CN104372007B - 骨肉瘤的生物标记物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一骨肉瘤的生物标记物，生物标记物为具有序列表SEQ.ID.No.1碱基序列的novel‑miR‑14。本发明的生物标记物novel‑miR‑14，其相比现有的其它的骨肉瘤诊断的生理指标上，其可以在更早的时间获得骨肉瘤病变是否发生，且其还能根据novel‑miR‑14表达的水平，评估骨肉瘤的恶性程度，具有更好的时间优势和准确性。
Description
技术领域
本发明属于分子生物检测技术领域，具体涉及一种骨肉瘤的生物标记物及其应用。
背景技术
骨肉瘤是骨恶性肿瘤中最多见的一种，是从间质细胞系发展而来，肿瘤迅速生长是由于肿瘤经软骨阶段直接或间接形成肿瘤骨样组织和骨组织。下肢负重骨在外界因素(如病毒)的作用下，使细胞突变，可能与骨肉瘤形成有关。
现有在骨肉瘤影响预后的因素关键在于早诊断，术后血清碱性磷酸酶增加的变化观察。现有的诊断均基于早期发现血液中骨源性碱性磷酸酶增高，与该肿瘤的成骨作用有关而进行；检测的手段多采用Gomori钙钴法、偶氮偶联法、碱性磷酸酶染色试剂盒法，检测骨源性碱性磷酸酶的表达水平。但是，酶的表达依然存在滞后性，且检测时酶的含量会随着组织分离出现变化，而与原始基体中的表达的含量有差异，而无法最真实准确地反应骨肉瘤的情况。
发明内容
本发明实施例的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种骨肉瘤的生物标记物novel-miR-14及其应用。
为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：
一种骨肉瘤的生物标记物，所述生物标记物为具有序列表SEQ.ID.No.1碱基序列的novel-miR-14。
本发明的生物标记物novel-miR-14，其相比现有的其它的骨肉瘤诊断的生理指标上，其可以在更早的时间获得骨肉瘤病变是否发生，且其还能根据novel-miR-14表达的水平，评估骨肉瘤的恶性程度，具有更好的时间优势和准确性。
本发明进一步提出一种上述骨肉瘤的生物标记物在骨肉瘤检测中的应用。采用本发明的上述应用基于方法基于novel-miR-14表达水平进行，其表达含量可以用于骨肉瘤的诊断分析，通过检测出于基因的突变和病变伊始，基于novel-miR-14表达水平的检测可以利于骨肉瘤更早的发现；且检测的结果更具准确性。
附图说明
下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
图1为本发明实施例检测的骨肉瘤组织和正常组织的novel-miR-14表达水平结果对照图；
图2为本发明实施例检测的骨肉瘤组织的不同恶性程度中novel-miR-14表达水平对照图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供一种用于骨肉瘤诊断的生物标记物，其为具有序列表SEQ.ID.No.1碱基序列的novel-miR-14。
同时，基于上述生物标记物，本发明进一步还提出一种上述骨肉瘤诊断的生物标记物在骨肉瘤诊断中的应用。其具体的应用比如可以针对该生物标记物作为骨肉瘤的生理参数指标辅助诊断，具体实现可以采用如下步骤：
S10，获取待测组织标样；
S20，提取待测标样的RNA；
S30，通过RT-PCR检测待测标样的RNA中的novel-miR-14表达水平。
本发明的上述方法基于novel-miR-14表达水平的差异进行；其中novel-miR-14具有序列表SEQ.ID.No.1碱基序列。
在本发明中，之前先通过生物信息学分析获取到了一些候选miRNA与骨肉瘤表达的潜在靶基因相关，同时进一步在对候选miRNA进行筛选，筛选过程中以miRNA预测的基础数据包括通过小RNA分类注释后未注释到任何数据库的但可以比对到基因组的序列、比对到内含子区域的序列以及比对到外显子反义链的数据为基础，然后以下述条件进一步进行精确筛选：
(1)候选的miRNA在基因组上的前体序列可以形成颈环结构，并且其成熟体序列位于前体的臂上；
(2)前体折叠后miRNA/miRNA*复合体两端有2nt的悬挂；
(3)前体臂上无较大的泡，同时没有较多的凸起；
(4)前体折叠后总体的最小自由能应不大于-18kcal/mol；
(5)预测到前体的成熟体序列的比对结果中最小支持数应大于等于5。
预测到的新的miRNA表达谱构建，针对预测到的miRNA其表达量的计算是根据比对结果，序列与成熟体序列在两端不超过3nt的错配，中间需完全匹配，符合这样条件的序列的表达量加和作为该miRNA的表达量，之后确定骨肉瘤的分子生物标记物novel-miR-14。
上述筛选的条件可以按照设定华大基因miRNA Mireap软件的参数：
Minimal miRNA sequence length(18)
Maximal miRNA sequence length(26)
Minimal miRNA reference sequence length(20)
Maximal miRNA reference sequence length(24)
Minimal depth of Drosha/Dicer cutting site(3)
Maximal copy number of miRNAs on reference(20)
Maximal free energy allowed for a miRNA precursor(-18kcal/mol)
Maximal space between miRNA and miRNA*(35)
Minimal base pairs of miRNA and miRNA*(14)
Maximal bulge of miRNA and miRNA*(4)
Maximal asymmetry of miRNA/miRNA*duplex(5)
Flank sequence length of miRNA precursor(10)。
在筛选之后，选取手术中切除的新鲜骨肉瘤组织和旁边配对的正常骨组织，抽提总RNA，用于高通量测序。高通量测序结果如下表：
| 名称 | 序列(5’-3’) | 长度 | 序列号 | 表达倍数* | P值 |
| novel-miR-14 | TTCATCGGCTGAGAGGGCGT | 20bp | SEQ.ID.No.1 | 216 | 2.70E-6 |
注：*倍数＝(骨肉瘤/正常骨组织)
因此，本发明中基于发明人发现novel-miR-14和骨肉瘤的恶性程度具有相关性，novel-miR-14可以作为骨肉瘤的分子标记物；因此在本发明针对novel-miR-14的表达情况进行检测而最终实现间接辅助骨肉瘤的分析。
且本发明的生物标记物novel-miR-14，其相比现有的其它的骨肉瘤诊断的生理指标上，其可以在更早的时间获得骨肉瘤病变是否发生，且其还能根据novel-miR-14表达的水平，评估骨肉瘤的恶性程度，具有更好的时间优势和准确性。
为使本发明的上述方法过程更加易于理解，以及使本领域技术人员能明确本novel-miR-14检测的效果和真实代表性，并且能更加突出其在骨肉瘤检测中的突出效果，以下通过实施例进行举例说明：
分别选择90例骨肉瘤组织石蜡标本，所有肿瘤组织TNM分期有Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期，患者平均年龄是21(最小的18岁，最大的36岁)，其中59％是男性。同时，选取90例正常的肌肉和软骨组织做对照。
S10，提取待测组织RNA：
S11，将获取的组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次，获得研磨组织；
S12，按50-100mg组织/ml Trizol提取液的比例，向研磨组织加入Trizol；同时控制组织体积不能超过Trizol体积的10％，否则匀浆效果会不好；然后转入离心管并将具有Trizol提取液的组织匀浆用电动匀浆器充分匀浆约需1-2分钟；室温放置5min，使其充分裂解；
S13，将裂解混合液12000rpm离心5min，弃沉淀；并向清液中按200ul氯仿/mlTrizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置15min后；4℃12000g离心15min；
S14，吸取上层水相，至另一离心管中；按0.5ml异丙醇/ml Trizol加入异丙醇混匀，室温放置5-10min；4℃12000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底；
S15，按1ml 75％乙醇/ml Trizol加入75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀后4℃8000g离心5min，尽量弃上清；室温晾干或真空干燥5-10min；即为提取的RNA样品；
S16，然后用50ul H2O，TE buffer或0.5％SDS溶解RNA样品，55-60℃、5-10min，测O.D值定量RNA浓度；选取RNA A260/A280值在1.6-1.8之间的合格样本进行后续步骤。
S20，进行荧光定量RT-PCR(该步骤中的RT-PCR试剂盒采用Ambion公司的TaqManMicroRNA assays kit)：
S21，反转录：每个反转录反应包括10ng总RNA、1mM dNTPs、50U MultiscribeReverse Transcriptase、1.5μl 10×RT buffer、0.188μl RNase inhibitor、and 3μl 5×TaqMan MicroRNA RT primer；反转录的条件如下：16℃for 30分；42℃for 30分；85℃for5分钟；
S22，PCR：将反转录后的cDNA产物稀释15倍，按照1.33μl的cDNA、1μl的TaqManMicroRNA Assay和10μl的TaqMan Universal PCR Master Mix，总反应体积是20μl进行PCR。反应过程是：95℃10分钟，接下来是40个循环，每个循环是95℃15秒，60℃1分钟，72℃1分钟；通过PCR过程中的检测表达的水平，相对表达水平用RNU6B表达水平校正。
总体上180份待测的组织样本中骨肉瘤组织和正常组织的novel-miR-14表达水平结果参见下图1；同时将患病的90份骨肉瘤组织同时通过现有的观察以及骨源性碱性磷酸酶等最终确定的患病程度数量(恶性程度低n＝42份，恶性程度高n＝48份)样本中的novel-miR-14表达水平进行对比，其结果参见图2。
从图1的结果显示中，qRT-PCR分析novel-miR-14在骨肉瘤组织和正常骨和肌肉组织中表达水平(P＝0.0136)；同时novel-miR-14和骨肉瘤的恶性程度具有相关性(P＝0.0016)。因此，采用本发明的上述方法基于novel-miR-14表达水平的检测，其检测的方法过程均更加利于实现，并且由于病变发生均出于基因的突变和病变伊始，基于novel-miR-14表达水平的检测可以利于骨肉瘤更早的发现；且检测的结果更具准确性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种骨肉瘤的生物标记物在制备骨肉瘤药物中的应用，其特征在于，所述生物标记物为novel-miR-14，且所述novel-miR-14的基因序列如SEQ.ID.No.1所示。
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