WO2010121601A2 - Vorrichtung zur automatisierten, parallelisierten kultivierung von zellen - Google Patents

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WO2010121601A2
WO2010121601A2 PCT/DE2010/000454 DE2010000454W WO2010121601A2 WO 2010121601 A2 WO2010121601 A2 WO 2010121601A2 DE 2010000454 W DE2010000454 W DE 2010000454W WO 2010121601 A2 WO2010121601 A2 WO 2010121601A2
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culture vessels
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Josef Seidl
Michael Wiechmann
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Pan-Systech Gmbh
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    • C12M33/04—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus by injection or suction, e.g. using pipettes, syringes, needles

Definitions

  • the present invention relates to a device for the automated, parallelized cultivation of cells in cell culture vessels, in particular microtiter plates (MT plates).
  • MT plates microtiter plates
  • the observation unit with a microscope and a camera enables constant observation and optical evaluation of cell growth and cell morphology.
  • Cell culture vessels can be, for example, cell culture bottles.
  • the cell culture vessels are MT plates.
  • the MT plates are automatically filled by the fluid distribution unit or unneeded or used fluid is sucked off or replaced.
  • the modules of the system are arranged in a special housing, so that the device acts as a so-called sterile bench.
  • a sterile bench With this sterile bench, an open fluid and media supply is possible because the risk of bacterial contamination through the housing is greatly minimized.
  • the entire device usually functions automatically, i.e., the essential steps in culturing the cells, such as e.g. Filling and aspiration of the wells (wells of the MT plates), microscopic observation and evaluation are carried out automatically.
  • all the work steps can be performed in the closed system of the sterile bench and it must, for example, no MT plates are removed from the system. Due to the controllability of the climatic conditions in the device, the climate (temperature and / or gas mixture) can be adapted from the outside to the respective needs of the cell cultures.
  • the device according to the invention has a climate chamber in which a desired climate, namely a desired temperature and / or a desired humidity and / or gas composition, is preferably automatically adjustable and in which the receiving device with the cell culture vessels, in particular the MT plates at least partially is integrated, wherein the climate chamber is arranged in the housing.
  • the climate chamber makes it possible to create a specific climate only within a limited area within the enclosure. As a rule, all cell culture vessels used, in particular MT plates with the cell cultures located therein, are arranged inside the climate chamber.
  • a specific, optimal for the respective cell cultures climate set is set.
  • the temperature is preferably set to values of 20 to 45 ° C.
  • the CO 2 concentration is usually set to 0 to 20%.
  • the proportion of oxygen within the climate chamber is usually 10 to 40%.
  • the control of the climate within the climate chamber is preferably carried out by appropriate sensors within the climatic chamber. Furthermore, it is achieved by the climate chamber that a further separation of the cell cultures from the outside world takes place and thus the danger of a bacterial contamination of the cell cultures in the cell culture vessels is further minimized.
  • separate gas containers are provided which contain different gases, preferably O 2 , CO 2 and N 2 , wherein the gas streams are controllable from the gas cylinders and wherein certain amounts of gas are passed into a mixing chamber, from where the thus prepared gas mixture is passed into the climatic chamber.
  • gases preferably O 2 , CO 2 and N 2
  • the gas streams are controllable from the gas cylinders and wherein certain amounts of gas are passed into a mixing chamber, from where the thus prepared gas mixture is passed into the climatic chamber.
  • a precisely predetermined gas mixture can be prepared and initially tested for the desired composition. Only then is the gas mixture passed from the mixing chamber into the climate chamber.
  • the adjustment of a particular gas composition is particularly important in the cultivation of cells. For example, tumor cells grow at significantly less oxygen than it does in the ambient air. On the other hand, one wants to investigate, for example, damaged neuronal cells at much higher O 2 concentrations than those of the tumor cells mentioned.
  • the gas mixture produced in the mixing chamber is brought to a certain temperature before it is passed into the climatic chamber.
  • optimal conditions for different cells to be cultivated can be produced.
  • MT plates of a different number and number of wells eg 6, 12, 24, 48, 96, 384 wells per MTP
  • the cell culture vessels, in particular MT plates, preferably in the region of the observation unit and / or in the area of the fluid distribution unit, are preferably transportable automatically from the climate chamber or into the climate chamber by a carriage or robotic arm.
  • certain selected cell culture vessels in particular MT plates for filling with fluid can be brought out of the climatic chamber for a short time.
  • certain cell culture vessels can be transported for observation in the area of the observation unit.
  • These targeted, short-term transports from the climatic chamber have no negative effects on the climate within the chamber.
  • the automatic transport of the cell culture vessels from the climate chamber or into the climate chamber replaces a manual movement of the MT plates within the system, which would be associated with a high risk of contamination.
  • the observation unit and / or the Fluidver Ecuadors- unit are arranged outside the climatic chamber.
  • the receiving device comprises at least two receiving units, preferably arranged one above the other, and preferably has holding devices for holding the cell culture vessels, in particular MT plates.
  • the stacked receiving units a serious space savings is achieved, which also leads to a reduction in system costs.
  • the holding devices may be, for example, recesses within the receiving units whose shape is adapted to the shape of the cell culture vessels, in particular MT plates.
  • a cell culture vessel located in the region of the observation unit, in particular MT plate can be moved, the movements preferably being controllable.
  • the optics (microscope incl. Camera) of the observation unit and / or the cell culture vessel to be observed are movable, wherein the movements of the camera or of the cell culture vessels are preferably controllable.
  • the microscope used in the optics of the device according to the invention can be a normal microscope (transmitted-light microscope) or else a phase-contrast microscope or any other detection device for the observation and / or analysis of cells.
  • fluorescence microscopy can also be carried out with the device according to the invention, which is why it is often advantageous if the microscope is a fluorescence microscope.
  • the optics of the device according to the invention preferably has an automatic focusing. Furthermore, the optics usually has an automatic lens change.
  • the observation unit is preferably capable of online evaluation of cell morphology, cell physiology, cell behavior and cell growth.
  • the evaluation of the data of the cell cultivations is usually carried out by a PC with a specifically created software and user interface.
  • the fluid distribution unit comprises a plurality of containers for storing different fluids, such as cell solutions, nutrients and dyes, and a microdosing for targeted, controlled addition of the fluids in the cell culture vessels, in particular in the wells of the MT plates and preferably also for removing the fluids from the cell culture vessels, in particular from the wells of the MT plates, wherein the movements and actions of the microdosing unit are preferably controllable.
  • the fluid distribution unit By carrying out the fluid distribution unit with a plurality of containers for storing different fluids, it is possible, for example, to add a plurality of different fluids to specific wells of MT plates. If, for example, fluorescence microscopy is to be used, dyes for fluorescence microscopy can also be introduced into some wells in addition to cell solutions and nutrients. If some wells are again to be freed from fluids, this can also be done by the microdosing unit of the fluid distribution unit.
  • the containers can be positioned around the microdosing unit.
  • the microdosing unit is preferably rotatable and / or raised and lowered, so that the microdosing unit can approach the individual containers by means of rotational and / or lifting and lowering movements.
  • the cell culture vessels in particular MT plates and preferably also the wells of the MT plates are indicated.
  • each plate and preferably each well is assigned an assignment number (index), which is recognized by the system, in particular by the software described below.
  • each culture vessel is indexed for unique assignment and identification and provided with an internal index / number (for example MTP 1 to MTP 24).
  • each sub-vessel of a culture vessel typically each well of an MT plate
  • each pitch is indexed in the cradle (especially in the climatic chamber) for unambiguous assignment and identification (for example, pitch 1 to 24).
  • the cell culture vessels are transparent.
  • all types of microscopy, especially fluorescence microscopy can be performed.
  • Used MT plates are preferably formed very thin, whereby the lenses of the microscope can be brought as close as possible to a cell culture to be observed.
  • the MT plates may, for example, have thin film bottoms.
  • the MT plates may be made of any translucent materials, such as e.g. Glass, plastic, etc. be made.
  • cell culture vessels such as cell culture bottles such as T25 or T75 or closed autoflasks can be used as an alternative to MT plates.
  • said different culture vessels can be used both alternatively and side by side.
  • the receiving device for receiving the cell culture vessels to different adapters, through which an adaptation to different shapes and sizes of culture vessels is possible.
  • these sensors have the control of all relevant parameters, in particular temperature, gas concentration, in particular CO 2 concentration, O 2 concentration, N 2 concentration, humidity and / or supply of fluids into the cell culture vessels, in particular in the wells of MT plates on. These sensors are the basis for fully automatic control and regulation of the climatic conditions as well as the supply of fluids into the cell culture vessels.
  • a particularly preferred embodiment of the device according to the invention is characterized by a computer-controlled control and control system for automatic control and control of at least one, preferably all listed below parameters or steps: a) temperature, in particular in the climatic chamber; b) O 2 content in the gas, in particular in the climatic chamber; c) CO 2 content in the gas, in particular in the climate chamber; d) N 2 content in the gas, in particular in the climatic chamber; e) filling and / or draining selected cell culture vessels, in particular selected wells, of selected MT plates with selected amounts of selected fluids; f) microscopic observation and evaluation of cell cultures in selected cell culture vessels, in particular selected wells of selected MT plates at selected times with selected technique, such as fluorescence or phase contrast microscopy.
  • all parameters or work steps are fed into the system.
  • the climatic conditions are automatically regulated by the system. Should one or more parameters deviate from the entered values in the course of the cell cultivation cycles (eg as a consequence of a short-term opening of the climatic chamber for transporting an MT plate out or in), this will be immediately readjusted to the specified value.
  • the MT plates For specific filling of selected wells of selected MT Plates with selected amounts of selected fluids are indicated as the MT plates, and preferably also the wells of the MT plates. As a result, the wells of the MT plates can be entered in a particularly simple manner in the system and recognized by this.
  • the recordings are preferably stored by the system.
  • the system also preferably recognizes certain changes in the cell cultures and can thereby react to certain changes in the cell cultures by readjusting the above-mentioned parameters or work steps.
  • a preferred embodiment of the device according to the invention is characterized by a loading and Entdeckelungsvorraum for, preferably automatic loading and Entdeckein the cell culture vessels (see also figure description).
  • a controlled selective use of disposable and multiple pipettes is possible in the fluid distribution unit. This can prevent cross-contamination between individual culture vessels and wells.
  • two types of pipettes are used in the device according to the invention. So come on the one hand so-called working pipettes used, which are used several times during a cultivation, which brings the need for a sterile recording and sterile filing.
  • the working pipettes are stored in sterile boxes within the device according to the invention.
  • a robot arm In the area of the fluid distribution unit, a robot arm generally takes up the working pipettes in a sterile manner from the receiving boxes. Thereafter, the desired Fluid pressen be performed on the cell culture containers.
  • the robot arm of the fluid distribution unit rests the working pipettes again sterile in the receiving box.
  • This work cycle can take place several times during a cell cultivation.
  • the inventive device usually also disposable pipettes used. These disposable pipettes are used only once during cell culture, with the need for one-time sterile ingestion and safe disposal after a one-time procedure.
  • the disposable pipettes are stored in sterile disposable boxes in the area of the fluid station.
  • the fluid robot arm takes a disposable pipette sterile from a receiving box.
  • the desired fluid action is performed on a cell culture container, in particular an MT plate.
  • the robotic arm drops the disposable pipette into a waste box. This working cycle takes place only once with a disposable pipette during a cell cultivation.
  • the present invention further relates to a method for the automated, parallelized cultivation of cells in cell culture vessels, in particular microtiter plates, which are in a cell culture system, in particular in a device according to one of claims 1 to 13, comprising the following steps: a) filling the system with cell culture vessels ; b) filling the system with containers containing fluids to be used, such as cell culture medium, cell suspension, test substance, dye; c) loading the system with containers containing gases to be used, such as O 2 , CO 2 , N 2 ; d) Programming the automatic tuning system for at least one of the following parameters:
  • the system automatically regulates the climatic conditions in the sense of a control loop for the constant maintenance of the climatic conditions. Furthermore, the system carries out the microscopic evaluation according to the programmed values for the microscopy.
  • multiple freely selectable observation points in the culture vessel or in the subunits (for example POI 1 to 10 in the well 2 of the culture vessel 4) can be defined in each culture vessel.
  • a specific control software with a user interface can freely choose which POI is to be evaluated in which culture vessel at which time and which optical method (for example transmitted light, phase contrast, fluorescence).
  • each POI can be approached by the traversing unit (cross table) in three axes x-y-z (ie horizontal and vertical), focused by the system, recorded, evaluated and stored. Owing to the possibility of this three-dimensional recording and storing of POIs, different levels can be focused in a culture vessel or in a subunit of a culture vessel.
  • Each POI can be approached and evaluated very accurately over time with a precision of ⁇ 1 ⁇ m.
  • you can also use time-lapse photography and dynamic evaluations of each POI are made possible by composition of the individual images.
  • automatic analysis of the optical image information by means of a specific software and user interface is usually possible (for example cell number, cell movement, cell shape, color information of fluorescently labeled cell components, number of stained cells).
  • the system can remove used media and feed new media.
  • the device according to the invention may have a further housing, which may contain the said gas cylinders.
  • FIG. 1 shows a side view of a device according to the invention (without housing and climatic chamber);
  • FIG. 2 is a perspective view of the device of FIG. 1; FIG.
  • Fig. 3 is a plan view of the device of Fig. 1;
  • FIG. 4 shows a perspective view of the device of FIG. 1 with climate chamber
  • FIG. 5 shows the device of FIG. 4 with housing
  • Fig. 6 control and regulation scheme for a device according to the invention.
  • FIG. 7 shows a perspective illustration of a de-capping device in a device according to the invention
  • FIG. 8 is a plan view of the de-capping device of FIG. 7.
  • FIG. 8 is a plan view of the de-capping device of FIG. 7.
  • FIG. 1 shows a side view of a device 1 according to the invention for automated, parallelized cultivation of cells in microtiter plates 2 with an observation unit 3, a recording device 4 for receiving the microtiter plates 2 and a fluid distribution unit 5.
  • the observation unit 3 comprises a CCD camera 6 , and a microscope 7.
  • the camera 6 and the microscope 7 are arranged on a holder 8.
  • the observation unit 3 further comprises a receiving table 9 for receiving the MT plates 2.
  • the receiving device 4 comprises four superimposed receiving plates 10.
  • the receiving plates 10 have (not shown here) recesses into which the MT plates are fitted.
  • the receiving device 4 can be raised or lowered.
  • the MT Plates 2 are moved.
  • it is shown how an MT plate 2a is transported by the receiving device 4 into the region of the observation unit 3 with the aid of a carriage 11.
  • the fluid distribution unit 5 comprises a microdosing device 12 with a movable, in particular rotational movements and / or lifting and lowering movements exporting arm 13, which is provided with a fixed or exchangeable pipette 14.
  • the fluid distribution unit further comprises a plurality of containers 15, in which different fluids, such as cell suspensions, nutrients, dyes, etc., are included.
  • the containers 15 are arranged in a certain arrangement around the microdosing device 12, wherein the pipette 14 by rotational movements and / or lifting and lowering movements of the Verteilarms 13 and / or by movement of the pipette along the upper portion 16 of the Verteilarms 13 to the individual containers can be brought.
  • the MT plates 2 can be automatically transported by the receiving device 4 into the region of the fluid distribution unit 5 by means of a carriage.
  • an MT plate 2b is arranged in the region of the fluid distribution unit 5 and is filled there with the aid of the microdosing device 12 with specific fluids.
  • FIG. 2 shows a perspective view of the device of Figure 1. Good to see in this illustration, the superimposed receiving plates 10 of the receiving device 4. The individual receiving plates 10 have recesses 18 which are dimensioned so that the MT plates 2 received therein and can be kept.
  • FIG. 3 shows a plan view of the device 1 of FIG. 1 and FIG. 2. In addition to the actual working space, which is located below the housing (not shown here), a receiving chamber 19 for receiving gas cylinders 20 is arranged.
  • FIG. 4 shows the device 1, wherein the receiving device 4 is arranged in a climatic chamber 21.
  • the housing 21 a of the climate chamber may be transparent or opaque.
  • the housing 21a encloses the receiving device 4 substantially airtight and thus contributes to avoiding contamination of the MT plates.
  • a desired climate can be adjusted. For example, the temperature, the O 2 concentration, the CO 2 concentration, N 2 concentration and the air humidity can be set. In this way, the climatic conditions can be adjusted to the particular needs of the cells to be cultivated.
  • the observation unit 3 and the fluid distribution unit 5 are arranged outside the climate chamber 21 and are thus not exposed to the climatic conditions which are necessary for optimum cell cultivation.
  • a two openings 22 are arranged, which allow the transporting of MT plates from the climatic chamber 21 out or in the climatic chamber 21 inside.
  • the openings 22 are arranged in the region of the observation unit 3 as well as in the area of the fluid distribution unit 5 and allow transport of MT plates 2 there.
  • the openings 22 can be closed after the MT plates have been transported.
  • FIG. 5 shows the device 1 with attached housing 23.
  • the housing 23 may be completely transparent or completely opaque.
  • the housing 23 can also-as in the present exemplary embodiment-have a transparent region 24 in the form of a glass pane.
  • the glass pane 24 may be formed as an open window, so that, if necessary, can be passed through the open window 24 into the interior of the housing 23.
  • the entire device 1 is designed as a so-called "sterile bench.”
  • the housing 23 closes the cultivation space substantially airtight and prevents penetration of dirt, bacteria, etc. from the outside into the interior.
  • All climatic conditions inside the climate chamber 21 and in the housing 23 are controlled by a computer-controlled control and control system. Sensors inside the housing 23 or inside the climate chamber 21 constantly provide information about the current conditions in the respective rooms. Through the control and control software, the climatic conditions are always kept at a predetermined level. Also, the filling of wells 17 of certain MT plates with certain amounts of particular fluids is controlled by the computer controlled control system. For this purpose, the MT plates (2) and the individual wells 17 of the MT plates 2 are indexed and recognized by the system. The computer controlled control system may be programmed to fill certain wells (17) of selected MT plates (2) with certain amounts of particular fluids at specific times.
  • the computerized control system for microscopically observing and evaluating certain cell cultures in particular wells (17) of certain MT plates (2) at certain times with certain technique, such as e.g. Programmed fluorescence or phase contrast microscopy and / or any other detection method for observation and / or analysis of cells.
  • certain technique such as e.g. Programmed fluorescence or phase contrast microscopy and / or any other detection method for observation and / or analysis of cells.
  • the system can be programmed to take pictures of cell cultures at specific times, with recordings usually being stored and continually evaluated.
  • FIG. 6 shows a schematic representation of the control and regulation of the climatic conditions in the interior of the climate chamber 21 and in Inside the housing 23.
  • gas sensors 25 are arranged, namely a CO 2 sensor 26, an N 2 sensor 27 and an O 2 sensor, not shown here. Furthermore, sensors for other gases may be present.
  • the concentration values determined by the gas sensors are fed to a climate chamber controller.
  • An air humidity sensor 29 constantly detects the humidity in the interior of the climate chamber 21 or in the interior of the housing 23.
  • a temperature sensor 30 continuously measures the temperature.
  • the humidity sensor 29 and the temperature sensor 30 also transmit their values to the climate chamber controller 28.
  • Another temperature sensor 31 constantly measures the temperature inside the housing 23.
  • a so-called laminar hot air heater 32 sets a temperature in the housing, preferably the temperature in the climatic chamber corresponds, a. This prevents condensation processes in the climate chamber.
  • the climate chamber controller 28 regulates the humidity in the interior of the climatic chamber 21 via a humidifier 33. Between the humidifier 33 and the climatic chamber 21, a filter element 34 is interposed. Furthermore, fresh air 35 can be introduced into the interior of the housing 23 or the climatic chamber 21.
  • the gas flows from the gas cylinders 20 are controlled by gas regulators. In this case, certain amounts of gas are passed into a mixing chamber 36. Via a gas circulation pump 37, which is also regulated via the climate chamber controller 28, the desired gas mixture is passed into the climatic chamber 21. The desired gas mixture is brought to the desired temperature by a gas mixture line heater 38.
  • the receiving device for receiving the MT plates can also be constructed of superposed, independently rotatable turntables.
  • the individual receiving elements of the receiving device may be formed in the manner of assembly lines, through which a linear arrangement of the MT plates and a linear trans- the same port is reached.
  • the climate chamber is transparent at least in the region of the observation unit and can be microscoped or observed through the wall of the climate chamber, so that the MT plates do not have to be moved out of the climate chamber.
  • the climatic chamber can also have a bulge into which an MT plate to be observed can be brought in for observation.
  • the positions of the MT plates are defined to be the same for each observation, i. with repeated passage, the observation position should be approached reproducibly with high accuracy.
  • the accuracy of the system is dictated by the accuracy of the outside dimensions of the MT plates.
  • the MT plates can be covered with a foil at the bottom and thus optically defined. However, certain deviations occur in the Z direction.
  • Another embodiment of the MT plates is that the plates are equipped with a glass sheet and optically defined. These MT plates have hardly any deviations in the Z direction.
  • FIG 7 shows a perspective view of a Entdeckelungsvor- direction (40) of a preferred embodiment of a device according to the invention.
  • the de-capping device comprises a robot arm (41) and a lid holding device (42).
  • Figure 8 shows the lid holding device (40) in a plan view.
  • the Entdeckelungsvor- direction (40) is used for loading and uncovering MT plates (2).
  • the MT plates are stored in the climate chamber for incubation with the lid closed. In the fluid or optical station, however, the MT plates are to be processed without a lid. Therefore, the MT plates must always be entdeckelt or what is possible with the Entdeckelungsvortechnisch (40).
  • the term decapping device also includes that the device (40) is also suitable for covering. If, for example, an MT plate is to be moved from the incubator to the optics station, the robot arm (41) retrieves the corresponding MT plate from the selected place in the climate chamber ("shelf space").
  • the lid holding device (42) has horizontally displaceable retaining clips (43) which are movable by means of a spring or mechanically movable pin (45)
  • a spring or mechanically movable pin 45
  • the lid (44) of the MT plate (2) is inserted into the holding device (42) and held by the retaining clips (43), and then the robot arm (41) moves down with the MT plate (2) the lid (44) remains in the lid holding device (42) .
  • the decapping device (40) is positioned in the climatic chamber (21).
  • the robot arm (41) moves the opened MT plate (2) out of the climatic chamber into the observation unit (optical station). While the MT plate remains in the observation unit for a certain time, the lid (44) is still held in the lid holding device.
  • the robot arm (41) moves the open MT plate back from the optics station back into the climate chamber. There, the robot arm (41) moves the open MT plate (2) upwards in the direction of the cover holding device (42), wherein ultimately the open MT plate is accurately connected to the cover (44). Now let the retaining clips (43) the lid (44), causing the MT plate (2) is finally covered again. Now the robot arm (41) moves the MT plate down and spends it to the desired "parking space".

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Abstract

Vorrichtung zur automatisierten, parallelisierten Kultivierung von Zellen in Zellkulturgefäßen, insbesondere Mikrotiterlatten (MT-Platten) (2) mit einem Gehäuse (23), in welchem eine Beobachtungseinheit (3), umfassend mindestens ein Mikroskop (7) und mindestens eine Kamera (6), eine Aumahmevorrichtung (4) zur Aufnahme der Zellkulturgefäße sowie eine Fluidverteilungseinheit (5) zum automatischen Befüllen und/oder Entleeren der Zellkulturgefaße, insbesondere der Wells (17) von MT-Platten mit Fluiden angeordnet sind, wobei die klimatischen Verhältnisse in der Vorrichtung, insbesondere die Gaszusammensetzung und die Temperatur zumindest im Bereich der Zellkulturgefäße regelbar sind, wobei im Gehäuse eine Klimakammer (21) vorgesehen ist, in der eine gewünschte Temperatur und/oder eine bestimmte Gaszusammensetzung automatisch einstellbar ist und in der die Aufhahmevorrichtung (4) mit den Zellkulturgefäßen (2) mindestens teilweise integriert ist.

Description

BESCHREIBUNG:
Vorrichtung zur automatisierten, parallelisierten Kultivierung von Zellen
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur automatisierten, parallelisierten Kultivierung von Zellen in Zellkulturgefäßen, insbesondere Mikrotiterplatten (MT-Platten).
Die Kultivierung von isolierten Zellen in vitro ist ein anerkanntes wertvolles Werkzeug der biomedizinischen Forschung zur Ermittlung reproduzierbarer Daten. Die Zellkultivierung wird heute aber immer noch überwiegend manuell durchgeführt. Da bei händischen Prozessen signifikante Prozessvariationen unvermeidbar sind und Sterilitätsprinzipien häufig durchbrochen werden, leidet die Reproduzierbarkeit und Zellqualität, welche wiederum eine unmittelbare Voraussetzung für einen erfolgreichen Einsatz z.B. in der Wirkstoffentwicklung darstellt. Weiterhin besteht durch den Faktor Mensch grundsätzlich ein erhöhtes Risiko der falschen bzw. instabilen Handhabung, insbesondere auch bei der Arbeit mit einer großen Anzahl unterschiedlicher Zelllinien. Außer der Qualität ist auch der Durchsatz bei der händischen Zellkultivierung limitiert bzw. nur durch einen entsprechenden Mitarbeiterstab skalierbar. Zellkulturen werden u.a. in der Pharma-, Kosmetik- und Biotechindustrie bei der Suche nach neuen Wirkprinzipien und Wirkstoffen auf dem Sektor der Pharmazeutika und Pflanzenschutzmittel häufig verwendet und sind mittlerweile unverzichtbar. Nur standardisierte, automatisierte Zellkulturverfahren mit zuverlässiger Überwachung sämtlicher Zellkulturparameter ermöglichen über Jahre hinweg einen Vergleich zwischen den Substanzen und ihren Wirkprinzipien und stellen somit unter anderem eine essentielle Basis für die Forschungs- und Entwicklungs- Aktivität in der biopharmazeutischen Industrie in den Bereichen Zellkul- tivierung, Medienentwicklung und Wirkstoffentwicklung dar.
Die aus dem Stand der Technik bekannten Zellkulturverfahren zeichnen sich bislang durch einen hohen manuellen Aufwand aufgrund umfangreicher serieller Testungen mit schwieriger Dokumentation und Reproduzierbarkeit aus. Jegliche gewollte Veränderung der Kulturbedingungen führt momentan aufgrund fehlender Flexibilität und Automatisierung der Zellkultur zu hohen Mehraufwänden und geht einher mit einer hohen Ressourcenbildung (Personal, Zeit) mit entsprechenden Kostenimplikationen für die Anwender.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Vorrich- tung zur automatisierten, parallelisierten Kultivierung von Zellen in Zellkulturgefäßen, insbesondere Mikrotiterplatten zur Verfügung zu stellen, welche die Nachteile des Standes der Technik überwindet.
Diese Aufgabe wird gelöst durch eine Vorrichtung mit den Merkmalen des Anspruchs 1.
Durch die Beobachtungseinheit mit einem Mikroskop und einer Kamera ist eine ständige Beobachtung und optische Auswertung des Zellwachstums und der Zellmorphologie möglich.
Zellkulturgefäße können z.B. Zellkulturflaschen sein. Vorzugsweise sind die Zellkulturgefäße jedoch MT-Platten. Die MT-Platten werden automatisch durch die Fluidverteilungseinheit befüllt bzw. nicht benötigtes bzw. verbrauchtes Fluid wird abgesaugt bzw. ausgetauscht.
Die Module des Systems (Fluidverteilungseinheit, Aufnahmevorrichtung, Klimakammer und Fluidverteilungseinheit) sind in einem speziellen Gehäuse angeordnet, sodass die Vorrichtung als so genannte Sterilbank fungiert. Mit dieser Sterilbank ist eine offene Fluidik und Medienversorgung möglich, da die Gefahr einer bakterielle Verunreinigung durch das Gehäuse stark minimiert wird.
Die gesamte Vorrichtung funktioniert in der Regel automatisch, d.h., dass die wesentlichen Arbeitsschritte bei der Kultivierung der Zellen, wie z.B. Befüllen und Absaugen der Wells (Mulden der MT-Platten), mikroskopische Beobachtung und Auswertung automatisch erfolgen. Dadurch können sämtliche Arbeitssschritte in dem geschlossenen System der Sterilbank durchgeführt werden und es müssen beispielsweise keine MT-Platten aus dem System entnommen werden. Durch die Regelbarkeit der klimatischen Verhältnisse in der Vorrichtung kann das Klima (Temperatur und/oder Gasgemisch) von außen an die jeweiligen Bedürfnisse der Zellkulturen angepasst werden.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung weist eine Klimakammer auf, in der ein gewünschtes Klima, nämlich eine gewünschte Temperatur und/oder eine gewünschte Luftfeuchtigkeit und/oder bestimmte Gaszusammensetzung, vorzugsweise automatisch einstellbar ist und in der die Aufnahmevorrichtung mit den Zellkulturgefäßen, insbesondere den MT-Platten mindestens teilweise integriert ist, wobei die Klimakammer im Gehäuse angeordnet ist. Durch die Klimakammer ist es möglich, ein bestimmtes Klima nur innerhalb eines begrenzten Bereiches innerhalb des Gehäuses zu erzeugen. In der Regel sind sämtliche verwendete Zellkulturgefäße, insbesondere MT-Platten mit den darin befindlichen Zellkulturen inner- halb der Klimakammer angeordnet. In der Klimakammer wird dann ein bestimmtes, für die jeweiligen Zellkulturen optimales Klima eingestellt. Die Temperatur wird vorzugsweise auf Werte von 20 bis 45° C eingestellt. Die CO2-Konzentration wird in der Regel auf 0 bis 20 % eingestellt. Der Anteil an Sauerstoff innerhalb der Klimakammer liegt in der Regel bei 10 bis 40 %. Die Kontrolle des Klimas innerhalb der Klimakammer erfolgt vorzugsweise durch entsprechende Sensoren innerhalb der Klimakammer. Ferner wird durch die Klimakammer erreicht, dass eine weitere Abschottung der Zellkulturen von der Aussen- welt erfolgt und so die Gefahr einer bakteriellen Verunreinigung der Zellkulturen in den Zellkulturgefäßen weiter minimiert wird.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind getrennte Gasbehälter vorgesehen, welche unterschiedliche Gase, vorzugsweise O2, CO2 und N2 enthalten, wobei die Gasströme aus den Gasflaschen steuerbar sind und wobei bestimmte Gasmengen in eine Mischkammer geleitet werden, von wo aus das so hergestellte Gasgemisch in die Klimakammer geleitet wird. Auf diese Art und Weise kann eine exakt vorbestimmte Gasmischung hergestellt und zunächst auch auf die gewünschte Zusammensetzung getestet werden. Erst dann wird das Gasgemisch von der Mischkammer in die Klimakammer geleitet. Die Einstellung einer bestimmten Gaszusammensetzung ist bei der Kultivierung von Zellen besonders wichtig. So wachsen beispielsweise Tumorzellen bei wesentlich weniger Sauerstoff als dieser in der Umgebungsluft vorkommt. Andererseits will man beispielsweise geschädigte neuronale Zellen bei wesentlich höheren O2-Konzentrationen als die der genannten Tumorzellen untersuchen. Mit Vorteil wird das in der Mischkammer hergestellte Gasgemisch auf eine bestimmte Temperatur gebracht bevor dieses in die Klimakammer geleitet wird. Auf diese Art und Weise können optimale Bedingungen für unterschiedliche zu kultivierende Zellen hergestellt werden. Durch die Aufnahmevorrichtung können beispielsweise MT-Platten in verschiedener Anzahl und Wellzahl (z.B. 6-, 12-, 24-, 48-, 96-, 384- wells pro MTP) aufgenommen werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind die Zellkulturgefäße, insbesondere MT-Platten vorzugsweise im Bereich der Beobachtungseinheit und/oder im Bereich der Fluidverteilungseinheit, vorzugsweise automatisch durch einen Schlitten oder Roboterarm aus der Klimakammer bzw. in die Klimakammer transportierbar. Auf diese Art und Weise können bestimmte, ausgewählte Zellkulturgefäße, insbesondere MT- Platten zum Befüllen mit Fluid kurzfristig aus der Klimakammer herausgebracht werden. Auch können bestimmte Zellkulturgefäße zum Beobachten in den Bereich der Beobachtungseinheit transportiert werden. Diese gezielten, kurzfristigen Transporte aus der Klimakammer heraus haben keine negativen Auswirkungen auf das Klima innerhalb der KIi- makammer. Das automatische Transportieren der Zellkulturgefäße aus der Klimakammer bzw. in die Klimakammer ersetzt ein manuelles Bewegen der MT-Platten innerhalb des Systems, was mit einer hohen Verunreinigungsgefahr verbunden wäre.
Mit Vorteil sind die Beobachtungseinheit und/oder die Fluidverteilungs- einheit außerhalb der Klimakammer angeordnet. Dies hat u.a. den Vorteil, dass diese Einheiten nicht dem, teilweise extremen Klima innerhalb der Klimakammer ausgesetzt werden. So werden diese Einheiten beispielsweise von einer hohen Luftfeuchtigkeit bewahrt, welche die genannten Einheiten schädigen könnte. Ferner werden Verunreinigungen der Zellkulturen durch die genannten Einheiten vermieden.
Mit Vorteil umfasst die Aufnahmevorrichtung mindestens zwei, vorzugsweise übereinander angeordnete Aufnahmeeinheiten und weist vorzugsweise Halteeinrichtungen zum Halten der Zellkulturgefäße, insbesondere MT-Platten auf. Durch die übereinander angeordneten Aufnahmeeinheiten wird eine gravierende Platzeinsparung erreicht, was auch zu einer Senkung der Systemkosten führt. Durch die Anordnung übereinander angeordneter Aufnahmeeinheiten können wesentlich mehr Zellkulturgefäße in der Klimakammer untergebracht werden. Die Halteeinrichtungen können, beispielsweise Aussparungen innerhalb der Aufnahmeeinheiten sein, deren Form an die Form der Zellkulturgefäße, insbesondere MT-Platten angepasst ist.
Bei einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist ein im Bereich der Beobachtungseinheit befindliches Zellkulturgefäß, insbesondere MT-Platte bewegbar, wobei die Bewegungen vorzugsweise steuerbar sind.
Mit Vorteil sind die Optik (Mikroskop inkl. Kamera) der Beobachtungseinheit und/oder das zu beobachtende Zellkulturgefäß bewegbar, wobei die Bewegungen der Kamera bzw. der Zellkulturgefäße vorzugsweise steuerbar sind.
Das verwendete Mikroskop der Optik der erfindungsgemäßen Vorrich- tung kann ein normales Mikroskop (Durchlichtmikroskop) oder auch ein Phasenkontrastmikroskop oder jedwede andere Detektionsvorrichtung zur Beobachtung und/oder Analyse von Zellen sein. Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann jedoch auch Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt werden, weshalb es oftmals auch von Vorteil ist, wenn das Mikro- skop ein Fluoreszenzmikroskop ist.
Die Optik der erfindungsgemäßen Vorrichtung weist vorzugsweise eine automatische Fokussierung auf. Ferner weist die Optik in der Regel einen automatischen Objektivwechsel auf.
Die Beobachtungseinheit ist vorzugsweise zur Online-Auswertung von Zellmorphologie, Zellphysiologie, Zellverhalten und Zellwachstum fähig. Die Auswertung der Daten der Zellkultivierungen erfolgt in der Regel auch durch einen PC mit einer spezifisch erstellten Software und Anwenderoberfläche. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung umfasst die Fluidverteilungseinheit mehrer Behältnisse zum Lagern unterschiedlicher Fluide, wie z.B. Zelllösungen, Nährstoffe und Farbstoffe, sowie eine Mikrodosiereinheit zur gezielten, kontrollierten Zugabe der Fluide in die Zellkulturgefäße, insbesondere in die Wells der MT-Platten und vorzugsweise auch zum Entfernen der Fluide aus den Zellkulturgefäßen, insbesondere aus den Wells der MT-Platten, wobei die Bewegungen und Aktionen der Mikrodosiereinheit vorzugsweise steuerbar sind. Durch die Ausführung der Fluidverteilungseinheit mit mehreren Behältnissen zum Lagern unterschiedlicher Fluide können beispielsweise in bestimmte Wells von MT-Platten mehrere, unterschiedliche Fluide zugegeben werden. Soll beispielsweise mit Fluoreszenzmikroskopie gearbeitet werden, können in manche Wells neben Zellösungen und Nährstoffen auch Farbstoffe für die Fluoreszenzmikroskopie einge- bracht werden. Sollen manche Wells wiederum von Fluiden befreit werden, kann dies ebenfalls durch die Mikrodosiereinheit der Fluidverteilungseinheit erfolgen. Die Behältnisse können um die Mikrodosiereinheit herum positioniert werden. Bei einer derartigen Ausführungsform ist die Mikrodosiereinheit vorzugsweise rotierbar und/oder heb- und senkbar ausgestaltet, sodass die Mikrodosiereinheit durch Rotations- und/oder Hub- und Senkbewegungen die einzelnen Behältnisse anfahren kann.
Mit Vorteil sind die Zellkulturgefäße, insbesondere MT-Platten und vorzugsweise auch die Wells der MT-Platten indiziert. Dabei wird in der Regel jeder Platte und vorzugsweise jedem Well eine Zuordnungsnum- mer (Index) zugeordnet, welche vom System, insbesondere durch die unten beschriebene Software, wiedererkannt werden.
Für die besonders genaue Steuerung der einzelnen Prozessschritte und genauen Zuordnung der Zellkultursubstanzen (zum Beispiel Zellen, Fluids) zu den einzelnen Kulturgefäßen und der Kulturgefäße zu den einzelnen Prozessstationen (Fluidstation, Inkubationsstation, Optikstation) findet vorzugsweise eine 4-stufige Indexierung statt. Bei der ersten Stufe der Indexierung wird jedes Kulturgefäß zur eindeutigen Zuordnung und Identifizierung indexiert und mit einem internen Index/Nummer versehen (zum Beispiel MTP 1 bis MTP 24). Bei der zweiten Stufe der Indexierung wird jedes Untergefäß eines Kulturgefäßes (in der Regel jedes Well einer MT-Platte) indexiert. Bei der dritten Stufe der Indexierung wird jeder Stellplatz in der Aufnahmevorrichtung (insbesondere in der Klimakammer) zur eindeutigen Zuordnung und Identifizierung indexiert (zum Beispiel Stellplatz 1 bis 24). Bei der vierten Stufe der Indexierung wird jeder Prozessplatz des Gesamtsystems zur eindeutigen Zuordnung, Identifizierung und Steuerung indexiert (zum Beispiel Fluidstation = 1 , Aufnahmestation = 2, Optikstation = 3).
Besonders bevorzugt sind die Zellkulturgefäße transparent ausgebildet. Dadurch können alle Arten von Mikroskopie, insbesondere auch Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt werden. Verwendete MT-Platten sind vorzugsweise sehr dünn ausgebildet, wodurch die Objektive des Mikroskops möglichst nah an eine zu beobachtende Zellkultur herangebracht werden können. Die MT-Platten können beispielsweise dünne Folienböden aufweisen. Die MT-Platten können aus allen lichtdurchlässigen Materialien, wie z.B. Glas, Kunststoff etc. gefertigt sein.
Wie bereits oben dargelegt, können alternativ zu MT-Platten auch andere Zellkulturgefäße, wie beispielsweise Zellkulturflaschen wie T25 oder T75 oder auch geschlossene Autoflascs verwendet werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung können die genannten unterschiedlichen Kulturgefäße sowohl alternativ als auch nebeneinander verwendet werden. Hierzu weist beispielsweise die Aufnahmevorrichtung zur Aufnahme der Zellkulturgefäße unterschiedliche Adapter auf, durch die eine Anpassung an verschiedene Formen und Größen von Kulturgefäßen möglich ist.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemä- ßen Vorrichtung weist diese Sensoren zur Kontrolle sämtlicher relevanter Parameter, insbesondere Temperatur, Gaskonzentration, insbesondere CO2-Konzentration, O2-Konzentration, N2-Konzentration, Luftfeuchtigkeit und/oder Zufuhr von Fluiden in die Zellkulturgefäße, insbesondere in die Wells von MT-Platten auf. Diese Sensoren sind die Grundlage für eine vollautomatische Kontrolle und Steuerung der klimatischen Ver- hältnisse sowie der Zufuhr von Fluiden in die Zellkulturgefäße.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist gekennzeichnet durch ein computergesteuertes Kontroll- und Steuersystem zur automatischen Kontrolle und Steuerung mindestens einer, vorzugsweise aller nachfolgend aufgeführter Parameter bzw. Arbeitsschritte: a) Temperatur, insbesondere in der Klimakammer; b) O2-Anteil im Gas, insbesondere in der Klimakammer; c) CO2-Anteil im Gas, insbesondere in der Klimakammer; d) N2-Anteil im Gas, insbesondere in der Klimakammer; e) Befüllung und/oder Entleerung ausgewählter Zellkulturgefäße, insbesondere ausgewählter Wells von ausgewählten MT-Platten mit ausgewählten Mengen von ausgewählten Fluiden; f) mikroskopische Beobachtung und Auswertung von Zellkulturen in ausgewählten Zellkulturgefäßen, insbesondere ausgewählten Wells von ausgewählten MT-Platten zu ausgewählten Zeiten mit ausgewählter Technik, wie z.B. Fluoreszenz - oder Phasenkontrastmikroskopie.
Vorzugsweise werden sämtliche Parameter bzw. Arbeitsschritte in das System eingespeist. Ab diesem Zeitpunkt werden beispielsweise die klimatischen Bedingungen vom System automatisch geregelt. Sollte ein oder mehrere Parameter im Laufe der Zellkultivierungszyklen von den eingegebenen Werten abweichen (z.B . in Folge eines kurzfristigen Öffnens der Klimakammer zum Heraus- bzw. Hineintransportieren einer MT-Platte), wird dieser umgehend auf den vorgegebenen Wert nachgeregelt. Zur gezielten Befüllung ausgewählter Wells von ausgewählten MT- Platten mit ausgewählten Mengen von ausgewählten Fluiden sind die MT-Platten und vorzugsweise auch die Wells der MT-Platten indiziert. Dadurch können die Wells der MT-Platten auf besonders einfache Weise in das System eingegeben und von diesem wiedererkannt werden. Mit Hilfe der Optik werden vorzugsweise kontinuierlich Aufnahmen von den kultivierten Zellen gemacht, wobei die Aufnahmen vorzugsweise vom System gespeichert werden. Das System erkennt vorzugsweise auch bestimmte Veränderungen an den Zellkulturen und kann dadurch auf bestimmte Veränderungen der Zellkulturen durch Nachregeln der oben genannten Parameter bzw. Arbeitsschritte reagieren.
Eine bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist gekennzeichnet durch eine Be- und Entdeckelungsvorrichtung zum, vorzugsweise automatischen Be- und Entdeckein der Zellkulturgefäße (siehe auch Figurenbeschreibung).
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist in der Fluidverteilungseinheit eine gesteuerte selektive Verwendung von Einmal- und Mehrfachpipetten möglich. Dadurch kann eine Kreuzkontamination zwischen einzelnen Kulturgefäßen und Wells verhindert werden. In der erfindungsgemäßen Vorrichtung werden insbeson- dere zwei Arten von Pipetten verwendet. So kommen zum einen sogenannte Working-Pipetten zum Einsatz, welche mehrfach während einer Kultivierung verwendet werden, was die Notwendigkeit einer sterilen Aufnahme und sterilen Ablage mit sich bringt. Die Working-Pipetten werden in sterilen Boxen innerhalb der erfindungsgemäßen Vorrichtung gelagert. Im Bereich der Fluidverteilungseinheit nimmt in der Regel ein Roboterarm die Working-Pipetten steril aus den Aufnahmeboxen auf. Danach werden die gewünschten Fluidaktionen an den Zellkulturbehältern durchgeführt. Anschließend legt der Roboterarm der Fluidverteilungseinheit die Working-Pipetten wieder steril in der Aufnahmebox ab. Dieser Arbeitszyklus kann mehrfach während einer Zellkultivierung stattfinden. Neben den Working-Pipetten kommen bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung in der Regel auch Einmal-Pipetten zum Einsatz. Diese Einmal- Pipetten werden nur einmal während einer Zellkultivierung verwendet, mit der Notwendigkeit der einmaligen sterilen Aufnahme und sicheren Entsorgung nach einer durchgeführten Einmalaktion. Die Einmal- Pipetten werden in sterilen Einmalboxen im Bereich der Fluidstation gelagert. Beim Einsatz nimmt der Fluidroboterarm eine Einmal-Pipette steril aus einer Aufnahmebox auf. Anschließend wird die gewünschte Fluidaktion an einem Zellkulturbehälter, insbesondere einer MT-Platte durchgeführt. Nach der Aktion wirft der Roboterarm die Einmal-Pipette in eine Abfallbox ab. Dieser Arbeitszyklus findet mit einer Einmal- Pipette während einer Zellkultivierung nur einmal statt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur automatisierten, parallelisierten Kultivierung von Zellen in Zellkulturgefäßen, insbesondere Mikrotiterplatten, die sich in einem Zellkultursystem, insbesondere in einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 13 befinden, umfassend folgende Arbeitsschritte: a) Befüllen des Systems mit Zellkulturgefäßen; b) Befüllen des Systems mit Behältnissen, enthaltend zu verwendende Fluide, wie Zellkulturmedium, Zellsuspension, Prüfsubstanz, Farbstoff; c) Bestücken des Systems mit Behältnissen, enthaltend zu verwendende Gase, wie O2, CO2, N2; d) Programmieren des Systems zur automatischen Einstellung min- destens einer der folgenden Parameter:
Temperatur O2-Anteil im Gas CO2-Anteil im Gas N2-Anteil im Gas; e) Programmieren des Systems zur automatischen Befüllung und/oder
Entleerung von Zellkulturgefäßen, insbesondere von ausgewählten Wells von ausgewählten MT-Platten mit ausgewählten Mengen von ausgewählten Fluiden, zu ausgewählten Zeiten;
f) Programmieren des Systems zur mikroskopischen Beobachtung und Auswertung von Zellkulturen in ausgewählten Zellkulturgefäßen, insbesondere in ausgewählten Wells von ausgewählten MT-Platten zu ausgewählten Zeiten mit ausgewählter Technik, wie z.B. Fluoreszenz - oder Phasenkontrastmikroskopie oder jedwedes anderes Detektionsverfahren zur Beobachtung und/oder Analyse von Zellen.
Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung bzw. beim erfindungsgemäßen Verfahren regelt das System die klimatischen Bedingungen automatisch nach im Sinne eines Regelkreises zur konstanten Aufrechterhaltung der klimatischen Bedingungen. Ferner führt das System die mikroskopische Auswertung gemäß den programmierten Werten für die Mikroskopie aus.
Für die optische Auswertung können in jedem Kulturgefäß vielfache frei wählbare Beobachtungspunkte (points of interest = POI) im Kulturgefäß oder in den Subeinheiten (zum Beispiel POI 1 bis 10 im Well 2 des Kulturgefäßes 4) definiert werden. Hierbei kann über eine spezifische Steuerungssoftware mit Anwenderoberfläche frei gewählt werden, welcher POI in welchem Kulturgefäß zu welchem Zeitpunkt und welcher optischer Methode (zum Beispiel Durchlicht, Phasenkontrast, Fluoreszenz) ausgewertet werden soll. Besonders bevorzugt kann jeder POI durch die Verfahreinheit (Kreuztisch) in drei Achsen x-y-z (also horizontal sowie vertikal) angefahren, vom System fokussiert, aufgenommen, ausgewertet und gespeichert werden. Durch die Möglichkeit dieses dreidimensionalen Aufnehmens und Speicherns von POI's können verschiedene Ebenen in einem Kulturgefäß beziehungsweise in einer Sub- einheit eines Kulturgefäßes fokussiert werden.
Jeder POI kann im Zeitverlauf hoch genau mit einer Präzision von < 1 μm wieder angefahren und ausgewertet werden. Jedoch können neben Ein- zelbildern und Einzelbildauswertungen auch Zeitrafferaufnahmen und dynamische Auswertungen jedes POI durch Zusammensetzung der Einzelbilder ermöglicht werden. Ferner ist in der Regel eine automatische Analyse der optischen Bildinformationen mittels spezifischer Software und Anwenderoberfläche möglich (zum Beispiel Zellzahl, Zellbewegung, Zellform, Farbinformationen fluoreszenzmarkierter Zellbestandteile, Anzahl der gefärbten Zellen).
Ferner kann das System verbrauchtes Medium entnehmen und neues Medium zuführen.
Das Befüllen des Systems mit Zellkulturgefäßen und das Befüllen des Systems mit Behältnissen, enthaltend zu verwendende Fluide erfolgt in der Regel manuell. Dies gilt auch für das Bestücken des Systems mit Behältnissen, enthaltend zu verwendende Gase. Hierzu kann die erfindungsgemäße Vorrichtung ein weiteres Gehäuse aufweisen, welches die genannten Gasflaschen enthalten kann.
Zusammenfassend lassen sich unter anderem folgende Vorteile der erfindungsgemäßen Vorrichtung sowie des erfindungsgemäßen Verfahrens nennen:
Automatisierte, parallelisierte Kultivierung von Zellen in Zellkulturgefäßen, insbesondere in Mikrotiterplatten in einem Gesamtsys- tem mit automatischer Kontrolle sämtlicher Zellkulturparameter
(z.B. Temperatur, CO2-Konzentration, O2-Konzentration, N2- Konzentration, Luftfeuchtigkeit, Fluidsupport, aktive Substanzen);
- niedrige Kosten;
- offene Systemplattform-Lösung für die biopharmazeutische Indus- trie, um sowohl neue verbesserte Zelllinien entwickeln als auch neue Wirkstoffe effizient und hoch-reproduzierbar screenen und entwickeln zu können;
geringer Platzbedarf und einheitliche, intuitive Bedienung mit ge- ringer Einarbeitungszeit für das Bedienpersonal;
wirtschaftliche Nutzung durch Mehrfachverwendung teurer Baugruppen;
apparativ einfach, ergonomischer, modularer Aufbau, langlebige Komponenten mit hoher Biokompatibilität;
ermöglicht eine parallele, simultane Kultivierung unterschiedlicher Zellen unter identischen Bedingungen;
Möglichkeit einer ständigen mikroskopischen Beobachtung und Dokumentation und Speicherung aller relevanter Daten für den späteren Abruf und Auswertung;
direkte Messung der Effekte bei Veränderung der Kulturbedingungen und Möglichkeit der Auswertung je nach Medienzusammensetzung;
sofortige Erkennung morphologischer Veränderungen und Verbes- serung der Entwicklungsqualität durch aussagekräftige Ergebnisse;
Möglichkeit der Einstellung optimaler Konzentrationen einzelner Stoffe und stufenlose Änderung der Kulturbedingungen;
Verkürzung der Entwicklungszeiten durch Parallelisierung um den Faktor 2 bis 4 (z.B. Reduktion der Zeit für eine Medienoptimie- rung von bisher 12 Monaten auf 3 bis 6 Monate);
Reduktion der Entwicklungskosten durch Automatisierung um den Faktor 2 bis 3 (z.B. Reduktion der Kosten für eine Medienoptimierung von früher 75.000 EUR auf 25.000 EUR bis 40.000 EUR);
automatisiertes Durchführen komplexer Zellkulturen z.B. für Toxi- zitätsstudien zur Reduktion der Notwendigkeit und der Anzahl von
Tierversuchen. Folgende Anwendungsfelder sind mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung bzw. dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich (beispielhaft):
Entwicklung serumfreier Systeme;
- Nährmedien-Optimierung;
- Stammzellenforschung;
Klonentwicklung;
- Wirkstoffforschung;
Zellzyklus-Untersuchungen;
- Zeil-Interaktionen;
- Organsimulation;
Cytotoxizitäts-Tests;
- Cell-processing;
Entwicklung therapeutischer Ansätze auf zellulärer Basis;
Automatisiertes Durchführen komplexer Zellkulturen zur Redukti- on von Tierversuchen.
Weitere Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung in Verbindung mit den Zeichnungen und den Unteransprüchen. Hierbei können die einzelnen Merkmale jeweils für sich allein oder in Kombina- tion miteinander verwirklicht sein. In den Zeichnungen zeigen:
Fig. 1 : eine Seitenansicht einer erfindungsgemäßen Vorrichtung (ohne Gehäuse und Klimakammer);
Fig. 2: eine perspektivische Darstellung der Vorrichtung von Figur 1 ;
Fig. 3 : eine Draufsicht der Vorrichtung von Figur 1 ;
Fig. 4: eine perspektivische Darstellung der Vorrichtung von Figur 1 mit Klimakammer;
Fig. 5 : die Vorrichtung von Figur 4 mit Gehäuse;
Fig. 6: Steuer- und Regelungsschema für eine erfindungsgemäße Vorrichtung.
Fig. 7: eine perspektivische Darstellung einer Entdeckelungsvorrich- tung in einer erfindungsgemäßen Vorrichtung
Fig. 8 : eine Draufsicht auf die Entdeckelungsvorrichtung von Fig. 7.
Figur 1 zeigt eine Seitenansicht einer erfindungsgemäßen Vorrichtung 1 zur automatisierten, parallelisierten Kultivierung von Zellen in Mikroti- terplatten 2 mit einer Beobachtungseinheit 3, einer Aufnahmevorrichtung 4 zur Aufnahme der Mikrotiterplatten 2 sowie einer Fluidverteilungsein- heit 5. Die Beobachtungseinheit 3 umfasst eine CCD-Kamera 6, sowie ein Mikroskop 7. Die Kamera 6 sowie das Mikroskop 7 sind an einer Halterung 8 angeordnet. Die Beobachtungseinheit 3 umfasst ferner einen Aufnahmetisch 9 zur Aufnahme der MT-Platten 2.
Die Aufnahmevorrichtung 4 umfasst vier übereinander angeordnete Aufnahmeplatten 10. Die Aufnahmeplatten 10 weisen (hier nicht dargestellte) Aussparungen auf, in welche die MT-Platten einpassbar sind. Die Aufnahmevorrichtung 4 kann gehoben bzw. gesenkt werden. Innerhalb der Aufnahmeplatten 10 der Aufnahmevorrichtung 4 können die MT- Platten 2 bewegt werden. In der vorliegenden Darstellung ist gezeigt, wie eine MT-Platte 2a von der Aufnahmevorrichtung 4 in den Bereich der Beobachtungseinheit 3 mit Hilfe eines Schlittens 1 1 transportiert wird. Durch die Hub- und Senkbewegungen der Aufnahmevorrichtung 4 sowie durch die Transportierbarkeit der MT-Platten 2 innerhalb einer Ebene können gezielt MT-Platten beispielsweise der Beobachtungseinheit 3 oder der Fluidverteilungseinrichtung 5 zugeführt werden.
Die Fluidverteilungseinheit 5 umfasst eine Mikrodosiervorrichtung 12 mit einem bewegbaren, insbesondere Rotationsbewegungen und/oder Hub- und Senkbewegungen ausführenden Verteilarm 13 , welcher mit einer festen oder wechselbaren Pipette 14 versehen ist. Die Fluidverteilungseinheit umfasst ferner mehrere Behältnisse 15, in welchen unterschiedliche Fluide, wie beispielsweise Zellsuspensionen, Nährstoffe, Farbstoffe etc., enthalten sind. Die Behältnisse 15 sind in einer bestimm- ten Anordnung um die Mikrodosiervorrichtung 12 herum angeordnet, wobei die Pipette 14 durch Rotationsbewegungen und/oder Hub- und Senkbewegungen des Verteilarms 13 und/oder durch Bewegung der Pipette entlang des oberen Abschnittes 16 des Verteilarms 13 zu den einzelnen Behältnissen gebracht werden kann. Zum Befüllen der Wells 17 der MT-Platten 2 können die MT-Platten 2 automatisch von der Aufnahmevorrichtung 4 in den Bereich der Fluidverteilungseinheit 5 mittels eines Schlittens transportiert werden. In der vorliegenden Darstellung ist eine MT-Platte 2b im Bereich der Fluidverteilungseinheit 5 angeordnet und wird dort mit Hilfe der Mikrodosiervorrichtung 12 mit bestimmten Fluiden befüllt.
Figur 2 zeigt eine perspektivische Darstellung der Vorrichtung von Figur 1. Gut zu erkennen sind in dieser Darstellung die übereinander angeordneten Aufnahmeplatten 10 der Aufnahmevorrichtung 4. Die einzelnen Aufnahmeplatten 10 weisen Aussparungen 18 auf, die so dimensioniert sind, dass die MT-Platten 2 darin aufgenommen und gehalten werden können. Figur 3 zeigt eine Draufsicht auf die Vorrichtung 1 von Figur 1 bzw. Figur 2. Neben dem eigentlichen Arbeitsraum, welcher sich unter dem hier nicht dargestellten Gehäuse befindet, ist eine Aufnahmekammer 19 zur Aufnahme von Gasflaschen 20 angeordnet.
Figur 4 zeigt die Vorrichtung 1 , wobei die Aufnahmevorrichtung 4 in einer Klimakammer 21 angeordnet ist. Das Gehäuse 21 a der Klimakammer kann transparent oder undurchsichtig sein. Das Gehäuse 21 a schließt die Aufnahmevorrichtung 4 im Wesentlichen luftdicht ein und trägt so zu einer Vermeidung von Verunreinigung der MT-Platten bei. Innerhalb der Klimakammer 21 kann ein gewünschtes Klima eingestellt werden. So können beispielsweise die Temperatur, die O2-Konzentration, die CO2- Konzentration, N2-Konzentration sowie die Luftfeuchtigkeit eingestellt werden. Auf diese Art und Weise können die klimatischen Verhältnisse auf die jeweiligen Bedürfnisse der zu kultivierenden Zellen eingestellt werden. Die Beobachtungseinheit 3 sowie die Fluidverteilungseinheit 5 sind außerhalb der Klimakammer 21 angeordnet und werden so nicht den klimatischen Gegebenheiten, welche für eine optimale Zellkultivierung nötig sind, ausgesetzt. Ferner wird verhindert, dass Verunreinigungen (z.B. Schmierfette) von der Beobachtungseinheit 3 bzw. der Fluidvertei- lungseinheit 5 in die MT-Platten 2 gelangen. Im Gehäuse 21 a sind zwei Öffnungen 22 angeordnet, welche das Transportieren von MT-Platten aus der Klimakammer 21 heraus bzw. in die Klimakammer 21 hinein ermöglichen. Die Öffnungen 22 sind im Bereich der Beobachtungseinheit 3 sowie im Bereich der Fluidverteilungseinheit 5 angeordnet und ermögli- chen dort ein Transportieren von MT-Platten 2. Die Öffnungen 22 können nach dem Transport der MT-Platten verschlossen werden.
Figur 5 zeigt die Vorrichtung 1 mit aufgesetztem Gehäuse 23. Das Gehäuse 23 kann komplett transparent oder auch komplett undurchsichtig sein. Das Gehäuse 23 kann auch - wie im vorliegenden Ausführungsbei- spiel - einen transparenten Bereich 24 in Form einer Glasscheibe aufweisen. Die Glasscheibe 24 kann als offenbares Fenster ausgebildet sein, so dass im Bedarfsfall durch das geöffnete Fenster 24 in das Innere des Gehäuses 23 gelangt werden kann. Die gesamte Vorrichtung 1 ist als so genannte „Sterilbank" ausgeführt. Das Gehäuse 23 schließt den Kultivierungsraum im Wesentlichen luftdicht ab und verhindert ein Eindringen von Schmutz, Bakterien etc. von außen in den Innenraum.
Sämtliche klimatische Bedingung im Inneren der Klimakammer 21 bzw. im Gehäuse 23 werden durch ein computergesteuertes Kontroll- und Steuersystem gesteuert. Sensoren im Inneren des Gehäuses 23 bzw. im Inneren der Klimakammer 21 liefern ständig Informationen über die gegenwärtigen Verhältnisse in den jeweiligen Räumen. Durch die Kontroll- und Steuersoftware werden die klimatischen Bedingungen stets auf einem vorgegebenen Level gehalten. Auch die Befüllung der Wells 17 bestimmter MT-Platten mit bestimmten Mengen von bestimmten Fluiden wird durch das computergesteuerte Kontroll- und Steuersystem gesteuert. Hierzu sind die MT-Platten (2) und die einzelnen Wells 17 der MT- Platten 2 indiziert und werden vom System wiedererkannt. Das computergesteuerte Kontroll- und Steuersystem kann dahingehend programmiert werden, dass bestimmte Wells ( 17) von ausgewählten MT-Platten (2) zu bestimmten Zeiten mit bestimmten Mengen von bestimmten Fluiden befüllt werden.
Ebenso wird das computergesteuerte Kontroll- und Steuersystem zur mikroskopischen Beobachtung und Auswertung von bestimmten Zellkulturen in bestimmten Wells ( 17) von bestimmten MT-Platten (2) zu bestimmten Zeiten mit bestimmter Technik, wie z.B. Fluoreszenz- oder Phasenkontrastmikroskopie und/oder jedwedes anderes Detektionsverfah- ren zur Beobachtung und/oder Analyse von Zellen programmiert. Ferner kann das System dahingehend programmiert werden, dass zu bestimmten Zeiten Aufnahmen von Zellkulturen gemacht werden, wobei die Aufnahmen in der Regel gespeichert und ständig ausgewertet werden.
Figur 6 zeigt eine schematische Darstellung der Steuerung und Regelung der klimatischen Verhältnisse im Inneren der Klimakammer 21 bzw. im Inneren des Gehäuses 23. In der Klimakammer 21 sind Gassensoren 25 angeordnet, nämlich ein CO2-Sensor 26, ein N2-Sensor 27 sowie ein hier nicht dargestellter O2-Sensor. Ferner können Sensoren für andere Gase vorhanden sein. Die von den Gassensoren ermittelten Konzentrationswer- te werden einem Klimakammerregler 28 zugeführt. Ein Luftfeuchtigkeitssensor 29 detektiert ständig die Luftfeuchtigkeit im Inneren der Klimakammer 21 bzw. im Inneren des Gehäuses 23. Ferner misst ein Temperatursensor 30 ständig die Temperatur. Auch der Feuchtigkeitssensor 29 sowie der Temperatursensor 30 übermitteln ihre Werte an den Klimakammerregler 28. Ein weiterer Temperatursensor 31 misst ständig die Temperatur im Inneren des Gehäuses 23. Eine so genannte Lami- narflowheizung 32 stellt eine Temperatur im Gehäuse, die vorzugsweise der Temperatur in der Klimakammer entspricht, ein. Dadurch werden Kondensationsprozesse im Bereich der Klimakammer verhindert. Der Klimakammerregler 28 regelt über einen Befeuchter 33 die Luftfeuchtigkeit im Inneren der Klimakammer 21. Zwischen dem Befeuchter 33 und der Klimakammer 21 ist ein Filterelement 34 zwischengeschaltet. Ferner kann Frischluft 35 ins Innere des Gehäuses 23 bzw. der Klimakammer 21 eingebracht werden. Über den Klimakammerregler 28 werden über Gasregler die Gaszuströme aus den Gasflaschen 20 gesteuert. Dabei werden bestimmte Gasmengen in eine Mischkammer 36 geleitet. Über eine Gasumlaufpumpe 37, welche ebenfalls über den Klimakammerregler 28 geregelt wird, wird das gewünschte Gasgemisch in die Klimakammer 21 geleitet. Das gewünschte Gasgemisch wird durch eine Gasgemisch- Leitungsheizung 38 auf die gewünschte Temperatur gebracht.
Es versteht sich, dass eine erfindungsgemäße Vorrichtung auch anders ausgestaltet sein kann, als dies in den Figuren dargestellt ist. So kann die Aufnahmevorrichtung zur Aufnahme der MT-Platten auch aus übereinander angeordneten, unabhängig von einander drehbaren Drehtellern aufgebaut sein. Auch können die einzelnen Aufnahmeelemente der Aufnahmevorrichtung in der Art von Fließbändern ausgebildet sein, durch die eine lineare Anordnung der MT-Platten und ein linearer Trans- port derselben erreicht wird.
Ferner ist es denkbar, dass die Klimakammer zumindest im Bereich der Beobachtungseinheit transparent ausgebildet ist und durch die Wand der Klimakammer hindurch mikroskopiert bzw. beobachtet werden kann, so dass die MT-Platten nicht aus der Klimakammer heraus bewegt werden müssen. Hierzu kann die Klimakammer auch eine Ausbuchtung aufweisen, in welche eine zu beobachtende MT-Platte zum Beobachten hineingebracht werden kann.
Unabhängig von der Ausführungsform sollen die Positionen der MT- Platten bei jeder Beobachtung definiert gleich sein, d.h. bei mehrmaligem Durchlauf sollte die Beobachtungsposition mit hoher Genauigkeit reproduzierbar angefahren werden. Die Genauigkeit des Systems wird von der Genauigkeit der Außenmaße der MT-Platten vorgegeben. Hierbei gibt es hinsichtlich der Ausrüstung der Platten verschiedene Varianten. Die MT-Platten können mit einer Folie am Boden bespannt und somit optisch definiert sein. Allerdings entstehen in Z-Richtung bestimmte Abweichungen. Eine andere Ausführungsform der MT-Platten besteht darin, dass die Platten mit einer Glasscheibe ausgerüstet und optisch definiert sind. Diese MT-Platten haben kaum Abweichungen in Z- Richtung.
Bei wiederholter Vorlage der MT-Platten an die Optik besteht die Notwendigkeit, die Zellpositionen in den MT-Platten mit den Maßabweichungen im System abzugleichen. Auch dies erfolgt durch das computergesteuerte Kontrollsystem.
Figur 7 zeigt eine perspektivische Darstellung einer Entdeckelungsvor- richtung (40) einer bevorzugten Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung. Die Entdeckelungsvorrichtung umfasst einen Roboterarm (41 ) sowie eine Deckelhaltevorrichtung (42). Figur 8 zeigt die Deckelhaltevorrichtung (40) in einer Draufsicht. Die Entdeckelungsvor- richtung (40) dient der Be- bzw. Entdeckelung von MT-Platten (2). In der Regel werden die MT-Platten in der Klimakammer zum Inkubieren mit geschlossenem Deckel gelagert. In der Fluid- oder Optikstation sollen die MT-Platten jedoch ohne Deckel bearbeitet werden. Daher müssen die MT-Platten immer wieder be- bzw. entdeckelt werden, was mit der Entdeckelungsvorrichtung (40) möglich ist. Der Begriff Entde- ckelungsvorrichtung schließt natürlich auch ein, dass die Vorrichtung (40) auch zum Bedeckelen geeignet ist. Soll nun beispielsweise eine MT- Platte vom Inkubator zur Optikstation gefahren werden, holt der Roboterarm (41 ) die entsprechende MT-Platte vom gewählten Platz in der Klimakammer („Regalplatz"). Anschließend fährt der Roboterarm (41 ) unter die Deckelhaltevorrichtung (42) und fährt anschließend auf diese zu. Die Deckelhaltevorrichtung (42) weist horizontal verschiebbare Halteklammern (43) auf, die über eine Feder oder mechanisch bewegbaren Stift (45) bewegbar sind. Beim Hochfahren der MT-Platte (2) auf die Deckelhaltevorrichtung (42) zu wird der Deckel (44) der MT-Platte (2) schließlich in die Haltevorrichtung (42) eingesetzt und von den Halteklammern (43) gehalten. Anschließend fährt der Roboterarm (41 ) mit der MT-Platte (2) nach unten, wobei der Deckel (44) in der Deckelhaltevorrichtung (42) verbleibt. Die Entdeckelungsvorrichtung (40) ist in der Klimakammer (21 ) positioniert.
Anschließend fährt der Roboterarm (41 ) die geöffnete MT-Platte (2) von der Klimakammer hinaus in die Beobachtungseinheit (Optikstation). Während die MT-Platte in der Beobachtungseinheit für eine gewisse Zeit verbleibt, wird der Deckel (44) weiterhin in der Deckelhaltevorrichtung gehalten.
Sind die Aktionen an der Optikstation beendet, fährt der Roboterarm (41 ) die offene MT-Platte von der Optikstation wieder zurück in die Klimakammer. Dort fährt der Roboterarm (41 ) die offene MT-Platte (2) nach oben in Richtung auf die Deckelhaltevorrichtung (42), wobei letztlich die offene MT-Platte passgenau mit dem Deckel (44) verbunden wird. Nun lassen die Halteklammern (43) den Deckel (44) los, wodurch die MT-Platte (2) schließlich wieder bedeckelt ist. Nun fährt der Roboterarm (41 ) die MT-Platte nach unten und verbringt diese an den gewünschten „Parkplatz".

Claims

ANSPRUCHE:
1. Vorrichtung zur automatisierten, parallelisierten Kultivierung von Zellen in Zellkulturgefäßen, insbesondere Mikrotiterplatten (MT-Platten) (2) mit einem
Gehäuse (23), in welchem eine Beobachtungseinheit (3), umfassend mindestens ein Mikroskop (7) und mindestens eine Kamera (6), eine Aufhahmevorrichtung (4) zur Aufnahme der Zellkulturgefäße sowie eine Fluidverteilungseinheit (5) zum automatischen Befallen und/oder Entleeren der Zellkulturgefäße, insbeson- dere der Wells (17) von MT-Platten mit Fluiden angeordnet sind, wobei die klimatischen Verhältnisse in der Vorrichtung, insbesondere die Gaszusammensetzung und die Temperatur zumindest im Bereich der Zellkulturgefäße regelbar sind, wobei im Gehäuse eine Klimakammer (21) vorgesehen ist, in der eine gewünschte Temperatur und/oder eine bestimmte Gaszusammensetzung automatisch einstellbar ist und in der die Aumahmevorrichtung (4) mit den Zellkulturgefäßen (2) mindestens teilweise integriert ist.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass getrennte Gasbehälter vorgesehen sind, welche unterschiedliche Gase, vorzugsweise O2, CO2 und N2 enthalten, wobei die Gasströme aus den Gasflaschen steuerbar sind und wobei bestimmte Gasmengen in eine Mischkammer geleitet werden, von wo aus das so hergestellte Gasgemisch in die Klimakammer geleitet wird, wobei das Gasgemisch vor dem Einleiten in die Klimakammer vorzugsweise auf eine gewünschte Temperatur gebracht wird.
3. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass Zellkulturgefäße (2) vorzugsweise im Bereich der Beobachtungseinheit (3) und/oder im Bereich der Fluidverteilungseinheit (5), vorzugsweise automatisch durch einen Schlitten (11) oder Roboterarm aus der Klimakammer (21) bzw. in die Klimakammer transportierbar sind.
4. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeich- net, dass die Beobachtungseinheit (3) und/oder die Fluidverteilungseinheit (5) außerhalb der Klimakammer (21) angeordnet sind.
5. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Aufhahmevorrichtung (4) mindestens zwei, vorzugsweise überein- ander angeordnete Aufhahmeeinheiten (10) umfasst und vorzugsweise Halteeinrichtungen (18) zum Halten der Zellkulturgefäße (2) aufweist.
6. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Optik (Mikroskop (7) inkl. Kamera (6)) der Beobachtungseinheit (3) bewegbar ist, wobei die Bewegungen vorzugsweise steuerbar sind.
7. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein im Bereich der Beobachtungseinheit (3) befindliches Zellkulturgefäß (2a) bewegbar ist, wobei die Bewegungen vorzugsweise steuerbar sind.
8. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Mikroskop (7) ein Durchlicht- und/oder Phasenkontrast- und/oder Fluoreszenzmikroskop ist.
9. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Fluidverteilungseinheit (5) mehrere Behältnisse zum Lagern unterschiedlicher Fluide, wie z.B. Zelllösungen, Nährstoffe und Farbstoffe, sowie eine Mikrodosiereinheit (12) zur gezielten, kontrollierten Zugabe der Fluide in die Zellkulturgefaße, insbesondere in die Wells (17) von MT-Platten (2) und vor- zugsweise auch zum Entfernen der Fluide aus den Zellkulturgefäßen, insbesondere aus den Wells der MT-Platten umfasst, wobei die Bewegungen und Aktionen der Mikrodosiereinheit vorzugsweise steuerbar sind.
10. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellkulturgefäße, insbesondere die MT-Platten (2) und vorzugsweise auch die Wells (17) der MT-Platten indiziert sind.
1 1. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellkulturgefäße (2) transparent ausgebildet sind.
12. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch Sensoren (25, 26, 27, 29, 30, 31) zur Kontrolle sämtlicher relevanter Parameter, insbesondere Temperatur, CO2-Konzentration, O2-Konzentration, N2- Konzentration, Luftfeuchtigkeit und/oder Zufuhr von Fluiden in die Zeilkultivierungsgefäße, insbesondere in die Wells (17) der MT-Platten (2).
13. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch ein computergesteuertes Kontroll- und Steuersystem zur automatischen Kontrolle und Steuerung mindestens einer, vorzugsweise aller nachfolgend aufgeführter Parameter bzw. Arbeitsschritte: a) Temperatur, insbesondere in der Klimakammer (21); b) O2- Anteil im Gas, insbesondere in der Klimakammer; c) CO2- Anteil im Gas, insbesondere in der Klimakammer; d) N2-Anteil im Gas, insbesondere in der Klimakammer; e) Befüllung und/oder Entleerung von ausgewählten Zellkulturgefäßen, insbesondere ausgewählter Wells (17) von ausgewählten MT-Platten (2) mit ausgewähl- ten Mengen von ausgewählten Fluiden, zu ausgewählten Zeiten; f) mikroskopische Beobachtung und Auswertung von Zellkulturen in ausgewählten Zellkulturgefäßen, insbesondere in ausgewählten Wells von ausgewählten MT- Platten zu ausgewählten Zeiten mit ausgewählter Technik, wie z.B. Fluoreszenz -, Durchlicht- oder Phasenkontrastmikroskopie.
14. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch eine Be- und Entdeckelungsvorrichtung zum vorzugsweise automatischen Be- und Entdeckein der Zellkulturgefäße.
15. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in der Fluidverteilungseinheit eine gesteuerte selektive Verwendung von Einmal- und Mehrfachpipetten möglich ist.
16. Verfahren zur automatisierten, parallelisierten Kultivierung von Zellen in ZeIl- kulturgefaßen, insbesondere Mikrotiterplatten (2), die sich in einem Zellkultursystem, insbesondere in einer Vorrichtung (1) nach einem der Ansprüche 1 bis 15 befinden, umfassend folgende Arbeitsschritte: a) Befüllen des Systems mit Zellkulturgefäßen (2); b) Befüllen des Systems mit Behältnissen (15), enthaltend zu verwendende Fluide, wie Zellkulturmedium, Zellsuspension, Prüfsubstanz, Farbstoff; c) Bestücken des Systems mit Behältnissen (20), enthaltend zu verwendende Gase, wie O2, CO2, N2; d) Programmieren des Systems zur automatischen Einstellung mindestens einer der folgenden Parameter: - Temperatur
O2-Anteil im Gas
- CO2-Anteil im Gas
- N2-Anteil im Gas; e) Programmieren des Systems zur automatischen Befüllung und/oder Entleerung von Zellkulturgefäßen, insbesondere von ausgewählten Wells (17) von ausgewählten MT-Platten (2) mit ausgewählten Mengen von ausgewählten Fluiden, zu ausgewählten Zeiten; f) Programmieren des Systems zur mikroskopischen Beobachtung und Auswertung von Zellkulturen in ausgewählten Zellkulturgefäßen, insbesondere in ausge- wählten Wells von ausgewählten MT-Platten zu ausgewählten Zeiten mit ausgewählter Technik, wie z.B. Fluoreszenz -, Durchlicht- oder Phasenkontrastmikroskopie.
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013052836A1 (en) 2011-10-07 2013-04-11 Atmi Packaging, Inc. Fluid processing control system and related methods
KR101341833B1 (ko) 2011-10-24 2013-12-16 대한민국 공기전염 병원성 미생물 무인 포자채집장치
WO2013186318A1 (en) 2012-06-14 2013-12-19 Aglaris Cell S.L. Cell culture method and system
WO2016055169A1 (de) * 2014-10-07 2016-04-14 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Automatisches verfahren zur beobachtung von zellkulturwachstum
EP3284815A4 (de) * 2015-07-09 2018-12-12 Samsung Life Public Welfare Foundation Automatisierte zellkultivierungsvorrichtung und verfahren zum betrieb einer kultivierungsvorrichtung
EP3081632B1 (de) * 2013-12-12 2019-03-27 Yamaha Hatsudoki Kabushiki Kaisha Gegenstandsbewegungsvorrichtung
LU100885B1 (de) * 2018-07-25 2020-01-27 Cytena Gmbh Vorrichtung mit wenigstens einem Behältnis

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113308373A (zh) 2013-03-01 2021-08-27 格尼亚Ip控股私人有限公司 用于培养样品发育监测的装置，方法和系统
US10202568B2 (en) 2013-08-12 2019-02-12 Invivosciences Inc. Automated cell culture system and method
CN106103688A (zh) * 2014-03-10 2016-11-09 株式会社斯库林集团 摄像装置、摄像系统以及培养箱
JP6619544B2 (ja) 2014-03-19 2019-12-11 株式会社日立ハイテクノロジーズ 検査装置
US11041871B2 (en) 2014-04-16 2021-06-22 Bd Kiestra B.V. System and method for incubation and reading of biological cultures
DE102014213348A1 (de) 2014-07-09 2016-01-14 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Durchlichtmikroskop und Verfahren zur Durchlichtmikroskopie
US20180072980A1 (en) * 2015-03-18 2018-03-15 Rohto Pharmaceutical Co., Ltd. Apparatus to produce cultured cell products and method for producing cultured cell products
JP6437103B2 (ja) * 2015-04-23 2018-12-12 株式会社日立ハイテクノロジーズ 感受性計測装置及び検査装置
US10351812B2 (en) 2015-08-28 2019-07-16 Axion Biosystems, Inc. Device and system for creating and maintaining a localized environment for a cell culture plate
CN106244456B (zh) * 2016-08-29 2019-05-10 杭州键一生物科技有限公司 全自动智能培养箱及其控制方法
KR102444077B1 (ko) 2017-11-29 2022-09-16 한국전자통신연구원 세포 노출 시스템
CN110643577A (zh) * 2018-06-26 2020-01-03 深圳市北科生物科技有限公司 基于机械臂的全自动细胞培养方法及其系统
CN108707551B (zh) * 2018-06-27 2022-12-20 深圳市深研生物科技有限公司 一种细胞观察方法
KR20200032830A (ko) * 2018-09-19 2020-03-27 메디칸(주) 자가 줄기세포의 자가 배양 방법 및 장치
CN109294909A (zh) * 2018-09-30 2019-02-01 镇江华智睿安物联科技有限公司 一种细胞观察培养箱
KR102156091B1 (ko) * 2018-11-27 2020-09-15 김철 인장자극 및 실시간 관찰이 가능한 배양체 인큐베이터 시스템
KR102330693B1 (ko) * 2019-11-26 2021-11-24 (주)인포바이오테크 세포 배양기
KR102296208B1 (ko) * 2019-11-27 2021-08-31 (주)인포바이오테크 세포 배양기
DE102019134003A1 (de) * 2019-12-11 2021-06-17 Aixinno Limited Verfahren und Vorrichtung zum Kultivieren biologischer Zellen
CN111004706B (zh) * 2019-12-23 2023-06-16 长春长光辰英生物科学仪器有限公司 一种用于微小尺寸目标分选仪器中的高通量接收系统
WO2021186648A1 (ja) 2020-03-18 2021-09-23 ファナック株式会社 顕微鏡観察システム

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2924446C2 (de) * 1979-06-18 1982-09-16 W.C. Heraeus Gmbh, 6450 Hanau Verfahren und Vorrichtung zum Kultivieren von Zellen und Geweben von Menschen und Tieren oder von Mikroorganismen
US6673595B2 (en) * 2001-08-27 2004-01-06 Biocrystal, Ltd Automated cell management system for growth and manipulation of cultured cells
US20030092178A1 (en) * 2001-11-15 2003-05-15 Biospherix, Ltd. Cell culture incubator with dynamic oxygen control
JP2004051920A (ja) * 2002-07-24 2004-02-19 Jfe Steel Kk 生分解性プラスチックとその製造方法およびその製造装置
WO2004011593A1 (ja) * 2002-07-31 2004-02-05 Japan Science And Technology Agency 生体由来の細胞または組織の自動培養装置
WO2004090093A1 (ja) * 2003-04-09 2004-10-21 Olympus Corporation 培養処理装置および自動培養装置
US20050037485A1 (en) * 2003-06-05 2005-02-17 Rodgers Seth T. System and method for process automation
EP1598415A1 (de) * 2004-05-20 2005-11-23 The Automation Partnership (Cambridge) Limited Intelligente Kultivierung von Zellen
US20050282268A1 (en) * 2004-05-26 2005-12-22 Olympus Corporation Culture microscope and computer program controlling culture microscope
JP4599937B2 (ja) * 2004-08-18 2010-12-15 株式会社ニコン 自動培養装置、および自動培養システム
JP2008533989A (ja) * 2005-03-22 2008-08-28 アイアールエム・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー 化合物をプロファイル解析するデバイス、システムおよび関連方法
JP2007024576A (ja) * 2005-07-13 2007-02-01 Fujifilm Holdings Corp 細胞重層培養物における毒性試験装置

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
None

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013052836A1 (en) 2011-10-07 2013-04-11 Atmi Packaging, Inc. Fluid processing control system and related methods
EP2764083A4 (de) * 2011-10-07 2015-05-20 Pall Technology Uk Ltd Fluidverarbeitungssteuerungssystem und entsprechendes verfahren
US10989362B2 (en) 2011-10-07 2021-04-27 Pall Technology Uk Limited Fluid processing control system and related methods
KR101341833B1 (ko) 2011-10-24 2013-12-16 대한민국 공기전염 병원성 미생물 무인 포자채집장치
WO2013186318A1 (en) 2012-06-14 2013-12-19 Aglaris Cell S.L. Cell culture method and system
CN104704107A (zh) * 2012-06-14 2015-06-10 阿格拉瑞斯细胞公司 细胞培养方法和系统
US9587216B2 (en) 2012-06-14 2017-03-07 Aglaris Cell S.L. Cell culture method and system
US10494599B2 (en) 2012-06-14 2019-12-03 Algaris Cell S.L. Cell culture method and system
EP3081632B1 (de) * 2013-12-12 2019-03-27 Yamaha Hatsudoki Kabushiki Kaisha Gegenstandsbewegungsvorrichtung
WO2016055169A1 (de) * 2014-10-07 2016-04-14 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Automatisches verfahren zur beobachtung von zellkulturwachstum
EP3284815A4 (de) * 2015-07-09 2018-12-12 Samsung Life Public Welfare Foundation Automatisierte zellkultivierungsvorrichtung und verfahren zum betrieb einer kultivierungsvorrichtung
LU100885B1 (de) * 2018-07-25 2020-01-27 Cytena Gmbh Vorrichtung mit wenigstens einem Behältnis

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