WO2010131745A1 - 18ｆ標識アジド化合物、18ｆ標識化用試薬及びそれを用いたアルキン化合物の18ｆ標識方法 - Google Patents

18ｆ標識アジド化合物、18ｆ標識化用試薬及びそれを用いたアルキン化合物の18ｆ標識方法 Download PDF

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labeling
reaction
alkyne
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恭良 渡辺
正昭 鈴木
久志 土居
剛之 窪山
聡 小比賀
武 今西
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独立行政法人理化学研究所
国立大学法人大阪大学
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    • C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
    • C07B2200/00—Indexing scheme relating to specific properties of organic compounds
    • C07B2200/05—Isotopically modified compounds, e.g. labelled

Definitions

  • the present invention relates to an 18 F-labeled azide compound, an 18 F labeling reagent, and an 18 F labeling method for an alkyne compound using the same.
  • the present invention can be suitably used for the production of a radioactive tracer essential for positron emission tomography (hereinafter referred to as “PET”).
  • PET positron emission tomography
  • a tracer labeled with a short-lived radionuclide that emits a positron such as 18 F or 11 C is administered into a living body, and ⁇ rays generated from the tracer are emitted from a PET camera (from a gamma ray scintillator and a photomultiplier tube).
  • a PET camera from a gamma ray scintillator and a photomultiplier tube.
  • the PET method is used as a useful measurement technique in various fields such as biology, drug development, and medicine because it can follow the movement of a substance in a living body over time, non-invasively and quantitatively.
  • radionuclides used in the PET method 18 F, 11 C and the like are used, and compounds labeled with these radionuclides are used as tracers.
  • 11 C uses carbon atoms present in organic compounds, so it has a very wide range of applications and can be said to be an ideal radionuclide, but it has a short half-life of 20 minutes, and from synthesis to measurement by the PET method. There is a restriction that it must be performed in a very short time.
  • 18 F has a half-life of 110 minutes, and since it has a longer half-life than 11 C and is easy to handle, 18 F-labeled glucose and the like are widely used. However, even with 18 F, since the amount of positron emission decreases with time, PET measurement becomes difficult. For this reason, there is a need for a rapid and simple 18 F labeling method.
  • 18 F-labeled compound Upon preparation of 18 F-labeled compound, 18 F as a raw material is supplied by nuclide by cyclotron. Specifically, 18 O colliding the ions accelerated in a cyclotron in water containing, are prepared by nuclide from 18 O to 18 F. When a very dilute aqueous solution containing 18 F ions thus obtained is reacted with a compound to be subjected to the PET method, a compound labeled with 18 F can be obtained.
  • 18 F conjugate an intermediate compound that is labeled with 18 F and has a functional group for binding to another compound (hereinafter, such an intermediate is referred to as “ 18 F conjugate” in this specification) is prepared in advance.
  • 18 F conjugate an intermediate compound that is labeled with 18 F and has a functional group for binding to another compound
  • 18 F conjugate an intermediate compound that is labeled with 18 F and has a functional group for binding to another compound
  • the properties required for the 18 F-junction are (1) quick and easy synthesis, (2) binding to the target compound with high efficiency in a short time under mild conditions, and (3) in vivo of the target compound. It has a small influence on the dynamics. In order to meet these demands, attention has been focused on 18 F junctions utilizing the Huisgen reaction.
  • the Huisgen reaction refers to a reaction in which an organic azide compound and an alkyne undergo a [3 + 2] -type cycloaddition reaction to become a 1,2,3-triazole derivative (see the following chemical formula).
  • the copper (I) ion serves as a catalyst, and a 1,4-disubstituted product is selectively obtained.
  • This reaction is not hindered by various functional groups such as alcohols, amines, amides, esters and halides, and the desired triazole can be obtained in high yield.
  • the reaction solvent proceeds without problems in alcohol, general organic solvents, water and the like. Azides and alkynes can be easily introduced into various organic compounds and have many advantages that no extra waste is generated after the reaction. For this reason, it is listed as a representative example of click chemistry proposed by K.B.Sharpless et al.
  • an 18 F-junction is introduced into a target compound using a compound obtained by labeling 18 F on an azide compound or an alkyne compound as an 18 F-junction. Specific examples are given below.
  • Non-Patent Document 2
  • Non-patent Document 3 Korean Sungkyunkwan University
  • Korean Inha Group University has reported a method of using a plurality of 18 F-labeled alkyne compound and 18 F-labeled azide compound (see the following chemical formula) as 18 F prosthetic groups, 18 F-labeled substrates variety (Non-Patent Document 5).
  • their method also uses the method of coupling reaction as it is without purifying the 18 F-junction as in the case of Patent Document 1, so that a large excess of 18 F-label is added to the 18 F-junction.
  • the target compound is used.
  • the Stanford group obtained 18 F-labeled alkyne compound with high purity by purification by preparative HPLC, which is easier to automate than the distillation method (Non-patent Document 6).
  • the Huisgen reaction was carried out with a catalyst system of copper sulfate-sodium ascorbate without an amine base, whereby 18 F labeling of the ligand of integrin ⁇ v ⁇ 3 was performed, and PET imaging using a mouse was performed.
  • a nitro group, or a trimethylammonio group at the 2-position of the pyridine derivative represented by the following formula and a fluorine-substituted after obtaining the highly pure 18 F prosthetic groups by HPLC purification, TBTA, Cu (CH 3 CN )
  • the Huisgen reaction was carried out with 18 F-labeled compound (azidated peptide precursor) in a catalyst system using 4 PF 6 and diisopropylethylamine.
  • the amount of 18 F labeling target compound used is as large as 1400 nmol, and further reduction is necessary for practical use.
  • the “double strand formation with complementary strand” phenomenon which is a characteristic property of oligonucleotides, can be observed in living organisms using oligonucleotides labeled with 18 F (in vivo hybridization). If possible, it will be possible to easily measure the mRNA expression level in vivo, and it can be widely applied to disease diagnosis and medical / pharmaceutical research. Against this background, methods for labeling oligonucleotides with 18 F have been studied and reported so far (for example, Non-Patent Documents 9 to 14).
  • the 18 F prosthetic groups hitherto various 18 F-labeled azide compound and 18 F-labeled alkyne compounds have been synthesized, 18 F-labeled using Huisgen reaction has been carried out. Furthermore, the dynamics of 18 F-labeled compounds have been investigated by the PET method. However, in these 18 F-labeled azide compounds, all of them must use a large amount of acetylene group-modified substrate as a reaction partner, and in 18 F-labeled alkyne compounds, all of them have an azide group-modified substrate as a reaction partner. Had to be used in large quantities. This is considered to be due to the following reasons.
  • Non-patent documents 9 to 14 mentioned above can be cited as reports of 18 F labeling of oligonucleotides by a method not utilizing the Huisgen reaction.
  • the present invention has been made in view of the above-described conventional situation, and is an 18 F-labeled azide compound that can be used for the Huisgen reaction, and 18 F labeling is possible even in a small amount of an alkyne compound as a partner substrate. it can be applied PET method to peptides and oligonucleotides, the 5 'end and 3' 18 F labeling in sites other than the end that can 18 F-labeled azide compound of oligonucleotides, reagents and a 18 F-labeled
  • An object of the present invention is to provide an 18 F labeling method for an alkyne compound using the same.
  • the present inventors first examined the design of an 18 F-labeled azide compound that is preferable for application to the PET method.
  • the 18 F labeling is preferably a compound having a low molecular weight so as not to affect the dynamics of the compound to be subjected to the PET method in vivo.
  • 18 FCH 2 N 3 can be considered as such a compound, but it cannot be used due to the risk of radiation exposure because of its low boiling point and easy gasification. For this reason, it is preferable that a boiling point is high to some extent.
  • HPLC high performance liquid chromatograph
  • the precursor can be synthesized quickly from the 18 F-labeled azide compound in one step.
  • chemical stability should be considered.
  • the present inventors have proposed a phenyl azide compound labeled with 18 F as a candidate.
  • a fluoroalkyl group into the phenyl group
  • Huisgen reaction with the oligonucleotide modified with the acetylene group was performed, it discovered that the said problem could be solved, and came to complete this invention.
  • the 18 F-labeled azide compound of the present invention is represented by the following structural formula (1).
  • the 18 F-labeled azide compound Since the 18 F-labeled azide compound has an azide group, it can cause a Huisgen reaction with a compound having a carbon-carbon triple bond. For this reason, it can be used as a reagent for 18 F labeling.
  • the 18 F-labeled azide compound can be rapidly and easily converted to an 18 F-labeled triazole derivative by performing a Huisgen reaction in the presence of an alkyne compound and a copper compound catalyst. This reaction proceeds even when the concentration of the alkyne compound serving as the partner substrate is low compared to the Huisgen reaction using a conventional 18 F-labeled azide compound. For this reason, it can be used for 18 F labeling of peptides and oligonucleotides, which are difficult to prepare in large quantities.
  • a mixed solvent composed of water and a water-soluble organic solvent as a reaction solvent.
  • the water-soluble organic solvent include diphenyl sulfone, dimethyl sulfone, dimethyl sulfoxide, benzophenone, tetrahydrothiophene-1,1-dioxide, N, N-dimethylacetamide, N-methyl-2-pyrrolidinone, N-methyl- ⁇ - Examples include caprolactam, 1,3-dimethyl-2-imidazolidinone, methanol, ethanol, n-propanol, i-propanol, n-butanol, i-butanol, and t-butanol.
  • dimethyl sulfoxide (hereinafter referred to as DMSO) is particularly suitable because it has excellent dissolving power, high safety, low corrosivity, appropriate melting point and boiling point, easy handling, and good yield.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the amine base include diisopropylethylamine, triethylamine, pyridine, 2,6-lutidine, (tris ((1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl) methyl) amine, and the like.
  • TBTA (tris ((1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl) methyl) amine
  • the alkyne compound in the 18 F labeling method of the alkyne compound of the present invention can be a nucleotide derivative.
  • Oligonucleotides are biomolecules that can be applied to pharmaceuticals due to their physiological activity based on phenomena such as antisense, antigene, decoy, and RNA interference.
  • non-natural artificial nucleic acids eg 2'-O-MeRNA, phosphorothioate oligos, BNAs, LNA
  • oligonucleotides are labeled with 18 F to form PET probes, which are then administered to humans and experimental animals and their in vivo dynamics are measured with a PET camera to promote oligonucleotide research.
  • 18 F labeling at a site other than the 5 ′ end or the 3 ′ end is possible.
  • 4-azidobenzyl alcohol (2a) prepared by the method described in the literature (Andersena, J. et al .; Synlett 2005, 14, 2209-2213)) (149 mg, 1.00 mmol) in methylene chloride (5.0 mL)
  • pyridine 0.162 mL, 2.00 mmol
  • p-toluenesulfonic anhydride 343 mg, 1.05 mmol
  • 2 ′, 4′-BNA also referred to as LNA, see the following formula
  • an acetylene group-modified oligonucleotide precursor (4b) having a phosphorothioate bond underline in the formula
  • the part indicates 2 ′, 4′-BNA, the underlined part indicates natural DNA, and “s” indicates a phosphorothioate bond individually) in the literature (S. Obika, et al. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, 2009, 19, 3316-3319).
  • Acetylene group-modified Oligonucleotide (4c) Further, acetylene group-modified oligonucleotide precursor (4c) in which the 2′-position and 4′-position of deoxyribose are cross-linked (the underlined part is 2 ′, 4′-BNA) The underlined portion indicates natural DNA.) Described in the literature (S. Obika, et al. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, in press, doi: 10.1016 / j.bmcl.2009.04.063). It was synthesized by the method.
  • Example 1 the 18 F-labeled azide compound (1a) was synthesized by replacing the tosylate group of 4-methylbenzenesulfonic acid-4-azidobenzyl (3a) with 18 F, and the acetylene group-modified oligonucleotide ( A coupling reaction using the Huisgen reaction with 4a) was performed. Details are shown below.
  • the resin cartridge (SAIKA-SPE SAX-30, manufactured by AiSTI SCIENCE) was passed through.
  • the adsorbed [ 18 F] fluorine ion was desorbed with tetra-N-butylammonium hydrogen carbonate (0.025 mol / L 80% acetonitrile / water solution, 0.6 mL), and further washed with 0.6 mL of acetonitrile.
  • the [ 18 F] fluorine ion solution introduced into the first reaction vessel was dried at 110 ° C. under reduced pressure while flowing a helium stream, and further azeotropically dried with acetonitrile (1 mL).
  • the 18 F-labeled azide compound (1a) thus obtained in a DMSO-water mixed solution (about 0.5 mL) was mixed with a buffer (100 mmol / L sodium phosphate buffer, pH 7.0, 60 ⁇ L) and an acetylene group-modified oligonucleotide (4a) ( 0.50 mmol / L aqueous solution, 40 ⁇ L) and copper sulfate (50 mmol / L aqueous solution, 12 ⁇ L) and TBTA (tris ((1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl) methyl) amine, 50 mmol / L DMSO solution, 6 ⁇ L) and sodium ascorbate (50 mmol / L aqueous solution, 12 ⁇ L) were added and reacted at 40 ° C.
  • a buffer 100 mmol / L sodium phosphate buffer, pH 7.0, 60 ⁇ L
  • TEAA can be desalted or concentrated as necessary. Details of the desalting process are shown below. Pass the TEAA buffer solution of [ 18 F] (5a) through Sep-Pak Plus C18 (Waters, preconditioned with 40 mL EtOH and 40 mL water), wash twice with water (5 mL), and add nitrogen. Dry with gas flow for 1 minute and elute [ 18 F] (5a) with ethanol (1 mL). Ethanol was volatilized with a nitrogen gas flow to obtain a concentrated aqueous solution of [ 18 F] (5a). This was diluted with an appropriate amount of physiological saline to prepare a solution for administration to animals. The process took an additional 30 minutes, but 90% was recovered (with attenuation correction).
  • Example 2 By replacing the tosylate group of 4-methylbenzenesulfonic acid-3-azidobenzyl (3b) with 18 F in the same manner as in Example 1, 18 F-labeled azide compound (1b) was synthesized, and the above acetylene group was further synthesized. A coupling reaction using the Huisgen reaction with the modified oligonucleotide (4a) was performed. Although not shown in the examples, the same procedure as in Example 1 was carried out using 2-azidobenzyl alcohol instead of 4-azidobenzyl alcohol (2a) which was the starting material in Example 1. It is clear from technical common sense that an ortho 18 F-labeled azide compound can be obtained.
  • Example 3 an 18 F-labeled azide compound (1b) was synthesized by replacing the tosylate group of 4-methylbenzenesulfonic acid-3-azidobenzyl (3b) with 18 F in the same manner as in Example 2. Furthermore, coupling with the acetylene group-modified oligonucleotide (4b) by Huisgen reaction was performed.
  • Example 4 an 18 F-labeled azide compound (1b) was synthesized by substituting the tosylate group of 4-methylbenzenesulfonic acid-3-azidobenzyl (3b) with 18 F in the same manner as in Example 2. Furthermore, coupling with the acetylene group-modified oligonucleotide (4c) was performed by Huisgen reaction.
  • Non-Patent Documents 1 to 8 are 18 F labeling methods using the Huisgen reaction
  • the methods described in Non-Patent Documents 9 to 14 are conventional methods in which oligonucleotides are labeled with 18 F. It is an example.
  • reaction conditions were examined using an unlabeled 19 F azide compound as a substrate for the alkyne compound modeled on N- (prop-2-ynyl) benzamide.
  • a Huisgen reaction between substrates at a high concentration was performed.
  • the yield was examined by changing the DMSO concentration.
  • the volume% of DMSO is preferably 30% or more.
  • oligonucleotide of the present invention it is possible to directly observe the effects of artificial nucleic acids such as 2 ′, 4′-BNA-modified oligonucleotide and phosphorothioate oligonucleotide. It becomes.
  • the present invention can provide a useful means in the medical field using nucleic acid oligomers such as RNA drug discovery that is expected to develop into individualized medicine.

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Abstract

【課題】Huisgen反応に利用できる18Ｆ標識アジド化合物であって、相手基質となるアルキン化合物が少ない量でも18Ｆ標識化が可能であり、ペプチドやオリゴヌクレオチドへのＰＥＴ法の適用が可能であり、オリゴヌクレオチドの５'末端や３'末端以外の部位にも18Ｆ標識化が可能な18Ｆ標識アジド化合物、18Ｆ標識化用試薬及びそれを用いたアルキン化合物の18Ｆ標識方法を提供することを目的とする 【解決手段】 本発明の18Ｆ標識アジド化合物は、下記構造式（１）で示されることを特徴とする。

Description

18Ｆ標識アジド化合物、18Ｆ標識化用試薬及びそれを用いたアルキン化合物の18Ｆ標識方法
　本発明は、18Ｆ標識アジド化合物、18Ｆ標識化用試薬及びそれを用いたアルキン化合物の18Ｆ標識方法に関する。本発明は、陽電子放射断層画像撮影（以下「ＰＥＴ」という）に不可欠な放射性トレーサーの製造に、好適に用いることができる。
　ＰＥＴ法とは、18Ｆや11Ｃなどのポジトロンを放出する短寿命放射核で標識されたトレーサーを生体内に投与し、トレーサーから発生するγ線をＰＥＴカメラ（ガンマ線シンチレーターと光電子増倍管からなる検出器）によって計測して、その体内分布をコンピューターにより画像化する方法である。ＰＥＴ法は生体内での物質の移動を経時的、非侵襲的かつ定量的に追跡することができるため、生物学、医薬品開発、医療などの各分野において有用な測定技術として活用されている。　

　ＰＥＴ法で使用される短寿命放射核種としては18Ｆや11Ｃ等が用いられ、これらの放射核種で標識された化合物がトレーサーとして用いられる。11Ｃは有機化合物中に存在している炭素原子を利用しているため適用範囲が極めて広く、理想的な放射核種ともいえるが、半減期が２０分と短く、合成からＰＥＴ法での測定までを極めて短時間で行なわなければならないという制約がある。これに対して18Ｆの半減期は１１０分であり、11Ｃよりは半減期が長くて扱いやすいため、18Ｆ標識グルコース等、広く利用されている。しかしながら、18Ｆといえども時間と共にポジトロンの放出量が少なくなるため、ＰＥＴ測定が困難となる。このため、迅速かつ簡便な18Ｆによる標識方法が求められている。　
18Ｆ標識化合物の調製に際し、原料となる18Ｆはサイクロトロンによる核種変換によって供給される。具体的には、18Ｏを含んだ水にサイクロトロンで加速したイオンを衝突させ、18Ｏから18Ｆへ核種変換させることによって調製される。こうして得られた18Ｆイオンを含む極めて希薄な水溶液と、ＰＥＴ法の対象となる化合物とを反応させれば、18Ｆによる標識された化合物が得られることになる。　
しかし、ＰＥＴ法の対象となる化合物に対して18Ｆを直接結合させることは、通常極めて困難である。このため、18Ｆで標識されているとともに、他の化合物と結合するための官能基を有する中間化合物（以下、本明細書においてこのような中間体を「18Ｆ接合団」という）を予め調製しておき、これをＰＥＴ法の対象となる化合物と結合させるという、間接的な18Ｆ標識化手法が用いられる。　
　18Ｆ接合団に要求される性質としては、（１）手早く簡単に合成ができること、（２）温和な条件で短時間に高効率で目的化合物と結合すること、（３）目的化合物の生体内での動態に与える影響が小さいこと、等が挙げられる。これらの要求に応えるため、Huisgen反応を利用する18Ｆ接合団が注目されている。
　Huisgen反応とは、有機アジド化合物とアルキン類とが［３＋２］型の付加環化反応を起こし、1,2,3-トリアゾール誘導体となる反応をいう（下記化学式参照）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　アルキン類が末端アルキンの場合、銅（Ｉ）イオンが触媒となり、選択的に1,4-二置換体が得られる。この反応は、他にアルコール、アミン、アミド、エステル、ハライドなど各種官能基があっても邪魔されず、目的のトリアゾールが高収率で得られる。反応溶媒もアルコール、一般的有機溶媒、水などの中で問題なく進行する。またアジド及びアルキンは各種有機化合物に導入が容易であり、反応後に余分な廃棄物を出さないという多くの利点を有している。このため、ノーベル化学賞を受賞したK.B.Sharplessらが提唱するクリック化学の代表例として挙げられている。
　近年、このHuisgen反応を利用し、アジド化合物又はアルキン化合物に18Ｆを標識した化合物を18Ｆ接合団として用いて、目的化合物に18Ｆ接合団を導入することが行なわれている。以下、その具体例を挙げる。　
例えば、カリフォルニア大学デービス校のMarik及びSutcliffeは、末端にアセチレン基を有するトシラート体を[18Ｆ]ＫＦ及びカリウム捕捉剤（Ｋｒｙｐｔｏｆｉｘ２２２）の存在下でフルオロ化し、蒸留によって精製して18Ｆで標識されたフルオロアルキン類を18Ｆ接合団として得ている（非特許文献１）。そして、さらにアジド化したペプチドと18Ｆ接合団とのHuisgen反応をヨウ化銅（Ｉ）、アスコルビン酸ナトリウム、及びアミン塩基としてジイソプロピルエチルアミンを添加した触媒系で行い、室温１０分の条件でペプチドの18Ｆ標識化を行なっている（下記反応式参照）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
そして、さらに彼らのグループは上記式におけるｎ＝３の18Ｆ接合団を用いてαｖβ６特異的ペプチドの18Ｆによる標識化を行い、マウスを用いてｉｎ　ｖｉｖｏでのＰＥＴ撮像に成功している（非特許文献２）。
さらに、上記式におけるｎ＝１のものを用いた例は、韓国のSungkyunkwan大学校のグループからも報告されている（非特許文献３）。
また、シーメンス・メディカル・ソリューションズ・ＵＳＡ社のグループは、上記式におけるｎ＝０に相当する化合物を用いる方法を報告している（特許文献１）。すなわち、プロパルギルトシラートを18Ｆ化し反応容器内に18Ｆ接合団([18F]-3-fluoropropyne)を生成させ、これを精製することせずに反応液に大過剰のアジド基質を加え、酢酸銅（Ｉ）でカップリング反応を行っている。　
また、18Ｆ標識アジド化合物を用いた例として、非特許文献４では[18Ｆ]フルオロエチレンアジドを18Ｆとして用いて末端アセチレン基を有するオリゴペプチドとのHuisgen反応を行い、オリゴペプチドの18Ｆ標識化に成功している（下記化学式参照）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　また、韓国インハ大学校のグループは、複数の18Ｆ標識アルキン化合物及び18Ｆ標識アジド化合物（下記化学式参照）を18Ｆ接合団として用いる方法を報告しており、多岐にわたる基質の18Ｆ標識化を行なっている（非特許文献５）。しかしながら、彼らの方法もまた、特許文献１と同様、18Ｆ接合団の精製をせずにそのままカップリング反応をする方法を取っているため、18Ｆ接合団に対して大過剰の18Ｆ標識化対象化合物を用いている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　さらに、スタンフォード大のグループは、蒸留法よりも自動化しやすい分取ＨＰＬＣで精製することで、純度の高い18Ｆ標識アルキン化合物を得た（非特許文献６）。そして、硫酸銅－アスコルビン酸ナトリウムでアミン塩基無しの触媒系でHuisgen反応を行うことで、インテグリンαｖβ３のリガンドの18Ｆ標識化を行ない、マウスを使ったＰＥＴ撮像を行った。
　また、ドイツのDresden-Rossendorf研究センターのグループは下記製法によって合成される4-[18F]Fluoro-N-(prop-2-ynyl)benzamideをSPE法(Solid phase extraction法)で精製して18Ｆ接合団として用い、Huisgen反応を用いてアジド化Neurotensin (8-13)ペプチドの18Fによる標識化を行なっている（非特許文献７）。
　彼らは、18Ｆ標識化実験1回あたりに必要なペプチドの使用量を減らすべく、Huisgen反応の条件検討を行い、硫酸銅－アスコルビン酸ナトリウムの触媒系をホウ酸バッファーと共に用いる最適化条件に到達し、アジド化Neurotensin (8-13)ペプチドの使用量を１ｍｇ（約１μｍｏｌ）まで削減することに成功したが、実用化のためには、使用量の更なる削減が必要である。
　また、カナダのTRIUMFのグループは、アリファティックなフッ素よりもアリールフッ素の方が代謝的に安定であろうという仮説を立て、1段階で合成できるアリールフッ素型の18Ｆ接合団を開発し、2008年に報告した（非特許文献８）。
　すなわち、下記式に示すピリジン誘導体の２位のニトロ基又はトリメチルアンモニオ基をフッ素置換し、ＨＰＬＣ精製することで純度の高い18Ｆ接合団を得たのちに、ＴＢＴＡ，Ｃｕ（ＣＨ３ＣＮ）４ＰＦ６及びジイソプロピルエチルアミンを用いる触媒系で18Ｆ標識化対象化合物（アジド化ペプチド前駆体）とHuisgen反応を行った。しかしながら、18Ｆ標識化対象化合物の使用量は１４００ｎｍｏｌと多く、実用化のためには、やはり、更なる削減が必要である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　一方、近年アンチセンス、アンチジーン、デコイ、RNA干渉などの現象に基づく遺伝子治療等の分野が進んでおり、天然型（ＤＮＡ，ＲＮＡ）や、天然型（ＤＮＡ，ＲＮＡ）よりもより優れた薬物動態や生理活性をもつ非天然型（例えば2’-O-MeRNA、ホスホロチオアートオリゴ、BNA類、LNA）の人工核酸を用いた遺伝子治療の試みがなされている。これら天然型あるいは非天然型のオリゴヌクレオチドを18Ｆ標識化してＰＥＴプローブとし、ヒトや実験動物に投与してその生体内での動態をＰＥＴカメラで測定することは、オリゴヌクレオチドの研究を推進し、医薬品としての開発を加速すると思われる。また、オリゴヌクレオチドに特徴的な性質である「相補鎖との二重鎖形成」現象を、18Ｆにより標識化されたオリゴヌクレオチドを用いて生きた生体内で観察すること(in vivo hybridization)ができれば、生体内でのmRNA発現量の簡便な測定が可能になり、疾病の診断及び医学／薬学研究に幅広く応用できると思われる。このような背景から、これまでにもオリゴヌクレオチドの18Ｆ標識化法が研究され、報告されている（例えば非特許文献９～１４）。
ＷＯ２００６／１１６６２９
Marik, J.; Sutcliffe, J. L. Tetrahedron Lett. 2006, 47, 6681-6684. Hausner, S. H.; Marik, J.; Gagnon, M. K. J.; Sutcliffe, J. L. J. Med. Chem. 2008, 51, 5901-5904. Kim, D. H.; Choe, Y. S.; Jung, K. -H.; Lee, K. -H.; Choi, J. Y.; Choi, Y.; Kim, B. -T. Arch. Pharm. Res. 2008, 31, 587-593. Glaser, M.; Arstad, E. Bioconjugate Chem. 2007, 18, 989-993. Sirion, U.; Kim, H. J.; Lee, J. H.; Seo, J. W.; Lee, B. S.; Lee, S. J.; Oh, S. J.; Chi, D. Y. Tetrahedron Lett. 2007, 48, 3953-3957. Li, Z. B.; Wu, Z.; Chen, K.; Chin, F. T.; Chen, X. Bioconjugate Chem. 2007, 18, 1987-1994. Ramenda, T.; Bergmann, R.; Wuest, F. Lett. Drug Des. Discovery 2007, 4, 279-285. Inkster, J. A. H.; Guerin, B.; Ruth. T. J.; Adam, M. J. J. LabelledCompd. Radiopharm. 2008, 51, 444-452. Dolle, F.; Hinnen, F.; Vaufrey, F.; Tavitian, B.; Crouzel, C. J. LabelledCompd. Radiopharm. 1997, 39, 319-330. Kuhnast, B.; Dolle, F.; Terrazzino, T.; Rousseau, B.; Loc’h, C.; Vaufrey, F.; Hinnen, F.; Doignon, I.; Pillon, F.; David, C.; Crouzel, C.; Tavitian, B. Bioconjugate Chem. 2000, 11, 627-636. Kuhnast, B.; de Bruin, B.; Hinnen, F.; Tavitian, B.; Dolle, F. Bioconjugate Chem. 2004, 15, 617-627. Hedberg, E.; Langstrom, B. Acta Chem. Scand. 1997, 51, 1236-1240. Hedberg, E.; Langstrom, B. Acta Chem. Scand. 1998, 52, 1034-1039. Christopher, W. L.; VanBrocklin, H. F.; Taylor, S. E. J. Label. Compd. Radiopharm. 2002, 45, 257-268.
　上述のように、18Ｆ接合団として、これまで様々な18Ｆ標識アジド化合物及び18Ｆ標識アルキン化合物が合成され、Huisgen反応を利用した18Ｆ標識化が行なわれてきた。そして、さらには18Ｆ標識化された化合物の動態がＰＥＴ法によって調べられてきた。しかしながら、それらの18Ｆ標識アジド化合物では、何れも反応の相手となるアセチレン基修飾基質を多量に用いなければならず、18Ｆ標識アルキン化合物では、何れも反応の相手となるアジ基修飾基質を多量に用いなければならなかった。これは、次のような理由によると考えられる。
　有機化学の分野において、Huisgen反応は、銅（Ｉ）触媒存在下、アジド化合物とアルキンとを混合するだけで容易かつ迅速に進行する便利な反応と思われているが、Huisgen反応を利用した18Ｆ標識化においては、以下に示すように、事情が全く異なり、極めて困難となる。それは、サイクロトロンによって製造される18Ｆは極少量であるため、極めて低濃度の18Ｆ接合団を用いざるを得ないからである。反応速度論によれば、反応速度は反応速度定数と反応基質との関数となり、このため極めて低濃度の18Ｆ接合団を用いてHuisgen反応を行なう場合、反応速度定数の大きな反応系を選んだり、標識化対象化合物の濃度を高めたりする必要がある。ところが、上記従来の反応系における反応速度定数は充分に大きくはなかったため、標識化対象化合物の濃度を高める、つまり多量の標識化対象化合物を用いるより他なかったのである。このため、例えばオリゴペプチドやオリゴヌクレオチドのように、天然物から多量に単離したり多種多量に合成するには多大な時間とコストがかかる物質を標識化対象化合物とする場合においては、限られた回数のＰＥＴ撮像は可能であっても、何配列ものオリゴペプチドやオリゴヌクレオチドを用いた本格的なＰＥＴ研究に応用するのは困難となっていたのである。なお、オリゴヌクレオチドに対しては、これまでHuisgen反応を利用して18Ｆ標識化を行なった例は存在しない。
　Huisgen反応を利用しない方法によってオリゴヌクレオチドの18Ｆ標識化を行なった報告としては、前述した非特許文献９～１４が挙げられる。しかし、これらの方法を用いてＰＥＴ法を行なおうとした場合、やはり、多量多種の入手には多大な時間とコストがかかるオリゴヌクレオチド前駆体を多量に用いることが必要であったため、実用化は困難となっていた。また、これらは、５’末端又は３’末端に18Ｆ標識化する方法であり、それ以外の部位への18Ｆ標識化はできなかった。このため、オリゴヌクレオチド前駆体の使用量が少なく、標識化部位の選択の幅が広い18Ｆ標識化法が強く望まれていた。
　本発明は、上記従来の実情に鑑みてなされたものであり、Huisgen反応に利用できる18Ｆ標識アジド化合物であって、相手基質となるアルキン化合物が少ない量でも18Ｆ標識化が可能であり、ペプチドやオリゴヌクレオチドへのＰＥＴ法の適用が可能であり、オリゴヌクレオチドの５’末端や３’末端以外の部位にも18Ｆ標識化が可能な18Ｆ標識アジド化合物、18Ｆ標識化用試薬及びそれを用いたアルキン化合物の18Ｆ標識方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記従来の問題点を解決すべく、まずＰＥＴ法に適用する上で好ましい18Ｆ標識アジド化合物のデザインについて検討を行なった。18Ｆ標識化に際しては、ＰＥＴ法の対象となる化合物の生体内での動態になるべく影響を与えないよう、分子量の小さな化合物であることが好ましい。このような化合物として究極的には18ＦＣＨ２Ｎ３が考えられるが、沸点が低くてガス化しやすいため、放射能被曝の危険性から使用することができない。このため、ある程度沸点が高いことが好ましい。また、合成後に精製濃縮しやすくするためには、高速液体クロマトグラフ（以下「ＨＰＬＣ」という）装置におけるＵＶ検出器で検出可能な強いＵＶ吸収を持ち、かつ溶出したフラクションを濃縮時に揮発しない程度の沸点を持ちようにデザインされていることが望ましい。また、18Ｆ標識アジド化合物の前駆体からは、１段階で迅速に合成できることが望ましい。さらには、化学的な安定性も考慮すべきである。
　こうした要求を満たす化合物として、本発明者らは18Ｆで標識化したフェニルアジド化合物を候補として挙げた。そして、フェニル基の水素をフッ素に変換することは困難であることを考慮し、フェニル基にフルオロアルキル基を導入することを考え、最も小さいフルオロメチル基を導入するデザインを考えた。そして、このデザインに沿った化合物を合成し、さらにはアセチレン基で修飾したオリゴヌクレオチドとのHuisgen反応を行ない、上記問題点を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明の18Ｆ標識アジド化合物は、下記構造式（１）で示されることを特徴とする。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　上記18Ｆ標識アジド化合物はアジ基を有しているため、炭素－炭素三重結合を有する化合物とHuisgen反応を起こすことができる。このため、18Ｆ標識化用試薬として用いることができる。
　本発明者らによれば、上記18Ｆ標識アジド化合物は、アルキン化合物と銅化合物触媒存在下でHuisgen反応を行うことによって、迅速かつ容易に18Ｆ標識トリアゾール誘導体とすることができる。この反応は、従来の18Ｆ標識アジド化合物を用いたHuisgen反応と比べて、相手基質となるアルキン化合物の濃度が低くても反応が進行する。このため、多量に基質を用意することが難しい、ペプチドやオリゴヌクレオチドの18Ｆ標識化にも用いることができる。
　この場合において、反応溶媒として水及び水溶性の有機溶媒からなる混合溶媒を用い、アスコルビン酸塩及びアミン系塩基の存在下で反応を行なうことが好ましい。水溶性の有機溶媒としては、例えば、ジフェニルスルホン、ジメチルスルホン、ジメチルスルホキシド、ベンゾフェノン、テトラヒドロチオフェン－１，１－ジオキシド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルー２－ピロリジノン、Ｎ－メチル―ε―カプロラクタム、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン、メタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、ｉ－プロパノール、ｎ－ブタノール、ｉ－ブタノール、ｔ－ブタノールなどが挙げられる。この中でもジメチルスルホキシド（以下ＤＭＳＯという）は溶解力に優れ、安全性が高く、腐食性も少なく、融点や沸点が適当で扱いやすく、収率が良いことから、特に好適に用いることができる。また、アミン系塩基としては、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、２，６－ルチジン、（トリス((1-ベンジル-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)メチル)アミン等が挙げられる。これらの中でも、（トリス((1-ベンジル-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)メチル)アミン（以下「ＴＢＴＡ」という）が特に好ましい。
　本発明のアルキン化合物の18Ｆ標識方法におけるアルキン化合物は、ヌクレオチド誘導体とすることができる。オリゴヌクレオチドは、アンチセンス、アンチジーン、デコイ、RNA干渉などの現象に基づく生理活性から、医薬品へ応用可能な生体分子である。また近年は天然型（ＤＮＡ，ＲＮＡ）よりもより優れた薬物動態や生理活性をもつ非天然型の人工核酸（例えば2’-O-MeRNA、ホスホロチオアートオリゴ、BNA類、LNA）の研究も進んでいる。これら天然型あるいは非天然型のオリゴヌクレオチドを18Ｆ標識化してＰＥＴプローブとし、ヒトや実験動物に投与してその生体内での動態をＰＥＴカメラで測定することは、オリゴヌクレオチドの研究を推進し、医薬品としての開発を加速することができる。
　また、オリゴヌクレオチドへのアルキニル基の修飾は、５’末端や３’末端以外の部位へも可能であるため、５’末端や３’末端以外の部位への18Ｆ標識が可能となる。
　本発明を具体化した実施例について以下に詳細を述べる。
4-メチルベンゼンスルホン酸4-アジドベンジル(3a)の合成
　まず、本発明の18Ｆ標識アジド化合物の前駆体となる4-メチルベンゼンスルホン酸4-アジドベンジル(3a)を下記反応式に示す方法により合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　すなわち、4-アジドベンジルアルコール(2a)(文献(Andersena,J.et al.;Synlett 2005, 14, 2209-2213)記載の方法により調製)（149mg、1.00mmol）を塩化メチレン（5.0mL）に溶解し、ピリジン（0.162mL、2.00mmol）及びp-トルエンスルホン酸無水物（343mg、1.05mmol）を0℃で加えた。３０分間撹拌した後、水を加えてクエンチした。水層を除去し、有機層を1mol/L塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下溶媒を留去した。得られた残渣にジエチルエーテル（3mL）を加え、不溶物を綿栓でろ過した。ろ液にヘキサン（5mL）を加えて撹拌し、０℃で３０分静置して結晶を析出させた。上澄み液をピペットを用いて除去し、結晶をヘキサンで洗浄した後、減圧下乾燥して4-メチルベンゼンスルホン酸4-アジドベンジル(3a)（218mg、0.719mmol,71.9%）を無色の結晶として得た。このものの1H-NMRスペクトル、13C-NMR スペクトル及びマススペクトル（EI法）を以下に示す。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3)
δ: 2.45 (3H, s), 5.02 (2H, s), 6.97 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.24 (3H, d, J = 8.3 Hz), 7.34 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.79 (2H, d, J = 8.3 Hz) 
13C-NMR (100 MHz, CDCl3)
δ: 21.7, 71.3, 119.2, 127.9, 129.9, 129.9, 130.3, 133.3, 141.0, 144.9 
HRMS (EI)
calc 303.0677 obs 303.0650
4-メチルベンゼンスルホン酸3-アジドベンジル（３b）の合成
　また、上記と同様の方法により、上記化合物(3a)の異性体である4-メチルベンゼンスルホン酸3-アジドベンジル(3b)を収率51.8%で得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
このもののIRスペクトル、1H-NMRスペクトル、13C-NMR スペクトル、マススペクトル（EI法）及び元素分析を以下に示す。
IR (film, KBr) 
2114, 1593, 1489, 1452, 1360, 1292, 1177, 945, 835, 814, 781, 665 cm-1 
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) 
δ: 2.45 (3H, s), 5.03 (2H, s), 6.85 (1H, s), 6.97 (1H, d, J = 7.8 Hz), 7.03 (1H, d, J = 7.8 Hz), 7.30 (1H, t, J = 7.8 Hz), 7.33 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.79 (2H, d, J = 8.5 Hz)
13C-NMR (100 MHz, CDCl3)
δ: 21.6, 71.0, 118.8, 119.5, 124.7, 128.0, 129.9, 130.1, 133.1, 135.3, 140.5, 145.0. LRMS (EI)
calc 303 obs 303.
元素分析
calc. H4.32%, C55.43%, N13.85%. obs. H4.32%, C55.59%, N13.89%
＜アセチレン基修飾オリゴヌクレオチドの合成＞
アセチレン基修飾オリゴヌクレオチド（４a）の合成
　次に、Huisgen反応の基質となるアルキン化合物として、下記アセチレン基修飾オリゴヌクレオチド（４a）（式中の配列は天然型ＤＮＡを示す）を文献（S. Obika, et al. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, 2009,19,3316-3319）に記載の方法により合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
アセチレン基修飾オリゴヌクレオチド（４b）の合成
　さらに、人工核酸として２’,４’－ＢＮＡ（ＬＮＡとも呼ばれる、下式参照）及びホスホロチオエート結合を有するアセチレン基修飾オリゴヌクレオチド前駆体(4b)（式中下線部は２’,４’－ＢＮＡを示し、無下線部は天然型のＤＮＡを示す。また、式中「ｓ」は個々にホスホロチオエート結合を示す。）を、文献（S. Obika, et al. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, 2009,19,3316-3319）に記載の方法により合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
アセチレン基修飾オリゴヌクレオチド（４c）の合成
　さらに、デオキシリボースの２´位と４´位が架橋化されたアセチレン基修飾オリゴヌクレオチド前駆体(4c)（式中下線部は２’,４’－ＢＮＡを示し、無下線部は天然型のＤＮＡを示す。）を、文献（S. Obika, et al. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, in press, doi:10.1016/j.bmcl.2009.04.063）に記載の方法により合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
＜18Ｆ標識アジド化合物の合成及びアセチレン基修飾オリゴヌクレオチドの18Ｆ標識化＞
　続いて、先に合成した4-メチルベンゼンスルホン酸-4-アジドベンジル(3a)及び4-メチルベンゼンスルホン酸-3-アジドベンジル(3ｂ)を用いて18Ｆ標識アジド化合物を合成し、さらにアセチレン基修飾オリゴヌクレオチドとのHuisgen反応を用いたカップリング反応を行なった。
（実施例１）
　実施例１では、4-メチルベンゼンスルホン酸-4-アジドベンジル(3a)のトシレート基を18Ｆで置換することにより18Ｆ標識アジド化合物(1a)を合成し、さらに上記アセチレン基修飾オリゴヌクレオチド（４a）とのHuisgen反応を用いたカップリング反応を行なった。詳細を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
＜18Ｆ標識アジド化合物(1a)の合成＞
　[18O]水（大陽日酸株式会社製, 約2 mL）を12 MeVの電子ビーム（HM-12S, 住友重機械工業株式会社製、50μA電流値、３０分）で照射して[18F]フッ素イオンを生成した。得られた約50 GBqの[18F]フッ素イオンの[18O]水溶液をホットセル内に設置した標識用合成装置（GNMS-アルファ大日本精機株式会社製GNMS-α）に導入し、陰イオン交換樹脂カートリッジ(SAIKA-SPE SAX-30、AiSTI SCIENCE製)に通じた。吸着された[18F]フッ素イオンを炭酸水素テトラN-ブチルアンモニウム（0.025 mol/L 80%アセトニトリル／水溶液、0.6 mL）で脱離させ、さらにアセトニトリル0.6 mLで洗浄した。そして、第１の反応容器へ導入した[18F]フッ素イオンの溶液を減圧下、ヘリウム気流を流しながら110℃に加熱して乾固させ、さらにアセトニトリル（1mL）で共沸乾燥した。残渣に（4-メチルベンゼンスルホン酸4-アジドベンジル）（１a）（6.0 mg）のアセトニトリル（1 mL）溶液を加えて８５℃で５分間反応させた。この時の分析ラジオ化学収率は９９％であった。反応混合物をセミ分取HPLC (条件: ナカライテスク株式会社製COSMOSIL MS-II 10 x 250 mmカラム, 40%アセトニトニル/水で６分60%で14分通液, 4 mL/min流量, 保持時間15-16 分に目的物は溶出する)で分離精製した。
＜アセチレン基修飾オリゴヌクレオチド(4a)の18Ｆ標識アジド化合物(1a)による18Ｆ標識化＞
　上記のようにして分離精製した18Ｆ標識アジド化合物(1a)を含むフラクションを集め、あらかじめ0.18 mLのDMSOを入れておいた第２の反応容器に移送した。４０℃に加熱しつつヘリウム気流下で減圧してアセトニトリルを慎重に揮発させた。こうして得られた18Ｆ標識アジド化合物（１a）のDMSO-水混合溶液（約0.5 mL）にバッファー（100 mmol/L リン酸ナトリウムバッファー, pH 7.0, 60μL）とアセチレン基修飾オリゴヌクレオチド（４a）（0.50 mmol/L水溶液、40μL）と硫酸銅（50 mmol/L水溶液、12μL）とTBTA（トリス((1-ベンジル-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)メチル)アミン、50 mmol/L　DMSO溶液、6μL）とアスコルビン酸ナトリウム（50 mmol/L水溶液、12μL）を加えて４０℃で１５分間反応させた。この時の分析ラジオ化学収率は９２％であった。反応液を水（0.3 mL）で希釈し、セミ分取HPLC（条件: ナカライテスク株式会社製COSMOSIL AR-II 10 x 250 mmカラム, カラム温度50 °C, 20分かけて10-20% CH3CN/ 0.1 mol/L TEAA bufferで直線的にグラジエント, 4 mL/min流量, 保持時間14-15分に目的物は溶出する。）で分離精製した。目的物[18F]（５a）を含むフラクションを集め、減圧下アセトニトリルをエバポレートして18Ｆ標識化オリゴヌクレオチド（５a）のTEAAバッファー溶液（5 mL）を得た。
＜18Ｆ標識化オリゴヌクレオチド(5a)の合成に要する時間と収率＞
　以上、18Ｆ標識化オリゴヌクレオチド(5a)の合成に要する時間及び収率等は以下の通りである。
　合成時間:84分、単離した（５ａ）の放射能:2.53GBq、比放射能:2366GBq/μmol、化学的純度（UV260nm）:95%、放射化学的純度:87%、[18F]フッ素イオンに基づく放射化学収率:5.2%(減衰補正なし)、8.6%(減衰補正あり)であった。
　また、本合成法は必要に応じてTEAAを脱塩したり、濃縮したりすることも可能である。以下に脱塩の処理の詳細を示す。
　[18F]（５a）のTEAAバッファー溶液をSep-Pak Plus C18 (ウォーターズ社製、40 mLの EtOH と40 mLの水でプレコンディショニング済)に通じ、水（５ｍL）で２回洗浄し、窒素ガスフローで１分間乾燥させ、エタノール（1 mL）で[18F]（５a）を溶出させた。エタノールは窒素ガスフローで揮発させ、[18F]（５a）の濃厚水溶液を得た。これを適切な量の生理食塩水で希釈して動物への投与液を作成した。プロセス時間がさらに30分かかったが、90%が回収された(減衰補正あり)。
（実施例２）
　実施例１と同様の方法により、4-メチルベンゼンスルホン酸-3-アジドベンジル(3b)のトシレート基を18Ｆで置換することにより18Ｆ標識アジド化合物(1b)を合成し、さらに上記アセチレン基修飾オリゴヌクレオチド(4a)とのHuisgen反応を用いたカップリング反応を行なった。
　なお、実施例には示さないが、実施例１において出発物質となった4-アジドベンジルアルコール(2a)の代わりに2-アジドベンジルアルコールを用いて、実施例１と同様の操作を行なうことにより、オルト体の18Ｆ標識アジド化合物が得られることは、技術常識から明白である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
＜18Ｆ標識アジド化合物(1b)の合成＞
　実施例１における18Ｆ標識アジド化合物(1a)の合成と同様の方法により、18Ｆ標識アジド化合物(1b)を合成した。
＜アセチレン基修飾オリゴヌクレオチド(4a)の18Ｆ標識アジド化合物(1b)による標識化＞
　次いで実施例１と同様の方法により、アセチレン基修飾オリゴヌクレオチド(4a)の18Ｆ標識アジド化合物(1b)による標識化を行なった。すなわち、上記で合成した18Ｆ標識アジド化合物(1b)とアセチレン基修飾オリゴヌクレオチド(4a)とをHuisgen反応を用いてカップリング反応を行い、18Ｆ標識化オリゴヌクレオチド(5b)のTEAAバッファー溶液（5mL）を得た。
＜18Ｆ標識化オリゴヌクレオチド(5b)の合成に要する時間と収率＞
　以上、18Ｆ標識化オリゴヌクレオチド(5b)の合成の合成に要する時間及び収率等は以下の通りである。
　合成時間:83分、単離した（５ｂ）の放射能:2.12GBq、比放射能:1809 GBq/μmol、化学的純度（UV260nm）:99%、放射化学的純度:93%、[18F]フッ素イオンに基づく放射化学収率: 4.2%(減衰補正なし)、7.2%(減衰補正あり)であった。
（実施例３）
　実施例３では実施例２と同様の方法により、4-メチルベンゼンスルホン酸-3-アジドベンジル(3b)のトシレート基を18Ｆで置換することにより18Ｆ標識アジド化合物(1b)を合成し、さらに上記アセチレン基修飾オリゴヌクレオチド(4b)とのHuisgen反応によるカップリングを行なった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
＜アセチレン基修飾オリゴヌクレオチド（４b）の18Ｆ標識化＞
　前述の方法により合成した18Ｆ標識アジド化合物(1b)と、アセチレン基修飾オリゴヌクレオチド（４b）とを、実施例２と同様の方法によりカップリングさせて18Ｆ標識化オリゴヌクレオチド(5c)を合成した。
＜18Ｆ標識化オリゴヌクレオチド（５c）の合成に要する時間と収率＞
　合成時間: 95分、単離した（５c）の放射能:0.862GBq、比放射能:762 GBq/μmol、化学的純度（UV260nm）:96%、放射化学的純度:>99%、[18F]フッ素イオンに基づく放射化学収率:1.7%(減衰補正なし)、3.1%(減衰補正あり)であった。
（実施例４）
　実施例４では実施例２と同様の方法により、4-メチルベンゼンスルホン酸-3-アジドベンジル(3b)のトシレート基を18Ｆで置換することにより18Ｆ標識アジド化合物(1b)を合成し、さらに上記アセチレン基修飾オリゴヌクレオチド(4c)とのHuisgen反応によるカップリングを行なった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
＜アセチレン基修飾オリゴヌクレオチド（４c）の18Ｆ標識化＞
　前述の方法により合成した18Ｆ標識アジド化合物(1b)と、アセチレン基修飾オリゴヌクレオチド（４b）とを、実施例２と同様の方法によりカップリングさせて18Ｆ標識化オリゴヌクレオチド(5d)を合成した。
＜18Ｆ標識化オリゴヌクレオチド（５d）の合成に要する時間と収率＞
合成時間: 83分、単離した（５ｄ）の放射能:1.66 GBq、比放射能:3205 GBq/μmol、化学的純度（UV260nm）:98%、放射化学的純度:96%、[18F]フッ素イオンに基づく放射化学収率:3.3%(減衰補正なし)、5.6%(減衰補正あり)であった。
[先行技術との比較]
　上記実施例１～３の結果から、極めて希薄な本発明の18Ｆ標識アジド化合物(1a)及び(1b)と、極めて希薄なアセチレン基修飾オリゴヌクレオチドとを、銅化合物触媒存在下でHuisgen反応を行なうことにより、収率よくアルキン化合物の18Ｆ標識化ができることが分かった。表１に、従来の18Ｆ標識化法と本発明の18Ｆ標識化法における、18Ｆ標識化対象化合物の必要量及び18Ｆ標識化対象化合物の必要な濃度を示す。この表から明らかなように、上記実施例１～３で行なった18Ｆ標識アジド化合物（1a)(1b)を用いた18Ｆ標識化は、従来の18Ｆ標識方法と比較して、18Ｆ標識化対象化合物の必要量及び18Ｆ標識化対象化合物の必要な濃度がともに極めて小さい場合でも可能となるという、顕著な効果を奏することが分かる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
 　ここで、非特許文献１～８の方法は、Huisgen反応を利用する18Ｆ標識方法であり、非特許文献９～１４に記載の方法は、オリゴヌクレオチドに対して18Ｆ標識化を行なった従来の例である。
[反応条件の検討]
　本発明の18Ｆ標識アジド化合物を用いてHuisgen反応による18Ｆ標識化を行なうためには、放射能の被曝を避けるため、合成は機械により遠隔的に行なうことが好ましい。このため、遮蔽されたドラフト内で標識用合成装置を用いることが必要となり、時間も限られ、多量に用いた前駆体、分解物及び各種試薬の中から、痕跡量の18Ｆ標識アジド化合物を非常に高い純度で取得するという要求に答えなければならない。また、Huisgen反応の迅速化及び高収率化も必要となる。このため最適な反応条件の検討を行なった。
＜Huisgen反応の適切な条件＞
　Huisgen反応における効率化において、反応速度に着目し、これをなるべく大きくするための最適化を検討した。なぜならば、本発明において18Ｆ標識アジド化合物は少量しか合成されないため、極めて希釈された二つの基質を、温和な条件で短時間で反応させる条件を見出す必要があるからである。
　このため、N-(プロパ-2-イニル)ベンズアミドをモデルとなるアルキン化合物の基質として、非標識の１９Ｆアジド化合物を用いて反応条件の検討を行なった。まず、反応に最適な有機溶媒をスクリーニングするために、高い濃度の基質同士のHuisgen反応を行った。触媒としては硫酸銅を１ｍＭ／Ｌとし、還元剤としてアスコルビン酸ナトリウムを２ｍＭ／Ｌ、ＴＢＴＡを１ｍＭ／Ｌとし、水：有機溶媒＝３：７(容量比)で有機溶媒を種々変えて、Huisgen反応を行なった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
 　その結果、下記表２に示すように、非プロトン性極性溶媒を添加した場合が収率がよく、特にＤＭＳＯの場合が最も収率がよかった。また、エントリー５とエントリー６との比較から明らかなように、ＴＢＴＡの添加によって収率を劇的に高められることが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
　また、上記の反応において、希薄溶液下における反応条件を検討した。すなわち、放射標識化実験で使われる濃度を模して、より希釈された基質(100μmol/LのN-(プロパ-2-イニル)ベンズアミドと50μmol/Lの非標識１９Ｆアジド化合物(1b))とを用い、反応条件を変化させた。その結果、表３に示すように、ＴＢＴＡの濃度は１００μＭ／Ｌ以上で収率が高いことが分かった。また、（TBTAの濃度）／（Cuの濃度）は１よりも１／２の方が収率が良かく、１未満であることが好ましいことが分かった。さらに、反応温度は室温よりも４０℃に加温したほうが、収率が良かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
　また、上記表３のエントリー2の条件において、リン酸ナトリウムバッファのｐHを変化させて収率を調べた。その結果、表４に示すように、ｐＨは６．５～７．５の範囲において優れた収率を示し、特にｐＨ７付近で最大になることが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
　さらに、上記表３のエントリー2の条件において、ＤＭＳＯの濃度を変化させて収率を調べた。その結果、表５に示すように、ＤＭＳＯの容量％は３０％以上とするのが好ましいことが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
[ＰＥＴ画像撮影]
　上記実施例１で得た18Ｆ標識化オリゴヌクレオチド（５a）をラットに投与してＰＥＴ画像を撮影した。すなわち、４５ＭＢｑの18Ｆ標識化オリゴヌクレオチド（５a）の生理食塩水溶液を麻酔下のＳＤラット（８週齢、体重２５２ｇ）に尾静脈から投与し、シーメンス社製動物用ＰＥＴ装置ＭｉｃｒｏＰＥＴ　Ｆｏｃｕｓ－２２０で撮像した。プローブ投与後１２０分後から３０分間の全身像（Ｍａｘｉｍｕｍ　Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ　Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ画像）を図１に示す。この図から、投与された18Ｆ標識化オリゴヌクレオチド（５a）は、血中で速やかに代謝され、尿排泄されることが分かった。なお、全身の骨組織に強い放射能の集積が認められるが、これは18Ｆ標識化オリゴヌクレオチド（５a）の代謝によって生成したＦ－イオンに基づくものと考えられる。
　同様の方法により、18Ｆ標識化オリゴヌクレオチド（５ｂ）、（５ｃ）及び（５ｄ）をラットに投与してＰＥＴ撮像した。投与後１２０分後から３０分間の全身像（Ｍａｘｉｍｕｍ　Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ　Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ画像）を図２～図４に示す。これらの図から2’,4’-ＢＮＡ化体である（５ｄ）は血中の代謝が遅くなり、腎臓・膀胱への集積が観察され、骨組織での放射活性は低下していることが分かった。また2’,4’-ＢＮＡ化し骨格をホスホロチオアート結合とした（５ｃ）は血中の代謝がさらに遅くなり、肝臓・腎臓への集積が観察され、骨組織での放射活性はさらに低下していることが分かった。
　以上のように、本発明の18Ｆ標識化オリゴヌクレオチドを用いることにより、2’,4’-ＢＮＡ化オリゴヌクレオチドやホスホロチオアートオリゴヌクレオチドなどの人工核酸の効果について、直接的な観察が可能となる。このことは、例えばＲＮＡ干渉を用いた遺伝子治療の研究において、ヌクレアーゼ耐性や各組織への分布をｉｎ　ｖｉｖｏで、直接的に観察できるなど、オリゴヌクレオチド医薬の研究開発における強力な研究ツールとして利用できることを意味するものである。
　この発明は上記発明の実施の態様及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
18Ｆ標識化オリゴヌクレオチド（５a）をＳＤラットに尾静脈から投与した場合における投与１２０分後から３０分間の積算した場合の全身像（ＭＩＰ画像）である。 18Ｆ標識化オリゴヌクレオチド（５ｂ）をＳＤラットに尾静脈から投与した場合における投与１２０分後から３０分間の積算した場合の全身像（ＭＩＰ画像）である。 18Ｆ標識化オリゴヌクレオチド（５ｃ）をＳＤラットに尾静脈から投与した場合における投与１２０分後から３０分間の積算した場合の全身像（ＭＩＰ画像）である。 18Ｆ標識化オリゴヌクレオチド（５ｄ）をＳＤラットに尾静脈から投与した場合における投与１２０分後から３０分間の積算した場合の全身像（ＭＩＰ画像）である。
　本発明は、個別化医療への展開が期待されているＲＮＡ創薬等、核酸オリゴマーを用いた医療分野において有用な手段を提供することができる。

Claims (6)

  1. 　下記構造式（１）で示される18Ｆ標識アジド化合物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
  2. 　請求項１に記載の18Ｆ標識アジド化合物からなる18Ｆ標識化用試薬。
  3. 　アルキン化合物と、請求項１に記載の18Ｆ標識アジド化合物とを銅化合物触媒存在下でHuisgen反応を行ない18Ｆ標識トリアゾール誘導体とするアルキン化合物の18Ｆ標識方法。
  4. 　反応溶媒として水及び水溶性の有機溶媒からなる混合溶媒を用い、アスコルビン酸塩及びアミン系塩基の存在下で反応を行なうことを特徴とする請求項３記載のアルキン化合物の18Ｆ標識方法。
  5. 　アミン系塩基は（トリス((1-ベンジル-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)メチル)アミンであることを特徴とする請求項４記載のアルキン化合物の18Ｆ標識方法。
  6. 　前記アルキン化合物はヌクレオチド誘導体であることを特徴とする請求項３乃至５のいずれか１項記載のアルキン化合物の18Ｆ標識方法。
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