WO2010123043A1 - 癌の評価方法 - Google Patents

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雅彦 黒田
彰 齋藤
真貴 佐野
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    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Definitions

  • the present invention relates to a method for evaluating the possibility of cancer by detecting a new cancer marker.
  • the cancer marker is also referred to as a tumor marker.
  • Specific examples of the cancer marker include, for example, PSA (prostate specific antigen: Prostate Specific Antigen), CEA (Carcinoembryonic Antigen), CA19-9 (Carcinoembryonic Antigen 19-9) 72-4).
  • PSA prostate specific antigen: Prostate Specific Antigen
  • CEA Carcinoembryonic Antigen
  • CA19-9 Carcinoembryonic Antigen 19-9) 72-4.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 the expression of miRNAs such as has-mir-15, has-mir-16, miR-143, and miR-145 is down-regulated in lymphocytic leukemia and colon cancer.
  • an object of the present invention is to provide an evaluation method using a novel cancer marker for evaluating cancer, and an evaluation reagent used therefor.
  • the evaluation method of the present invention is an evaluation method for evaluating the possibility of cancer, A cancer marker detection step of detecting a cancer marker in a sample; And evaluating the possibility of cancer of the sample based on the expression level of the cancer marker detected in the cancer marker detection step,
  • the sample is a cell or tissue;
  • the cancer marker includes at least one miRNA of hsa-miR-92 and hsa-miR-494.
  • the present inventors have found that the expression levels of hsa-miR-92 and hsa-miR-494 are changed in cells or tissues as cancer develops, and the present invention has been reached. .
  • the evaluation method of the present invention by detecting the expression level of the miRNA in a sample, for example, the presence or absence of cancer or the progression of cancer can be determined with excellent reliability.
  • the expression of the miRNA has a significant difference between negative and positive for canceration, for example, according to the present invention, for example, for an early stage cancer that is difficult to detect by general palpation or the like. Can be easily detected.
  • the evaluation method of the present invention correspond to, for example, conventional evaluation of cancer by HE staining or the like, it is possible to evaluate cancer with even higher reliability.
  • FIG. 1B of this invention It is a block diagram which shows the cancer pathological image diagnosis assistance system of Embodiment 1B of this invention. It is a figure explaining the content of the dyeing
  • FIG. 20 is a block diagram illustrating a cancer pathological image diagnosis support system according to Embodiment 1A of the present invention.
  • FIG. 20 is a flowchart for demonstrating an example of operation
  • each term means the following.
  • Cancer generally refers to a malignant tumor.
  • Carcinogenesis generally means the onset of cancer and includes the meaning of “malignant transformation”.
  • Onset is referred to as onset when, for example, a specific disease is diagnosed by comprehensive judgment based on disease-specific clinical symptoms or test data.
  • the “preclinical phase” generally refers to a pre-onset state before a disease-specific clinical symptom appears, and an early state in which a minute amount of malignant tumor cells are already present.
  • Prognosis means, for example, a course after treatment of a disease such as after surgery.
  • the cancer marker in the present invention can be referred to as “prognostic factor” because it can be used as a judgment material for predicting prognosis, making a prospect, and selecting an appropriate treatment method, for example.
  • the “advanced stage of cancer” can be determined as appropriate depending on, for example, the type of cancerous tissue, etc., and generally, stage 0 and stage I can be classified as early stage cancer, stage II as early stage cancer, and stage III to IV as advanced cancer.
  • “possibility of cancer” means, for example, the possibility of developing cancer, whether or not it has become cancerous, the degree of progression of cancer in the preclinical stage or clinical stage, or the prognostic state, etc. including.
  • the cancer marker miRNA in the present invention is at least one miRNA of hsa-miR-92 and hsa-miR-494.
  • the cancer marker is also referred to as a cancer marker miRNA.
  • the cancer marker miRNA may be, for example, a single strand (monomer) or a double strand (dimer).
  • the cancer marker miRNA may be, for example, an immature miRNA or a mature miRNA.
  • the immature miRNA include primary transcription initial miRNA (pri-miRNA) and precursor miRNA (pre-miRNA).
  • pri-miRNA primary transcription initial miRNA
  • pre-miRNA precursor miRNA
  • the pri-miRNA has a hairpin loop structure by intramolecular bonding.
  • the pri-miRNA is cleaved with Drosha and converted into a short pre-miRNA having a stem-loop structure.
  • the pre-miRNA is also referred to as a stem-loop miRNA.
  • the pre-miRNA is cleaved with Dicer to generate shorter double-stranded RNA (miRNA-miRNA * ).
  • This double-stranded RNA is unwound on the RISC, and two single-stranded RNAs are generated.
  • the single-stranded RNA is a mature miRNA.
  • one of mature miRNAs is referred to as functional miRNA, and the other is referred to as Minor miRNA * .
  • the cancer marker miRNA is not particularly limited, but is preferably a stem-loop miRNA and a mature miRNA, and particularly preferably a mature miRNA.
  • hsa-miR-92 examples include hsa-miR-92a and hsa-miR-92b.
  • Hsa-miR-92a may be either immature miRNA or mature miRNA as described above.
  • the former is also referred to as immature hsa-miR-92a
  • the latter is also referred to as mature hsa-miR-92a.
  • Examples of immature hsa-miR-92a include hsa-miR-92a-1 and hsa-miR-92a-2, and any of them may be used.
  • hsa-miR-92a-1 and hsa-miR-92a-2 are stem-loop miRNAs.
  • the former is also referred to as stem loop hsa-miR-92a-1
  • the latter is also referred to as stem loop hsa-miR-92a-2.
  • Both are transcripts from different genomic regions, but the mature sequences of each are identical.
  • the stem loop hsa-miR-92a-1 for example, has the sequence of Accession No.
  • the stem loop hsa-miR-92a-2 has a sequence of Accession No. Registered in MI00000094.
  • the mature hsa-miR-92a includes, for example, a functional miRNA. Registered in MIMAT000098.
  • the sequence of this functional hsa-miR-92a is shown in SEQ ID NO: 1.
  • Functional hsa-miR-92a (SEQ ID NO: 1) 5'-uauugcacuuguccccgcccugu-3 '
  • Minor miRNA * can be mentioned.
  • Examples of the Minor miRNA * include hsa-miR-92a-1 * and hsa-miR-92a-2 * .
  • hsa-miR-92a-1 * has a sequence of Accession No. It is registered in MIMAT0004507. This sequence is shown in SEQ ID NO: 6.
  • the sequence of hsa-miR-92a-2 * is registered in MIMAT0004508. This sequence is shown in SEQ ID NO: 7.
  • Hsa-miR-92b is a transcription product from a genomic region different from hsa-miR-92a, but its seed sequence is similar to hsa-miR-92a. Therefore, hsa-miR-92b can be used as a cancer marker in the same manner as hsa-miR-92a. As described above, hsa-miR-92b may be either an immature miRNA or a mature miRNA. Hereinafter, the former is also referred to as immature hsa-miR-92b, and the latter is also referred to as mature hsa-miR-92b.
  • the stem loop miRNA is hereinafter also referred to as stem loop hsa-miR-92b.
  • the stem loop hsa-miR-92b has, for example, a sequence whose accession Mo. Registered in MI0003560.
  • the mature hsa-miR-92b includes, for example, a functional miRNA, and its sequence is indicated by the accession no. Registered in MIMAT0003218.
  • the sequence of this functional hsa-miR-92b is shown in SEQ ID NO: 3.
  • Functional hsa-miR-92b (SEQ ID NO: 3) 5'-uauugcacucucccccggccuccc-3 '
  • examples of the mature hsa-miR-92b include Minor miRNA * .
  • examples of the Minor miRNA * include hsa-miR-92b * .
  • hsa-miR-92b * is a transcript from a different genomic region than hsa-miR-92a-1 * or hsa-miR-92a-2 * , but its seed sequence is hsa-miR-92a-1 * Or similar to hsa-miR-92a-2 * .
  • hsa-miR-92b * can be used as a cancer marker in the same manner as hsa-miR-92a-1 * or hsa-miR-92a-2 * .
  • hsa-miR-92b * has a sequence of Accession No. It is registered in MIMAT0004792. This sequence is shown in SEQ ID NO: 4.
  • Minor hsa-miR-92b * (SEQ ID NO: 4) 5′-agggacggggacggcggugcagug-3 ′
  • Hsa-miR-494 may be either an immature miRNA or a mature miRNA as described above. Hereinafter, the former is also referred to as immature hsa-miR-494, and the latter is also referred to as mature hsa-miR-494.
  • Examples of immature hsa-miR-494 include stem-loop miRNA. Hereinafter, this is also referred to as stem loop hsa-miR-494.
  • the stem loop hsa-miR-494 has, for example, the sequence of Accession No. Registered in MI0003134.
  • the mature type hsa-miR-494 includes, for example, a functional miRNA. It is registered in MIMAT0002816. The sequence of this functional hsa-miR-494 is shown in SEQ ID NO: 2. Functional hsa-miR-494 (SEQ ID NO: 2) 5'-ugaaacauaacggggagaaccuc-3 '
  • each of the miRNAs has several variations, for example, at the 5 ′ end and the 3 ′ end. Therefore, each miRNA in the present invention further includes a variant having a different number of bases by several from the mature sequence described above.
  • Wu H. et al. 2007, PLoS ONE 2 (10): e1020 miRNA profiling of naive, effector and memory CD8 T cells.
  • Pablo Landgraf et al. 2007, Cell, vol. 129, p. 1401-1414 A Mammalian microRNA Expression Atlas Based on Small RNA Library Sequencing.
  • Neilson et al. 2007, Genes Dev, vol. 21, p. 578-589 Dynamic regulation of miRNA expression in order to stage of cellular development.
  • the cancer marker miRNA includes, for example, a polynucleotide comprising a base sequence having homology with the base sequence described in each of the above SEQ ID NOs, or a polynucleotide comprising a base sequence complementary thereto.
  • the “homology” is the degree of identity when sequences to be compared are appropriately aligned, and means the occurrence rate (%) of an exact match of nucleotides between the sequences.
  • the phrase “having homology” in the nucleotide sequences of polynucleotides means that the polynucleotides are sufficiently similar to maintain the function as miRNA in the present invention.
  • the alignment can be performed by using an arbitrary algorithm such as BLAST, for example.
  • the base sequences Even if the base sequences have differences due to point mutations such as substitution, deletion, insertion or addition, if they do not affect the function of the miRNA, they can be said to be homologous.
  • the number of different bases is, for example, 1 to 20, 1 to 15, 1 to 10, 1 to 5, 1 to 3, 2, or 1. Further, by comparing two polynucleotides, for example, the base sequence is 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 If they show% or 100% identity, they are said to be homologous.
  • both can be said to be homologous.
  • the stringent conditions are not particularly limited. For example, in a solution containing 6 ⁇ SSC, 0.5% SDS, 5 ⁇ Denhardt, 0.01% denatured salmon sperm nucleic acid, “Tm (° C.) ⁇ 25 ° C. And the like, and the like.
  • the evaluation method of the present invention includes a cancer marker detection step for detecting a cancer marker in a sample, and the possibility of cancer in the sample based on the expression level of the cancer marker detected in the cancer marker detection step.
  • the sample is a cell or tissue
  • the cancer marker comprises at least one miRNA of hsa-miR-92 and hsa-miR-494.
  • the evaluation method of the present invention can be said to be an evaluation method for determining whether or not the patient is suffering from cancer, for example.
  • the cancer marker in the present invention is as described above.
  • the cancer marker to be detected may be, for example, either or both of hsa-miR-92 and hsa-miR-494.
  • hsa-miR-92 When the cancer marker to be detected is hsa-miR-92, for example, either one of mature type and immature type may be used, or both may be used. As for hsa-miR-92, for example, the type of mature type and immature type is not limited, and any one type, two types, or all may be used.
  • the cancer marker to be detected is mature type hsa-miR-92a, for example, any one of functional hsa-miR-92, Minor hsa-miR-92a-1 * and Minor hsa-miR-92a-2 * It may be any two or all of them.
  • the cancer marker to be detected is immature type hsa-miR-92a, for example, one or both of stem loop hsa-miR-92a-1 and stem loop hsa-miR-92a-2 may be used. May be.
  • the cancer marker to be detected is mature type hsa-miR-92b, for example, either one or both of functional hsa-miR-92b and Minor hsa-miR-92b * may be used.
  • hsa-miR-494 When the cancer marker to be detected is hsa-miR-494, for example, either one of mature type and immature type may be used, or both may be used.
  • the type of hsa-miR-494 is not limited, and the type of mature type and immature type may be any one type or two types.
  • functional hsa-miR-494 can be mentioned.
  • the present invention is characterized by detecting the expression level of the cancer marker.
  • the detection method of the said cancer marker is not restrict
  • the detection method is preferably, for example, a method of visualizing the cancer marker.
  • the visualization method is not particularly limited, but is preferably performed by, for example, color development, fluorescence, autoradiography, or the like.
  • the cancer marker can be detected by visual observation, absorbance measurement, image processing, or the like.
  • the cancer marker when the cancer marker is visualized by fluorescence, the cancer marker can be detected by visual observation, fluorescence intensity measurement, image processing, or the like.
  • cancer marker miRNA staining visualization of cancer marker miRNA by color development or fluorescence is also referred to as miRNA staining.
  • the cancer marker miRNA can be detected by, for example, visual observation of an autoradiographic image, image processing of the image, or the like.
  • the cancer to be evaluated is not particularly limited.
  • the cancer include colon cancer, rectal cancer, gallbladder cancer, gastric cancer, breast cancer, leukemia, pancreatic cancer, liver cancer, brain tumor, osteosarcoma and the like as described above.
  • the sample is a biological sample and may be any cell or tissue, and is not particularly limited. Specific examples include, for example, the large intestine, rectum, gallbladder, stomach, breast, blood cells, liver, brain, bone, bone and surrounding tissues such as cells, blood cells such as leukocytes, and the like.
  • the subject from which the sample is derived is not particularly limited, and examples thereof include humans.
  • Other examples include non-human mammals including non-human primates, rodents, dogs, cats and the like.
  • the detection of the cancer marker miRNA in the sample may be performed directly on the sample, for example, or indirectly on RNA recovered from the sample.
  • the detection of the cancer marker miRNA in the sample may be performed directly on the sample, for example, or indirectly on RNA recovered from the sample.
  • the present invention for example, since the expression region of the cancer marker in the sample can be specified, it is preferable to directly detect the cancer marker for the sample.
  • the method for recovering RNA from the sample is not particularly limited, and a known method can be employed. Specific examples include guanidine-cesium chloride ultracentrifugation, AGPC (Acid Guanidinium-Phenol-Chloroform), and commercially available reagents and kits.
  • the cancer marker miRNA can be detected indirectly by detecting the cDNA of the cancer marker miRNA for cDNA synthesized using the recovered RNA as a template.
  • the cancer marker miRNA can be detected using, for example, a nucleic acid amplification method.
  • the nucleic acid amplification method is not particularly limited, and examples thereof include a polymerase chain reaction (PCR) method, a reverse transcription PCR (RT-PCR) method, a real-time PCR method, and a real-time RT-PCR method.
  • PCR polymerase chain reaction
  • RT-PCR reverse transcription PCR
  • real-time PCR method a real-time RT-PCR method.
  • a real-time RT-PCR method is preferred.
  • RNA is extracted from a sample, and cDNA is synthesized using the total RNA as a template and a random primer.
  • an amplification reaction is performed using a primer capable of amplifying the cDNA of the target cancer marker miRNA, and the amplification product is detected.
  • the expression level of the cancer marker miRNA in the sample that is, the presence or amount of expression of the cancer marker miRNA can be detected.
  • the random primer used in the cDNA synthesis reaction is not particularly limited, and for example, a commercially available random primer can be used. Further, the primer used in the amplification reaction is not limited at all.
  • the primer hybridizes to the cDNA of the cancer marker miRNA or a sequence complementary thereto, or the cDNA in the peripheral region of the cancer marker miRNA or a sequence complementary thereto. Possible primers are listed.
  • the primer can be appropriately designed based on, for example, the base sequence of the cancer marker miRNA and common technical knowledge. Specific examples of the primer include a primer comprising a cDNA of the target cancer marker miRNA or a sequence complementary thereto, or a cDNA in the peripheral region of the cancer marker miRNA or a sequence complementary thereto.
  • the sequence of the primer is, for example, about 70% or more complementary to the cDNA of the target cancer marker miRNA or a sequence complementary thereto, or the cDNA in the peripheral region of the cancer marker miRNA or a sequence complementary thereto.
  • it is 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, and particularly preferably 100% complementary.
  • the structural unit of the primer is not particularly limited, and a known structural unit can be adopted. Specific examples include nucleotides such as deoxyribonucleotides and ribonucleotides, and may include PNA (Peptide Nucleic Acid), LNA (Locked Nucleic Acid), and the like.
  • the base in the structural unit is not particularly limited, and may include natural bases (non-artificial bases) such as A, C, G, T, and U, and may include non-natural bases (artificial bases).
  • the length of the primer is not particularly limited and can be a general length.
  • the detection method of the amplification product is not particularly limited, and a known method can be adopted.
  • a fluorescent reagent coexists in the reaction solution of the amplification reaction.
  • the fluorescent reagent include fluorescent substances that specifically bind to double-stranded nucleic acids, fluorescent substances that intercalate with double-stranded nucleic acids, and the like.
  • the coexisting fluorescent substance binds to or intercalates with the double-stranded nucleic acid.
  • the presence or absence of the amplification product can be confirmed, and the presence or absence of the target cancer marker miRNA can be indirectly confirmed.
  • the amplification product can be quantified by measuring the fluorescence intensity of the fluorescent substance, and the target cancer marker miRNA can be quantified indirectly.
  • the fluorescent reagent include SYBR (trademark) Green. Detection using the fluorescent reagent can be performed by, for example, a known method.
  • a commercially available reagent such as SYBR (trademark) Green PCR master mix (trade name, Perkin-Elmer Applied Biosystems), ABI Prism 7900 Sequence Detection System (trade name, Perkin- A commercially available detection device such as Elmer Applied Biosystems) can be used, and can be carried out according to their manual.
  • SYBR trademark
  • Green PCR master mix trade name, Perkin-Elmer Applied Biosystems
  • ABI Prism 7900 Sequence Detection System trade name, Perkin- A commercially available detection device such as Elmer Applied Biosystems
  • the labeled probe examples include a probe having a fluorescent substance and a quencher, and specific examples include a TaqMan (trademark) probe and a cycling probe using RNase in combination.
  • a TaqMan (trademark) probe examples include a TaqMan (trademark) probe and a cycling probe using RNase in combination.
  • a method using such a labeled probe can be performed, for example, according to a known method.
  • the cancer marker miRNA cDNA can be detected using a probe.
  • the probe include a primer capable of hybridizing to the cDNA of the cancer marker miRNA or a sequence complementary thereto.
  • the cancer marker cDNA and the probe are hybridized, and the probe hybridized to the cancer marker cDNA is detected.
  • the presence or absence or amount of the probe hybridized to cDNA of the cancer marker corresponds to the presence or amount of the cancer marker miRNA in the RNA recovered from the sample. Therefore, the presence or amount of the cancer marker miRNA in the sample can be indirectly detected by detecting the probe.
  • the probe can be detected by a known method, for example, the same method as described later.
  • the cancer marker miRNA may be directly detected from the recovered RNA.
  • a hybridization method using a probe can be mentioned.
  • the probe for example, a probe that can specifically hybridize to the cancer marker miRNA can be used.
  • the cancer marker miRNA and the probe are hybridized, and the probe hybridized to the cancer marker miRNA is detected.
  • the presence / absence or amount of the probe hybridized to the cancer marker corresponds to the presence / absence or amount of the cancer marker miRNA in RNA recovered from the sample. Therefore, the presence or amount of the cancer marker miRNA in the sample can be indirectly detected by detecting the probe.
  • the method for detecting the probe is not particularly limited.
  • a labeled probe labeled with a labeling substance can be used as the probe, and the labeling substance can be detected.
  • the labeling substance for example, a substance that can be detected by itself can be used, and examples thereof include a coloring substance, a fluorescent substance that emits fluorescence, and a radioactive substance.
  • the presence and amount of the coloring material can be determined by, for example, the presence or absence of coloring and the strength of coloring.
  • the color-developing substance may be, for example, a substance that exhibits color development, or may be a substance that liberates a substance that exhibits color development by an enzyme reaction or the like, or changes to a substance that exhibits color development by an enzyme reaction or an electron transfer reaction. It may be a substance.
  • the presence and amount of the fluorescent substance can be determined based on the presence or absence of fluorescence and the intensity of fluorescence.
  • the fluorescent substance may be, for example, a substance that emits fluorescence itself, a substance that liberates a substance that emits fluorescence by an enzyme reaction or the like, or a substance that emits fluorescence by an enzyme reaction or an electron transfer reaction. It may be a substance.
  • the presence and amount of the labeling substance can be determined by measuring the radioactivity level with a scintillation counter or the presence or absence of an image and the density of the image by an autoradiography method, for example. Examples of the hybridization method using the probe labeled with the radioactive substance include Northern blotting and microarray analysis.
  • the labeling substance may be a labeling substance that can be detected by other reagents, for example.
  • a labeling substance include enzymes such as alkaline phosphatase (AP) and horseradish peroxidase (HRP).
  • AP alkaline phosphatase
  • HRP horseradish peroxidase
  • the labeling substance is an enzyme, for example, the presence or absence of color development or fluorescence due to the reaction with the enzyme by adding, as the other reagent, a substrate that emits color or fluorescence by the enzyme reaction or electron transfer accompanying it, etc. Absorbance or fluorescence intensity may be detected.
  • the substrate is not particularly limited and can be appropriately set depending on the type of enzyme.
  • BCIP bromochloroindolyl phosphate
  • NBT nilotu blue tetrazolium
  • DAB Benzidine tetrahydrochloride
  • the labeling substance that can be detected by the other reagents include biotin and avidin, and preferably biotin.
  • biotin and avidin When the probe is labeled with biotin, it is preferable to add, for example, the enzyme, the coloring material, the fluorescent material, or the radioactive material, to which avidin is bound, as the other reagent. Since biotin, which is a labeling substance for the probe, binds to avidin, the enzyme or the like bound to avidin may be detected by the method described above.
  • the other reagent may be, for example, a complex of avidin, biotin, the enzyme, or the like, so-called avidin-biotin complex. This method is a so-called ABC (avidin-biotin complex) method.
  • biotin of one complex and biotin of another complex can be bound, and the number of molecules such as an enzyme that binds to one molecule of probe can be increased. For this reason, detection with higher sensitivity is possible.
  • the biotin may be a biotin derivative, for example, and the avidin may be an avidin derivative such as streptavidin, for example.
  • examples of the method for detecting the probe hybridized to the cancer marker miRNA include a method using an antigen-antibody reaction using a labeled probe labeled with an antigen as the probe.
  • a labeled primary antibody that can specifically bind to the antigen and is labeled with a labeling substance.
  • other methods include a primary antibody that can specifically bind to the antigen and a labeled secondary antibody that can specifically bind to the primary antibody and is labeled with a labeling substance.
  • the cancer marker miRNA and the antigen-labeled probe are hybridized. Subsequently, the labeled primary antibody is bound to the antigen-labeled probe bound to the cancer marker miRNA via the antigen. Then, the labeling substance of the labeled primary antibody bound to the probe is detected. Thereby, the probe hybridized to the cancer marker miRNA can be detected, and as a result, the cancer marker miRNA can be indirectly detected.
  • the type of antigen for labeling the probe is not particularly limited, and examples thereof include digoxigenin (DIG).
  • the primary antibody is not particularly limited, and can be appropriately set according to, for example, the type of the antigen. When the antigen is DIG, for example, an anti-DIG antibody can be used.
  • the labeling substance of the labeled primary antibody is not particularly limited and is the same as described above.
  • the latter method using a labeled secondary antibody is a so-called sandwich method.
  • the cancer marker miRNA and the antigen-labeled probe are first hybridized.
  • the primary antibody is bound to the antigen-labeled probe bound to the cancer marker miRNA via the antigen.
  • the labeled secondary antibody is bound to the primary antibody bound to the probe.
  • the labeled secondary antibody binds to the cancer marker miRNA via the primary antibody.
  • the labeling substance of the labeled secondary antibody is detected.
  • the kind of antigen for labeling the probe and the primary antibody are not particularly limited, and are the same as described above.
  • the labeling substance of the secondary antibody is not particularly limited and is the same as described above.
  • the detection of the cancer marker miRNA is preferably performed directly on the sample because, for example, the expression region of the cancer marker miRNA in the sample can be identified.
  • the sample is preferably immobilized.
  • the method for detecting the cancer marker miRNA is preferably, for example, a hybridization method using a probe.
  • the cancer marker is preferably detected by an in situ hybridization method for an immobilized sample, and in particular, immunohistochemistry (IHC) using an antigen-antibody reaction is preferably applied.
  • IHC immunohistochemistry
  • the cytoplasm or nucleus can be stained with the cancer marker miRNA.
  • a labeled probe is preferable as the probe, and the same probes as described above can be used.
  • the in situ hybridization method can be performed, for example, according to a known method. Moreover, it can also carry out according to the instruction manual using a commercially available kit etc. Examples of the kit include a Ventana brand name RiboMap in situ hybridization kit.
  • in situ hybridization method for example, preparation of a section slide of the sample, pretreatment of the section slide, hybridization of the labeled probe, and detection of a hybridization signal are performed. Specific examples of the in situ hybridization method are shown below, but the present invention is not limited thereto.
  • a section slide is prepared for the cell or tissue as the sample.
  • the section slide can be prepared by fixing the sample using a fixing solution, embedding, cutting the sample to a desired thickness, and placing the sample on the slide.
  • the fixing solution include cross-linking agents such as formaldehyde and paraformaldehyde; PLP (periodate-lysine-paraformaldehyde); Zamboni solution; glutaraldehyde; coagulating precipitates such as ethanol and acetone.
  • the immobilization method may be any production method such as an unfixed frozen section, a fixed frozen section, and a fixed paraffin embedded section.
  • the immobilization conditions are not particularly limited, but for example, it is preferably performed at room temperature for 1 hour or more, more preferably 6 hours or more.
  • the section slide is pretreated.
  • the pretreatment include deparaffinization treatment, rehydration, re-immobilization, acid treatment, and proteinase K treatment for improving the permeability of the labeled probe.
  • a neutralization treatment of a positive charge may be performed.
  • the labeled probe is added to the pretreated slice slide, hybridization is performed, and a hybridization signal corresponding to the labeled substance of the labeled probe is detected.
  • the amount of the labeled probe to be added is not particularly limited, and can be appropriately set depending on, for example, the type of the labeling substance, the labeling ratio in the entire probe used, and the like.
  • a specific example is, for example, 1 to 1000 ng per general slide used in the in situ hybridization method, but is not limited thereto.
  • Hybridization conditions are not particularly limited.
  • the heat denaturation treatment before hybridization is preferably a treatment temperature of 50 to 100 ° C. and a treatment time of 1 to 60 minutes, more preferably a treatment temperature of 60 to 95 ° C. and a treatment time of 5 to 10 minutes.
  • the hybridization is preferably performed at a treatment temperature of 40 to 80 ° C. and a treatment time of 1 to 36 hours, more preferably at a treatment temperature of 45 to 70 ° C. and a treatment time of 4 to 24 hours.
  • the signal detection method is not particularly limited, and can be appropriately determined according to, for example, the type of the labeled substance of the labeled probe, the labeled primary antibody, or the labeled secondary antibody, as described above.
  • color development or fluorescence for example, the presence or absence or amount of the cancer marker miRNA in the sample can be detected from the presence or absence of color development or fluorescence, or the intensity of color development or intensity of fluorescence.
  • the color development or fluorescence may be determined visually, for example, or may be determined by image processing.
  • the presence or amount of the cancer marker miRNA in the sample can be detected from the presence or absence of an image in an autoradiography image or the density of the image using an autoradiography method.
  • the presence / absence of the image or the density of the image may be determined visually, for example, or may be determined by image processing.
  • the image processing is not particularly limited, and can be performed using a known system or software.
  • the sequence of the probe is not particularly limited.
  • the probe include probes that can specifically bind to any of the aforementioned cancer marker miRNAs.
  • a commercially available product may be used, or it may be prepared in-house.
  • the sequence of the probe can be appropriately designed based on, for example, the base sequence of the aforementioned cancer marker miRNA and common technical knowledge.
  • Specific examples include a probe composed of a sequence complementary to a cancer marker miRNA for detection or a probe containing the complementary sequence.
  • the probe sequence is preferably about 70% or more complementary, more preferably 90% or more, and particularly preferably 100% complementary to the target cancer marker miRNA. .
  • the structural unit of the probe is not particularly limited, and for example, a known structural unit can be adopted. Specific examples include nucleotides such as deoxyribonucleotides and ribonucleotides, and structural units such as PNA and LNA. Examples of the LNA include BNA (Bridged Nucleic Acid) such as 2 ′, 4′-Bridged Nucleic Acid.
  • the base in the structural unit is not particularly limited, and may be a natural base such as adenine, guanine, cytosine, thymine, uracil, or an unnatural base.
  • the length of the probe is not particularly limited. For example, the length is 10 to 100 bases, and preferably 15 to 40 bases.
  • the probe include a polynucleotide comprising a complementary sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 5.
  • hsa-miR-92a detection probe SEQ ID NO: 5'-acagggccgggacaagtgcaata-3 '
  • the evaluation method of the present invention evaluates the possibility of cancer of the sample based on the expression level of the cancer marker miRNA detected as described above in the evaluation step.
  • the expression level of the cancer marker examples include the presence / absence or expression level of the cancer marker miRNA in the sample.
  • the expression level may be, for example, the actual miRNA amount or a value correlated with the actual miRNA amount. Examples of the latter include a signal value obtained upon detection of the cancer marker miRNA.
  • the signal value can be appropriately determined according to, for example, the miRNA detection method or the type of signal value detection device.
  • the detection method uses a nucleic acid amplification method such as a PCR method such as a real-time RT-PCR method
  • the detection method can also be represented by a copy number per 1 ⁇ L (copies / ⁇ L) or the like. Further, as will be described later, when an miRNA-stained image obtained by staining miRNA is used, for example, color or fluorescence brightness or saturation corresponds to the signal value.
  • a section slide visualizing the cancer marker miRNA and HE (hematoxylin and eosin) staining are performed. It is preferable to prepare a section slide and collate them.
  • HE staining and visualization of cancer marker miRNA are performed on section slides of the same sample, and both are collated. Then, by comparing the tumor area determined from HE staining with the visualized positive area of the cancer marker miRNA, the cancer can be determined with higher reliability. Positive means, for example, that the cancer marker is present, and negative means, for example, that the cancer marker is not present or is below the detection limit.
  • the method for judging cancer by comparing a section slide visualizing the cancer marker miRNA and a section slide stained with HE is not particularly limited, but can be performed, for example, as follows. First, as described later, the HE staining and miRNA visualization are performed on adjacent section slides. On the other hand, for the HE-stained section slide, the tumor region is determined by, for example, microscopic observation. Then, the HE-stained section slide is compared with the section slide visualizing the cancer marker. As a result, for example, when the tumor region in the HE-stained section slide and the cancer marker positive region in the section slide visualizing the cancer marker overlap, the tumor region and the cancer marker positive region can be determined as cancer.
  • the section slide for detecting the cancer marker miRNA and the section slide for HE staining are fixed and embedded. It is preferable that the slices are adjacent slices cut out from the sample. Specifically, continuous slices are preferred. As a result, the two images can be collated more accurately.
  • the verification of the visualized cancer marker miRNA and the HE staining is preferably performed by, for example, image verification. That is, it is preferable to prepare a cancer marker visualization image and an HE-stained image for the immobilized sample and collate them.
  • the image can be converted into a digital image of the immobilized sample visualized by the cancer marker miRNA and the immobilized sample visualized by the HE staining using a CCD (Charge Coupled Device Image Sensor) or a scanner, for example.
  • CCD Charge Coupled Device Image Sensor
  • the method for judging cancer by comparing the visualized image of the cancer marker miRNA with the HE-stained image is not particularly limited, but can be performed as follows, for example. First, as described above, the HE staining and visualization of the cancer marker miRNA are performed on adjacent section slides, and an HE staining image and a cancer marker visualization image are prepared. Then, a tumor region is determined for the HE-stained image, and the HE-stained image and the cancer marker visualized image are collated. As a result, when the tumor region in the HE-stained image and the cancer marker miRNA positive region in the cancer marker visualized image overlap, the tumor region and the cancer marker positive region can be determined as cancer.
  • region is not confirmed in the said HE dyeing
  • the expression levels of the cancer marker miRNAs hsa-miR-92a and hsa-miR-494 increase with canceration, for example, in cells and tissues.
  • the cancer marker miRNA for example, significantly increases the expression level after the onset of cancer compared to before the onset of cancer, the expression level of the preclinical stage is significantly higher than before the preclinical stage. Increased, significantly increased expression level in clinical phase compared to pre-clinical phase, significantly increased early level expression level compared to early phase, expressed after initial phase compared to early phase It is understood that the level increases significantly.
  • the method may include determining the likelihood of cancer.
  • the term “normal person” means, for example, a person who is not determined to have developed the cancer to be evaluated, or a person who has not been determined to have the possibility of developing the cancer. To do.
  • “patient” means, for example, a person who is determined to have developed the cancer to be evaluated.
  • the subject Determines that the cancer is likely.
  • the expression level of the cancer marker miRNA in the sample of the subject is compared with the expression level of the cancer marker miRNA in the sample of the normal subject.
  • the examiner determines that the cancer is relatively advanced.
  • the expression level of the cancer marker miRNA in the sample of the subject is compared with the expression level of the cancer marker miRNA in the sample of each patient according to the advanced stage, and the subject has a similar expression level. Determined to be in the same progression as the patient shown.
  • the expression level of the normal cancer marker miRNA in the above (1) and (2) can be determined using, for example, a sample collected from the normal person.
  • the expression level of the cancer marker miRNA of each patient in (3) can be determined, for example, by classifying patients for each advanced stage and using samples collected from patients in each advanced stage.
  • the expression levels of normal subjects and patients in the above (1) to (3) may be determined in advance, for example, and need not be determined every time evaluation is performed.
  • the normal and patient samples in the above (1) to (3) are preferably, for example, the same type of sample as the subject sample.
  • the normal and patient samples are preferably samples prepared by the same method and conditions as the sample of the subject, for example.
  • the expression level of the cancer marker miRNA of the normal person or patient may be, for example, the expression level of one normal person or one patient, or the expression level of multiple normal persons or multiple patients Therefore, the expression level calculated by a statistical method may be used.
  • the expression level of the subject is higher than the expression level of the normal subject, it can be determined that the subject has a high possibility of cancer.
  • the expression level of the subject is equal to or lower than the expression level of the normal subject, it can be determined that the possibility of cancer is low for the subject.
  • the possibility of cancer can be said to be, for example, the possibility of becoming cancerous or the possibility of suffering from cancer.
  • the subject develops the cancer relatively. Can be judged. Even if the expression level of the subject is higher than the expression level of the normal subject, it can be determined that the smaller the difference is, the less advanced the cancer.
  • the expression level is determined for each patient in each advanced stage.
  • the significant difference is, for example, T-test (t test), F test, chi-square It can be judged by statistical methods such as tests.
  • the evaluation method for example, it can be determined that the possibility of cancer is high with high reliability even for a subject in the preclinical stage of cancer that has been difficult to determine.
  • the advanced stage of cancer can be determined with high reliability. Therefore, in the prevention and treatment of cancer, for example, important information for determining a policy such as medication or surgery can be obtained with high reliability.
  • the evaluation method of the present invention can evaluate cancer by, for example, calculating the content of staining positive cells.
  • the staining positive cell means, for example, a cell having the cancer marker and stained by staining the cancer marker.
  • the evaluation method of the present invention acquires a cancer marker stained image in which the cancer marker is stained for the immobilized sample.
  • a HE-stained image acquisition step of acquiring a HE-stained image An information acquisition step of acquiring information of a tumor region in the HE-stained image; A matching step of calculating a matching position between the HE stained image acquired in the HE image acquiring step and the cancer marker stained image acquired in the cancer marker detecting step; A specifying step of identifying a tumor region in the cancer marker-stained image based on information on the tumor region in the HE-stained image acquired in the information acquisition step and information on the matching position calculated in the matching step; and It is preferable to include a staining positive cell detection step of detecting staining positive cells in the tumor region based on information on the tumor region in the cancer marker staining image identified in the identification step.
  • the staining positive cell detection step may be, for example, a calculation step of calculating a staining positive cell content rate in the tumor region based on information on the tumor region in the cancer marker staining image identified in the identification step.
  • the cancer marker-stained image may be, for example, an image obtained by visualizing the cancer marker miRNA by color development or an image visualized by light emission.
  • the evaluation of cancer to be compared with the HE-stained image can be performed, for example, by a cancer pathological image diagnosis support method described later.
  • This method can be realized, for example, by executing a cancer pathological image diagnosis support system, a cancer pathological image diagnosis support program, or a cancer pathological image diagnosis support device, which will be described later. Details of these will be described later.
  • the evaluation reagent of the present invention is an evaluation reagent for use in the evaluation method of the present invention, and is a cancer marker detection reagent of the present invention, that is, hsa-miR-92 and hsa-miR-494.
  • a miRNA detection reagent for detecting at least one of the miRNAs is included. According to such an evaluation reagent, the evaluation method of the present invention can be easily carried out.
  • the present invention is characterized by detecting at least one of hsa-miR-92 and hsa-miR-494 as a cancer marker miRNA, and the method for detecting these miRNAs is not limited at all.
  • the miRNA detection reagent contained in the evaluation reagent of the present invention only needs to be able to detect any of these cancer marker miRNAs.
  • the type and composition of the reagent are not limited. Those skilled in the art can set detection reagents for these cancer marker miRNAs based on common general technical knowledge.
  • the miRNA detection reagent is not particularly limited, and examples thereof include probes that can hybridize to any of the cancer marker miRNAs as described above.
  • the probe may be a labeled probe as described above. Further, depending on the miRNA detection method and the type of labeling substance of the labeling probe, other reagents may be included.
  • the evaluation reagent of the present invention may further contain, for example, an enzyme, a buffer solution, a washing solution, a lysis solution, a dispersion solution, a dilution solution, etc. depending on the miRNA detection method.
  • the form of the evaluation reagent of the present invention is not particularly limited, and may be, for example, a liquid wet system or a dry dry system.
  • the evaluation kit of the present invention is an evaluation kit for use in the evaluation method of the present invention, and is a miRNA detection reagent for detecting at least one miRNA of hsa-miR-92 and hsa-miR-494. It is characterized by including.
  • Examples of the miRNA detection reagent include the evaluation reagent of the present invention, and are as described above. According to such an evaluation kit, the evaluation method of the present invention can be easily performed.
  • the form of the evaluation kit of the present invention is not particularly limited, and may be, for example, a liquid wet system or a dry system.
  • the various reagents are, for example, separate and may be used together at the time of use, or may be mixed before use.
  • the evaluation kit of the present invention includes, for example, instructions for use.
  • the present invention is a system, program, method and apparatus for supporting diagnosis based on a pathological image of cancer, and includes the following first and second embodiments.
  • a first aspect of the present invention is a cancer pathological image diagnosis support system (hereinafter referred to as an image diagnosis support system) that supports diagnosis based on a pathological image of cancer.
  • an image acquisition means for acquiring a HE stained image and a cancer marker stained image
  • Information acquisition means for acquiring information of a tumor region in the HE-stained image
  • a matching unit for calculating a matching position between the HE-stained image and the cancer marker-stained image acquired by the image acquiring unit
  • Identification means for identifying a tumor region in the cancer marker-stained image based on information on the tumor region in the HE-stained image acquired by the information acquisition unit and information on the matching position calculated by the matching unit;
  • staining positive cell detection means for detecting staining positive cells in the tumor region based on information on the tumor region in the cancer marker stained image identified by the identification unit.
  • the staining positive cell detection means may be, for example, a calculation means for calculating a staining positive cell content rate in the tumor region based on information on the tumor region in the cancer marker stained image specified by the specifying means. Good (hereinafter the same).
  • the calculating means calculates a staining intensity in addition to the staining positive cell content rate.
  • the staining intensity include staining intensity in a tumor region in the cancer marker stained image.
  • the image diagnosis support system of the present invention further includes: Input receiving means for receiving input of the specified information of the pathological image to be diagnosed and the specified information of the examination type; A stained image database storing the HE stained image and the cancer marker stained image; The image acquisition means preferably acquires the HE stained image and the cancer marker stained image from the stained image database based on the designation information.
  • the pathological image designation information is an image identifier of the HE-stained image
  • the image acquisition means acquires the HE stained image having the image identifier and the cancer marker stained image adjacent to the HE stained image from the stained image database.
  • the designation information of the pathological image is an image identifier of the cancer marker stained image
  • the image acquisition means acquires the cancer marker stained image having the image identifier and the HE stained image adjacent to the cancer marker stained image from the stained image database.
  • the specified information of the pathological image is a subject identifier of a subject to be diagnosed
  • the image acquisition means preferably acquires the HE stained image having the subject identifier and the cancer marker stained image from the stained image database.
  • the information acquisition means preferably acquires information on a tumor region in the HE-stained image from the stained image database.
  • the image diagnosis support system of the present invention further includes a tumor region calculation unit that calculates a tumor region in the HE-stained image acquired by the image acquisition unit, It is preferable that the information acquisition unit acquires information on a tumor region in the HE-stained image calculated by the tumor region calculation unit.
  • the image diagnosis support system of the present invention further includes: An input receiving means for receiving an input of a slide identifier of a slide to be diagnosed and designation information of an examination type; A slide database in which the slides are stored; A slide acquisition means for acquiring the slide having the slide identifier from the slide database; The image acquisition unit preferably acquires the HE-stained image and the cancer marker-stained image by photographing the slide acquired by the slide acquisition unit.
  • the present invention is an image diagnosis support system for supporting diagnosis based on a pathological image of cancer, A terminal and a server, The terminal and the server can be connected via a communication network outside the system,
  • the terminal Terminal-side transmission means for transmitting information in the terminal to the server via the communication network;
  • Terminal-side receiving means for receiving information transmitted from the server via the communication network,
  • the server Server-side transmission means for transmitting information in the server to the terminal via the communication network;
  • Server-side receiving means for receiving information transmitted from the terminal via the communication network;
  • As the pathological image to be diagnosed an image acquisition means for acquiring a HE stained image and the cancer marker stained image;
  • Information acquisition means for acquiring information of a tumor region in the HE-stained image;
  • a matching unit for calculating a matching position between the HE-stained image and the cancer marker-stained image acquired by the image acquiring unit;
  • Identification means for identifying a tumor region in the cancer marker-stained image based on information on the tumor region in the HE-
  • the staining positive cell detection means for example, based on the information on the tumor area in the cancer marker stained image specified by the specifying means, the staining positive cell content rate in the tumor area It may be a calculation means for calculating.
  • information on the staining positive cell content rate calculated by the calculation unit of the server is transmitted from the server side transmission unit to the terminal side reception unit.
  • the present invention is a server used in the image diagnosis support system of the present invention,
  • the server Server-side transmission means for transmitting information in the server to a terminal via the communication network;
  • Server-side receiving means for receiving information transmitted from the terminal via the communication network;
  • an image acquisition means for acquiring a HE stained image and a cancer marker stained image;
  • Information acquisition means for acquiring information of a tumor region in the HE-stained image;
  • a matching unit for calculating a matching position between the HE-stained image and the cancer marker-stained image acquired by the image acquiring unit;
  • Identification means for identifying a tumor region in the cancer marker-stained image based on information on the tumor region in the HE-stained image acquired by the information acquisition unit and information on the matching position calculated by the matching unit;
  • staining positive cell detection means for detecting staining positive cells in the tumor region based on the information on the tumor region in the cancer marker stained image identified by the identifying unit.
  • the staining positive cell detection unit calculates, for example, a staining positive cell content rate in the tumor region based on information on the tumor region in the cancer marker staining image identified by the identification unit. It may be a calculation means.
  • the present invention is a terminal used in the image diagnosis support system of the present invention, Terminal-side transmission means for transmitting information in the terminal to the server via the communication network; Terminal-side receiving means for receiving information transmitted from the server via the communication network, Information on the pathological image is transmitted from the terminal side transmission unit to the server side reception unit, and information on staining positive cells detected by the staining positive cell detection unit of the server is transmitted from the server side transmission unit. It is transmitted to the terminal side receiving means.
  • information on the staining positive cell content rate calculated by the calculation unit of the server may be transmitted from the server side transmission unit to the terminal side reception unit.
  • the present invention is a cancer pathological image diagnosis support method (hereinafter referred to as an image diagnosis support method) for supporting diagnosis based on a pathological image of cancer,
  • an image acquisition step of acquiring a HE stained image and a cancer marker stained image;
  • An information acquisition step of acquiring information of a tumor region in the HE-stained image;
  • a matching step of calculating a matching position between the HE-stained image and the cancer marker-stained image acquired in the image acquiring step;
  • a specifying step for specifying the tumor region in the cancer marker-stained image;
  • a staining positive cell detection step of detecting staining positive cells in the tumor region based on information on the tumor region in the cancer marker staining image identified in the identifying step.
  • the staining positive cell detection step includes, for example, a staining positive cell content rate in the tumor region based on information on the tumor region in the cancer marker staining image identified in the identification step. It may be a calculation step of calculating (hereinafter the same).
  • the calculation step calculates a staining intensity in addition to the staining positive cell content rate.
  • the staining intensity include staining intensity in a tumor region in the cancer marker stained image.
  • the image acquisition step acquires the HE-stained image and the cancer marker-stained image based on, for example, designation information of the pathological image to be diagnosed.
  • the HE-stained image and the cancer marker-stained image are preferably acquired from, for example, a stained image database in which the HE-stained image and the cancer marker-stained image are stored.
  • the pathological image designation information is preferably an image identifier of the HE-stained image.
  • the image acquisition step preferably acquires, for example, the HE stained image having the image identifier and the cancer marker stained image adjacent to the HE stained image from the stained image database.
  • the pathological image designation information is an image identifier of the cancer marker stained image.
  • the image acquisition step preferably acquires, for example, the cancer marker stained image having the image identifier and the HE stained image adjacent to the cancer marker stained image from the stained image database.
  • the pathological image designation information is a subject identifier of a person to be diagnosed.
  • the said image acquisition process acquires the said HE stained image and the said cancer marker stained image with the said subject identifier from the said stained image database, for example.
  • the diagnostic imaging support method of the present invention it is preferable that information on a tumor region in the HE stained image is also stored in the stained image database. And it is preferable that the said information acquisition process acquires the information of the tumor area
  • the image diagnosis support method of the present invention preferably further includes a tumor region calculation step of calculating a tumor region in the HE-stained image acquired in the image acquisition step.
  • the information acquisition step preferably acquires information on a tumor region in the HE-stained image calculated in the tumor region calculation step.
  • the present invention is also a cancer pathological image diagnosis support program (hereinafter referred to as an image diagnosis support program) that supports diagnosis based on a cancer pathological image, and the image diagnosis method of the present invention can be executed by a computer. It is characterized by that.
  • the image diagnosis support program of the present invention includes, for example, an image acquisition step of acquiring a HE stained image and a cancer marker stained image as the pathological image to be diagnosed, An information acquisition step of acquiring information of a tumor region in the HE-stained image; A matching step of calculating a matching position between the HE-stained image and the cancer marker-stained image acquired in the image acquiring step; Based on the information on the tumor region in the HE-stained image acquired in the information acquisition step and the information on the matching position calculated in the matching step, a specifying step for specifying the tumor region in the cancer marker-stained image; The computer is caused to execute a staining positive cell detection step of detecting staining positive cells in the tumor region based on information on the tumor region in the cancer marker staining image identified in the identifying step.
  • the staining positive cell detection step includes, for example, a staining positive cell content rate in the tumor region based on information on the tumor region in the cancer marker stained image specified in the specifying step. It may be a calculation step for calculating.
  • the staining positive cell content rate can be finally obtained as a quantitative value.
  • the first embodiment of the present invention will be specifically described by taking Embodiments 1A to 1D as examples.
  • the cancer marker stained image is also referred to as “miRNA stained image”. Note that the present invention is not limited to these embodiments.
  • FIG. 19 is a block diagram showing an example of the configuration of an image diagnosis support apparatus including the image diagnosis support system of the present invention.
  • the diagnostic imaging support apparatus 190 includes a processing unit 191 and a storage unit 192.
  • the image diagnosis support apparatus 190 is connected to the CCD 194, the scanner 195, and the display 196 connected to the microscope 193 in the processing unit 191.
  • the diagnostic imaging support apparatus 190 includes, for example, a CPU (Central Processing Unit), a RAM (Random Access Memory), an input unit, a drive, an input / output interface (I / F), a communication bus, and the like.
  • the CPU is responsible for overall control of the image diagnosis support apparatus.
  • each means in the image diagnosis support apparatus 190 can be constructed, and the image diagnosis support apparatus 190 can be realized.
  • the image diagnosis support apparatus 190 implements its operation by mounting circuit parts made of hardware parts such as LSI (Large Scale Integration) incorporating a computer program for realizing the functions of the respective means. You can also.
  • a computer program may be in the form of a recording medium storing the computer program. Examples of the recording medium include HDD, FD, CD-ROM (CD-R, CD-RW), MO, DVD, memory card, and the like.
  • the storage unit 192 is, for example, a ROM, HDD, HD, or the like.
  • the HDD controls reading and writing of data with respect to the HD under the control of the CPU, and the HD stores the written data under the control of the HDD, for example.
  • the display 196 displays various information such as images, data, and documents.
  • Examples of the input unit include a keyboard and a mouse.
  • the scanner 195 for example, scans the aforementioned section slide and optically converts the image into an electrical signal.
  • the CCD 194 converts, for example, a microscope image of the section slide into an electric signal.
  • the image diagnosis support apparatus 190 may be accessible to, for example, an external stained image database that stores information related to stained images.
  • the image diagnosis support apparatus 190 may be connected to the stained image database via a communication line, for example.
  • FIG. 20 is a block diagram showing an outline of the configuration of the image diagnosis support system in the present embodiment.
  • the present invention is not limited to this embodiment.
  • the image diagnosis support system of the present embodiment includes an image acquisition unit 2001 that acquires a HE-stained image and a miRNA-stained image, an information acquisition unit 2002 that acquires information on a tumor region in the HE-stained image, and an image acquisition Matching means 2003 for calculating the matching position between the HE-stained image acquired by the means and the miRNA-stained image, information on the tumor region in the HE-stained image acquired by the information acquiring means, and information on the matching position calculated by the matching means Based on the identification means 2004 for identifying the tumor region in the miRNA-stained image and the information on the tumor region in the miRNA-stained image identified by the identification means, the calculation for calculating the staining positive cell content in the tumor region Means 2005 are provided.
  • the image diagnosis support system may further include staining level determination means for determining the staining level of miRNA for the miRNA-stained image.
  • the staining level determination means determines, for example, the staining level in the specified tumor region of the miRNA stained image.
  • each component means should just be a functional block implement
  • the image diagnosis support system of the present embodiment is the same as, for example, Embodiments 1B to 1E described later.
  • FIG. 21 is a flowchart showing the flow of the process.
  • This process is an example of the image diagnosis method of the present invention, and can be executed by, for example, the image diagnosis support system, the image diagnosis support program, or the like of the present invention.
  • an HE-stained image and an miRNA-stained image are acquired (step S2101).
  • the image can be acquired as an electric signal converted by an image sensor such as a scanner or a CCD.
  • tumor region information is acquired for the HE-stained image (S2102).
  • the information on the tumor region in the HE-stained image may be information determined by a doctor or the like, or may be information calculated by a known method.
  • the HE-stained image and the miRNA-stained image are superposed and matched to calculate a matching position (S2103).
  • the tumor region in the miRNA-stained image is calculated from the tumor region information of the HE-stained image and the obtained matching position information. That is, in the miRNA-stained image, a region corresponding to the tumor region in the HE-stained image is calculated and specified as a tumor region (S2104).
  • the tumor region in the miRNA-stained image specified based on the information of the HE-stained image is also referred to as “tumor region based on the HE-stained image”.
  • the miRNA staining level in the tumor region based on the HE staining image of the miRNA staining image is determined (S2105).
  • the miRNA staining level for example, in each slide, since the degree of staining varies depending on the staining process, temperature, type of probe, type of color developing substance or fluorescent substance, etc., it is preferable to standardize the image. .
  • the miRNA staining level may be similarly determined for regions other than the tumor region based on the HE-stained image.
  • the information on the stained image obtained in this step is accumulated in the stained image database as described above (S2106).
  • a tumor region is detected again from the miRNA-stained image (S2107). That is, it is determined whether the staining level of the miRNA-stained image is a level that indicates tumor cells or a level that indicates less than the level that indicates tumor cells. Then, the region indicating the former staining level is specified as a tumor region based on the miRNA staining level. As a result, when the tumor region based on the HE-stained image and the tumor region based on the miRNA staining level overlap, the tumor region based on the miRNA staining level is set as a detection target region.
  • the tumor region based on the miRNA staining level is set as a detection target region.
  • the threshold between staining at a level meaning a tumor and staining below a level meaning a tumor can be determined, for example, by detecting the intensity of staining at a plurality of levels for the miRNA-stained image. Thereby, for example, even when a non-tumor cell is weakly stained, it can be determined that it does not correspond to staining of a tumor cell. Further, for example, the threshold data is also stored in the stained image database as stained image information.
  • the detection target area determined as described above is output as the determined cancer area.
  • the staining positive cell content is calculated for the detection target region, and the result is output.
  • the tumor region in the miRNA-stained image can be determined based on the database without matching with the HE-stained image.
  • FIG. 1 is a block diagram showing an example of an image diagnosis support system of the present invention.
  • This system is a system that supports diagnosis based on a pathological image of cancer.
  • the system is acquired by an image acquisition unit that acquires a HE-stained image and a miRNA-stained image as a pathological image to be diagnosed, an information acquisition unit that acquires information on a tumor region in the HE-stained image, and an image acquisition unit.
  • miRNA staining A specifying unit that specifies a tumor region in the image
  • a calculating unit that calculates a staining positive cell content in the tumor region based on information on the tumor region in the miRNA-stained image specified by the specifying unit.
  • the system of the present embodiment includes an input device 111, an output device 112, a stained image database 113, a processing device 120, and a storage device 130.
  • the stained image database 113 includes one or more HE-stained images, a miRNA-stained image that is a sample of a continuous section adjacent to the HE-stained image specimen (section slide), the HE-stained image, and the miRNA-stained image.
  • the adjacent information of the specimen with the image and the tumor region information calculated from the HE-stained image or determined by a doctor or the like are accumulated.
  • the relationship information with the subject is associated with the subject identifier.
  • a subject identifier 201 for uniquely identifying a subject for example, as shown in FIG. 2, an image identifier 202, staining information 203, image data 204, specimen adjacent information 205, And tumor region information 206 in the HE-stained image is included.
  • the image identifier 202 is an identifier for identifying a plurality of pathological images that exist for each subject.
  • Staining information 203, image data 204, and tumor region information 206 are distinguished from other images by an image identifier 202.
  • the staining information 203 stores the staining information of the image, and examples of the staining information include HE staining information and cancer marker miRNA staining information.
  • Image data is stored in the image data 204.
  • the specimen adjacency information 205 a correspondence relationship is stored by the image identifier 202.
  • tumor region information 206 of the HE-stained image tumor region information calculated from the HE-stained image or determined by a doctor or the like is stored.
  • the HE-stained image tumor region information 206 may be stored separately in association with the image identifier 202.
  • the input device 111 and the output device 112 for example, a normal input / output device provided in a computer can be used.
  • the input device 111 is, for example, a keyboard or a mouse.
  • the output device 112 is, for example, a display device or a printer.
  • the input device 111 and the output device 112 may be an input file and / or an output file, or may be another computer or the like.
  • the storage device 130 includes, for example, a main storage device and an auxiliary storage device provided in a computer, and is used to hold various programs and data executed by the processing device 120.
  • the processing device 120 includes, for example, a CPU of a computer and operates under program control.
  • the processing device 120 includes an input reception processing unit 121, a stained image and tumor region information acquisition unit 122, an image matching processing unit (matching unit) 123, a miRNA-stained image tumor region extraction unit (identification unit) 124, and a staining. And a positive cell content rate calculation unit (calculation means) 125.
  • the stained image and tumor region information acquisition unit 122 has, for example, the functions of the above-described image acquisition unit and information acquisition unit.
  • the input reception processing unit 121 receives pathological image designation information to be diagnosed and examination type designation information from the user or the like through the input device 111.
  • Examples of the test type include the type of cancer marker miRNA to be tested.
  • the input reception processing unit 121 stores the information in the diagnostic image information and the examination target storage unit 131 in the storage device 130, and moves the process to the stained image and tumor region information acquisition unit 122.
  • the pathological image designation information is the image identifier 202.
  • the image identifier 202 is a HE-stained image or a miRNA-stained image, and one or a plurality of images can be designated.
  • the examination type designation information is an miRNA staining item, and any one miRNA or two or more miRNAs can be designated among the cancer marker miRNAs of the present invention.
  • the stained image and tumor region information acquisition unit 122 acquires the HE stained image, the miRNA stained image, and the tumor region information in the HE stained image to be diagnosed from the stained image database 113, and each of the HE stained images in the storage device 130 is stained with HE.
  • the data is stored in the image data storage unit 132, the miRNA-stained image data storage unit 134, and the HE-stained image tumor region information storage unit 133, and the process is transferred to the image matching processing unit 123.
  • the image data 204 having the image identifier 202 is stored in the HE staining image data storage unit 132. . Further, referring to the diagnostic image information and the examination type and specimen adjacency information 205 stored in the examination object storage unit 131, the image data 204 of the miRNA-stained image of the continuous section specimen adjacent to the HE image specimen to be diagnosed is obtained. , And miRNA-stained image data storage unit 134. Further, information of the tumor region information 206 of the HE-stained image is stored in the tumor region information storage unit 133 of the HE-stained image.
  • the staining information 203 having diagnostic image information and the image identifier stored in the examination target storage unit 131 is miRNA staining
  • the image data 204 having the image identifier 202 is stored in the miRNA stained image data storage unit 134.
  • the HE-stained image data storage unit 132 stores the HE-stained image data 204 of the continuous section specimen adjacent to the miRNA-stained image specimen to be diagnosed.
  • information of the tumor region information 206 of the HE-stained image is stored in the tumor region information storage unit 133 of the HE-stained image.
  • the image matching processing unit 123 reads the HE-stained image and the miRNA-stained image from the HE-stained image data storage unit 132 and the miRNA-stained image data storage unit 134, respectively, and calculates a matching position between the HE-stained image and the miRNA-stained image. Further, the image matching processing unit 123 stores the matching position information in the matching position information storage unit 135 and moves the process to the tumor region extraction unit 124 of the miRNA-stained image. Examples of the matching position information include a rotation angle, a horizontal / vertical deviation width, and the like.
  • the HE-stained image and the miRNA-stained image are images similar to each other because they are images obtained by staining continuous sections.
  • the HE staining and the miRNA staining may be, for example, the same hue or different hues. However, since the HE staining image and the miRNA staining image are matched, the miRNA staining has a hue different from the HE staining. It is preferred to stain the cells with In HE staining, cell nuclei are usually stained blue with hematoxylin, and cytoplasm is stained pink with eosin.
  • the hue of staining by miRNA staining can be appropriately set depending on, for example, the coloring material or fluorescent material used. For image matching, each image can be binarized, and a phase-only correlation method, a residual sequential test method, a method using a singular point, or the like can be used.
  • the tumor region extraction unit 124 of the miRNA-stained image includes the tumor region information of the HE-stained image, the miRNA-stained image from the tumor region information storage unit 133 of the HE-stained image, the miRNA-stained image data storage unit 134, and the matching position information storage unit 135, respectively. Data and matching position information are read, and a tumor area in the miRNA-stained image data is calculated. Further, the tumor region extraction unit 124 of the miRNA-stained image stores the information of the tumor region in the miRNA-stained image data in the tumor region information storage unit 136 of the miRNA-stained image, and moves the processing to the staining positive cell content rate calculation unit 125. .
  • the staining positive cell content rate calculation unit 125 reads miRNA staining image data and tumor region information from the miRNA staining image data storage unit 134 and the tumor region information storage unit 136 of the miRNA staining image, respectively, and counts the number of staining positive cell nuclei in the tumor region. And the number of staining negative cell nuclei are counted, and the staining positive cell content is calculated and output from the output device 112.
  • FIG. 1 An example of the operation of the system shown in FIG. 1 will be described as an embodiment 1B of the image diagnosis support method and image diagnosis support program of the present invention with reference to the flowcharts of FIGS.
  • miRNA staining will be described on the assumption that staining of positive cell nuclei is blue and staining of negative cell nuclei is brown.
  • the present invention is not limited to this.
  • positive cell nuclei and negative cell nuclei can be counted by a general method for identifying stained cell nuclei.
  • nuclei may be stained by a general staining method, and cell nuclei with positive miRNA staining and negative cell nuclei may be counted.
  • This method is generally a method for supporting diagnosis based on a pathological image of cancer, and includes the following steps (a) to (e).
  • the program of this embodiment is a program that supports diagnosis based on a pathological image of cancer, and causes the computer to execute the steps (a) to (e).
  • A An image acquisition step of acquiring a HE-stained image and a miRNA-stained image as a pathological image to be diagnosed
  • An information acquisition step of acquiring information on a tumor region in the HE-stained image (c) acquired in the image acquisition step Based on the information on the tumor region in the HE-stained image acquired in the matching step (d) information acquisition step and the information on the matching position calculated in the matching step, which calculates the matching position between the HE-stained image and the miRNA-stained image, Identifying step of identifying tumor region in miRNA-stained image (e) Calculation step of calculating staining positive cell content in the tumor region based on information of tumor region in miRNA-stained image identified in the identifying step
  • the stained image database 113 includes a subject identifier 201, an image identifier 202, staining information 203, image data 204, and specimen adjacent data that are a series of data for the subject.
  • Information 205 and tumor region information 206 in the HE-stained image are stored.
  • the tumor region information 206 is information in which a tumor region has been calculated in advance from an HE-stained image, or tumor region information specified by a doctor.
  • an image identifier of an HE-stained image or miRNA-stained image that designates a diagnostic image and an miRNA test item request that designates a cancer marker miRNA to be examined are input to the input reception processing unit 121 of the processing device 120 from the input device 111. Supplied.
  • the input reception processing unit 121 passes the diagnostic image designation information and examination target designation information from the diagnostic image information and examination target storage unit 131 in the storage unit 130 to the stained image and tumor region information acquisition unit 122. Then, the process proceeds to the stained image and tumor region information acquisition unit 122 (step S301).
  • the stained image and tumor region information acquisition unit 122 searches the stained image database 113 using the diagnostic image information and the image identifier in the examination target storage unit 131. If the staining information 203 having the designated image identifier is HE staining, the stained image and tumor region information acquisition unit 122 stores the image data 204 having the image identifier in the HE stained image data storage unit 132. . Further, the tumor region information 206 of the HE-stained image is stored in the tumor region information storage unit 133 of the HE-stained image.
  • the diagnostic image information and the miRNA test item in the test target storage unit 131 are read out, the specimen adjacent information 205 in the stained image database 113 is referred to, and the miRNA stained image data 204 that is a continuous section specimen adjacent to the HE stained image is obtained. , And stored in the miRNA-stained image data storage unit 134.
  • the staining information 203 having the designated image identifier is miRNA staining
  • the image data 204 having the image identifier is stored in the miRNA stained image data storage unit 134.
  • the HE stained image data 204 which is a continuous section specimen adjacent to the miRNA stained image, is stored in the HE stained image data storage unit 132.
  • the tumor region information 206 of the HE-stained image is stored in the tumor region information storage unit 133 of the HE-stained image.
  • the image matching processing unit 123 calculates a matching position between the HE stained image stored in the HE stained image data storage unit 132 and the miRNA stained image stored in the miRNA stained image data storage unit 134.
  • the matching position is calculated using, for example, the phase-only correlation method after matching the color scales of the two images.
  • the obtained matching position information is stored in the matching position information storage unit 135.
  • the matching position information is, for example, a rotation angle and a horizontal / vertical deviation width.
  • a process transfers to the tumor area
  • the tumor region extraction unit 124 of the miRNA-stained image includes the tumor region information of the HE-stained image stored in the tumor region information storage unit 133 of the HE-stained image and the matching position information stored in the matching position information storage unit 135.
  • the tumor region in the miRNA-stained image stored in the miRNA-stained image data storage unit 134 is calculated.
  • the tumor region information of the obtained miRNA-stained image is stored in the tumor region information storage unit 136 of the miRNA-stained image.
  • a process transfers to the staining positive cell content rate calculation part 125 (step S304).
  • the staining positive cell rate calculation unit 125 receives the miRNA staining image data stored in the miRNA staining image data storage unit 134 and the tumor region information stored in the tumor region information storage unit 136 of the miRNA staining image. Then, the number of staining positive cell nuclei and the number of staining negative cell nuclei in the tumor region are counted, the staining positive cell content rate is calculated, and output from the output device 112 (step S305). For example, when staining positive cell nuclei are stained brown and staining negative cells are stained blue, the number of nuclei stained brown and the number of nuclei stained blue are counted. This step is performed, for example, according to the procedure shown in FIGS. 4, 5 and 6 as described below.
  • the outside of the tumor region of the miRNA-stained image data is masked from the received miRNA-stained image data and tumor region information (step S401). Then, a brown region that is a brown-stained region and a blue region that is a blue-stained region in the tumor region are identified by discriminant analysis (step S402).
  • step S501 image data is converted into an HSV color space (step S501), an unstained region is removed by S (saturation) and V (lightness) (step S502), and a value range of H (hue) is set. [0, 1] is converted to [0.3, 1.3] (step S503).
  • step S504 it is checked whether the H (hue) value of all the pixels is included in either [0.3, 0.8] or [0.8, 1.3] (step S504). If all pixels are included on one side, [0.3, 0.8] is output as a blue region and [0.8, 1.3] is output as a brown region (step S507).
  • the threshold value t is calculated by discriminant analysis (step S505), and [0.3, t] is output as a blue area and [t, 1.3] is output as a brown area (step S505). S506).
  • nucleus extraction is performed in the brown region (step S403), and then nucleus extraction is performed in the blue region (step S404).
  • steps S601 first, when a brown region or a blue region is input (step S601), an average and variance of V (lightness) values are taken into consideration, and a V ′ value in which the V value is emphasized by a sigmoid function is calculated. (Step S602).
  • Step S603 Next, a Gaussian filter is applied to the binary image, and the position of the nucleus is calculated by comparing adjacent pixels (step S604).
  • step S405 the number of nuclei detected in the brown region is counted (step S405), and the number of nuclei detected in the blue region is counted (step S406). Finally, the ratio of the number of brown nuclei to the total number of nuclei, that is, the number of brown nuclei / (the number of brown nuclei + the number of blue nuclei) is calculated (step S407).
  • the HE-stained image and the miRNA-stained image are acquired by the image acquisition unit, and the information on the tumor region in the HE-stained image is acquired by the information acquisition unit. Thereafter, a matching position between the HE stained image and the miRNA stained image is calculated by the matching means. Subsequently, based on the information on the tumor region in the HE-stained image and the information on the matching position, the tumor region in the miRNA-stained image is specified by the specifying unit. Based on the information on the tumor region in the miRNA-stained image, the staining means calculates the staining positive cell content in the tumor region in the miRNA-stained image. Thereby, a staining positive cell content rate can be obtained as a quantitative value. As a result, for example, the doctor can make a diagnosis by miRNA staining based on the quantitative value.
  • the work labor burden of a doctor or the like is reduced.
  • the tumor region determined by the HE-stained image can be associated with the miRNA-stained image by matching the HE-stained image and the miRNA-stained image, which are images of the continuous section specimen. Further, by applying discriminant analysis to the H (hue) value, for example, a brown region and a blue region can be distinguished. Furthermore, the ratio of the number of brown nuclei to the total number of nuclei can be calculated by extracting nuclei in each of the brown and blue regions. Therefore, by presenting the staining positive cell content rate to a doctor or the like, information useful for diagnosis by the doctor can be provided and the diagnosis can be supported.
  • FIG. 7 is a block diagram showing an example of an image diagnosis support system of the present invention.
  • the system of this embodiment is different from the system of Embodiment 1B shown in FIG. 1 in that the staining positive cell content rate calculation unit 125 calculates the staining intensity in addition to the staining positive cell content rate.
  • the other configurations and operations are the same as those in Embodiment 1B.
  • the staining positive cell content rate and staining intensity calculation unit 725 reads miRNA staining image data and tumor region information from the miRNA staining image data storage unit 134 and the tumor region information storage unit 136 of the miRNA staining image, respectively. Then, the staining positive cell content rate and staining intensity calculation unit 725 counts the number of staining positive cell nuclei and the number of staining negative cell nuclei in the tumor region, calculates the staining positive cell content rate, and further calculates the staining intensity. And output from the output device 112.
  • Embodiment 1C of the image diagnosis support method and image diagnosis support program of the present invention with reference to the flowcharts of FIGS.
  • the processing of this embodiment is different from the processing of Embodiment 1B shown in FIG. 3 in that not only the staining positive cell content rate calculation but also the staining intensity calculation is performed, but other operations are the same as those in the above embodiment. The same as 1B.
  • the staining positive cell content rate and staining intensity calculation unit 725 receives the miRNA staining image data stored in the miRNA staining image data storage unit 134 and the tumor region stored in the tumor region information storage unit 136 of the miRNA staining image. Then, the number of staining positive cell nuclei and the number of staining negative cell nuclei in the tumor region are counted to calculate the staining positive cell content, and the staining intensity (0: negative, 1: weakly positive, 2: moderately positive, 3: strong positive) are calculated and output from the output device 112 (step S805). This process is performed, for example, according to the procedure shown in FIGS. 9 and 10 as described below.
  • step S908 the nuclear staining intensity in the brown region is calculated.
  • step S1001 the brown area determined in step S402 in FIG. 9 is input (step S1001). Then, in consideration of the average and variance of the V (brightness) values, a V ′ value in which the V value is emphasized by a sigmoid function is calculated (step S1002). If the value is equal to or lower than the threshold value x, which is the V ′ value, the pixel is in the nucleus region and the number of pixels X is counted (step S1003).
  • step S1004 the ratio of the number of pixels satisfying the condition V value ⁇ a is obtained with respect to the number of pixels in the nucleus region.
  • step S1005 the staining intensity is output as “3: strong positive” (step S1005). If this is not the case, the ratio of the number of pixels satisfying the condition V value ⁇ b is obtained with respect to the number of pixels in the nucleus region.
  • step S1006 it outputs as dyeing
  • the ratio of the number of pixels satisfying the condition V value ⁇ c is obtained with respect to the number of pixels in the nucleus region. If the ratio is equal to or greater than a certain ratio (step S1008), the staining intensity is output as “1: weakly positive” (step S1009). If none of these applies, the staining intensity is output as “0: negative” (step S1010).
  • Embodiment 1B only the staining positive cell content rate is presented to the doctor, but in Embodiment 1C, not only the staining positive cell content rate but also the staining intensity can be presented to the doctor. For this reason, more useful information can be provided for diagnosis by a doctor, and diagnosis can be supported.
  • Other effects of the present embodiment are the same as those of Embodiment 1B.
  • FIG. 11 is a block diagram showing an example of an image diagnosis support system according to the present invention.
  • the system according to this embodiment is different from the system according to Embodiment 1B shown in FIG. 1 in that a tumor determination and tumor region calculation unit (tumor region calculation means) 1126 is provided.
  • the stained image database 113 includes, for example, one or more HE-stained images, a miRNA-stained image that is a sample of a continuous section adjacent to the HE-stained image sample, and a sample of the HE-stained image and the miRNA-stained image. Adjacent information is accumulated.
  • the tumor region information calculated from the miRNA-stained image or the tumor region information determined by a doctor or the like may or may not be present.
  • the stained image and tumor region information acquisition unit 122 acquires the HE stained image 204, the miRNA stained image 204, and the tumor region information 206 of the HE stained image from the stained image database 113, and the HE in the storage device 130, respectively.
  • the stained image data storage unit 132, the miRNA stained image data storage unit 134, and the HE stained image tumor region information storage unit 133 are stored.
  • the processing is transferred to the image matching processing unit 123.
  • the processing is transferred to the tumor determination and tumor region calculation unit 1126.
  • the tumor determination and tumor region calculation unit 1126 reads the HE staining image data from the HE staining image data storage unit 132, determines the tumor, calculates the tumor region, and moves the processing to the image matching processing unit 123.
  • a tumor determination method and a tumor region calculation method for example, the method described in Patent Document 1 can be used.
  • the staining intensity may be calculated together with the staining positive cell content rate as in Embodiment 1C.
  • FIG. 12 is a block diagram showing an example of an image diagnosis support system according to the present invention.
  • the system of this embodiment includes a slide imaging unit (slide acquisition unit) 1222 instead of the stained image and tumor region information acquisition unit 122 illustrated in FIG. 1 and the like, and includes a slide database 1213 instead of the stained image database 113.
  • diagnostic slide information and inspection object storage unit 1231 are provided.
  • the system further includes a slide imaging device 1214 and a tumor determination and tumor region calculation unit 1126. Unless otherwise indicated, in this embodiment, the other configurations and operations are the same as those in the embodiment 1B.
  • the slide database 1213 includes one or more HE-stained slides, a miRNA-stained slide that is a specimen of a continuous section adjacent to the HE-stained slide specimen, and a sample of the HE-stained slide and the miRNA-stained slide. Neighbor information is accumulated. Each slide is associated with information related to the subject by a subject identifier.
  • the slide photographing device 1214 photographs a designated slide and converts it into digital data.
  • the input reception processing unit 121 receives the designation information (slide identifier) of the slide to be diagnosed and the designation information of the examination type through the input device 111 from the user or the like. Then, these pieces of information are stored in the diagnostic slide information and inspection object storage unit 1231 of the storage device 130, and the process is transferred to the slide photographing unit 1222.
  • the slide photographing unit 1222 acquires, from the slide database 1213, the HE stained slide and the miRNA stained slide, which are adjacent specimens to be diagnosed. Furthermore, the slide photographing unit 1222 photographs the slide obtained by the slide photographing device 1214 and converts it into digital data, thereby obtaining a HE-stained image and a miRNA image. These images are stored in the HE-stained image data storage unit 132 and the miRNA-stained image data storage unit 134 of the storage device 130, respectively, and the process proceeds to the tumor determination and tumor region calculation unit 1126. As described above, in the present embodiment, the slide photographing unit 1222 has both functions of a slide acquisition unit and an image acquisition unit.
  • the staining intensity may be calculated together with the staining positive cell content rate as in Embodiment 1C.
  • the present invention is not limited to the above embodiment, and various modifications are possible.
  • the input reception processing unit 121 may receive not the image identifier but the subject identifier of the person to be diagnosed.
  • the stained image and tumor region information acquisition unit 122 may search the stained image database 113 for an image having a subject identifier and tumor region information.
  • a cancer pathological image diagnosis support apparatus (hereinafter referred to as an image diagnosis support apparatus) of the present invention comprises: A learning pattern input means for cutting out an image centered on a tumor from a pathological image used for learning and inputting it as a learning pattern; Learning pattern storage means for storing and holding the learning pattern to which class information is attached; Feature candidate generation means for generating a plurality of feature candidates; Feature determining means for determining a set of features suitable for diagnosis from among the feature candidates generated by the feature candidate generating means; Feature storage means for storing and holding a set of features determined by the feature determination means; A classification table creation means for creating a classification table; A pattern input means for cutting out an image centered on a tumor candidate from a pathological image to be diagnosed and inputting it as an input pattern; Feature extraction means for extracting features from the input pattern; Diagnostic means based on the characteristics, The feature determination means calculates a feature of each learning pattern corresponding to each feature candidate, and sets a feature candidate having the maximum mutual information amount with the class information of
  • the feature candidate having the maximum mutual information amount between the feature of each learning pattern corresponding to each feature candidate and the class information of each learning pattern is As the next feature of the set of
  • the classification table creation means calculates each feature of each learning pattern using the feature set, creates the classification table in which each feature of each learning pattern and class information are arranged, and Classify the learning patterns by a classification table;
  • the feature extraction means calculates each feature of the input pattern using the feature set,
  • the diagnosis unit diagnoses the input pattern based on the calculation result and the classification table.
  • the diagnostic imaging support apparatus of the present invention A learning pattern input means for cutting out an image centered on a tumor from a pathological image used for learning and inputting it as a learning pattern; Learning pattern storage means for storing and holding the learning pattern to which class information is attached; Feature candidate generation means for generating a plurality of feature candidates; Feature determining means for determining a set of features suitable for diagnosis from among the feature candidates generated by the feature candidate generating means; Feature storage means for storing and holding a set of features determined by the feature determination means; A classification table creation means for creating a classification table; A pattern input means for cutting out an image centered on a tumor candidate from a pathological image to be diagnosed and inputting it as an input pattern; Feature extraction means for extracting features from the input pattern; Diagnostic means based on the characteristics, The feature determination means prepares a set of a predetermined number of the learning patterns to be transitioned according to the value of the feature, calculates the feature of each learning pattern corresponding to each feature candidate, and The feature candidate that maximizes the mutual information
  • the classification table creation means calculates each feature of each learning pattern using the feature set, creates the classification table in which each feature of each learning pattern and class information are arranged, and Classify the learning patterns by a classification table;
  • the feature extraction means calculates each feature of the input pattern using the feature set,
  • the diagnosis means performs the transition of the input pattern based on each feature of the input pattern and a transition table in which a set to which the learning pattern belongs is sequentially recorded when each feature of the feature set is determined. And, as a result of the transition, the input pattern is diagnosed based on a set to which the input pattern belongs.
  • the diagnostic imaging support apparatus of the present invention A learning pattern input means for cutting out an image centered on a tumor from a pathological image used for learning and inputting it as a learning pattern; Learning pattern storage means for storing and holding the learning pattern to which class information is attached; Feature candidate generation means for generating a plurality of feature candidates; Feature determining means for determining a set of features suitable for diagnosis from among the feature candidates generated by the feature candidate generating means; Feature storage means for storing and holding a set of features determined by the feature determination means; A classification table creation means for creating a classification table; A pattern input means for cutting out an image centered on a tumor candidate from a pathological image to be diagnosed and inputting it as an input pattern; Feature extraction means for extracting features from the input pattern; Diagnostic means based on the characteristics, The feature determination means prepares a set of a predetermined number of the learning patterns to be transitioned according to the value of the feature, calculates the feature of each learning pattern corresponding to each feature candidate, and The feature candidate that maximizes the mutual information
  • the classification table creating means calculates each feature of each learning pattern using the feature set, and uses the classification table formed by arranging each feature of each learning pattern and class information.
  • the feature extraction means uses the feature set to calculate each feature of the input pattern that indicates the probability that the ranking feature will be a predetermined value;
  • the diagnostic means predetermines the input pattern based on each feature of the input pattern and a transition table that sequentially records a set to which the learning pattern belongs when determining each feature of the feature set. The probability of having class information is calculated and diagnosed.
  • the learning pattern input unit and the pattern input unit are pixels belonging to a color region to which a preset tumor cell nucleus belongs, based on RGB values of each pixel in the stained pathological image. And calculating the distance between the center of the distribution of the color area and each pixel belonging to the color area, giving a signal to each pixel according to the distance, and from the distribution of the signal in the pathological image It is preferable to detect a peak and input an image centered on the peak as the learning pattern.
  • the feature candidates generated by the feature candidate generation unit include a feature candidate obtained from a feature extraction function.
  • the feature candidates generated by the feature candidate generation unit include a feature candidate obtained from a feature extraction function obtained by standardizing a complex Gabor function.
  • the feature candidates generated by the feature candidate generation unit include a feature candidate for identifying a tumor color.
  • the feature determination unit compares a signal of each pixel included in the learning pattern calculated by the learning pattern input unit with a preset threshold value.
  • the feature determination unit includes an average value of a signal of each pixel included in the learning pattern calculated by the learning pattern input unit and a signal of a pixel located in the vicinity of each pixel. Is preferably compared.
  • the feature determination unit performs an operation using a noise parameter determined in advance for each of the feature candidates to each of the learning patterns.
  • the feature determination means may calculate a probability that the feature of each learning pattern takes a predetermined value as the feature of each learning pattern corresponding to each feature candidate. preferable.
  • the classification table creating means replaces the value of the feature with a corresponding position in the classification table, It is preferable to put redundant terms.
  • each feature of the input pattern is a value of a probability that the feature of the ranking is a predetermined value
  • the diagnosis unit uses the feature to generate the classification table. It is preferable to make a determination by calculating the probability that each feature pattern included in is a predetermined class information value.
  • the image diagnosis support program of the present invention is characterized in that the image diagnosis method of the present invention can be executed by a computer.
  • the image diagnosis support program of the present invention includes, for example, a learning pattern input unit that cuts out an image centered on a tumor from a pathological image used for learning and inputs it as a learning pattern; Learning pattern storage means for storing and holding the learning pattern to which class information is attached; Feature candidate generation means for generating a plurality of feature candidates; Feature determining means for determining a set of features suitable for diagnosis from among the feature candidates generated by the feature candidate generating means; Feature storage means for storing and holding a set of features determined by the feature determination means; A classification table creation means for creating a classification table; A pattern input means for cutting out an image centered on a tumor candidate from a pathological image to be diagnosed and inputting it as an input pattern; Feature extraction means for extracting features from the input pattern; An image diagnosis support program of an image diagnosis support apparatus having a diagnosis means for diagnosing based on the characteristics, The feature
  • the classification table creating means uses the feature set to calculate each feature of each learning pattern, and uses the classification table formed by arranging each feature of each learning pattern and class information.
  • Execute the process of classification Causing the feature extraction means to execute a process of calculating each feature of the input pattern using the feature set;
  • the diagnosis unit is configured to execute a process of diagnosing the input pattern based on the calculation result and the classification table.
  • the program of the present invention is a program for causing various means of the diagnostic imaging support apparatus to execute the processing steps as described above.
  • the image diagnosis support program of the present invention includes: A learning pattern input means for cutting out an image centered on a tumor from a pathological image used for learning and inputting it as a learning pattern; Learning pattern storage means for storing and holding the learning pattern to which class information is attached; Feature candidate generation means for generating a plurality of feature candidates; Feature determining means for determining a set of features suitable for diagnosis from among the feature candidates generated by the feature candidate generating means; Feature storage means for storing and holding a set of features determined by the feature determination means; A classification table creation means for creating a classification table; A pattern input means for cutting out an image centered on a tumor candidate from a pathological image to be diagnosed and inputting it as an input pattern; Feature extraction means for extracting features from the input pattern; An image diagnosis support program of an image diagnosis support apparatus having a diagnosis means for diagnosing based on the characteristics, The feature determining means prepares a set of a predetermined number of learning patterns to be transitioned according to feature values, calculates the features of each learning pattern
  • the classification table creating means calculates each feature of each learning pattern, and creates the classification table in which each feature of each learning pattern and class information are arranged.
  • Causing the learning pattern to be classified by the classification table Causing the feature extraction means to execute a process of calculating each feature of the input pattern using the feature set; Based on each feature of the input pattern and a transition table that sequentially records a set to which the learning pattern belongs when determining each feature of the feature set, the diagnostic means And performing a process of diagnosing the input pattern based on a set to which the input pattern belongs as a result of the transition.
  • the program of the present invention is a program for causing various means of the diagnostic imaging support apparatus to execute the processing steps as described above.
  • the image diagnosis support program of the present invention includes: A learning pattern input means for cutting out an image centered on a tumor from a pathological image used for learning and inputting it as a learning pattern; Learning pattern storage means for storing and holding the learning pattern to which class information is attached; Feature candidate generation means for generating a plurality of feature candidates; Feature determining means for determining a set of features suitable for diagnosis from among the feature candidates generated by the feature candidate generating means; Feature storage means for storing and holding a set of features determined by the feature determination means; A classification table creation means for creating a classification table; A pattern input means for cutting out an image centered on a tumor candidate from a pathological image to be diagnosed and inputting it as an input pattern; Feature extraction means for extracting features from the input pattern; An image diagnosis support program of an image diagnosis support apparatus having a diagnosis means for diagnosing based on the characteristics, The feature determination means prepares a predetermined number of sets to which the learning pattern should be changed according to the value of the feature, calculates the feature of each learning pattern
  • the program of the present invention is a program for causing the various means of the diagnostic imaging support apparatus to execute the processing steps as described above (the same applies hereinafter).
  • the image diagnosis support program of the present invention is, for example, In the learning pattern input means and the pattern input means, A process of selecting pixels belonging to a color region to which a preset tumor cell nucleus belongs, from the RGB values of each pixel in the stained pathological image; Processing for calculating the distance between the center of the distribution of the color area and each pixel belonging to the color area; A process of giving a signal to each pixel according to the distance; Processing for detecting a peak from the distribution of the signal in the pathological image; It is preferable to execute a process of inputting an image centered on the peak as the learning pattern.
  • the feature candidates generated by the feature candidate generation unit include a feature candidate obtained from a feature extraction function.
  • the feature candidates generated by the feature candidate generation means include a feature candidate obtained from a feature extraction function obtained by standardizing a complex Gabor function.
  • the feature candidates generated by the feature candidate generation unit include a feature candidate for identifying a tumor color.
  • the feature determination unit compares the signal of each pixel included in the learning pattern calculated by the learning pattern input unit with a preset threshold value. It is preferable to execute.
  • the feature determination unit includes a signal of each pixel included in the learning pattern calculated by the learning pattern input unit and a signal of a pixel located in the vicinity of each pixel. It is preferable to execute a process of comparing the average value.
  • the image diagnosis support program of the present invention causes the feature determination means to execute a process of applying an operation with a noise parameter predetermined for each feature candidate to each learning pattern.
  • the image diagnosis support program calculates, for example, the probability that the feature of each learning pattern takes a predetermined value as the feature of each learning pattern corresponding to each feature candidate in the feature determination unit. It is preferable to execute the processing.
  • the image diagnosis support program of the present invention replaces the feature value at the corresponding position in the classification table with the classification table creation unit. It is preferable to execute processing for placing redundant terms.
  • each feature of the input pattern is a value of a probability that the feature of the ranking becomes a predetermined value
  • the diagnosis table is used for the classification table by using the feature. It is preferable to execute a process of making a determination by calculating a probability that each feature pattern included in is a value of predetermined class information.
  • the image diagnosis support method of the present invention comprises: A learning pattern input means for cutting out an image centered on a tumor from a pathological image used for learning and inputting it as a learning pattern; Learning pattern storage means for storing and holding the learning pattern to which class information is attached; Feature candidate generation means for generating a plurality of feature candidates; Feature determining means for determining a set of features suitable for diagnosis from among the feature candidates generated by the feature candidate generating means; Feature storage means for storing and holding a set of features determined by the feature determination means; A classification table creation means for creating a classification table; A pattern input means for cutting out an image centered on a tumor candidate from a pathological image to be diagnosed and inputting it as an input pattern; Feature extraction means for extracting features from the input pattern; An image diagnosis support method using an image diagnosis support device having a diagnosis means for diagnosing based on the characteristics, The feature determination means calculates the feature of each learning pattern corresponding to each feature candidate, and sets the feature candidate that maximizes the mutual information amount with the class information of the learning
  • the feature candidate that maximizes the mutual information amount between the feature of each learning pattern corresponding to each feature candidate and the class information of each learning pattern.
  • the classification table creating means calculates each feature of each learning pattern using the feature set, and the pattern is generated by the classification table formed by arranging each feature of each learning pattern and class information.
  • Perform the steps of classifying The feature extraction means performs a step of calculating each feature of the input pattern using the set of features,
  • the diagnosis means performs a step of diagnosing the input pattern based on the calculation result and the classification table.
  • the use of the diagnostic imaging support apparatus is not essential, and a method for performing the various steps as described above may be used.
  • the image diagnosis support method of the present invention comprises: A learning pattern input means for cutting out an image centered on a tumor from a pathological image used for learning and inputting it as a learning pattern; Learning pattern storage means for storing and holding the learning pattern to which class information is attached; Feature candidate generation means for generating a plurality of feature candidates; Feature determining means for determining a set of features suitable for diagnosis from among the feature candidates generated by the feature candidate generating means; Feature storage means for storing and holding a set of features determined by the feature determination means; A classification table creation means for creating a classification table; A pattern input means for cutting out an image centered on a tumor candidate from a pathological image to be diagnosed and inputting it as an input pattern; Feature extraction means for extracting features from the input pattern; An image diagnosis support method using an image diagnosis support device having a diagnosis means for diagnosing based on the characteristics, The feature determining means prepares a set of a predetermined number of the learning patterns to be transitioned according to a feature value, calculates the features of each
  • the classification table creation means calculates each feature of each learning pattern using the feature set, creates the classification table formed by arranging each feature of each learning pattern and class information, Performing the step of classifying the learning pattern by the classification table;
  • the feature extraction means performs a step of calculating each feature of the input pattern using the set of features,
  • the diagnosis means performs the transition of the input pattern based on each feature of the input pattern and a transition table in which a set to which the learning pattern belongs is sequentially recorded when each feature of the feature set is determined.
  • the method of the present invention does not necessarily require the use of the image diagnosis support apparatus, and may be a method for performing the various steps as described above.
  • the image diagnosis support method of the present invention comprises: A learning pattern input means for cutting out an image centered on a tumor from a pathological image used for learning and inputting it as a learning pattern; Learning pattern storage means for storing and holding the learning pattern to which class information is attached; Feature candidate generation means for generating a plurality of feature candidates; Feature determining means for determining a set of features suitable for diagnosis from among the feature candidates generated by the feature candidate generating means; Feature storage means for storing and holding a set of features determined by the feature determination means; A classification table creation means for creating a classification table; A pattern input means for cutting out an image centered on a tumor candidate from a pathological image to be diagnosed and inputting it as an input pattern; Feature extraction means for extracting features from the input pattern; An image diagnosis support method using an image diagnosis support device having a diagnosis means for diagnosing based on the characteristics, The feature determination means prepares a set of a predetermined number of the learning patterns to be transitioned according to the value of the feature, calculates the feature of each
  • the classification table creation means calculates each feature of each learning pattern using the feature set, creates the classification table formed by arranging each feature of each learning pattern and class information, Performing the step of classifying the learning pattern by the classification table;
  • the feature extraction means performs a step of calculating each feature of the input pattern, using the feature set, indicating a probability that the feature of the rank is a predetermined value;
  • the diagnostic means predetermines the input pattern based on each feature of the input pattern and a transition table that sequentially records a set to which the learning pattern belongs when determining each feature of the feature set. Calculating a probability of having the determined class information, and performing a diagnosis step.
  • the learning pattern input unit and the pattern input unit include: From the RGB value of each pixel in the stained pathological image, the step of selecting a pixel belonging to a color region to which a preset tumor cell nucleus belongs, Calculating the distance between the center of the color area distribution and each pixel belonging to the color area; Applying a signal to each pixel according to the distance; Performing a step of detecting a peak from the distribution of the signal in the pathological image; It is preferable to perform a step of inputting an image centered on the peak as the learning pattern.
  • the feature candidates generated by the feature candidate generation unit include a feature candidate obtained from a feature extraction function.
  • the feature candidates generated by the feature candidate generation means include a feature candidate obtained from a feature extraction function obtained by standardizing a complex Gabor function.
  • the feature candidates generated by the feature candidate generation unit include a feature candidate for identifying a tumor color.
  • the feature determination unit performs a step of comparing a signal of each pixel included in the learning pattern calculated by the learning pattern input unit with a preset threshold value. It is preferable.
  • the feature determination means includes an average value of a signal of each pixel included in the learning pattern calculated by the learning pattern input means and a signal of a pixel located in the vicinity of each pixel. Is preferably performed.
  • the feature determination means performs a step of applying an operation with a noise parameter predetermined for each feature candidate to each of the learning patterns.
  • the feature determination means calculates a probability that a feature of each learning pattern takes a predetermined value as a feature of each learning pattern corresponding to each feature candidate. It is preferable to implement.
  • the classification table creation means replaces the feature value with a redundant value at a corresponding position in the classification table.
  • the step of placing a term is performed.
  • each feature of the input pattern is a value of a probability that the feature of the ranking becomes a predetermined value
  • the diagnosis unit uses the feature to generate the classification table. It is preferable to perform a step of calculating and determining a probability that each feature pattern included in is a predetermined class information value.
  • the diagnostic imaging support system of the present invention includes: An information processing terminal that holds pathological image data in which patient-specific information is added to a pathological image; and an image diagnosis server that diagnoses the pathological image data;
  • the diagnostic imaging server The diagnostic imaging support apparatus of the present invention for diagnosing the pathological image included in the pathological image data; Diagnostic result storage means for storing a diagnostic result by the diagnostic imaging support apparatus together with information specific to the patient;
  • the information processing terminal requests transmission of the diagnosis result with information specific to the patient,
  • the diagnostic imaging server compares the patient-specific information received from the information processing terminal with the patient-specific information stored together with the diagnosis result, and the patient-specific information received from the information processing terminal When the patient-specific information stored together with the diagnosis result matches, the diagnosis result is transmitted to the information processing terminal.
  • the diagnostic imaging support system further includes a billing server that holds usage fee data of the diagnostic imaging support apparatus and the information processing terminal.
  • the billing server adds a usage fee for the diagnostic imaging support apparatus when the diagnostic result is stored in the diagnostic result storage means.
  • the billing server adds a usage fee for the information processing terminal when the information processing terminal receives the diagnosis result.
  • the server of the present invention is a server used in the image diagnosis support system of the present invention,
  • the server Server-side transmission means for transmitting information in the server to a terminal via a communication network;
  • Server-side receiving means for receiving information transmitted from the terminal via the communication network;
  • the diagnostic imaging support apparatus of the present invention for diagnosing a subject using the pathological image data;
  • Diagnostic result storage means for storing a diagnostic result by the diagnostic imaging support apparatus together with information specific to the patient;
  • the patient-specific information received from the information processing terminal is compared with the patient-specific information stored together with the diagnosis result, and stored together with the patient-specific information received from the information processing terminal and the diagnosis result When the patient-specific information matches, the diagnosis result is transmitted to the information processing terminal.
  • the terminal of the present invention is a terminal used in the image diagnosis support system of the present invention, and the terminal An information processing terminal for holding pathological image data in which patient-specific information is added to a pathological image, and terminal-side transmission means for transmitting information in the terminal to the server via the communication network; Terminal-side receiving means for receiving information transmitted from the server via the communication network, Requesting transmission of the diagnostic result accompanied by the patient-specific information and receiving the diagnostic result transmitted from the server.
  • image diagnosis support apparatus image diagnosis support method, image diagnosis support program, and image diagnosis support system of the present invention, for example, to identify whether the nature of a tumor is benign or malignant, a cell nucleus, its surrounding tissue, etc.
  • Sub-images centered on cell nuclei, stroma, etc. by extracting sub-image image data and storing the sub-images as learning patterns and input patterns, Based on the image, the presence or absence of the tumor and the benign / malignant tumor can be determined with high accuracy and in a short time.
  • the pathological image is the aforementioned cancer marker-stained image.
  • the sub-image is considered in consideration of changes in cell nuclei and surrounding tissues.
  • the presence or absence of a tumor and the benign / malignant tumor can be determined based on the sub-image with high accuracy and in a short time.
  • the present invention will be described by taking Embodiments 2A and 2B as examples.
  • the cancer marker stained image is referred to as “miRNA stained image”. Note that the present invention is not limited to these embodiments.
  • FIG. 13 is a block diagram illustrating a configuration of the diagnostic imaging support apparatus according to the present embodiment.
  • the diagnostic imaging support apparatus according to the present embodiment includes a learning pattern input unit 1300, a learning pattern storage unit 1301, a feature candidate generation unit 1302, a feature determination unit 1303, a feature storage unit 1304, and a classification table creation unit. 1305 and a classification table 1306.
  • Learning pattern input means 1300 extracts sub-images such as cell nuclei and cytoplasm from the miRNA-stained image, and stores the sub-images in learning pattern storage means 1301.
  • Learning pattern storage means 1301 is means for storing and holding a desired number of sub-images used for learning.
  • Feature candidate generation means 1302 is means for sequentially generating feature candidates from a predetermined number of feature parameter sets.
  • the feature determination unit 1303 is a unit that determines a feature set that is optimal for pattern identification from among the feature candidates generated by the feature candidate generation unit 1302.
  • the feature storage unit 1304 is a unit that stores and holds the feature set determined by the feature determination unit 1303.
  • the classification table creation unit 1305 is a unit that creates a classification table 1306 for performing diagnosis using the feature set determined by the feature determination unit 1303.
  • FIG. 14 is a flowchart for explaining the procedure of the feature determination process of the image diagnosis support apparatus according to this embodiment.
  • the feature candidate generation unit 1302 sequentially generates feature candidates based on a large number of preset feature parameter sets (for example, N) (S1401).
  • N preset feature parameter sets
  • parameter sets 1 to N_1 are feature candidates related to texture
  • parameter sets N_1 + 1 to N_1 + N_2 are feature candidates related to colors
  • N_1 + N_2 + 1 to Let N parameter sets be feature candidates related to colors averaged by surrounding pixels.
  • feature candidates related to texture, feature candidates related to color, and feature candidates related to color averaged in surrounding pixels are adopted as feature candidates.
  • Elements necessary for determining the features of the pixels included in the pathological image can be generated as feature candidates.
  • This feature is determined, for example, by one of procedures 1 to 3 shown below.
  • the s-th feature parameter set (k_s, r 0 _s, ⁇ _s, th_s) is substituted into (k, r 0 , ⁇ , th), and is defined by the parameters k, r 0 , ⁇ .
  • a complex Gabor function Gab and a Gaussian function G exemplified in the following formula (1) are generated.
  • the feature c is calculated using a grayscale image obtained by performing grayscale conversion on a color sub-image stored in the learning pattern storage unit 1301 as a learning pattern.
  • the feature candidate generating unit 1302 sends the complex Gabor function Gab and the Gaussian function G of the formula (1) to the feature determining unit 1303 together with the threshold parameter th and the feature candidate identification number s (step S1402).
  • the data is sent to the determination unit 1303 (step S1403).
  • the present invention is not limited to this.
  • the method of the present invention can be applied to a case of three or more classes.
  • the feature determination unit 1303 calculates the feature c according to the following equation (2) using the feature candidates for the sub-images sequentially received from the learning image storage unit 1301 (step S1404).
  • the feature candidates are, for example, a complex Gabor function, a Gaussian function, and other parameters shown in the equation (1).
  • the t-th learning pattern is I_t (r, i_rgb), and the calculation is repeated for all learning patterns (M).
  • the denominator is a normalization (standardization) factor for suppressing the fluctuation of the value of a due to the size of the pattern (image brightness).
  • the denominator equation can be replaced by another form of normalization factor. Further, depending on the pattern to be handled, such a normalization factor may be omitted.
  • the s-th feature parameter set (x_s, y_s, color_index) and the feature candidate identification number s are sent to the feature determination unit 1303 (step S1402).
  • (x_s, y_s) represents the position of the pixel that determines the feature c in the sub-image
  • miRNA staining of cells with the cancer marker miRNA is an important element in characterizing a pathological image, it is preferable to stain the cell nucleus, cytoplasm, stroma, pores, and the like with different colors.
  • color_index 1, 2, 3, 4 is assigned to the cell nucleus color, cytoplasm color, stroma color, and pore color, respectively.
  • r is a pixel coordinate
  • t 1 to M.
  • the feature determination unit 1303 determines the color of the pixel located at the position (x_s, y_s) in the learning pattern for the learning pattern received from the learning pattern storage unit 1301 (step S1403) by the following method. If it matches the color specified by the parameter color_index, the value of the feature c is set to 1, and otherwise, the value of the feature c is set to 0 (step S1404).
  • the t-th learning pattern is set to I_t (r, i_rgb), and the determination of the feature c is repeated for all learning patterns (M).
  • a predetermined threshold value for example 0.25.
  • the value of the hematoxylene signal is added only for a pixel in which the value of the hematoxylene signal is in the vicinity of the pixel of interest, for example, 0.25 or more, and the average value is calculated.
  • a predetermined threshold value for example, 0.25
  • the configuration may be determined.
  • Colors of holes, cytoplasm, stroma, etc. other than cell nuclei are classified according to a predetermined color area.
  • (x_s, y_s) represents the position of the pixel that determines the feature c in the sub-image
  • th represents the threshold parameter
  • the feature determination unit 1303 determines the feature c by the following method for the learning pattern received from the learning pattern storage unit 1301 (step S1403) (step S1404).
  • the t-th learning pattern is set to I_t (r, i_rgb), and the determination of the feature c is repeated for all learning patterns (M).
  • the feature determining unit 1303 designates the color of the pixel (x ′, y ′) within 2 pixels from the pixel in the vicinity of the sub-image position (x_s, y_s) to the x coordinate and the y coordinate by color_index. Check if it matches the color.
  • the pixel (x ′, y ′) is, for example, a pixel within two pixels from the pixel of interest (x_s, y_s) to the x coordinate and y coordinate, and
  • the number of neighboring pixels having a color that matches the color specified by color_index is added and divided by the total number of neighboring pixels to obtain an average value. If the average value exceeds the threshold parameter (th_s), the feature c is set to 1. In other cases, the feature c is set to 0.
  • the feature determination unit 1303 can determine the feature c of the pixel of interest by, for example, the following method in addition to the above-described three procedures.
  • the RGB value of each pixel of the sub-image including the pixel of interest is HSV converted, and the RGB value is converted to hue (H: 0 to 1), saturation (S: 0 to 1), brightness (V: 0 to 1). ) Value.
  • the color of the pixel at the position (x, y) in the sub-image specified by (x, y, H ′, S ′, V ′) received from the feature candidate generation unit 102 as the feature parameter set is ( H ′, S ′, V ′), the feature c is 1; otherwise, the feature c is 0.
  • the feature determination unit 1303 calculates the mutual information MI obtained from the s-th feature candidate, Calculation is performed according to the following equation (3), and this is stored together with the feature candidate identification number s (step S1405).
  • M is the total number of sub-images.
  • M (q) is the total number of sub-images belonging to class q
  • M (c) is the total number of sub-images with feature c
  • M (q, c) is the sub-feature with feature c and belonging to class q The total number of images.
  • c]> C is an averaging operation regarding c, and is calculated by the following formula (4).
  • the next (s + 1) th feature candidate is sent from the feature candidate generating means 1302, and the same processing is repeated (steps S1402 to S1405).
  • the feature determination unit 1303 compares the mutual information MI obtained from each feature candidate. Then, the feature candidate that provides the maximum mutual information Max MI [Q; C] is determined as the first feature of the feature set to be determined (step S1406).
  • the feature determination unit 1303 determines the second feature.
  • the feature determination unit 1303 sequentially receives feature candidates from the feature candidate generation unit 1302 (step S1402), and calculates a feature c for each sub-image (steps S1403 and S1404). Note that the calculation result of the feature c in step S1404 at the time of determining the first feature described above is stored and held according to the usable storage capacity, and the feature determination unit 1303 stores the stored content (feature candidate). ) May be replaced with an operation of reading out.
  • the feature determination means 1303 has a condition that the first feature c 1 that has already been determined is known.
  • the mutual information MI 2 obtained from the sth feature candidate is calculated according to the following equation (5), and stored together with the feature candidate identification number s (step 1405).
  • M (c 1 ) is the total number of sub-images whose first feature is c 1
  • M (q, c 1 ) is a sub-image whose first feature is c 1 and belongs to class q
  • M (c, c 1 ) is the total number of sub-images whose feature is c and the first feature is c 1
  • M (q, c, c 1 ) is feature c and 1
  • the th feature is c 1 and the total number of sub-images belonging to class q.
  • the feature determination unit 1303 compares the conditional mutual information MI 2 obtained from each feature candidate, feature candidate of information is obtained and determined as the feature c 2 a second set of features to be determined (step S1406).
  • the MI m + 1 represents the amount of information obtained from the feature c under the condition that the m-th feature (c 1 , c 2 ,..., C m ) is known. Even if a new feature is selected, such processing is continued until the obtained information amount (additional information amount) becomes smaller than a preset threshold MI_th. For example, when the threshold value MI_th is set to zero, the following procedure is performed to determine the next feature until the obtained information amount (additional information amount) becomes zero, that is, until the end condition is satisfied. Repeated.
  • the feature determination process ends when this end condition is satisfied.
  • Each parameter of the determined feature set is stored in the feature storage unit 1304 (step S1407).
  • the following configuration can be considered in which a device for reducing the number of feature candidates generated by the feature candidate generation unit 1302 is added.
  • the structure which fixes the value of threshold value MI_th to the intermediate value of these two in-class average values can be considered.
  • the mutual information MI is calculated for each complex Gabor function by the above equation (3).
  • a threshold value MI_th that gives MI is recorded.
  • the complex Gabor function is used as the feature extraction function that constitutes the feature candidate.
  • the feature candidate may be constituted only by the other feature extraction function as appropriate. May be.
  • a modification in which a partial space is configured for each class and an index indicating the distance to the partial space is added to the feature candidate is also preferable. It is also possible to add a weighted average luminance near a certain point calculated using a Gaussian function to a feature candidate. Also, the weighted average brightness near a point calculated using a Gaussian function, normalized by the average brightness calculated using a Gaussian function with a larger spread, that is, the vicinity of a point is It is also possible to add an index indicating whether it is brighter or darker than the surrounding area to the feature candidate. In addition, standard features used in diagnosis can be added to feature candidates.
  • a classification table 1306 (shown in FIG. 16) for use in pattern identification can be created.
  • the classification table creating unit 1305 activated by a desired unit creates the classification table 1306 will be described.
  • the classification table creating unit 1305 determines each sub-image from the learning pattern storage unit 1301 and each parameter of the feature set from the feature storage unit 1304 (hereinafter, a total of n features are determined). Receive) Then, each sub-image and each feature value (c 1 , c 2 ,..., C n ) for each sub-image are stored in the classification table 1306.
  • a redundant term (don't care term) is used. For example, when a certain sub-image can be classified only with the feature values from the beginning to the i-th feature (c 1 , c 2 ,..., C i ), the value of the feature vector after the i + 1th is Replace with a symbol representing don't care and store.
  • FIG. 15 is an example of a flowchart showing a procedure for creating the classification table 1306 according to this embodiment.
  • the classification table creation unit 1305 uses the parameters of the feature set stored in the feature storage unit 1304 for the input sub-image, and uses the feature vectors (c 1 , c 2 ,. c n ) is calculated (steps S1501 and S1502).
  • step S1503 It is determined whether or not a sub-image having a feature vector that matches the feature vector exists in the classification table 1306 (step S1503).
  • the value of the corresponding feature is determined as matching regardless of the value.
  • the first to i-th features (c 1 , c 2 ,. ., C i ) checks whether there is a sub-image that matches this sub-image (step S1505).
  • step S1506 the process returns to step S1501, and the next sub-image is input.
  • step S1501 the increment variable i is incremented by 1, and the process returns to step S1501. That is, the process of increasing i is continued until it can be identified by the value of the i-th feature of the input sub-image.
  • sub-images belonging to different classes may have the same feature vector. In this case, for example, the number of sub-images belonging to each class is counted, and the larger class can be determined as the class represented by this feature vector.
  • FIG. 16 is an example of the classification table 1306 employed by the present invention.
  • FIG. 16 shows a table for storing the identification mark (q) of each sub-image class and the feature vectors (c 1 , c 2 ,..., C n ).
  • the symbol “*” represents don't care.
  • FIG. 17 is a block diagram showing an example of the processing flow of the diagnostic method of the present invention.
  • FIG. 17 shows a pattern input unit 1701, a feature extraction unit 1702, and a diagnosis unit 1703.
  • a feature storage unit 1304 for storing and holding a set of determined features used for feature extraction by the feature extraction unit 1702 and a created classification table 1306 used for diagnosis by the diagnosis unit 1703 are shown.
  • the pattern input unit 1701 is a unit for inputting a sub image from a desired medium. In the present embodiment, it is means for inputting an image (sub-image) centered on the cell nucleus of the cells constituting the pathological tissue. In the present embodiment, an image centered on the cell nucleus is input, but the present invention is not limited to this. For example, an image used as a judgment material by a pathologist in diagnosis of a pathological tissue such as a cell nucleus, a void, a cytoplasm, and a stroma can be input as a sub-image.
  • the feature extraction unit 1702 is a unit that extracts the feature from the sub-image sent from the pattern input unit 1701 using the determined feature set.
  • Diagnostic unit 1703 is a unit for diagnosing information represented by the sub-image based on the feature obtained by the feature extraction unit 1702.
  • a sub-image is taken and sent to the feature extraction means 1702.
  • the feature extraction unit 1702 calculates a sub-image feature vector for the input sub-image, and sends the calculation result to the diagnosis unit 1703.
  • the feature vector is calculated by using a feature set determined by the procedures 1, 2, and 3 stored in the feature storage unit 1304, for example, a feature set determined by the feature determination method described above.
  • the diagnosis unit 1703 refers to the classification table 1306, searches for a match with the feature vector, reads the class indicator recorded therein, and outputs it as a diagnosis result. At this time, if a symbol representing don't care is recorded on the classification table 1306, the diagnosis unit 1703 determines that the part is the same regardless of the value of the corresponding feature. To do.
  • ID3 and the like are also in common with the present invention in that the classification rule at each node of the decision tree is determined according to the information amount maximization criterion.
  • a classification rule for example, a feature
  • the different classification rules Is determined.
  • the node depth is the same
  • the same feature is determined as an arbitrary n-th feature. This is a major difference between the two.
  • the learning patterns are completely classified.
  • a big difference appears in the generalization performance that is, the discrimination performance with respect to a sub-image that has not been learned.
  • both trees have the same depth (assumed to be n)
  • 2n features are determined in ID3 or C4.5, whereas only n features are determined in the present invention. Therefore, the present invention has a simpler structure.
  • the difference in the number of determined features grows exponentially as the problem becomes more difficult and deeper trees are needed.
  • processing for extracting a sub-image from a pathological image in the learning pattern input unit 1300 and the pattern input unit 1701 will be described.
  • sub-image extraction centering on cell nuclei will be described, but the present invention is not limited to this. Therefore, the morphological features that the pathologist pays attention to when observing the pathological image, such as holes, cytoplasm, and stroma, can be extracted as sub-images.
  • the process of extracting the sub-image centered on the cell nucleus is to calculate the miRNA staining signal from the RGB value of each pixel in the pathological image and to detect the center position of the cell nucleus from the distribution of the miRNA staining signal of each pixel in the pathological image. It is divided roughly into the step to do. Actually, processing such as smoothing of the miRNA staining signal is also included.
  • a pathological image in which cell nuclei are stained blue by miRNA staining will be described as an example.
  • the learning pattern input unit 1300 and the pattern input unit 1701 first apply a miRNA staining signal to each pixel of the pathological image in which the cell nucleus is stained blue.
  • the miRNA staining signal having a value of 0 is calculated for the area stained with color. This process is performed by examining the color distribution of cell nuclei in the RGB space and calculating the distance from the center of the distribution to the RGB value of each pixel. That is, if the RGB value of each pixel is examined and the value is located near the center of the color distribution of the cell nucleus in the RGB space, a large miRNA staining signal close to 1 is far from the center. A miRNA staining signal close to 0 is given. However, since the method of staining nuclei may vary from sample to sample due to differences in staining processing, the color distribution of cell nuclei is calculated by an adaptive method here.
  • a pixel whose RGB value falls within the color region of the cell nucleus is selected from the pathological image, and this is used as a pixel representing the color of the cell nucleus.
  • the color region of the cell nucleus is determined in advance by the following method. First, images of cell nuclei that vary in staining due to differences in staining processing are collected. Next, in each image, the RGB value of each pixel in the cell nucleus region is examined. At the same time, in each of these images, for example, the RGB values of the pixels in a region stained with a color characteristic of cytoplasm, stroma, and pores are also examined. Then, the pixel region of the cell nucleus, which is dyed with a characteristic color of the cytoplasm, stroma, and pores, is not included at all or hardly, and the color region of the cell nucleus composed of pixels of the cell nucleus region is determined.
  • the learning pattern input unit 1300 and the pattern input unit 1701 give a miRNA staining signal to each pixel based on the following method.
  • N pixels whose RGB values fall within the color region of the cell nucleus are selected from the pathological images input to the learning pattern input unit 1300 and the pattern input unit 1701 (Ste S1802).
  • T is a symbol representing a vector transposition operation.
  • ⁇ the distance L between each pixel (R, G, B) and the average value (R 0 , G 0 , B 0 ), and miRNA staining signal (Hema) according to the following equation (8) Is calculated (step S1804).
  • the miRNA staining signal calculated for each pixel according to the equation (8) is defined as Hema ( ⁇ r).
  • ⁇ r (x, y) is a position vector representing the position of the pixel in the pathological image.
  • Hema ( ⁇ r) is smoothed by the following equation (9) using the smoothing mask M low (step S1805), and the peak is set as the center position of the cell nucleus (steps S1806 and S1807).
  • the smoothing mask M low for example, a function represented by the following formula (10) is used.
  • the normalization factor 1 / l of the equation (10) is determined by the following equation (11).
  • S ex and S in are parameters, which are determined in advance.
  • the value of S ex is the typical size (radius) degree of cell nuclei, and the value of S in is set to a value of 1.2 times that of S ex.
  • miRNA staining signal (miR ′) is calculated for each pixel, the value of miR ′ at the point of interest is larger than a predetermined threshold (for example, 0.25) and in the vicinity of the point (for example, If the difference between the x, y and y coordinates is greater than the value of miR ′ at any point of any pixel within 3 pixels), that point is detected as a peak, and this is taken as the center of the cell nucleus (step S1807).
  • a predetermined threshold for example, 0.25
  • a predetermined threshold for example, 0.25
  • the difference between the x, y and y coordinates is greater than the value of miR ′ at any point of any pixel within 3 pixels
  • the miRNA staining signal smoothing process and the peak detection process among the above processes include a plurality of (for example, parameters S ex and S in ) having different sizes (for example, 3 types) Smoothing processing and peak detection processing are performed using a smoothing mask. And it is good also as a structure which makes the peak position detected by one of processes the center of a cell nucleus.
  • Learning pattern input means 1300 and pattern input means 1701 first detect the cell nucleus center by the above processing on the input pathological image. Then, a large number of images (sub-images) of a predetermined size centered on the detected cell nucleus center are extracted from the pathological image (by the number of detected cell nucleus centers), and each of these sub-images is learned patterns or input. Extracted as a pattern (step S1808).
  • the image diagnosis support system of the present invention may have means for evaluating the effectiveness of miRNA-stained images, for example.
  • the accuracy of cancer evaluation can be further improved by evaluating the effectiveness of miRNA-stained images.
  • staining image is synonymous with evaluation of the effectiveness of the slice slide which performed miRNA dyeing
  • the third embodiment further includes correction means for correcting the staining state of the miRNA-stained image and non-tumor cells in the corrected miRNA-stained image in the diagnostic imaging support system of the first or second form.
  • correction means for correcting the staining state of the miRNA-stained image and non-tumor cells in the corrected miRNA-stained image in the diagnostic imaging support system of the first or second form.
  • Non-tumor cell detection means and determination means for determining the presence or absence of miRNA staining of the detected non-tumor cells.
  • the processing by the system of this embodiment can be performed as follows, for example.
  • First, the staining state of the acquired miRNA stained image is corrected.
  • the correction is performed on the dye, intensity, and the like in consideration of the state of the section slide used, the state of the section slide similarly stained, the staining condition, the acquisition condition of the image data, and the like.
  • non-tumor cells are detected from the miRNA-stained image after correction.
  • the non-tumor cells can be determined based on information such as the shape and size of cells, the shape and size of cell nuclei, and the location of tissue. Further, this determination can be made by a module that has performed machine learning based on the above-described conditions, for example.
  • the detection of the non-tumor cells can be performed, for example, by obtaining a stained image with a counter stain and matching the counter stained image with the miRNA stained image.
  • the matching is the same as the matching between the miRNA stained image and the HE stained image, for example.
  • the counter stain can be appropriately determined according to, for example, the type of sample that is the subject, and examples thereof include a Cologne Echrotroth.
  • the type of non-tumor cells to be detected is not particularly limited, and can be appropriately determined according to the type of sample as a specimen, for example, lymphocytes, fibroblasts, vascular endothelial cells, etc. Whether a cell is a non-tumor cell can be determined by whether it is a defined cell size and / or shape.
  • the miRNA stained image the presence or absence of miRNA staining of the detected non-tumor cell is determined.
  • the miRNA-stained image is regarded as having no effectiveness, and the process is terminated without proceeding to further steps.
  • this miRNA-stained image is considered valid and proceeds to further steps, for example, detection of tumor regions based on the miRNA staining described above.
  • an LNA-modified probe (trade name: miRCURY-LNA detection probe, Exiqon) labeled with digoxigenin (DIG) was used.
  • DIG digoxigenin
  • SEQ ID NO: 5 The sequence of the probe for detecting hsa-miR-92a is shown in SEQ ID NO: 5
  • SEQ ID NO: 6 The sequence of the probe for negative control is shown in SEQ ID NO: 6.
  • the following negative control probe sequence is a scrambled sequence of the following hsa-miR-92a detection probe sequence.
  • hsa-miR-92a detection probe (SEQ ID NO: 5) 5'-acagggccgggacaagtgcaata-3 '
  • Negative control probe (SEQ ID NO: 6) 5'-gtgtacacgtctataccccca-3 '
  • In situ hybridization is performed by using the RiboMap in situ hybridization kit (trade name, Ventana Medical Systems), using the Ventana Discovery in Ventilator product name. Unless otherwise indicated, the standard protocol provided by RiboMap application note (http://www.ventanamed.com) of Ventana Medical Systems was used.
  • leukocytes were collected from the whole blood of each leukemia patient.
  • the obtained leukocytes were fixed with paraformaldehyde fixing solution, embedded in paraffin, and prepared with a general method.
  • the section was deparaffinized and then subjected to in situ hybridization.
  • in situ hybridization initial fixation of a section after deparaffinization is performed by incubating the slide having the section with formalin-based RiboPrep (trade name, Ventana Medical Systems) at 37 ° C. for 30 minutes. It was.
  • FIG. 1 The results are shown in FIG.
  • the upper and middle panels are photographs showing the staining of leukocytes from AML patients (FAB classification M3), and the lower panels are photographs showing the staining of leukocytes from ALL patients.
  • the left panel is a photograph showing counterstaining with Cologne Echrotroth
  • the middle panel is a photograph showing staining with the hsa-miR-92a detection probe
  • the right panel is the photograph shown above. It is a photograph which shows the dyeing
  • the bar in each figure shows a length of 50 ⁇ m.
  • FIG. 22 shows the results of one AML patient and one ALL patient, but similar results were obtained in other patients.
  • hsa-miR-92a expression was not detected in normal leukocytes.
  • hsa-miR-92a is strongly expressed in leukocytes of AML patients and ALL patients, it can be seen that detection of hsa-miR-92a in leukocytes can evaluate the possibility of cell cancer. It was.
  • Example 2 A section was prepared in the same manner as in Example 1 except that the tissue collected from the breast was used, and hsa-miR-92a was detected by in situ hybridization. The result is shown in FIG. (A) to (D) of FIG. 23 are photographs showing the results of miRNA staining of breast tissue collected from different parts.
  • Example 3 A section was prepared in the same manner as in Example 1 except that tissue collected from hepatocytes was used, and hsa-miR-92a was detected by in situ hybridization.
  • HCC hepatocellular carcinoma
  • LC liver cirrhosis
  • hepatocytes of HCC patients were collected from patients with different ages, sexes, hepatitis virus types, clinical stages, and tumor differentiation levels.
  • FIG. 24 shows the staining results of two hepatocytes (Case 1 and Case 2) as representatives of the 22 HCC patient-derived hepatocytes.
  • FIG. 24 is a photograph showing staining of hepatocytes derived from an HCC patient.
  • the upper and middle panels show the results of case 1 hepatocytes, and the lower panels show the results of case 2 hepatocytes.
  • the left panel is a photograph showing counterstaining with Cologne Echrotroth and HE
  • the middle panel is a photograph showing staining with the hsa-miR-92a detection probe
  • the right panel is a photograph.
  • FIG. 3 is a photograph showing staining using the negative control probe.
  • FIG. The bar in each figure shows a length of 100 ⁇ m.
  • the middle panel is an enlarged photo of the upper panel. In each panel, the dark part is the dyed part and the light part is the non-stained part.
  • the expression level of RNU48 was also measured in the same manner.
  • the ratio of the expression level of hsa-miR-92a to the expression level of RNU48 (hsa-miR-92a / RNU48) was calculated as the expression level of hsa-miR-92a.
  • hsa-miR-92a is strongly expressed in the hepatocytes of HCC patients, it was found that the detection of hsa-miR-92a in hepatocytes can evaluate the possibility of cell cancer. .
  • the present invention by detecting the expression level of the cancer marker of the present invention in a sample, for example, the presence / absence and progression of cancer can be determined with high reliability. Furthermore, by making the evaluation method of the present invention correspond to the evaluation of cancer by conventional HE staining or the like, it becomes possible to evaluate cancer with even higher reliability.
  • Input Device 112 Output Device 113 Stained Image Database 120 Processing Device 121 Input Acceptance Processing Unit 122 Information Acquisition Unit 123 Image Matching Processing Unit 124 Tumor Region Extraction Unit 125 Staining Positive Cell Content Calculation Unit 130 Storage Devices 131, 132, 133, 134 135, 136, 1231 Storage unit 725 Staining positive cell content rate and staining degree calculation unit 1126 Tumor determination and tumor region calculation unit 1213 Slide database 1214 Slide device 1222 Slide photographing unit 1300 Learning pattern input unit 1301 Learning pattern storage unit 1302 Feature candidate Generation unit 1303 Feature determination unit 1304 Feature storage unit 1305 Classification table creation unit 1306 Classification table 1701 Pattern input unit 1702 Feature extraction unit 1703 Diagnosis unit 190 Diagnosis support apparatus 191 processing unit 192 storage unit 193 microscope 194 CCD 195 Scanner 196 Display 2001 Image acquisition means 2002 Information acquisition means 2003 Matching means 2004 Tumor region specifying means 2005 Calculation means

Landscapes

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Abstract

　被検者の癌の発症、前臨床期、臨床期または予後を評価するための新規な癌マーカーを用いた癌の評価方法を提供する。　ｈｓａ-ｍｉＲ-９２およびｈｓａ-ｍｉＲ-４９４の少なくとも一方のｍｉＲＮＡを、癌の評価における新規の癌マーカーとする。細胞または組織の試料における前記癌マーカーを検出し、その発現レベルに基づいて、前記試料の癌の可能性を評価する。この評価方法によれば、癌マーカーである前記ｍｉＲＮＡを検出することにより、優れた信頼性で前記試料について癌の可能性を評価することが可能となる。前記癌マーカーの検出方法としては、例えば、固定化した前記試料について、標識プローブを用いてｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法を行うことが好ましい。

Description

癌の評価方法
　本発明は、新たな癌マーカーの検出による、癌の可能性の評価方法に関する。
　臨床医療の分野において、疾患の有無、進行度、治療後の効果等を容易に判断することが求められている。そこで、間接的な判断手法として、各疾患の発症および進行に応じて特異的に発現量が変化するマーカーの検出が提案されており、実際に実用化が試みられている。
　疾患の中でも、悪性腫瘍、いわゆる癌については、特に、早期発見、適切な治療方針の選択および変更が重要である。このため、前述のようなマーカー検出による間接的な判断を実現するため、種々の癌マーカーが報告されている。前記癌マーカーは、腫瘍マーカーともいう。前記癌マーカーの具体例としては、例えば、ＰＳＡ（前立腺特異抗原：Ｐｒｏｓｔａｔｅ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ａｎｔｉｇｅｎ）、ＣＥＡ（癌胎児性抗原：Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　Ａｎｔｉｇｅｎ）、ＣＡ１９－９（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　Ａｎｔｉｇｅｎ　１９－９）、ＣＡ７２－４（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　Ａｎｔｉｇｅｎ　７２－４）等がある。また、非特許文献１および２には、ｈａｓ－ｍｉｒ－１５、ｈａｓ－ｍｉｒ－１６、ｍｉＲ－１４３およびｍｉＲ－１４５等のｍｉＲＮＡの発現が、リンパ性白血病および大腸癌等で、ダウンレギュレーションされるとの記載もある（非特許文献１および２）。
Ｃａｌｉｎ　ＧＡ，　Ｄｕｍｉｔｒｕ　ＣＤ，　Ｓｈｉｍｉｚｕ　Ｍ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｆｒｅｑｕｅｎｔ　ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏ－ＲＮＡ　ｇｅｎｅｓ　ｍｉＲ１５　ａｎｄ　ｍｉＲ１６　ａｔ　１３ｑ１４　ｉｎ　ｃｈｒｏｎｉｃ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ　ｌｅｕｋｅｍｉａ，　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ，　２００２年，　ｖｏｌ．９９，　ｐ．１５５２４－９ Ｍｉｃｈａｅｌ　ＭＺ，　ＳＭ　ＯＣ，　ｖａｎ　Ｈｏｌｓｔ　Ｐｅｌｌｅｋａａｎ　ＮＧ，　Ｙｏｕｎｇ　ＧＰ，　Ｊａｍｅｓ　ＲＪ，　Ｒｅｄｕｃｅｄ　ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ　ｉｎ　ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ　ｎｅｏｐｌａｓｉａ，　Ｍｏｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，　２００３年，　１巻，　ｐ．８８２－９１
　しかしながら、臨床医療の分野においては、優れた信頼性で、癌の発症およびその進行度を判断できる癌マーカーが必要である。このため、さらに、新たな癌マーカーの提供が望まれている。そこで、本発明の目的は、癌を評価するための新規な癌マーカーを用いた評価方法、および、それに用いる評価試薬を提供することにある。
　本発明の評価方法は、癌の可能性を評価する評価方法であり、
試料における癌マーカーを検出する癌マーカー検出工程と、
前記癌マーカー検出工程において検出した前記癌マーカーの発現レベルに基づいて、前記試料の癌の可能性を評価する工程とを含み、
前記試料が、細胞または組織であり、
前記癌マーカーが、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２およびｈｓａ－ｍｉＲ－４９４の少なくとも一方のｍｉＲＮＡを含むことを特徴とする。
　本発明者らは、鋭意研究の結果、癌の発生に伴って、細胞または組織において、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２およびｈｓａ－ｍｉＲ－４９４の発現レベルが変化することを見出し、本発明に到った。本発明の評価方法によれば、試料中の前記ｍｉＲＮＡの発現レベルを検出することによって、例えば、癌の発生の有無または癌の進行を、優れた信頼性で判断可能となる。また、前記ｍｉＲＮＡの発現は、例えば、癌化について、陰性・陽性の差が有意であることから、本発明によれば、例えば、一般的な触診等では検出が困難である初期段階の癌についても、容易に検出が可能となる。さらに、本発明の評価方法を、例えば、従来のＨＥ染色等による癌の評価と対応させることによって、より一層信頼性に優れた癌の評価が可能となる。
本発明の実施形態１Ｂの癌病理画像診断支援システムを示すブロック図である。 本発明の前記実施形態１Ｂにおける、染色画像データベースの内容を説明する図である。 本発明の前記実施形態１Ｂにおける、図１に示す癌病理画像診断支援システムの動作の一例を説明するフローチャートである。 本発明の前記実施形態１Ｂにおける、図１に示す癌病理画像診断支援システムの動作の一例を説明するフローチャートである。 本発明の前記実施形態１Ｂにおける、図１に示す癌病理画像診断支援システムの動作の一例を説明するフローチャートである。 本発明の前記実施形態１Ｂにおける、図１に示す癌病理画像診断支援システムの動作の一例を説明するフローチャートである。 本発明の実施形態１Ｃの癌病理画像診断支援システムを示すブロック図である。 本発明の前記実施形態１Ｃにおける、図７に示す癌病理画像診断支援システムの動作の一例を説明するフローチャートである。 本発明の前記実施形態１Ｃにおける、図７に示す癌病理画像診断支援システムの動作の一例を説明するフローチャートである。 本発明の前記実施形態１Ｃにおける、図７に示す癌病理画像診断支援システムの動作の一例を説明するフローチャートである。 本発明の実施形態１Ｄの癌病理画像診断支援システムを示すブロック図である。 本発明の実施形態１Ｅの癌病理画像診断支援システムを示すブロック図である。 本発明の実施形態２Ａの特徴選択方法を行うシステムの構成を示すブロック図である。 本発明の実施形態２Ｂの特徴選択方法を説明するフローチャートである。 本発明の前記実施形態２Ｂにおける、分類テーブルの作成処理の一例を示すフローチャートである。 本発明の前記実施形態２Ｂにおける、作成された分類テーブルの一例である。 本発明の前記実施形態２Ｂの診断を行うシステムの構成を示すブロック図である。 本発明の前記実施形態２Ｂにおける、サブイメージを抽出する処理の一例を示すフローチャートである。 本発明の実施形態１Ａの癌病理画像診断支援装置の構成を示すブロック図である。 本発明の前記実施形態１Ａの癌病理画像診断支援システムを示すブロック図である。 本発明の前記実施形態１Ａにおける、図２０に示した癌病理画像診断支援システムの動作の一例を説明するためのフローチャートである。 本発明の実施例１における、白血球細胞のｍｉＲＮＡ染色の結果を示す写真である。 本発明の実施例２における、乳房組織のｍｉＲＮＡ染色の結果を示す写真である。 本発明の実施例３における、肝細胞のｍｉＲＮＡ染色の結果を示す写真である。
　本発明において、各用語は、以下のことを意味する。「癌」は、一般的に、悪性腫瘍を意味する。「癌化」は、一般的に、癌の発症を意味し、「悪性転換」の意味も含む。「発症」とは、例えば、疾患特異的臨床症状または検査データ等に基づく総合的判断によって、特定疾患と診断された時点をもって、発症とよぶ。「前臨床期」とは、一般的に、疾患特異的な臨床症状が表れる前の発症前状態であって、既に微量の悪性腫瘍細胞が存在している早期の状態を指す。「予後」とは、例えば、術後等の疾患の治療後の経過を意味する。本発明における癌マーカーは、例えば、予後を予測し、見通しを立て、適切な治療方法を選択するための判断材料となりうることから、「予後因子」ということもできる。「癌の進行期」は、例えば、癌化組織の種類等によって適宜判断でき、一般に、０期およびＩ期を初期癌、II期を早期癌、III～IV期を進行癌と分類できる。
　本発明において、「癌の可能性」とは、例えば、癌が発症する可能性、癌化しているか否か、前臨床期もしくは臨床期等の癌の進行度、または、予後の状態等の意味を含む。
＜癌マーカー＞
　本発明における癌マーカーｍｉＲＮＡは、前述のように、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２およびｈｓａ－ｍｉＲ－４９４の少なくとも一方のｍｉＲＮＡである。以下、癌マーカーを、癌マーカーｍｉＲＮＡともいう。
　本発明において、前記癌マーカーｍｉＲＮＡは、例えば、一本鎖（一量体）でもよいし、二本鎖（二量体）であってもよい。また、本発明において、前記癌マーカーｍｉＲＮＡは、例えば、未成熟型ｍｉＲＮＡでもよいし、成熟型ｍｉＲＮＡでもよい。前記未成熟型ｍｉＲＮＡは、例えば、一次転写初期ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）および前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）があげられる。前記ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡは、分子内結合によりヘアピンループ構造をとる。前記ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡは、Ｄｒｏｓｈａで切断され、ステムループ構造をとる短い前記ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡに変換される。以下、前記ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡを、ステムループｍｉＲＮＡともいう。前記ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡが、Ｄｉｃｅｒで切断され、より短い二本鎖ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ－ｍｉＲＮＡ＊）が生成される。この二本鎖ＲＮＡがＲＩＳＣ上で巻き戻しを受け、二本の一本鎖ＲＮＡが生成される。前記一本鎖ＲＮＡが、成熟ｍｉＲＮＡである。以下、成熟型ｍｉＲＮＡのうち、一方を、機能性ｍｉＲＮＡといい、他方を、Ｍｉｎｏｒ　ｍｉＲＮＡ＊という。
　本発明において、前記癌マーカーｍｉＲＮＡは、特に制限されないが、好ましくは、ステムループｍｉＲＮＡおよび成熟型のｍｉＲＮＡであり、特に好ましくは、成熟型のｍｉＲＮＡである。
　ｈｓａ－ｍｉＲ－９２としては、例えば、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａおよびｈｓａ－ｍｉＲ－９２ｂがあげられる。
　ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａは、前述のように、未成熟型ｍｉＲＮＡおよび成熟型ｍｉＲＮＡのいずれであってもよい。以下、前者を、未成熟型ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ、後者を、成熟型ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａともいう。
　未成熟型ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａとしては、例えば、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－１およびｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－２があげられ、いずれであってもよい。ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－１およびｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－２は、ステムループｍｉＲＮＡである。以下、前者を、ステムループｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－１、後者を、ステムループｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－２ともいう。両者は、異なるゲノム領域からの転写産物であるが、それぞれの成熟型の配列は同一である。ステムループｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－１は、例えば、その配列がアクセッションＮｏ．ＭＩ０００００９３に登録されており、ステムループｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－２は、例えば、その配列がアクセッションＮｏ．ＭＩ０００００９４に登録されている。
　成熟型ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａは、例えば、機能性ｍｉＲＮＡがあげられ、例えば、その配列がアクセッションＮｏ．ＭＩＭＡＴ０００００９２に登録されている。この機能性ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａの配列を、配列番号１に示す。
機能性ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ（配列番号１）
　　５’－ｕａｕｕｇｃａｃｕｕｇｕｃｃｃｇｇｃｃｕｇｕ－３’
　成熟型ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａとしては、この他に、Ｍｉｎｏｒ　ｍｉＲＮＡ＊があげられる。前記Ｍｉｎｏｒ　ｍｉＲＮＡ＊としては、例えば、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－１＊およびｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－２＊があげられる。ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－１＊は、例えば、その配列がアクセッションＮｏ．ＭＩＭＡＴ０００４５０７に登録されている。この配列を、配列番号６に示す。ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－２＊の配列は、ＭＩＭＡＴ０００４５０８に登録されている。この配列を、配列番号７に示す。
Ｍｉｎｏｒ　ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－１＊（配列番号６）
　　５’－ａｇｇｕｕｇｇｇａｕｃｇｇｕｕｇｃａａｕｇｃｕ－３’
Ｍｉｎｏｒ　ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－２＊（配列番号７）
　　５’－ｇｇｇｕｇｇｇｇａｕｕｕｇｕｕｇｃａｕｕａｃ－３’
　ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ｂは、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａとは異なるゲノム領域からの転写産物であるが、そのシード配列が、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａと類似している。このため、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ｂは、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａと同様に癌マーカーとして使用できる。ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ｂは、前述のように、未成熟型ｍｉＲＮＡおよび成熟型ｍｉＲＮＡのいずれであってもよい。以下、前者を、未成熟型ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ｂ、後者を、成熟型ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ｂともいう。
　未成熟型ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ｂの中で、ステムループｍｉＲＮＡを、以下、ステムループｈｓａ－ｍｉＲ－９２ｂともいう。ステムループｈｓａ－ｍｉＲ－９２ｂは、例えば、その配列が、アクセッションＭｏ．ＭＩ０００３５６０に登録されている。
　成熟型ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ｂは、例えば、機能性ｍｉＲＮＡがあげられ、その配列が、アクセッションＮｏ．ＭＩＭＡＴ０００３２１８に登録されている。この機能性ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ｂの配列を、配列番号３に示す。
機能性ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ｂ（配列番号３）
　　５’－ｕａｕｕｇｃａｃｕｃｇｕｃｃｃｇｇｃｃｕｃｃ－３’
　成熟型ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ｂとしては、この他に、例えば、Ｍｉｎｏｒ　ｍｉＲＮＡ＊があげられる。前記Ｍｉｎｏｒ　ｍｉＲＮＡ＊としては、例えば、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ｂ＊があげられる。ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ｂ＊は、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－１＊またはｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－２＊とは異なるゲノム領域からの転写産物であるが、そのシード配列が、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－１＊またはｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－２＊と類似している。このため、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ｂ＊は、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－１＊またはｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－２＊と同様に癌マーカーとして使用できる。ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ｂ＊は、例えば、その配列がアクセッションＮｏ．ＭＩＭＡＴ０００４７９２に登録されている。この配列を、配列番号４に示す。
Ｍｉｎｏｒ　ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ｂ＊（配列番号４）
　　５’－ａｇｇｇａｃｇｇｇａｃｇｃｇｇｕｇｃａｇｕｇ－３’
　ｈｓａ－ｍｉＲ－４９４は、前述のように、未成熟型のｍｉＲＮＡおよび成熟型のｍｉＲＮＡのいずれであってもよい。以下、前者を、未成熟型ｈｓａ－ｍｉＲ－４９４、後者を、成熟型ｈｓａ－ｍｉＲ－４９４ともいう。
　未成熟型ｈｓａ－ｍｉＲ－４９４は、例えば、ステムループｍｉＲＮＡがあげられる。以下、これを、ステムループｈｓａ－ｍｉＲ－４９４ともいう。ステムループｈｓａ－ｍｉＲ－４９４は、例えば、その配列がアクセッションＮｏ．ＭＩ０００３１３４に登録されている。
　成熟型ｈｓａ－ｍｉＲ－４９４は、例えば、機能性ｍｉＲＮＡがあげられ、例えば、その配列がアクセッションＭｏ．ＭＩＭＡＴ０００２８１６に登録されている。この機能性ｈｓａ－ｍｉＲ－４９４の配列を、配列番号２に示す。
機能性ｈｓａ－ｍｉＲ－４９４（配列番号２）
　　５’－ｕｇａａａｃａｕａｃａｃｇｇｇａａａｃｃｕｃ－３’
　下記文献に開示されるように、前記各ｍｉＲＮＡは、例えば、５’末端と３’末端とに、それぞれ数個のｖａｒｉａｔｉｏｎが存在する。したがって、本発明における各ｍｉＲＮＡは、さらに、前述の成熟型の配列に対して、数個ずつ塩基が異なるｖａｒｉａｎｔも含む。
Ｗｕ　Ｈ．ｅｔ　ａｌ．，　２００７年，　ＰＬｏＳ　ＯＮＥ　２（１０）：ｅ１０２０　ｍｉＲＮＡ　ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ　ｏｆ　ｎａｉｖｅ，ｅｆｆｅｃｔｏｒ　ａｎｄ　ｍｅｍｏｒｙ　ＣＤ８　Ｔ　ｃｅｌｌｓ．
Ｐａｂｌｏ　Ｌａｎｄｇｒａｆ　ｅｔ　ａｌ．，　２００７年，　Ｃｅｌｌ，　ｖｏｌ．１２９，　ｐ．１４０１－１４１４　Ａ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｍｉｃｒｏＲＮＡ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｔｌａｓ　Ｂａｓｅｄ　ｏｎ　Ｓｍａｌｌ　ＲＮＡ　Ｌｉｂｒａｒｙ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．
Ｎｅｉｌｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，　２００７年，　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ，　ｖｏｌ．２１，　ｐ．５７８－５８９　Ｄｙｎａｍｉｃ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｉＲＮＡ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　ｓｔａｇｅ　ｏｆ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．
Ｒｕｂｙ　ｅｔ　ａｌ．，　２００６年，　Ｃｅｌｌ，　ｖｏｌ．１２７，　ｐ．１１９３－１２０７　Ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｒｅｖｅａｌｓ　２１Ｕ－ＲＮＡｓ　ａｎｄ　ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ　ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ　ａｎｄ　ｅｎｄｏｇｅｎｅｏｕｓ　ｓｉＲＮＡｓ　ｉｎ　Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ．
Ｏｂｅｒｎｏｓｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　ＲＮＡ　２００６年，　ｖｏｌ．１２，　ｐ．１１６１－１１６７　Ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏＲＮＡ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．
Ｌａｇｏｓ－Ｑｕｉｎｔａｎａ　ｅｔ　ａｌ．，　２００２年，　Ｃｕｒｒ　Ｂｉｏｌ，ｖｏｌ．１２，　ｐ．７３５－７３９　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｉｓｓｕｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ　ｆｒｏｍ　ｍｏｕｓｅ．
　本発明において、前記癌マーカーｍｉＲＮＡは、例えば、前記各配列番号に記載の塩基配列と相同性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド、または、それらに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む。前記「相同性」とは、比較する配列同士を適切にアライメントしたときの同一性の程度であり、前記配列間のヌクレオチドの正確な一致の出現率（％）を意味する。ポリヌクレオチドの塩基配列が「相同性を有する」とは、前記ポリヌクレオチドが、本発明におけるｍｉＲＮＡとしての機能を維持できるほど十分に類似していることをいう。前記アライメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ等の任意のアルゴリズムの利用により行える。前記塩基配列が、例えば、置換、欠失、挿入または付加等の点変異による相違を有しても、これらが前記ｍｉＲＮＡの機能に影響を与えないならば、両者は相同といえる。相違する塩基数としては、例えば、１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～５個、１～３個、２個または１個である。また、二つのポリヌクレオチドを比較して、例えば、塩基配列が８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を示す場合、これらは相同であるといえる。また、例えば、二つのポリヌクレオチドのうち一方が、他方のポリヌクレオチドの相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする場合には、両者は相同といえる。前記ストリンジェントな条件としては、特に限定されないが、例えば、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト、０．０１％変性サケ精子核酸を含む溶液中、「Ｔｍ（℃）－２５℃」の温度で一晩保温する条件等があげられる。
＜評価方法＞
　本発明の評価方法は、前述のように、試料における癌マーカーを検出する癌マーカー検出工程と、前記癌マーカー検出工程において検出した前記癌マーカーの発現レベルに基づいて、前記試料の癌の可能性を評価する工程とを含み、前記試料が、細胞または組織であり、前記癌マーカーが、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２およびｈｓａ－ｍｉＲ－４９４の少なくとも一方のｍｉＲＮＡを含むことを特徴とする。本発明によれば、例えば、被検者の試料について、前記癌マーカーを検出することによって、癌が発症する可能性、癌化しているか否か、前臨床期（初期段階）もしくは臨床期等の癌の進行度、または、予後の状態の評価等を行うことが可能となる。本発明の評価方法は、例えば、癌に罹患しているか否かの評価方法ともいえる。
　本発明における前記癌マーカーは、前述の通りである。本発明において、検出する癌マーカーは、例えば、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２およびｈｓａ－ｍｉＲ－４９４のいずれか一方でもよいし、両方であってもよい。
　検出する癌マーカーがｈｓａ－ｍｉＲ－９２の場合、例えば、成熟型および未成熟型のいずれか一種類でもよいし、両方であってもよい。ｈｓａ－ｍｉＲ－９２は、例えば、成熟型および未成熟型の種類も制限されず、いずれか一種類でもよいし、二種類でもよいし、全てであってもよい。
　検出する癌マーカーが成熟型ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａの場合、例えば、機能性ｈｓａ－ｍｉＲ－９２、Ｍｉｎｏｒ　ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－１＊およびＭｉｎｏｒ　ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－２＊のいずれか一種類でもよいし、いずれか二種類または全てであってもよい。検出する癌マーカーが、未成熟型ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａの場合、例えば、ステムループｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－１およびステムループｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－２のいずれか一種類でもよいし、両方であってもよい。また、検出する癌マーカーが成熟型ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ｂの場合、例えば、機能性ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ｂおよびＭｉｎｏｒ　ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ｂ＊のいずれか一種類でもよいし、両方であってもよい。
　検出する癌マーカーがｈｓａ－ｍｉＲ－４９４の場合、例えば、成熟型および未成熟型のいずれか一種類でもよいし、両方であってもよい。ｈｓａ－ｍｉＲ－４９４は、例えば、成熟型および未成熟型の種類も制限されず、いずれか一種類でもよいし、二種類でもよい。成熟型ｈｓａ－ｍｉＲ－４９４の場合、例えば、機能性ｈｓａ－ｍｉＲ－４９４があげられる。
　本発明は、前述のように、前記癌マーカーの発現レベルを検出することが特徴である。前記癌マーカーの検出方法は、何ら制限されず、公知の手法を利用できる。前記検出方法は、例えば、前記癌マーカーを可視化する方法が好ましい。前記可視化の方法は、特に制限されないが、例えば、発色、蛍光、オートラジオグフィー等によって行うことが好ましい。前記癌マーカーを発色により可視化した場合、前記癌マーカーの検出は、例えば、目視、吸光度測定、画像処理等により行える。また、前記癌マーカーを蛍光により可視化した場合、前記癌マーカーの検出は、例えば、目視、蛍光強度測定、画像処理等により行える。以下、発色または蛍光による癌マーカーｍｉＲＮＡの可視化を、ｍｉＲＮＡ染色ともいう。また、前記癌マーカーを、例えば、前記オードラジオグラフィーにより可視化した場合、前記癌マーカーｍｉＲＮＡの検出は、例えば、オートラジオグラフィー像の目視、前記像の画像処理等により行える。
　本発明において、評価対象となる癌は、特に制限されない。前記癌としては、前述のように、例えば、大腸癌、直腸癌、胆嚢癌、胃癌、乳癌、白血病、膵癌、肝臓癌、脳腫瘍、骨肉腫等があげられる。
　本発明において、前記試料は、生体試料であり、細胞または組織であればよく、特に制限されない。具体例としては、例えば、大腸、直腸、胆嚢、胃、乳房、血液細胞、肝臓、脳、骨、骨の周辺等の組織または細胞、白血球等の血中細胞等があげられる。
　本発明において、前記試料の由来となる被検者は、特に制限されず、例えば、ヒトがあげられる。この他にも、例えば、ヒト以外の霊長類、げっ歯類、犬、猫等を含む非ヒト哺乳類動物等があげられる。
　本発明において、前記試料における前記癌マーカーｍｉＲＮＡの検出は、例えば、前記試料について直接的に行ってもよいし、前記試料から回収したＲＮＡに対して間接的に行ってもよい。本発明は、例えば、前記試料における前記癌マーカーの発現領域を特定できることから、前記試料について、直接的に、前記癌マーカーの検出を行うことが好ましい。
　以下に、まず、前記試料から回収したＲＮＡを用いて、前記試料における前記癌マーカーｍｉＲＮＡを検出する方法について、例をあげて説明する。
　前記試料からのＲＮＡの回収方法は、特に制限されず、公知の方法が採用できる。具体例としては、グアニジン－塩化セシウム超遠心法、ＡＧＰＣ（Ａｃｉｄ　Ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ－Ｐｈｅｎｏｌ－Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）等が使用でき、また、市販の試薬やキットを使用することもできる。
　前記試料からＲＮＡを回収する場合、例えば、回収したＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡについて、前記癌マーカーｍｉＲＮＡのｃＤＮＡを検出することにより、間接的に、前記癌マーカーｍｉＲＮＡを検出することもできる。
　前記ＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを使用する場合、前記癌マーカーｍｉＲＮＡの検出は、例えば、核酸増幅法を利用して行える。前記核酸増幅法は、特に制限されないが、例えば、ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）法、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）法、リアルタイムＰＣＲ法、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法等があげられ、中でも、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法が好ましい。
　前記核酸増幅法を利用する場合、例えば、まず、試料から全ＲＮＡを抽出し、前記全ＲＮＡを鋳型として、ランダムプライマーを用いて、ｃＤＮＡの合成を行う。ついで、得られたｃＤＮＡを鋳型として、目的の癌マーカーｍｉＲＮＡのｃＤＮＡを増幅可能なプライマーを用いて、増幅反応を行い、増幅産物を検出する。このように、増幅産物の有無または増幅産物の量を検出することで、前記試料における前記癌マーカーｍｉＲＮＡの発現レベル、すなわち、前記癌マーカーｍｉＲＮＡの発現の有無または量を検出できる。
　ｃＤＮＡの合成反応に使用する前記ランダムプライマーは、特に制限されず、例えば、市販のランダムプライマーが使用できる。また、前記増幅反応に使用する前記プライマーは、何ら制限されず、例えば、前記癌マーカーｍｉＲＮＡのｃＤＮＡもしくはそれに相補的な配列または前記癌マーカーｍｉＲＮＡの周辺領域のｃＤＮＡもしくはそれに相補的な配列にハイブリダイズ可能なプライマーがあげられる。前記プライマーは、例えば、前記癌マーカーｍｉＲＮＡの塩基配列ならびに技術常識に基づいて、適宜設計可能である。前記プライマーの具体例としては、例えば、目的の癌マーカーｍｉＲＮＡのｃＤＮＡもしくはそれに相補的な配列または前記癌マーカーｍｉＲＮＡの周辺領域のｃＤＮＡもしくはそれに相補的な配列からなるプライマーがあげられる。前記プライマーの配列は、例えば、目的の癌マーカーｍｉＲＮＡのｃＤＮＡもしくはそれに相補的な配列または前記癌マーカーｍｉＲＮＡの周辺領域のｃＤＮＡもしくはそれに相補的な配列に対して、例えば、約７０％以上相補的であることが好ましく、好ましくは８０％以上であり、より好ましくは９０％以上であり、さらに好ましくは９５％以上であり、特に１００％相補的であることが好ましい。
　前記プライマーの構成単位は、特に制限されず、公知の構成単位が採用できる。具体例として、例えば、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド等のヌクレオチドがあげられ、また、ＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）等を含んでもよい。前記構成単位における塩基は、特に制限されず、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴおよびＵ等の天然塩基（非人工塩基）を含んでもよいし、非天然塩基（人工塩基）を含んでもよい。前記プライマーの長さは、特に制限されず、一般的な長さがあげられる。
　前記増幅産物の検出方法は、特に制限されず、公知の方法が採用できる。前記増幅産物をリアルタイムで検出する場合、例えば、前記増幅反応の反応液に蛍光試薬を共存させることが好ましい。前記蛍光試薬としては、例えば、二本鎖核酸に特異的に結合する蛍光物質、二本鎖核酸にインターカレートする蛍光物質等があげられる。前記増幅反応において、前記鋳型ｃＤＮＡにアニーリングした前記プライマーからの伸長によって二本鎖核酸が形成されると、共存させた前記蛍光物質が、前記二本鎖核酸に結合またはインターカレートする。そこで、前記二本鎖核酸に結合またはインターカレートした前記蛍光物質の蛍光を確認することで、前記増幅産物の有無を確認でき、間接的に、目的の癌マーカーｍｉＲＮＡの有無を確認できる。また、前記蛍光物質の蛍光強度を測定することで、前記増幅産物を定量でき、間接的に、目的の癌マーカーｍｉＲＮＡを定量できる。前記蛍光試薬としては、例えば、ＳＹＢＲ（商標）Ｇｒｅｅｎ等があげられる。前記蛍光試薬を使用する検出は、例えば、公知の方法により行える。具体的には、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲの場合、例えば、ＳＹＢＲ（商標）Ｇｒｅｅｎ　ＰＣＲマスターミックス（商品名、Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）等の市販試薬、ＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ　７９００　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（商品名、Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）等の市販検出機器を使用し、それらのマニュアルに従って、実施できる。
　前記増幅産物をリアルタイムで検出する場合、この他にも、標識プローブを共存させる方法等があげられる。前記標識プローブは、例えば、蛍光物質とクエンチャーとを有するプローブがあげられ、具体例としては、例えば、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ、ＲＮａｓｅを併用するサイクリングプローブ等があげられる。前記標識プローブは、例えば、単独では、前記クエンチャーによって前記蛍光物質の蛍光がクエンチングされ、二本鎖核酸の形成により、クエンチング効果が解除されて、蛍光を発する。このような標識化プローブを使用する方法は、例えば、公知の方法に従って行える。
　また、プローブを用いて、前記癌マーカーｍｉＲＮＡのｃＤＮＡを検出することもできる。前記プローブとしては、例えば、前記癌マーカーｍｉＲＮＡのｃＤＮＡまたはそれに相補的な配列にハイブリダイズ可能なプライマーがあげられる。この方法では、前記癌マーカーのｃＤＮＡと前記プローブとをハイブリダイズさせ、前記癌マーカーのｃＤＮＡにハイブリダイズした前記プローブを検出する。前記癌マーカーのｃＤＮＡにハイブリダイズした前記プローブの有無または量は、前記試料から回収したＲＮＡにおける前記癌マーカーｍｉＲＮＡの有無または量に相当する。このため、前記プローブの検出により、前記試料における前記癌マーカーｍｉＲＮＡの有無または量を、間接的に検出できる。前記プローブの検出は、公知の方法により行うことができ、例えば、後述する方法と同様である。
　また、前記試料からＲＮＡを回収する場合、例えば、前記回収したＲＮＡについて、直接的に、前記癌マーカーｍｉＲＮＡを検出してもよい。この場合、例えば、プローブを用いるハイブリダイゼーション法があげられる。前記プローブとしては、例えば、前記癌マーカーｍｉＲＮＡに特異的にハイブリダイズ可能なプローブが使用できる。この方法では、前記癌マーカーｍｉＲＮＡと前記プローブとをハイブリダイズさせ、前記癌マーカーｍｉＲＮＡにハイブリダイズした前記プローブを検出する。前記癌マーカーにハイブリダイズした前記プローブの有無または量は、前記試料から回収したＲＮＡにおける前記癌マーカーｍｉＲＮＡの有無または量に相当する。このため、前記プローブの検出により、前記試料における前記癌マーカーｍｉＲＮＡの有無または量を、間接的に検出できる。
　前記プローブの検出方法は、特に制限されない。具体例としては、例えば、前記プローブとして、標識物質で標識化した標識プローブを使用し、前記標識物質を検出することにより行える。
　前記標識物質は、例えば、それ自体が検出可能な物質が使用でき、発色物質、蛍光を発する蛍光物質、放射性物質等があげられる。前記発色物質の場合、例えば、発色の有無および発色の強弱によって、前記発色物質の有無および量を判断できる。前記発色物質は、例えば、それ自体が発色を示す物質でもよいし、酵素反応等によって、発色を示す物質を遊離する物質でもよいし、酵素反応または電子授受の反応によって、発色を示す物質に変化する物質であってもよい。前記蛍光物質の場合、例えば、蛍光の有無および蛍光の強弱によって、前記蛍光物質の有無および量を判断できる。前記蛍光物質は、例えば、それ自体が蛍光を発する物質でもよいし、酵素反応等によって、蛍光を発する物質を遊離する物質でもよいし、酵素反応または電子授受の反応によって、蛍光を発する物質に変化する物質であってもよい。前記放射性物質は、例えば、シンチレーションカウンターによる放射能レベルの測定またはオートラジオグラフィー法による像の有無および像の濃淡によって、前記標識物質の有無および量を判断できる。前記放射性物質で標識化したプローブを使用するハイブリダイゼーション法としては、例えば、ノーザンブロッティング法およびマイクロアレイ解析法があげられる。
　前記標識物質は、例えば、他の試薬によって検出可能な標識物質であってもよい。このような標識物質としては、例えば、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）等の酵素があげられる。前記標識物質が酵素の場合、例えば、前記他の試薬として、前記酵素反応またはそれに付随する電子授受等によって発色または蛍光を発する基質等を添加して、前記酵素との反応による発色または蛍光の有無、吸光度または蛍光強度を検出してもよい。前記基質は、特に制限されず、酵素の種類等によって適宜設定できる。具体例としては、ＡＰの場合、例えば、ブロモクロロインドリルリン酸（ＢＣＩＰ）、前記ＢＣＩＰとニロトブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）との組合せ等が使用でき、ＨＲＰの場合、例えば、３，３’－ジアミノベンジジン　テトラヒドロクロリド（ＤＡＢ）等が使用できる。
　前記他の試薬によって検出可能な標識物質は、この他に、例えば、ビオチンまたはアビジンがあげられ、好ましくは、ビオチンである。前記プローブがビオチンで標識化されている場合、例えば、前記他の試薬として、アビジンが結合した、前記酵素、前記発色物質、前記蛍光物質または前記放射性物質等を添加することが好ましい。前記プローブの標識物質であるビオチンは、アビジンと結合するため、アビジンに結合した前記酵素等を、前述の方法で検出すればよい。また、前記他の試薬は、例えば、アビジンとビオチンと前記酵素等との複合体、いわゆる、アビジン－ビオチンコンプレックスであってもよい。この方法は、いわゆるＡＢＣ（アビジン－ビオチンコンプレックス）法である。前記複合体によれば、例えば、ある複合体のアビジンと他の複合体のビオチンとが結合可能であり、１分子のプローブに結合する酵素等の分子数を増加できる。このため、より感度に優れる検出が可能となる。前記ビオチンは、例えば、ビオチン誘導体でもよく、前記アビジンは、例えば、ストレプトアビジン等のアビジン誘導体でもよい。
　さらに、前記癌マーカーｍｉＲＮＡにハイブリダイズした前記プローブの検出方法としては、例えば、前記プローブとして、抗原で標識化した標識プローブを使用し、抗原抗体反応を利用する方法があげられる。具体的には、例えば、前記抗原標識プローブに加えて、前記抗原に特異的に結合可能であり且つ標識物質で標識化された標識一次抗体を使用する方法がある。また、この他に、前記抗原に特異的に結合可能である一次抗体および前記一次抗体に特異的に結合可能であり且つ標識物質で標識化された標識二次抗体を使用する方法等があげられる。
　前者の標識一次抗体を使用する場合、例えば、まず、前記癌マーカーｍｉＲＮＡと前記抗原標識プローブとをハイブリダイズさせる。続いて、前記癌マーカーｍｉＲＮＡに結合した前記抗原標識プローブに、前記抗原を介して前記標識一次抗体を結合させる。そして、前記プローブに結合した前記標識化一次抗体の標識物質を検出する。これによって、前記癌マーカーｍｉＲＮＡにハイブリダイズした前記プローブを検出でき、結果的に、前記癌マーカーｍｉＲＮＡを間接的に検出できる。前記プローブを標識化する抗原の種類は、特に制限されないが、例えば、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）等があげられる。前記一次抗体は、特に制限されないが、例えば、前記抗原の種類に応じて適宜設定できる。前記抗原がＤＩＧの場合、例えば、抗ＤＩＧ抗体等が使用できる。前記標識一次抗体の標識物質は、特に制限されず、前述と同様である。
　後者の標識二次抗体を使用する方法は、いわゆるサンドイッチ法である。この方法は、例えば、まず、前記癌マーカーｍｉＲＮＡと前記抗原標識プローブとをハイブリダイズさせる。続いて、前記癌マーカーｍｉＲＮＡに結合した前記抗原標識プローブに、前記抗原を介して前記一次抗体を結合させる。さらに、前記プローブに結合した前記一次抗体に、前記標識二次抗体を結合させる。この結果、前記癌マーカーｍｉＲＮＡには、前記一次抗体を介して、前記標識二次抗体が結合する。そして、前記標識二次抗体の標識物質を検出する。これによって、前記癌マーカーｍｉＲＮＡにハイブリダイズした前記プローブを検出でき、結果的に、前記癌マーカーｍｉＲＮＡを間接的に検出できる。前記プローブを標識化する抗原の種類および前記一次抗体は、特に制限されず、前述と同様である。前記二次抗体の標識物質は、特に制限されず、前述と同様である。
　つぎに、前記試料について、直接的に、前記癌マーカーｍｉＲＮＡを検出する方法について、例をあげて説明する。
　本発明において、前記癌マーカーｍｉＲＮＡの検出は、例えば、前記試料における前記癌マーカーｍｉＲＮＡの発現領域を特定できることから、前記試料について、直接的に行うことが好ましい。この場合、前記試料は、固定化することが好ましい。前記癌マーカーｍｉＲＮＡの検出方法は、例えば、プローブを用いるハイブリダイゼーション法が好ましい。中でも、例えば、固定化した試料に対するｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法により、前記癌マーカーを検出することが好ましく、特に、抗原抗体反応を利用する免疫組織化学（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：ＩＨＣ）を適用することが好ましい。このような方法によれば、例えば、細胞質または核内を、前記癌マーカーｍｉＲＮＡにより染色することが可能である。前記プローブとしては、例えば、標識プローブが好ましく、前述と同様のものが使用できる。
　ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法は、例えば、公知の手法に従って行える。また、市販のキット等を用いて、その取扱説明書にしたがって行うこともできる。前記キットとしては、例えば、Ｖｅｎｔａｎａ社の商品名ＲｉｂｏＭａｐ　ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｋｉｔ等があげられる。
　ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法では、例えば、前記試料の切片スライドの作成、前記切片スライドの前処理、前記標識プローブのハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションシグナルの検出を行う。以下に、ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法の具体例を示すが、本発明はこれには制限されない。
　まず、前記試料である細胞または組織について、切片スライドを作製する。前記切片スライドは、前記試料を、固定液を用いて固定し、包埋した後、所望の厚みにカットして、スライド上に配置することで、作製できる。前記固定液としては、例えば、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド等の架橋剤；ＰＬＰ（ｐｅｒｉｏｄａｔｅ－ｌｙｓｉｎｅ－ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）；ザンボニ液；グルタルアルデヒド；エタノール、アセトン等の凝固沈澱剤があげられる。固定化方法は、例えば、未固定凍結切片、固定後凍結切片、固定後パラフィン包埋等のいずれの作製方法であってもよい。固定化の条件は、特に制限されないが、例えば、室温で、１時間以上行うことが好ましく、より好ましくは６時間以上である。
　つぎに、ハイブリダイゼーションに先立って、前記切片スライドを前処理する。前記前処理は、例えば、脱パラフィン処理、再水和、再度の固定化、酸処理、前記標識プローブの浸透性を向上するためのプロテイナーゼＫ処理等があげられる。さらに、前記プロテイナーゼＫの活性を止めるためのグリシンの添加または酢酸等の添加による、プローブの非特異的結合を防止するために、プラス電荷の中和処理等を行ってもよい。
　そして、前処理後の前記切片スライドに前記標識プローブを添加して、ハイブリダイゼーションを行い、前記標識プローブの標識物質に応じたハイブリダイゼーションシグナルの検出を行う。
　前記標識プローブの添加量は、特に制限されず、例えば、標識物質の種類、使用するプローブ全体における標識化の割合等によって、適宜設定できる。具体例としては、例えば、ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法で使用する一般的なスライド１枚あたり、１～１０００ｎｇであるが、これには何ら制限されない。
　ハイブリダイゼーションの条件は、特に制限されない。具体例として、例えば、ハイブリダイゼーション前の熱変性処理は、処理温度５０～１００℃、処理時間１～６０分が好ましく、より好ましくは処理温度６０～９５℃、処理時間５～１０分である。また、ハイブリダイゼーションは、処理温度４０～８０℃、処理時間１～３６時間が好ましく、より好ましくは処理温度４５～７０℃、処理時間４～２４時間である。
　つぎに、前記ハイブリダイゼーションのシグナル検出を行う。シグナル検出の方法は、特に制限されず、前述のように、例えば、前記標識プローブ、前記標識一次抗体または前記標識二次抗体の標識物質の種類に応じて、適宜決定できる。発色または蛍光を検出する場合、例えば、発色もしくは蛍光の有無、または、発色の濃淡もしくは蛍光の強弱から、前記試料における前記癌マーカーｍｉＲＮＡの有無または量を検出できる。前記発色または蛍光は、例えば、目視で判断してもよいし、画像処理によって判断してもよい。前記標識物質が放射性物質の場合、例えば、オートラジオグラフィー法を利用し、オートラジオグラフィー像における像の有無または像の濃淡から、前記試料における前記癌マーカーｍｉＲＮＡの有無または量を検出できる。前記像の有無または像の濃淡は、例えば、目視で判断してもよいし、画像処理によって判断してもよい。画像処理は、特に制限されず、公知のシステムまたはソフトウェアを使用して行える。
　前記癌マーカーｍｉＲＮＡの検出において、前述のようにプローブを使用する場合、前記プローブの配列は、特に制限されない。前記プローブは、例えば、前述の各癌マーカーｍｉＲＮＡのいずれかに特異的に結合可能なプローブがあげられる。前記プローブは、例えば、市販品を使用してもよいし、自家調製してもよい。前記プローブの配列は、例えば、前述した癌マーカーｍｉＲＮＡの塩基配列ならびに技術常識に基づいて、適宜設計可能である。具体例としては、検出目的の癌マーカーｍｉＲＮＡに相補的な配列からなるプローブまたは前記相補的な配列を含むプローブがあげられる。前記プローブの配列は、例えば、目的の癌マーカーｍｉＲＮＡに対して、約７０％以上相補的であることが好ましく、より好ましくは９０％以上相補的であり、特に１００％相補的であることが好ましい。
　前記プローブの構成単位としては、特に制限されず、例えば、公知の構成単位が採用できる。具体例として、例えば、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド等のヌクレオチド、ＰＮＡ、ＬＮＡ等の構成単位があげられる。前記ＬＮＡは、例えば、２',４'－Ｂｒｉｄｇｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ等のＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）等があげられる。前記構成単位における塩基は、特に制限されず、例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル等の天然塩基でもよいし、非天然塩基であってもよい。前記プローブの長さは、特に制限されないが、例えば、１０～１００塩基長であり、好ましくは、１５～４０塩基長である。
　前記プローブの具体例を以下に示すが、本発明は、これには制限されない。前記プローブとしては、この他にも、例えば、配列番号５で示す塩基配列の相補的配列からなるポリヌクレオチドがあげられる。
ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ検出用プローブ（配列番号５）
　　５’－ａｃａｇｇｃｃｇｇｇａｃａａｇｔｇｃａａｔａ－３’
　本発明の評価方法は、前記評価工程において、前述のようにして検出した前記癌マーカーｍｉＲＮＡの発現レベルに基づいて、前記試料の癌の可能性を評価する。
　前記癌マーカーの発現レベルは、例えば、前記試料における前記癌マーカーｍｉＲＮＡの発現の有無または発現量があげられる。前記発現量は、例えば、実際のｍｉＲＮＡの量でもよいし、実際のｍｉＲＮＡの量と相関関係にある値であってもよい。後者としては、例えば、前記癌マーカーｍｉＲＮＡの検出の際に得られるシグナル値等があげられる。前記シグナル値は、例えば、ｍｉＲＮＡの検出方法またはシグナル値の検出機器の種類等に応じて適宜決定できる。前記検出方法が、例えば、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法等のＰＣＲ法をはじめとする核酸増幅法を利用する場合、１μＬあたりのコピー数（ｃｏｐｉｅｓ／μＬ）等で表わすこともできる。また、後述するように、ｍｉＲＮＡを染色したｍｉＲＮＡ染色画像を用いる場合、例えば、発色または蛍光の明度もしくは彩度が、シグナル値に該当する。
　本発明の評価方法は、例えば、前述のように、前記固定化した試料について、前記癌マーカーｍｉＲＮＡの検出を行う場合、前記癌マーカーｍｉＲＮＡを可視化した切片スライドと、ＨＥ（ヘマトキシリン・エオシン）染色した切片スライドとを準備し、これらを照合することが好ましい。
　現在、病理医が、細胞または組織の癌化を判断する際には、ＨＥ染色画像が使用されている。しかし、ＨＥ染色によっては、例えば、ボーダーラインの病変の判断、１個または２個の細胞での判断が困難という問題がある。そこで、同じ試料の切片スライドについて、ＨＥ染色と癌マーカーｍｉＲＮＡの可視化とを行い、両者を照合する。そして、ＨＥ染色から判断される腫瘍領域と、前記可視化された癌マーカーｍｉＲＮＡの陽性領域とを照合することで、癌を、より高い信頼性で判断できる。陽性とは、例えば、前記癌マーカーが存在することを意味し、陰性とは、例えば、前記癌マーカーが存在しない、または、検出限界以下であることを意味する。
　前記癌マーカーｍｉＲＮＡを可視化した切片スライドと、ＨＥ染色した切片スライドとを照合して、癌を判断する方法は、特に制限されないが、例えば、以下のようにして行える。まず、後述するように、隣接する切片スライドについて、前記ＨＥ染色とｍｉＲＮＡの可視化とを行う。他方、ＨＥ染色した切片スライドについては、例えば、顕微鏡観察等により、腫瘍領域を決定する。そして、前記ＨＥ染色の切片スライドと、癌マーカーを可視化した切片スライドとを照合する。その結果、例えば、前記ＨＥ染色の切片スライドにおける腫瘍領域と、前記癌マーカーを可視化した切片スライドにおける癌マーカー陽性領域とが重複する場合、前記腫瘍領域および癌マーカー陽性領域は、癌と判断できる。
　このように、前記試料について、前記癌マーカーｍｉＲＮＡの可視化だけでなく、ＨＥ染色も行う場合、前記癌マーカーｍｉＲＮＡ検出用の切片スライドと、前記ＨＥ染色用の切片スライドとは、固定および包埋された試料から切り出した、隣接する切片であることが好ましく、具体的には、連続する切片が好ましい。これによって、より正確に、前記両画像を照合できる。
　可視化した前記癌マーカーｍｉＲＮＡと前記ＨＥ染色との照合は、例えば、画像の照合により行うことが好ましい。すなわち、前記固定化した試料について、癌マーカー可視化画像と、ＨＥ染色画像とを準備し、これらを照合することが好ましい。前記画像は、例えば、前記癌マーカーｍｉＲＮＡにより可視化した前記固定化試料および前記ＨＥ染色により可視化した前記固定化試料を、ＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ　Ｃｏｕｐｌｅｄ　Ｄｅｖｉｃｅ　Ｉｍａｇｅ　Ｓｅｎｓｏｒ）またはスキャナ等により、デジタル画像化できる。
　このように、画像を使用すれば、より簡便且つ正確に、両者の照合ならびに癌の判断を行える。また、画像データの蓄積によって、より一層信頼性に優れた評価が可能となる。
　前記癌マーカーｍｉＲＮＡの可視化画像と、ＨＥ染色画像とを照合して、癌を判断する方法は、特に制限されないが、例えば、以下のように行える。まず、前述のように、隣接する切片スライドについて、前記ＨＥ染色と前記癌マーカーｍｉＲＮＡの可視化とを行い、ＨＥ染色画像と癌マーカー可視化画像とを準備する。そして、前記ＨＥ染色画像について、腫瘍領域を決定し、前記ＨＥ染色画像と前記癌マーカー可視化画像とを照合する。その結果、前記ＨＥ染色画像における腫瘍領域と、前記癌マーカー可視化画像における癌マーカーｍｉＲＮＡの陽性領域とが重複する場合は、前記腫瘍領域および前記癌マーカー陽性領域は、癌と判断できる。また、前記ＨＥ染色画像において腫瘍領域が確認されず、且つ、前記癌マーカー可視化画像において癌マーカーｍｉＲＮＡが陰性の場合、癌ではないと判断できる。さらに、前記ＨＥ染色画像の腫瘍領域と、前記癌マーカー可視化画像の前記癌マーカー陽性領域とが重複しない場合は、例えば、最終判断は病理医に委託し、このデータを蓄積データとして保存し、今後の判定に備えることもできる。
　本発明において、前記癌マーカーｍｉＲＮＡであるｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａおよびｈｓａ－ｍｉＲ－４９４は、例えば、細胞および組織において、癌化にともなって、発現レベルが増加することが明らかとなった。このことから、前記癌マーカーｍｉＲＮＡは、例えば、癌の発症前と比較して癌の発症後の発現レベルが有意に増加する、前臨床期前と比較して前臨床期の発現レベルが有意に増加する、臨床期前と比較して臨床期の発現レベルが有意に増加する、初期段階前と比較して初期段階の発現レベルが有意に増加する、初期段階と比較して初期段階以後の発現レベルが有意に増加する、と解される。このため、本発明の評価方法は、例えば、前記評価工程において、前記癌マーカーｍｉＲＮＡの発現レベルから、例えば、下記（１）、（２）および（３）からなる群から選択された少なくとも一つの方法により、癌の可能性を決定する工程を含んでもよい。本発明において、「正常者」とは、例えば、評価対象の癌を発症していると判断されていない者、または、前記癌を発症している可能性があると判断されていない者を意味する。他方、「患者」とは、例えば、評価対象の癌を発症していると判断されている者を意味する。
（１）被検者の試料における前記癌マーカーｍｉＲＮＡの発現レベルを、正常者の試料における前記癌マーカーｍｉＲＮＡの発現レベルと比較し、前記正常者の発現レベルよりも高い場合に、前記被検者は、前記癌の可能性が高いと決定する。
（２）被検者の試料における前記癌マーカーｍｉＲＮＡの発現レベルを、正常者の試料における前記癌マーカーｍｉＲＮＡの発現レベルと比較し、前記正常者の発現レベルよりも相対的に高い程、前記被検者は、前記癌が相対的に進行していると決定する。
（３）被検者の試料における前記癌マーカーｍｉＲＮＡの発現レベルを、進行期別の各患者の試料における前記癌マーカーｍｉＲＮＡの発現レベルと比較し、前記被検者は、同程度の発現レベルを示す患者と同じ進行期であると決定する。
　前記（１）および（２）における正常者の癌マーカーｍｉＲＮＡの発現レベルは、例えば、前記正常者から採取した試料を用いて決定できる。前記（３）における各患者の癌マーカーｍｉＲＮＡの発現レベルは、例えば、進行期ごとに患者を分類し、各進行期の患者から採取した試料を用いて決定できる。また、前記（１）～（３）における正常者および患者の発現レベルは、例えば、予め、決定してもよく、評価の度に決定する必要はない。前記（１）～（３）における正常者および患者の試料は、例えば、前記被検者の試料と同じ種類の試料であることが好ましい。また、前記正常者および患者の試料は、例えば、前記被検体の試料と同様の方法および条件で調製した試料であることが好ましい。前記正常者または患者の前記癌マーカーｍｉＲＮＡの発現レベルは、例えば、１名の正常者または１名の患者の発現レベルであってもよいし、複数人の正常者または複数人の患者の発現レベルから、統計学的手法により算出した発現レベルであってもよい。
　前記（１）の方法では、前述のように、前記被検者の発現レベルが、前記正常者の発現レベルよりも高ければ、前記被検者について、癌の可能性が高いと判断できる。一方、前記被検者の発現レベルが、前記正常者の発現レベルと同等またはそれよりも低い場合には、前記被検者について、癌の可能性は低いと判断できる。癌の可能性とは、例えば、癌化している可能性または癌に罹患している可能性ともいえる。
　前記（２）の方法では、前述のように、前記被検者の発現レベルが、前記正常者の発現レベルよりも相対的に高い程、前記被検者は、前記癌が相対的に進行していると判断できる。また、前記被検者の発現レベルが、前記正常者の発現レベルよりも高い場合であっても、その差が小さい程、前記癌が相対的に進行していないと判断できる。
　前記（３）の方法では、例えば、進行期別の各患者について発現レベルを決定する。前記各患者の発現レベルと前記被検者の発現レベルとの対比により、前記被検者の癌化の可能性だけでなく、その癌の進行期を評価可能である。
　前記（１）～（３）において、前記被検者と前記正常者または前記患者との発現レベルを比較する場合、その有意差は、例えば、Ｔ－ｔｅｓｔ（ｔ検定）、Ｆ検定、カイ二乗検定等の統計学的手法により判断できる。
　このような評価方法によれば、例えば、従来、判断が困難であった癌の前臨床期の被検者についても、高い信頼性で、癌の可能性が高いと判断できる。また、例えば、癌の進行期についても、高い信頼性で判断できる。このため、癌の予防および治療において、例えば、投薬または手術等の方針を決定するための重要な情報を、高い信頼性で得ることができる。
　また、本発明の評価方法は、例えば、染色陽性細胞の含有率の算出により、癌を評価できる。前記染色陽性細胞とは、例えば、前記癌マーカーを有する細胞であって、前記癌マーカーの染色により染色された細胞を意味する。この場合、本発明の評価方法は、例えば、前記癌マーカー検出工程において、前記固定化した試料について、前記癌マーカーを染色した癌マーカー染色画像を取得する。そして、さらに、前記固定化した試料について、ＨＥ染色画像を取得するＨＥ染色画像取得工程、
前記ＨＥ染色画像における腫瘍領域の情報を取得する情報取得工程、
前記ＨＥ画像取得工程において取得された前記ＨＥ染色画像と、前記癌マーカー検出工程において取得された前記癌マーカー染色画像とのマッチング位置を算出するマッチング工程、
前記情報取得工程において取得された前記ＨＥ染色画像における腫瘍領域の情報および前記マッチング工程において算出された前記マッチング位置の情報に基づいて、前記癌マーカー染色画像における腫瘍領域を特定する特定工程、および、
前記特定工程において特定された前記癌マーカー染色画像における腫瘍領域の情報に基づいて、前記腫瘍領域内の染色陽性細胞を検出する染色陽性細胞検出工程を含むことが好ましい。
　前記染色陽性細胞検出工程は、例えば、前記特定工程において特定された前記癌マーカー染色画像における腫瘍領域の情報に基づいて、前記腫瘍領域内の染色陽性細胞含有率を算出する算出工程であってもよい。前記癌マーカー染色画像は、例えば、前記癌マーカーｍｉＲＮＡを、発色により可視化した画像でもよいし、発光により可視化した画像であってもよい。
　前述のように、ＨＥ染色画像との照合を行う癌の評価は、例えば、後述する癌病理画像診断支援方法により行える。この方法は、例えば、後述する、癌病理画像診断支援システム、癌病理画像診断支援プログラムまたは癌病理画像診断支援装置の実行によって実現できる。これらの詳細については、後述する。
＜評価試薬＞
　本発明の評価試薬は、前述のように、本発明の評価方法に使用するための評価試薬であって、本発明の癌マーカーの検出試薬、すなわち、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２およびｈｓａ－ｍｉＲ－４９４の少なくとも一方のｍｉＲＮＡを検出するためのｍｉＲＮＡ検出試薬を含むことを特徴とする。このような評価試薬によれば、本発明の評価方法を簡便に実施できる。
　本発明は、前述のように、癌マーカーｍｉＲＮＡとして、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２およびｈｓａ－ｍｉＲ－４９４の少なくとも一方を検出することが特徴であって、これらのｍｉＲＮＡの検出方法は何ら制限されない。本発明の評価試薬に含まれる前記ｍｉＲＮＡ検出試薬は、これらの癌マーカーｍｉＲＮＡのいずれかを検出できればよく、例えば、その試薬の種類および組成等は、何ら制限されない。また、当業者であれば、技術常識に基づいて、これらの癌マーカーｍｉＲＮＡの検出試薬を設定できる。
　前記ｍｉＲＮＡ検出試薬は、特に制限されないが、例えば、前述のような、前記癌マーカーｍｉＲＮＡのうちいずれかにハイブリダイズ可能なプローブがあげられる。前記プローブは、前述のような標識プローブであってもよい。また、ｍｉＲＮＡの検出方法および前記標識プローブの標識物質の種類等に応じて、さらに、その他の試薬を含んでもよい。
　本発明の評価試薬は、例えば、ｍｉＲＮＡの検出方法に応じて、さらに、酵素、緩衝液、洗浄液、溶解液、分散液、希釈液等を含んでもよい。また、本発明の評価試薬の形態は、特に制限されず、例えば、液体状態のウェット系であってもよいし、乾燥状態のドライ系であってもよい。
＜評価キット＞
　本発明の評価キットは、前述のように、本発明の評価方法に使用するための評価キットであって、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２およびｈｓａ－ｍｉＲ－４９４の少なくとも一方のｍｉＲＮＡを検出するｍｉＲＮＡ検出試薬を含むことを特徴とする。前記ｍｉＲＮＡ検出試薬は、例えば、前記本発明の評価試薬があげられ、前述の通りである。このような評価キットによれば、本発明の評価方法を簡便に行える。
　本発明の評価キットの形態は、特に制限されず、例えば、液体状態のウェット系でもよいし、乾燥状態のドライ系であってもよい。本発明の評価キットにおいて、各種試薬は、例えば、それぞれ別個であり、使用時に併用してもよいし、使用時前から混合されてもよい。本発明の評価キットは、例えば、使用説明書を含む。
＜癌病理画像に基づく診断支援＞
　本発明は、癌の病理画像に基づく診断を支援するためのシステム、プログラム、方法および装置であって、下記に示す第１の形態および第２の形態があげられる。
第１の形態
　本発明は、癌の病理画像に基づく診断を支援する、癌病理画像診断支援システム（以下、画像診断支援システムという）であって、
診断対象となる前記病理画像として、ＨＥ染色画像および癌マーカー染色画像を取得する画像取得手段と、
前記ＨＥ染色画像における腫瘍領域の情報を取得する情報取得手段と、
前記画像取得手段により取得された、前記ＨＥ染色画像と前記癌マーカー染色画像とのマッチング位置を算出するマッチング手段と、
前記情報取得手段により取得された前記ＨＥ染色画像における腫瘍領域の情報および前記マッチング手段により算出された前記マッチング位置の情報に基づいて、前記癌マーカー染色画像における腫瘍領域を特定する特定手段と、
前記特定手段により特定された前記癌マーカー染色画像における腫瘍領域の情報に基づいて、前記腫瘍領域内の染色陽性細胞を検出する染色陽性細胞検出手段とを備えることを特徴とする。
　前記染色陽性細胞検出手段は、例えば、前記特定手段により特定された前記癌マーカー染色画像における腫瘍領域の情報に基づいて、前記腫瘍領域内の染色陽性細胞含有率を算出する算出手段であってもよい（以下、同様）。
　前記算出手段は、前記染色陽性細胞含有率に加えて、染色強度を算出することが好ましい。前記染色強度は、例えば、前記癌マーカー染色画像における腫瘍領域内の染色強度があげられる。
　本発明の画像診断支援システムは、さらに、
診断対象となる前記病理画像の指定情報と検査種別の指定情報との入力を受け付ける入力受付手段と、
前記ＨＥ染色画像および前記癌マーカー染色画像が格納された染色画像データベースとを備え、
前記画像取得手段は、前記指定情報に基づいて、前記染色画像データベースから前記ＨＥ染色画像および前記癌マーカー染色画像を取得することが好ましい。
　本発明の画像診断支援システムにおいて、
前記病理画像の指定情報は、前記ＨＥ染色画像の画像識別子であり、
前記画像取得手段は、前記染色画像データベースから、前記画像識別子を持つ前記ＨＥ染色画像と前記ＨＥ染色画像に隣接する前記癌マーカー染色画像とを取得することが好ましい。
　本発明の画像診断支援システムにおいて、
前記病理画像の指定情報は、前記癌マーカー染色画像の画像識別子であり、
前記画像取得手段は、前記染色画像データベースから、前記画像識別子を持つ前記癌マーカー染色画像と前記癌マーカー染色画像に隣接する前記ＨＥ染色画像とを取得することが好ましい。
　本発明の画像診断支援システムにおいて、
前記病理画像の指定情報は、診断対象者の被検者識別子であり、
前記画像取得手段は、前記染色画像データベースから、前記被検者識別子を持つ前記ＨＥ染色画像と前記癌マーカー染色画像とを取得することが好ましい。
　本発明の画像診断支援システムにおいて、
前記染色画像データベースには、前記ＨＥ染色画像における腫瘍領域の情報も格納されており、
前記情報取得手段は、前記染色画像データベースから、前記ＨＥ染色画像における腫瘍領域の情報を取得することが好ましい。
　本発明の画像診断支援システムは、さらに、前記画像取得手段により取得された前記ＨＥ染色画像における腫瘍領域の算出を行う腫瘍領域算出手段を備え、
前記情報取得手段は、前記腫瘍領域算出手段により算出された前記ＨＥ染色画像における腫瘍領域の情報を取得することが好ましい。
　本発明の画像診断支援システムは、さらに、
診断対象となるスライドのスライド識別子と検査種別の指定情報との入力を受け付ける入力受付手段と、
前記スライドが格納されたスライドデータベースと、
前記スライド識別子を持つ前記スライドを前記スライドデータベースから取得するスライド取得手段とを備え、
前記画像取得手段は、前記スライド取得手段により取得された前記スライドを撮影することにより、前記ＨＥ染色画像および前記癌マーカー染色画像を取得することが好ましい。
　本発明は、癌の病理画像に基づく診断を支援する、画像診断支援システムであって、
端末とサーバとを有し、
前記端末およびサーバは、システム外の通信網を介して接続可能であり、
前記端末は、
前記端末内の情報を前記通信網を介して前記サーバに送信する端末側送信手段と、
前記サーバから送信された情報を前記通信網を介して受信する端末側受信手段とを有し、
前記サーバは、
前記サーバ内の情報を前記通信網を介して前記端末に送信するサーバ側送信手段と、
前記端末から送信された情報を前記通信網を介して受信するサーバ側受信手段と、
診断対象となる前記病理画像として、ＨＥ染色画像および前記癌マーカー染色画像を取得する画像取得手段と、
前記ＨＥ染色画像における腫瘍領域の情報を取得する情報取得手段と、
前記画像取得手段により取得された、前記ＨＥ染色画像と前記癌マーカー染色画像とのマッチング位置を算出するマッチング手段と、
前記情報取得手段により取得された前記ＨＥ染色画像における腫瘍領域の情報および前記マッチング手段により算出された前記マッチング位置の情報に基づいて、前記癌マーカー染色画像における腫瘍領域を特定する特定手段と、
前記特定手段により特定された前記癌マーカー染色画像における腫瘍領域の情報に基づいて、前記腫瘍領域内の染色陽性細胞を検出する染色陽性細胞検出手段とを有し、
前記病理画像の情報が、前記端末側送信手段から前記サーバ側受信手段に送信され、かつ、前記サーバの前記染色陽性細胞検出手段により検出された染色陽性細胞の情報が、前記サーバ側送信手段から前記端末側受信手段に送信されることを特徴とする。
　本発明の画像診断支援システムにおいて、前記染色陽性細胞検出手段は、例えば、前記特定手段により特定された前記癌マーカー染色画像における腫瘍領域の情報に基づいて、前記腫瘍領域内の染色陽性細胞含有率を算出する算出手段であってもよい。この場合、例えば、前記サーバの前記算出手段により算出した染色陽性細胞含有率の情報が、前記サーバ側送信手段から前記端末側受信手段に送信される。
　本発明は、前記本発明の画像診断支援システムに用いるサーバであって、
前記サーバは、
前記サーバ内の情報を前記通信網を介して端末に送信するサーバ側送信手段と、
前記端末から送信された情報を前記通信網を介して受信するサーバ側受信手段と、
診断対象となる前記病理画像として、ＨＥ染色画像および癌マーカー染色画像を取得する画像取得手段と、
前記ＨＥ染色画像における腫瘍領域の情報を取得する情報取得手段と、
前記画像取得手段により取得された、前記ＨＥ染色画像と前記癌マーカー染色画像とのマッチング位置を算出するマッチング手段と、
前記情報取得手段により取得された前記ＨＥ染色画像における腫瘍領域の情報および前記マッチング手段により算出された前記マッチング位置の情報に基づいて、前記癌マーカー染色画像における腫瘍領域を特定する特定手段と、
前記特定手段により特定された前記癌マーカー染色画像における腫瘍領域の情報に基づいて、前記腫瘍領域内の染色陽性細胞を検出する染色陽性細胞検出手段とを有することを特徴とする。
　本発明のサーバにおいて、前記染色陽性細胞検出手段は、例えば、前記特定手段により特定された前記癌マーカー染色画像における腫瘍領域の情報に基づいて、前記腫瘍領域内の染色陽性細胞含有率を算出する算出手段であってもよい。
　本発明は、本発明の画像診断支援システムに用いる端末であって、
前記端末内の情報を前記通信網を介して前記サーバに送信する端末側送信手段と、
前記サーバから送信された情報を前記通信網を介して受信する端末側受信手段とを有し、
前記病理画像の情報が、前記端末側送信手段から前記サーバ側受信手段に送信され、かつ、前記サーバの前記染色陽性細胞検出手段により検出された染色陽性細胞の情報が、前記サーバ側送信手段から前記端末側受信手段に送信されることを特徴とする。
　また、例えば、前記サーバの前記算出手段により算出した染色陽性細胞含有率の情報が、前記サーバ側送信手段から前記端末側受信手段に送信されてもよい。
　本発明は、癌の病理画像に基づく診断を支援する、癌病理画像診断支援方法（以下、画像診断支援方法という）であって、
診断対象となる前記病理画像として、ＨＥ染色画像および癌マーカー染色画像を取得する画像取得工程と、
前記ＨＥ染色画像における腫瘍領域の情報を取得する情報取得工程と、
前記画像取得工程において取得された、前記ＨＥ染色画像と前記癌マーカー染色画像とのマッチング位置を算出するマッチング工程と、
前記情報取得工程において取得された前記ＨＥ染色画像における腫瘍領域の情報および前記マッチング工程において算出された前記マッチング位置の情報に基づいて、前記癌マーカー染色画像における腫瘍領域を特定する特定工程と、
前記特定工程において特定された前記癌マーカー染色画像における腫瘍領域の情報に基づいて、前記腫瘍領域内の染色陽性細胞を検出する染色陽性細胞検出工程とを含むことを特徴とする。
　本発明の画像診断支援方法において、前記染色陽性細胞検出工程は、例えば、前記特定工程において特定された前記癌マーカー染色画像における腫瘍領域の情報に基づいて、前記腫瘍領域内の染色陽性細胞含有率を算出する算出工程であってもよい（以下、同様）。
　本発明の画像診断支援方法において、前記算出工程は、前記染色陽性細胞含有率に加えて、染色強度を算出することが好ましい。前記染色強度は、例えば、前記癌マーカー染色画像における腫瘍領域内の染色強度があげられる。
　本発明の画像診断支援方法において、前記画像取得工程は、例えば、診断対象となる前記病理画像の指定情報に基づいて、前記ＨＥ染色画像および前記癌マーカー染色画像を取得することが好ましい。前記ＨＥ染色画像および前記癌マーカー染色画像は、例えば、前記ＨＥ染色画像および前記癌マーカー染色画像が格納された染色画像データベースから取得することが好ましい。
　本発明の画像診断支援方法において、前記病理画像の指定情報は、前記ＨＥ染色画像の画像識別子であることが好ましい。そして、前記画像取得工程は、例えば、前記染色画像データベースから、前記画像識別子を持つ前記ＨＥ染色画像と前記ＨＥ染色画像に隣接する前記癌マーカー染色画像とを取得することが好ましい。
　本発明の画像診断支援方法において、前記病理画像の指定情報は、前記癌マーカー染色画像の画像識別子であることが好ましい。そして、前記画像取得工程は、例えば、前記染色画像データベースから、前記画像識別子を持つ前記癌マーカー染色画像と前記癌マーカー染色画像に隣接する前記ＨＥ染色画像とを取得することが好ましい。
　本発明の画像診断支援方法において、前記病理画像の指定情報は、診断対象者の被検者識別子であることが好ましい。そして、前記画像取得工程は、例えば、前記染色画像データベースから、前記被検者識別子を持つ前記ＨＥ染色画像と前記癌マーカー染色画像とを取得することが好ましい。
　本発明の画像診断支援方法において、前記染色画像データベースには、前記ＨＥ染色画像における腫瘍領域の情報も格納されていることが好ましい。そして、前記情報取得工程は、例えば、前記染色画像データベースから、前記ＨＥ染色画像における腫瘍領域の情報を取得することが好ましい。
　本発明の画像診断支援方法は、さらに、前記画像取得工程において取得された前記ＨＥ染色画像における腫瘍領域の算出を行う腫瘍領域算出工程を含むことが好ましい。そして、前記情報取得工程は、前記腫瘍領域算出工程において算出された前記ＨＥ染色画像における腫瘍領域の情報を取得することが好ましい。
　また、本発明は、癌の病理画像に基づく診断を支援する、癌病理画像診断支援プログラム（以下、画像診断支援プログラムという）であって、前記本発明の画像診断方法を、コンピュータで実行可能なことを特徴とする。
　本発明の画像診断支援プログラムは、例えば、診断対象となる前記病理画像として、ＨＥ染色画像および癌マーカー染色画像を取得する画像取得工程と、
前記ＨＥ染色画像における腫瘍領域の情報を取得する情報取得工程と、
前記画像取得工程において取得された、前記ＨＥ染色画像と前記癌マーカー染色画像とのマッチング位置を算出するマッチング工程と、
前記情報取得工程において取得された前記ＨＥ染色画像における腫瘍領域の情報および前記マッチング工程において算出された前記マッチング位置の情報に基づいて、前記癌マーカー染色画像における腫瘍領域を特定する特定工程と、
前記特定工程において特定された前記癌マーカー染色画像における腫瘍領域の情報に基づいて、前記腫瘍領域内の染色陽性細胞を検出する染色陽性細胞検出工程とを、コンピュータに実行させることを特徴とする。
　本発明の画像診断支援プログラムにおいて、前記染色陽性細胞検出工程は、例えば、前記特定工程において特定された前記癌マーカー染色画像における腫瘍領域の情報に基づいて、前記腫瘍領域内の染色陽性細胞含有率を算出する算出工程であってもよい。
　これらの支援システム、支援方法および支援プログラムによれば、例えば、最終的に、染色陽性細胞含有率を定量値として得ることもできる。
　以下に、前記本発明の第１の形態について、具体的に、実施形態１Ａ～１Ｄを例にあげて説明する。以下、前記癌マーカー染色画像を、「ｍｉＲＮＡ染色画像」ともいう。なお、本発明は、これらの実施形態には制限されない。
（実施形態１Ａ）
　図１９は、本発明の画像診断支援システムを備える画像診断支援装置の構成の一例を示すブロック図である。同図に示すように、画像診断支援装置１９０は、処理部１９１および記憶部１９２を備える。画像診断支援装置１９０は、処理部１９１において、顕微鏡１９３に接続されたＣＣＤ１９４、スキャナ１９５およびディスプレイ１９６に、接続されている。画像診断支援装置１９０は、例えば、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　Ｕｎｉｔ）、ＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ　Ａｃｃｅｓｓ　Ｍｅｍｏｒｙ）、入力部、ドライブ、入出力インターフェース（Ｉ／Ｆ）、通信バス等を備える。ＣＰＵは、画像診断支援装置の全体の制御を担う。ＣＰＵに、例えば、前記各手段の各機能を提供するコンピュータプログラムを組み込むことで、画像診断支援装置１９０における前記各手段を構築でき、画像診断支援装置１９０を実現できる。また、画像診断支援装置１９０は、その動作を、前記各手段の機能を実現するコンピュータプログラムを組み込んだ、ＬＳＩ（Ｌａｒｇｅ　Ｓｃａｌｅ　Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）等のハードウェア部品からなる回路部品を実装して、実現することもできる。このようなコンピュータプログラムは、これを格納した記録媒体等の形態であってもよい。前記記録媒体は、例えば、ＨＤＤ、ＦＤ、ＣＤ－ＲＯＭ（ＣＤ－Ｒ、ＣＤ－ＲＷ）、ＭＯ、ＤＶＤ、メモリーカード等があげられる。また、記憶部１９２は、例えば、ＲＯＭ、ＨＤＤ、ＨＤ等である。ＨＤＤは、例えば、ＣＰＵの制御下、ＨＤに対するデータの読み込みと書き込みを制御し、ＨＤは、例えば、ＨＤＤの制御下、書き込まれたデータを記憶する。
　ディスプレイ１９６は、例えば、画像、データ、文書等の各種情報を表示する。入力部は、例えば、キーボードやマウス等がある。スキャナ１９５は、例えば、前述の切片スライドをスキャニングして、画像を光学的に電気信号に変換する。また、ＣＣＤ１９４は、例えば、前記切片スライドの顕微鏡画像を電気信号に変換する。
　画像診断支援装置１９０は、例えば、染色画像に関する情報を蓄積する外部の染色画像データベースと、アクセス可能であってもよい。この場合、画像診断支援装置１９０は、例えば、通信回線を介して、前記染色画像データベースと接続してもよい。
　本発明の画像診断支援システムの一例を、以下に説明する。図２０は、本実施形態における画像診断支援システムの構成の概略を示すブロック図である。なお、本発明は、この実施形態には制限されない。
　図２０に示すように、本実施形態の画像診断支援システムは、ＨＥ染色画像およびｍｉＲＮＡ染色画像を取得する画像取得手段２００１、ＨＥ染色画像における腫瘍領域の情報を取得する情報取得手段２００２、画像取得手段により取得されたＨＥ染色画像とｍｉＲＮＡ染色画像とのマッチング位置を算出するマッチング手段２００３、情報取得手段により取得されたＨＥ染色画像における腫瘍領域の情報およびマッチング手段により算出されたマッチング位置の情報に基づいて、ｍｉＲＮＡ染色画像における腫瘍領域を特定する特定手段２００４、および、特定手段により特定されたｍｉＲＮＡ染色画像における腫瘍領域の情報に基づいて、前記腫瘍領域内の染色陽性細胞含有率を算出する算出手段２００５を備える。
　前記画像診断支援システムは、さらに、ｍｉＲＮＡ染色画像について、ｍｉＲＮＡの染色レベルを決定する染色レベル決定手段を備えてもよい。前記染色レベル決定手段は、例えば、ｍｉＲＮＡ染色画像の特定された腫瘍領域における染色レベルを決定する。
　このようなシステムは、前記図１９に示すような画像診断支援装置があげられる。また、各構成手段は、例えば、コンピュータのＣＰＵが所定のプログラムを実行することによって実現される機能的ブロックであればよい。このため、例えば、各構成手段が、ハードウェアとして実装されていなくともよく、ネットワークシステムであってもよい。本実施形態の画像診断支援システムは、特に示さない限り、例えば、後述する実施形態１Ｂ～１Ｅと同様である。
　図２１を用いて、本実施形態の画像診断支援システムにおける処理の流れの一例を説明する。図２１は、前記処理の流れを示すフローチャートである。この処理は、本発明の画像診断方法の一例であり、例えば、本発明の画像診断支援システム、画像診断支援プログラム等により実行できる。
　まず、ＨＥ染色画像とｍｉＲＮＡ染色画像とが取得される（ステップＳ２１０１）。前記画像は、例えば、スキャナやＣＣＤ等の撮像素子により変換された電気信号として取得できる。
　つぎに、前記ＨＥ染色画像について、腫瘍領域情報を取得する（Ｓ２１０２）。前記ＨＥ染色画像における腫瘍領域の情報は、例えば、医師等によって判定された情報でもよいし、公知の方法によって算出された情報であってもよい。
　つぎに、前記ＨＥ染色画像と前記ｍｉＲＮＡ染色画像とを重ね合わせてマッチングを行い、マッチング位置を算出する（Ｓ２１０３）。そして、前記ＨＥ染色画像の腫瘍領域情報と、得られたマッチング位置情報とから、前記ｍｉＲＮＡ染色画像における腫瘍領域を算出する。つまり、前記ｍｉＲＮＡ染色画像において、前記ＨＥ染色画像における腫瘍領域と対応する領域とを算出し、腫瘍領域として特定する（Ｓ２１０４）。前記ＨＥ染色画像の情報に基づいて特定される、前記ｍｉＲＮＡ染色画像における腫瘍領域を、以下、「ＨＥ染色画像に基づく腫瘍領域」ともいう。
　つづいて、前記ｍｉＲＮＡ染色画像の前記ＨＥ染色画像に基づく腫瘍領域におけるｍｉＲＮＡ染色レベルを決定する（Ｓ２１０５）。前記ｍｉＲＮＡ染色レベルについては、例えば、各スライドにおいて、染色のプロセス、温度、プローブの種類、発色物質または蛍光物質の種類等に応じて、染色の程度が異なるため、画像の標準化を行うことが好ましい。この際、前記ｍｉＲＮＡ染色画像において、前記ＨＥ染色画像に基づく腫瘍領域以外の領域についても、同様に、ｍｉＲＮＡ染色レベルを決定してもよい。
　そして、このステップで得られた染色画像の情報は、前述のような、染色画像データベースに蓄積される（Ｓ２１０６）。
　つぎに、決定したｍｉＲＮＡ染色レベルに基づき、再度、前記ｍｉＲＮＡ染色画像について、腫瘍領域を検出する（Ｓ２１０７）。つまり、前記ｍｉＲＮＡ染色画像の染色レベルについて、腫瘍細胞を意味するレベルの染色であるか、腫瘍細胞を意味するレベルに満たない染色であるかを判断する。そして、前者の染色レベルを示す領域を、ｍｉＲＮＡ染色レベルに基づく腫瘍領域として特定する。その結果、前記ＨＥ染色画像に基づく腫瘍領域と前記ｍｉＲＮＡ染色レベルに基づく腫瘍領域とが重複する場合、前記ｍｉＲＮＡ染色レベルに基づく腫瘍領域を、検出対象領域とする。また、前記ＨＥ染色画像においては腫瘍領域と判断されず、前記ｍｉＲＮＡ染色レベルに基づき腫瘍領域と判断された場合も、前記ｍｉＲＮＡ染色レベルに基づく腫瘍領域を、検出対象領域とする。
　腫瘍を意味するレベルの染色と、腫瘍を意味するレベルに満たない染色との閾値は、例えば、前記ｍｉＲＮＡ染色画像について、染色の強度を複数のレベルで検出することによって決定できる。これにより、例えば、非腫瘍細胞が弱いながらも染色されている場合でも、それが腫瘍細胞の染色には該当しないと判断できる。また、染色画像の情報として、例えば、前記閾値のデータについても、前記染色画像データベースに蓄積される。
　以上のようにして決定された検出対象領域を、決定した癌領域として出力する。または、前記検出対象領域について、染色陽性細胞含有率を算出し、その結果を出力する。
　前記染色画像データベースに、ｍｉＲＮＡ染色画像の情報が蓄積された場合は、例えば、ＨＥ染色画像とのマッチングを行うことなく、前記データベースに基づいて、ｍｉＲＮＡ染色画像における腫瘍領域を決定することもできる。
（実施形態１Ｂ）
　図１は、本発明の画像診断支援システムの一例を示すブロック図である。このシステムは、癌の病理画像に基づく診断を支援するシステムである。前記システムは、診断対象となる病理画像として、ＨＥ染色画像およびｍｉＲＮＡ染色画像を取得する画像取得手段と、ＨＥ染色画像における腫瘍領域の情報を取得する情報取得手段と、画像取得手段により取得されたＨＥ染色画像とｍｉＲＮＡ染色画像とのマッチング位置を算出するマッチング手段と、情報取得手段により取得されたＨＥ染色画像における腫瘍領域の情報およびマッチング手段により算出されたマッチング位置の情報に基づいて、ｍｉＲＮＡ染色画像における腫瘍領域を特定する特定手段と、特定手段により特定されたｍｉＲＮＡ染色画像における腫瘍領域の情報に基づいて、前記腫瘍領域内の染色陽性細胞含有率を算出する算出手段とを備える。
　より詳細には、本実施形態のシステムは、入力装置１１１と、出力装置１１２と、染色画像データベース１１３と、処理装置１２０と、記憶装置１３０とを備える。
　染色画像データベース１１３には、１つ以上のＨＥ染色画像と、前記ＨＥ染色画像の標本（切片スライド）に隣接している連続切片の標本であるｍｉＲＮＡ染色画像と、前記ＨＥ染色画像と前記ｍｉＲＮＡ染色画像との標本の隣接情報と、前記ＨＥ染色画像から算出された、あるいは医師等によって判定された腫瘍領域情報とが蓄積されている。
　各画像には、被検者との関係情報が被検者識別子によって関連付けられている。染色画像データベース１１３には、例えば、図２に示されるように、被検者を一意に識別するための被検者識別子２０１、画像識別子２０２、染色情報２０３、画像データ２０４、標本隣接情報２０５、およびＨＥ染色画像での腫瘍領域情報２０６が含まれている。
　画像識別子２０２は、前記被検者ごとに複数存在する病理画像を識別するための識別子である。染色情報２０３と画像データ２０４と腫瘍領域情報２０６とは、画像識別子２０２によって、他の画像と区別される。染色情報２０３には、前記画像の染色情報が記憶されており、前記染色情報としては、例えば、ＨＥ染色の情報および癌マーカーｍｉＲＮＡ染色の情報があげられる。画像データ２０４には、画像データが記憶されている。標本隣接情報２０５には、画像識別子２０２によって、対応関係が記憶されている。ＨＥ染色画像の腫瘍領域情報２０６には、前記ＨＥ染色画像から算出された、あるいは医師等によって判定された腫瘍領域情報が記憶されている。ＨＥ染色画像の腫瘍領域情報２０６は、画像識別子２０２と対応させて、別に記憶しても良い。
　入力装置１１１および出力装置１１２は、例えば、コンピュータに備わる通常の入出力装置を使用できる。入力装置１１１は、例えば、キーボードまたはマウスである。出力装置１１２は、例えば、ディスプレイ装置またはプリンタである。入力装置１１１および出力装置１１２は、入力ファイルおよび／または出力ファイルであっても良いし、他のコンピュータ等であっても良い。
　記憶装置１３０は、例えば、コンピュータに備わる主記憶装置および補助記憶装置で構成され、処理装置１２０で実行される各種のプログラムおよびデータを保持するために使用される。処理装置１２０は、例えば、コンピュータのＣＰＵを含んで構成され、プログラム制御により動作する。
　処理装置１２０は、入力受付処理部１２１と、染色画像および腫瘍領域情報取得部１２２と、画像マッチング処理部（マッチング手段）１２３と、ｍｉＲＮＡ染色画像の腫瘍領域抽出部（特定手段）１２４と、染色陽性細胞含有率算出部（算出手段）１２５とを含む。染色画像および腫瘍領域情報取得部１２２は、例えば、前述の画像取得手段および情報取得手段の機能を兼ね備えている。
　入力受付処理部１２１は、利用者等から入力装置１１１を通じて、診断対象となる病理画像の指定情報と、検査種別の指定情報とを受け付ける。前記検査種別は、例えば、検査対象の癌マーカーｍｉＲＮＡの種別等があげられる。さらに、入力受付処理部１２１は、それらの情報を、記憶装置１３０における診断画像情報および検査対象記憶部１３１に記憶し、染色画像および腫瘍領域情報取得部１２２に処理を移す。本実施形態の場合、病理画像の指定情報は、画像識別子２０２である。画像識別子２０２は、ＨＥ染色画像またはｍｉＲＮＡ染色画像であり、１つまたは複数を指定することが可能である。また、検査種別の指定情報は、ｍｉＲＮＡ染色項目であり、本発明における癌マーカーｍｉＲＮＡのうち、いずれか一つのｍｉＲＮＡまたは２種類以上のｍｉＲＮＡを指定可能である。
　染色画像および腫瘍領域情報取得部１２２は、染色画像データベース１１３から、診断対象となるＨＥ染色画像とｍｉＲＮＡ染色画像とＨＥ染色画像における腫瘍領域の情報とを取得し、それぞれ、記憶装置１３０のＨＥ染色画像データ記憶部１３２とｍｉＲＮＡ染色画像データ記憶部１３４とＨＥ染色画像の腫瘍領域情報記憶部１３３とに記憶し、画像マッチング処理部１２３に処理を移す。
　診断画像情報および検査対象記憶部１３１に記憶された画像識別子２０２を持つ染色情報２０３が、ＨＥ染色である場合、画像識別子２０２を持つ画像データ２０４が、ＨＥ染色画像データ記憶部１３２に記憶される。また、診断画像情報および検査対象記憶部１３１に記憶されている検査種別と標本隣接情報２０５とを参照して、診断対象のＨＥ画像標本に隣接した連続切片標本のｍｉＲＮＡ染色画像の画像データ２０４が、ｍｉＲＮＡ染色画像データ記憶部１３４に記憶される。さらに、ＨＥ染色画像の腫瘍領域情報２０６の情報が、ＨＥ染色画像の腫瘍領域情報記憶部１３３に記憶される。
　一方、診断画像情報および検査対象記憶部１３１に記憶された画像識別子を持つ染色情報２０３が、ｍｉＲＮＡ染色である場合、画像識別子２０２を持つ画像データ２０４が、ｍｉＲＮＡ染色画像データ記憶部１３４に記憶される。また、標本隣接情報２０５を参照して、診断対象のｍｉＲＮＡ染色画像標本に隣接した連続切片標本のＨＥ染色画像の画像データ２０４が、ＨＥ染色画像データ記憶部１３２に記憶される。さらに、ＨＥ染色画像の腫瘍領域情報２０６の情報が、ＨＥ染色画像の腫瘍領域情報記憶部１３３に記憶される。複数の画像識別子２０２が指定されている場合、それぞれについて検索し、対応付けて記憶される。
　画像マッチング処理部１２３は、ＨＥ染色画像データ記憶部１３２およびｍｉＲＮＡ染色画像データ記憶部１３４から、それぞれＨＥ染色画像およびｍｉＲＮＡ染色画像を読み出し、ＨＥ染色画像とｍｉＲＮＡ染色画像とのマッチング位置を算出する。さらに、画像マッチング処理部１２３は、マッチング位置情報をマッチング位置情報記憶部１３５に記憶し、ｍｉＲＮＡ染色画像の腫瘍領域抽出部１２４に処理を移す。前記マッチング位置情報は、例えば、回転角度、および水平・垂直ずれ幅等があげられる。ＨＥ染色画像とｍｉＲＮＡ染色画像とは、連続切片を染色した画像であるため、よく類似した画像である。ＨＥ染色とｍｉＲＮＡ染色とは、例えば、同じ色相であっても、異なる色相であってもよいが、ＨＥ染色画像とｍｉＲＮＡ染色画像とをマッチングすることから、ｍｉＲＮＡ染色では、ＨＥ染色とは異なる色相で細胞を染色することが好ましい。ＨＥ染色は、通常、ヘマトキシリンにより細胞核が青色に染色され、エオシンにより細胞質がピンク色に染色される。ｍｉＲＮＡ染色による染色の色相は、例えば、使用する発色物質または蛍光物質等によって、適宜設定できる。画像のマッチングには、各画像を２値化して、位相限定相関法、残差逐次検定法、特異点を用いる方法等が利用できる。
　ｍｉＲＮＡ染色画像の腫瘍領域抽出部１２４は、ＨＥ染色画像の腫瘍領域情報記憶部１３３、ｍｉＲＮＡ染色画像データ記憶部１３４およびマッチング位置情報記憶部１３５から、それぞれＨＥ染色画像の腫瘍領域情報、ｍｉＲＮＡ染色画像データおよびマッチング位置情報を読み出し、ｍｉＲＮＡ染色画像データでの腫瘍領域を算出する。さらに、ｍｉＲＮＡ染色画像の腫瘍領域抽出部１２４は、ｍｉＲＮＡ染色画像データにおける腫瘍領域の情報を、ｍｉＲＮＡ染色画像の腫瘍領域情報記憶部１３６に記憶させ、染色陽性細胞含有率算出部１２５に処理を移す。
　染色陽性細胞含有率算出部１２５は、ｍｉＲＮＡ染色画像データ記憶部１３４およびｍｉＲＮＡ染色画像の腫瘍領域情報記憶部１３６から、それぞれｍｉＲＮＡ染色画像データおよび腫瘍領域情報を読み出し、腫瘍領域内の染色陽性細胞核数と染色陰性細胞核数とをカウントし、染色陽性細胞含有率を算出して、出力装置１１２から出力する。
　図３～図６のフローチャートを参照し、本発明の画像診断支援方法および画像診断支援プログラムの実施形態１Ｂとして、図１に示したシステムの動作の一例を説明する。本実施形態においては、ｍｉＲＮＡ染色について、陽性細胞核の染色を青色、陰性細胞核の染色を茶褐色と仮定して説明する。本発明は、これには制限されず、例えば、染色細胞核を特定する一般的な方法により、陽性細胞核と陰性細胞核とをカウント可能である。具体的には、例えば、ｍｉＲＮＡ染色のスライドについて、一般的な染色方法により核を染色し、ｍｉＲＮＡ染色が陽性の細胞核と陰性の細胞核とをカウントしてもよい。
　この方法は、概括すると、癌の病理画像に基づく診断を支援する方法であって、下記工程（ａ）～（ｅ）を含む。また、本実施形態のプログラムは、癌の病理画像に基づく診断を支援するプログラムであって、前記工程（ａ）～（ｅ）をコンピュータに実行させる。
（ａ）診断対象となる病理画像として、ＨＥ染色画像およびｍｉＲＮＡ染色画像を取得する画像取得工程
（ｂ）ＨＥ染色画像における腫瘍領域の情報を取得する情報取得工程
（ｃ）画像取得工程において取得されたＨＥ染色画像とｍｉＲＮＡ染色画像とのマッチング位置を算出するマッチング工程
（ｄ）情報取得工程において取得されたＨＥ染色画像における腫瘍領域の情報およびマッチング工程において算出されたマッチング位置の情報に基づいて、ｍｉＲＮＡ染色画像における腫瘍領域を特定する特定工程
（ｅ）特定工程において特定されたｍｉＲＮＡ染色画像における腫瘍領域の情報に基づいて、前記腫瘍領域内の染色陽性細胞含有率を算出する算出工程
　より詳細には、処理の開始にあたって、染色画像データベース１１３には、被検者に対する一連のデータである被検者識別子２０１と、画像識別子２０２と、染色情報２０３と、画像データ２０４と、標本隣接情報２０５と、ＨＥ染色画像での腫瘍領域情報２０６とが記憶されている。腫瘍領域情報２０６は、予めＨＥ染色画像から腫瘍領域が算出されてある情報、または医師が特定した腫瘍領域情報である。この状態で処理装置１２０を起動すると、図３に示す処理が開始される。
　まず、入力装置１１１から診断画像を指定するＨＥ染色画像の画像識別子またはｍｉＲＮＡ染色画像の画像識別子と、検査対象の癌マーカーｍｉＲＮＡを指定するｍｉＲＮＡ検査項目要求が処理装置１２０の入力受付処理部１２１に供給される。入力受付処理部１２１は、この診断画像指定情報と検査対象指定情報とを、記憶部１３０における診断画像情報および検査対象記憶部１３１から、染色画像および腫瘍領域情報取得部１２２へ渡す。そして、処理は、染色画像および腫瘍領域情報取得部１２２に移行する（ステップＳ３０１）。
　次に、染色画像および腫瘍領域情報取得部１２２は、診断画像情報および検査対象記憶部１３１中の画像識別子で、染色画像データベース１１３を検索する。そして、染色画像および腫瘍領域情報取得部１２２は、指定された画像識別子を持つ染色情報２０３がＨＥ染色であれば、前記画像識別子をもつ画像データ２０４を、ＨＥ染色画像データ記憶部１３２に保存する。さらに、ＨＥ染色画像の腫瘍領域情報２０６をＨＥ染色画像の腫瘍領域情報記憶部１３３に保存する。また、診断画像情報および検査対象記憶部１３１中のｍｉＲＮＡ検査項目を読み出して、染色画像データベース１１３の標本隣接情報２０５を参照し、ＨＥ染色画像に隣接した連続切片標本であるｍｉＲＮＡ染色画像データ２０４を、ｍｉＲＮＡ染色画像データ記憶部１３４に保存する。
　一方、指定された画像識別子を持つ染色情報２０３がｍｉＲＮＡ染色であれば、前記画像識別子をもつ画像データ２０４を、ｍｉＲＮＡ染色画像データ記憶部１３４に保存する。また、染色画像データベース１１３の標本隣接情報２０５を参照し、ｍｉＲＮＡ染色画像に隣接した連続切片標本であるＨＥ染色画像データ２０４を、ＨＥ染色画像データ記憶部１３２に保存する。さらに、ＨＥ染色画像の腫瘍領域情報２０６を、ＨＥ染色画像の腫瘍領域情報記憶部１３３に保存する。そして、処理は、画像マッチング処理部１２３に移行する（ステップＳ３０２）。
　画像マッチング処理部１２３は、ＨＥ染色画像データ記憶部１３２に記憶されたＨＥ染色画像と、ｍｉＲＮＡ染色画像データ記憶部１３４に記憶されたｍｉＲＮＡ染色画像とのマッチング位置を算出する。マッチング位置の算出は、例えば、前記両画像の色スケールを合わせてから、位相限定相関法を使って行う。そして、得られたマッチング位置情報を、マッチング位置情報記憶部１３５に記憶させる。前記マッチング位置情報は、例えば、回転角度および水平・垂直ずれ幅である。そして、処理は、ｍｉＲＮＡ染色画像の腫瘍領域抽出部１２４に移行する（ステップＳ３０３）。
　ｍｉＲＮＡ染色画像の腫瘍領域抽出部１２４は、ＨＥ染色画像の腫瘍領域情報記憶部１３３に記憶されたＨＥ染色画像の腫瘍領域情報と、マッチング位置情報記憶部１３５に記憶されたマッチング位置情報とから、ｍｉＲＮＡ染色画像データ記憶部１３４に記憶されたｍｉＲＮＡ染色画像における腫瘍領域を算出する。得られたｍｉＲＮＡ染色画像の腫瘍領域情報を、ｍｉＲＮＡ染色画像の腫瘍領域情報記憶部１３６に記憶させる。そして、処理は、染色陽性細胞含有率算出部１２５に移行する（ステップＳ３０４）。
　染色陽性細胞率算出部１２５は、ｍｉＲＮＡ染色画像データ記憶部１３４に記憶されたｍｉＲＮＡ染色画像データと、ｍｉＲＮＡ染色画像の腫瘍領域情報記憶部１３６に記憶された腫瘍領域情報とを受け取る。そして、腫瘍領域内の染色陽性細胞核数と染色陰性細胞核数とをカウントし、染色陽性細胞含有率を算出して、出力装置１１２から出力する（ステップＳ３０５）。例えば、染色陽性細胞核を茶褐色、染色陰性細胞を青色にそれぞれ染色した場合、茶色に染色された核数と青色に染色された核数とをそれぞれカウントする。この工程は、例えば、以下に示すように、図４、図５および図６に示す手順で行われる。
　まず、受け取ったｍｉＲＮＡ染色画像データと腫瘍領域情報とから、ｍｉＲＮＡ染色画像データの腫瘍領域外をマスクする（ステップＳ４０１）。そして、腫瘍領域内で茶色に染色された領域である茶色領域と青色に染色された領域である青色領域とを、判別分析により識別する（ステップＳ４０２）。
　この工程は、まず、画像データをＨＳＶ色空間に変換し（ステップＳ５０１）、Ｓ（彩度）とＶ（明度）とによって未染色領域を除去し（ステップＳ５０２）、Ｈ（色相）の値域を［０，１］から［０．３，１．３］に変換する（ステップＳ５０３）。次に、全画素のＨ（色相）値が、［０．３，０．８］または［０．８，１．３］のどちらかの範囲に含まれるか否かを調べる（ステップＳ５０４）。全画素が片側に含まれてしまう場合は、［０．３，０．８］を青色領域、［０．８，１．３］を茶色領域として出力する（ステップＳ５０７）。画素が両方の領域に存在する場合は、判別分析により閾値ｔを算出し（ステップＳ５０５）、［０．３，ｔ］を青色領域、［ｔ，１．３］を茶色領域として出力する（ステップＳ５０６）。
　次に、茶色領域で核抽出（ステップＳ４０３）し、続いて、青色領域で核抽出（ステップＳ４０４）する。これらの工程は、まず、茶色領域または青色領域が入力されると（ステップＳ６０１）、Ｖ（明度）値の平均と分散とを考慮し、シグモイド関数でＶ値を強調したＶ'値を算出する（ステップＳ６０２）。そして、Ｖ'値である閾値以下の値の場合に、核領域内（＝１）とし、Ｖ’値である閾値より大きい値の場合に、核領域外（＝０）とする、２値画像に変換する（ステップＳ６０３）。次に、２値画像にガウスフィルタをかけ、隣接画素の比較によって、核の位置を算出する（ステップＳ６０４）。
　次に、茶色領域で検出された核の数をカウント（ステップＳ４０５）し、青色領域で検出された核の数をカウント（ステップＳ４０６）する。最後に、全核数に対する茶色の核数の割合、すなわち、茶色の核数／（茶色の核数＋青色の核数）を算出する（ステップＳ４０７）。
　本実施形態の効果について説明する。本実施形態においては、画像取得手段によりＨＥ染色画像およびｍｉＲＮＡ染色画像が取得されるとともに、情報取得手段によりＨＥ染色画像における腫瘍領域の情報が取得される。その後、マッチング手段により、ＨＥ染色画像とｍｉＲＮＡ染色画像とのマッチング位置が算出される。続いて、ＨＥ染色画像における腫瘍領域の情報とマッチング位置の情報とに基づいて、特定手段により、ｍｉＲＮＡ染色画像における腫瘍領域が特定される。そして、ｍｉＲＮＡ染色画像における腫瘍領域の情報に基づいて、算出手段により、ｍｉＲＮＡ染色画像における腫瘍領域内の染色陽性細胞含有率が算出される。これにより、染色陽性細胞含有率を定量値として得ることができる。その結果、例えば、定量値によって、医師が、ｍｉＲＮＡ染色による診断を行える。
　さらに、近年、組織診や細胞診の件数が増えており、それに対し病理医が少ないことから、従来は、病理医に長時間の作業が強いられるという問題もあった。この点、本実施形態によれば、医師等の作業労力負担が軽減される。
　また、本実施形態によれば、連続切片標本の画像である、ＨＥ染色画像とｍｉＲＮＡ染色画像とのマッチングによって、ＨＥ染色画像で判定された腫瘍領域を、ｍｉＲＮＡ染色画像に対応付けることができる。また、Ｈ（色相）値に判別分析を適用することによって、例えば、茶色領域と青色領域との識別ができる。さらに、茶色領域および青色領域の各々で核抽出することによって、全核数に対する茶色の核数の割合を算出できる。そのため、染色陽性細胞含有率を医師等に提示することにより、医師による診断に有益な情報を提供し、診断を支援できる。
（実施形態１Ｃ）
　図７は、本発明の画像診断支援システムの一例を示すブロック図である。本実施形態のシステムは、図１に示す実施形態１Ｂのシステムと比べて、染色陽性細胞含有率算出部１２５が、染色陽性細胞含有率に加えて染色強度をも算出する点で相違する。特に示さない限り、本実施形態において、その他の構成および動作は、実施形態１Ｂと同様である。
　図７において、染色陽性細胞含有率および染色強度算出部７２５は、ｍｉＲＮＡ染色画像データ記憶部１３４およびｍｉＲＮＡ染色画像の腫瘍領域情報記憶部１３６から、それぞれｍｉＲＮＡ染色画像データおよび腫瘍領域情報を読み出す。そして、染色陽性細胞含有率および染色強度算出部７２５は、腫瘍領域内の染色陽性細胞核数と染色陰性細胞核数とをカウントして、染色陽性細胞含有率を算出し、さらに、染色強度を算出して、出力装置１１２から出力する。
　図８～図１０のフローチャートを参照し、本発明の画像診断支援方法および画像診断支援プログラムの実施形態１Ｃとして、図７に示したシステムの動作の一例を説明する。
　本実施形態の処理は、図３に示される実施形態１Ｂの処理と比べて、染色陽性細胞含有率算出だけでなく染色強度算出をも行う点で相違するが、その他の動作は、前記実施形態１Ｂと同様である。
　染色陽性細胞含有率および染色強度算出部７２５は、ｍｉＲＮＡ染色画像データ記憶部１３４に記憶されたｍｉＲＮＡ染色画像データと、ｍｉＲＮＡ染色画像の腫瘍領域情報記憶部１３６に記憶された腫瘍領域を受け取る。そして、腫瘍領域内の染色陽性細胞核数と染色陰性細胞核数とをカウントして、染色陽性細胞含有率を算出し、また、染色強度（０：陰性、１：弱陽性、２：中等度陽性、３：強陽性）を算出し、これらを出力装置１１２から出力する（ステップＳ８０５）。この処理は、例えば、以下に示すように、図９および図１０に示す手順で行われる。
　図９のステップＳ４０７までは、前記実施形態１Ｂにおいて図４に示す処理と同じである。ステップＳ４０７の次に、茶色領域における核染色強度を算出する（ステップＳ９０８）。
　まず、図９のステップＳ４０２で判定された茶色領域が入力される（ステップＳ１００１）。そして、Ｖ（明度）値の平均と分散とを考慮して、シグモイド関数でＶ値を強調したＶ'値を算出する（ステップＳ１００２）。Ｖ'値である閾値ｘ以下の値の場合に、核領域内とし、その画素数Ｘをカウントする（ステップＳ１００３）。
　次に、０＜ａ＜ｂ＜ｃ＜１である定数ａ、ｂ、ｃを設定する。まず、核領域内の画素数に対して、条件Ｖ値≦ａを満たす画素数の割合を求める。前記割合が、ある一定割合以上の場合（ステップＳ１００４）、染色強度「３：強陽性」として出力する（ステップＳ１００５）。これに該当しない場合は、核領域内の画素数に対して、条件Ｖ値≦ｂを満たす画素数の割合を求める。そして、前記割合が、ある一定割合以上であった場合（ステップＳ１００６）、染色強度「２：中等度陽性」として出力する（ステップＳ１００７）。これに該当しない場合は、核領域内の画素数に対して、条件Ｖ値≦ｃを満たす画素数の割合を求める。そして、前記割合が、ある一定割合以上であった場合（ステップＳ１００８）、染色強度「１：弱陽性」として出力する（ステップＳ１００９）。いずれにも該当しない場合には、染色強度「０：陰性」として出力する（ステップＳ１０１０）。
　本実施形態の効果について説明する。前記実施形態１Ｂでは、染色陽性細胞含有率のみの医師への提示であったが、本実施形態１Ｃでは、染色陽性細胞含有率だけでなく、染色強度をあわせて医師等に提示できる。このため、医師による診断に、より有益な情報を提供し、診断を支援できる。本実施形態のその他の効果は、前記実施形態１Ｂと同様である。
（実施形態１Ｄ）
　図１１は、本発明による画像診断支援システムの一例を示すブロック図である。本実施形態のシステムは、図１に示す前記実施形態１Ｂに係るシステムと比べて、腫瘍判定および腫瘍領域算出部（腫瘍領域算出手段）１１２６を設けた点で相違する。特に示さない限り、本実施形態において、その他の構成および動作は、前記実施形態１Ｂと同様である。染色画像データベース１１３には、例えば、１つ以上のＨＥ染色画像と、前記ＨＥ染色画像の標本に隣接した連続切片の標本であるｍｉＲＮＡ染色画像と、前記ＨＥ染色画像と前記ｍｉＲＮＡ染色画像との標本の隣接情報とが蓄積されている。本実施形態において、前記ｍｉＲＮＡ染色画像から算出された腫瘍領域情報、あるいは医師等によって判定された腫瘍領域情報は、あってもなくてもよい。
　図１１において、染色画像および腫瘍領域情報取得部１２２は、染色画像データベース１１３から、ＨＥ染色画像２０４、ｍｉＲＮＡ染色画像２０４およびＨＥ染色画像の腫瘍領域情報２０６を取得し、それぞれ、記憶装置１３０におけるＨＥ染色画像データ記憶部１３２、ｍｉＲＮＡ染色画像データ記憶部１３４およびＨＥ染色画像の腫瘍領域情報記憶部１３３に記憶させる。ここで、腫瘍領域情報２０６が存在した場合は、画像マッチング処理部１２３に処理を移すが、腫瘍領域情報２０６が存在しなかった場合は、腫瘍判定および腫瘍領域算出部１１２６に処理を移す。
　腫瘍判定および腫瘍領域算出部１１２６は、ＨＥ染色画像データ記憶部１３２からＨＥ染色画像データを読み出し、腫瘍判定して腫瘍領域を算出し、画像マッチング処理部１２３へ処理を移す。腫瘍の判定方法および腫瘍領域の算出方法としては、例えば、特許文献１に記載された方法が利用できる。
　本実施形態の効果について説明する。本実施形態では、ＨＥ染色画像で腫瘍判定されていない場合でも、腫瘍判定および腫瘍領域算出部を設けることによって、一連の処理が行われる。このため、癌診断から免疫組織化学染色画像診断まで統合した診断情報を、医師等に提示できる。したがって、医師による診断に、有益な情報を提供し、診断を支援できる。本実施形態のその他の効果は、前記実施形態１Ｂと同様である。
　本実施形態においては、例えば、前記実施形態１Ｃと同様に、染色陽性細胞含有率と共に染色強度を算出してもよい。
（実施形態１Ｅ）
　図１２は、本発明による画像診断支援システムの一例を示すブロック図である。本実施形態のシステムは、図１等に示す染色画像および腫瘍領域情報取得部１２２に代えて、スライド撮影部（スライド取得手段）１２２２を備え、染色画像データベース１１３に代えて、スライドデータベース１２１３を備え、診断画像情報および検査対象記憶部１３１に代えて、診断スライド情報および検査対象記憶部１２３１を備える。さらに、このシステムには、スライド撮影装置１２１４および腫瘍判定および腫瘍領域算出部１１２６を備える。特に示さない限り、本実施形態において、その他の構成および動作は、前記実施形態１Ｂと同様である。
　スライドデータベース１２１３には、１つ以上のＨＥ染色スライドと、前記ＨＥ染色スライドの標本に隣接している連続切片の標本であるｍｉＲＮＡ染色スライドと、前記ＨＥ染色スライドと前記ｍｉＲＮＡ染色スライドとの標本の隣接情報とが蓄積されている。各スライドは、被験者との関係情報が、被験者識別子によって関連付けられている。スライド撮影装置１２１４は、指定されたスライドを撮影し、デジタルデータへ変換する。
　入力受付処理部１２１は、利用者等から入力装置１１１を通じて、診断対象となるスライドの指定情報（スライド識別子）と検査種別の指定情報とを受け付ける。そして、これらの情報を、記憶装置１３０の診断スライド情報および検査対象記憶部１２３１に記憶し、スライド撮影部１２２２に処理を移す。
　スライド撮影部１２２２は、スライドデータベース１２１３から、診断対象となる隣接した標本であるＨＥ染色スライドとｍｉＲＮＡ染色スライドとを取得する。さらに、スライド撮影部１２２２は、スライド撮影装置１２１４により取得したスライドを撮影し、デジタルデータに変換することにより、ＨＥ染色画像およびｍｉＲＮＡ画像を取得する。そして、これらの画像を、それぞれ記憶装置１３０のＨＥ染色画像データ記憶部１３２およびｍｉＲＮＡ染色画像データ記憶部１３４に記憶させ、腫瘍判定および腫瘍領域算出部１１２６に処理を移す。このように、本実施形態においては、スライド撮影部１２２２が、スライド取得手段および画像取得手段の機能を兼ね備えている。
　本実施形態の効果について説明する。本実施形態では、病理スライドがデジタルデータ化されていない場合でも、スライド撮影装置とスライドデータベースとスライド撮影部とを備えることによって、一連の処理がなされる。このため、スライド撮影から、癌診断、さらに免疫組織化学染色画像診断まで、統合した診断情報を、医師等に提示できる。したがって、医師による診断に有益な情報を提供し、診断を支援できる。本実施形態のその他の効果は、前記実施形態１Ｂと同様である。
　本実施形態においては、前記実施形態１Ｃと同様に、染色陽性細胞含有率と共に染色強度を算出してもよい。
　本発明は、前記実施形態に限定されるものではなく、様々な変形が可能である。例えば、前記実施形態においては、例えば、入力受付処理部１２１が診断画像を指定する画像識別子を受け付ける例を示した。しかし、入力受付処理部１２１は、画像識別子ではなく、診断対象者の被験者識別子を受け付けてもよい。この場合、染色画像および腫瘍領域情報取得部１２２は、被験者識別子を持つ画像と腫瘍領域情報とを、染色画像データベース１１３から検索してもよい。
第２の形態
　本発明の癌病理画像診断支援装置（以下、画像診断支援装置という）は、
学習に用いる病理画像から腫瘍を中心としたイメージを切り出し、学習パターンとして入力する学習パターン入力手段と、
クラス情報が付された前記学習パターンを記憶保持する学習パターン記憶手段と、
複数の特徴候補を生成する特徴候補生成手段と、
前記特徴候補生成手段によって生成される特徴候補の中から、診断に適した特徴のセットを決定する特徴決定手段と、
前記特徴決定手段により決定される特徴のセットを記憶保持する特徴記憶手段と、
分類テーブルを作成する分類テーブル作成手段と、
診断する病理画像から腫瘍候補を中心としたイメージを切り出し、入力パターンとして入力するパターン入力手段と、
前記入力パターンから特徴を抽出する特徴抽出手段と、
前記特徴に基づいて診断する診断手段とを有し、
前記特徴決定手段は、前記各特徴候補に対応する各学習パターンの特徴を計算して、前記学習パターンのクラス情報との相互情報量が最大となる特徴候補を、特徴のセットの最初の特徴として決定し、決定した特徴が既知であるとの条件の下、各特徴候補に対応する各学習パターンの特徴と、前記各学習パターンのクラス情報との相互情報量が最大となる特徴候補を、特徴のセットの次なる特徴として、順次決定し、
前記分類テーブル作成手段は、前記特徴のセットを用いて、前記各学習パターンの各特徴を計算し、前記各学習パターンの各特徴とクラス情報とを配置してなる前記分類テーブルを作成し、前記分類テーブルにより前記学習パターンを分類し、
前記特徴抽出手段は、前記特徴のセットを用いて、前記入力パターンの各特徴を算出し、
前記診断手段は、前記算出結果および前記分類テーブルに基づいて、前記入力パターンを診断することを特徴とする。
　本発明の画像診断支援装置は、
学習に用いる病理画像から腫瘍を中心としたイメージを切り出し、学習パターンとして入力する学習パターン入力手段と、
クラス情報が付された前記学習パターンを記憶保持する学習パターン記憶手段と、
複数の特徴候補を生成する特徴候補生成手段と、
前記特徴候補生成手段によって生成される特徴候補の中から診断に適した特徴のセットを決定する特徴決定手段と、
前記特徴決定手段により決定されている特徴のセットを記憶保持する特徴記憶手段と、
分類テーブルを作成する分類テーブル作成手段と、
診断する病理画像から腫瘍候補を中心としたイメージを切り出し、入力パターンとして入力するパターン入力手段と、
前記入力パターンから特徴を抽出する特徴抽出手段と、
前記特徴に基づいて診断する診断手段とを有し、
前記特徴決定手段は、特徴の値に応じて遷移させるべき、予め定めた個数の前記学習パターンの集合を用意し、前記各特徴候補に対応する各学習パターンの特徴を計算して、前記学習パターンのクラス情報との相互情報量が最大となる特徴候補を、特徴のセットの最初の特徴として決定し、前記各学習パターンを、決定した特徴に応じた重みを付けて、分配するとともに、決定した特徴に対応する集合に、順次、遷移させ、前記各学習パターンが含まれる集合についての情報と、決定されている特徴とが既知であるとの条件の下で、各特徴候補に対応する各学習パターンの特徴と、前記各学習パターンのクラス情報との相互情報量が最大となる特徴候補を、特徴のセットの次なる特徴として、順次、決定し、
前記分類テーブル作成手段は、前記特徴のセットを用いて、前記各学習パターンの各特徴を計算し、前記各学習パターンの各特徴とクラス情報とを配置してなる前記分類テーブルを作成し、前記分類テーブルにより前記学習パターンを分類し、
前記特徴抽出手段は、前記特徴のセットを用いて、前記入力パターンの各特徴を算出し、
前記診断手段は、前記入力パターンの各特徴と、前記特徴のセットの各特徴の決定の際に前記学習パターンが属する集合を逐次記録してなる遷移テーブルとに基づいて、前記入力パターンの遷移を行って、前記遷移の結果、前記入力パターンが属する集合に基づいて前記入力パターンを診断することを特徴とする。
　本発明の画像診断支援装置は、
学習に用いる病理画像から腫瘍を中心としたイメージを切り出し、学習パターンとして入力する学習パターン入力手段と、
クラス情報が付された前記学習パターンを記憶保持する学習パターン記憶手段と、
複数の特徴候補を生成する特徴候補生成手段と、
前記特徴候補生成手段によって生成される特徴候補の中から診断に適した特徴のセットを決定する特徴決定手段と、
前記特徴決定手段により決定されている特徴のセットを記憶保持する特徴記憶手段と、
分類テーブルを作成する分類テーブル作成手段と、
診断する病理画像から腫瘍候補を中心としたイメージを切り出し、入力パターンとして入力するパターン入力手段と、
前記入力パターンから特徴を抽出する特徴抽出手段と、
前記特徴に基づいて診断する診断手段とを有し、
前記特徴決定手段は、特徴の値に応じて遷移させるべき、予め定めた個数の前記学習パターンの集合を用意し、前記各特徴候補に対応する各学習パターンの特徴を計算して、前記学習パターンのクラス情報との相互情報量が最大となる特徴候補を、特徴のセットの最初の特徴として決定し、前記各学習パターンを、決定した特徴に応じた重みを付けて、分配するとともに、決定した特徴に対応する集合に、順次、遷移させ、前記各学習パターンが含まれる集合の情報と、決定されている特徴とが既知であるとの条件の下で、各特徴候補に対応する各学習パターンの特徴と、前記各学習パターンのクラス情報との相互情報量が最大となる特徴候補を、特徴のセットの次なる特徴として、順次、決定し、
前記分類テーブル作成手段は、前記特徴のセットを用いて、前記各学習パターンの各特徴を計算し、前記各学習パターンの各特徴と、クラス情報とを配置してなる前記分類テーブルにより前記学習パターンを分類し、
前記特徴抽出手段は、前記特徴のセットを用いて、前記順位の特徴が予め定めた値となる確率を示している、前記入力パターンの各特徴を算出し、
前記診断手段は、前記入力パターンの各特徴と、前記特徴のセットの各特徴の決定の際に前記学習パターンが属する集合を逐次記録してなる遷移テーブルとに基づいて前記入力パターンが予め定められたクラス情報を有する確率を算出し、診断することを特徴とする。
　本発明の前記画像診断支援装置において、前記学習パターン入力手段および前記パターン入力手段は、染色された前記病理画像中の各画素のＲＧＢ値から、予め設定された腫瘍細胞核が属する色領域に属する画素を選択し、前記色領域の分布の中心と前記色領域に属する各画素との距離を算出し、前記距離に応じて前記各画素に信号を付与し、前記病理画像中における前記信号の分布からピークを検出し、前記ピークを中心としたイメージを前記学習パターンとして入力することが好ましい。
　本発明の前記画像診断支援装置において、前記特徴候補生成手段が生成する特徴候補には、特徴抽出関数から得られる特徴候補が含まれることが好ましい。
　本発明の前記画像診断支援装置において、前記特徴候補生成手段が生成する特徴候補には、複素ガボール関数を規格化した特徴抽出関数から得られる特徴候補が含まれることが好ましい。
　本発明の画像診断支援装置において、前記特徴候補生成手段が生成する特徴候補には、腫瘍の色を識別する特徴候補が含まれることが好ましい。
　本発明の画像診断支援装置において、前記特徴決定手段は、前記学習パターン入力手段によって算出された前記学習パターンに含まれる前記各画素の信号と、予め設定された閾値とを比較することが好ましい。
　本発明の画像診断支援装置において、前記特徴決定手段は、前記学習パターン入力手段によって算出された前記学習パターンに含まれる前記各画素の信号と、前記各画素近傍に位置する画素の信号の平均値とを比較することが好ましい。
　本発明の画像診断支援装置において、前記特徴決定手段は、前記各学習パターンに対して、前記特徴候補毎に予め定められたノイズパラメータによる操作を加えることが好ましい。
　本発明の画像診断支援装置において、前記特徴決定手段は、前記各特徴候補に対応する前記各学習パターンの特徴として、前記各学習パターンの特徴が、予め定めた値となる確率を計算することが好ましい。
　本発明の画像診断支援装置において、前記特徴の値に関らず、前記学習パターンを分類できるとき、前記分類テーブル作成手段は、前記分類テーブルの対応する位置に、前記特徴の値に代えて、冗長項を置くことが好ましい。
　本発明の画像診断支援装置において、前記入力パターンの各特徴は、前記順位の特徴が予め定めた値となる確率の値であって、前記診断手段は、前記各特徴を用いて、前記分類テーブルに含まれる各特徴パターンが予め定めたクラス情報の値となる確率を計算して判定を行うことが好ましい。
　また、本発明の画像診断支援プログラムは、前記本発明の画像診断方法を、コンピュータで実行可能なことを特徴とする。本発明の画像診断支援プログラムは、例えば、学習に用いる病理画像から腫瘍を中心としたイメージを切り出し、学習パターンとして入力する学習パターン入力手段と、
クラス情報が付された前記学習パターンを記憶保持する学習パターン記憶手段と、
複数の特徴候補を生成する特徴候補生成手段と、
前記特徴候補生成手段によって生成される特徴候補の中から診断に適した特徴のセットを決定する特徴決定手段と、
前記特徴決定手段により決定されている特徴のセットを記憶保持する特徴記憶手段と、
分類テーブルを作成する分類テーブル作成手段と、
診断する病理画像から腫瘍候補を中心としたイメージを切り出し、入力パターンとして入力するパターン入力手段と、
前記入力パターンから特徴を抽出する特徴抽出手段と、
前記特徴に基づいて診断する診断手段とを有する画像診断支援装置の画像診断支援プログラムであって、
前記特徴決定手段に、前記各特徴候補に対応する各学習パターンの特徴を計算して、前記学習パターン集合のクラス情報との相互情報量が最大となる特徴候補を、特徴のセットの最初の特徴として決定し、決定した特徴が既知であるとの条件の下で、各特徴候補に対応する各学習パターンの特徴と、前記各学習パターンのクラス情報との相互情報量が最大となる特徴候補を、特徴のセットの次なる特徴として、順次、決定する処理を実行させ、
前記分類テーブル作成手段に、前記特徴のセットを用いて、前記各学習パターンの各特徴を計算し、前記各学習パターンの各特徴と、クラス情報とを配置してなる前記分類テーブルにより前記パターンを分類する処理を実行させ、
前記特徴抽出手段に、前記特徴のセットを用いて、前記入力パターンの各特徴を算出する処理を実行させ、
前記診断手段に、前記算出結果および前記分類テーブルに基づいて、前記入力パターンを診断する処理を実行させることを特徴とする。具体的には、本発明のプログラムは、前記画像診断支援装置の各種手段に、前述のような処理工程を実行させるためのプログラムである。
　本発明の画像診断支援プログラムは、
学習に用いる病理画像から腫瘍を中心としたイメージを切り出し、学習パターンとして入力する学習パターン入力手段と、
クラス情報が付された前記学習パターンを記憶保持する学習パターン記憶手段と、
複数の特徴候補を生成する特徴候補生成手段と、
前記特徴候補生成手段によって生成される特徴候補の中から診断に適した特徴のセットを決定する特徴決定手段と、
前記特徴決定手段により決定されている特徴のセットを記憶保持する特徴記憶手段と、
分類テーブルを作成する分類テーブル作成手段と、
診断する病理画像から腫瘍候補を中心としたイメージを切り出し、入力パターンとして入力するパターン入力手段と、
前記入力パターンから特徴を抽出する特徴抽出手段と、
前記特徴に基づいて診断する診断手段とを有する画像診断支援装置の画像診断支援プログラムであって、
前記特徴決定手段に、特徴の値に応じて遷移させるべき、予め定めた個数の前記学習パターンの集合を用意し、前記各特徴候補に対応する各学習パターンの特徴を計算して、前記学習パターンのクラス情報との相互情報量が最大となる特徴候補を、特徴のセットの最初の特徴として決定し、前記各学習パターンを、決定した特徴に応じた重みを付けて分配するとともに、決定した特徴に対応する集合に、順次、遷移させ、前記各学習パターンが含まれる集合についての情報と、決定されている特徴とが既知であるとの条件の下で、各特徴候補に対応する各学習パターンの特徴と、前記各学習パターンのクラス情報との相互情報量が最大となる特徴候補を、特徴のセットの次なる特徴として、順次、決定する処理を実行させ、
前記分類テーブル作成手段に、前記特徴のセットを用いて、前記各学習パターンの各特徴を計算し、前記各学習パターンの各特徴と、クラス情報とを配置してなる前記分類テーブルを作成して、前記分類テーブルにより前記学習パターンを分類する処理を実行させ、
前記特徴抽出手段に、前記特徴のセットを用いて、前記入力パターンの各特徴を算出する処理を実行させ、
前記診断手段に、前記入力パターンの各特徴と、前記特徴のセットの各特徴の決定の際に前記学習パターンが属する集合を逐次記録してなる遷移テーブルと、に基づいて前記入力パターンの遷移を行って、前記遷移の結果、前記入力パターンが属する集合に基づいて前記入力パターンを診断する処理を実行させることを特徴とする。具体的には、本発明のプログラムは、前記画像診断支援装置の各種手段に、前述のような処理工程を実行させるためのプログラムである。
　本発明の画像診断支援プログラムは、
学習に用いる病理画像から腫瘍を中心としたイメージを切り出し、学習パターンとして入力する学習パターン入力手段と、
クラス情報が付された前記学習パターンを記憶保持する学習パターン記憶手段と、
複数の特徴候補を生成する特徴候補生成手段と、
前記特徴候補生成手段によって生成される特徴候補の中から診断に適した特徴のセットを決定する特徴決定手段と、
前記特徴決定手段により決定されている特徴のセットを記憶保持する特徴記憶手段と、
分類テーブルを作成する分類テーブル作成手段と、
診断する病理画像から腫瘍候補を中心としたイメージを切り出し、入力パターンとして入力するパターン入力手段と、
前記入力パターンから特徴を抽出する特徴抽出手段と、
前記特徴に基づいて診断する診断手段とを有する画像診断支援装置の画像診断支援プログラムであって、
前記特徴決定手段に、前記学習パターンを特徴の値に応じて遷移させるべき、予め定めた個数の集合を用意し、前記各特徴候補に対応する各学習パターンの特徴を計算して、前記学習パターンのクラス情報との相互情報量が最大となる特徴候補を、特徴のセットの最初の特徴として決定し、前記各学習パターンを、決定した特徴に応じた重みを付けて分配するとともに、決定した特徴に対応する集合に、順次、遷移させ、前記各学習パターンが含まれる集合の情報と、決定されている特徴とが既知であるとの条件の下で、各特徴候補に対応する各学習パターンの特徴と、前記各学習パターンのクラス情報との相互情報量が最大となる特徴候補を、特徴のセットの次なる特徴として、順次、決定する処理を実行させ、
前記分類テーブル作成手段に、前記特徴のセットを用いて、前記各学習パターンの各特徴を計算し、前記各学習パターンの各特徴と、クラス情報とを配置してなる前記分類テーブルにより前記学習パターンを分類する処理を実行させ、
前記特徴抽出手段に、前記特徴のセットを用いて、前記順位の特徴が予め定めた値となる確率を示している、前記入力パターンの各特徴を算出する処理を実行させ、
前記診断手段に、前記入力パターンの各特徴と、前記特徴のセットの各特徴の決定の際に前記学習パターンが属する集合を逐次記録してなる遷移テーブルとに基づいて前記入力パターンが予め定められたクラス情報を有する確率を算出し、診断する処理を実行させることを特徴とする。具体的には、本発明のプログラムは、前記画像診断支援装置の各種手段に、前述のような処理工程を実行させるためのプログラムである（以下、同様）。
　本発明の画像診断支援プログラムは、例えば、
前記学習パターン入力手段および前記パターン入力手段に、
染色された前記病理画像中の各画素のＲＧＢ値から、予め設定された腫瘍細胞核が属する色領域に属する画素を選択する処理と、
前記色領域の分布の中心と前記色領域に属する各画素との距離を算出する処理と、
前記距離に応じて前記各画素に信号を付与する処理と、
前記病理画像中における前記信号の分布からピークを検出する処理と、
前記ピークを中心としたイメージを前記学習パターンとして入力する処理とを実行させることが好ましい。
　本発明の画像診断支援プログラムにおいて、前記特徴候補生成手段が生成する特徴候補には、特徴抽出関数から得られる特徴候補が含まれることが好ましい。
　本発明の画像診断支援プログラムにおいて、前記特徴候補生成手段が生成する特徴候補には、複素ガボール関数を規格化した特徴抽出関数から得られる特徴候補が含まれることが好ましい。
　本発明の画像診断支援プログラムにおいて、前記特徴候補生成手段が生成する特徴候補には、腫瘍の色を識別する特徴候補が含まれることが好ましい。
　本発明の画像診断支援プログラムは、例えば、前記特徴決定手段に、前記学習パターン入力手段によって算出された前記学習パターンに含まれる前記各画素の信号と、予め設定された閾値とを比較する処理を実行させることが好ましい。
　本発明の画像診断支援プログラムは、例えば、前記特徴決定手段に、前記学習パターン入力手段によって算出された前記学習パターンに含まれる前記各画素の信号と、前記各画素近傍に位置する画素の信号の平均値とを比較する処理を実行させることが好ましい。
　本発明の画像診断支援プログラムは、例えば、前記特徴決定手段に、前記各学習パターンに対して、前記特徴候補毎に予め定められたノイズパラメータによる操作を加える処理を実行させることが好ましい。
　本発明の画像診断支援プログラムは、例えば、前記特徴決定手段に、前記各特徴候補に対応する前記各学習パターンの特徴として、前記各学習パターンの特徴が、予め定めた値をとる確率を計算する処理を実行させることが好ましい。
　本発明の画像診断支援プログラムは、例えば、前記特徴の値に関らず、前記学習パターンを分類できるとき、前記分類テーブル作成手段に、前記分類テーブルの対応する位置に、前記特徴の値に代えて冗長項を置く処理を実行させることが好ましい。
　本発明の画像診断支援プログラムにおいて、前記入力パターンの各特徴は、前記順位の特徴が予め定めた値となる確率の値であって、前記診断手段に、前記各特徴を用いて、前記分類テーブルに含まれる各特徴パターンが予め定めたクラス情報の値となる確率を計算して判定を行う処理を実行させることが好ましい。
　本発明の画像診断支援方法は、
学習に用いる病理画像から腫瘍を中心としたイメージを切り出し、学習パターンとして入力する学習パターン入力手段と、
クラス情報が付された前記学習パターンを記憶保持する学習パターン記憶手段と、
複数の特徴候補を生成する特徴候補生成手段と、
前記特徴候補生成手段によって生成される特徴候補の中から診断に適した特徴のセットを決定する特徴決定手段と、
前記特徴決定手段により決定されている特徴のセットを記憶保持する特徴記憶手段と、
分類テーブルを作成する分類テーブル作成手段と、
診断する病理画像から腫瘍候補を中心としたイメージを切り出し、入力パターンとして入力するパターン入力手段と、
前記入力パターンから特徴を抽出する特徴抽出手段と、
前記特徴に基づいて診断する診断手段とを有する画像診断支援装置を用いた画像診断支援方法であって、
前記特徴決定手段が、前記各特徴候補に対応する各学習パターンの特徴を計算して、前記学習パターンのクラス情報との相互情報量が最大となる特徴候補を、特徴のセットの最初の特徴として決定し、決定した特徴が既知であるとの条件の下で、各特徴候補に対応する各学習パターンの特徴と、前記各学習パターンのクラス情報との相互情報量が最大となる特徴候補を、特徴のセットの次なる特徴として、順次、決定するステップを実施し、
前記分類テーブル作成手段が、前記特徴のセットを用いて、前記各学習パターンの各特徴を計算し、前記各学習パターンの各特徴と、クラス情報と、を配置してなる前記分類テーブルにより前記パターンを分類するステップを実施し、
前記特徴抽出手段が、前記特徴のセットを用いて、前記入力パターンの各特徴を算出するステップを実施し、
前記診断手段が、前記算出結果および前記分類テーブルに基づいて、前記入力パターンを診断するステップを実施することを特徴とする。なお、本発明の方法は、前記画像診断支援装置の使用は必須ではなく、前述のような各種ステップを実施する方法であってもよい。
　本発明の画像診断支援方法は、
学習に用いる病理画像から腫瘍を中心としたイメージを切り出し、学習パターンとして入力する学習パターン入力手段と、
クラス情報が付された前記学習パターンを記憶保持する学習パターン記憶手段と、
複数の特徴候補を生成する特徴候補生成手段と、
前記特徴候補生成手段によって生成される特徴候補の中から診断に適した特徴のセットを決定する特徴決定手段と、
前記特徴決定手段により決定されている特徴のセットを記憶保持する特徴記憶手段と、
分類テーブルを作成する分類テーブル作成手段と、
診断する病理画像から腫瘍候補を中心としたイメージを切り出し、入力パターンとして入力するパターン入力手段と、
前記入力パターンから特徴を抽出する特徴抽出手段と、
前記特徴に基づいて診断する診断手段とを有する画像診断支援装置を用いた画像診断支援方法であって、
前記特徴決定手段が、特徴の値に応じて遷移させるべき、予め定めた個数の前記学習パターンの集合を用意し、前記各特徴候補に対応する各学習パターンの特徴を計算して、前記学習パターンのクラス情報との相互情報量が最大となる特徴候補を、特徴のセットの最初の特徴として決定し、前記各学習パターンを、決定した特徴に応じた重みを付けて、分配するとともに、決定した特徴に対応する集合に、順次、遷移させ、前記各学習パターンが含まれる集合の情報と、決定されている特徴とが既知であるとの条件の下で、各特徴候補に対応する各学習パターンの特徴と、前記各学習パターンのクラス情報との相互情報量が最大となる特徴候補を、特徴のセットの次なる特徴として、順次、決定するステップを実施し、
前記分類テーブル作成手段が、前記特徴のセットを用いて、前記各学習パターンの各特徴を計算し、前記各学習パターンの各特徴と、クラス情報とを配置してなる前記分類テーブルを作成し、前記分類テーブルにより前記学習パターンを分類するステップを実施し、
前記特徴抽出手段が、前記特徴のセットを用いて、前記入力パターンの各特徴を算出するステップを実施し、
前記診断手段が、前記入力パターンの各特徴と、前記特徴のセットの各特徴の決定の際に前記学習パターンが属する集合を逐次記録してなる遷移テーブルと、に基づいて前記入力パターンの遷移を行って、前記遷移の結果、前記入力パターンが属する集合に基づいて前記入力パターンを診断するステップを実施することを特徴とする。本発明の方法は、前記画像診断支援装置の使用は必須ではなく、前述のような各種ステップを実施する方法であってもよい。
　本発明の画像診断支援方法は、
学習に用いる病理画像から腫瘍を中心としたイメージを切り出し、学習パターンとして入力する学習パターン入力手段と、
クラス情報が付された前記学習パターンを記憶保持する学習パターン記憶手段と、
複数の特徴候補を生成する特徴候補生成手段と、
前記特徴候補生成手段によって生成される特徴候補の中から診断に適した特徴のセットを決定する特徴決定手段と、
前記特徴決定手段により決定されている特徴のセットを記憶保持する特徴記憶手段と、
分類テーブルを作成する分類テーブル作成手段と、
診断する病理画像から腫瘍候補を中心としたイメージを切り出し、入力パターンとして入力するパターン入力手段と、
前記入力パターンから特徴を抽出する特徴抽出手段と、
前記特徴に基づいて診断する診断手段とを有する画像診断支援装置を用いた画像診断支援方法であって、
前記特徴決定手段は、特徴の値に応じて遷移させるべき、予め定めた個数の前記学習パターンの集合を用意し、前記各特徴候補に対応する各学習パターンの特徴を計算して、前記学習パターンのクラス情報との相互情報量が最大となる特徴候補を、特徴のセットの最初の特徴として決定し、前記各学習パターンを、決定した特徴に応じた重みを付けて、分配するとともに、決定した特徴に対応する集合に、順次、遷移させ、前記各学習パターンが含まれる集合についての情報と、決定されている特徴とが既知であるとの条件の下で、各特徴候補に対応する各学習パターンの特徴と、前記各学習パターンのクラス情報との相互情報量が最大となる特徴候補を、特徴のセットの次なる特徴として、順次、決定するステップを実施し、
前記分類テーブル作成手段が、前記特徴のセットを用いて、前記各学習パターンの各特徴を計算し、前記各学習パターンの各特徴と、クラス情報とを配置してなる前記分類テーブルを作成し、前記分類テーブルにより前記学習パターンを分類するステップを実施し、
前記特徴抽出手段は、前記特徴のセットを用いて、前記順位の特徴が予め定めた値となる確率を示している、前記入力パターンの各特徴を算出するステップを実施し、
前記診断手段は、前記入力パターンの各特徴と、前記特徴のセットの各特徴の決定の際に前記学習パターンが属する集合を逐次記録してなる遷移テーブルと、に基づいて前記入力パターンが予め定められたクラス情報を有する確率を算出し、診断するステップを実施することを特徴とする。本発明の方法は、前記画像診断支援装置の使用は必須ではなく、前述のような各種ステップを実施する方法であってもよい。
　本発明の画像診断支援方法において、前記学習パターン入力手段および前記パターン入力手段は、
染色された前記病理画像中の各画素のＲＧＢ値から、予め設定された腫瘍細胞核が属する色領域に属する画素を選択するステップを実施し、
前記色領域の分布の中心と前記色領域に属する各画素との距離を算出するステップと、
前記距離に応じて前記各画素に信号を付与するステップを実施し、
前記病理画像中における前記信号の分布からピークを検出するステップを実施し、
前記ピークを中心としたイメージを前記学習パターンとして入力するステップを実施することが好ましい。
　本発明の画像診断支援方法において、前記特徴候補生成手段が生成する特徴候補には、特徴抽出関数から得られる特徴候補が含まれることが好ましい。
　本発明の画像診断支援方法において、前記特徴候補生成手段が生成する特徴候補には、複素ガボール関数を規格化した特徴抽出関数から得られる特徴候補が含まれることが好ましい。
　本発明の画像診断支援方法において、前記特徴候補生成手段が生成する特徴候補には、腫瘍の色を識別する特徴候補が含まれることが好ましい。
　本発明の画像診断支援方法において、前記特徴決定手段は、前記学習パターン入力手段によって算出された前記学習パターンに含まれる前記各画素の信号と、予め設定された閾値とを比較するステップを実施することが好ましい。
　本発明の画像診断支援方法において、前記特徴決定手段は、前記学習パターン入力手段によって算出された前記学習パターンに含まれる前記各画素の信号と、前記各画素近傍に位置する画素の信号の平均値とを比較するステップを実施することが好ましい。
　本発明の画像診断支援方法において、前記特徴決定手段は、前記各学習パターンに対して、前記特徴候補毎に予め定められたノイズパラメータによる操作を加えるステップを実施することが好ましい。
　本発明の画像診断支援方法において、前記特徴決定手段は、前記各特徴候補に対応する前記各学習パターンの特徴として、前記各学習パターンの特徴が、予め定めた値をとる確率を計算するステップを実施することが好ましい。
　本発明の画像診断支援方法において、前記特徴の値に関らず、前記学習パターンを分類できるとき、前記分類テーブル作成手段は、前記分類テーブルの対応する位置に、前記特徴の値に代えて冗長項を置くステップを実施することが好ましい。
　本発明の画像診断支援方法において、前記入力パターンの各特徴は、前記順位の特徴が予め定めた値となる確率の値であって、前記診断手段は、前記各特徴を用いて、前記分類テーブルに含まれる各特徴パターンが予め定めたクラス情報の値となる確率を計算して判定を行うステップを実施することが好ましい。
　本発明の画像診断支援システムは、
病理画像に患者固有の情報が付加された病理画像データを保持する情報処理端末と、前記病理画像データを診断する画像診断サーバとを有し、
前記画像診断サーバは、
前記病理画像データが有する前記病理画像を診断する前記本発明の画像診断支援装置と、
前記画像診断支援装置による診断結果を前記患者固有の情報とともに記憶する診断結果記憶手段とを有し、
前記情報処理端末は、前記患者固有の情報を伴って前記診断結果の送信を要求し、
前記画像診断サーバは、前記情報処理端末から受信した前記患者固有の情報と前記診断結果とともに記憶された前記患者固有の情報とを比較し、前記情報処理端末から受信した前記患者固有の情報と前記診断結果とともに記憶された前記患者固有の情報とが一致したとき、前記診断結果を前記情報処理端末に送信することを特徴とする。
　本発明の画像診断支援システムにおいて、さらに、前記画像診断支援装置および前記情報処置端末の使用料金データを保持する課金サーバを有することが好ましい。
　本発明の画像診断支援システムにおいて、さらに、前記課金サーバは、前記診断結果記憶手段に前記診断結果が記憶されたとき、前記画像診断支援装置の使用料金を加算することが好ましい。
　本発明の画像診断支援システムにおいて、前記課金サーバは、前記情報処理端末が前記診断結果を受信したとき、前記情報処理端末の使用料金を加算することが好ましい。
　本発明のサーバは、前記本発明の画像診断支援システムに用いるサーバであって、
前記サーバは、
前記サーバ内の情報を通信網を介して端末に送信するサーバ側送信手段と、
前記端末から送信された情報を前記通信網を介して受信するサーバ側受信手段と、
前記病理画像データを用いて被検者を診断する前記本発明の画像診断支援装置と、
前記画像診断支援装置による診断結果を前記患者固有の情報とともに記憶する診断結果記憶手段とを有し、
前記情報処理端末から受信した前記患者固有の情報と前記診断結果とともに記憶された前記患者固有の情報とを比較し、前記情報処理端末から受信した前記患者固有の情報と前記診断結果とともに記憶された前記患者固有の情報とが一致したとき、前記診断結果を前記情報処理端末に送信することを特徴とする。
　本発明の端末は、前記本発明の画像診断支援システムに用いる端末であって、前記端末は、
病理画像に患者固有の情報が付加された病理画像データを保持する情報処理端末であり、前記端末内の情報を前記通信網を介して前記サーバに送信する端末側送信手段と、
前記サーバから送信された情報を前記通信網を介して受信する端末側受信手段とを有し、
前記患者固有の情報を伴った前記診断結果の送信を要求し、前記サーバから送信された前記診断結果を受信することを特徴とする。
　これらの本発明の画像診断支援装置、画像診断支援方法、画像診断支援プログラムおよび画像診断支援システムによれば、例えば、腫瘍の性質が良性なのか悪性なのかの識別に、細胞核、その周辺組織等の変化が重要であることを考慮し、病理画像から細胞核、間質等を中心とするサブイメージ（サブイメージの画像データを抽出し、サブイメージを学習パターンおよび入力パターンとして記憶することにより、サブイメージに基づいて高精度かつ短時間で腫瘍の有無、および腫瘍の良性・悪性を判定することができる。なお、本発明において、病理画像は、前述の癌マーカー染色画像である。
　このような第２の形態によれば、例えば、腫瘍の性質が良性なのか悪性なのかを識別するために、細胞核やその周辺組織等の変化が重要であることを考慮し、前記サブイメージを抽出して、学習パターンおよび入力パターンとして記憶することによって、前記サブイメージに基づいて高精度かつ短時間で、例えば、腫瘍の有無、および腫瘍の良性・悪性を判定することができる。
　以下に、本発明について、実施形態２Ａおよび２Ｂを例にあげて説明する。以下、癌マーカー染色画像を、「ｍｉＲＮＡ染色画像」という。なお、本発明は、これらの実施形態には制限されない。
（実施形態２Ａ）
　図１３は、本実施形態に係る画像診断支援装置の構成を示すブロック図である。図１３に示すように、本実施形態に係る画像診断支援装置は、学習パターン入力手段１３００、学習パターン記憶手段１３０１、特徴候補生成手段１３０２、特徴決定手段１３０３、特徴記憶手段１３０４、分類テーブル作成手段１３０５、および分類テーブル１３０６を有している。
　学習パターン入力手段１３００は、前記ｍｉＲＮＡ染色画像から細胞核、細胞質等のサブイメージを抽出し、前記サブイメージを学習パターン記憶手段１３０１に格納する。
　学習パターン記憶手段１３０１は、学習に用いる所望の個数のサブイメージを、記憶保持する手段である。
　特徴候補生成手段１３０２は、予め定めた個数の特徴パラメータセットから、特徴候補を順次生成する手段である。
　特徴決定手段１３０３は、特徴候補生成手段１３０２によって生成された特徴候補の中から、パターン識別に最適な特徴のセットを決定する手段である。
　特徴記憶手段１３０４は、特徴決定手段１３０３により決定される特徴のセットを、記憶保持する手段である。
　分類テーブル作成手段１３０５は、特徴決定手段１３０３により決定される特徴のセットを用いて診断を行うための分類テーブル１３０６を作成する手段である。
　次に、図１４を参照して特徴決定処理の手順について説明する。図１４は、本実施形態に係る画像診断支援装置の特徴決定処理の手順を説明するためのフローチャートである。
　特徴候補生成手段１３０２は、予め設定しておく大量の特徴パラメータセット（例えば、Ｎ個）に基づいて、特徴候補を順次生成する（Ｓ１４０１）。本実施形態においては、前記Ｎ個の特徴パラメータセットのうち、１～Ｎ＿１のパラメータセットを、テクスチャに関連する特徴候補とし、Ｎ＿１＋１～Ｎ＿１＋Ｎ＿２のパラメータセットを、色に関連する特徴候補とし、Ｎ＿１＋Ｎ＿２＋１～Ｎのパラメータセット、を周辺の画素で平均化した色に関連する特徴候補とする。なお、ここでは、テクスチャに関連する特徴候補、色に関連する特徴候補、および周辺の画素で平均化された色に関連する特徴候補を、それぞれ特徴候補として採用したが、これに制限されず、病理画像に含まれる画素の特徴を決定するために必要な要素を、特徴候補として生成できる。
　次に、特徴候補生成手段１３０２において生成された特徴候補に基づいて、サブイメージが有する特徴を決定する方法について説明する。この特徴は、例えば、以下に示す手順１から３のいずれかにより決定される。
　手順１
　特徴候補生成手段１３０２は、まず、ｓ番目の特徴パラメータセットを読み出す。ｓ＝１～Ｎであり、ｓ＝１からスタートする。ｓ≦Ｎ＿１の場合は、ｓ番目の特徴パラメータセット（ｋ＿ｓ、ｒ０＿ｓ、σ＿ｓ、ｔｈ＿ｓ）を（ｋ、ｒ０、σ、ｔｈ）に代入し、パラメータｋ、ｒ０、σで規定される下記式（１）に例示する複素ガボール関数Ｇａｂ、およびガウス関数Ｇを生成する。なお、ｓ≦Ｎ＿１の場合、学習パターンとして、学習パターン記憶手段１３０１に記憶されたカラーのサブイメージをグレースケール変換したグレースケール画像を用いて特徴ｃを算出する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　・・・（１）
　ここで、ｒ＝（ｘ、ｙ）は位置ベクトルを表し、ｉ２＝－１である。そして、特徴候補生成手段１３０２は、前記式（１）の複素ガボール関数Ｇａｂとガウス関数Ｇとを、閾値パラメータｔｈ、および特徴候補の識別番号ｓとともに、特徴決定手段１３０３に送る（ステップＳ１４０２）。
　学習パターン記憶手段１３０１は、予め定めたＭ通りのサブイメージＩ＿ｔ（ｒ，ｉ＿ｒｇｂ）（ｔ＝１～Ｍ）と、各サブイメージが属するクラスｑｔ（ｔ＝１～Ｍ）との組を、特徴決定手段１３０３に送る（ステップＳ１４０３）。本実施形態においては、説明を簡単にするため、クラスは、２クラス（ｑ＝０または１）として説明する。本発明は、これには制限されず、例えば、３クラス以上の場合にも、本発明の方法は適用できる。
　特徴決定手段１３０３は、学習イメージ記憶手段１３０１から順次受け取ったサブイメージに対し、特徴候補を用いて下記式（２）に従って、特徴ｃを計算する（ステップＳ１４０４）。前記特徴候補は、例えば、前記式（１）に示す複素ガボール関数、ガウス関数およびその他のパラメータである。ここで、ｔ番目の学習パターンを、Ｉ＿ｔ（ｒ，ｉ＿ｒｇｂ）とし、すべての学習パターン（Ｍ個）について、前記計算を繰り返す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　・・・（２）
　前記式（２）の上段の式において、分母は、パターンの大きさ（画像の輝度）によるａの値の変動を抑えるための規格化（標準化）因子である。前記分母の式は、別の形式の規格化因子に置き換えることも可能である。また、取り扱うパターンによっては、このような規格化因子を省いてもよい。
　手順２
　特徴候補生成手段１３０２は、まず、ｓ番目の特徴パラメータセットを読み出す。ｓ＝１～Ｎであり、ｓ＝１からスタートする。Ｎ＿１＋１≦ｓ≦Ｎ＿１＋Ｎ＿２の場合は、ｓ番目の特徴パラメータセット（ｘ＿ｓ、ｙ＿ｓ、ｃｏｌｏｒ＿ｉｎｄｅｘ）および特徴候補の識別番号ｓを、特徴決定手段１３０３に送る（ステップＳ１４０２）。
　ここで、（ｘ＿ｓ、ｙ＿ｓ）は、サブイメージ中の特徴ｃを決定する画素の位置を表し、ｃｏｌｏｒ＿ｉｎｄｅｘ（＝１～４）は、特徴ｃに対応する色を表す。
　ｃｏｌｏｒ＿ｉｎｄｅｘ（＝１～４）は、例えば、以下に示すように、色と対応付けられる。
　前記癌マーカーｍｉＲＮＡによる細胞のｍｉＲＮＡ染色は、病理画像を特徴付ける上で重要な要素となることから、細胞核、細胞質、間質、空孔等の色を、それぞれ異なる色で染色することが好ましい。このように染色したｍｉＲＮＡ染色画像について、細胞核の色、細胞質の色、間質の色、空孔の色、それぞれにｃｏｌｏｒ＿ｉｎｄｅｘ＝１、２、３、４とインデックスを付与する。
　学習パターン記憶手段１３０１は、予め定めたＭ通りの学習パターン（カラーサブイメージ）Ｉ＿ｔ（ｒ、ｉ＿ｒｇｂ）と、各学習パターンが属するクラスｑｔ（ｔ＝１～Ｍ）との組を、特徴決定手段１３０３に送る（ステップＳ１４０３）。ｒは、画素の座標であり、ｉ＿ｒｇｂ＝１～３は、画像のｒ信号、ｇ信号、ｂ信号を指定するパラメータであり、ｔ＝１～Ｍである。なお、本実施形態においては、説明を簡単にするため、クラスは、２クラス（ｑ＝０または１）として説明する。本発明は、これには制限されず、例えば、３クラス以上の場合にも、本発明の方法は適用可能である。
　特徴決定手段１３０３は、学習パターン記憶手段１３０１から受け取った学習パターンについて（ステップＳ１４０３）、以下の方法により、学習パターン中の位置（ｘ＿ｓ、ｙ＿ｓ）に位置する画素の色を判定する。そして、それが、パラメータｃｏｌｏｒ＿ｉｎｄｅｘで指定される色と一致する場合には、特徴ｃの値を１とし、それ以外の場合には、特徴ｃの値を０とする（ステップＳ１４０４）。ここで、ｔ番目の学習パターンをＩ＿ｔ（ｒ、ｉ＿ｒｇｂ）とし、全ての学習パターン（Ｍ個）に対して、特徴ｃの決定が繰り返す。
　細胞核の色（ｃｏｌｏｒ＿ｉｎｄｅｘ＝１）は、サブイメージの検出において算出した各画素のヘマトキシレン信号を、予め定めた閾値（例えば、０．２５）と比較し、閾値よりも大きい場合、その画素の色が細胞核の色であると判断する。ここで、閾値を適応的に決定するため、ヘマトキシレン信号の値が、注目する画素の近傍で、例えば０．２５以上である画素に関してのみ、ヘマトキシレン信号の値を加算し、その平均値を求める。そして、例えば、前記平均値の０．９倍を、注目する画素の閾値とし、この閾値よりも、注目する画素のヘマトキシレン信号値が大きい場合には、その画素の色は細胞核の色であると判断する構成でもよい。
　細胞核の以外の空孔、細胞質、間質等の色は、予め定めた色領域に従って分類する。例えば、各画素のＲＧＢ値をＨＳＶ変換し、ＲＧＢ値を、色相（Ｈ：０～１）、彩度（Ｓ：０～１）、明度（Ｖ：０～１）の値に変換する。そして、注目する画素が細胞核の色に分類されておらず、明度Ｖ＞０．９２かつ彩度Ｓ＜０．２の場合、その画素の色は、空孔の色（ｃｏｌｏｒ＿ｉｎｄｅｘ＝２）と判断する。また、その画素の色が、細胞核の色および空孔の色のいずれにも該当せず、色相Ｈ＜０．９かつ明度Ｖ＜０．８５の場合は、細胞質の色（ｃｏｌｏｒ＿ｉｎｄｅｘ＝３）と判断する。そして、いずれにも該当しなかった場合は、その画素の色を、間質の色（ｃｏｌｏｒ＿ｉｎｄｅｘ＝４）と判断する。
　手順３
　特徴候補生成手段１３０２は、まず、ｓ番目の特徴パラメータセットを読み出す。ｓ＝１～Ｎであり、ｓ＝１からスタートする。Ｎ＿１＋Ｎ＿２＋１≦ｓ≦Ｎの場合は、ｓ番目の特徴パラメータセット（ｘ＿ｓ、ｙ＿ｓ、ｃｏｌｏｒ＿ｉｎｄｅｘ、ｔｈ＿ｓ）および特徴候補の識別番号ｓを、特徴決定手段１３０３に送る（ステップＳ１４０２）。
　ここで、（ｘ＿ｓ、ｙ＿ｓ）は、サブイメージ中の特徴ｃを決定する画素の位置を表し、ｃｏｌｏｒ＿ｉｎｄｅｘ（＝１～４）は、特徴ｃに対する色を表し、ｔｈは、閾値パラメータを表す。
　特徴決定手段１３０３は、学習パターン記憶手段１３０１から受け取った学習パターンについて（ステップＳ１４０３）、以下の方法により特徴ｃを決定する（ステップＳ１４０４）。ここで、ｔ番目の学習パターンをＩ＿ｔ（ｒ、ｉ＿ｒｇｂ）とし、全ての学習パターン（Ｍ個）に対して特徴ｃの決定を繰り返す。
　以下、注目する画素の色がｃｏｌｏｒ＿ｉｎｄｅｘ（＝１～４）に該当する色と判断する処理は、手順２と同様であるため説明を省略する。
　まず、特徴決定手段１３０３は、サブイメージの位置（ｘ＿ｓ、ｙ＿ｓ）の近傍の画素からｘ座標、ｙ座標へ２画素以内にある画素（ｘ'、ｙ'）の色が、ｃｏｌｏｒ＿ｉｎｄｅｘで指定される色と一致しているか否かを調べる。前記画素（ｘ'、ｙ'）は、例えば、注目する画素（ｘ＿ｓ、ｙ＿ｓ）からｘ座標、ｙ座標へ２画素以内にある画素であり、｜ｘ－ｘ'｜≦２かつ｜ｙ－ｙ'｜≦２と表わされる。そして、ｃｏｌｏｒ＿ｉｎｄｅｘで指定される色と一致する色を持つ近傍の画素数を加算し、それを近傍の画素の総数で割り、平均値を求める。そして、その平均値が閾値パラメータ（ｔｈ＿ｓ）を越える場合、特徴ｃは１をとし、それ以外の場合、特徴ｃは０とする。
　特徴決定手段１３０３は、前述の３つの手順に加え、例えば、以下の方法によって、注目する画素の特徴ｃを決定することもできる。
　まず、注目する画素が含まれるサブイメージの各画素のＲＧＢ値をＨＳＶ変換し、ＲＧＢ値を色相（Ｈ：０～１）、彩度（Ｓ：０～１）、明度（Ｖ：０～１）の値に変換する。次に、Ｈ、Ｓ、Ｖの値を、例えば、５段階に粗視化する。例えば、注目する画素のＨ、Ｓ、Ｖの値が、すべて０．２（＝１／５）以下であれば、その画素の色を（１、１、１）とする。また、Ｈ、Ｓの値が０．２以下で、Ｖの値が０．２＜Ｖ≦０．４であれば、注目する画素の色を（１、１、２）とする。ここで、特徴パラメータセットとして特徴候補生成手段１０２から受け取った（ｘ、ｙ、Ｈ'、Ｓ'、Ｖ'）で指定されるサブイメージ中の位置（ｘ、ｙ）の画素の色が、（Ｈ'、Ｓ'、Ｖ'）である場合、特徴ｃは１とし、それ以外の場合、特徴ｃは０とする。
　この、ｓ番目の特徴候補（特徴パラメータセット）を用いて、各サブイメージに対して特徴ｃが計算されると、特徴決定手段１３０３は、ｓ番目の特徴候補から得られる相互情報量ＭＩを、下記式（３）に従って算出し、これを、特徴候補の識別番号ｓとともに記憶する（ステップＳ１４０５）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　・・・（３）
　ここで、Ｑは、クラスの集合｛ｑ＝０、ｑ＝１｝であり、Ｍは、サブイメージの総数である。Ｍ（ｑ）は、クラスｑに属するサブイメージの総数、Ｍ（ｃ）は、特徴がｃであるサブイメージの総数、Ｍ（ｑ、ｃ）は、特徴がｃでありかつクラスｑに属するサブイメージの総数である。
　また、前記式（３）において、＜Ｈ［Ｑ｜ｃ］＞Ｃは、ｃに関する平均化操作であり、下記式（４）で算出される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　・・・（４）
　前述の処理に従って、次の（ｓ＋１）番目の特徴候補が特徴候補生成手段１３０２から送られ、同様の処理が繰り返される（ステップＳ１４０２～Ｓ１４０５）。こうして全ての特徴候補（Ｎ個）に対応する相互情報量ＭＩの計算が完了した時点で、特徴決定手段１３０３は、各特徴候補から得られる相互情報量ＭＩを比較する。そして、最大の相互情報量Ｍａｘ　ＭＩ［Ｑ；Ｃ］が得られる特徴候補を、決定すべき特徴のセットの第１番目の特徴として決定する（ステップＳ１４０６）。
　このように、第１番目の特徴が決定されると、特徴決定手段１３０３は、第２番目の特徴を決定する。前述と全く同様にして、特徴決定手段１３０３は、特徴候補を特徴候補生成手段１３０２から順次受け取り（ステップＳ１４０２）、各サブイメージに対して特徴ｃを算出する（ステップＳ１４０３、Ｓ１４０４）。なお、使用可能な記憶容量に応じて、前述した第１番目の特徴を決定する際のステップＳ１４０４における特徴ｃの算出結果を記憶保持しておき、特徴決定手段１３０３が前記記憶保持内容（特徴候補）を読み出す操作に代えても良い。ｓ番目の特徴パラメータセットを用いて、各サブイメージに対して特徴ｃが計算された時点で、特徴決定手段１３０３は、既に決定されている第１番目の特徴ｃ１が既知であるという条件下で、ｓ番目の特徴候補から得られる相互情報量ＭＩ２を、下記式（５）に従って算出し、これを、特徴候補の識別番号ｓとともに記憶しておく（ステップ１４０５）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000005
 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　・・・（５）
　ここで、Ｍ（ｃ１）は、１番目の特徴がｃ１であるサブイメージの総数であり、Ｍ（ｑ、ｃ１）は、１番目の特徴がｃ１で、かつクラスｑに属するサブイメージの総数である。また、Ｍ（ｃ、ｃ１）は、特徴がｃで、かつ１番目の特徴がｃ１であるサブイメージの総数であり、Ｍ（ｑ、ｃ、ｃ１）は、特徴がｃで、１番目の特徴がｃ１で、かつクラスｑに属するサブイメージの総数である。
　このような操作に従って、次の（ｓ＋１）番目の特徴候補が特徴候補生成手段１３０２から送られ、同様の操作が繰り返される（ステップＳ１４０２～Ｓ１４０５）。こうして、全ての特徴候補（Ｎ個）に対応する相互情報量ＭＩの算出が済んだ時点で、特徴決定手段１３０３は、各特徴候補から得られる条件付きの相互情報量ＭＩ２を比較し、最大の情報量が得られる特徴候補を、決定すべき特徴のセットの第２番目の特徴ｃ２として決定する（ステップＳ１４０６）。
　以下同様に、第ｍ番目の特徴までが決定されたら、第（ｍ＋１）番目の特徴ｃは、下記式（６）の評価関数ＭＩｍ＋１を最大にする特徴候補を採用する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000006
 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　・・・（６）
　前記ＭＩｍ＋１は、第ｍ番目までの特徴（ｃ１、ｃ２、．．．、ｃｍ）が既知であるという条件下で、特徴ｃから得られる情報量を表す。このような処理は、新しい特徴を選んでも、得られる情報量（追加の情報量）が、予め設定しておく閾値ＭＩ＿ｔｈよりも小さくなるまで続けられる。例えば、閾値ＭＩ＿ｔｈをゼロに設定している場合、得られる情報量（追加の情報量）がゼロになるまで、即ち、終了条件が満たされるまで、次の特徴を決定するため、前述した手順が繰り返される。
　そして、この終了条件が満たされた時点で特徴決定処理は終了する。決定された特徴のセットの各パラメータは、特徴記憶手段１３０４に格納される（ステップＳ１４０７）。
　また、前記特徴決定処理の変形例として、特徴候補生成手段１３０２が生成する特徴候補の数を減らす工夫を加えた、以下の構成が考えられる。例えば、各複素ガボール関数について、前記式（２）で算出されるａの値のクラス内平均値を、ｑ＝０のクラス、ｑ＝１のクラスのそれぞれに対して、予め調べておく。そして、閾値ＭＩ＿ｔｈの値を、これら２つのクラス内平均値の中間値に固定する構成が考えられる。また、例えば、第１番目の特徴を決定する際に、前記式（３）で各複素ガボール関数に対して相互情報量ＭＩを計算するが、この時、各特徴候補に対して、それぞれ最大のＭＩを与える閾値ＭＩ＿ｔｈを記録しておく。そして、第２番目以降の特徴を決定する場合、閾値ＭＩ＿ｔｈの値をそのまま固定するという構成が挙げられる。
　前記実施形態では、特徴候補を構成する特徴抽出関数として複素ガボール関数を用いているが、他の特徴抽出関数を加えてもよく、また、適宜、他の特徴抽出関数だけで特徴候補を構成してもよい。
　また、例えば、クラスごとに部分空間を構成し、その部分空間への距離を表す指標を特徴候補に加える変形も好ましい。また、ガウス関数を用いて計算される、ある点の近傍の重み付き平均輝度を特徴候補に加えることも可能である。また、ガウス関数を用いて計算される、ある点の近傍の重み付き平均輝度を、より広がりの大きいガウス関数を用いて計算される平均輝度で規格化したもの、即ち、ある点の近傍がその周辺よりも明るいか、暗いかを示す指標を、特徴候補に加えることも可能である。その他、診断で用いられる標準的な特徴を、特徴候補に加えることも可能である。
　特徴の決定処理が完了し、決定された特徴のセットが特徴記憶手段１３０４に記憶された時点で、パターン識別に用いるための分類テーブル１３０６（図１６に示す）の作成が可能となる。以下、所望の手段により起動された分類テーブル作成手段１３０５が、分類テーブル１３０６を作成する処理について説明する。
　まず、分類テーブル作成手段１３０５は、学習パターン記憶手段１３０１から各サブイメージを、特徴記憶手段１３０４からは、特徴のセットの各パラメータを（以下、全部でｎ個の特徴が決定されているものとする）受け取る。そして、各サブイメージと、前記各サブイメージに対する各特徴の値（ｃ１、ｃ２、．．．、ｃｎ）とを、ともに分類テーブル１３０６に記憶する。
　前記手順により、各サブイメージを一意に分類する分類テーブルの作成が可能であり、より好ましくは、冗長項（ｄｏｎ'ｔ　ｃａｒｅ項）を用いる。例えば、先頭からｉ番目までの特徴の値（ｃ１、ｃ２、．．．、ｃｉ）だけで、あるサブイメージの分類が可能な場合には、ｉ＋１番目以降の特徴ベクトルの値は、ｄｏｎ'ｔ　ｃａｒｅを表す記号に置き換えて記憶する。
　前記冗長項（ｄｏｎｔ'ｔ　ｃａｒｅ）を用いて、分類テーブル１３０６を作成する手順について、一例として、図１５を用いて説明する。図１５は、本実施形態に係る分類テーブル１３０６の作成処理の手順を示すフローチャートの一例である。
　まず、分類テーブル作成手段１３０５は、入力されたサブイメージに対して、特徴記憶手段１３０４に記憶されている特徴のセットの各パラメータを用いて、特徴ベクトル（ｃ１、ｃ２、．．．、ｃｎ）の値を計算する（ステップＳ１５０１、Ｓ１５０２）。
　前記特徴ベクトルと一致する特徴ベクトルを有するサブイメージが、分類テーブル１３０６中に存在するか否かを判断する（ステップＳ１５０３）。分類テーブル１３０６にｄｏｎ'ｔ　ｃａｒｅを表す記号が記載されている場合は、それに対応する特徴の値は、いかなるものであっても一致するものと見なして判定を行う。
　前記判断の結果、計算した特徴ベクトルと一致する特徴ベクトルを有するサブイメージが、分類テーブル中に既に存在する場合、前記サブイメージを記録することなく、ステップＳ１５０１に戻り、次のサブイメージの入力を行う。
　一方、一致するサブイメージが無い場合、インクリメント変数ｉ＝１を設定して（ステップＳ１５０４）、以下の処理を行う。まず、このサブイメージが属するクラス（例：ｑ＝０）以外のクラス（例：ｑ＝１）に属するサブイメージの中に、１番目からｉ番目までの特徴（ｃ１、ｃ２、．．．、ｃｉ）の全てが、このサブイメージと一致するサブイメージがあるか否かを調べる（ステップＳ１５０５）。
　その結果、一致するサブイメージが無い場合、１番目からｉ番目までの特徴の値（ｃ１、ｃ２、．．．、ｃｉ）を、このサブイメージが属するクラスの標識（例：ｑ＝０）とともに、分類テーブルに記録し、ｉ＋１番目以後の特徴ベクトルの値には、ｄｏｎ'ｔ　ｃａｒｅを表す記号を記録する（ステップＳ１５０６）。そして、ステップＳ１５０１に戻り、次のサブイメージの入力を行う。
　他方、このサブイメージと一致するサブイメージが１つでもある場合は、インクリメント変数ｉを１増加して、ステップＳ１５０１に戻る。即ち、入力したサブイメージのｉ番目までの特徴の値により自他識別可能になるまで、ｉを増加する処理を継続する。
　以上の処理は、全てのサブイメージを入力するまで繰り返される。なお、以上の手続のみでは、サブイメージの全てが分類できない場合が生じうる。例えば、異なるクラスに属するサブイメージが同じ特徴ベクトルを持つことがある。この場合、例えば、それぞれのクラスに属するサブイメージの数を数えて、多いほうのクラスを、この特徴ベクトルが表すクラスと定めることもできる。
　また、ｉを増加させつつ、特徴ｃ１～ｃｉが一致するパターンをグループ化（細分化）してゆき、１つのグループに１のサブイメージしか存在しない場合に、そのサブイメージのｉ＋１以降の特徴を、ｄｏｎ'ｔ　ｃａｒｅ項とする方法等も可能である。
　図１６は、本発明により採用された分類テーブル１３０６の例である。図１６は、各サブイメージのクラスの識別標識（ｑ）と、特徴ベクトル（ｃ１、ｃ２、．．．、ｃｎ）とを格納するテーブルを示す。図１６において、記号「＊」は、ｄｏｎ'ｔ　ｃａｒｅを表す。
　続いて、図面を参照して、前記分類テーブルを用いる病理画像の診断方法について説明する。
　図１７は、本発明の診断方法の処理の流れの一例を示すブロック図である。図１７には、パターン入力手段１７０１と、特徴抽出手段１７０２と、診断手段１７０３とを示される。特徴抽出手段１７０２の特徴抽出のために用いる決定済みの特徴のセットを記憶保持する特徴記憶手段１３０４と、診断手段１７０３が診断に用いる作成済みの分類テーブル１３０６とが示されている。
　パターン入力手段１７０１は、所望の媒体からサブイメージを入力するための手段である。本実施形態においては、病理組織を構成する細胞の細胞核を中心とした画像（サブイメージ）を入力するための手段である。本実施形態においては、細胞核を中心とした画像を入力したが、これに限定されるものではない。例えば、細胞核、空孔、細胞質、間質等、病理組織の診断において病理医が判断材料として用いる画像を、サブイメージとして入力できる。
　特徴抽出手段１７０２は、決定された特徴のセットを用いて、パターン入力手段１７０１から送られたサブイメージから、その特徴を抽出する手段である。
　診断手段１７０３は、特徴抽出手段１７０２により得られた特徴に基づいて、サブイメージの表す情報を診断する手段である。
　まず、パターン入力手段１７０１により得られた特徴に基づいて、サブイメージを取り込んで、特徴抽出手段１７０２に送る。
　続いて、特徴抽出手段１７０２が入力されたサブイメージに対して、サブイメージの特徴ベクトルを算出し、更に、前記算出結果を診断手段１７０３に対して送る。前記特徴ベクトルは、特徴記憶手段１３０４に記憶された手順１、２、および３によって決定した特徴のセット、例えば、前述の特徴決定手法によって決定された特徴のセットを用いて、算出される。
　診断手段１７０３は、分類テーブル１３０６を参照し、この特徴ベクトルと一致するものを検索し、そこに記録されているクラスの標識を読み出し、それを診断結果として出力する。このとき、分類テーブル１３０６上にｄｏｎ'ｔ　ｃａｒｅを表す記号が記録されている場合、診断手段１７０３は、それに対応する特徴の値がいかなるものであっても、前記部分については一致するものとして判定する。
　ここで、前記各手順によりサブイメージの特徴の決定およびイメージの判定を行う本発明の利点を、一層明確にすべく、本発明と決定木を用いる従来手法（ＩＤ３、Ｃ４．５）との相違点について述べる。
　ＩＤ３等も、決定木の各ノードにおける分類ルールを、情報量最大化の基準に従って決定していく点において、本発明と共通する。しかしながら、ＩＤ３およびＣ４．５では、分類ルール（例えば、特徴）を、ノード毎に決定する。例えば、１番目の特徴ｃ１を決定した後で２番目の特徴を決定する際には、１番目の特徴ｃ１が１である場合、０である場合、それぞれの場合で異なる分類ルール（特徴）が決定される。これに対して、本発明は、ノード深さが同じ場合、任意のｎ番目の特徴には、同一の特徴が決定される。この点が両者の大きな相違点である。
　いずれの方法を採用する場合でも、学習パターンは完全に分類される。しかしながら、汎化性能、すなわち、学習していないサブイメージに対する識別性能に大きな違いが現れる。両者の木の深さが同じ場合（ｎとする）、ＩＤ３またはＣ４．５では、２ｎ個の特徴が決定されるのに対して、本発明では、ｎ個の特徴だけが決定される。従って、本発明の方がより単純な構造を持つことになる。前記決定される特徴の個数の差は、問題がより困難になり、より深い木が必要になるに従い、指数関数的に拡大する。
　学習パターンに対する性能が同一の場合、より単純な構造の分類器の方が汎化性能に優れていることが知られている（オッカムの剃刀）。この点が、本発明による特徴決定方法およびそれを用いた診断方法が、従来手法に比べて性能、特に汎化性能を大幅に向上できる理由である。
　ここで、学習パターン入力手段１３００およびパターン入力手段１７０１において、病理画像からサブイメージを抽出する処理について説明する。なお、本実施形態においては、細胞核を中心としたサブイメージの抽出について説明するが、これに限定されるものではない。よって、空孔、細胞質、間質等、病理医が病理画像を観察する際に着目する形態的な特徴部分を、サブイメージとして抽出することもできる。
　細胞核を中心としてサブイメージを抽出する処理は、病理画像中の各画素のＲＧＢ値からｍｉＲＮＡ染色信号を算出するステップと、病理画像中における各画素のｍｉＲＮＡ染色信号の分布から細胞核の中心位置を検出するステップとに大別される。実際は、ｍｉＲＮＡ染色信号の平滑化等の処理も含まれる。以下の例は、ｍｉＲＮＡ染色により細胞核が青色に染色された病理画像を例として、説明する。
　以下、図１８を用い、学習パターン入力手段１３００およびパターン入力手段１７０１において、サブイメージを抽出する処理について説明する。
　学習パターン入力手段１３００およびパターン入力手段１７０１は、病理画像が入力されると（ステップＳ１８０１）、まず、細胞核が青く染色された病理画像の各画素にｍｉＲＮＡ染色信号を付与する。
　各画素のＲＧＢ値（２４ビットの場合、Ｒ＝０～２５５、Ｇ＝０～２５５、Ｂ＝０～２５５）から、青く染まった細胞核の部分は、値１．０となり、他の領域（異なる色で染色された領域）は、値０となる、ｍｉＲＮＡ染色信号を算出する。この処理は、ＲＧＢ空間内における細胞核の色分布を調べ、その分布の中心から各画素のＲＧＢ値までの距離を計算することによって行われる。つまり、各画素のＲＧＢ値を調べ、その値がＲＧＢ空間内における細胞核の色分布の中心付近に位置すれば、１に近い大きいｍｉＲＮＡ染色信号を、中心から遠く離れていれば。０に近いｍｉＲＮＡ染色信号を付与する。ただし、染色処理の違い等によって、サンプルごとに核の染まり方に変動が起こりうるため、ここでは適応的な方法によって細胞核の色分布を算出する。
　すなわち、予め定めた細胞核の色領域を参照して、病理画像中から、ＲＧＢ値がこの細胞核の色領域内に入る画素のみを選択し、これを細胞核の色を表す画素とする。
　細胞核の色領域は、以下の方法で、予め定められる。まず、染色処理の違い等によって染まり方に変動がある細胞核の画像を集める。次に、各画像中で、細胞核領域の各画素のＲＧＢ値を調べる。同時に、これらの各画像中で、例えば、細胞質、間質、空孔に特徴的な色で染色された領域の画素のＲＧＢ値も調べる。そして、前記細胞質、間質、空孔に特徴的な色で染色された領域の画素の画素が、全くまたは殆ど含まれず、かつ細胞核領域の画素からなる細胞核の色領域を決める。
　学習パターン入力手段１３００およびパターン入力手段１７０１は、具体的には、以下の方法に基づいて、ｍｉＲＮＡ染色信号を各画素に付与する。
　まず、予め定められた細胞核の色領域を参照して、学習パターン入力手段１３００およびパターン入力手段１７０１に入力された病理画像中から、ＲＧＢ値が細胞核の色領域に入る画素をＮ個選択する（ステップＳ１８０２）。そして、選択されたＮ個の各画素のＲＧＢ値を、Ｒｉ、Ｇｉ、Ｂｉ（ｉ＝１～Ｎ）とする。次に、各画素のＲｉ、Ｇｉ、Ｂｉ（ｉ＝１～Ｎ）から、下記式（７）に従って、平均値（Ｒ０、Ｇ０、Ｂ０）および共分散行列Σを算出する（ステップＳ１８０３）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000007
 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　・・・（７）
　前記式（７）において、Ｔは、ベクトルの転置操作を表す記号である。この共分散行列Σを用いて、下記式（８）に従って、各画素（Ｒ、Ｇ、Ｂ）と平均値（Ｒ０、Ｇ０、Ｂ０）との距離Ｌ、およびｍｉＲＮＡ染色信号（Ｈｅｍａ）を算出する（ステップＳ１８０４）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000008
 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　・・・（８）
　次に、各画素について算出したｍｉＲＮＡ染色信号の分布から、細胞核の中心位置を検出する処理について説明する。
　前記式（８）によって各画素について算出されたｍｉＲＮＡ染色信号を、Ｈｅｍａ（－ｒ）とする。ここで、－ｒ＝（ｘ、ｙ）は、病理画像中の画素の位置を表す位置ベクトルである。平滑化マスクＭｌｏｗを用いた下記式（９）により、Ｈｅｍａ（－ｒ）に平滑化処理を施し（ステップＳ１８０５）、そのピークを、細胞核の中心位置とする（ステップＳ１８０６、Ｓ１８０７）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000009
 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　・・・（９）
　前記平滑化マスクＭｌｏｗとしては、例えば、下記式（１０）に示す関数を用いる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000010
 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　・・・（１０）
　ここで、前記式（１０）の規格化因子１／ｌは、下記式（１１）によって定める。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000011
 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　・・・（１１）
　また、前記Ｓｅｘ、Ｓｉｎは、パラメータであり、それぞれ予め定めておく。通常、Ｓｅｘの値は、細胞核の典型的なサイズ（半径）程度に、また、Ｓｉｎの値は、Ｓｅｘの１．２倍程度の値に設定する。
　各画素についてｍｉＲＮＡ染色信号（ｍｉＲ'）が算出されると、注目している点におけるｍｉＲ'の値が、予め定めた閾値（例えば、０．２５）よりも大きく、かつその点の近傍（例えば、ｘ座標、ｙ座標の違いが、いずれも３画素以内である画素）のいずれの点におけるｍｉＲ'の値よりも大きい場合、その点をピークとして検出し、これを細胞核の中心とする（ステップＳ１８０７）。
　細胞核の大きさに変動があり得ることを考慮して、前記処理のうち、ｍｉＲＮＡ染色信号の平滑化処理およびピーク検出処理は、異なるサイズ（パラメータＳｅｘ、Ｓｉｎ）をもつ複数の（例えば、３種類）平滑化マスクを用いて、平滑化処理およびピーク検出処理を行う。そして、いずれかの処理で検出されたピーク位置を、細胞核の中心とする構成としてもよい。
　学習パターン入力手段１３００およびパターン入力手段１７０１は、入力された病理画像に対して、まず前記処理によって細胞核中心を検出する。そして、検出された細胞核中心を中心に予め定めたサイズのイメージ（サブイメージ）を、病理画像中から多数（検出された細胞核中心の数だけ）切り出し、これらの各サブイメージを、学習パターンまたは入力パターンとして抽出する（ステップＳ１８０８）。
　本発明の画像診断支援システムは、例えば、ｍｉＲＮＡ染色画像の有効性を評価する手段を有してもよい。このように、ｍｉＲＮＡ染色画像の有効性を評価することによって、さらに癌評価の精度を向上できる。なお、このｍｉＲＮＡ染色画像の有効性の評価は、ｍｉＲＮＡ染色を行った切片スライドの有効性の評価と同義である。以下に、一例を示すが、本発明は、これには制限されない。
（実施形態３）
　本実施形態３は、前記第１の形態または第２の形態の画像診断支援システムにおいて、さらに、ｍｉＲＮＡ染色画像の染色状態の補正を行う補正手段、補正したｍｉＲＮＡ染色画像における非腫瘍細胞を検出する非腫瘍細胞検出手段、および、検出した非腫瘍細胞のｍｉＲＮＡ染色の有無を判定する判定手段を有する。
　本実施形態のシステムによる処理は、例えば、以下のように行える。まず、取得したｍｉＲＮＡ染色画像について、染色状態の補正を行う。前記補正は、例えば、使用した切片スライドの状態、同様にして染色した切片スライドの状態、染色条件、および画像データの取得条件等を考慮し、色素、強度等について行う。
　そして、補正後のｍｉＲＮＡ染色画像について、非腫瘍細胞の検出を行う。前記非腫瘍細胞は、例えば、細胞の形状および大きさ、細胞核の形状および大きさ、組織における存在部位等の情報に基づいて、判断できる。また、この判断は、例えば、前述のような条件をベースに機械学習を行ったモジュールによって行える。
　前記非腫瘍細胞の検出は、例えば、カウンター染色剤による染色画像を取得して、このカウンター染色画像と前記ｍｉＲＮＡ染色画像とをマッチングすることによって、行える。マッチングは、例えば、前述したｍｉＲＮＡ染色画像とＨＥ染色画像とのマッチングと同様である。前記カウンター染色剤は、例えば、被検体である試料の種類に応じて適宜決定できるが、例えば、ケルンエヒトロート等があげられる。検出する非腫瘍細胞の種類は、特に制限されず、例えば、被検体である試料の種類に応じて適宜決定できるが、例えば、リンパ球、繊維芽細胞、血管内皮細胞等があげられ、これらの細胞が、規定の細胞の大きさおよび／または形状であるか否かによって、非腫瘍細胞か否かを判断できる。
　そして、前記ｍｉＲＮＡ染色画像において、前記検出した非腫瘍細胞のｍｉＲＮＡ染色の有無を判定する。その結果、前記非腫瘍細胞がｍｉＲＮＡ染色されている場合、このｍｉＲＮＡ染色画像は、有効性無しとして、さらなるステップには進まず、処理を終了する。他方、前記非腫瘍細胞がｍｉＲＮＡ染色されていない場合、このｍｉＲＮＡ染色画像は、有効性ありとして、さらなるステップ、例えば、前述したｍｉＲＮＡ染色に基づく腫瘍領域の検出に進む。
　なお、前述した各種実施形態は、特に示さない限り、それぞれ相互に組み合わせ可能である。
　つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記の実施例により制限されない。
［実施例１］
　プローブを用いてｉｎ　ｓｉｔｕ　ハイブリダイゼーションを行い、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者（ｎ＝４）および急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）患者（ｎ＝２）の白血球におけるｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａの発現レベルを調べた。
　前記プローブとしては、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）でラベルしたＬＮＡ修飾プローブ（商品名ｍｉＲＣＵＲＹ－ＬＮＡ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｐｒｏｂｅ、Ｅｘｉｑｏｎ社）を用いた。以下に、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ検出用の前記プローブの配列を、配列番号５に示し、陰性コントロール用の前記プローブの配列を、配列番号６に示す。下記陰性コントロール用プローブの配列は、下記ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ検出用プローブの配列を、スクランブルした配列である。
ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ検出用プローブ（配列番号５）
　　５’－ａｃａｇｇｃｃｇｇｇａｃａａｇｔｇｃａａｔａ－３’
陰性コントロール用プローブ（配列番号６）
　　５’－ｇｔｇｔａａｃａｃｇｔｃｔａｔａｃｇｃｃｃａ－３’
　ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、ＲｉｂｏＭａｐ　ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（商品名、Ｖｅｎｔａｎａ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、Ｖｅｎｔａｎａ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ　ａｕｔｏｍａｔｅｄ　ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（商品名、Ｖｅｎｔａｎａ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社）により行った。なお、特に示さない限り、Ｖｅｎｔａｎａ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社のＲｉｂｏＭａｐ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｎｏｔｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖｅｎｔａｎａｍｅｄ．ｃｏｍ）が提供する標準的プロトコールに従った。
　まず、前記各白血病患者の全血から白血球を回収した。得られた白血球について、一般的な方法により、パラホルムアルデヒド固定液による固定、パラフィン包埋、切片の調製を行った。そして、前記切片を脱パラフィンした後、ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った。ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいて、脱パラフィン後の切片の最初の固定化は、前記切片を有するスライドを、ホルマリンベースのＲｉｂｏＰｒｅｐ（商品名、Ｖｅｎｔａｎａ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社）で、３７℃、３０分間インキュベートすることにより行った。続いて、塩酸ベースのＲｉｂｏＣｌｅａｒ液（商品名、Ｖｅｎｔａｎａ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社）で、３７℃で１０分間インキュベートした後、ｒｅａｄｙ－ｔｏ－ｕｓｅ　ｐｒｏｔｅａｓｅ２（商品名、Ｖｅｎｔａｎａ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、３７℃で処理した。つぎに、前記スライドを、７０℃で６分間、変性のためのプレハイブリダイズ処理を行った。前記プレハイブリダイゼーション後、３７℃で６時間、ＲｉｂｏＨｙｄｅハイブリダイゼーションバッファー（商品名、Ｖｅｎｔａｎａ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、スライド当たり２ｎｇの前記ＤＩＧラベル化ＬＮＡ修飾プローブをハイブリダイズさせた。前記スライドを、２×ＲｉｂｏＷａｓｈ液（商品名、Ｖｅｎｔａｎａ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、４２℃で６分間、低ストリンジェントの洗浄を行った。その後、１×ＲｉｂｏＦｉｘ（商品名、Ｖｅｎｔａｎａ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、３７℃で２０分間洗浄し、続いて、スライド当たり０.１μｇのビオチンラベル化抗ＤＩＧ抗体（Ｓｉｇｍａ社）と３７℃で３０分間インキュベートした。そして、前記スライドを、スライド当たり０．１μｇのストレプトアビジン－アルカリフォスファターゼコンジュゲート（Ｄａｋｏ社）を用いて、３７℃で１６分間インキュベートした後、ＢｌｕｅＭａｐ　ＮＢＴ／ＢＣＩＰ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｋｉｔ（商品名、Ｖｅｎｔａｎａ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、３７℃で４時間、シグナルを検出した。最後に、隣接するスライド切片をケルンエヒトロートおよびＨＥにより対比染色し、カバーガラスで覆った。
　この結果を、図２２に示す。図２２において。上段および中段のパネルは、ＡＭＬ患者（ＦＡＢ分類Ｍ３）由来の白血球の染色を示す写真であり、下段のパネルは、ＡＬＬ患者由来の白血球の染色を示す写真である。左列のパネルは、ケルンエヒトロートによる対比染色を示す写真であり、中列のパネルは、前記ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ検出用プローブを用いた染色を示す写真であり、右のパネルは、前記陰性コントロール用プローブを用いた染色を示す写真である。各図におけるバーは、５０μｍの長さを示す。
　同図に示すように、ＡＭＬ患者およびＡＬＬ患者のいずれについても、細胞が染色されており、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ検出用プローブを用いた染色のシグナル強度は、陰性コントロール用プローブを用いた染色のシグナル強度よりも強かった。なお、図２２は、ＡＭＬ患者１名およびＡＬＬ患者１名の結果を示すが、他の患者においても同様の結果が得られた。他方、図示していないが、正常白血球では、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａの発現は検出されなかった。このように、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａが、ＡＭＬ患者およびＡＬＬ患者の白血球において強く発現していることから、白血球中のｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａの検出によって、細胞の癌の可能性を評価できることがわかった。
　また、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ検出用プローブを用いた染色では、ケルンエヒトロートによる染色と同様の領域が染色された。前記ケルンエヒトロート染色は、癌化領域を染色できるため、この結果からも、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ検出によって、癌の可能性を評価できるといえる。
［実施例２］
　乳房から採取した組織を用いた以外は、前記実施例１と同様にして、切片を作成し、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａをｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより検出した。その結果を、図２３に示す。図２３の（Ａ）～（Ｄ）は、異なる部分から採取した乳房組織についてのｍｉＲＮＡ染色の結果を示す写真である。
　図２３の各図において、染色部分の一部を矢印で示す。これらの図に示すように、ｍｉＲＮＡの染色が確認された。
　以上、実施形態および実施例を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。
　この出願は、２００９年４月２１日に出願された日本出願特願２００９－１０３３３２を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
［実施例３］
　肝細胞から採取した組織を用いた以外は、前記実施例１と同様にして、切片を作成し、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａをｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより検出した。
　肝細胞は、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ＨＣＣ）患者（ｎ＝２２）と、非腫瘍型の肝硬変（ｌｉｖｅｒ　ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ：ＬＣ）の患者（ｎ＝５）から採取した。なお、ＨＣＣ患者の肝細胞は、年齢、性別、肝炎ウイルスの種類、臨床病期および腫瘍分化度が、それぞれ異なる患者から採取した。
　その結果、非腫瘍型のＬＣ患者は、肝細胞において、前記ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ検出用プローブによる染色は、ほとんど確認できなかった。これに対して、全てのＨＣＣ患者について、肝細胞において、前記ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ検出用プローブによる顕著な染色が確認された。
　２２例のＨＣＣ患者由来の肝細胞のうち、代表して２例の肝細胞（ケース１およびケース２）の染色結果を図２４に示す。図２４は、ＨＣＣ患者由来の肝細胞の染色を示す写真であり、上段および中段のパネルは、ケース１の肝細胞の結果であり、下段のパネルは、ケース２の肝細胞の結果を示す。左列のパネルは、ケルンエヒトロートおよびＨＥによる対比染色を示す写真であり、中列のパネルは、前記ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ検出用プローブを用いた染色を示す写真であり、右のパネルは、前記陰性コントロール用プローブを用いた染色を示す写真である。各図におけるバーは、１００μｍの長さを示す。中段のパネルは、上段のパネルの拡大写真である。各パネルにおいて、色の濃い部分が染色部分であり、色の薄い部分が非染色部分である。
　図２４に示すように、ケース１およびケース２のいずれについても、前記ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ検出用プローブによる染色が確認された。このことより、ＨＣＣ患者の肝細胞において、前記ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａが発現されていることがわかる。なお、図２４では、２例の結果のみを示したが、他のＨＣＣ患者由来の肝細胞においても、同様の結果が得られた。
　また、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ検出用プローブを用いた染色では、ケルンエヒトロートおよびＨＥによる染色と同様の領域が染色された。前記ケルンエヒトロート染色は、癌化領域を染色できるため、この結果からも、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ検出によって、癌の可能性を評価できるといえる。
　さらに、ＨＣＣ患者の肝細胞（ｎ＝５）およびＬＣ患者の肝細胞（ｎ＝５）から、それぞれＲＮＡを回収し、定量ＲＴ－ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）によりｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ発現量を測定した。また、内在性コントロールとして、ＲＮＵ４８の発現量についても同様に測定した。そして、ＲＮＵ４８の発現量に対するｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａの発現量の比（ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ／ＲＮＵ４８）を、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ発現レベルとして算出した。その結果を、ＨＣＣ患者由来の肝細胞は、ＬＣ患者由来の肝細胞よりも、有意にｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａが発現していることがわかった。
　このように、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａが、ＨＣＣ患者の肝細胞において強く発現していることから、肝細胞中のｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａの検出によって、細胞の癌の可能性を評価できることがわかった。
　本発明によれば、試料中の本発明の癌マーカーの発現レベルを検出することによって、例えば、癌の発生の有無や進行を高い信頼性で判断することが可能となる。さらに、本発明の評価方法を、従来のＨＥ染色等による癌の評価と対応させることによって、より一層信頼性に優れた癌の評価が可能となる。
１１１　　入力装置
１１２　　出力装置
１１３　　染色画像データベース
１２０　　処理装置
１２１　　入力受付処理部
１２２　　情報取得部
１２３　　画像マッチング処理部
１２４　　腫瘍領域抽出部
１２５　　染色陽性細胞含有率算出部
１３０　　記憶装置
１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１２３１　記憶部
７２５　　染色陽性細胞含有率および染色度算出部
１１２６　腫瘍判定および腫瘍領域算出部
１２１３　スライドデータベース
１２１４　スライド装置
１２２２　スライド撮影部
１３００　学習パターン入力手段
１３０１　学習パターン記憶手段
１３０２　特徴候補生成手段
１３０３　特徴決定手段
１３０４　特徴記憶手段
１３０５　分類テーブル作成手段
１３０６　分類テーブル
１７０１　パターン入力手段
１７０２　特徴抽出手段
１７０３　診断手段
１９０　　画像診断支援装置
１９１　　処理部
１９２　　記憶部
１９３　　顕微鏡
１９４　　ＣＣＤ
１９５　　スキャナ
１９６　　ディスプレイ
２００１　画像取得手段
２００２　情報取得手段
２００３　マッチング手段
２００４　腫瘍領域の特定手段
２００５　算出手段

Claims (13)

  1. 試料における癌マーカーを検出する癌マーカー検出工程と、
    前記癌マーカー検出工程において検出した前記癌マーカーの発現レベルに基づいて、前記試料の癌の可能性を評価する工程とを含み、
    前記試料が、細胞または組織であり、
    前記癌マーカーが、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２およびｈｓａ－ｍｉＲ－４９４の少なくとも一方のｍｉＲＮＡを含むことを特徴とする、癌の可能性を評価する評価方法。
  2. 前記ｈｓａ－ｍｉＲ－９２が、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ｂおよびｈｓａ－ｍｉＲ－９２ｂ＊からなる群から選択された少なくとも一つである、請求の範囲１記載の評価方法。
  3. 前記ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａが、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－１およびｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－２の少なくとも一方である、請求の範囲２記載の評価方法。
  4. 前記ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ＊が、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－１＊およびｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－２＊の少なくとも一方である、請求の範囲２記載の評価方法。
  5. 前記ｍｉＲＮＡが、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａである、請求の範囲１記載の評価方法。
  6. 前記癌が、大腸癌、直腸癌、胆嚢癌、胃癌、乳癌、白血病、膵癌、肝臓癌、脳腫瘍および骨肉腫からなる群から選択された少なくとも一つの癌である、請求の範囲１から５のいずれか一項に記載の評価方法。
  7. 前記評価方法が、癌の発症の有無、癌の進行度または予後の状態を判断する評価方法である、請求の範囲１から６のいずれか一項に記載の評価方法。
  8. 前記癌マーカー検出工程において、前記癌マーカーを、発色、蛍光およびオートラジオグラフィーからなる群から選択された少なくとも一つにより可視化する、請求の範囲１から７のいずれか一項に記載の評価方法。
  9. 前記試料を固定化し、ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法により前記癌マーカーを検出する、請求の範囲１から８のいずれか一項に記載の評価方法。
  10. 前記癌マーカーの発現レベルが、前記試料における前記癌マーカーの発現量で表わされる、請求の範囲１から９のいずれか一項に記載の評価方法。
  11. 前記評価工程において、検出した前記癌マーカーの発現レベルに基づいて、下記（１）、（２）および（３）からなる群から選択された少なくとも一つの方法により、癌の可能性を評価する、請求の範囲１から１０のいずれか一項に記載の評価方法。
    （１）被検者の試料における前記癌マーカーの発現レベルを、正常者の試料における前記癌マーカーの発現レベルと比較し、前記正常者の発現レベルよりも高い場合に、前記被検者は、前記癌の可能性が高いと決定する。
    （２）被検者の試料における前記癌マーカーの発現レベルを、正常者の試料における前記癌マーカーの発現レベルと比較し、前記正常者の発現レベルよりも相対的に高い程、前記被検者は、前記癌が相対的に進行していると決定する。
    （３）被検者の試料における前記癌マーカーの発現レベルを、進行期別の各癌患者の試料における前記癌マーカーの発現レベルと比較し、前記被検者は、同程度の発現レベルを示す患者と同じ進行期であると決定する。
  12. 前記癌マーカー検出工程において、固定化した前記試料について、前記癌マーカーを染色した癌マーカー染色画像を取得し、
    さらに、
    前記固定化した試料について、ＨＥ染色画像を取得するＨＥ染色画像取得工程、
    前記ＨＥ染色画像における腫瘍領域の情報を取得する情報取得工程、
    前記ＨＥ画像取得工程において取得された前記ＨＥ染色画像と、前記癌マーカー検出工程において取得された前記癌マーカー染色画像とのマッチング位置を算出するマッチング工程、
    前記情報取得工程において取得された前記ＨＥ染色画像における腫瘍領域の情報および前記マッチング工程において算出された前記マッチング位置の情報に基づいて、前記癌マーカー染色画像における腫瘍領域を特定する特定工程、および、
    前記特定工程において特定された前記癌マーカー染色画像における腫瘍領域の情報に基づいて、前記腫瘍領域内の染色陽性細胞を検出する染色陽性細胞検出工程を含む、
    請求の範囲９から１１のいずれか一項に記載の評価方法。
  13. 前記染色陽性細胞検出工程が、前記特定工程において特定された前記癌マーカー染色画像における腫瘍領域の情報に基づいて、前記腫瘍領域内の染色陽性細胞含有率を算出する算出工程である、請求の範囲１２記載の評価方法。
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