているWntと同様の作用を有する。また、FGF7やFGF10は胸腺原基周囲の間充組織から放出されている因子であり、胸腺の発達と深く関わりがある。骨形成因子でもあるBMP4については胸腺原基となる部位での発現が認められ、BMP4欠損マウスでは胸腺の形成不全が起こることが報告されている。FGF8の欠損マウスおいても同様に胸腺の形成不全が報告されている。本発明では、上記の規定通りの独自の組合せ及び使用時期によってこれらの因子を併用し、第１誘導工程によって胚体内胚葉系細胞へと分化した多能性幹細胞を胸腺上皮へと分化誘導する。
　ここで、培地中の各因子の添加濃度の例を以下に示す。括弧内は好ましい濃度範囲である。
　FGF8：0.4 ng/ml～ 40 ng/ml（2 ng/ml～20 ng/ml）
　FGF7：2 ng/ml～200 ng/ml（10 ng/ml～100 ng/ml）
　FGF10：0.5 ng/ml～50 ng/ml（2.5 ng/ml～25 ng/ml）
　BMP4：1 ng/ml～100 ng/ml（5 ng/ml～50 ng/ml）
　LiCl：0.5 mM～30 mM（2 mM～10 mM）
　第１培養の培養期間は例えば２日～７日、好ましくは２日～４日、更に好ましくは３日である。同様に第２培養の培養期間は例えば４日～２０日、好ましくは６日～１５日、更に好ましくは７日～１０日である。
　第１誘導工程によって生じた胚体内胚葉系細胞が髄質胸腺上皮細胞へと分化誘導される限りにおいて、以上で説明した培養条件を満たすこと以外、培養条件は特に限定されない。但し、第１誘導工程の場合と同様に第２誘導工程においても好ましくは追加の培養条件として「血清を含まない培地を使用する」という培養条件を採用する。無血清培地を使用すると分化誘導の効率が高まる。
　一態様では、第２誘導工程において第１培養及び第２培養に続き、培地にRANKリガンド又はCD40リガンドを添加した条件下で培養（第３培養）する。この第３培養は、分化を進行させて髄質胸腺上皮細胞を誘導するために行われる。RANKリガンド又はCD40リガンドに加えてLiClを添加した培地を使用することが、より好ましい。従って好ましい一態様では、RANKリガンド又はCD40リガンドと、LiClとを添加した無血清培地を用いて培養する。また、第２培養の際に培地に添加する因子（FGF7、FGF10、BMP4）の一つ以上を併用することにしてもよい。RANKリガンドとCD40リガンドは排他的なものではなく、両者を併用することにしてもよい。RANKリガンド又はCD40リガンドの添加濃度は例えば1 ng/ml～100 ng/ml、好ましくは5ng/ml～15 ng/mlである。第３培養の培養期間は例えば２日～２０日、好ましくは３日～１５日、更に好ましくは４日～１０日である。
　RANKリガンドとCD40リガンドは、胸腺における髄質領域の発達と自己寛容の構築に重要な因子であり（参考文献１８）、これらを用いることにより、胸腺上皮前駆細胞から髄質胸腺上皮細胞を選択的に生じさせることができる。尚、初期の髄質領域の構築にはRANKリガンドがより重要であることが示唆されていることに鑑み（上掲の文献）、本発明では好ましくはRANKリガンドを使用する。
　好ましい一態様では、第１培養をFGF8、LiCl及びアクチビンを添加した条件で行う。この条件を採用することにより、目的の細胞を効率良く得ることができる。また、後の培養においてRANKリガンド等を使用しなくとも、胸腺上皮細胞様の細胞群をより単一的な細胞群として得ることが可能となる。尚、この条件の採用と上記第３培養の採用は互いに排他的なものではない。即ち、この態様においても、上記第３培養を行うことにしてもよい。
　典型的には、第１誘導工程を経て得られた細胞集団又はその一部を、選別することなく第２誘導工程に供する。一方で、第１誘導工程を経て得られた細胞集団の中から胚体内胚葉系細胞を選別した上で第２誘導工程を実施することにしてもよい。胚体内胚葉系細胞の選別は例えば、細胞表面マーカーを指標にしてフローサイトメーター（セルソーター）で行えばよい。
　第２誘導工程によって胸腺上皮前駆細胞が得られる。即ち、細胞集団の少なくとも一部として胸腺上皮前駆細胞が認められることになる。胸腺上皮前駆細胞であることは例えばPax1、Pax9、Eya1、Six1等が発現していることで確認できる。第１培養及び第２培養に続いて第３培養も実施した場合には更に分化が進んだ髄質胸腺上皮細胞が得られる。即ち、細胞集団の少なくとも一部として髄質胸腺上皮細胞が認められることになる。一態様では、胸腺上皮前駆細胞と髄質胸腺上皮細胞が混在した状態の細胞集団となる。髄質胸腺上皮細胞であることは例えばケラチン5が発現する一方でケラチン8が発現していないこと（K5+,K8-）やFoxN1が発現していることで確認できる。
　目的の細胞（胸腺上皮前駆細胞及び／又は髄質胸腺上皮細胞）のみからなる細胞集団又は目的の細胞が高比率（高純度）で含まれた細胞集団を得ようと思えば、目的の細胞に特徴的な細胞表面マーカーを指標にして培養後の細胞集団を選別・分取すればよい。
　第１誘導工程及び／又は第２誘導工程の途中において継代培養を行ってもよい。例えばコンフルエント又はサブコンフルエントになった際に細胞の一部を採取して別の培養容器に移し、培養を継続する。分化を促進するために細胞密度を低く設定することが好ましい。例えば1×104個／cm2～1×106個／cm2程度の細胞密度で細胞を播種するとよい。典型的には培養皿などを用いて二次元的に細胞を培養するが、ゲル状の培養基材などを用いた３次元培養を実施することにしてもよい。
　第１誘導工程に使用する培地や第２誘導工程に使用する培地に含有させることができる他の成分としては、ウシ血清アルブミン（BSA）、抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン等）、血清代替物（Knockout serum replacement(KSR)など）、還元剤（2－メルカプトエタノールなど）等を例示することができる。基本培地には例えばSF-03（三光純薬株式会社）が利用できる。
　培養温度等、その他の培養条件は、動物細胞の培養において一般に採用されている条件とすればよい。即ち、例えば37℃、5%CO2の環境下で培養すればよい。
１．材料及び方法
（１）RT-PCR及びリアルタイム定量RT-PCR
　RNAをTRIzol Reagent(invitrogen)とGlycogen(Roche)を用い、添付のプロトコルに従って培養細胞や組織から抽出した。次に0.5μgのmRNAをDeoxyribonuclease I, Amplification Grade(invitrogen)を用いDNase処理をし、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits(Applied Biosystems)を用い、添付のプロトコルに従ってcDNA合成をした。そしてTakara Ex Taq（TaKaRa）を用いPCRを行った。使用したプライマーは以下の通りである。β-アクチンFw（フォワード）(5'-agtgtgacgttgacatccgt-3'：配列番号１), β-アクチンRv（リバース）(5'-gcagctcagtaacagtccgc-3'：配列番号２), FoxN1 Fw(actcttcccaaagcccatct：配列番号３), FoxN1 Rv(agcaatggggtctttcctct：配列番号４), Pax1 Fw(gcagccggctacctatctc：配列番号５), Pax1 Rv(ggcagtccgtgtaagctacc：配列番号６), Pax3 Fw(ctgcactcaagggactcctc：配列番号７), Pax3 Rv(gttgtcacctgcttgggttt：配列番号８), Pax9 Fw(gctgccctacaaccacattt：配列番号９), Pax9 Rv (accagaaggagagcagcactgt：配列番号１０), Hoxa3 Fw(cacctggaactggagaccat：配列番号１１), Hoxa3 Rv(accgtagatcgctgagctgt：配列番号１２), Six1 Fw(ttaagaaccggaggcaaaga：配列番号１３), Six1 Rv(accaaactggaggtgagtgg：配列番号１４), Eya1 Fw(tgcatatgggcaaacacagt：配列番号１５), Eya1 Rv(gaactgttgaatccggagga：配列番号１６), Tbx1 Fw(tgaagaagaacccgaaggtg：配列番号１７), Tbx1 Rv(ttgtcatctacgggcacaaa：配列番号１８), AIRE Fw(caactctggcctcaaagagc：配列番号１９), AIRE RV(cctgactcaaacacctgctg：配列番号２０), K5 Fw(cctgactcaaacacctgctg：配列番号２１), K5 Rv(aactcattctcagccgtggt：配列番号２２), Dll1 Fw(ccggctgaagctacagaaac：配列番号２３), Dll1 Rv(taagtgttggggcgatcttc：配列番号２４), Dll4 Fw(tcagccaaatcatcatccaa：配列番号２５), Dll4 Rv(gtgggggatacattcattgc：配列番号２６), Bmi1 Fw(tgtgtcctgtgtggagggta：配列番号２７), Bmi1 Rv(tgcaacttctcctcggtctt：配列番号２８), p63 Fw(gagatccccagatgatgagc：配列番号２９), p63 Rv(tgaagtaggtgctggtgctg：配列番号３０), Plet1 Fw(cttccacacctgggactgtt：配列番号３１), Plet1 Rv(cgtcctccttcactgctttc：配列番号３２), FGFr2 Fw(caccgagaagatggagaagc：配列番号３３), FGFr2 Rv(gtctgacgggaccacacttt：配列番号３４), K8 Fw(atcgagatcaccacctaccg：配列番号３５), K8 Rv(agccagggctagtgagt：配列番号３６), CK18 Fw(cgaggcactcaaggaagaac：配列番号３７), CK18 Rv(ctgagccagcgcttcatact：配列番号３８), Oct3/4 Fw(ccaatcagcttgggctagag：配列番号３９), Oct3/4 Rv(ctgggaaaggtgtccctgta：配列番号４０), Nanog Fw(aagtacctcgacctccagca：配列番号４１), Nanog Rv(cgtaaggctgcagaaagtcc：配列番号４２), E-cad Fw(aaacttggggacagcaacatcag：配列番号４３), E-cad Rv(tcttttggtttgcagagacaggg：配列番号４４), GSC Fw(ctcggaggagtcagaaaacg：配列番号４５), GSC Rv(tcgactgtctgtgcaagtcc：配列番号４６) Brachyury(T) Fw(ctcctcatagcctcgtggac：配列番号４７), Brachyury(T) Rv(ggcaacaagggaggacatta：配列番号４８), Cad11 Fw(tcagggaacattcatgccac：配列番号４９), Cad11 Rv(ttctatgccgtctccatcaac：配列番号５０), Sox17 Fw(aagattgagaaaacacgcatgac：配列番号５１),Sox17 Rv(tttgtgtataagcccgagatgg：配列番号５２), Sox1 Fw(gcccaggaaaaccccgagatg：配列番号５３), Sox1 Rv(ccgttagcccagccgttgac：配列番号５４), PDGFRα Fw及びRv(桜井博士（京都大学）から供与された)
（２）FACS解析
　培養細胞を0.05%もしくは0.25％Trypsin-EDTA(GIBCO)で回収し、細胞を解離してから遠心処理を行った。上清を取り除き、0.1% BSAを含むHBSS(GIBCO)で懸濁し、細胞をカウントした。カウント後、目的の細胞数（解析の場合は2×105）を遠心チューブに移し、遠心後、上清を取り除いた。ブロッキング処理のため10%FBS/HBSSに懸濁した後、20分間氷上に静置した。遠心処理によって上清を取り除いた後、1次抗体を含むHBSSで細胞を懸濁し、氷上に15～30分間静置した。2次抗体を使用する際には、1度HBSSを用いて洗浄した後に、1次抗体と同様の手順で染色した。その後、フローサイトメーター（FACSCalibur、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社、日本）で検出した。解析にはFLOW JOソフトウエア（トミーデジタルバイオロジー株式会社、日本）を使用した。ラットモノクローナル抗体であるAPA5（抗PDGFR-α）抗体及びECCD2抗体は西川博士（理化学研究所発生科学研究センター幹細胞研究グループ）より供与された。フィコエリスリン標識ストレプタビジン（BD Pharmingen）をビオチン化APA5抗体の検出に使用した。アロフィコシアニン（APC）を使用する標準的な方法でECCD2モノクローナル抗体を標識化した。ビオチン化抗マウスEpCAM抗体をBioLegend社（カリフォルニア州、米国）から購入した。MTS24はBoyd, R.L.氏（Monash Immunology and Stem Cell Laboratories, Monash University, Australia）より供与を受けた。
（３）In vitroにおける細胞の維持と分化誘導
（ａ）細胞の維持
　CCE（ES）細胞は桜井博士（京都大学）から供与された。また、iPS(APS0001)細胞は理研細胞バンクから購入した。これらの細胞の維持は2 mM L-グルタミン(GIBCO)と0.1 mM Non-Essential MEM(GIBCO)、50ユニット/ml- 50 mg/mlペニシリン-ストレプトマイシン(GIBCO)、0.1 mM 2-メルカプトエタノール(Sigma Aldrich)、103ユニット/ml LIF（白血病抑制因子を含む15%FBS/KNOCKOUT DMEM（invitrogen）培地で行った。2日に1回の頻度で細胞を継代した。iPS細胞については培地交換を毎日行った。また、フィーダー細胞を用いずに維持するため、0.1% ブタ皮膚由来Ａ型ゼラチン（Gelatin from porcine skin,Type A）(SIGMA)/DWでコートした培養皿を使用した。細胞の多能性を維持するため、液体窒素に保存し、できるだけ解凍培養後早期の細胞を実験に使用した。細胞のパッセージの際には0.25％ Trypsin-EDTA(GIBCO)で細胞を解離させて回収した。遠心処理後、上清を取り除き、4×105個の細胞を10cm培養皿に蒔いた。
（ｂ）分化誘導に用いた試薬
　分化誘導には、0.2% BSAを含む無血清SF-03(三光純薬)を使用した。分化誘導に用いた因子はアクチビンA(R&D systems)、FGF8b(R&D systems)、FGF7(R&D systems)、FGF10(R&D systems)、BMP4(R&D systems)、LiCl(Sigma Aldrich)及び2-メルカプトエタノールである。また、分化誘導の際は、コラーゲンIV型(新田ゼラチン)でコートした培養皿を使用した。分化誘導の際の細胞数は2×105／10cm培養皿とした。
（４）腎皮膜下へのコラーゲンスポンジの移植
　in vitroでの分化誘導後の細胞をin vivoで培養する方法として、細胞を吸収させたコラーゲンスポンジを腎臓の皮膜下に移植した。まず、分化誘導後の細胞を0.25％Trypsin-EDTA(GIBCO)で回収した後、遠心処理に供した。上清を取り除いた後、無血清培地で洗浄し、続いてPBS(-)で2回洗い、1～2×106の細胞を10μlのPBSに懸濁した。このようにして調製したサンプルを、3mm四方に切ったコラーゲンスポンジ(KOKEN)に吸収させ、ヌードマウスの腎皮膜下に移植した（参考文献１９）。
（５）組織解析
（ａ）凍結切片の作製
　移植したコラーゲンスポンジを3週間後に回収し、OCTコンパウンド(Sakura)に埋没させ、液体窒素で固めた。光顕用凍結ミクロトーム（CW3050-4、共通機器）を用いて5μm厚の凍結切片を作製し、APSコート付のスライドグラス(MATSUNAMI)に貼り付けた。
（ｂ）ヘマトキシリン・エオジン(H.E)染色
　凍結切片を乾燥させた後、100％エタノールで処理し、完全に乾いたのを確認した後、蒸留水（DW）で洗浄した。4% ホルムアルデヒド/PBSで固定した後、DWで洗浄した。続いてヘマトキシリン溶液(WAKO)で染色した後、流水で洗浄した。次に、エオジン(MERCK)で染色した後、流水で洗浄した。乾燥したことを確認した後、マリノール(MUTO PURE CHEMICALS co. LTD)で封入した。
（６）蛍光免疫染色
　凍結切片を乾燥させた後、冷アセトンで固定し、PBSで3回洗浄した。次にブロッキング液(1%(2次抗体の免疫動物の血清)と0.2% BSA、0.2% Triton X-100/PBS)を用い室温でブロッキング処理を行った後、1次抗体で染色し、4℃で一晩置いた。次の日にPBST(0.2% Triton X-100/PBS)で3回洗浄した後、2次抗体で染色し、4℃で一晩置いた。PBSで3回洗浄した後、蛍光用のMounting Medium(DAKO)で封入し、乾燥したことを確認した後、蛍光顕微鏡で観察した。
（７）マウス
　ヌードマウス(KSN Slc)(中部科学資材株式会社)を使用した。
２．結果
（１）ES細胞及びiPS細胞の内胚葉系細胞への分化
　ES細胞及びiPS細胞の分化誘導方法には大きく分けて2種類ある。1つがハンギング・ドロップなどの方法で培養するEB（Embryoid Body、胚様体）形成法である。この培養方法の利点は、球体状のEBを形成することによって三胚葉全てに分化し、ある程度の細胞にまで分化できることである。そのため、目的の細胞をEBから回収することも可能である。しかし、EBを形成してしまうと三胚葉全てに分化してしまうため、目的の細胞を効率よく誘導するのに限界がある。また、EBを形成すると3次元の複雑な構造となるため、培養中に加えた因子が全ての細胞に均一に作用しなくなる可能性も考えられる。もう１つの方法が単層培養法であり、この方法は単に培養皿の上に細胞を蒔いて培養する方法である。この方法では2次元（平面）の構造であるため、EBとは異なり全ての細胞に均一に因子が作用すると考えられ、特異的な細胞への分化誘導効率を上げることが可能である。また、一層培養法では、周りの細胞との相互作用が少なく、培地に加える因子を変えることによって、発生段階に必要な因子の決定も行うことができ、発生学の研究手段としても有用であると考えられる。そのため、本実験では単層培養法を採用した。
　目的の細胞群である内胚葉へ効率よく誘導することを目指し、胚発生における三胚葉の誘導に関わる因子を参考に検討した。誘導因子としては、初期胞胚から後期原腸胚で知られているNordalやアクチビン、BMPなどがある。アクチビンに関してはアクチビンAによる内中胚葉（mesendoderm）の誘導方法が実際に知られている（参考文献２、８）。また、Nordalを用いた分化誘導方法でも内中胚葉への分化は可能であるが、効率が良くないことが報告されている（参考文献２）。BMPに関してはBMP4を用いた、中胚葉への誘導系が知られている。これに加え、リチウムがGSK-3bの活性を抑制し、βカテニンを経由するカノニカルWnt経路（Wnt-βカテニン経路）を刺激し、この経路も初期発生の経路として知られている（参考文献２８）。
　そこで、内胚葉系の細胞に誘導するため、アクチビンAとLiClの併用を検討した。本実験では、コラーゲンIV型でコートした培養皿を用い、インスリンやトランスフェリンなどを含んだ無血清培地SF-03で培養し、分化誘導した。アクチビンA（10 ng/ml）と様々な濃度のLiClを添加した無血清培地SF-03でES細胞（CCE）を分化誘導した。内中胚葉の細胞はE-カドヘリンとPDGFR-αの両方が陽性の細胞であり、胚体（definitive）内胚葉はE-カドヘリンとCXCR4の両方が陽性の細胞であることが知られているため（参考文献２）、それぞれの抗体で免疫染色をし、FCM（フローサイトメトリー）で解析した。まず、アクチビンA（10 ng/ml）単独で内中胚葉、胚体内胚葉へ分化することを確認した（図１）。次に分化誘導の際の細胞濃度の違いによって分化効率に違いが生じるか検討した。コラーゲンIV型でコートした培養皿を用い、細胞濃度を4.5, 6.4, 8.2, 10×104／cm2でそれぞれ誘導した結果（アクチビンAの濃度は10 ng/ml）、面積あたりの細胞濃度が低いほうが効率よく分化し、細胞濃度が高くなるにつれ、内中胚葉と胚体内胚葉の細胞群の割合が減少した（結果を図示せず）。LiCl単独では内中胚葉、胚体内胚葉への分化が見られなかったが（結果を図示せず）、アクチビンA（10 ng/ml）とLiClを併用すると内中胚葉への分化が促進され、最適なLiCl濃度は5 mMであった（図２）。この条件のときには、内中胚葉の細胞群がアクチビンA単独(13.2%)のときに比較して約1.6倍に増加した（図１、図２）。iPS細胞を用いた場合も、アクチビンA（10 ng/ml）とLiCl（5 mM）の併用によって内中胚葉の細胞群が効率的に誘導された（図３）。アクチビンA含有の無血清培地に血清を加えた場合、内中胚葉と胚体内胚葉へ分化が起こらなかった（結果を図示せず）。この結果から、血清に含まれる成分がアクチビンAに対して抑制的に働いていることが示唆された。
　発生初期に関わるWntの刺激は背側の位置を決める因子であり、植物極側で発現した因子と協調してアクチビンやNordalを誘導し、内中胚葉を分化するため、LiClのみで内中胚葉の細胞に誘導できなかったことは発生学上正しいことと考えられる。また、アクチビンAとLiClの両方で誘導することによって、内中胚葉への分化が促進されたのはアクチビンによって内中胚葉を誘導するときに、発生初期でWntのシグナルも内中胚葉の分化に何らかの関わりがあることを示唆する。
（２）内中胚葉、胚体内胚葉から胸腺上皮細胞への分化
　胸腺のみならず、全ての器官形成はいくつかの異なる段階に分けることができる（参考文献１）。即ち、a「位置決め（臓器原基が胚のどの部位で発生するかを正確に決める）」、b「開始（臓器原基の明白な発達）」、c「突起と配置（原基の成長にともなう、異なる領域の発生）」、d「分化（空間的情報により異なる細胞型への分化）」である。これらの段階は厳密に調節され、そして正確な臓器形成を確かにするための調整がおこなわれている。胸腺の器官形成における初期段階では、間充細胞と上皮細胞の相互作用の必要性が知られている。胸腺の周りにある神経冠細胞（NCC）が胎児胸腺の発達に関わっており、胸腺の発達に重要なシグナルを出している考えは広く受け入れられているが、正確な役割やこのシグナルの性質についてはまだ解明されていない。内胚葉と間充細胞との間の相互シグナルが原基の位置決定(positioning)と突起(outgrowth)の制御を行い、また配置決定(patterning)も含むカスケードが予測されている。しかしながら、主な発達シグナル経路であるFGFsやWnt、BMPs、SHHを含むシグナル経路が胸腺の発達に関与することが示唆されているものの、その詳細は解明されていない。
　FGF8はE10.5での咽頭嚢内胚葉で発現しており、この発現はおそらく周りのNCC間充細胞へのシグナルと考えられている。FGFR2-IIIbは約E13.5からTECで発現しており、周りにある間充細胞が放出するFGF7とFGF10のシグナルを受け取ると考えられている（参考文献２４、２７、２９）。また、FGFR2-IIIbの発現はRT-PCRの結果、E14における間充細胞でも検出されている。いくつかの知見から内胚葉と間充細胞におけるFGF7とFGF10などのFGFシグナルが原基形成の初期段階に必要と考えられており、すくなくとも胸腺におけるFGFsの役割のいくつかは下流のBMP4シグナルとの関わりも示唆されている。BMP4もまた、FoxN1とFGFR2-IIIbの両方の発現を促進し、間充細胞からのFGF7とFGF10シグナルに対するTECの反応性が促進させるモデルが現在支持されている。Wntシグナルもまた、TEC自体の分化や胸腺T細胞の分化における機能が示唆されている（参考文献１１、１６）。そして、WntはFoxN1の発現を誘導し、TECでオートクリンやパラクリン機構の両方でFoxN1の発現を維持、調節を通してTECの分化を促進していると考えられている。胸腺の分化には中胚葉由来の間充組織との相互が重要であることが知られているため、ES細胞及びiPS細胞を内中胚葉へ誘導し、内胚葉だけを取り出すのではなく、両方を混在したまま分化誘導することによって胸腺再生を試みた。
　本実験では胸腺の発達に従った分化誘導を行い、胸腺上皮細胞を再生することを目指しているため、現在得られている知見を参考に分化誘導方法を考えた。in vivoではFGF8の発現がE9.5における第2や3，4咽頭嚢で確認され、他にもいくつかの部位（頭など）でも発現が確認されている。FGF8の機能は、間充細胞を第3咽頭嚢の周りに誘導すると考えられているが、オートクリン機構によって、自己に作用している可能性も考慮し、FGF8による分化誘導を行った。アクチビンA（10 ng/ml）とLiCl（5 mM）を加え、内中胚葉と胚体内胚葉へ分化誘導後、培養４日目から培養７日目にFGF8(4 ng/ml)とLiCl（5 mM）を加え、3日間培養した。
　BMP4はE9.5の第3咽頭嚢内胚葉では発現が見られないが、E10.5から第3咽頭嚢のanteriorの部分で発現が確認されている（参考文献４）。また、BMP4の抑制因子であるNogginの発現は異所的に発現し、胸腺原基ができる場所を限定していると考えられている。BMP4の発現が胸腺の発達において重要な因子であることはBMP4のノックアウトマウスの研究から知られている（参考文献２３）。また、FGF7とFGF10は胸腺原基の発達に関わっていることが知られており、FGF7とFGF10はE13.5における胸腺原基の周りにある間充細胞におけるRT-PCRの結果から発現が確認されている。またFGF7、FGF10の受容体であるFGFR2-IIIbが、同じ時期であるE13.5で胸腺原基部位での発現が確認されており、FGFR2-IIIbはFGF7やFGF10の刺激によって活性化される。本実験では、FGF8の発現がある咽頭嚢から胸腺原基の形成後にFGF7とFGF10の発現が起こることを利用し、FGF8とLiClを加えた培地で培養後（培養４日目（D4）～７日目（D7））、BMP4とFGF7、FGF10と引き続きLiClを加えて培養した。
　iPS細胞を用い、各因子の添加濃度と分化誘導との関係を調べた。まず、FGF10の濃度のみを変化させ（2～20 ng/ml）、その他の因子の濃度を一定にして７日目（D7）～１２日目（D12）の培養を行った。結果、FGF10濃度が2～10ng/mlで胸腺関連遺伝子の発現がみられた（結果を図示せず）。そこでFGF10の至適濃度は5ng/mlとした。次にBMP4の濃度のみを変化させ（1～10 ng/ml）、その他の因子の濃度を一定にして同様の実験を施行した。BMP4の濃度に対応した変化はそれほど見られなかったが、Dll1の発現上昇が10ng/mlで認められたため（結果を図示せず）、この濃度を採用することにした。最後に、FGF7の濃度のみ変化させ（2～50 ng/ml）、その他の因子の濃度を一定にして同様の実験を施行した。その結果、2 ng/mlではPax1とPax3の発現が低下したため（結果を図示せず）、20ng/mlを採用することにした。以上の結果を踏まえ、図４に示す分化誘導法を構築した。
（３）分化誘導によるD0からD15までの経時的な変化
　図４の分化誘導法におけるiPS細胞の遺伝子発現の経時的な変化をRT-PCRで調べた。胸腺の発達段階ではHoxa3、Pax1、Pax9、Eya1そしてSix1の順で発現することが知られている。Hoxa3 は培養４日目（D4）、Pax1は培養７日目（D7）、Pax9は培養９日目（D9）にそれぞれ発現が上昇し（図５）、発生学で知られている事実に則した結果になった。Eya1とSix1は未分化な細胞でも発現があるが（参考文献１，３，２１，２５，２６）、分化に従い発現が上昇した（図５）。さらに、胸腺細胞の分化に必要とされているDll1とDll4（参考文献３３）の発現も未分化でも弱く発現が見られたが、Dll4の発現は培養７日目（D7）から少し上昇した（結果を図示せず）。胸腺の発達上知られているほかの因子では、発生段階に関わるTbx1や幹細胞の維持に関わるp63、FGFsの受容体であるFGFR2、胸腺髄質のマーカーであるK5（参考文献９、１０、１６）の発現も分化誘導に従って上昇した（図５）。さらに、Nanogの発現が経時的に減少していることから分化が進んでいることが示唆され（図５）、また、NanogとOct3/4の発現が完全に消失せず、p63の発現が上昇したことから（結果を図示せず）、ES細胞以外の幹細胞でこれらが発現している可能性も示唆された。実際に分化誘導した細胞を血清入りの培地で継代を行うとコロニーが出現し、増殖したことからホロクローンと考えられ、さらに、この細胞は胸腺と関わる遺伝子も発現していた（結果を図示せず）。この結果から、分化誘導した細胞を継代することによって、増殖能が低い成熟した細胞を含んだ細胞から上皮幹細胞を回収できることが示唆された。また、継代した細胞を観察とFCMの結果から、完全に均一な細胞のみが存在するのではなく、いくつかの細胞群が混在していることが分かった。
　初期内胚葉系のマーカーであるSox17が培養４日目（D4）で強く発現していることから（結果を図示せず）、内胚葉系への分化が起きていることが確認された。また、E-カドヘリンの発現は常に一定であることから（結果を図示せず）、内胚葉系の細胞が一定の割合で存在している可能性が示唆された。胸腺原基の周りに存在する間充組織で発現が確認されているPDGFR-αの発現が培養４日目（D4）以降強くなっており（結果を図示せず）、また、中胚葉系のマーカーであるBrachyuryとCad11の発現も経時的に発現が強くなっていることから（結果を図示せず）、中胚葉由来の間充組織への分化が示唆された。そして、内中胚葉のマーカー遺伝子であるGSCの発現は培養４日目（D4）で一番強くなる一方でその後は発現がなくなり（結果を図示せず）、併せて外胚葉系のマーカー遺伝子であるSox1の発現がまったく確認されなかったことから（結果を図示せず）、外胚葉系への分化は起こっていないことが確認できた。
　次に、胸腺上皮細胞の表面マーカーであるEpCAM1と初期発生段階において胸腺上皮前駆細胞のサブポピュレーションを規定することで知られるMTS24の発現を培養１４日目の細胞について調べた。その結果、二つの細胞集団を認めた。この内、小細胞集団にEpCAM1とMTS24の発現を認めた（図６）。RT-PCRの結果を併せて総合判断すると、当該細胞集団が胸腺上皮前駆細胞であると考えられる。
（４）髄質胸腺上皮細胞（mTEC）の誘導
　胸腺上皮前駆細胞（TEPC）は皮質胸腺上皮細胞（cTEC）と髄質胸腺上皮細胞（mTEC）の前駆細胞である。そこで、上記の分化誘導法で生じた胸腺上皮前駆細胞を髄質胸腺上皮細胞へ分化させることを試みた。胸腺における髄質領域の発達と自己寛容の構築に重要な因子としてRANKリガンドとCD40リガンドの存在が報告されるとともに、初期の胸腺髄質領域の構築にはRANKリガンドがより重要であることが示唆された（参考文献１８）。そこで、髄質胸腺上皮細胞への分化を誘導するため、培養１２日目からRANKリガンド（10ng/ml）とLiCl（5mM）を添加した培地で培養した（図７）。その結果、今まで発現に変化がなかったFoxN1の発現が培養１６日目に顕著に増加し、ケラチン５の発現も同様に増加した（図８）。自己寛容に関わる遺伝子であるAIREとCrp、Sap１については、CrpとSap1の発現が増加していた（図８）。また、胸腺T細胞の分化に関わるDll1とDll4については、Dll4の発現が経時的に増加していた（図８）。リアルタイムPCRでPax1、FoxN1及びK5の発現を検出した結果、培養１６日目においてFoxN1及びK5が高発現しており、胸腺上皮細胞への分化が確認された（図９）。
（５）in vivo実験（腎皮膜下へのコラーゲンスポンジの移植）
　分化誘導した細胞がin vivoの環境下でどのような組織に分化をするかを解析するために、12日間分化誘導した細胞を小さく切ったコラーゲンスポンジに吸い込ませ、ヌードマウスの腎皮膜下に移植した。このサンプルを3週間後に回収し、解析した。移植したコラーゲンスポンジは移植前に比べて大きくなっていた。
　5mmの厚さに切った凍結切片をH.E染色した結果、コラーゲンスポンジの中には細胞が密に存在しており、部位によって細胞密度が異なるようであった。コラーゲンスポンジに存在する細胞が、移植した細胞由来のものであるか宿主由来の細胞であるかを確認するため、各種抗体を用いて解析した。その結果、E-cad陽性細胞と、PDGFR-α陽性細胞がそれぞれ異なる部位で密集して存在していた。E-cad陽性細胞群は内胚葉系由来の細胞であり、PDGFR-α陽性細胞群は中胚葉由来の細胞であると考えることができるため（参考文献３３，３４）、ここに採用した分化誘導法によって少なくとも内胚葉系細胞と中胚葉系細胞が分化し、それぞれが集団を形成したことが示唆された。
（６）改良法の検討
　考案した誘導方法を改良することによって目的の細胞集団を単一的に得ることができないか検討した。具体的には、培養４日目からの培養を、FGF8b(4ng/ml)及びLiCL(5mM)を含むSF-03培地に代えて、FGF8b(5ng/ml)、LiCL(5mM)及びアクチビンＡ(5ng/ml)を含むSF-03培地で行うことにした（図１０）。この改良法を採用した場合、培養７日目（D7）の段階で目的とする丸いコロニー群の割合を劇的に増加させることができた（図１１）。培養４日目（D4）から培養７日目（D7）までアクチビンＡを添加して得られた細胞群をＡ＋細胞群と呼ぶことにし、アクチビンＡを添加しない場合の細胞群をＡ－細胞群と呼ぶことにした。RT-PCRによりこのＡ＋細胞群は目的の遺伝子を強く発現していた（図１２）。さらに培養７日目（D7）からFGF7、FGF10、BMP4及びLiCLを含む培地に交換し７日間培養を続けることにより、胸腺発達に関わる多くの遺伝子発現が上昇し、胸腺上皮細胞のマーカーであるFoxN1の発現も著しく上昇した（図１２）。このように、RANKリガンドを用いずに胸腺上皮細胞と類似した細胞群をより単一的な細胞群として得ることに成功した。改良法では、アクチビンＡの添加によって、ほとんどの細胞群が内胚葉系の細胞群に誘導され、その結果、他の細胞からの因子が培地中に存在しない状態（即ち、添加したFGF7、FGF10、BMP4及びLiCLしか存在しない状態）が形成されたため、効率よく胸腺上皮細胞の方向へ分化が進んだのではないかと考えられる。
　本発明の方法によれば、生体外（in vitro）で胸腺上皮前駆細胞又は髄質胸腺上皮細胞を調製できる。これらの細胞は胸腺障害に対する治療用の材料として利用され得る。また、本発明の方法によって得られる細胞を用いて胸腺様の組織・器官を構築し、これをT細胞の教育器官として利用することも期待される。
　この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
　本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
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　配列番号１～５４：人工配列の説明：プライマー

Claims (9)

  1. 　多能性幹細胞を胸腺上皮前駆細胞又は髄質胸腺上皮細胞へ分化誘導する方法であって、
    　多能性幹細胞を胚体内胚葉系細胞へと分化させる第１誘導工程と、
    　FGF8、FGF7、FGF10、BMP4及び塩化リチウムを併用することによって、胚体内胚葉系細胞から胸腺上皮前駆細胞又は髄質胸腺上皮細胞へと分化させる第２誘導工程と、を含み、
    　前記第２誘導工程において、培地にFGF8を添加し且つFGF7及びFGF10は添加しない条件下での第１培養に続いて、培地にFGF7及びFGF10を添加し且つFGF8は添加しない条件下での第２培養を行う、方法。
  2. 　第１誘導工程が、培地にアクチビン及び塩化リチウムを添加した条件下で細胞培養する工程である、請求項１に記載の方法。
  3. 　培地中の塩化リチウムの濃度が約5mMである、請求項２に記載の方法。
  4. 　第１培養が、培地にFGF8及び塩化リチウムを添加した条件下で細胞培養する工程である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　第１培養が、培地にFGF8、塩化リチウム及びアクチビンを添加した条件下で細胞培養する工程である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　第２培養が、培地にFGF7、FGF10、BMP4及び塩化リチウムを添加した条件下で細胞培養する工程である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 　第１誘導工程及び第２誘導工程に使用される培地が血清を含まない、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 　第２誘導工程が、培地にRANKリガンド又はCD40リガンドを添加した条件下での第３培養を含み、該培養によって髄質胸腺上皮細胞が誘導される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 　多能性幹細胞が胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
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