WO2010114106A1 - ヒトサイトメガロウイルスｇＢ糖タンパク質のＡＤ１領域に存在する特定の不連続エピトープに結合するモノクローナル抗体ならびにその抗原結合性断片 - Google Patents

ヒトサイトメガロウイルスｇＢ糖タンパク質のＡＤ１領域に存在する特定の不連続エピトープに結合するモノクローナル抗体ならびにその抗原結合性断片 Download PDF

Info

Publication number
WO2010114106A1
WO2010114106A1 PCT/JP2010/056037 JP2010056037W WO2010114106A1 WO 2010114106 A1 WO2010114106 A1 WO 2010114106A1 JP 2010056037 W JP2010056037 W JP 2010056037W WO 2010114106 A1 WO2010114106 A1 WO 2010114106A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
amino acid
acid sequence
seq
antibody
hcmv
Prior art date
Application number
PCT/JP2010/056037
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
賢蔵 高田
里香 栗野
崇 寅嶋
Original Assignee
株式会社イーベック
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to US13/262,061 priority Critical patent/US8492529B2/en
Priority to BRPI1013648-7A priority patent/BRPI1013648B1/pt
Application filed by 株式会社イーベック filed Critical 株式会社イーベック
Priority to RU2011144113/10A priority patent/RU2542472C2/ru
Priority to EP10758877.4A priority patent/EP2420572B1/en
Priority to AU2010232202A priority patent/AU2010232202B2/en
Priority to DK10758877.4T priority patent/DK2420572T3/en
Priority to JP2011507298A priority patent/JP4981192B2/ja
Priority to ES10758877.4T priority patent/ES2539751T3/es
Priority to MX2011010382A priority patent/MX2011010382A/es
Priority to SI201030942T priority patent/SI2420572T1/sl
Priority to KR1020117025880A priority patent/KR101390015B1/ko
Priority to CN2010800149887A priority patent/CN102378814B/zh
Priority to CA2756889A priority patent/CA2756889C/en
Publication of WO2010114106A1 publication Critical patent/WO2010114106A1/ja
Priority to IL215439A priority patent/IL215439A/en
Priority to HRP20150623TT priority patent/HRP20150623T1/hr

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/42—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum viral
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/06—Antiabortive agents; Labour repressants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
    • C07K16/085—Herpetoviridae, e.g. pseudorabies virus, Epstein-Barr virus
    • C07K16/089—Cytomegalovirus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16111—Cytomegalovirus, e.g. human herpesvirus 5
    • C12N2710/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the present invention relates to a monoclonal antibody that binds to human cytomegalovirus (hereinafter sometimes referred to as “HCMV”), and an antigen-binding fragment thereof.
  • HCMV human cytomegalovirus
  • it relates to human monoclonal antibodies that bind to the AD1 region of the HCMV gB glycoprotein and antigen-binding fragments thereof.
  • HCMV Human cytomegalovirus
  • HHV-6 human herpesvirus 6
  • HHV-7 human herpesvirus 7
  • HHV-6 human herpesvirus 6
  • HHV-7 human herpesvirus 7
  • HCMV is highly species-specific and does not infect animals other than humans, but is widely infected in humans and has affinity for a wide range of tissues in the human body. Moreover, once infected, it is retained throughout its life without being eliminated even after immunity of the host is established.
  • HCMV is a latent infection throughout life, and more than 90% of Japanese adults are already infected and carry the virus.
  • immunocompromised states such as AIDS, cancer, organ transplantation, bone marrow transplantation, and hemodialysis
  • reactivation of this latently infected HCMV occurs, causing interstitial pneumonia, retinitis, gastroenteritis, It can cause severe HCMV infections, such as encephalitis, which can be fatal (Non-Patent Documents 3 and 4).
  • congenital cytomegalovirus disease congenital cytomegalovirus disease
  • Also called cytomegalic inclusion disease congenital cytomegalovirus disease
  • miscarriage stillbirth, and death just after birth.
  • Non-Patent Documents 3, 4, and 5 disclose HCMV infection via the birth canal, breast milk, urine, saliva, etc.
  • HCMV infection via the birth canal, breast milk, urine, saliva, etc. causes liver function abnormalities, interstitial pneumonia, In some cases, nucleosis or the like develops (Non-Patent Documents 3, 4, and 5).
  • HCMV infection is a worldwide problem, and the development of preventive or therapeutic drugs capable of suppressing or alleviating the onset of various pathologies caused by the HCMV is being promoted.
  • ganciclovir Non-patent documents 6 and 7
  • foscarnet non-patent document 8
  • valganciclovir non-patent document 9
  • Ganciclovir becomes an active form of ganciclovir-triphosphate in the cell and inhibits DNA polymerase by competitively antagonizing with DNA polymerase substrate deoxyguanosine-triphosphate (dGTP), thereby inhibiting viral DNA.
  • dGTP DNA polymerase substrate deoxyguanosine-triphosphate
  • Antiviral drugs that interfere with synthesis, mainly treating cytomegalovirus retinitis in immunocompromised states such as AIDS, and suppressing the onset of cytomegalovirus retinitis in advanced HIV infection with CD4 lymphocyte counts of 100 / mm 3 or less It is also used as a pharmaceutical product.
  • antiviral agents such as ganciclovir have various side effects such as hematopoietic disorder, and the usage mode is limited as described above.
  • ganciclovir blood disorders associated with bone marrow suppression that require attention.
  • Leukocytes, red blood cells, and platelets are abnormally decreased, and initial symptoms include fever, sore throat, abnormal dullness, and bleeding tendency such as subcutaneous bleeding.
  • abnormalities are found in the neuropsychiatric system, causing headache, dizziness, insomnia, abnormal thinking, anxiety, and the like.
  • teratogenicity, mutagenicity, and carcinogenicity have been reported and cannot be used during pregnancy.
  • the use of ganciclovir in severe cases of congenital HCMV infection is said to have the effect of reducing the development of neurological sequelae and improving the progression of hearing loss (Non-patent Document 10).
  • Valganciclovir is an L-valine ester of gancyclyl and is orally administered and then converted to ganciclovir by intestinal and liver esterases. Therefore, the mechanism of action and side effects are the same as those of ganciclovir, and there are problems of myelosuppression, teratogenicity, and carcinogenicity. Is obtained.
  • foscarnet inhibits the growth of HCMV by inhibiting the DNA polymerase by acting directly on the pyrophosphate binding site of the DNA polymerase with an analog of pyrophosphate. It is also effective against gancvvir resistant HCMV.
  • Major side effects include nausea, anemia, elevated serum creatinine, vomiting, hypomagnesemia, hypokalemia, and sensory abnormalities. Especially, shock and nephropathy occur frequently, so careful medication is necessary. . In Japan, it is approved for use only in patients with AIDS who have been diagnosed with HCMV retinitis or clinically strongly suspected of having HCMV retinitis. Reference 8).
  • Non-patent Document 11 Non-patent Document 11
  • HCMV vaccine development has been conducted eagerly, there is still no product that can withstand clinical use.
  • human-derived anti-CMV high-titer gamma globulin preparations have been developed, and in the United States, they have been approved for the indication of prevention of HCMV infection associated with kidney transplantation.
  • the anti-CMV high titer gamma globulin preparation is a human blood preparation, it has various problems.
  • anti-HCMV antibody a monoclonal antibody that can bind to HCMV and neutralize its infectivity (can lose its biological activity)
  • anti-HCMV antibody a monoclonal antibody that can bind to HCMV and neutralize its infectivity (can lose its biological activity)
  • a human-derived anti-HCMV antibody that has a strong affinity for HCMV, a high neutralizing ability, and does not exhibit an allergic reaction in order to prevent or alleviate symptoms by losing the activity of HCMV Is considered to be particularly effective as a so-called “antibody drug”.
  • HCMV inhibitory antibodies for example, Patent Documents 1, 2, 3, 4, and 5
  • Patent Documents 1, 2, 3, 4, and 5 reported to date have not been sufficient in terms of affinity and neutralizing ability for HCMV. It has not been possible to expect to sufficiently block the biological activity of HCMV, prevent the onset of various diseases caused by HCMV, or alleviate the symptoms. Therefore, an anti-HCMV antibody that is a human monoclonal antibody that does not cause a foreign body recognition response, has excellent affinity, specificity, and neutralizing ability for HCMV, and can be expected to be used as a preventive or therapeutic agent, and Development of the antigen-binding fragment has been strongly desired.
  • Non-patent Documents 12 and 13 Recently, in order to suppress the growth of HCMV in vivo, it has been pointed out that not only neutralization activity but also prevention of intercellular infection has been pointed out (Non-patent Documents 12 and 13). An anti-HCMV antibody having an infection inhibitory activity has been eagerly desired.
  • antibodies or antigen-binding fragments that specifically bind to HCMV and sufficiently inhibit its biological activity are useful in therapeutic strategies or preventive strategies for various diseases caused by HCMV. It is thought that.
  • HCMV is inherently infectious in a wide range of tissues and cell types in the body (Sinzger, C.
  • the anti-HCMV antibody is eagerly desired to have not only a neutralizing ability but also an ability to inhibit intercellular infection. Furthermore, considering the effectiveness and safety as a pharmaceutical, human-derived monoclonal antibody having high neutralizing ability and ability to prevent intercellular infection and its antigen-binding ability against HCMV that causes various disease states It would be desirable to provide pharmaceutical compositions containing the fragments.
  • the present inventors specifically recognize an unreported discontinuous epitope present in the AD1 region on the HCMV gB glycoprotein, The present invention was completed by successfully obtaining a human monoclonal antibody having both high neutralizing ability and high ability to inhibit intercellular infection.
  • the present invention relates to an anti-HCMV monoclonal antibody or a binding fragment thereof, a DNA (polynucleotide) encoding the antibody or binding fragment, a vector containing the DNA, and a host cell containing the vector described below. And so on.
  • An antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to the AD1 region of human cytomegalovirus (HCMV) gB glycoprotein, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, which is present in the AD1 region;
  • An antibody or antigen-binding fragment thereof that recognizes a discontinuous sequence consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27 as an epitope.
  • variable region of the heavy chain is (a) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 and deletion, substitution, insertion, addition of one or several amino acid residues in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, or a combination of any two or more thereof
  • An amino acid sequence of a heavy chain CDR1 selected from the group consisting of amino acid sequences (b) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 and deletion, substitution, insertion, addition of one or several amino acid residues in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, or a combination of any two or more thereof
  • An amino acid sequence of a heavy chain CDR2 selected from the group consisting of the amino acid sequences; and (c) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, an amino acid having a deletion, substitution, insertion, addition of one or several amino acid residues in the amino acid sequence of
  • [5] The antibody or antigen-binding fragment thereof according to [3] or [4] above, (I) (a) the amino acid sequence of heavy chain CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, (b) the amino acid sequence of heavy chain CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, and (c) the amino acid sequence of heavy chain CDR3 selected from the group consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22, and (ii) (a) the amino acid sequence of light chain CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, (b) the amino acid sequence of light chain CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, and (c) the amino acid sequence of light chain CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, Or an antigen-binding fragment thereof.
  • the 50% plaque formation inhibitory concentration under human fibroblasts is 0.05 ⁇ g / mL (about 0.3 nM) or less against the laboratory strain (AD169) of HCMV Or an antigen-binding fragment thereof.
  • HCMV human cytomegalovirus
  • a pharmaceutical composition for [16] Diseases involving HCMV are: (a) interstitial pneumonia, retinitis, gastroenteritis, or encephalitis due to reactivation of HCMV in an immunocompromised state, (b) HCMV infection spread from pregnant woman to fetus (C) miscarriage, stillbirth, short-term death caused by the congenital CMV infection, (d) low birth weight in cases where the congenital CMV infection does not result in death, hepatosplenomegaly, Jaundice, thrombocytopenic purpura, microcephaly, mental developmental disorder, delayed intellectual development, chorioretinitis, or hearing impairment, or (e) liver dysfunction caused by HCMV infection in neonates or infants, interstitial pneumonia Or the pharmaceutical composition according
  • a nucleic acid encoding an anti-HCMV monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof capable of specifically binding to the AD1 region of HCMV gB glycoprotein and neutralizing its biological activity comprising SEQ ID NOs: 2, 4, 6,
  • the anti-HCMV antibody according to the present invention in particular, an antibody that specifically binds to the AD1 region of HCMV-gB glycoprotein, or an antigen-binding fragment thereof, is specific for HCMV that causes various diseases, for example, in an immunodeficient state. It binds and loses (neutralizes) its biological activity and exhibits an excellent neutralizing ability for HCMV.
  • the anti-HCMV-gB glycoprotein AD1 antibody according to the present invention is a human monoclonal antibody, there is an advantage that it has no immunogenicity and no immune reaction.
  • One embodiment of the anti-HCMV antibody according to the present invention also has high cell-cell infection inhibitory activity or cell-cell infection inhibitory activity against HCMV. Considering the mode of infection spread of HCMV in vivo, it is advantageous that the anti-HCMV antibody has not only a neutralizing ability but also an intercellular infection inhibiting ability.
  • the anti-HCMV antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention has a high neutralizing ability and infection spreading inhibitory activity against HCMV, and is not immunogenic for human monoclonal antibody embodiments.
  • composition containing a human monoclonal antibody according to the present invention is effective in an extremely small amount.
  • an antibody that specifically binds to the AD1 region of gB glycoprotein and has high neutralizing activity is very useful as a preventive or therapeutic agent for HCMV infection.
  • Non-patent Documents 12 and 13 In order to suppress the growth of viruses such as HCMV in vivo, importance of not only neutralizing activity but also prevention of intercellular infection has been pointed out (Non-patent Documents 12 and 13). GB glycoproteins have been shown to play an important role in the entry and intercellular infection of viral particles (Isaacson, MK et al., Human cytomegalovirus glycoprotein B is required). for virus entry and cell-to-cell spread but not for virion attachment, assembly, or egress. J. Virology, 2009; 83: p3891-3903), antibodies against gB are likely to contribute to inhibition of intercellular infection .
  • the AD1 region is an essential part for the formation of gB function and conformation (Qadri, I. et al., Assembly of conformational-dependent neutralizing domains on glycoprotein).
  • it is known as a part with few mutations even in clinically isolated virus strains, and an antibody against AD1 may have a broad spectrum.
  • the AD1 antibody that recognizes a discontinuous epitope extending over a long region on gB has high specificity and is less likely to cause unexpected side effects due to cross-reaction with other biomolecules. it is conceivable that.
  • amino acids constituting EV2038 CDR-H3 amino acid residues whose binding ability to AD1 has been reduced by non-conservative amino acid substitutions, except for the 125th proline (121, 123, 124, and 126th residues in total 4 residues) 4 types of variants in which two or four sites were simultaneously substituted were prepared (two-substitution: I124V / G126A, I124V / G126S, four-place substitution: L121I / W123Y / I124V / G126A, L121I / W123Y / I124V / G126S) and binding ability to AD1 were evaluated.
  • amino acids constituting EV2038 CDR-H3 amino acid residues whose binding ability to AD1 is reduced by non-conservative amino acid substitution, except for 125th proline (121, 123, 124, and 126th total 4)
  • 125th proline 121, 123, 124, and 126th total 4
  • deletion and insertion variants were prepared (E122del and G126_D127insE), and the binding ability to AD1 was evaluated. This is an evaluation of the binding ability to AD1 in the variant of the 79th amino acid residue of the EV2038 CDR-H2 region.
  • FIG. (A) illustrates clones of deletion mutants of the gB glycoprotein AD1 region used for the analysis of the epitope region, and (B) shows the results of Western blot analysis using these deletion variants.
  • FIG. (A) is the figure which showed the result of the epitope mapping of EV2038 using a peptide array.
  • the above analysis results are illustrated on the amino acid sequence of the gB glycoprotein, the analysis results using a deletion mutant of EV2038, and the epitope sequence of ITC52 reported in the past are shown. It is a graph which shows the result of having evaluated the neutralization activity of the anti- HCMV antibody concerning this invention.
  • an antibody capable of specifically binding to gB glycoprotein of human cytomegalovirus (HCMV) and neutralizing its biological activity Antigen binding fragments are provided.
  • an antibody or antigen-binding fragment thereof is provided that can specifically bind to a discontinuous epitope present in the AD1 region of the HCMV gB glycoprotein and neutralize the biological activity of the protein. .
  • “Human cytomegalovirus (HCMV) gB glycoprotein” is one of the major glycoproteins constituting the envelope of HCMV, and is a virus particle. It is known to contribute to cell entry, cell fusion, and viral cell-to-cell infection.
  • the amino acid sequence of the HCMV gB glycoprotein is obtained from the publicly available sequence database (Swiss-Prot), and the amino acid sequence of the protein of accession number: P06473 (SEQ ID NO: 137). ) Is available.
  • AD1 region of gB glycoprotein of human cytomegalovirus (HCMV)” or “HCMV gB glycoprotein AD1 region” is a region consisting of consecutive amino acid residues at positions 552 to 635 in the amino acid sequence of HCMV gB glycoprotein. (Wagner et al., Journal of Virology, Vol. 66, No. 9, Sept. 1992, p.5290-5297).
  • epipe is used in the meaning commonly used in the art, and means a small partial structure of an antigen molecule as a partner to which an antibody binds (Iwanami Biological Encyclopedia 4th Edition (1996). First year of printing))).
  • the discontinuous epitope present in the AD1 region is an amino acid sequence consisting of consecutive amino acid residues at positions 549 to 580 of the human cytomegalovirus (HCMV) gB glycoprotein ( SEQ ID NO: 23) and an amino acid sequence consisting of consecutive amino acid residues at positions 596 to 640 (SEQ ID NO: 24). More specifically, the discontinuous epitope consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27.
  • HCMV human cytomegalovirus
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention in one embodiment thereof, (a) a heavy chain (H chain) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 6, and (b) containing a light chain (L chain) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or 8, wherein this antibody or antigen-binding fragment specifically binds to gB glycoprotein of human cytomegalovirus and its biological activity Can be neutralized.
  • an antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof can also be (a) a heavy chain variable region (HCVR) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, and (b) contains a light chain variable region (LCVR) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, and can specifically bind to human cytomegalovirus gB glycoprotein and neutralize its biological activity.
  • HCVR heavy chain variable region
  • LCVR light chain variable region
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention further comprises (I) the amino acid sequences of CDR (Complementarity Determining Region) 1, CDR2, and CDR3 of the variable region of the heavy chain, (a) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, (b) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, and (c) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, Containing (Ii) the amino acid sequences of CDR1, CDR2, and CDR3 of the variable region of the light chain, (a) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, (b) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, and (c) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, Can specifically bind to the gB glycoprotein of human cytomegalovirus and neutralize its biological activity.
  • CDR Complementarity Determining Region
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention also has a function of the above-mentioned antibody or antigen-binding fragment that can specifically bind to the gB glycoprotein of human cytomegalovirus and neutralize its biological activity.
  • Equivalents are also included, for example, (a) in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 6, an amino acid sequence having a deletion, substitution, insertion, addition of any one to several amino acid residues, or a combination of any two or more thereof, or a sequence A heavy chain (H chain) represented by an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence of No. 2 or 6, and (b) 1 to several amino acid residues in the amino acid sequence of SEQ ID No.
  • amino acid sequence having a deletion, substitution, insertion, addition, or mutation of any combination of any two or more thereof, or an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or 8 Contains light chain (L chain).
  • functional equivalents of the above antibodies or antigen-binding fragments can also be (a) an amino acid sequence having a deletion, substitution, insertion, addition, or mutation of any combination of any two or more thereof in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, or of SEQ ID NO: 10
  • a heavy chain variable region (HCVR) comprising an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence
  • deletion, substitution, insertion of one to several amino acid residues in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 A light chain variable region (LCVR) comprising an amino acid sequence having an addition or a mutation of any combination of two or more thereof, or an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 is contained.
  • a functional equivalent of the antibody or antigen-binding fragment described above is further (I) (a) selected from the group consisting of amino acid sequences having deletions, substitutions, insertions, additions, or combinations of any two or more thereof in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 Heavy chain CDR1, (b) selected from the group consisting of an amino acid sequence having a deletion, substitution, insertion, addition, or mutation of any combination of any two or more thereof in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 (C) an amino acid sequence having a deletion, substitution, insertion, addition, or combination of any two or more of these in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 And a heavy chain CDR3 selected from the group consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22, and (ii) (a) selected from the group consisting of amino acid sequences having deletions, substitutions, insertions, additions, or combinations of any two or more of these in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16.
  • Light chain CDR1 (b) selected from the group consisting of amino acid sequences having deletions, substitutions, insertions, additions, or combinations of any two or more of these in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 (C) an amino acid sequence having a deletion, substitution, insertion, addition, or mutation of any combination of any two or more thereof in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18
  • a light chain CDR3 selected from the group consisting of:
  • the upper limit of the number of mutations in the amino acid sequence of the functional equivalent can be determined based on whether or not it can specifically bind to HCMV gB glycoprotein and neutralize its biological activity.
  • the neutralizing activity of HCMV can be evaluated, for example, by the method described in Examples 9 and 10 described later.
  • the evaluation of the ability to inhibit cell-to-cell infection can be performed, for example, by the method shown in Example 11.
  • antibody as used herein is four polypeptide chains, two heavy (H) chains and two light (L) chains, interconnected by disulfide bonds. It shall refer to an immunoglobulin molecule consisting of things.
  • the monoclonal antibody in the present invention is also composed of immunoglobulin molecules each containing two light chains (L chains) and heavy chains (H chains).
  • Each heavy chain consists of three domains, the heavy chain variable region (sometimes referred to as “HCVR” or “V H ”) and the heavy chain constant region (the heavy chain constant region is “C H 1”). , “C H 2” and “C H 3” (generic name: C H )).
  • Each L chain consists of an L chain variable region (sometimes referred to as “LCVR” or “V L ”) and an L chain constant region (the L chain constant region is referred to as “C L ”). May be).
  • HCVR and LCVR are particularly important in that they are involved in antibody binding specificity. Since antibodies interact with target antigens primarily through LCVR and HCVR amino acid residues, the amino acid sequences within the variable region are more different between individual antibodies than sequences outside the variable region. Furthermore, HCVR and LCVR can be further subdivided into a region called a framework region (FR) and a hypervariable region called a complementarity determining region (CDR) that are kept more constant between various antibodies. HCVR and LCVR are each composed of 3 CDRs and 4 FRs, which are arranged in the order FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 from the amino terminus to the carboxy terminus.
  • FR framework region
  • CDR complementarity determining region
  • antibody fragment refers to a fragment of one or more antibodies capable of specifically binding to an antigen (eg, HCMV).
  • the fragment includes a peptide having a minimum amino acid sequence that specifically binds to an antigen.
  • antigen-binding fragment also included in the “antigen-binding fragment” are single-chain antibodies (scFV), bispecific antigens, multispecific antigens and the like having variable regions and complementarity determining regions of antibodies that specifically bind to antigens.
  • scFV single-chain antibodies
  • bispecific antigens bispecific antigens
  • multispecific antigens multispecific antigens and the like having variable regions and complementarity determining regions of antibodies that specifically bind to antigens.
  • antibody or antigen-binding fragment is also simply referred to as “antibody”.
  • Antibodies capable of neutralizing the biological activity of HCMV shall refer to antibodies that inhibit the biological activity of HCMV by binding to HCMV or HCMV-infected cells.
  • the “biological activity of HCMV” typically includes, but is not limited to, the activity of HCMV causing the diseases exemplified in (a) to (e) below.
  • HCMV activity that induces various diseases caused by causes includes: (A) Various diseases such as interstitial pneumonia, retinitis, gastroenteritis, encephalitis due to reactivation of HCMV in immunodeficient states such as AIDS, cancer, organ transplantation, bone marrow transplantation, and hemodialysis; (B) congenital CMV infection caused by HCMV infection spreading from pregnant woman to fetus; (C) A miscarriage, stillbirth, or late birth death caused by the congenital CMV infection; (D) low birth weight, hepatosplenomegaly, jaundice, thrombocytopenic purpura, microcephaly, mental developmental disorder, delayed intellectual development, chorioretinitis and hearing impairment when not dying due to the congenital CMV infection; (E) Abnormal hepatic function, interstitial pneumonia, mononucleosis, etc. caused by HCMV infection in newborns and infants (Non-Patent Documents 3, 4, and 5).
  • HCMV disease caused by HCMV
  • a disease in which the biological activity of HCMV causes a disease is a disease in which the symptoms and / or progression of the disease is expected to be alleviated by inhibiting the biological activity of HCMV.
  • diseases can be alleviated or cured using, for example, the anti-HCMV antibodies described above. Specifically, by increasing the concentration of anti-HCMV antibody in the biological fluid of the subject suffering from the disease (eg, increasing the concentration of anti-HCMV antibody in the serum or plasma of the subject, synovial fluid) The above diseases can be proved.
  • the terms “inhibitory effect”, “inhibition”, “suppression”, “can inhibit” and the like refer to biological activity attributable to an antigen (HCMV) of about 5-100%, preferably 10 -100%, more preferably 20-100%, more preferably 30-100%, more preferably 40-100%, more preferably 50-100%, more preferably 60-100%, more preferably 70-100. %, More preferably 80 to 100%.
  • HCMV antigen
  • variable region sequence derived from a specific naturally occurring antibody or the sequence of the CDR portion is a different antibody having different properties.
  • an expression vector that contains an invariant region or framework sequence derived from it the recombinant antibody that mimics the properties of a particular naturally occurring antibody can be expressed. Therefore, it is not necessary to obtain the entire sequence of a particular antibody when recreating an intact recombinant antibody having binding properties similar to those of the original antibody.
  • the variable region region or CDR portion sequences of the antibody heavy and light chains may be sufficient for this purpose.
  • SEQ ID NOs: 13, 14, and 15 are amino acid sequences corresponding to heavy chain CDR1, CDR2, and CDR3, respectively.
  • SEQ ID NOs: 16, 17, and 18 are amino acid sequences corresponding to light chain CDR1, CDR2, and CDR3, respectively. Accordingly, preferred antibodies of the invention correspond to SEQ ID NOs: 13, 14, 15, 16, 17, and 18 corresponding to the heavy chain CDR1, CDR2, and CDR3 and the light chain CDR1, CDR2, and CDR3, respectively. Is the case.
  • SEQ ID NOs: 13, 14, 15, 16, 17, and 18 are the heavy chain CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, and It is not necessary to correspond to the light chain CDR1, CDR2 and CDR3.
  • the heavy chain CDR-3 may be an amino acid sequence selected from the amino acid sequence group represented by SEQ ID NO: 22.
  • one to several CDR sequences (specifically, one in the amino acid sequence selected from each group of SEQ ID NOs: 13, 14, 15, 16, 17, and 18) -9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, or 1) deletion of amino acid residues, It may be an amino acid sequence having a substitution, insertion, addition, or any combination of two or more of these mutations.
  • the amino acid sequence other than the CDR is not particularly limited, and so-called CDR-grafted antibodies in which the amino acid sequence other than the CDR is derived from other antibodies, particularly other types of antibodies, are also included in the antibody of the present invention.
  • antibodies whose amino acid sequences other than CDRs are also human-derived are preferable, but deletion of one to several amino acid residues (specific numbers are the same as above) in the framework region (FR) as necessary. , Substitutions, insertions, additions, or combinations of any two or more of these may be present.
  • Known methods can be used for the production of these antibodies (Riechmann L, et al., Reshaping human antibodies for therapy. Nature, 332: 323-327, 1988). In the present invention, of course, fully human antibodies are preferred.
  • amino acid sequence of the protein of the present invention one or more amino acid residues are deleted, substituted, inserted, added, or any combination of two or more thereof is any one or more amino acids in the same sequence It means that there is a deletion, substitution, insertion or addition of one or more amino acid residues at a position in the sequence, and two or more of deletion, substitution, insertion and addition may occur simultaneously.
  • amino acids constituting natural proteins can be grouped according to the characteristics of their side chains.
  • amino acids having similar characteristics include aromatic amino acids (tyrosine, phenylalanine, tryptophan), bases Amino acids (lysine, arginine, histidine), acidic amino acids (aspartic acid, glutamic acid), neutral amino acids (serine, threonine, asparagine, glutamine), amino acids having a hydrocarbon chain (alanine, valine, leucine, isoleucine, proline), And other groups (glycine, methionine, cysteine).
  • amino acid residues that can be substituted with each other including non-natural amino acids include the following groups, and amino acid residues contained in the same group can be substituted with each other.
  • Group A leucine, isoleucine, norleucine, valine, norvaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, o-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine, cyclohexylalanine;
  • Group B aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid , Isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid, 2-aminosuberic acid;
  • group C asparagine, glutamine;
  • group D lysine, arginine, ornithine, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid;
  • group E Proline, 3-hydroxyproline, 4-hydroxyproline;
  • Group F serine, threonine, homoserine;
  • Group G phenylalanine, tyrosine, tryptophan.
  • more preferred antibodies are: (a) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10; 1 to several (specifically, 1 to 9, 1 to 8, 1 to 7) of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10; 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, or 1) amino acid residue deletion, substitution, insertion, addition, or any two of these An amino acid sequence having two or more combinations of mutations; or 95% or more (preferably 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, or 99.5% or more) of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 (B) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12; 1 to several amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 (specific numbers are the same as above) Residue deletion, substitution, insertion, addition, or these A light chain variable region represented by an amino acid sequence having at least two combinations of mutations; or an amino acid sequence having 95% or more identity (specific% is the same as described above) with the amino acid sequence of SEQ ID NO
  • more preferred antibodies include (a) a heavy chain variable region (HCVR) represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 and (b) a light chain variable region (LCVR) represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12. contains.
  • HCVR heavy chain variable region
  • LCVR light chain variable region
  • further preferred antibodies are: (a) amino acid sequence of SEQ ID NO: 6; deletion or substitution of 1 to several amino acid residues (specific numbers are the same as above) in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 , Insertion, addition, or an amino acid sequence having a mutation of any combination of two or more thereof; or an amino acid sequence having 95% or more identity (specific% is the same as above) with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 And (b) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8; deletion of one to several amino acid residues (specific numbers are the same as above) in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 , Substitution, insertion, addition, or an amino acid sequence having a mutation of any combination of two or more thereof; or 95% or more (specific% is the same as above) with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 amino Containing a light chain (L chain) of SEQ.
  • the most preferred antibody in the present invention is a fully human monoclonal antibody containing a heavy chain (H chain) represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 and a light chain (L chain) represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. .
  • a preferred antibody class (subclass) in the present invention is IgG1 ( ⁇ ).
  • the above-described anti-HCMV antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention specifically binds to HCMV causing various diseases, neutralizes its biological activity, and is more neutralized than conventional anti-HCMV antibodies. It has the function.
  • “specifically binds” means to recognize and bind to a predetermined antigen.
  • the dissociation constant (Kd value) of the antibody of the present invention from HCMV is preferably 1 ⁇ 10 ⁇ 7 M or less, more preferably 1 ⁇ 10 ⁇ 8 M or less, and further preferably Is 1 ⁇ 10 ⁇ 9 M or less, and most preferably 1 ⁇ 10 ⁇ 10 M or less.
  • a known method can be used to measure the dissociation constant between the antibody and HCMV.
  • it can be measured by a protein interaction analyzer such as BIACORET 100 (registered trademark) using an anti-HCMV antibody immobilized on a chip.
  • the neutralizing ability of the anti-HCMV antibody can be evaluated by examining the infection inhibition rate and the plaque formation inhibition rate by immunostaining. That is, when inoculating a cell culture system capable of infecting AD169 strain and Towne strain, which are representative strains of HCMV, with an anti-HCMV antibody at various concentrations for a certain period of time in advance, and then inoculating them into cells.
  • the neutralization activity of anti-HCMV antibody is measured by measuring the number of HCMV-infected cells by immunostaining 24 hours after infection to determine the infection inhibition rate, or by obtaining the inhibition rate from the number of plaques formed 5 to 6 days after infection. can do.
  • the anti-HCMV antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention preferably has a neutralizing activity against AD169 strain of 1 ⁇ g / mL (about 7 nM) or less, more preferably 0.1 ⁇ g / mL (about 0.7 nM). Below, even more preferably 0.05 ⁇ g / mL (about 0.3 nM) or less, and most preferably about 0.03 ⁇ g / mL (about 0.2 nM) or less, about 50% of plaque formation inhibiting ability.
  • the ability to inhibit intercellular infection is to evaluate the inhibitory effect of intercellular infection by culturing cells previously infected with HCMV for a certain period of time and then adding various concentrations of anti-HCMV antibodies to the cell culture system. I can do it.
  • the anti-HCMV antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention preferably has a final concentration of 2 ⁇ g / mL (about 13 nM) or less, more preferably 0.5 ⁇ g / mL (about 3 nM) or less, and even more preferably 0. It has an ability to inhibit intercellular infection of 50% or more at 2 ⁇ g / mL (about 0.13 nM) or less.
  • the antibody of the present invention is a full-length antibody or an antigen-binding fragment thereof, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, 8, 10 or 12 indicating a variable region, or the SEQ ID NO indicating a complementarity determining region (CDR).
  • CDR complementarity determining region
  • the heavy and light chain signal sequences are cleaved during protein maturation and do not contribute to the properties of the final antibody, but to add missing sequences
  • the cloned cDNA sequences are It can be combined with synthetic oligonucleotides by ligation or PCR amplification methods.
  • the entire variable region can be synthesized as a set of short, overlapping oligonucleotides and combined in a PCR amplification method to create a fully artificial variable region clone.
  • nucleic acid encoding an antibody or the like According to another embodiment of the present invention, an anti-HCMV monoclonal antibody or an antigen-binding fragment thereof that specifically binds to HCMV and can neutralize its biological activity is encoded.
  • a nucleic acid encoding an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 13-18 and 22, and hybridizing with the nucleic acid under highly stringent conditions An isolated nucleic acid selected from soy nucleic acids is provided.
  • the nucleic acid is DNA or RNA, more preferably DNA.
  • a nucleic acid encoding an anti-HCMV monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof capable of binding to HCMV and neutralizing its biological activity comprising 2, 4, 6, 8, 10, 12, 13-18 and 22
  • Isolated nucleic acids having a high identity with a nucleic acid encoding an amino acid sequence selected from the group are also included in the present invention.
  • “having high identity” means sequence identity to the extent that it can hybridize to a given nucleic acid sequence under highly stringent conditions, for example, 60%, 70%, It means having 80%, 90%, or 95% or more identity.
  • “High stringent conditions” are, for example, 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 50 ° C.
  • nucleic acid examples include a nucleic acid encoding any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 13-18, and 22, for example, 70% or more , 80% or more, 90% or more, 95% or more, 97% or more, or 99% or more nucleic acid having the identity.
  • the identity of the base sequence can be determined using the above-described identity search algorithm (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268, 1990; Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993) .
  • the nucleic acid preferred in the present invention is DNA encoding both the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 10 and 12, and more preferably DNA encoding both the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 6 and 8. Even more preferred nucleic acids are DNAs that encode both the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2 and 4. Even more preferred nucleic acids are nucleic acids comprising both nucleic acids of SEQ ID NOs: 5 and 7, and even more preferred nucleic acids are nucleic acids comprising both nucleic acids of SEQ ID NOs: 1 and 3.
  • the present invention also relates to a vector incorporating the nucleic acid, a host cell into which the vector has been introduced, and an antibody production method using these.
  • the antibody of the present invention can also be prepared as a recombinant human antibody using a known method (see Nature, 312: 643, 1984, Nature, 321: 522, 1986, etc.).
  • the antibody of the present invention can be produced by culturing host cells into which the vector of the present invention has been introduced, and purifying the produced antibody from the culture supernatant or the like.
  • an expression vector for animal cells containing a gene encoding a human antibody C H and / or a human antibody C L prepared from cDNA encoding V H and V L from the same cell or another human cell. It can be produced by constructing a human antibody expression vector by inserting each vector, introducing it into an animal cell and expressing it.
  • the vector into which the nucleic acid encoding the V H or V L of the antibody of the present invention is not necessarily limited, but a vector or a high expression vector that is generally used for expression of protein genes and the like and is particularly suitable for expression of antibody genes is preferred. . Suitable examples include vectors containing the EF promoter and / or CMV enhancer. In addition, expression vectors that normally incorporate nucleic acids encoding VH or VL are prepared and cotransfected into host cells, but they may be incorporated into a single expression vector.
  • the host cell into which the expression vector is introduced is not necessarily limited, but a cell that is widely used for the expression of protein genes and the like and is particularly suitable for the expression of antibody genes is preferred. Examples include bacteria (such as E. coli), actinomycetes, yeast, insect cells (such as SF9), and mammalian cells (such as COS-1, CHO, and myeloma cells).
  • a recombinant animal cell line that stably produces the antibody for example, a CHO cell line is generally used.
  • Known methods can be used to generate, clone, and amplify and screen such recombinant cell lines (eg, Omasa T .: J. Biosci. Bioeng.,. 94, 600-605). , See 2002 etc.).
  • the present invention includes an antigen-binding fragment of the antibody of the present invention in addition to an antibody composed of two heavy chains and two light chains.
  • the antigen-binding fragment include Fab (fragment of antigen binding), Fab ′, and F (ab ′) 2.
  • Fab fragment of antigen binding
  • Fab ′ fragment of antigen binding
  • F (ab ′) 2 a single chain antibody
  • peptides containing active fragments of antibodies include CDR-containing peptides.
  • These can be produced by a known method such as a method of treating the antibody of the present invention with an appropriate proteolytic enzyme or a gene recombination technique. Purification of the antibody can be performed using a known purification means such as salting out, gel filtration, ion exchange chromatography or affinity chromatography.
  • the diversified scFv (which has been developed by artificially shuffling the V H and V L genes by the phage display antibody technology, which uses genetic engineering technology to express recombinant antibodies (recombinant antibodies) on the phage surface.
  • a specific antibody can also be obtained by expressing a single chain fragment of variable region antibody as a phage fusion protein.
  • This technique is highly evaluated as a humanized antibody production technique that can avoid immunity and is replaced with a cell fusion method.
  • any specific antibody or antigen-binding fragment thereof prepared by referring to the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 13-18 and 22 in the present specification can be used. It belongs to the technical scope of the invention.
  • an antibody Obtained by applying a potellent technology that has been developed in recent years to significantly improve the ADCC activity of an antibody by modifying the sugar chain portion of the antibody. al, Clin. Cancer Res., 10, 6248-6255 (2004)) or an antibody obtained by applying the Complement technology for improving CDC activity to the antibody of the present invention (Kanda S., et al. al, Glycobiology, 17, 104-118 (2007)) also belongs to the technical scope of the present invention.
  • polyclonal antibodies and monoclonal antibodies are usually obtained using laboratory animals such as mice, rabbits, goats, etc., but the antibodies thus obtained were used. Since it has a sequence characteristic to animal species, if it is administered to humans as it is, it is recognized as a foreign substance by the human immune system, and a human anti-animal antibody response may occur (that is, an antibody of an antibody is produced).
  • the anti-HCMV monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention can be obtained from blood-derived antibody-producing cells such as healthy persons, and is a fully human antibody. Even if this fully human antibody is administered to the human body as an antibody drug, it is considered that it has no immunogenicity and no immune reaction is observed.
  • the anti-HCMV monoclonal antibody of the present invention has a higher neutralizing ability than conventional anti-HCMV monoclonal antibodies, the same therapeutic effect can be expected with a smaller dose.
  • the anti-HCMV monoclonal antibody and antigen-binding fragment thereof according to the present invention were obtained from the culture supernatant of an antibody-producing cell clone by separating the cell clone producing the antibody from blood of a healthy person through various steps.
  • the antibody can be obtained by affinity purification.
  • Isolation of fully human antibody-producing cell clones against HCMV B lymphocytes are isolated from the blood of a healthy person, and the proliferation of the B lymphocytes is induced.
  • Methods for inducing proliferation are known per se, for example, a transform method (D. Kozbor) using “Epstein-Barr virus” (hereinafter referred to as EBV), which is an inducer of cancer. Et al.). That is, the B lymphocytes are infected with EBV to induce proliferation, and the proliferated cells are used as an antibody-producing cell library.
  • the method of recovering monoclonal antibody from cells induced to proliferate can be carried out by well-known methods commonly used in the production of monoclonal antibodies.
  • a lymphocyte clone that produces an antibody that binds to HCMV is selected from the antibody-producing cell library, and the antibody is removed from the culture supernatant. That is, a cell population (clone) that produces an antibody that binds to HCMV is selected from the antibody-producing cell library by a limiting dilution method.
  • ELISA using HCMV-derived antigen and labeled mouse anti-human IgG antibody is preferably employed. By culturing the selected antibody-positive cell population and repeating the screening, a cell population (clone) that produces only the target antibody can be obtained.
  • selected cells can be grown in roller bottles, 2 liter spinner flasks, or other culture systems.
  • the obtained culture supernatant is filtered, concentrated, and then subjected to affinity chromatography using protein A or protein G-Sepharose (GE Healthcare) to purify the protein.
  • the buffer can be exchanged for PBS and the concentration can be determined by OD 280 or preferably by nephelometer analysis.
  • the isotype can be determined by a method specific to the isotype antigen.
  • the anti-HCMV antibody thus obtained is a fully human antibody prepared from B lymphocytes sensitized in the human body, the possibility of an immune reaction to the antibody is low.
  • Another feature of the production of antibody-producing cell clones is the use of an EB virus that has the activity of inducing proliferation by infecting B lymphocytes.
  • the advantage of the EB virus method is that a natural antibody produced in the human body can be produced and an antibody with high affinity can be obtained.
  • human antibodies against HCMV have been found to be about 10-100 times more affinity than antibodies made by artificially immunizing mice.
  • a population of B lymphocytes proliferated by EB virus infection becomes a library of antibody-producing cells.
  • a specific antibody-producing cell clone can be isolated from this library to obtain a human antibody.
  • composition containing antibody provides a method for preventing or preventing a disease associated with human cytomegalovirus (HCMV) comprising the antibody or antigen-binding portion thereof and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • HCMV human cytomegalovirus
  • a disease caused by HCMV is a disease in which inhibition of HCMV activity is expected to alleviate the symptoms and / or progression of the disease.
  • the term “disease involving HCMV” means that a subject suffering from the disease having HCMV is responsible for the pathophysiology of the disease or aggravates the disease. Diseases and other illnesses that have been shown or suspected to be causative are to be included.
  • the anti-HCMV antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention has a high neutralizing ability against HCMV, various diseases caused by HCMV such as (a) AIDS, cancer, Various diseases such as interstitial pneumonia, retinitis, gastroenteritis, encephalitis due to reactivation of HCMV in an immunodeficient state such as after organ transplantation, bone marrow transplantation, and after hemodialysis, and (b) HCMV from pregnant woman to fetus Congenital CMV infection caused by the spread of infection, (c) miscarriage, stillbirth, short-term death caused by the congenital CMV infection, (d) low birth in the case of no death due to the congenital CMV infection Body weight, hepatosplenomegaly, jaundice, thrombocytopenic purpura, microcephaly, mental developmental disorder, delayed intellectual development, chorioretinitis and hearing impairment, (e) due to HCMV infection in neonates and infants
  • pharmaceutically acceptable carrier includes any and all physiologically compatible solvents, dispersion media, coatings, isotonic and absorption delaying agents and the like.
  • pharmaceutically acceptable carriers include one or more of water, saline, phosphate buffered saline, dextrose, glycerol, ethanol, and the like, as well as combinations thereof.
  • the composition preferably contains a pH adjuster or isotonic agent such as sugar, polyalcohol such as mannitol or sorbitol, or sodium chloride.
  • Pharmaceutically acceptable carriers can additionally contain minor amounts of auxiliary substances such as wetting or emulsifying agents, preservatives, buffering agents, stabilizing agents and the like that increase the preservability or effectiveness of the antibody or antibody portion.
  • compositions of the present invention can be made into various dosage forms.
  • Such compositions include, for example, liquids, semi-solids such as solutions (eg, injectable and infusible solutions) and dispersions, suspensions, tablets, capsules, troches, pills, powders, liposomes, suppositories, etc.
  • Solid dosage forms are included. The preferred form depends on the intended mode of administration and therapeutic application. Generally preferred compositions are in the form of injectable or infusible solutions, such as compositions similar to those used to passively immunize humans with other antibodies.
  • Preferred dosage forms are parenteral (eg, intravenous, subcutaneous, intraperitoneal, intramuscular).
  • the antibody is administered by intravenous infusion or intravenous injection.
  • the antibody is administered by intramuscular or subcutaneous injection.
  • the antibodies and antibody fragments of the present invention can be incorporated into pharmaceutical compositions suitable for parenteral administration.
  • the antibody or antibody portion is preferably prepared as an injectable preparation containing 0.1 to 250 mg / mL of antibody when a single type is used.
  • an injectable preparation containing 0.001 to 100 mg / mL of antibody.
  • the mixing ratio of the plurality of types of antibodies can be set as appropriate.
  • the injectable preparation can be constituted by dissolving the active ingredient in a liquid or freeze-drying the active ingredient in a flint or amber vial, ampoule or prefilled syringe.
  • the buffer can be L-histidine (1-50 mM) at pH 5.0-7.0 (optimally pH 6.0), and 5-10 mM L-histidine, optimally.
  • Other suitable buffering agents include, but are not limited to, sodium succinate, sodium citrate, sodium phosphate, or potassium phosphate.
  • Sodium chloride can be used to change the osmotic pressure of a 0-300 mM concentration solution (150 mM, optimal for liquid dosage forms).
  • the lyophilized dosage form can contain a cryoprotectant, primarily 0-10% (optimally 0.5-5.0%) sucrose.
  • suitable cryoprotectants include mannitol, trehalose and lactose.
  • the lyophilized dosage form can contain a bulking agent, primarily 1-10% mannitol (2-4% when optimal).
  • stabilizers primarily 1-50 mM (optimally 5-10 mM) L-methionine can be used.
  • stabilizers include glycine, arginine, polysorbate 80, and the like, and in the case of polysorbate 80 can include 0-0.05% (optimally 0.005-0.01%).
  • surfactants include, but are not limited to, polysorbate 20 and BRIJ surfactant.
  • the pharmaceutical composition generally must be sterile or stable under the conditions of manufacture and storage.
  • the composition can be formulated as a solution, microemulsion, dispersion, liposome, or other ordered structure suitable to high drug concentration.
  • Sterile injectable solutions are prepared by mixing the required amount of active compound (ie antibody or antibody portion) in a suitable solvent with one or a combination of the above components, if necessary, followed by filter sterilization. It can be prepared by doing.
  • dispersions are prepared by mixing the active compound with a sterile vehicle that contains a basic dispersion medium and the required other ingredients from those enumerated above.
  • a sterile powder formulation for the preparation of a sterile injectable solution the preferred method of preparation is freeze vacuum drying and spray drying of the sterile filtered solution as previously described, thereby adding to the active ingredient powder, A composition containing any other desired ingredients is obtained.
  • the proper fluidity of the solution can be achieved, for example, by using a coating such as lecithin, by maintaining the required particle size in the case of dispersions, and by using surfactants. Can be maintained.
  • Prolonged absorption of injectable compositions can be brought about by including in the composition an agent that delays absorption, for example, monostearate salts or gelatin.
  • an antibody or antibody portion of the invention is formulated together with one or more other therapeutic agents useful for treating a disease caused by HCMV, or such other therapeutic agents Administer at the same time.
  • an anti-HCMV antibody or antibody portion of the invention is formulated together with one or more other antibodies that bind to other targets (eg, antibodies that bind to other binding sites of HCMV), or Can be administered simultaneously with other antibodies.
  • one or more antibodies of the present invention can be used in combination of two or more of the aforementioned therapeutic agents. Such combination therapy can advantageously utilize lower doses of the administered therapeutic agent, thus avoiding the toxicities or complications that may be associated with various single therapies.
  • SEQ ID NO: 1 This represents a nucleotide sequence encoding the heavy chain of an antibody against the AD1 region of the HCMV gB glycoprotein (hereinafter “anti-AD1 antibody”) (EV2038), including a signal sequence.
  • SEQ ID NO: 2 The amino acid sequence of the heavy chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) including the signal sequence.
  • SEQ ID NO: 3 The nucleotide sequence encoding the light chain of the anti-AD1 antibody (EV2038), including the signal sequence.
  • SEQ ID NO: 4 It represents the amino acid sequence of the L chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) including the signal sequence.
  • SEQ ID NO: 5 This represents the nucleotide sequence encoding the heavy chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) without the signal sequence.
  • SEQ ID NO: 6 The amino acid sequence of the heavy chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) does not include a signal sequence.
  • SEQ ID NO: 7 This represents the nucleotide sequence encoding the light chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) without the signal sequence.
  • SEQ ID NO: 8 The amino acid sequence of the L chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) does not include a signal sequence.
  • SEQ ID NO: 9 This represents the nucleotide sequence encoding the heavy chain variable region of the anti-AD1 antibody (EV2038).
  • SEQ ID NO: 10 1 represents the amino acid sequence of the heavy chain variable region of the anti-AD1 antibody (EV2038).
  • SEQ ID NO: 11 The nucleotide sequence encoding the light chain variable region of the anti-AD1 antibody (EV2038).
  • SEQ ID NO: 12 1 represents the amino acid sequence of the light chain variable region of the anti-AD1 antibody (EV2038).
  • SEQ ID NO: 13 1 represents the amino acid sequence of the heavy chain CDR1 of the anti-AD1 antibody (EV2038).
  • SEQ ID NO: 14 1 represents the amino acid sequence of the heavy chain CDR2 of the anti-AD1 antibody (EV2038).
  • SEQ ID NO: 15 1 represents the amino acid sequence of the heavy chain CDR3 of the anti-AD1 antibody (EV2038).
  • SEQ ID NO: 16 1 represents the amino acid sequence of the light chain CDR1 of the anti-AD1 antibody (EV2038).
  • SEQ ID NO: 17 1 represents the amino acid sequence of the L chain CDR2 of the anti-AD1 antibody (EV2038).
  • SEQ ID NO: 18 1 represents the amino acid sequence of the light chain CDR3 of the anti-AD1 antibody (EV2038).
  • SEQ ID NO: 19 The nucleotide sequence of 38 Hind-S primer used when producing EV2038 CDR-H3 variant in an Example is represented.
  • SEQ ID NO: 20 The nucleotide sequence of 38 Not-A primer used when producing CDR-H3 variant of EV2038 in the Examples is shown.
  • SEQ ID NO: 21 In the Examples, the nucleotide sequence of the primer for confirming the base sequence used in preparing the CDR20H variant of EV2038 is shown.
  • SEQ ID NO: 22 2 represents a consensus amino acid sequence in the amino acid sequence of CDR-H3 of anti-AD1 antibody.
  • SEQ ID NO: 23 The amino acid sequence consisting of amino acid residues from position 549 to position 580 of the HCMV gB glycoprotein AD1 region identified as the region where the epitope is present by the deletion mutation method shown in the Examples.
  • SEQ ID NO: 24 The amino acid sequence consisting of amino acid residues from position 596 to position 640 of the HCMV gB glycoprotein AD1 region identified as the region where the epitope is present by the deletion mutation method shown in the Examples.
  • SEQ ID NO: 25 The amino acid sequence consisting of amino acid residues from position 549 to position 560 of the HCMV gB glycoprotein AD1 region identified as an epitope region by the peptide array method shown in the Examples.
  • SEQ ID NO: 26 The amino acid sequence consisting of amino acid residues from positions 569 to 576 of the HCMV gB glycoprotein AD1 region identified as the epitope region by the peptide array method shown in the Examples.
  • SEQ ID NO: 27 The amino acid sequence consisting of amino acid residues from 625 to 632 in the HCMV gB glycoprotein AD1 region identified as an epitope region by the peptide array method shown in the Examples.
  • SEQ ID NO: 28 This represents the amino acid sequence of a mutant in which valine (V) at position 117 in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of the present invention is substituted with lysine (K).
  • SEQ ID NO: 29 The amino acid sequence of the mutant in which threonine (T) at position 118 in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of the present invention is substituted with tryptophan (W) is shown.
  • SEQ ID NO: 30 The amino acid sequence of the variant which substituted arginine (R) of the 119th position in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of this invention by valine (V) is represented.
  • SEQ ID NO: 31 The amino acid sequence of the variant which substituted aspartic acid (D) of the 120th position in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of this invention by isoleucine (I) is represented.
  • SEQ ID NO: 32 3 shows the amino acid sequence of a mutant in which leucine (L) at position 121 in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of the present invention is substituted with glutamic acid (E).
  • SEQ ID NO: 33 The amino acid sequence of the variant which substituted the glutamic acid (E) of the 122nd position in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of this invention by leucine (L) is represented.
  • SEQ ID NO: 34 3 represents the amino acid sequence of a mutant in which tryptophan (W) at position 123 in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of the present invention is replaced with threonine (T).
  • SEQ ID NO: 35 This represents the amino acid sequence of a mutant in which isoleucine (I) at position 124 in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of the present invention is substituted with aspartic acid (D).
  • SEQ ID NO: 36 The amino acid sequence of the variant which substituted the 125th proline (P) in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of this invention by arginine (R) is represented.
  • SEQ ID NO: 37 The amino acid sequence of the variant which substituted the glycine (G) of 126th position in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of this invention by phenylalanine (F) is represented.
  • SEQ ID NO: 38 3 shows the amino acid sequence of a mutant in which aspartic acid (D) at position 127 in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of the present invention is replaced with isoleucine (I).
  • SEQ ID NO: 39 The amino acid sequence of the mutant in which tyrosine (Y) at position 128 in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of the present invention is substituted with asparagine (N) is shown.
  • SEQ ID NO: 40 The amino acid sequence of the variant which substituted asparagine (N) the tyrosine (Y) of the 129th position in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of this invention is represented.
  • SEQ ID NO: 41 The amino acid sequence of the variant which substituted the methionine (M) of the 130th position in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of this invention by glutamine (Q) is represented.
  • SEQ ID NO: 42 The amino acid sequence of the variant which substituted aspartic acid (D) of the 131st position in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of this invention by isoleucine (I) is represented.
  • SEQ ID NO: 43 This represents the amino acid sequence of the mutant in which valine (V) at position 132 in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of the present invention is substituted with lysine (K).
  • SEQ ID NO: 44 The amino acid sequence of the variant which substituted the leucine (L) of the 121st position in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of this invention by isoleucine (I) is represented.
  • SEQ ID NO: 45 3 shows the amino acid sequence of a mutant in which leucine (L) at position 121 in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of the present invention is substituted with valine (V).
  • SEQ ID NO: 46 3 shows the amino acid sequence of a mutant in which leucine (L) at position 121 in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of the present invention is substituted with alanine (A).
  • SEQ ID NO: 47 The amino acid sequence of the variant which substituted the leucine (L) of the 121st position in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of this invention by phenylalanine (F) is represented.
  • SEQ ID NO: 48 3 shows the amino acid sequence of a mutant in which leucine (L) at position 121 in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of the present invention is replaced with proline (P).
  • SEQ ID NO: 49 3 represents the amino acid sequence of a mutant in which tryptophan (W) at position 123 in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of the present invention is substituted with tyrosine (Y).
  • SEQ ID NO: 50 This represents the amino acid sequence of a mutant in which tryptophan (W) at position 123 in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of the present invention is substituted with phenylalanine (F).
  • SEQ ID NO: 51 This represents the amino acid sequence of a mutant in which tryptophan (W) at position 123 in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of the present invention is replaced with proline (P).
  • SEQ ID NO: 52 3 shows the amino acid sequence of a mutant in which tryptophan (W) at position 123 in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of the present invention is replaced with leucine (L).
  • SEQ ID NO: 53 3 represents the amino acid sequence of a mutant in which tryptophan (W) at position 123 in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of the present invention is replaced with isoleucine (I).
  • SEQ ID NO: 54 This represents the amino acid sequence of a variant in which isoleucine (I) at position 124 in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of the present invention is replaced with leucine (L).
  • SEQ ID NO: 55 This represents the amino acid sequence of a mutant in which isoleucine (I) at position 124 in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of the present invention is substituted with methionine (M).
  • SEQ ID NO: 56 This represents the amino acid sequence of a mutant in which isoleucine (I) at position 124 in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of the present invention is substituted with proline (P).
  • SEQ ID NO: 57 This represents the amino acid sequence of a mutant in which isoleucine (I) at position 124 in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of the present invention is substituted with valine (V).
  • SEQ ID NO: 58 This represents the amino acid sequence of a variant in which isoleucine (I) at position 124 in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of the present invention is substituted with alanine (A).
  • SEQ ID NO: 59 The amino acid sequence of the variant which substituted glycine (G) of the 126th position in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of this invention by proline (P) is represented.
  • SEQ ID NO: 60 The amino acid sequence of the variant which substituted the glycine (G) of 126th position in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of this invention by the alanine (A) is represented.
  • SEQ ID NO: 61 This represents the amino acid sequence of a mutant in which glycine (G) at position 126 in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of the present invention is substituted with serine (S).
  • SEQ ID NO: 62 The amino acid sequence of the variant which substituted glycine (G) of the 126th position in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of this invention by asparagine (N) is represented.
  • SEQ ID NO: 63 3 represents the amino acid sequence of a mutant in which glycine (G) at position 126 in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of the present invention is replaced with threonine (T).
  • SEQ ID NO: 64 The amino acid sequence of the variant which substituted the 125th proline (P) in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of this invention by glycine (G) is represented.
  • SEQ ID NO: 65 This represents the amino acid sequence of a mutant in which proline (P) at position 125 in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of the present invention is replaced with isoleucine (I).
  • SEQ ID NO: 66 3 represents the amino acid sequence of a mutant in which proline (P) at position 125 in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of the present invention is substituted with alanine (A).
  • SEQ ID NO: 67 3 represents the amino acid sequence of a mutant in which proline (P) at position 125 in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of the present invention is replaced with leucine (L).
  • SEQ ID NO: 68 The amino acid sequence of the variant which substituted the 125th proline (P) in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of this invention by valine (V) is represented.
  • SEQ ID NO: 69 The amino acid sequence of the variant which substituted the 125th proline (P) in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of this invention by serine (S) is represented.
  • SEQ ID NO: 70 The amino acid sequence of the variant which substituted the 125th proline (P) in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of the present invention with threonine (T).
  • SEQ ID NO: 71 The amino acid sequence of the variant which substituted asparagine (N) the 125th position proline (P) in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of this invention.
  • SEQ ID NO: 72 The amino acid sequence of the variant which substituted the proline (P) of 125th position in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of this invention by glutamine (Q) is represented.
  • SEQ ID NO: 73 The amino acid sequence of the variant which substituted aspartic acid (D) the proline (P) of 125th position in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of this invention is represented.
  • SEQ ID NO: 74 The amino acid sequence of the variant which substituted the 125th proline (P) in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of this invention by glutamic acid (E) is represented.
  • SEQ ID NO: 75 The amino acid sequence of the variant which substituted the 125th proline (P) in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of this invention by lysine (K) is represented.
  • SEQ ID NO: 76 The amino acid sequence of the variant which substituted the 125th proline (P) in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of this invention by histidine (H) is represented.
  • SEQ ID NO: 77 The amino acid sequence of the variant which substituted the 125th proline (P) in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of this invention by cysteine (C) is represented.
  • SEQ ID NO: 78 This represents the amino acid sequence of a mutant in which the proline (P) at position 125 in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of the present invention is substituted with methionine (M).
  • SEQ ID NO: 79 The amino acid sequence of the mutant in which proline (P) at position 125 in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of the present invention is replaced with tyrosine (Y).
  • SEQ ID NO: 80 This represents the amino acid sequence of a mutant in which proline (P) at position 125 in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of the present invention is substituted with tryptophan (W).
  • SEQ ID NO: 81 The amino acid sequence of the variant which substituted the 125th proline (P) in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of this invention by phenylalanine (F) is represented.
  • SEQ ID NO: 82 3 represents the amino acid sequence of a mutant in which valine (V) at position 117 in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of the present invention is substituted with leucine (L).
  • SEQ ID NO: 83 This represents the amino acid sequence of the mutant in which valine (V) at position 117 in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of the present invention is replaced with isoleucine (I).
  • SEQ ID NO: 84 This represents the amino acid sequence of a mutant in which threonine (T) at position 118 in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of the present invention is substituted with serine (S).
  • SEQ ID NO: 85 This represents the amino acid sequence of a mutant in which threonine (T) at position 118 in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of the present invention is substituted with lysine (K).
  • SEQ ID NO: 86 This represents the amino acid sequence of a mutant in which arginine (R) at position 119 in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of the present invention is substituted with lysine (K).
  • SEQ ID NO: 87 3 represents the amino acid sequence of a mutant in which arginine (R) at position 119 in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of the present invention is replaced with threonine (T).
  • SEQ ID NO: 88 The amino acid sequence of the variant which substituted aspartic acid (D) of the 120th position in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of this invention by glutamic acid (E) is represented.
  • SEQ ID NO: 89 The amino acid sequence of the variant which substituted aspartic acid (D) of the 120th position in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of this invention by the alanine (A) is represented.
  • SEQ ID NO: 90 The amino acid sequence of the mutant in which glutamic acid (E) at position 122 in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of the present invention is substituted with aspartic acid (D) is shown.
  • SEQ ID NO: 91 The amino acid sequence of the variant which substituted the glutamic acid (E) of the 122nd position in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of this invention by the alanine (A) is represented.
  • SEQ ID NO: 92 The amino acid sequence of the mutant in which the aspartic acid (D) at position 127 in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of the present invention is substituted with glutamic acid (E) is shown.
  • SEQ ID NO: 93 The amino acid sequence of the variant which substituted the aspartic acid (D) of 127th position in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of this invention by the alanine (A) is represented.
  • SEQ ID NO: 94 This represents the amino acid sequence of a mutant in which tyrosine (Y) at position 128 in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of the present invention is substituted with phenylalanine (F).
  • SEQ ID NO: 95 The amino acid sequence of the mutant in which tyrosine (Y) at position 128 in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of the present invention is substituted with tryptophan (W) is shown.
  • SEQ ID NO: 96 This represents the amino acid sequence of the mutant in which tyrosine (Y) at position 129 in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of the present invention is substituted with phenylalanine (F).
  • SEQ ID NO: 97 This represents the amino acid sequence of a mutant in which tyrosine (Y) at position 129 in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of the present invention is substituted with tryptophan (W).
  • SEQ ID NO: 98 The amino acid sequence of the variant which substituted the methionine (M) of the 130th position in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of this invention by phenylalanine (F) is represented.
  • SEQ ID NO: 99 The amino acid sequence of the variant which substituted the methionine (M) of the 130th position in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of this invention by isoleucine (I) is represented.
  • SEQ ID NO: 100 The amino acid sequence of the variant which substituted aspartic acid (D) of the 131st position in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of this invention by glutamic acid (E) is represented.
  • SEQ ID NO: 101 The amino acid sequence of the variant which substituted aspartic acid (D) of the 131st position in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of this invention by the alanine (A) is represented.
  • SEQ ID NO: 102 The amino acid sequence of the variant which substituted valine (V) of the 132nd position in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of this invention by tyrosine (Y) is represented.
  • SEQ ID NO: 103 3 represents the amino acid sequence of a mutant in which valine (V) at position 132 in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of the present invention is substituted with serine (S).
  • SEQ ID NO: 104 In the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of the present invention, an amino acid of a variant in which isoleucine (I) at position 124 is replaced with valine (V) and glycine (G) at position 126 is replaced with alanine (A) Represents an array.
  • SEQ ID NO: 105 In the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of the present invention, an amino acid of a variant in which isoleucine (I) at position 124 is replaced with valine (V) and glycine (G) at position 126 is replaced with serine (S) Represents an array.
  • leucine (L) at position 121 is isoleucine (I)
  • tryptophan (W) at position 123 is tyrosine (Y)
  • isoleucine at position 124 The amino acid sequence of the mutant in which I) is substituted with valine (V) and glycine (G) at position 126 with alanine (A).
  • SEQ ID NO: 107 In the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of the present invention, leucine (L) at position 121 is isoleucine (I), tryptophan (W) at position 123 is tyrosine (Y), and isoleucine at position 124 ( The amino acid sequence of the mutant in which I) is replaced with valine (V) and glycine (G) at position 126 is replaced with serine (S). SEQ ID NO: 108 The amino acid sequence of the mutant which deleted the glutamic acid (E) at position 122 in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of the present invention.
  • SEQ ID NO: 109 The amino acid sequence of the mutant in which glutamic acid (E) is inserted between glycine (G) at position 126 and aspartic acid (D) at position 127 in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of the present invention.
  • SEQ ID NO: 110 The amino acid sequence of the variant which substituted asparagine (N) of the 79th position in the amino acid sequence of the H chain of the anti-AD1 antibody (EV2038) of this invention by glutamine (Q) is represented.
  • SEQ ID NO: 111 1 represents the amino acid sequence of the synthetic peptide (peptide 1 in Table 5) prepared and used in Example 8.
  • SEQ ID NO: 112 The amino acid sequence of the synthetic peptide (peptide 2 in Table 5) prepared and used in Example 8 is shown.
  • SEQ ID NO: 113 The amino acid sequence of the synthetic peptide produced and used in Example 8 (peptide 3 in Table 5) is shown.
  • SEQ ID NO: 114 The amino acid sequence of the synthetic peptide produced and used in Example 8 (peptide 4 in Table 5) is shown.
  • SEQ ID NO: 115 1 represents the amino acid sequence of the synthetic peptide (peptide 5 in Table 5) prepared and used in Example 8.
  • SEQ ID NO: 116 1 represents the amino acid sequence of the synthetic peptide (peptide 6 in Table 5) prepared and used in Example 8.
  • SEQ ID NO: 117 The amino acid sequence of the synthetic peptide (peptide 7 in Table 5) prepared and used in Example 8 is shown.
  • SEQ ID NO: 118 1 represents the amino acid sequence of the synthetic peptide prepared and used in Example 8 (peptide 8 in Table 5).
  • SEQ ID NO: 119 1 represents the amino acid sequence of the synthetic peptide (peptide 9 in Table 5) prepared and used in Example 8.
  • SEQ ID NO: 120 The amino acid sequence of the synthetic peptide (peptide 10 in Table 5) prepared and used in Example 8 is shown.
  • SEQ ID NO: 121 1 represents the amino acid sequence of the synthetic peptide (peptide 11 in Table 5) prepared and used in Example 8.
  • SEQ ID NO: 122 The amino acid sequence of the synthetic peptide (peptide 12 in Table 5) prepared and used in Example 8 is shown.
  • SEQ ID NO: 123 The amino acid sequence of the synthetic peptide produced and used in Example 8 (peptide 13 in Table 5) is shown.
  • SEQ ID NO: 124 1 represents the amino acid sequence of the synthetic peptide produced and used in Example 8 (peptide 14 in Table 5).
  • SEQ ID NO: 125 The amino acid sequence of the synthetic peptide (peptide 15 in Table 5) prepared and used in Example 8 is shown.
  • SEQ ID NO: 126 1 represents the amino acid sequence of the synthetic peptide produced and used in Example 8 (peptide 16 in Table 5).
  • SEQ ID NO: 127 The amino acid sequence of the synthetic peptide (peptide 17 in Table 5) prepared and used in Example 8 is shown.
  • SEQ ID NO: 128 The amino acid sequence of the synthetic peptide produced and used in Example 8 (peptide 18 in Table 5) is shown.
  • SEQ ID NO: 129 The amino acid sequence of the synthetic peptide produced and used in Example 8 (peptide 19 in Table 5) is shown.
  • SEQ ID NO: 130 1 represents the amino acid sequence of the synthetic peptide prepared and used in Example 8 (peptide 20 in Table 5).
  • SEQ ID NO: 131 The amino acid sequence of the synthetic peptide produced and used in Example 8 (peptide 21 in Table 5) is shown.
  • SEQ ID NO: 132 The amino acid sequence of the synthetic peptide (peptide 22 in Table 5) prepared and used in Example 8 is shown.
  • SEQ ID NO: 133 1 represents the amino acid sequence of the synthetic peptide produced and used in Example 8 (peptide 23 in Table 5).
  • SEQ ID NO: 134 1 represents the amino acid sequence of the synthetic peptide prepared and used in Example 8 (peptide 24 in Table 5).
  • SEQ ID NO: 135 1 represents the amino acid sequence of the synthetic peptide prepared and used in Example 8 (peptide 25 in Table 5).
  • SEQ ID NO: 136 The amino acid sequence of the synthetic peptide produced and used in Example 8 (peptide 26 in Table 5) is shown.
  • SEQ ID NO: 137 1 represents the amino acid sequence (Swiss-Prot: P06473) of the gB glycoprotein of human cytomegalovirus (HCMV).
  • Table 1 shows the relationship between nucleotide or amino acid sequences appearing in Examples 1 to 6 of the present specification and SEQ ID NOs.
  • Example 1 Isolation of fully human antibody-producing cell clones against HCMV A flowchart up to the isolation of antibody-producing cell clones is shown in FIG. B lymphocytes were isolated from human peripheral blood with high serum anti-HCMV antibodies and infected with EBV. Infected cells were seeded in a 96-well plate and cultured for about 3 weeks, and then the anti-HCMV antibody in the culture supernatant was screened (primary screening). Screening was performed using AD1 and AD2 (J. Virol., 65, 138-146 (1991), J. Gen. Virol., 73, 2375-2383 (1992), J. Virol. 66, 5290-5297 (1992), J.
  • Example 2 Confirmation of antibody isotype and subclass Using the culture supernatant of the isolated antibody-producing cell clone, the isotype of the produced antibody was confirmed by ELISA (Reference: Curr Protoc Immunol. 2001 May; Chapter 2: Unit 2.2).
  • the ELISA used was a 96-well plate coated with GST-fused HCMV-AD1 or AD2, and antibodies specific for each isotype and subclass were used as secondary antibodies.
  • the isotype and subclass of the obtained anti-HCMV antibody are shown in Table 2.
  • Example 3 Cloning of DNA encoding anti-HCMV antibody From total-RNA of antibody-producing cells, reverse transcription was performed using Oligo-dT primer, and the antibody gene was amplified by PCR using the obtained cDNA as a template. Primers used for PCR were designed based on a database of cDNA encoding human IgG antibody H chain and L chain. In order to amplify full length H chain cDNA and L chain cDNA, the 5 ′ terminal primer has a translation initiation point and the 3 ′ terminal primer has a translation termination point.
  • Example 4 Determination of antibody amino acid sequence based on nucleotide sequence
  • the antibody H chain and L chain cDNAs amplified by the PCR method were inserted into a plasmid vector, and the respective nucleotide sequences were confirmed by an ABI sequencer. From the obtained base sequence, the signal sequence and the amino acid sequences of the antibody H chain and L chain were determined.
  • Kabat's method was used for analysis of the complementarity determining region (CDR) of the antibody (www.bioinf.org.uk: Dr. Andrew CR Martin's Group, Antibodies: General Information).
  • CDR sequences of the obtained anti-HCMV antibody (EV2038) are shown in SEQ ID NOs: 13-18.
  • the amino acid sequences of EV2038 H chain CDR1, H chain CDR2, H chain CDR3, L chain CDR1, L chain CDR2, and L chain CDR3 are SEQ ID NOS: 13, 14, 15, 16, 17, and 18, respectively. Shown in By the way, in order to examine the similarity with the monoclonal antibody reported as an AD1 antibody so far, the antibody whose variable region amino acid sequence is published in GenBank et al. was compared with the CDR sequence of EV2038. Various CDR sequences of known human or mouse-derived AD1 antibodies were determined by the Kabat method, and compared with the CDR sequences of EV2038 similarly determined.
  • the homology of individual CDRs is the homology obtained from the number of amino acid residues to be compared (denominator) and the number of amino acid residues (molecules) whose position and type matched EV2038 in the CRD part. (%).
  • the total (%) is the sum of the number of amino acid residues serving as the denominator and the number of amino acid residues serving as the numerator obtained by comparison of the individual CDRs.
  • the homology (%) is obtained from the radix.
  • EV2038 did not show any homology with known AD1 antibodies, and it was revealed that CDR sequences differ greatly from those reported so far.
  • Embodiment 5 Confirmation that the obtained antibody gene encodes an anti-HCMV antibody
  • the obtained H-chain and L-chain cDNAs were each inserted into an expression vector and simultaneously introduced into 293T cells. Gene transfer was performed under the conditions recommended by the manufacturer using Lipofectamine (Invitrogen) and Plus reagent (Invitrogen) (Invitrogen catalog: Cat.No.18324-111, Cat.No.18324-012, or Cat.No.18324-020). ).
  • the culture supernatant was recovered, and the antibody in the culture supernatant was a human IgG antibody by ELISA using a 96-well plate coated with anti-human IgG antibody and GST-fused HCMV-AD1, and HCMV- It was confirmed to bind to AD1.
  • Example 6 Production of antibody protein
  • the resulting anti-HCMV antibody expression plasmid was introduced into CHO cells.
  • the same method as in the case of 293T cells described above was employed for gene transfer.
  • a selection marker By culturing in the presence of a selection marker, a CHO cell clone that constantly produces antibodies was obtained.
  • CHO cells stably producing the antibody were cultured in a serum-free medium, and the culture supernatant was collected. This culture supernatant was added to a Protein A column, and a purified antibody was obtained by affinity purification.
  • the column used was a pre-packed column of HiTrap rProtein A FF (GE Healthcare), and the purification conditions were those recommended by the column manufacturer.
  • the HCMV-AD1 or HCMV-AD2 binding property of the antibody was confirmed by ELISA. Further, the antibody H chain of about 50 kDa and the antibody L chain of about 25 kDa were confirmed by SDS-PAGE.
  • Example 7 Preparation of variants and their binding activity
  • the CDR-H3 region (amino acid numbers 117 to 132) was examined in particular.
  • the number of the amino acid residue of CDR-H3 is represented by the rank from the N-terminus (methionine) of the heavy chain amino acid sequence including the signal sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • amino acids constituting natural proteins can be grouped according to their side chain characteristics.
  • amino acids having similar characteristics include aromatic amino acids (tyrosine, phenylalanine, tryptophan), basic Amino acids (lysine, arginine, histidine), acidic amino acids (aspartic acid, glutamic acid), neutral amino acids (serine, threonine, asparagine, glutamine), amino acids with hydrocarbon chains (alanine, valine, leucine, isoleucine, proline), and It can be classified into other groups (glycine, methionine, cysteine).
  • “conservative amino acid substitution” refers to substitution between amino acids with similar characteristics, that is, amino acid substitution mainly within the same group. This substitution is believed to not significantly affect the properties of the original protein or not significantly change it.
  • “non-conservative amino acid substitution” refers to substitution with an amino acid having a characteristic greatly different from that of the original amino acid.
  • EV2038 CDR-H3 variant One of the 16 amino acids constituting EV2038 CDR-H3 was subjected to non-conservative amino acid substitution using a two-step PCR method to obtain a variant (V117K, T118W, R119V, D120I, L121E, E122L, W123T, I124D, P125R, G126F, D127I, Y128N, Y129N, M130Q, D131I, V132K).
  • variants with conservative amino acid substitutions in this region (V117L, V117I, T118S, T118K, R119K, R119T, D120E, D120A, E122D, E122A, D127E, D127A, Y128F, Y128W, Y129F, Y130F, Y130F, Y130F, Y130F, D131E, D131A, V132Y, V132S) were found to retain the binding ability in AD1 as in the case of non-conservative amino acid substitution (FIG. 5).
  • Table 4 shows a list of SEQ ID NOs of the amino acid sequences (including signal sequences) of the variant H chains prepared in this section.
  • Example 8 FIG. Epitope mapping of anti-HCMV AD1 antibody
  • deletion mutations were introduced into the expression vector in which AD1 of HCMV gB was cloned, and various parts of AD1 were A series of E. coli mutants expressing the deleted protein were generated. After culturing and inducing expression of these mutant Escherichia coli, standard Western blot analysis was performed using cell lysate as an antigen. As controls, two types of EV2038 and variants having different binding sites and having the ability to bind to AD1 were selected as representatives.
  • One of the selected variants is the 124th isoleucine moiety (non-conservative amino acid) located at the top of the CDR-H3 loop structure (Shirai, H., et al., FEBS Letters, 1996; 399: p1-8). It is a conservative amino acid substitution I124V at one of the sites where AD1 binding activity was not observed by substitution. The other is a non-conservative amino acid substitution V132K of the 132rd valine located at the root of the loop structure of CDR-H3.
  • EV2038, I124V, and V132K all bind to clone numbers # 0, # 12, # 13, # 14, # 15, and # 19, and EV2038 and its variants both have : SEQ ID NO: 23), and 596-640 (EDNEILLGNHRTEECQLPSLKIFIAGNSAEYEYVDYLFKRMIDLSS: SEQ ID NO: 24) was found to have an epitope (FIGS. 9 and 10).
  • amino acid sequence of gB of HCMV AD169 strain used as an antigen was described with reference to the sequence of accession number P06473, numbered in order from the methionine of the start codon.
  • EV2038 For EV2038, more detailed epitopes were determined on the peptide array. Twenty-six peptides were synthesized by shifting the 12-residue peptide by 4 residues in the range of amino acid residues 548 to 641 (Table 5). Each peptide was coupled to the surface of the derivatized cellulose membrane at the C-terminus, and was solid-phase synthesized as a 3.7 mm ⁇ 3.7 mm individual spot (SPOTs method, Sigma Genosys). Determination of the peptide to which EV2038 binds was performed by standard dot blot analysis. EV2038 binds to Peptide Nos. 3, 7, 8, 21, and 22 (FIG.
  • the epitope is amino acid residues 549-560 (SCVTINQTSVKV: SEQ ID NO: 25), amino acid residues 569-576 (SPGRCYSR: SEQ ID NO: 26) ), Amino acid residues 625 to 632 (YEYVDYLF: SEQ ID NO: 27).
  • ITC52 or the like recognizes a discontinuous epitope of amino acid residues 570 to 579 and amino acid residues 606 to 619 (WO93 / 21952 and J. Virol, 67; p703-710 ( 1993)), but two epitope sequence portions excluding at least amino acid residues 569 to 576 (SPGRCYSR: SEQ ID NO: 26) were not observed in previous reports of AD1 antibody, and EV2038 has been It was shown that the antibody recognizes a discontinuous sequence different from the reported AD1 antibody (FIG. 10).
  • Example 9 Neutralization activity evaluation (1) Immunostaining method Neutralization activity was confirmed as an efficacy evaluation of the anti-HCMV antibody (EV2038). The neutralizing activity was evaluated based on the inhibition rate of antibodies against HCMV (AD169 strain) infection on human fetal lung-derived normal fibroblasts (MRC-5: RIKEN BRC No. RCB0211). The method was modeled after Abai et al. (Journal of Immunological Methods 322 2007 82-93). In summary: Complement (5%) was added to the virus solution and purified antibody for 1 hour, and then inoculated into MRC-5 cells (37 ° C., 1 hour).
  • IE1 which is an early protein of HCMV was detected by immunofluorescence staining. Measurement of HCMV-infected cells was performed with image analysis software Image J (http://rsbweb.nih.gov/ij/).
  • FIG. 11 shows the results of evaluating the neutralizing activity of anti-HCMV antibodies.
  • a human monoclonal antibody hIgG
  • a mouse monoclonal antibody clone name HCMV16, AbD
  • gH glycoprotein H
  • serotec 2470-5437
  • the 50% inhibitory concentration (IC 50 ) of EV2038 was 0.58 ⁇ g / mL, and it was confirmed that it has effective neutralizing activity at a lower concentration than EV2001.
  • the effective neutralizing activity cannot be confirmed with EV2001, whereas the IC 50 of EV2038 is 0.57 ⁇ g / mL, confirming that it has a neutralizing activity equivalent to that in the presence of complement. (Table 6).
  • Plaque method for EV2038 which showed high neutralizing activity in the above evaluation, further infection prevention by plaque method (Masuho, Y. et al., J. Gen. Virol., 1987; 68: p1457-1461) Activity was evaluated.
  • As the virus strain AD169, Towne, Davis, Merlin strain and HCMV clinical isolates T-137 and MDU-1 represented as HCMV laboratory strains were used. The method is summarized as follows. 50-100 PFU of virus solution and serially diluted purified antibody at a predetermined concentration were mixed, incubated at 37 ° C. for 1 hour, and then monolayered in a 48-well microplate (MRC-5) or retinal pigment epithelium Cells (ARPE-19) were inoculated.
  • MRC-5 48-well microplate
  • ARPE-19 retinal pigment epithelium Cells
  • the negative control is a human monoclonal antibody (hIgG) having no specificity for HCMV
  • the positive control is an anti-CMV high-titer immunoglobulin preparation CytoGam approved in the US for prevention of HCMV infection associated with kidney transplantation.
  • CSL Behring CytoGam Cytomegalovirus immune globulin intravenous, Prescribing information. (Revised July 2008)). It has been reported that HCMV has different invasion mechanisms depending on the mode of infection to fibroblasts and the mode of infection to epithelial cells and endothelial cells (Sinzger, C. et al., Curr Top Microbiol Immunol., 2008; 325: p63-83).
  • HCMV is inherently infectious in a wide range of tissues and cell types in the body (Sinzger, C. et al., Curr Top Microbiol Immunol., 2008; 325: p63-83).
  • the anti-HCMV antibody of the present invention exhibits an IC 50 of 0.012-0.037 ⁇ g / mL in infection of fibroblasts of a laboratory strain.
  • the IC 50 is 0.044 ⁇ g / mL
  • the fibroblast type and the epithelial cell / endothelial cell type had the same excellent neutralizing activity.
  • EV2038 is about 2000 times as active as AD169 strain compared to the commercially available anti-CMV high-titer immunoglobulin preparation CytoGam, and has a track record of clinical development. Was about 20 times more active than literature values (Masuho, Y. et al., J. Gen. Virol., 1987; 68: p1457-1461).
  • Example 10 Evaluation of Neutralizing Activity of EV2038 Variant Antibody Two variants with different substitution sites were selected from EV2038 variants, and the neutralizing activity was confirmed. One is a substitution of the amino acid at the 124th isoleucine part (the upper part of the loop structure of CDR-H3) in which non-conservative amino acid substitution was not observed but AD1 binding activity was observed, and a conservative amino acid substitution at that site I124V was used. The other is the non-conservative amino acid substitution V132K at the 132nd position (the root portion of the CDR-H3 loop structure) in which AD1 binding activity equivalent to that of the original was observed even in the non-conservative amino acid substitution. The method follows that of Abai et al.
  • HCMV infection inhibition rate of each antibody was determined as a percentage of the infection inhibition rate when the same concentration of hIgG was added.
  • IC 50 50% inhibitory concentration
  • I124V was 0.45 ⁇ g / mL
  • V132K was 1.20 ⁇ g / mL, and almost the same activity as EV2038 was observed.
  • Example 11 Evaluation of intercellular infection inhibitory activity Further, as one of the evaluations of the efficacy of EV2038, human fetal lung-derived normal fibroblasts (MRC-5) infected with HCMV were used to evaluate the intercellular infection inhibitory activity of EV2038. .
  • the evaluation method was based on the method of Navarro et al. (Virology. 1993; 197: p143-158). Specifically, MRC-5 that had been infected with HCMV (AD169) for 24 hours was used, and the antibody was added in a 4-fold dilution series from 10 mg / mL (about 67 nM). The cells were fixed 6 days after infection, and IE1, which is an early-expressed protein, was detected by immunostaining.
  • Navarro et al. reported an example of 100-75% inhibition at a concentration of 10 mg / mL with the most active antibodies (such as CH177-3 and CH244-4).
  • EV2038 showed 100-75% inhibition of cell infection in the concentration range of 10 to 0.63 ⁇ g / mL, and 75-50% even at 0.16 ⁇ g / mL (1.07 nM). Inhibition of intercellular infection was observed.
  • the anti-HCMV antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention can be used in various diseases caused by HCMV, such as interstitial pneumonia, retinitis, gastroenteritis, encephalitis in immunocompromised patients. It is considered to bring about a new approach as a preventive or therapeutic drug for diseases such as these, liver function abnormalities caused by HCMV infection in newborns and infants, interstitial pneumonia, and mononucleosis.
  • the anti-HCMV antibody of the present invention and a pharmaceutical composition containing the antibody are various diseases caused by HCMV, such as (a) AIDS, cancer, after organ transplantation, after bone marrow transplantation, after hemodialysis, etc. Diseases such as interstitial pneumonia, retinitis, gastroenteritis, encephalitis, etc.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Diabetes (AREA)

Abstract

　本発明は、様々な疾病状態を導く原因となるヒトサイトメガロウイルスＨＣＭＶに対し、ｇＢ糖タンパク質のＡＤ1領域に特異的に結合し、優れた中和能を有するモノクローナル抗体およびその抗原結合性断片を含む医薬組成物を提供する。本発明は、ＨＣＭＶに対して、ＡＤ１領域の不連続配列に特異的に結合する中和能および細胞間感染阻止能の優れたモノクローナル抗体ならびにその抗原結合断片、その抗体または断片を含む医薬組成物等を提供する。

Description

ヒトサイトメガロウイルスｇＢ糖タンパク質のＡＤ１領域に存在する特定の不連続エピトープに結合するモノクローナル抗体ならびにその抗原結合性断片
　本発明はヒトサイトメガロウイルス（human Cytomegalovirus）（以下「ＨＣＭＶ」と称す場合がある）に結合するモノクローナル抗体、ならびにその抗原結合性断片に関する。特に、ＨＣＭＶのｇＢ糖タンパク質のＡＤ１領域に結合するヒトのモノクローナル抗体ならびにその抗原結合性断片に関する。
　ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）は、ヒトヘルペスウイルス６型（ＨＨＶ－６）やヒトヘルペスウイルス７型（ＨＨＶ－７）と同じヘルペスウイルス科βヘルペスウイルス亜科に属する。直径約１８０ｎｍで、野生株では１６５個の遺伝子をコードし、そのゲノムサイズは約２３５ｋｂｐ（非特許文献１、および２）の２本鎖ＤＮＡウイルスで、ヘルペスウイルス科の中では最大である。
　ＨＣＭＶは、種特異性が強く、ヒト以外の動物には感染しないが、ヒトには広く感染し、ヒトの体内においては広汎な組織に親和性がある。
　しかも一度感染すると宿主の免疫が確立した後も排除されることなく終生保持されることとなる。
　ＨＣＭＶは、一度感染すると生涯にわたって潜状感染し、日本人成人では９割以上が既に感染してウイルスを保有しているが、健常人でウイルスが活性化して病気を引き起こすことはまれである。
　しかしながら、エイズ、癌、臓器移植後、骨髄移植後、血液透析後などの免疫不全状態においては、この潜伏感染していたＨＣＭＶの再活性化が起こり、間質性肺炎、網膜炎、胃腸炎、脳炎などの、場合によっては死に至る重篤なＨＣＭＶ感染症を引き起こすことがある（非特許文献３、および４）。
　又、胎児期に妊婦がＨＣＭＶの初感染を受け、妊婦から胎児へ胎盤を経由してＨＣＭＶ感染が波及すると、先天性ＣＭＶ感染症(congenital cytomegalovirus disease：巨細胞封入体症または先天性巨細胞封入体症(cytomegalic inclusion disease)とも呼ばれている。）を発症し、流産、死産、生後間もない死亡を引き起こす。または、死亡しない場合も低出生体重、肝脾腫、黄疸、血小板減少性紫斑病、小頭症、精神発育障害、知能発達遅延、脈絡網膜炎や聴覚障害などを引き起こすことがある。更に、新生児や乳児期においても、母親からのＨＣＭＶ抗体の移行が不十分であった場合、産道、母乳、尿、または唾液などを介したＨＣＭＶ感染により、肝機能異常、間質性肺炎、単核症などを発症する場合もある（非特許文献３,４,および５）。
　ＨＣＭＶ感染症は、世界的な問題となっており上記ＨＣＭＶによる様々な病態の発症を抑制、若しくはその病態を緩和することができる予防乃至治療薬の開発が進められている。近年は、ＨＣＭＶの増殖を抑える抗ウイルス薬としてガンシクロビル（非特許文献６および７）、ホスカルネット（非特許文献８）、バルガンシクロビル（非特許文献９）などが開発されている。
　ガンシクロビルは細胞内で活性型のガンシクロビル-三リン酸になり、ＤＮＡポリメラーゼの基質であるデオキシグアノシン-三リン酸（ｄＧＴＰ）と競合的に拮抗することにより、ＤＮＡポリメラーゼを阻害することでウイルスＤＮＡの合成を妨害する抗ウイルス薬で、主にエイズなど免疫不全状態におけるサイトメガロウイルス網膜炎の治療や、ＣＤ４リンパ球数１００／ｍｍ３以下の進行したＨＩＶ感染症におけるサイトメガロウイルス網膜炎の発症抑制に使用されており、医薬品としての認可も受けている。
　しかしながら、ガンシクロビル等の抗ウイルス剤には造血障害など種々の副作用があることが報告されており、その使用態様は上記の如く、極限られたものとなる。
　ガンシクロビルの副作用として、最も頻度が高く、注意を要するのは、骨髄抑制に伴う血液障害である。白血球や赤血球、血小板が異常に減少し、その初期症状として、発熱や喉の痛み、異常なだるさ、皮下出血等の出血傾向が認められる。場合によっては、精神神経系に異常が見られ、頭痛、目眩、不眠、思考の異常、不安感等を生じる。
　又、動物実験では催奇形性、変異原性、癌原性が報告されており、妊娠中は使用することができない。
　その他、先天性ＨＣＭＶ感染症の重症例にガンシクロビルを使用することで、神経学的後遺症発現の減少や難聴の進行改善等の効果があるとされているが（非特許文献１０）、やはりガンシクロビルの副作用である骨髄抑制、催奇形性、癌原性の問題については十分かつ慎重な検討が必要となる。
　バルガンシクロビルは、ガンシクルビルのＬ－バリンエステルであり、経口投与されたのち腸管および肝臓のエステラーゼによりガンシクロビルに変換される。従って、作用機作および副作用はガンシクロビルと同じであり、骨髄抑制、催奇形性、癌原性の問題があり、日本では主にエイズなど免疫不全状態におけるサイトメガロウイルス網膜炎の治療薬としての承認が得られている。
　一方、ホスカルネットは、ピロリン酸の類似物質でＤＮＡポリメラーゼのピロリン酸結合部位に直接作用してＤＮＡポリメラーゼを阻害することにより、ＨＣＭＶの増殖を抑制する。ガンシクロビル耐性のＨＣＭＶに対しても有効である。主たる副作用としては、嘔気、貧血、血清クレアチニン上昇、嘔吐、低マグネシウム血症、低カリウム血症、知覚異常などがあり、特にショック、腎障害が高頻度で出現するので慎重な投薬が必要である。日本ではエイズ患者でＨＣＭＶ網膜炎と確定診断された患者または臨床的にＨＣＭＶ網膜炎が強く疑われる患者においてのみ使用が許可されており、感染予防の目的では使用しないこととされている（非特許文献８）。
　以上より、上述したＨＣＭＶによる種々の疾病の発症を予防、若しくは症状を緩和することができ、且つ副作用のない薬剤の開発が強く望まれていた。そのような中、これまでに抗ＨＣＭＶ抗体としては臨床開発が２件行われており、1つが特許文献３に記載の抗ＨＣＭＶ抗体「Ｃ２３(開発時にはＴＩ－２３と呼ばれる。)」で、ｇＢ糖タンパク質のＡＤ２領域を認識する抗体であり、他が特許文献４に記載の抗ＨＣＭＶ抗体「ＳＤＺ　ＭＳＬ　１０９」で、ＨＣＭＶ表面のｇＨ糖タンパク質を認識するモノクローナル抗体であった。特に、Ｃ２３は、プラーク法で求めた５０％阻止濃度が、０．５μｇ／ｍＬと高い中和活性が報告されているにもかかわらず（非特許文献１１）、途中で開発を断念している。
　一方、ＨＣＭＶのワクチン開発に関しても鋭意行われているにもかかわらず、いまだ臨床使用に耐えられるものが得られていないのが現状である。
更にまた、近年はヒト由来の抗ＣＭＶ高力価ガンマグロブリン製剤が開発され、米国においては、腎移植に伴うＨＣＭＶ感染症の発症予防の適応で承認されている。しかしながら、抗ＣＭＶ高力価ガンマグロブリン製剤はヒト由来の血液製剤であるため、さまざまな問題も抱えている。例えば、ヒト由来ガンマグロブリンの混合物であるがために、ロット間の活性のばらつきが大きいこと、かつ活性が低いこと、および供給量に限界があること、さらには未知の病原性ウイルスや病原体の混入などのリスクが常に付きまとっている等である。
　そこで、ＨＣＭＶに結合し、その感染性を中和すること（その生物学的活性を喪失させること）のできるモノクローナル抗体（以下「抗ＨＣＭＶ抗体」と称す場合がある）は、ＨＣＭＶによる様々な病態の予防乃至治療薬として期待されることから、例えば、免疫不全状態の患者において、ＨＣＭＶが原因となって引き起こされる様々な疾病に対する予防乃至治療戦略上、有用である。
　即ち、ＨＣＭＶの活性を喪失させて疾病の発症を予防、若しくは症状を緩和するのに、ＨＣＭＶに対して強い親和性と高い中和能をもち、且つアレルギー反応を示さないヒト由来の抗ＨＣＭＶ抗体を、所謂「抗体医薬」として投与するのが特に有効であると考えられた。
　しかしながら、現在までに報告されているＨＣＭＶ阻害抗体（例えば、特許文献１、２、３、４、および５）では、ＨＣＭＶに対して親和性および中和能等の点において十分ではなかったので、ＨＣＭＶの生物活性を充分に阻止し、ＨＣＭＶによって引き起こされる様々な疾病の発症を予防、若しくは症状を緩和することを期待できるには至らなかった。
　その為、異物認識応答を起こさないヒトのモノクローナル抗体であって、ＨＣＭＶに対する親和性、特異性および中和能に優れ、予防乃至治療薬としてもその活用を期待することのできる抗ＨＣＭＶ抗体、ならびにその抗原結合性断片の開発が強く望まれていた。
更には、昨今、ＨＣＭＶの生体内での増殖を抑えるためには、中和活性のみならず、細胞間感染の阻止の重要性が指摘されており、（非特許文献１２および１３）、細胞間感染阻害活性を合わせ持つ抗ＨＣＭＶ抗体が切望されていた。
特表平８－５０２４０３号公報 特表平８－５０６３２５号公報 ＷＯ８７／０３６０２ ＷＯ９３／０２１９５２ ＷＯ２００７／０９４４２３
Davison, A.J. et al.,The human cytomegalovirus genome revisited: comparison with the chimpanzee cytomegalovirus genome. J. Gen. Virol., 2003;84: p17-28 Dolan, A. et al., Genetic content of wild-type human  cytomegalovirus. J. Gen. Virol., 2004; 85: p1301-1312 多屋　馨子, 感染症の話：サイトメガロウイルス感染症, Infectiou Diseases Weekly Report Japan. 2003; 第15週:10-14 Griffiths, P.D., The treatment of cytomegalovirus infection. J. Anti. Chemo., 2002; 49: ｐ243-253 Demmler, G.J.,Congential cytomegalovirus infection  and disease. Seminars in Pediatric Infection Diseases. Seminors in Pediatric Infectious Diseases, 1999; 10: p195-200 Freitas,V.R. et al.,Activity of 9-(1,3-dihydroxy-2-Propoxymethel)guanine compared with that of acyclovir against human.monkey, and rodent cytomegaloviruses.Anti. Agent Chemo., 1985; 28: p240-245 田辺三菱製薬株式会社、抗サイトメガロウイルス化学療法剤　デノシン点滴静注用500mg、ガンシクロビル製剤添付文書、（2007年10月改訂） アストラゼネカ株式会社、抗ウイルス剤　点滴注射用ホスカルビル２４ｍｇ／ｍＬ　ホスカルネットナトリウム水和物注射剤添付文書、（2007年6月　改訂） 田辺三菱製薬株式会社、抗サイトメガロウイルス化学療法剤　バリキサ錠4500mg、バルガンシクロビル塩酸塩製剤添付文書、（2007年10月改訂） Kimberlin,D.W.et al.,Effect of ganciclovir therapy on hearing in symptomatic congental cytomegalovirus disease involving the central nervous system; randomized, controlled trial. J. Pediatr., 2003; 143: 16-25 Masuho,T.,et al., Human monoclonal antibodies neutralizing human cytomegalovirus. J.Gen.Virol, 1987; 68: p1457-1461 Navarro、D.et al.,　Glycoprotein　B　of　human　cytomegalovirus　promotes　virion　penetration　into　cells,　transmission　of　infection from cell to cell, and fusion of infected cells. Virology,1993; 197:p143-158 Ohizumi, Y., Neutralizing mechanism of two human monoclonal antibodies against human cytomegalovirus glycoprotein130/55. J. Gen. Virol., 1992; 73: p2705-2707
　以上のことより、ＨＣＭＶに特異的に結合し、その生物活性を十分に阻害する抗体または抗原結合性断片は、ＨＣＭＶが原因となって引き起こされる様々な病気に対する治療戦略上、若しくは予防戦略上有用であると考えられる。
　一方、現在、医薬品として承認されている抗体医薬の大部分は、その投与量が1日当たり数ｍｇ～数百ｍｇと非常に多くかつ高価である。抗体医薬品を除くこれまでに上市されているバイオ医薬品の多くが、１日当たり数十μｇ～１ｍｇの投薬量である。これに比較すると、抗体医薬品の一日に必要な投与量は、これまでのバイオ医薬品の約１０倍から１０００倍と大幅な開きがある。ＨＣＭＶは様々な疾病状態を導き、それらの疾患の治療は、新生児、小児、および妊婦に及ぶ可能性を考慮すると、活性が高く治療用量が少ないこと、治療費が低く抑えられることなどは重要な課題である。即ち、抗体医薬といえども高い生物活性のものが求められており、親和性に優れかつ高い中和能を有するほど医療費などの面から医薬品としては有用性が高いということになる。
　また、抗体医薬品については、必要生産量が大幅に増加しているが生産設備は世界的に不足状態にある。これらの状況から、親和性、及び中和能に優れた抗体であれば、より少ない量で効果を発揮することができるため、より高い親和性及び中和能を有するヒト抗ＨＣＭＶモノクローナル抗体が望まれている。しかも、本来ＨＣＭＶは体内において広汎な組織および細胞種に感染性を有しており（Sinzger, C. et al., Curr Top Microbiol Immunol., 2008; 325: p63-83）、抗ＨＣＭＶV抗体が臨床効果を示す上では、繊維芽細胞型および上皮細胞・内皮細胞型のいずれのタイプが感染宿主細胞となっても、有効な中和活性を有することが重要であると考えられる。
　さらに、ＨＣＭＶの生体内での感染拡大の様式を考慮すると、当該抗ＨＣＭＶ抗体には単なる中和能のみならず細胞間感染阻止能を併せ持つ抗体が切望されている。さらにまた、医薬品としての有効性・安全性を考慮すると、様々な疾病状態を導く原因となるＨＣＭＶに対し、高い中和能と細胞間感染阻止能を有するヒト由来のモノクローナル抗体およびその抗原結合性断片を含む医薬組成物の提供が望まれている。
　本発明者らは、上記のような抗体を取得するために鋭意努力した結果、ＨＣＭＶｇＢ糖タンパク質上のＡＤ１領域に存在するこれまで報告のない不連続エピトープを特異的に認識する抗体であって、高い中和能と高い細胞間感染阻止能を併せ持つヒトモノクローナル抗体を創意工夫により取得することに成功し、本発明を完成した。
　即ち、本発明は、以下に記載する、抗ＨＣＭＶモノクローナル抗体またはその結合性断片、その抗体または結合性断片をコードするＤＮＡ（ポリヌクレオチド）、そのＤＮＡを含有するベクター、そのベクターを含有する宿主細胞などに関する。
［１］ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）ｇＢ糖タンパク質のＡＤ1領域に結合する抗体もしくはその抗原結合性断片であって、ＡＤ1領域に存在する配列番号２５のアミノ酸配列、配列番号２６のアミノ酸配列、および配列番号２７のアミノ酸配列から成る不連続配列をエピトープとして認識する、抗体もしくはその抗原結合性断片。
［２］ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）ｇＢ糖タンパク質のＡＤ１領域に特異的に結合し、その生物活性を中和し得るモノクローナル抗体であって、
（ｉ）重鎖の可変領域が、
　　(a)配列番号１３のアミノ酸配列、および配列番号１３のアミノ酸配列中１～数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加、またはこれらのいずれか２つ以上の組み合わせの変異を有するアミノ酸配列からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、
　　(b) 配列番号１４のアミノ酸配列、および配列番号１４のアミノ酸配列中１～数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加、またはこれらのいずれか２つ以上の組み合わせの変異を有するアミノ酸配列からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、および、
　　(c)配列番号１５のアミノ酸配列、配列番号１５のアミノ酸配列中１～数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加、またはこれらのいずれか２つ以上の組み合わせの変異を有するアミノ酸配列、および配列番号２２で示されるアミノ酸配列からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに
（ｉｉ）軽鎖の可変領域が、
　　(a)配列番号１６のアミノ酸配列、および配列番号１６のアミノ酸配列中１～数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加、またはこれらのいずれか２つ以上の組み合わせの変異を有するアミノ酸配列からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、
　　(b) 配列番号１７のアミノ酸配列、および配列番号１７のアミノ酸配列中１～数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加、またはこれらのいずれか２つ以上の組み合わせの変異を有するアミノ酸配列からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、および、
　　(c)配列番号１８のアミノ酸配列、および配列番号１８のアミノ酸配列中１～数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加、またはこれらのいずれか２つ以上の組み合わせの変異を有するアミノ酸配列からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列、
を含有する抗体もしくはその抗原結合性断片。
［３］上記［２］に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片であって、ＨＣＭＶ-ｇＢ糖タンパク質の５４９～５８０位の連続するアミノ酸残基からなるアミノ酸配列（配列番号２３）および５９６～６４０位の連続するアミノ酸残基からなるアミノ酸配列（配列番号２４）の領域に存在する２以上の不連続配列から成るエピトープに特異的に結合する、抗体もしくはその抗原結合性断片。
［４］上記［２］に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片であって、ＨＣＭＶ-ｇＢ糖タンパク質のＡＤ1領域にある配列番号２５のアミノ酸配列、配列番号２６のアミノ酸配列、および配列番号２７のアミノ酸配列から成る不連続配列をエピトープとして認識する、抗体もしくはその抗原結合性断片。
［５］上記［３］または［４］に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片であって、
（ｉ）
　　(a)配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、
　　(b)配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、および、
　(c)配列番号２２のアミノ酸配列からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに
（ｉｉ）
　　(a)配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、
　　(b)配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、および、
　　(c)配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列、
を含有する抗体もしくはその抗原結合性断片。
［６］上記［５］に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片であって、
（ｉ）
　　(a)配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、
　　(b)配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、および、
　　(c)配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに
（ｉｉ）
　　(a)配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、
　　(b)配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、および、
　　(c)配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列、
を含有する、抗体もしくはその抗原結合性断片。
［７］上記［２］に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片であって、
　(a) 配列番号１０のアミノ酸配列、配列番号１０のアミノ酸配列中１～数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加、もしくはこれらのいずれか２つ以上の組み合わせの変異を有するアミノ酸配列、または配列番号１０のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、ならびに
　(b) 配列番号１２のアミノ酸配列、配列番号１２のアミノ酸配列中１～数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加、もしくはこれらのいずれか２つ以上の組み合わせの変異を有するアミノ酸配列、または配列番号１２のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含有する、抗体もしくはその抗原結合性断片。
［８］上記［７］に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片であって、
(a)配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、および
(b) 配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含有する、抗体もしくはその抗原結合性断片。
［９］上記［２］に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片であって、
　(a) 配列番号２もしくは６のアミノ酸配列、配列番号２もしくは６のアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加、もしくはこれらのいずれか２つ以上の組み合わせの変異を有するアミノ酸配列、または配列番号２もしくは６のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列で示される重鎖（Ｈ鎖）、ならびに
　(b) 配列番号４もしくは８のアミノ酸配列、配列番号４もしくは８のアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加、もしくはこれらのいずれか２つ以上の組み合わせの変異を有するアミノ酸配列、または配列番号４もしくは８のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列で示される軽鎖（Ｌ鎖）を含有する、抗体もしくはその抗原結合性断片；
［１０］上記［９］に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片であって、
(a)配列番号２または６のアミノ酸配列を含む重鎖（Ｈ鎖）、および
(b)配列番号４または８のアミノ酸配列を含む軽鎖（Ｌ鎖）を含有する、抗体もしくはその抗原結合性断片。
［１１］上記抗体がヒトモノクローナル抗体である、上記［１］～［１０］のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
［１２］上記抗体のクラス（サブクラス）がＩｇＧ１（λ）である、上記［１］～［１１］のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
［１３］ＨＣＭＶの実験室株（ＡＤ１６９）に対するヒト繊維芽細胞下での５０％プラーク形成阻止濃度が０．０５μｇ／ｍＬ（約０．３nＭ）以下である上記［１］～［１２］のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
［１４］ヒト繊維芽細胞（ＭＲＣ－５）にあらかじめＨＣＭＶの実験室株(ＡＤ１６９)を感染させた系で、０．２μｇ／ｍＬ（約１．３ｎＭ）以下で５０%以上の細胞間感染阻止能を有する上記［１］～［１３］のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
［１５］上記［１］～［１４］のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片および薬学的に許容可能な担体を含む、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）が関与する疾患を予防または治療するための医薬組成物。
［１６］ＨＣＭＶが関与する疾患が、（ａ）免疫不全状態におけるＨＣＭＶの再活性化による間質性肺炎、網膜炎、胃腸炎、もしくは脳炎、（ｂ）妊婦から胎児へＨＣＭＶ感染が波及することによる先天性ＣＭＶ感染症、（ｃ）上記先天性ＣＭＶ感染症により引き起こされる流産、死産、生後間もない死亡、（ｄ）上記先天性ＣＭＶ感染症により死亡しない場合における低出生体重、肝脾腫、黄疸、血小板減少性紫斑病、小頭症、精神発育障害、知能発達遅延、脈絡網膜炎、もしくは聴覚障害、または（ｅ）新生児もしくは乳児期におけるＨＣＭＶ感染により発症する肝機能異常、間質性肺炎、もしくは単核症である、上記［１５］に記載の医薬組成物。
［１７］ＨＣＭＶｇＢ糖タンパク質のＡＤ1領域に特異的に結合し、その生物活性を中和し得る抗ＨＣＭＶモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片をコードする核酸であって、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１３～１８、および２２からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸、および該核酸と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸から選択される単離された核酸。
［１８］上記［１７］に記載の核酸を組込んだベクター。
［１９］上記［１８］に記載のベクターが導入された宿主細胞。
［２０］上記［１９］に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、上記［１］～［１４］のいずれかに記載の抗体または抗原結合性断片の作製方法。
　本発明に係る抗ＨＣＭＶ抗体、特に、ＨＣＭＶ-ｇＢ糖タンパク質のＡＤ１領域に特異的に結合する抗体、またはその抗原結合性断片は、例えば免疫不全状態において、様々な疾病の原因となるＨＣＭＶに特異的に結合し、その生物活性を喪失（中和）させ、ＨＣＭＶに対して優れた中和能を発揮することができる。また、本発明に係る抗ＨＣＭＶ-ｇＢ糖タンパク質ＡＤ１抗体がヒトのモノクローナル抗体である実施形態では、免疫原性を有さず、免疫反応も見られないという利点がある。
　本発明に係る抗ＨＣＭＶ抗体の一つの実施形態はまた、ＨＣＭＶに対して高い細胞間感染阻止能または細胞間感染阻害活性を有する。ＨＣＭＶの生体内での感染拡大の様式を考慮すると、当該抗ＨＣＭＶ抗体は単なる中和能のみならず細胞間感染阻止能を併せ持つことは有利である。
　本発明に係る抗ＨＣＭＶ抗体またはその抗原結合性断片は、ＨＣＭＶに対して高い中和能および感染拡大阻害活性を有するうえ、ヒトモノクローナル抗体の実施形態については免疫原性を有しないので、ＨＣＭＶが原因となって引き起こされる様々な疾病、例えば、（ａ）エイズ、癌、臓器移植後、骨髄移植後、および血液透析後などの免疫不全状態におけるＨＣＭＶの再活性化による間質性肺炎、網膜炎、胃腸炎、脳炎などの様々な病気や、（ｂ）妊婦から胎児へＨＣＭＶ感染が波及することによる先天性ＣＭＶ感染症、（ｃ）前記先天性ＣＭＶ感染症により引き起こされる流産、死産、生後間もない死亡、（ｄ）前記先天性ＣＭＶ感染症により死亡しない場合における低出生体重、肝脾腫、黄疸、血小板減少性紫斑病、小頭症、精神発育障害、知能発達遅延、脈絡網膜炎や聴覚障害、（ｅ）新生児や乳児期におけるＨＣＭＶ感染により発症する肝機能異常、間質性肺炎、単核症などの予防乃至治療薬として有用であると考えられる(非特許文献３、４、および５)。
　また、本発明に係る特に好ましいヒトのモノクローナル抗体を含む医薬組成物は、極めて少ない量で有効である。
　さらに、昨今、抗ＨＣＭＶ抗体としては、ｇＨ、ｇＬなどｇＢ糖タンパク質以外の種々の表面抗原をターゲットとした研究もおこなわれているが、下記（１）～（３）の様な状況を踏まえると、本発明の抗体のように、ｇＢ糖タンパク質の、特にＡＤ１領域に特異的に結合し高い中和活性を有する抗体は、ＨＣＭＶ感染症の予防乃至治療薬として非常に有用である。
（１）HCMV等の生体内でのウイルス増殖を抑えるためには、中和活性のみならず、細胞間感染の阻止の重要性が指摘されている（非特許文献１２および１３）中で、最近のｇＢ糖タンパク質の研究において、ウイルス粒子の細胞への侵入や細胞間感染には、ｇＢが重要な役割を果たしていることが示されており（Isaacson,M.K. et al., Human cytomegalovirus glycoprotein B is required for virus entry and cell-to-cell spread but not for virion attachment, assembly, or egress. J.Virology,2009; 83: p3891-3903）、ｇＢに対する抗体は細胞間感染阻害にも寄与する可能性が高い。
（２）ＨＣＭＶの感染に必須のｇＢ糖タンパク質の中でも、ＡＤ１領域はｇＢの機能や立体構造の形成に必須の部分であり（Qadri,I. et al., Assembly of conformational-dependent neutralizing domains on glycoprotein B of human cytomegalovirus. J.Gen.Virol,1992; 73; p2913-2921；およびBritt, W.J. et al., Antigenic domain is required for oligomerization of human cytomegalovirus glycoprotein B. J.Virol.,2005; 79: p4066-4079）、かつ臨床分離のウイルス株でも変異の少ない部分として知られており、ＡＤ１に対する抗体は幅広いスペクトルを有する可能性がある。
（３）ＡＤ２領域の抗体に比べ、ｇＢ上の長い領域に及ぶ不連続エピトープを認識するAD1抗体は特異性が高く、他の生体分子との交差反応により予期せぬ副作用を生ずる可能性は低いと考えられる。
本発明にかかる抗ＨＣＭＶ抗体を産生する抗体産生細胞クローン分離の手順をフローチャートで表した図である。 ＥＶ２０３８ ＣＤＲ－Ｈ３を構成する１６残基のアミノ酸の非保存的アミノ酸置換におけるＡＤ１に対する結合能を評価したものである。 ＥＶ２０３８　Ｈ鎖の１２１, １２３, １２４, １２６番目の保存的アミノ酸置換におけるＡＤ１に対する結合能を評価したものである。 ＥＶ２０３８　Ｈ鎖の１２５番目のプロリンをプロリンとアルギニン以外の全てのアミノ酸に置換した場合のＡＤ１に対する結合能を評価したものである。 ＥＶ２０３８ ＣＤＲ－Ｈ３を構成するアミノ酸のうち、上記図２の非保存的アミノ酸置換においてＡＤ１に対する結合能が低下しなかったアミノ酸残基に対して、保存的アミノ酸置換におけるＡＤ１に対する結合能を評価したものである。 ＥＶ２０３８　ＣＤＲ－Ｈ３を構成するアミノ酸のうち、非保存的アミノ酸置換においてＡＤ１に対する結合能が低下したアミノ酸残基で１２５番目のプロリンを除く残基（１２１, １２３, １２４,および １２６番目の計４残基）を対象に２箇所若しくは４箇所を同時に置換したバリアントを計４種作製し（２箇所置換体：Ｉ１２４Ｖ/Ｇ１２６Ａ, Ｉ１２４Ｖ/Ｇ１２６Ｓ,４箇所置換体：Ｌ１２１Ｉ/Ｗ１２３Ｙ/Ｉ１２４Ｖ/Ｇ１２６Ａ, Ｌ１２１Ｉ/Ｗ１２３Ｙ/Ｉ１２４Ｖ/Ｇ１２６Ｓ）、ＡＤ１に対する結合能を評価したものである。 ＥＶ２０３８　ＣＤＲ－Ｈ３を構成するアミノ酸のうち、非保存的アミノ酸置換においてＡＤ１との結合能が低下したアミノ酸残基で１２５番のプロリンを除く残基（１２１, １２３, １２４,および １２６番目の計４残基）を対象に欠失、挿入のバリアントを各1種作製し（Ｅ１２２ｄｅｌ,および Ｇ１２６＿Ｄ１２７ｉｎｓＥ）、ＡＤ１に対する結合能を評価したものである。 ＥＶ２０３８　ＣＤＲ－Ｈ２領域の７９番目のアミノ酸残基のバリアントにおけるＡＤ１に対する結合能を評価したものである。 （Ａ）は、エピトープ領域の解析に使用したｇＢ糖タンパク質ＡＤ１領域の欠失変異体のクローンを図示したものであり、（Ｂ）は、それら欠失変異体を使用したウエスタン・ブロット分析結果を示した図である。 （Ａ）は、ペプチドアレイを用いたＥＶ２０３８のエピトープ・マッピングの結果を示した図である。（Ｂ）では、上記の解析結果をｇＢ糖タンパク質のアミノ酸配列上に図示すると共に、ＥＶ２０３８の欠失変異体を使用した解析結果、および過去に報告のあったＩＴＣ５２のエピトープ配列を示した。 本発明にかかる抗ＨＣＭＶ抗体の中和活性を評価した結果を示すグラフである。（Ａ）補体存在下で、陰性コントロールであるＨＣＭＶに特異性のないヒトモノクローナル抗体（ｈＩｇＧ)と、抗ＡＤ１抗体であるＥＶ２００１(特許文献５において開示)のヒトサイトメガロウイルス(ＡＤ１６９株)に対する中和活性を示すグラフ；（Ｂ）補体存在下で、ｈＩｇＧと抗ＨＣＶＭモノクローナル抗体（ＥＶ２０３８およびＨＣＭＶ１６）のヒトサイトメガロウイルス(ＡＤ１６９株)に対する中和活性を示すグラフ；（Ｃ）補体非存在下で、陰性コントロールであるｈＩｇＧとＥＶ２００１のヒトサイトメガロウイルス(ＡＤ１６９株)に対する中和活性を示すグラフ；および（Ｄ）補体非存在下で、ｈＩｇＧと抗ＨＣＭＶモノクローナル抗体（ＥＶ２０３８およびＨＣＭＶ１６）のヒトサイトメガロウイルス(ＡＤ１６９株)に対する中和活性を示すグラフである。
1．本発明に係る抗体またはその抗原結合性断片
　本願発明の一実施形態によれば、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のｇＢ糖タンパク質に特異的に結合し、その生物活性を中和し得る抗体またはその抗原結合性断片が提供される。より具体的な実施形態では、ＨＣＭＶのｇＢ糖タンパク質のＡＤ１領域に存在する不連続エピトープに特異的に結合し、該タンパク質の生物活性を中和し得る抗体またはその抗原結合性断片が提供される。
　「ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のｇＢ糖タンパク質」（または「ＨＣＭＶ ｇＢ糖タンパク質」もしくは「ＨＣＭＢ-ｇＢ糖タンパク質」）は、ＨＣＭＶのエンベロープを構成する主要な糖タンパク質の１つであり、ウイルス粒子の細胞への侵入、細胞融合およびウイルスの細胞間感染に寄与していることが知られている。ＨＣＭＶ ｇＢ糖タンパク質のアミノ酸配列（ＨＣＭＶウイルスの代表株であるAD169株のアミノ酸配列）は、公に利用可能な配列データベース（Swiss-Prot）からアクセッション番号：P06473のタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１３７）として入手可能である。
　「ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のｇＢ糖タンパク質のＡＤ１領域」または「ＨＣＭＶ ｇＢ糖タンパク質ＡＤ１領域」とは、ＨＣＭＶ ｇＢ糖タンパク質のアミノ酸配列中の552-635位の連続するアミノ酸残基からなる領域のことをいう（Wagnerら， Journal of Virology, Vol. 66, No. 9, Sept. 1992, p.5290-5297）。
　本明細書中、「エピトープ」とは、当該分野で通常使用される意味で使用され、抗体が結合する相手としての、抗原分子の小さな部分構造を意味する（岩波　生物学事典　第４版（１９９６年第１刷発行））。
　本発明のさらにより具体的な実施形態によれば、ＡＤ１領域に存在する不連続エピトープは、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）ｇＢ糖タンパク質の５４９～５８０位の連続するアミノ酸残基からなるアミノ酸配列（配列番号２３）および５９６～６４０位の連続するアミノ酸残基からなるアミノ酸配列（配列番号２４）の領域に存在する。さらにより具体的には、上記不連続エピトープは、配列番号２５のアミノ酸配列、配列番号２６のアミノ酸配列、および配列番号２７のアミノ酸配列からなる。
　本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、その一実施形態において、
(a)配列番号２または６のアミノ酸配列を含む重鎖（Ｈ鎖）、および
(b)配列番号４または８のアミノ酸配列を含む軽鎖（Ｌ鎖）を含有し、この抗体または抗原結合性断片は、ヒトサイトメガロウイルスのｇB糖タンパク質に特異的に結合し、その生物活性を中和し得る。
　あるいは、本発明の抗体またはその抗原結合性断片はまた、
(a)配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、および
(b) 配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含有し、ヒトサイトメガロウイルスのｇＢ糖タンパク質に特異的に結合し、その生物活性を中和し得る。
　あるいは、本発明の抗体またはその抗原結合性断片はさらに、
（ｉ）重鎖の可変領域のＣＤＲ（Complementarity Determining Region）１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれ、
　　(a)配列番号１３のアミノ酸配列、
　　(b) 配列番号１４のアミノ酸配列、および、
　　(c)配列番号１５のアミノ酸配列、
を含有し、
（ｉｉ）軽鎖の可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれ、
　　(a)配列番号１６のアミノ酸配列、
　　(b) 配列番号１７のアミノ酸配列、および、
　　(c)配列番号１８のアミノ酸配列、
を含有し、ヒトサイトメガロウイルスのｇＢ糖タンパク質に特異的に結合し、その生物活性を中和し得る。
　さらに、本発明の抗体またはその抗原結合性断片にはまた、ヒトサイトメガロウイルスのｇＢ糖タンパク質に特異的に結合し、その生物活性を中和し得る、上記の抗体または抗原結合性断片の機能的等価物も含まれ、それらは、例えば、
　(a)配列番号２もしくは６のアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加、もしくはこれらのいずれか２つ以上の組み合わせの変異を有するアミノ酸配列、または配列番号２もしくは６のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列で示される重鎖（Ｈ鎖）、ならびに
　(b)配列番号４もしくは８のアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加、もしくはこれらのいずれか２つ以上の組み合わせの変異を有するアミノ酸配列、または配列番号４もしくは８のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列で示される軽鎖（Ｌ鎖）を含有する。
　あるいは、上記の抗体または抗原結合性断片の機能的等価物はまた、
　(a)配列番号１０のアミノ酸配列中１～数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加、もしくはこれらのいずれか２つ以上の組み合わせの変異を有するアミノ酸配列、または配列番号１０のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、ならびに
　(b)配列番号１２のアミノ酸配列中１～数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加、もしくはこれらのいずれか２つ以上の組み合わせの変異を有するアミノ酸配列、または配列番号１２のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含有する。
　あるいは、上記の抗体または抗原結合性断片の機能的等価物はさらに、
（ｉ）
　　(a)配列番号１３のアミノ酸配列中１～数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加、またはこれらのいずれか２つ以上の組み合わせの変異を有するアミノ酸配列からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ１、
　　(b)配列番号１４のアミノ酸配列中１～数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加、またはこれらのいずれか２つ以上の組み合わせの変異を有するアミノ酸配列からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ２、および
　　(c)配列番号１５のアミノ酸配列中１～数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加、またはこれらのいずれか２つ以上の組み合わせの変異を有するアミノ酸配列、および配列番号２２で示されるアミノ酸配列からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３、ならびに
（ｉｉ）
　　(a)配列番号１６のアミノ酸配列中１～数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加、またはこれらのいずれか２つ以上の組み合わせの変異を有するアミノ酸配列からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１、
　　(b)配列番号１７のアミノ酸配列中１～数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加、またはこれらのいずれか２つ以上の組み合わせの変異を有するアミノ酸配列からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ２、および
　　(c)配列番号１８のアミノ酸配列中１～数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加、またはこれらのいずれか２つ以上の組み合わせの変異を有するアミノ酸配列からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ３を含有する。
　上記機能的等価物のアミノ酸配列中の変異の数の上限は、ＨＣＭＶのｇＢ糖タンパク質に特異的に結合し、その生物活性を中和し得るか否かを指標に決定し得る。ＨＣＭＶの中和活性は、例えば、後述の実施例９および１０に記載される方法により評価することができる。また、細胞間感染阻止能の評価は、例えば、実施例１１に示される方法により評価することができる。
　本明細書で使用される「抗体」という用語は、４本のポリペプチド鎖、すなわち、２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖であってジスルフィド結合によって相互接続されたものからなる免疫グロブリン分子を指すものとする。本願発明におけるモノクローナル抗体も、各々２本の軽鎖（Ｌ鎖）および重鎖（Ｈ鎖）を含む免疫グロブリン分子からなる。各Ｈ鎖は、Ｈ鎖可変部領域（「ＨＣＶＲ」または「ＶＨ」と称す場合がある）とＨ鎖不変部領域（Ｈ鎖不変部領域は３つのドメインからなり、それぞれ「ＣＨ１」、「ＣＨ２」、「ＣＨ３」と称す場合がある（総称：ＣＨ））からなる。各Ｌ鎖は、Ｌ鎖可変部領域（「ＬＣＶＲ」または「ＶＬ」と称す場合がある）とＬ鎖不変部領域（Ｌ鎖不変部領域は１つのドメインからなり、「ＣＬ」と称す場合がある）からなる。
　特にＨＣＶＲおよびＬＣＶＲは、抗体の結合特異性に関与する点で重要である。抗体はＬＣＶＲおよびＨＣＶＲのアミノ酸残基を主に通じて標的抗原と相互作用するので、可変部領域内のアミノ酸配列は可変部領域の外にある配列よりも個々の抗体間の違いが大きい。更に、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲにおいても、各種抗体間でより一定に保たれたフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる領域と相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分することができる。ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲは、それぞれ３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなり、これらはＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序でアミノ末端からカルボキシ末端まで配列している。
　抗体の「抗原結合性断片」（または単に「抗体断片」）という用語は、抗原（例えばＨＣＭＶ）に特異的に結合する能力を持つ１つまたは複数の抗体のフラグメントを指す。なお、そのフラグメントには抗原に特異的に結合する最小限のアミノ酸配列を有するペプチドも含むものとする。また抗原に特異的に結合する抗体の可変領域や相補性決定領域を有する１本鎖抗体（ｓｃＦＶ）や二重特異性抗原、多特異性抗原なども「抗原結合性断片」に含まれる。なお、本明細書においては、簡略化のために、「抗体または抗原結合性断片」のことを単に「抗体」ともいう。
　「ＨＣＭＶの生物活性を中和し得る抗体」とは、ＨＣＭＶもしくはＨＣＭＶ感染細胞に結合することによってＨＣＭＶの生物活性を阻害する抗体を指すものとする。
　「ＨＣＭＶの生物活性」としては、代表的には、以下（ａ）～（ｅ）に例示する疾患を引き起こすＨＣＭＶの活性が含まれるが、これらに限定されず、活性化されたＨＣＭＶの活動が原因で引き起こされる種々の疾患を誘発するＨＣＭＶの活性が含まれる：
（ａ）エイズ、癌、臓器移植後、骨髄移植後、血液透析後などの免疫不全状態におけるＨＣＭＶの再活性化による間質性肺炎、網膜炎、胃腸炎、脳炎などの様々な病気；
（ｂ）妊婦から胎児へＨＣＭＶ感染が波及することによる先天性ＣＭＶ感染症；
（ｃ）前記先天性ＣＭＶ感染症により引き起こされる流産、死産、生後間もない死亡；
（ｄ）前記先天性ＣＭＶ感染症により死亡しない場合における低出生体重、肝脾腫、黄疸、血小板減少性紫斑病、小頭症、精神発育障害、知能発達遅延、脈絡網膜炎や聴覚障害；
（ｅ）新生児や乳児期におけるＨＣＭＶ感染により発症する肝機能異常、間質性肺炎、単核症等（非特許文献３、４、および５）。
　本明細書で使用される「ＨＣＭＶにより引き起こされる疾病」という用語は、その疾患にかかっている被験対象がＨＣＭＶを有することがその疾患の病態生理の原因でありまたはその疾患を悪化させる一因である、ということが示されまたはそうであると考えられる疾病およびその他の疾患を含むものとする。従って、ＨＣＭＶの生物活性が疾病の原因となる疾患は、ＨＣＭＶの生物活性の阻害によってその疾患の症状および／または進行が緩和されることが予測される疾患である。このような疾患は、例えば上述の抗ＨＣＭＶ抗体を使用して症状を緩和もしくは治癒することが可能である。具体的には、その疾患にかかっている被験対象の生物学的流体中の抗ＨＣＭＶ抗体濃度を高める（例えば、被験対象の血清や血漿、滑液中の抗ＨＣＭＶ抗体の濃度を高める）ことによって上記疾患を証明することができる。
　本明細書で使用される、「阻害効果」、「阻害」、「抑制」、「阻害し得る」等々の用語は、抗原（ＨＣＭＶ）に起因する生物活性を約５～１００％、好ましくは１０～１００％、より好ましくは２０～１００％、より好ましくは３０～１００％、より好ましくは４０～１００％、より好ましくは５０～１００％、より好ましくは６０～１００％、より好ましくは７０～１００％、さらに好ましくは８０～１００％、低減させることをいう。
　可変部領域のアミノ酸配列は、大半の抗体－抗原相互作用を担っているため、特定の天然発生型の抗体を由来とする可変部領域配列またはＣＤＲ部分の配列を、異なる性質を持った異なる抗体由来の不変部領域またはフレームワーク配列に移植した状態で含有するような発現ベクターを構築すると、特定の天然発生型抗体の性質を模倣する組換え抗体を発現させることができる。
　そのために、もとの抗体のものと同様な結合特性を有するインタクト組換え抗体を作り直す際に、特定の抗体の配列全体を得る必要はない。その抗体の重鎖および軽鎖の可変部領域配列若しくはＣＤＲ部分の配列があれば、この目的にとって充分な場合もある。
　配列番号１３、１４、および、１５は、それぞれ、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に対応するアミノ酸配列である。また配列番号１６、１７、および１８は、それぞれ、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に対応するアミノ酸配列である。したがって、本発明の好ましい抗体は、配列番号１３、１４、１５、１６、１７、および１８がそれぞれ重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に相当するに相当する場合である。しかし、ＨＣＭＶに特異的に結合し、その生物活性を中和し得るモノクローナル抗体であれば、配列番号１３、１４、１５、１６、１７、および１８がそれぞれ重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に相当するに必要はない。特に重鎖のＣＤＲ－３に関しては、配列番号２２で表示されるアミノ酸配列群の中から選ばれたアミノ酸配列であってもよい。また、上記中和活性を有する限り、ＣＤＲ配列は、配列番号１３、１４、１５、１６、１７、および１８の各群から選ばれたアミノ酸配列において、１～数個（具体的には、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個、１～２個または１個）のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加、またはこれらのいずれか２つ以上の組み合わせの変異を有するアミノ酸配列であってもよい。
　ＣＤＲ以外のアミノ酸配列は特に限定されず、ＣＤＲ以外のアミノ酸配列が他の抗体、特に、他種の抗体由来である、いわゆるＣＤＲ移植抗体も本発明の抗体に包含される。この内、ＣＤＲ以外のアミノ酸配列もヒト由来である抗体が好ましいが、必要に応じてフレームワーク領域（ＦＲ）に１ないし数個（具体的な数は上記と同様）のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加、またはこれらのいずれか２つ以上の組み合わせの変異があってもよい。これら抗体の作製方法は公知の方法を用いることができる(Riechmann L, et al., Reshaping human antibodies for therapy. Nature, 332：323-327, 1988）。本発明においては、勿論、完全ヒト抗体が好ましい。
　本発明のタンパク質のアミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入、付加、またはこれらのいずれか２つ以上の組み合わせがされたとは、同一配列中の任意かつ1もしくは複数のアミノ酸配列中の位置において、1または複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、または付加があることを意味し、欠失、置換、挿入および付加のうち2種以上が同時に生じてもよい。
　ところで、自然界のタンパク質を構成しているアミノ酸は、それらの側鎖の特性によって群分け可能であり、例えば、同様な特性を有するアミノ酸群としては、芳香族アミノ酸（チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン）、塩基性アミノ酸（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、中性アミノ酸（セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン）、炭化水素鎖を有するアミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン）、およびその他（グリシン、メチオニン、システイン）の群などに分類できる。
　非天然型のアミノ酸も含めた相互に置換可能なアミノ酸残基の例としては、下記の様な群わけもあり、同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。A群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、o-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン；　 B群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸； 　C群：アスパラギン、グルタミン； 　D群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸； 　E群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン；　F群：セリン、スレオニン、ホモセリン；　G群：フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン。
　本発明において、さらに好ましい抗体は、(a)配列番号１０のアミノ酸配列；配列番号１０のアミノ酸配列において、１～数個（具体的には、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個、１～２個または１個）のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加、またはこれらのいずれか２つ以上の組み合わせの変異を有するアミノ酸配列；または配列番号１０のアミノ酸配列と９５％以上（好ましくは、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上または９９．５％以上）の同一性を有するアミノ酸配列で示される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）と、(b)配列番号１２のアミノ酸配列；配列番号１２のアミノ酸配列中１～数個（具体的な数は上記と同様）のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加、またはこれらのいずれか２つ以上の組み合わせの変異を有するアミノ酸配列；または配列番号１２のアミノ酸配列と９５％以上（具体的な％は上記と同様）の同一性を有するアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ)を含有する。
　なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Proc. Natl． Acad．Sci． USA 872264-2268, 1990; proc Natl Acad Sci USA 90： 5873, 1993）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al： J Mol Biol 215： 403, 1990）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴＸを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore=50、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
　本発明において、さらに好ましい抗体は、(a)配列番号１０のアミノ酸配列で示される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）および、(b)配列番号１２のアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含有する。
　本発明において、さらに好ましい抗体は、(a)配列番号６のアミノ酸配列；配列番号６のアミノ酸配列において、１～数個（具体的な数は上記と同様）のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加、またはこれらのいずれか２つ以上の組み合わせの変異を有するアミノ酸配列；または配列番号６のアミノ酸配列と９５％以上（具体的な％は上記と同様）の同一性を有するアミノ酸配列で示される重鎖（Ｈ鎖）、および(b)配列番号８のアミノ酸配列；配列番号８のアミノ酸配列において、１～数個（具体的な数は上記と同様）のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加、またはこれらのいずれか２つ以上の組み合わせの変異を有するアミノ酸配列；または配列番号８のアミノ酸配列と９５％以上（具体的な％は上記と同様）の同一性を有するアミノ酸配列で示される軽鎖（Ｌ鎖）を含有する。
　本発明において最も好ましい抗体は、配列番号６のアミノ酸配列で示される重鎖（Ｈ鎖）、および配列番号８のアミノ酸配列で示される軽鎖（Ｌ鎖）を含有する、完全ヒトモノクローナル抗体である。また、本発明において好ましい抗体のクラス（サブクラス）はＩｇＧ１（λ）である。
　上述した本発明に係る抗ＨＣＭＶ抗体又はその抗原結合性断片は、様々な疾病の原因となるＨＣＭＶに特異的に結合し、その生物活性を中和させ、従来の抗ＨＣＭＶ抗体よりさらに高い中和能を有することを特徴とする。
　ここで「特異的に結合する」とは、所定の抗原を認識してそれに結合すること言う。
　典型的には、本発明の抗体のＨＣＭＶ（特に、ヒトＨＣＭＶ）との解離定数（Ｋｄ値）は、好ましくは１×１０－７Ｍ以下、より好ましくは１×１０－８Ｍ以下、さらに好ましくは１×１０－９Ｍ以下であり、最も好ましくは１×１０－１０Ｍ以下である。抗体とＨＣＭＶとの解離定数を測定するには、公知の方法を用いることができる。例えば、チップ上に固定化した抗ＨＣＭＶ抗体を用いてＢＩＡＣＯＲＥＴ１００（登録商標）のような蛋白質相互作用解析装置により測定することができる。
　抗ＨＣＭＶ抗体の中和能については、免疫染色法による感染阻止率やプラーク形成阻止率を調べることにより評価出来る。即ち、ＨＣＭＶの代表的な株であるＡＤ１６９株やＴｏｗｎｅ株を感染可能な細胞培養系に接種する際に、あらかじめ一定時間種々の濃度の抗ＨＣＭＶ抗体と接触させ、その後それらを細胞に接種し、感染２４時間後に免疫染色によりＨＣＭＶ感染細胞数を計測し感染阻止率を求めたり、もしくは感染５～６日後に形成されるプラーク数からその阻止率を求めることによって抗ＨＣＭＶ抗体の中和活性を測定することができる。
　本発明に係る抗ＨＣＭＶ抗体またはその抗原結合性断片は、好ましくは、ＡＤ１６９株に対する中和活性として、１μｇ／ｍＬ（約７nＭ）以下、より好ましくは、０．１μｇ／ｍＬ（約０．７nＭ）以下で、さらにより好ましくは０．０５μｇ／ｍＬ（約０．３ｎＭ）以下で、最も好ましくは約０．０３μｇ／ｍＬ（約０．２ｎＭ）以下で約５０％のプラーク形成阻止能を有する。
　また、細胞間感染阻止能としては、あらかじめＨＣＭＶに感染した細胞を一定時間培養後、その細胞培養系に種々の濃度の抗ＨＣＭＶ抗体を添加することにより、細胞間感染の阻害効果を評価することが出来る。
　本発明に係る抗ＨＣＭＶ抗体またはその抗原結合性断片は、好ましくは、終濃度２μｇ／ｍＬ（約１３nＭ）以下、より好ましくは、０．５μｇ／ｍＬ（約３nＭ）以下で、さらにより好ましくは０．２μｇ／ｍＬ（約０．１３ｎＭ）以下で５０%以上の細胞間感染阻止能を有する。
　なお、本願発明の抗体は、完全長の抗体若しくはその抗原結合性断片、または可変部領域を示す配列番号６、８、１０または１２のアミノ酸配列や、相補性決定領域（ＣＤＲ）を示す配列番号１３～１８のアミノ酸配列をもとにすれば、当該技術分野における周知の技術によって、ＨＣＭＶに特異的に結合し、その生物活性を中和し得る組換えヒトモノクローナル抗体、モノクローナル抗体（キメラ抗体、ヒト化抗体も含む）、またはそれらの抗原結合性断片を得ることができる。これらの抗体は本願発明の技術的範囲内に属するものである。
　例えば、重鎖および軽鎖のシグナル配列はタンパク質成熟の過程で切断され、最終的な抗体の特性には寄与しないが、欠けている配列を追加するためには、クローン化されたｃＤＮＡ配列を、ライゲーションまたはＰＣＲ増幅法により、合成オリゴヌクレオチドに組み合わせることができる。
　代替的には、可変領域全体を一組の短い、重複のあるオリゴヌクレオチドとして合成し、ＰＣＲ増幅法で組み合わせて、完全に人工的な可変領域クローンを作製することもできる。
２．本発明に係る抗体等をコードする核酸
　本願発明の別の実施形態によれば、ＨＣＭＶに特異的に結合し、その生物活性を中和し得る抗ＨＣＭＶモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片をコードする核酸であって、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１３～１８および２２からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸、および該核酸と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸から選択される単離された核酸が提供される。
　好ましくは、上記核酸はＤＮＡまたはＲＮＡであり、より好ましくはＤＮＡである。
　ＨＣＭＶに結合し、その生物活性を中和し得る抗ＨＣＭＶモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片をコードする核酸であって、２、４、６、８、１０、１２、１３～１８および２２からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸と高い同一性を有する単離された核酸も本願発明に含まれる。ここで、「高い同一性を有する」とは、高ストリンジェントな条件下で所定の核酸配列に対してハイブリダイズすることができる程度の配列同一性を意味し、例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％、またはそれを超える同一性を有することを意味する。
　「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である（例えば、J.SambrookらのMolecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989),　特に１１．４５節"Conditions for Hybridization of Oligonucleotide Probes"参照）。これらの条件において、温度を上げるほど高い同一性を有するポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）が効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
　上記高ストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸としては、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１３～１８および２２のいずれかのアミノ酸配列をコードする核酸と、例えば、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上または９９％以上の同一性を有する核酸が含まれる。
　塩基配列の同一性は、上述した同一性検索アルゴリズムなどを利用して決定することが出来る（Proc. Natl． Acad．Sci． USA 872264-2268, 1990; Proc Natl Acad Sci USA 90： 5873, 1993）。
　なお、本発明で好ましい核酸は、配列番号１０および１２のアミノ酸配列を共にコードするＤＮＡ、さらに好ましくは、配列番号６および８のアミノ酸配列を共にコードするＤＮＡである。さらにより好ましい核酸は、配列番号２および４のアミノ酸配列を共にコードするＤＮＡである。
　もっとさらにより好ましい核酸は、配列番号５および７の核酸を共に含む核酸であり、さらにより好ましい核酸は、配列番号１ならびに３の核酸の両方を含む核酸である。
３．本発明に係るベクター、宿主細胞および抗体の作製方法
　本発明は、上記核酸を組込んだベクターおよびそのベクターが導入された宿主細胞、これらを用いる抗体の作製方法にも関する。
　本発明の抗体は、公知の方法を用いた組換えヒト抗体としても作製できる（Nature,312:643,1984 、Nature,321:522,1986など参照）。例えば、本発明の抗体は、本発明に係るベクターを導入した宿主細胞を培養し、培養上清などから、産生された抗体を精製することによって作製することができる。より具体的には、ＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを同一細胞または別のヒト細胞より作製したヒト抗体ＣＨおよび／またはヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を含有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入し発現させることにより製造することができる。
　本発明の抗体のＶＨまたはＶＬをコードする核酸を組み込むベクターとしては、必ずしも限定されないが、蛋白質遺伝子等の発現に汎用され、特に抗体遺伝子の発現に適合するベクターまたは高発現用ベクターが好ましい。好適な例としては、ＥＦプロモーターおよび／またはＣＭＶエンハンサーを含有するベクターが挙げられる。また、通常ＶＨまたはＶＬをコードする核酸を組み込んだ発現ベクターをそれぞれ作製し、宿主細胞にコトランスフェクトするが、単一の発現ベクターに組み込んでも良い。
　発現ベクターを導入する宿主細胞としては、必ずしも限定されないが、蛋白質遺伝子等の発現に汎用され、特に抗体遺伝子の発現に適合する細胞が好ましい。例えば、細菌（大腸菌等）、放線菌、酵母、昆虫細胞（ＳＦ９等）、哺乳類細胞（ＣＯＳ－１、ＣＨＯ、ミエローマ細胞等）が挙げられる。
　組換抗体を工業的に生産するためには、一般的には当該抗体を安定して高生産する組換動物細胞株、例えば、ＣＨＯ細胞株が利用される。そのような組換細胞株の作製、クローン化、高発現のための遺伝子増幅およびスクリーニングは公知の方法を用いることができる（例えば、Omasa T.: J. Biosci. Bioeng., 94, 600-605, 2002等参照）。
　本発明は重鎖２本と軽鎖２本からなる抗体のほかに、本発明の抗体の抗原結合性断片も含まれる。抗原結合性断片としては、例えばＦａｂ （fragment of antigen binding ）、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２があり、抗体の活性断片をリンカー等で結合したものとして例えば一本鎖抗体（single chain Fv ：ｓｃＦｖ）やジスルフィド安定化抗体（disulfide stabilized Fv ：ｄｓＦｖ）があり、抗体の活性断片を含むペプチドとして例えばＣＤＲ を含有するペプチドが挙げられる。これらは、本発明の抗体を適当な蛋白分解酵素で処理する方法または遺伝子組換技術等、公知の方法で製造することができる。
　抗体の精製は、塩析法、ゲル濾過法、イオン交換クロマト法またはアフィニティークロマト法等の公知の精製手段を用いて行うことができる。
　その他、近年開発された、遺伝子工学技術を活用して組み換え抗体（リコンビナント抗体）をファージ表面に発現させる、ファージディスプレイ抗体技術により、人工的にＶＨ、ＶＬ遺伝子をシャッフリングさせ多様化したｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅｃｈａｉｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）抗体をファージ融合タンパクとして発現させ、特異抗体を得ることもできる。この技術は、免疫を回避でき、さらに細胞融合法に変わるヒト化抗体作製技術として高く評価されている。この技術を用いて、本願明細書における配列番号２、４、６、８、１０、１２、１３～１８および２２のアミノ酸配列を参考に作製した特異抗体またはその抗原結合性断片であれば、本願発明の技術的範囲内に属する。
　また更には、近年開発された抗体の糖鎖部分の修飾により抗体のＡＤＣＣ活性を大幅に改善するポテリジェント（Ｐｏｔｅｌｌｅｇｅｎｔ）技術を本願発明の抗体に応用して得られた抗体（Niwa R., et al, Clin.Cancer Res., 10,6248-6255(2004)参照）や、ＣＤＣ活性を改善するコンプリジェント（Ｃｏｍｐｌｅｇｎｅｎｔ）技術を本願発明の抗体に応用して得られた抗体（Kanda S., et al, Glycobiology, 17, 104-118(2007)参照）も、本発明の技術範囲に属する。
　なお、抗体作製の手法として、通常はマウス、ウサギ、ヤギ等の実験動物を利用してポリクローナル抗体や、モノクローナル抗体を取得することが行われているが、このようにして得られる抗体は用いた動物種に特徴的な配列を有しているので、そのままヒトに投与するとヒト免疫系により異物として認識され、ヒト抗動物抗体応答が起こる（即ち、抗体の抗体を作ってしまう）ことがある。
　本発明に係る抗ＨＣＭＶモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片は、健常人などの血液由来の抗体産生細胞から得ることができ、それは完全ヒト抗体である。この完全ヒト抗体は、抗体医薬として人体に投与したとしても、免疫原性を有さず、免疫反応は見られないものと考えられる。
　なお、本願発明の抗ＨＣＭＶモノクローナル抗体においては、従来の抗ＨＣＭＶモノクローナル抗体よりさらに高い中和能を有するため、より少ない投与量で同程度の治療効果が期待できる。
　次に、本発明に係る抗ＨＣＭＶモノクローナル抗体およびその抗原結合性断片を得た工程について説明するが、本発明に係る抗体等を得る手法はこれらの記載に何ら限定されるものではなく、上述したとおり、当該技術分野における通常の変更ができることは言うまでもない。
　本発明に係る抗ＨＣＭＶモノクローナル抗体およびその抗原結合性断片は、健常人の血液から種々の工程を経て、該抗体を産生する細胞クローンを分離し、抗体産生細胞クローンの培養上清より得られた抗体について、アフィニティー精製を行うことによって得ることができる。
１）ＨＣＭＶに対する完全ヒト抗体産生細胞クローンの分離
　健常人の血液からＢリンパ球を分離し、該Ｂリンパ球の増殖を誘導する。増殖誘導の方法自体は公知であり、例えばガンの誘因因子となる「エプスタイン・バールウイルス（ＥＢウイルス）」（Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ　ｖｉｒｕｓ）（以下、ＥＢＶと称す）を用いたトランスフォーム法（D.Kozborら）により、行うことができる。
　即ち、上記Ｂリンパ球をＥＢＶに感染させて増殖誘導し、増殖させた細胞を抗体産生細胞ライブラリとする。
２）抗体産生細胞ライブラリからモノクローナル抗体の回収
　増殖誘導させた細胞からモノクローナル抗体を回収する方法はモノクローナル抗体の作製 において常用されている周知の方法により行うことができる。
　前記抗体産生細胞ライブラリの中からＨＣＭＶに結合する抗体を作り出すリンパ球クローンを選別、その培養上清から抗体を取り出す。即ち、前記抗体産生細胞ライブラリから限界希釈法によりＨＣＭＶに結合する抗体を産生する細胞集団（クローン）を選択する。
　ＨＣＭＶと結合するクローンの検出には、ＨＣＭＶ由来の抗原および標識マウス抗ヒトＩｇＧ抗体を用いたＥＬＩＳＡを採用するのが好ましい。
　選択された抗体陽性細胞集団を培養し、スクリーニングを繰り返すことによって、目的とする抗体のみを産生する細胞集団（クローン）を得ることができる
　以上の抗体産生細胞クローンの分離までの工程を表すフローチャートを図１に示す。
３）ＰｒｏｔｅｉｎＡもしくはＧを用いたアフィニティー精製
　抗ＨＣＭＶ抗体を精製するには、選抜された細胞を、ローラ瓶、２リットル入りスピナー・フラスコ、または他の培養系で増殖させることができる。
　得られた培養上清を濾過し、濃縮してからプロテインＡあるいはプロテインＧ－セファロース（ＧＥヘルスケア社）などによるアフィニティ・クロマトグラフィにかけて当該タンパク質を精製することができる。緩衝液をＰＢＳに交換し、ＯＤ280または好ましくはネフェロメータ分析により、濃度を判定できる。
　アイソタイプはアイソタイプ抗原に特異的な方法で調べることができる。
　このようにして得られた抗ＨＣＭＶ抗体は、ヒト体内で感作されたＢリンパ球から作製した完全ヒト抗体であるので、抗体に対する免疫反応の可能性が低い。
　又、抗体産生細胞クローン作製に関して、Ｂリンパ球に感染して増殖誘導させる活性があるＥＢウイルスを利用している点も特徴である。
　ＥＢウイルス法の利点は、ヒトの体内で作られるナチュラルな抗体を作製できる点および親和性の高い抗体が得られる点である。例えば、ＨＣＭＶに対するヒト抗体は、マウスを人工的に免疫して作られた抗体より約１０～１００倍親和性が高いことが判明している。
　ＥＢウイルス感染で増殖したBリンパ球集団は抗体産生細胞のライブラリとなる。
　このライブラリから特定の抗体産生細胞クローンを分離しヒト抗体を得ることができる。
４．本発明に係る抗体を含有する医薬組成物
　次に、本発明は、上記抗体またはその抗原結合部分および薬学的に許容可能な担体を含む、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）が関与する疾患を予防または治療するための医薬組成物を提供する。
　本発明に係る抗ＨＣＭＶ抗体またはその抗原結合性断片は、ＨＣＭＶに対して、従来の抗ＨＣＭＶ抗体より高い中和能を有するので、ＨＣＭＶが関与する疾患（ＨＣＭＶが原因となって引き起こされる様々な疾病）の予防乃至治療薬として有用である。ＨＣＭＶが原因となって引き起こされる疾患は、ＨＣＭＶ活性の阻害によってその疾患の症状および／または進行が緩和されることが予測される疾患である。
　本明細書で使用される「ＨＣＭＶが関与する疾患」という用語は、その疾患にかかっている被験対象がＨＣＭＶを有することが、その疾患の病態病理の原因であり、またはその疾患を悪化させる一因である、ということが示され、またはそうであると考えられる疾病およびその他の疾患を含むものとする。即ち、本発明に係る抗ＨＣＭＶ抗体またはその抗原結合性断片は、ＨＣＭＶに対して高い中和能を有するので、ＨＣＭＶが原因となって引き起こされる様々な疾病、例えば、（ａ）エイズ、癌、臓器移植後、骨髄移植後、血液透析後などの免疫不全状態におけるＨＣＭＶの再活性化による間質性肺炎、網膜炎、胃腸炎、脳炎などの様々な病気や、（ｂ）妊婦から胎児へＨＣＭＶ感染が波及することによる先天性ＣＭＶ感染症、（ｃ）前記先天性ＣＭＶ感染症により引き起こされる流産、死産、生後間もない死亡、（ｄ）前記先天性ＣＭＶ感染症により死亡しない場合における低出生体重、肝脾腫、黄疸、血小板減少性紫斑病、小頭症、精神発育障害、知能発達遅延、脈絡網膜炎や聴覚障害、（ｅ）新生児や乳児期におけるＨＣＭＶ感染により発症する肝機能異常、間質性肺炎、単核症などの予防乃至治療薬としても期待できる（非特許文献３，４、および５）。
　本明細書で使用される「医薬品として許容される担体」には、生理学的に適合可能な任意の、または全ての溶媒、分散媒、コーティング、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。
　医薬品として許容される担体の例には、水、塩類溶液、リン酸緩衝化生理食塩水、デキ
ストロース、グリセロール、エタノールなどの１種または複数、ならびにこれらの組合せが含まれる。注射剤などとして使用される場合、ｐＨ調節剤や等張剤、例えば糖や、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、または塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましい。医薬品として許容される担体には、さらに、湿潤剤や乳化剤、防腐剤、緩衝剤、安定化剤など、抗体または抗体部分の保存性または有効性を増大させる少量の補助物質を含めることができる。
　本発明の組成物は、様々な剤型にすることができる。そのような組成物には、例えば、溶液（例えば注射可能であり輸液可能な溶液）や分散液、懸濁液、錠剤、カプセル、トローチ、ピル、粉末、リポソーム、坐剤など、液体、半固体、固体の剤型が含まれる。好ましい形は、意図される投与形態および治療の適用例により異なる。一般に好ましい組成物は、他の抗体でヒトを受動免疫化するために使用されるものと同様の組成物など、注射可能または輸液可能な溶液の形にあるものである。好ましい投与形態は、非経口的なもの（例えば静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内から）である。好ましい実施形態では、抗体は、静脈輸液または静脈注射によって投与される。別の好ましい実施形態では、抗体は筋肉内注射または皮下注射によって投与される。
　本発明の抗体および抗体断片は、非経口投与に適する医薬品組成物に組み込むことができる。抗体または抗体部分は、単独種類を使用する場合には、０．１～２５０ｍｇ／ｍＬの抗体を含有する注射可能な製剤として調製することが好ましい。一方、複数種類の抗体を混合して使用する場合には、０．００１～１００ｍｇ／ｍＬの抗体を含有する注射可能な製剤として調製することが好ましい。なお、その複数種類の抗体の混合割合は、適宜設定することができる。
　注射可能な製剤は、有効成分を液体に溶解したものまたは有効成分を凍結乾燥させたものを、フリントまたはアンバーバイアル、アンプル、またはプレフィルドシリンジに入れたもので構成することができる。緩衝剤は、ｐＨ５．０～７．０（最適な場合、ｐＨ６．０）のＬ－ヒスチジン（１～５０ｍＭ）、最適な場合は５～１０ｍＭのＬ－ヒスチジンにすることができる。その他の適切な緩衝剤には、コハク酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、またはリン酸カリウムが含まれるが、これらに限定されない。濃度０～３００ｍＭの溶液（液体剤型に関しては、最適な場合、１５０ｍＭ）の浸透圧を変えるために、塩化ナトリウムを使用することができる。凍結乾燥させた剤型には、凍結保護物質、主に０～１０％（最適な場合、０．５～５．０％）のスクロースを含めることができる。その他の適切な凍結保護物質にはマンニトール、トレハロースおよびラクトースが含まれる。凍結乾燥させた剤型には、増量剤、主に１～１０％のマンニトール（最適な場合、２～４％）を含めることができる。液体および凍結乾燥させた剤型の両方には、安定剤、主に１～５０ｍＭ（最適な場合、５～１０ｍＭ）のＬ－メチオニンを使用することができる。その他の適切な安定剤にはグリシン、アルギニンおよびポリソルベート８０等が含まれ、ポリソルベート８０の場合、０～０．０５％（最適な場合、０．００５～０．０１％）を含めることができる。他の界面活性剤には、ポリソルベート２０およびＢＲＩＪ界面活性剤が含まれるが、これらに限定されない。
　本医薬組成物は、一般に、製造および貯蔵の条件下で無菌または安定でなければならない。この組成物は、溶液、ミクロエマルジョン、分散液、リポソーム、または高い薬物濃度に適するその他のオーダーされた構造として、処方することができる。無菌の注射可能な溶液は、必要とされる量の活性化合物（すなわち抗体または抗体部分）を、必要な場合には上述の成分の１つまたは組合せと共に適切な溶媒に混ぜ、その後、濾過滅菌を行うことによって調製することができる。一般に、活性化合物を、基本的な分散媒および上記列挙したものから必要とされるその他の成分を含有する無菌ビークル（vehicle）に混ぜることによって、分散液を調製する。無菌の注射可能な溶液を調製するための無菌粉末製剤の場合、好ましい調製方法は、前に述べたその滅菌濾過溶液の凍結真空乾燥および噴霧乾燥であり、それによって、活性成分の粉末に加え、任意の他の所望の成分を含んだ組成物が得られる。溶液の適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、また、分散液の場合には必要とされる粒度を維持することによって、また、界面活性剤を使用することによって、維持することができる。注射可能な組成物の長期にわたる吸収は、その組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸塩やゼラチンを含めることによって行うことができる。
　本医薬組成物には、補助的な活性化合物も組み入れることができる。ある実施形態では、本発明の抗体または抗体部分は、ＨＣＭＶが原因となる疾患を治療するのに有用な１種または複数の他の治療薬と一緒に処方し、またはそのような他治療薬と同時に投与する。例えば、本発明の抗ＨＣＭＶ抗体または抗体部分は、他の標的に結合する１つまたは複数の他の抗体（例えば、ＨＣＭＶの他の結合サイトに結合する抗体）と一緒に処方し、またはそのような他の抗体と同時に投与することができる。さらに、本発明の１つまたは複数の抗体は、前述の治療薬のうち２種またはそれ以上の種類を組み合わせて使用することができる。そのような組合せによる療法は、投与された治療薬のより低い用量を有利に利用することができ、したがって、様々な単一療法に伴う可能性ある毒性または合併症が回避される。
　なお、本明細書中に現れるヌクレオチドまたはアミノ酸配列と配列番号との関係は以下のとおりである。
配列番号１
　シグナル配列を含む、ＨＣＭＶのｇＢ糖タンパク質のＡＤ１領域に対する抗体（以下、「抗ＡＤ１抗体」）（ＥＶ２０３８）のＨ鎖をコードするヌクレオチド配列を表す。
配列番号２
　シグナル配列を含む、抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列を表す。
配列番号３
　シグナル配列を含む、抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＬ鎖をコードするヌクレオチド配列を表す。
配列番号４
　シグナル配列を含む、抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＬ鎖のアミノ酸配列を表す。
配列番号５
　シグナル配列を含まない、抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖をコードするヌクレオチド配列を表す。
配列番号６
　シグナル配列を含まない、抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列を表す。
配列番号７
　シグナル配列を含まない、抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＬ鎖をコードするヌクレオチド配列を表す。
配列番号８
　シグナル配列を含まない、抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＬ鎖のアミノ酸配列を表す。
配列番号９
　抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を表す。
配列番号１０
　抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖可変領域のアミノ酸配列を表す。
配列番号１１
　抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＬ鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を表す。
配列番号１２
　抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＬ鎖可変領域のアミノ酸配列を表す。
配列番号１３
　抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列を表す。
配列番号１４
　抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列を表す。
配列番号１５
　抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を表す。
配列番号１６
　抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＬ鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列を表す。
配列番号１７
　抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＬ鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列を表す。
配列番号１８
　抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＬ鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を表す。
配列番号１９
　実施例でＥＶ２０３８ CDR-H3バリアントを作製する際に使用した38 Hind-Sプライマーのヌクレオチド配列を表す。
配列番号２０
　実施例でＥＶ２０３８のＣＤＲ－Ｈ３バリアントを作製する際に使用した38 Not-Aプライマーのヌクレオチド配列を表す。
配列番号２１
　実施例でＥＶ２０３８のＣＤＲ－Ｈ３バリアントを作製する際に使用した塩基配列確認用プライマーのヌクレオチド配列を表す。
配列番号２２
　抗ＡＤ１抗体のＣＤＲ－Ｈ３のアミノ酸配列中のコンセンサスアミノ酸配列を表す。
配列番号２３
　実施例に示す欠失変異法によりエピトープが存在する領域として同定されたＨＣＭＶ　ｇＢ糖タンパク質ＡＤ１領域の５４９位～５８０位までのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を表す。
配列番号２４
　実施例に示す欠失変異法によりエピトープが存在する領域として同定されたＨＣＭＶ　ｇＢ糖タンパク質ＡＤ１領域の５９６位～６４０位までのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を表す。
配列番号２５
　実施例に示すペプチドアレイ法によりエピトープ領域として同定されたＨＣＭＶ　ｇＢ糖タンパク質ＡＤ１領域の５４９位～５６０位までのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を表す。
配列番号２６
　実施例に示すペプチドアレイ法によりエピトープ領域として同定されたＨＣＭＶ　ｇＢ糖タンパク質ＡＤ１領域の５６９位～５７６位までのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を表す。
配列番号２７
　実施例に示すペプチドアレイ法によりエピトープ領域として同定されたＨＣＭＶ　ｇＢ糖タンパク質ＡＤ１領域の６２５位～６３２位までのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を表す。
配列番号２８
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１１７位のバリン（Ｖ）をリジン（Ｋ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号２９
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１１８位のトレオニン（Ｔ）をトリプトファン（Ｗ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号３０
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１１９位のアルギニン（Ｒ）をバリン（Ｖ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号３１
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２０位のアスパラギン酸（Ｄ）をイソロイシン（Ｉ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号３２
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２１位のロイシン（Ｌ）をグルタミン酸（Ｅ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号３３
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２２位のグルタミン酸（Ｅ）をロイシン（Ｌ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号３４
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２３位のトリプトファン（Ｗ）をトレオニン（Ｔ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号３５
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２４位のイソロイシン（Ｉ）をアスパラギン酸（Ｄ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号３６
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２５位のプロリン（Ｐ）をアルギニン（Ｒ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号３７
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２６位のグリシン（Ｇ）をフェニルアラニン（Ｆ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号３８
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２７位のアスパラギン酸（Ｄ）をイソロイシン（Ｉ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号３９
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２８位のチロシン（Ｙ）をアスパラギン（Ｎ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号４０
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２９位のチロシン（Ｙ）をアスパラギン（Ｎ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号４１
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１３０位のメチオニン（Ｍ）をグルタミン（Ｑ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号４２
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１３１位のアスパラギン酸（Ｄ）をイソロイシン（Ｉ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号４３
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１３２位のバリン（Ｖ）をリジン（Ｋ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号４４
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２１位のロイシン（Ｌ）をイソロイシン（Ｉ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号４５
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２１位のロイシン（Ｌ）をバリン（Ｖ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号４６
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２１位のロイシン（Ｌ）をアラニン（Ａ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号４７
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２１位のロイシン（Ｌ）をフェニルアラニン（Ｆ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号４８
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２１位のロイシン（Ｌ）をプロリン（Ｐ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号４９
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２３位のトリプトファン（Ｗ）をチロシン（Ｙ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号５０
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２３位のトリプトファン（Ｗ）をフェニルアラニン（Ｆ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号５１
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２３位のトリプトファン（Ｗ）をプロリン（Ｐ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号５２
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２３位のトリプトファン（Ｗ）をロイシン（Ｌ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号５３
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２３位のトリプトファン（Ｗ）をイソロイシン（Ｉ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号５４
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２４位のイソロイシン（Ｉ）をロイシン（Ｌ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号５５
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２４位のイソロイシン（Ｉ）をメチオニン（Ｍ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号５６
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２４位のイソロイシン（Ｉ）をプロリン（Ｐ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号５７
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２４位のイソロイシン（Ｉ）をバリン（Ｖ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号５８
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２４位のイソロイシン（Ｉ）をアラニン（Ａ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号５９
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２６位のグリシン（Ｇ）をプロリン（Ｐ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号６０
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２６位のグリシン（Ｇ）をアラニン（Ａ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号６１
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２６位のグリシン（Ｇ）をセリン（Ｓ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号６２
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２６位のグリシン（Ｇ）をアスパラギン（Ｎ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号６３
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２６位のグリシン（Ｇ）をトレオニン（Ｔ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号６４
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２５位のプロリン（Ｐ）をグリシン（Ｇ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号６５
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２５位のプロリン（Ｐ）をイソロイシン（Ｉ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号６６
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２５位のプロリン（Ｐ）をアラニン（Ａ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号６７
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２５位のプロリン（Ｐ）をロイシン（Ｌ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号６８
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２５位のプロリン（Ｐ）をバリン（Ｖ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号６９
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２５位のプロリン（Ｐ）をセリン（Ｓ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号７０
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２５位のプロリン（Ｐ）をトレオニン（Ｔ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号７１
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２５位のプロリン（Ｐ）をアスパラギン（Ｎ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号７２
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２５位のプロリン（Ｐ）をグルタミン（Ｑ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号７３
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２５位のプロリン（Ｐ）をアスパラギン酸（Ｄ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号７４
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２５位のプロリン（Ｐ）をグルタミン酸（Ｅ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号７５
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２５位のプロリン（Ｐ）をリジン（Ｋ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号７６
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２５位のプロリン（Ｐ）をヒスチジン（Ｈ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号７７
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２５位のプロリン（Ｐ）をシステイン（Ｃ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号７８
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２５位のプロリン（Ｐ）をメチオニン（Ｍ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号７９
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２５位のプロリン（Ｐ）をチロシン（Ｙ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号８０
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２５位のプロリン（Ｐ）をトリプトファン（Ｗ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号８１
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２５位のプロリン（Ｐ）をフェニルアラニン（Ｆ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号８２
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１１７位のバリン（Ｖ）をロイシン（Ｌ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号８３
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１１７位のバリン（Ｖ）をイソロイシン（Ｉ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号８４
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１１８位のトレオニン（Ｔ）をセリン（Ｓ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号８５
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１１８位のトレオニン（Ｔ）をリジン（Ｋ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号８６
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１１９位のアルギニン（Ｒ）をリジン（Ｋ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号８７
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１１９位のアルギニン（Ｒ）をトレオニン（Ｔ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号８８
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２０位のアスパラギン酸（Ｄ）をグルタミン酸（Ｅ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号８９
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２０位のアスパラギン酸（Ｄ）をアラニン（Ａ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号９０
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２２位のグルタミン酸（Ｅ）をアスパラギン酸（Ｄ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号９１
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２２位のグルタミン酸（Ｅ）をアラニン（Ａ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号９２
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２７位のアスパラギン酸（Ｄ）をグルタミン酸（Ｅ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号９３
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２７位のアスパラギン酸（Ｄ）をアラニン（Ａ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号９４
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２８位のチロシン（Ｙ）をフェニルアラニン（Ｆ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号９５
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２８位のチロシン（Ｙ）をトリプトファン（Ｗ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号９６
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２９位のチロシン（Ｙ）をフェニルアラニン（Ｆ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号９７
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２９位のチロシン（Ｙ）をトリプトファン（Ｗ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号９８
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１３０位のメチオニン（Ｍ）をフェニルアラニン（Ｆ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号９９
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１３０位のメチオニン（Ｍ）をイソロイシン（Ｉ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号１００
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１３１位のアスパラギン酸（Ｄ）をグルタミン酸（Ｅ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号１０１
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１３１位のアスパラギン酸（Ｄ）をアラニン（Ａ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号１０２
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１３２位のバリン（Ｖ）をチロシン（Ｙ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号１０３
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１３２位のバリン（Ｖ）をセリン（Ｓ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号１０４
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２４位のイソロイシン（Ｉ）をバリン（Ｖ）に、１２６位のグリシン（Ｇ）をアラニン（Ａ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号１０５
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２４位のイソロイシン（Ｉ）をバリン（Ｖ）に、１２６位のグリシン（Ｇ）をセリン（Ｓ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号１０６
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２１位のロイシン（Ｌ）をイソロイシン（Ｉ）に、１２３位のトリプトファン（Ｗ）をチロシン（Ｙ）に、１２４位のイソロイシン（Ｉ）をバリン（Ｖ）に、１２６位のグリシン（Ｇ）をアラニン（Ａ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号１０７
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２１位のロイシン（Ｌ）をイソロイシン（Ｉ）に、１２３位のトリプトファン（Ｗ）をチロシン（Ｙ）に、１２４位のイソロイシン（Ｉ）をバリン（Ｖ）に、１２６位のグリシン（Ｇ）をセリン（Ｓ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号１０８
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２２位のグルタミン酸（Ｅ）を欠失させた変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号１０９
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の１２６位のグリシン（Ｇ）と１２７位のアスパラギン酸（Ｄ）の間にグルタミン酸（Ｅ）を挿入した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号１１０
　本発明の抗ＡＤ１抗体（ＥＶ２０３８）のＨ鎖のアミノ酸配列中の７９位のアスパラギン（Ｎ）をグルタミン（Ｑ）に置換した変異体のアミノ酸配列を表す。
配列番号１１１
　実施例８で作製、使用した合成ペプチド（表５のペプチド１）のアミノ酸配列を表す。
配列番号１１２
　実施例８で作製、使用した合成ペプチド（表５のペプチド２）のアミノ酸配列を表す。
配列番号１１３
　実施例８で作製、使用した合成ペプチド（表５のペプチド３）のアミノ酸配列を表す。
配列番号１１４
　実施例８で作製、使用した合成ペプチド（表５のペプチド４）のアミノ酸配列を表す。
配列番号１１５
　実施例８で作製、使用した合成ペプチド（表５のペプチド５）のアミノ酸配列を表す。
配列番号１１６
　実施例８で作製、使用した合成ペプチド（表５のペプチド６）のアミノ酸配列を表す。
配列番号１１７
　実施例８で作製、使用した合成ペプチド（表５のペプチド７）のアミノ酸配列を表す。
配列番号１１８
　実施例８で作製、使用した合成ペプチド（表５のペプチド８）のアミノ酸配列を表す。
配列番号１１９
　実施例８で作製、使用した合成ペプチド（表５のペプチド９）のアミノ酸配列を表す。
配列番号１２０
　実施例８で作製、使用した合成ペプチド（表５のペプチド１０）のアミノ酸配列を表す。
配列番号１２１
　実施例８で作製、使用した合成ペプチド（表５のペプチド１１）のアミノ酸配列を表す。
配列番号１２２
　実施例８で作製、使用した合成ペプチド（表５のペプチド１２）のアミノ酸配列を表す。
配列番号１２３
　実施例８で作製、使用した合成ペプチド（表５のペプチド１３）のアミノ酸配列を表す。
配列番号１２４
　実施例８で作製、使用した合成ペプチド（表５のペプチド１４）のアミノ酸配列を表す。
配列番号１２５
　実施例８で作製、使用した合成ペプチド（表５のペプチド１５）のアミノ酸配列を表す。
配列番号１２６
　実施例８で作製、使用した合成ペプチド（表５のペプチド１６）のアミノ酸配列を表す。
配列番号１２７
　実施例８で作製、使用した合成ペプチド（表５のペプチド１７）のアミノ酸配列を表す。
配列番号１２８
　実施例８で作製、使用した合成ペプチド（表５のペプチド１８）のアミノ酸配列を表す。
配列番号１２９
　実施例８で作製、使用した合成ペプチド（表５のペプチド１９）のアミノ酸配列を表す。
配列番号１３０
　実施例８で作製、使用した合成ペプチド（表５のペプチド２０）のアミノ酸配列を表す。
配列番号１３１
　実施例８で作製、使用した合成ペプチド（表５のペプチド２１）のアミノ酸配列を表す。
配列番号１３２
　実施例８で作製、使用した合成ペプチド（表５のペプチド２２）のアミノ酸配列を表す。
配列番号１３３
　実施例８で作製、使用した合成ペプチド（表５のペプチド２３）のアミノ酸配列を表す。
配列番号１３４
　実施例８で作製、使用した合成ペプチド（表５のペプチド２４）のアミノ酸配列を表す。
配列番号１３５
　実施例８で作製、使用した合成ペプチド（表５のペプチド２５）のアミノ酸配列を表す。
配列番号１３６
　実施例８で作製、使用した合成ペプチド（表５のペプチド２６）のアミノ酸配列を表す。
配列番号１３７
　ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のｇＢ糖タンパク質のアミノ酸配列（Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：　Ｐ０６４７３）を表す。
　なお、本明細書の実施例１～６の中に現れるヌクレオチドまたはアミノ酸配列と配列番号との関係は表１のとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されるものではない。
　本実施例において使用する手順は、特に言及しない限り、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition) (Sambrookら、Cold Spring Harbour Laboratory Press，2001）で参照することができる。
実施例１．ＨＣＭＶに対する完全ヒト抗体産生細胞クローンの分離
　抗体産生細胞クローンの分離までのフローチャートを図1に示す。
　血清中の抗ＨＣＭＶ抗体が高値であるヒトの末梢血からＢリンパ球を分離し、ＥＢＶを感染させた。感染細胞を９６ウェルプレートに播種し、およそ３週間培養した後、培養上清中の抗ＨＣＭＶ抗体のスクリーニングを行った（1次スクリーニング）。スクリーニングはＨＣＭＶの主要な中和エピトープであるＡＤ１およびＡＤ２（J. Virol., 65, 138-146 (1991), J. Gen. Virol., 73, 2375-2383 (1992), J. Virol., 66, 5290-5297 (1992), J. Virol., 67, 703-710 (1993)）に対する抗体をターゲットとし、ＧＳＴ融合ＨＣＭＶ－ＡＤ１またはＧＳＴ融合ＨＣＭＶ－ＡＤ２をコートした９６ウェルプレートを用いて、ＥＬＩＳＡ法により行った。抗ＨＣＭＶ抗体産生が確認された各ウェルの細胞を希釈し、それぞれ新たな９６ウェルプレートに播種した。約３週間培養後、抗ＨＣＭＶ抗体産生の2次スクリーニングを行った。得られた抗体陽性ウェルの細胞を、新たな９６ウェルプレートにウェル当たり１～３０ヶ播種した。この限界希釈培養によるクローニング操作の結果、目的抗体を産生している細胞クローンを得た。
実施例２．抗体アイソタイプおよびサブクラスの確認
　分離した抗体産生細胞クローンの培養上清を用い、産生する抗体のアイソタイプをＥＬＩＳＡ法により確認した（文献：Curr Protoc Immunol. 2001 May; Chapter 2: Unit 2.2参照）。ＥＬＩＳＡはＧＳＴ融合ＨＣＭＶ－ＡＤ１またはＡＤ２をコートした９６ウェルプレートを用い、２次抗体としてそれぞれのアイソタイプおよびサブクラスに特異的な抗体を使用した。その結果、得られた抗ＨＣＭＶ抗体のアイソタイプおよびサブクラスを表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
実施例３．抗ＨＣＭＶ抗体をコードするＤＮＡのクローニング
　抗体産生細胞のｔｏｔａｌ－ＲＮＡから、Ｏｌｉｇｏ－ｄＴプライマーを用いて逆転写し、得られたｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法による抗体遺伝子の増幅を行った。ＰＣＲに使用したプライマーは、ヒトＩｇＧ抗体Ｈ鎖およびＬ鎖をコードするｃＤＮＡのデータベースをもとに設計した。完全長のＨ鎖ｃＤＮＡおよびＬ鎖ｃＤＮＡを増幅するため、５’末端側プライマーは翻訳開始点を、３’末端側プライマーは翻訳終止点を有している。
実施例４．塩基配列に基づく抗体のアミノ酸配列の決定
　ＰＣＲ法により増幅した抗体Ｈ鎖およびＬ鎖のｃＤＮＡをプラスミドベクターに挿入し、ＡＢＩシークエンサーによりそれぞれの塩基配列を確認した。得られた塩基配列より、シグナル配列、及び抗体Ｈ鎖およびＬ鎖のアミノ酸配列を決定した。
　また、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）の解析には、Ｋａｂａｔの方法を用いた（www.bioinf.org.uk:Dr.Andrew C.R. Martin’s Group, Antibodies: General Information）。得られた抗ＨＣＭＶ抗体（ＥＶ２０３８）のＣＤＲ配列を配列番号１３～１８に示す。具体的には、ＥＶ２０３８のＨ鎖ＣＤＲ１、Ｈ鎖ＣＤＲ２、Ｈ鎖ＣＤＲ３、Ｌ鎖ＣＤＲ１、Ｌ鎖ＣＤＲ２、およびＬ鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１３、１４、１５、１６、１７、および１８に示す。
　ところで、これまでにＡＤ１抗体として報告されているモノクローナル抗体との類似性を調べるために、可変領域のアミノ酸配列がＧｅｎＢａｎｋ等に掲載されている抗体について、ＥＶ２０３８のＣＤＲ配列との比較を行った。既知のヒトまたはマウス由来のＡＤ１抗体の各種ＣＤＲ配列をＫａｂａｔ法で定め、同様に定めたＥＶ２０３８のＣＤＲ配列とそれぞれ比較した。表３中、個々のＣＤＲの相同性は、比較対象となるアミノ酸残基の数(分母)と当該ＣＲＤ部分でＥＶ２０３８と位置と種類が一致したアミノ酸残基の数（分子）から求めた相同性（％）である。また、全体（％）は、個々のＣＤＲの比較で得られた分母となるアミノ酸残基の数と分子となるアミノ酸残基の数をそれぞれ合計し、得られた合計の分母および分子のアミノ酸残基数から相同性（％）を求めたものである。表３に示すようにＥＶ２０３８は既知のＡＤ１抗体とは相同性が全く認められず、これまで報告されているＡＤ１抗体とはＣＤＲ配列に大きな差異があることが明らかになった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 
実施例５．得られた抗体遺伝子が抗ＨＣＭＶ抗体をコードしていることの確認
　得られたＨ鎖およびＬ鎖のｃＤＮＡをそれぞれ発現ベクターに挿入し、２９３Ｔ細胞に同時に導入した。遺伝子導入はリポフェクタミン（Invitrogen）とプラス試薬（Invitrogen）により、メーカー推奨条件で行った（Invitrogen のカタログ：Cat.No.18324-111,　Cat.No.18324-012,またはCat.No.18324-020）。２日後に培養上清を回収し、抗ヒトＩｇＧ抗体およびＧＳＴ融合ＨＣＭＶ－ＡＤ１をコートした９６ウェルプレートを用いたＥＬＩＳＡ法により、培養上清中の抗体がヒトＩｇＧ抗体であること、およびＨＣＭＶ－ＡＤ１に結合することを確認した。
実施例６．抗体タンパクの産生
　得られた抗ＨＣＭＶ抗体発現プラスミドをＣＨＯ細胞に導入した。遺伝子導入は上述の２９３Ｔ細胞の場合と同様の方法を採用した。セレクションマーカー存在下で培養することにより、抗体を恒常的に産生するＣＨＯ細胞クローンを得た。
　同抗体安定産生ＣＨＯ細胞を無血清培地中で培養し、培養上清を回収した。この培養上清をＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラムに添加し、アフィニティー精製により精製抗体を得た。カラムはＨｉＴｒａｐ ｒＰｒｏｔｅｉｎＡ ＦＦ（ＧＥヘルスケア社）のプレパックカラムを使用し、精製条件はカラムメーカー推奨条件とした。精製後、抗体のＨＣＭＶ－ＡＤ１またはＨＣＭＶ－ＡＤ２結合性をＥＬＩＳＡにより確認した。また、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる約５０ｋＤａの抗体Ｈ鎖と約２５ｋＤａの抗体Ｌ鎖の確認を行った。
実施例７．バリアントの作製とそれらの結合活性
　本発明の抗体又はその結合性断片の特性に影響するアミノ酸配列を検討すべく、特に、ＣＤＲ－Ｈ３領域（アミノ酸番号１１７～１３２）について調べた。尚、ＣＤＲ－Ｈ３のアミノ酸残基の番号は、配列番号２で示したシグナル配列も含む重鎖のアミノ酸配列のＮ末（メチオニン）からの順位でもって表記した。
　ところで、自然界のタンパク質を構成しているアミノ酸は、それらの側鎖の特性によって群分け可能であり、例えば、同様な特性を有するアミノ酸としては、芳香族アミノ酸（チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン）、塩基性アミノ酸（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、中性アミノ酸（セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン）、炭化水素鎖を有するアミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン）、およびその他（グリシン、メチオニン、システイン）の群などに分類できる。
　本項において「保存的アミノ酸置換」とは特性の似通ったアミノ酸間の置換、すなわち、主として上記の同じ群内でのアミノ酸置換をさす。この置換においては、オリジナルのタンパク質の特性に顕著に影響しないか、またはそれを顕著に変えないと考えられる。一方、「非保存的アミノ酸置換」とは、上記とは異なりオリジナルのアミノ酸と大きく特性の異なるアミノ酸への置換をいう。
（１）ＥＶ２０３８のＣＤＲ－Ｈ３バリアントの作製
　ＥＶ２０３８のＣＤＲ－Ｈ３を構成している１６残基のアミノ酸について２ステップＰＣＲ法を用いて各1種類ずつ非保存的アミノ酸置換を行ない、バリアント （Ｖ１１７Ｋ， Ｔ１１８Ｗ， Ｒ１１９Ｖ, Ｄ１２０Ｉ, Ｌ１２１Ｅ, Ｅ１２２Ｌ, Ｗ１２３Ｔ, Ｉ１２４Ｄ, Ｐ１２５Ｒ, Ｇ１２６Ｆ, Ｄ１２７Ｉ, Ｙ１２８Ｎ, Ｙ１２９Ｎ, Ｍ１３０Ｑ, Ｄ１３１Ｉ, Ｖ１３２Ｋ）を作製した。まず、３８Ｈｉｎｄ－Ｓ (ＣＡＣＣＡＡＧＣＴＴＴＧＴＧＣＡＡＧＡＡＣＡＴＧＡＡＧＣＡＴＣ：配列番号１９)と置換部位のリバースプライマーのペアで前半部の遺伝子断片を、置換部位フォワードプライマーと３８Ｎｏｔ－Ａ (ＡＴＡＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＣＧＴＣＧＣＡＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣ：配列番号２０)のペアで後半部の遺伝子断片を得た。これらを鋳型として２ｎｄ ＰＣＲを行ない、完全長のバリアント抗体遺伝子を得た。その後、抗体遺伝子をおよびＮｏｔ Ｉの制限酵素処理にて末端を粘着にしたのち、抗体産生用プラスミドに組み込んだ。各バリアントの塩基配列の確認は塩基配列確認用プライマー(ＡＣＣＡＧＡＣＡＴＡＡＴＡＧＣＴＧＡＣＡＧ：配列番号２１)を使用し、３１３０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ABI社）を用いて推奨プロトコールに則り確認した。
（２）ＥＶ２０３８のＣＤＲ－Ｈ３バリアントの抗体発現確認
　得られたバリアントプラスミド（Ｈ鎖）をＬ鎖のオリジナルプラスミドとともにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ (Invitrogen社) の推奨プロトコールに則り、ＣＨＯ細胞に共遺伝子導入し、４８時間後の培養上清を採取した。抗ヒトＩｇＧ抗体（０．２５ μｇ／ｗｅｌｌ）を固相化したＩｍｍｕｎｏ ｐｌａｔｅ (Maxi sorp, Nunc社)に対し、段階希釈した培養上清を室温で1時間反応させた。２次抗体として、抗ヒトイムノグロブリンＧガンマおよび抗ヒトイムノグロブリンＧラムダ（MBL社）を同じく室温で１1時間反応させた。発色剤としてＴＭＢ基質を含むＳｕｒｅ Ｂｌｕｅ (MPL社)を５０μＬ／ｍＬ添加して室温で３０分静置後、１．５Ｍリン酸を等量加え、マイクロプレートリーダー（680XR, BIO-RAD社）を用いて４５０ ｎｍの吸光波長を測定した。ガンマ鎖とラムダ鎖の吸光度から抗体の有無と定量を行なった。
（３）ＥＬＩＳＡによるＥＶ２０３８のＣＤＲ－Ｈ３バリアントのＡＤ１に対する結合能評価
　５μｇ／ｍLのＡＤ１を固相化したＩｍｍｕｎｏ ｐｌａｔｅ (Poly sorp, Nunc社)に、ラムダ鎖を基準に１μg／ｍＬの濃度に調整した抗体を希釈系列で反応させた。その後、先述と同様にＥＬＩＳＡを行なった。得られたバリアントおよびＥＶ２０３８（オリジナル）の４５０ｎｍでの吸光度からバリアントのＡＤ１抗原に対する結合能を評価した。その結果、ＥＶ２０３８　ＣＤＲ－Ｈ３の１２２番目を除く１２１～１２６番目までの残基の非保存的なアミノ酸置換がＡＤ１への結合能を著しく低下させたことから、これらの残基がＡＤ１のパラトープとして重要であることが示唆された（図２）。
（４）ＥＶ２０３８のＣＤＲ－Ｈ３バリアントの作製２
　非保存的アミノ酸置換においてＡＤ１に対する結合能が低下した５つのアミノ酸残基のうち、１２１番目,１２３番目,１２４番目，及び１２６番目の４箇所のアミノ酸残基については、むしろ特性の近似したアミノ酸への置換を試みた。使用したアミノ酸はそれぞれ５種類で、具体的には、（図３）に示したようなバリアントを作製した。尚、１２５番目のプロリンについてはオリジナル以外のすべての天然アミノ酸への置換を行なった(図４)。バリアントは先述のごとく作製した。
（５）ＥＬＩＳＡによるＥＶ２０３８のＣＤＲ－Ｈ３バリアントのＡＤ１に対する結合能評価
　５ μｇ／ｍＬの-ＡＤ１を固相化したＩｍｍｕｎｏ ｐｌａｔｅ (Poly sorp, Nunc社)に、ラムダ鎖を基準に１ μｇ／ｍＬの濃度に調整した抗体を希釈系列で反応させた。その後、先述と同様にＥＬＩＳＡを行ない、バリアントのＡＤ１に対する結合能を評価した。１２１, １２３, １２４, １２６番目のアミノ酸については、保存的アミノ酸に則ったアミノ酸置換では大部分がＡＤ１に対する結合能を保持していた（図３）。しかし、１２５番目のプロリンについては他全ての天然型アミノ酸(１９種類)による置換においてもＡＤ１に対する結合能が認められることはなかった（図４）。このことから、本発明におけるＥＶ２０３８のＣＤＲ－Ｈ３において、１２５番目のプロリンは当該抗体のＡＤ１結合特性に必須のアミノ酸であることが示された。
（６）ＥＶ２０３８のＣＤＲ－Ｈ３バリアントの作製３
　非保存的アミノ酸置換においてＡＤ１との結合能が低下しなかったアミノ酸残基（１１７～１２０番目、１２２番目、１２７～１３２番目の計１１残基）について同様の方法で保存的アミノ酸置換についても実施し、ＡＤ１における結合能評価を確認した。その結果、この領域における保存的なアミノ酸置換を持つバリアント（Ｖ１１７Ｌ, Ｖ１１７Ｉ, Ｔ１１８Ｓ, Ｔ１１８Ｋ, Ｒ１１９Ｋ, Ｒ１１９Ｔ, Ｄ１２０Ｅ, Ｄ１２０Ａ, Ｅ１２２Ｄ, Ｅ１２２Ａ, Ｄ１２７Ｅ, Ｄ１２７Ａ, Ｙ１２８Ｆ, Ｙ１２８Ｗ, Ｙ１２９Ｆ, Ｙ１２９Ｗ, Ｍ１３０Ｆ, Ｍ１３０Ｉ, Ｄ１３１Ｅ, Ｄ１３１Ａ, Ｖ１３２Ｙ, Ｖ１３２Ｓ）は非保存的アミノ酸置換時同様、ＡＤ１における結合能を保持していることが明らかになった（図５）。
（７）ＥＶ２０３８のＣＤＲ－Ｈ３バリアントの作製４
　非保存的アミノ酸置換においてＡＤ１との結合能が低下したアミノ酸残基で１２５番のプロリンを除く残基（１２１, １２３, １２４,および １２６番目の計４残基）を対象に２箇所若しくは４箇所を同時に置換したバリアントを計４種作製し（２箇所置換体：Ｉ１２４Ｖ/Ｇ１２６Ａ, Ｉ１２４Ｖ/Ｇ１２６Ｓ,４箇所置換体：　 Ｌ１２１Ｉ/Ｗ１２３Ｙ/Ｉ１２４Ｖ/Ｇ１２６Ａ, Ｌ１２１Ｉ/Ｗ１２３Ｙ/Ｉ１２４Ｖ/Ｇ１２６Ｓ）、ＡＤ１に対する結合能を評価した。その結果、これらの重複置換のバリアントは、いずれもＡＤ１に対する結合能を保持していることが明らかになった（図６）。
　（８）ＥＶ２０３８のＣＤＲ－Ｈ３バリアントの作製５
非保存的アミノ酸置換においてＡＤ１との結合能が低下したアミノ酸残基で１２５番のプロリンを除く残基（１２１, １２３, １２４,および １２６番目の計４残基）を対象に欠失、挿入のバリアントを各1種作製し（Ｅ１２２ｄｅｌ,および Ｇ１２６＿Ｄ１２７ｉｎｓＥ）、ＡＤ１に対する結合能を評価した。その結果、Ｅ１２２ｄｅｌおよびＧ１２６＿Ｄ１２７ｉｎｓＥともにＡＤ１に対する結合能が完全に消失した。このことから、この部位（１２１～１２６番）におけるアミノ酸残基の数（６残基）がＡＤ１への結合に重要であることが示唆された（図７）。
　これらの結果を総合するとＥＶ２０３８のＣＤＲ－Ｈ３のアミノ酸配列としては、下記の様なコンセンサス 配列が考えられる。
ＸｎＸｎＸｎＸｎＸ１ＸｎＸ２Ｘ３ＰＸ４ＸｎＸｎＸｎＸｎＸｎＸｎ（配列番号２２）
　但し、Ｘｎ = 全ての天然型アミノ酸
　　　　　　Ｘ１ = Ｌ、Ｉ、Ｖ、ＦまたはＡ
　　　　　　Ｘ２ = Ｗ、ＹまたはＦ
　　　　　　Ｘ３ = Ｉ、Ｖ、ＬまたはＭ
　　　　　　Ｘ４ = Ｇ、Ｓ、ＡまたはＴ
（９）ＥＶ２０３８のＣＤＲ－Ｈ２バリアントの作製
　　ＣＤＲ－Ｈ３以外の保存的な置換がＡＤ１に対する結合能に影響するか否かを調べるために、ＥＶ２０３８のＣＤＲ－Ｈ２に位置するＮ７９をＮ７９Ｑにしたバリアントを他のバリアントと同様の方法で作製し、ＡＤ１に対する結合能を確認した。結果から、ＣＤＲ－Ｈ２に位置するＮ７９をＮ７９Ｑにしたバリアントにおいても、ＡＤ１に対する結合能は失われないことが証明された（図８）。
　尚、本項で作製したバリアントのＨ鎖のアミノ酸配列（シグナル配列も含む）の配列番号の一覧を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
実施例８．抗ＨＣＭＶ ＡＤ１抗体のエピトープマッピング
　これらＡＤ１抗体のｇＢ糖タンパク質上の結合部位を確認するために、ＨＣＭＶｇＢのＡＤ１がクローニングされた発現ベクターにＰＣＲ法で欠失変異を導入し、ＡＤ１の様々な部分が欠失したタンパク質を発現する大腸菌変異体シリーズを作製した。これらの変異体大腸菌を培養、発現誘導した後、セルライセートを抗原として標準的なウェスタンブロット分析を行った。対照としては、ＥＶ２０３８及び置換部位の異なるバリアントでＡＤ１に対する結合能を有するものを代表として２種選択した。選択したバリアントの１つは、ＣＤＲ－Ｈ３のループ構造（Shirai,H.,et al., FEBS Letters, 1996；399：p1-8）の上部に位置する１２４番目のイソロイシン部分（非保存的アミノ酸置換でＡＤ１結合活性が認められなかった部位の１つ）の置換体で、その部位の保存的アミノ酸置換体Ｉ１２４Ｖである。他は、ＣＤＲ－Ｈ３のループ構造の根元部分に位置する１３２番目のバリンの非保存的アミノ酸置換体Ｖ１３２Ｋである。
　ＥＶ２０３８、Ｉ１２４Ｖ、およびＶ１３２Ｋは、いずれもクローン番号＃０、＃１２、＃１３、＃１４、＃１５、および＃１９に結合し、ＥＶ２０３８およびそのバリアントは、いずれもアミノ酸残基５４９～５８０（ＳＣＶＴＩＮＱＴＳＶＫＶＬＲＤＭＮＶＫＥＳＰＧＲＣＹＳＲＰＶＶＩ:配列番号２３）、および５９６～６４０（ＥＤＮＥＩＬＬＧＮＨＲＴＥＥＣＱＬＰＳＬＫＩＦＩＡＧＮＳＡＹＥＹＶＤＹＬＦＫＲＭＩＤＬＳＳ:配列番号２４）の間にエピトープが存在することが判明した（図９および１０）。尚、抗原とするＨＣＭＶ ＡＤ１６９株のｇＢのアミノ酸配列は、アクセッション番号Ｐ０６４７３の配列を参照し開始コドンのメチオニンから順に番号をつけて表記した。
　更に、ＥＶ２０３８については、ペプチドアレイで更に詳細なエピトープを決定した。アミノ酸残基５４８～６４１の範囲で１２残基のペプチドを４残基ずつずらして２６種のペプチドを合成した（表５）。各ペプチドはＣ末端を誘導体化セルロース膜の表面に結合し、３．７ｍｍ×３．７ｍｍの個別スポットとして固相合成した（SPOTs法、Sigma Genosys)。ＥＶ２０３８が結合するペプチドの決定は標準的なドットブロット分析で行った。ＥＶ２０３８はペプチド番号３、７、８、２１、および２２に結合し（図１０）、エピトープはアミノ酸残基５４９～５６０　(ＳＣＶＴＩＮＱＴＳＶＫＶ:配列番号２５)、アミノ酸残基５６９～５７６　(ＳＰＧＲＣＹＳＲ：配列番号２６)、アミノ酸残基６２５～６３２　(ＹＥＹＶＤＹＬＦ：配列番号２７)と決定した。
ところで、ＡＤ１領域を認識する抗体としては、ＩＴＣ５２等でアミノ酸残基５７０～５７９及びアミノ酸残基６０６～６１９の不連続エピトープを認識すること(WO93／21952　およびJ.Virol, 67; p703-710(1993))が報告されているが、少なくともアミノ酸残基５６９～５７６ (ＳＰＧＲＣＹＳＲ：配列番号２６)を除いた２つのエピトープ配列部分は、過去のＡＤ１抗体における報告では認められず、ＥＶ２０３８はこれまでに報告されているＡＤ１抗体とは異なる不連続配列を認識する抗体であることが示された（図１０）。
　ところで、ＡＤ１領域を認識する抗体としては、ＩＴＣ５２等でアミノ酸残基５７０～５７９及びアミノ酸残基６０６～６１９の不連続エピトープを認識すること(WO93／21952　およびJ.Virol, 67; p703-710(1993))が報告されているが、少なくともアミノ酸残基５６９～５７６ (ＳＰＧＲＣＹＳＲ：配列番号２６)を除いた２つのエピトープ配列部分は、過去のＡＤ１抗体における報告では認められず、ＥＶ２０３８はこれまでに報告されているＡＤ１抗体とは異なる不連続配列を認識する抗体であることが示された（図１０）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
実施例９．中和活性評価
（１）免疫染色法
　抗ＨＣＭＶ抗体（ＥＶ２０３８）の有効性評価として中和活性を確認した。中和活性はヒト胎児肺由来正常繊維芽細胞（ＭＲＣ―５：理研BRC No.RCB0211）に対するＨＣＭＶ（ＡＤ１６９株）感染の抗体による阻止率で評価した。方法はＡｂａｉら（Journal of Immunological Methods 322 2007 82-93）に倣った。要約すると以下の通りである。ウイルス液と精製抗体に補体（５％）を加えて１時間おき、その後、ＭＲＣ－５細胞に接種（３７℃、１時間）した。細胞は２回洗浄し、２０時間培養した後、ＨＣＭＶの前早期タンパク質であるＩＥ１を免疫蛍光染色により検出した。ＨＣＭＶ感染細胞の計測は画像解析ソフトＩｍａｇｅ Ｊ　（http://rsbweb.nih.gov/ij/）で行なった。
　図１１は、抗ＨＣＭＶ抗体の中和活性を評価した結果である。陰性コントロールとしては、ＨＣＭＶに特異性を有しないヒトモノクローナル抗体(ｈＩｇＧ)を、陽性コントロールはＨＣＭＶの中和エピトープの一つであるｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｈ (ｇＨ) に結合するマウスモノクローナル抗体（clone name ＨＣＭＶ１６, AbD serotec : 2470-5437）を使用した。それぞれの抗体のＨＣＭＶ感染阻止率を、同濃度のｈＩｇＧを加えた場合の感染阻止率に対するパーセントで表示した。補体を加えた場合の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）はＥＶ２０３８が０．５８μｇ／ｍＬで、ＥＶ２００１より低濃度で有効な中和活性を有することを確認した。また、補体を加えない場合ＥＶ２００１では有効な中和活性を確認できないのに対して、ＥＶ２０３８のＩＣ５０は０．５７μｇ／ｍＬと、補体存在下と同等の中和活性を有することを確認した（表６）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
（２）プラーク法
　前記評価で高い中和活性を示したＥＶ２０３８について、更に、プラーク法（Masuho, Y. et al., J. Gen. Virol., 1987; 68: p1457-1461）での感染阻止活性を評価した。ウイルス株としてはＨＣＭＶ実験室株として代表されるＡＤ１６９、Ｔｏｗｎｅ、Ｄａｖｉｓ、Ｍｅｒｌｉｎ株およびＨＣＭＶ臨床分離株であるＴ-１３７,ＭＤＵ-１を使用した。方法を要約すると以下の通りである。５０～１００ＰＦＵのウイルス液と段階希釈した所定の濃度の精製抗体を混和し、３７℃、１時間インキュベーションした後、４８ウェルマイクロプレートで単層化した繊維芽細胞（ＭＲＣ-５）または網膜色素上皮細胞（ＡＲＰＥ-１９）に接種した。接種後、３７℃、２時間インキュベーションした後、培養上清を除去し、２回洗浄した後、２％ ＦＣＳを含む通常培地で３７℃で培養した。ウイルス感染細胞の死による明瞭なプラークの形成が確認されるまで、実験室株で５～６日、臨床分離株で１０～１２日培養した後、５％ホルマリンを加えて細胞を固定し、０．０２５％クリスタルバイオレットで染色した。染色後、ウェルあたりのプラーク数を計数し、抗ＨＣＭＶ抗体の感染阻止率を算出した。
　表７は、プラーク法によりＥＶ２０３８の中和活性を評価した結果である。陰性コントロールにはＨＣＭＶに特異性を有しないヒトモノクローナル抗体(ｈＩｇＧ)を、陽性コントロールには米国において腎移植に伴うＨＣＭＶ感染症の発症予防適応で承認されている抗ＣＭＶ高力価免疫グロブリン製剤ＣｙｔｏＧａｍ（CSL Behring, CytoGam Cytomegalovirus immune globulin intravenous, Prescribing information. (Revised July 2008)）を使用した。
　ＨＣＭＶは繊維芽細胞に対する感染様式と上皮細胞および内皮細胞に対する感染様式で侵入機構が異なることが報告されており（Sinzger, C. et al., Curr Top Microbiol Immunol., 2008; 325: p63-83）、ＡＤ１６９株およびＴｏｗｎｅ 株に代表される実験室株の多くは繊維芽細胞で複数回の継代を経たことで、上皮細胞および内皮細胞への感染性を失っているとされている（Dai Wang, et al., J. Virol., 2005; 79: p10330-10338）。一方で、本来ＨＣＭＶは体内において広汎な組織および細胞種に感染性を有しており（Sinzger, C. et al., Curr Top Microbiol Immunol., 2008; 325: p63-83）、抗ＨＣＭＶ抗体が臨床効果を示す上では、繊維芽細胞型および上皮細胞・内皮細胞型のいずれのタイプが感染宿主細胞となっても、有効な中和活性を有することが重要であると考えられる。
　本発明の抗ＨＣＭＶ抗体（ＥＶ２０３８）は、実験室株の繊維芽細胞への感染においてＩＣ５０で０．０１２- ０．０３７μｇ／ｍＬを示すことを確認した。また、上皮細胞・内皮細胞への感染性を保存する臨床分離株（ＭＤＵ-１）の繊維芽細胞への感染においてはＩＣ５０が０．０４４μｇ／ｍＬであるのに対して、上皮細胞への感染においても０．０４０μｇ／ｍＬと、繊維芽細胞型および上皮細胞・内皮細胞型のいずれの細胞種においても同等の優れた中和活性を有することを確認した。また、ＥＶ２０３８は、市販されている抗ＣＭＶ高力価免疫グロブリン製剤ＣｙｔｏＧａｍに比べてもＡＤ１６９株に対して約２０００倍も高活性であり、かつ臨床開発が行われた実績があるＣ２３に対しても文献値（Masuho, Y. et al., J. Gen. Virol., 1987; 68: p1457-1461）より約２０倍高活性であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
実施例１０．ＥＶ２０３８バリアント抗体の中和活性評価
　ＥＶ２０３８のバリアントの中から置換部位の異なる２種類のバリアントを選択し中和活性を確認した。１つは、非保存的アミノ酸置換はでＡＤ１結合活性が認められなかった１２４番目のイソロイシン部分（ＣＤＲ－Ｈ３のループ構造の上部部分）のアミノ酸の置換体で、その部位の保存的アミノ酸置換体Ｉ１２４Ｖを用いた。他は、非保存的アミノ酸置換においてもオリジナルと同等のＡＤ１結合活性が認められた１３２番目（ＣＤＲ－Ｈ３のループ構造の根元部分）の非保存的アミノ酸置換体Ｖ１３２Ｋである。方法は前述のＡｂａｉら（Journal of Immunological Methods 322 2007 82-93）に倣った。　陰性コントロールとしてはＨＣＭＶに特異性のないヒトモノクローナル抗体(ｈＩｇＧ)を、陽性コントロールとしてはＣＭＶの中和エピトープの一つであるｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｈ (ｇＨ) に結合するマウスモノクローナル抗体（clone name ＨＣＭＶ１６, AbD serotec : 2470-5437）を使用した。それぞれの抗体のＨＣＭＶ感染阻止率を、同濃度のｈＩｇＧを加えた場合の感染阻止率に対するパーセントで求めた。５０％阻害濃度（ＩＣ５０）はＩ１２４Ｖが０．４５μｇ／ｍＬ、Ｖ１３２Ｋが１．２０μｇ／ｍＬと、いずれもＥＶ２０３８とほぼ同等の活性が認められた。
実施例１１．細胞間感染阻止能の評価
　さらに、ＥＶ２０３８の有効性評価の一つとして、ＨＣＭＶに感染したヒト胎児肺由来正常線維芽細胞(ＭＲＣ-５)を用いて、ＥＶ２０３８の細胞間感染阻止活性について評価した。評価方法はNavarroら(Virology. 1993; 197: p143-158)の方法に準じた。具体的には、ＨＣＭＶ（ＡＤ１６９) を感染させて２４時間経過したＭＲＣ－５を用い、抗体を１０ mｇ/ｍＬ（約６７ｎＭ）からの４倍希釈系列で加えた。細胞は感染６日後に固定し、感染早期発現タンパク質であるＩＥ１を免疫染色により検出した。ＨＣＭＶ感染細胞の計測は画像解析ソフトＩｍａｇｅＪで行なった。その結果、抗ＡＤ１抗体であるＥＶ２０３８を感染後の細胞に添加することによって、ウイルスの細胞間感染を顕著に阻害することが明らかとなった（表８）。
　尚、表中　(1)＋＋＋は、１００－７５％の阻害、(2)＋＋は、７５-５０％の阻害、(3)＋は、５０-２５％の阻害、(4)±は、２５－０％の阻害を示し、(5)－は、感染拡大阻害効果が認められなかったことを意味する。
　Ｎａｖａｒｒｏら(Virology. 1993; 197: p143-158)の報告では、最も高活性の抗体（ＣＨ１７７－３，およびＣＨ２４４－４など）で１０ mｇ/ｍＬの濃度で１００－７５％の阻害を示す例が示されているたが、ＥＶ２０３８では、１０～０．６３μｇ／ｍＬの濃度範囲において１００－７５％の細胞感染阻害が認められ、更に０．１６μｇ／ｍＬ（１．０７ｎＭ）でも７５－５０％の細胞間感染阻害効果が認められた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　以上の性質より、本発明に係る抗ＨＣＭＶ抗体またはその抗原結合性断片は、ＨＣＭＶが原因となって引き起こされる様々な疾病、例えば、免疫不全患者における間質性肺炎、網膜炎、胃腸炎、脳炎などの病気や、新生児や乳児期においてＨＣＭＶ感染により発症する肝機能異常、間質性肺炎、単核症などの予防乃至治療薬として、新たな切り口をもたらすものであると考えられる。
　上述のとおり、本発明を特定の態様について特記したが、これらの態様はもっぱら説明上のものであって制約的なものではない。本発明の範囲は、特許請求の範囲の要件内のあらゆる変化、変形をなし得るものであり、これらは本発明の技術的範囲内に属するものである。
　本発明の抗HCMV抗体、およびその抗体を含む医薬組成物は、ＨＣＭＶが原因となって引き起こされる様々な疾病、例えば、（ａ）エイズ、癌、臓器移植後、骨髄移植後、血液透析後などの免疫不全状態におけるＨＣＭＶの再活性化による間質性肺炎、網膜炎、胃腸炎、脳炎などの病気や、（ｂ）妊婦から胎児へＨＣＭＶ感染が波及することによる先天性ＣＭＶ感染症、（ｃ）前記先天性ＣＭＶ感染症により引き起こされる流産、死産、生後間もない死亡、（ｄ）前記先天性ＣＭＶ感染症により死亡しない場合における低出生体重、肝脾腫、黄疸、血小板減少性紫斑病、小頭症、精神発育障害、知能発達遅延、脈絡網膜炎や聴覚障害、（ｅ）新生児や乳児期におけるＨＣＭＶ感染により発症する肝機能異常、間質性肺炎、単核症などの予防乃至治療薬としても期待できる。

Claims (20)

  1. 　ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）ｇＢ糖タンパク質のＡＤ1領域に結合する抗体もしくはその抗原結合性断片であって、ＡＤ1領域に存在する配列番号２５のアミノ酸配列、配列番号２６のアミノ酸配列、および配列番号２７のアミノ酸配列から成る不連続配列をエピトープとして認識する、抗体もしくはその抗原結合性断片。
  2. 　ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）ｇＢ糖タンパク質のＡＤ１領域に特異的に結合し、その生物活性を中和し得るモノクローナル抗体であって、
    （ｉ）重鎖の可変領域が、
    　　(a)配列番号１３のアミノ酸配列、および配列番号１３のアミノ酸配列中１～数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加、またはこれらのいずれか２つ以上の組み合わせの変異を有するアミノ酸配列からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、
    　　(b) 配列番号１４のアミノ酸配列、および配列番号１４のアミノ酸配列中１～数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加、またはこれらのいずれか２つ以上の組み合わせの変異を有するアミノ酸配列からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、および、
    　　(c)配列番号１５のアミノ酸配列、配列番号１５のアミノ酸配列中１～数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加、またはこれらのいずれか２つ以上の組み合わせの変異を有するアミノ酸配列、および配列番号２２で示されるアミノ酸配列からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに
    （ｉｉ）軽鎖の可変領域が、
    　　(a)配列番号１６のアミノ酸配列、および配列番号１６のアミノ酸配列中１～数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加、またはこれらのいずれか２つ以上の組み合わせの変異を有するアミノ酸配列からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、
    　　(b) 配列番号１７のアミノ酸配列、および配列番号１７のアミノ酸配列中１～数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加、またはこれらのいずれか２つ以上の組み合わせの変異を有するアミノ酸配列からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、および、
    　　(c)配列番号１８のアミノ酸配列、および配列番号１８のアミノ酸配列中１～数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加、またはこれらのいずれか２つ以上の組み合わせの変異を有するアミノ酸配列からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列、
    を含有する抗体もしくはその抗原結合性断片。
  3. 　請求項２に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片であって、ＨＣＭＶ-ｇＢ糖タンパク質の５４９～５８０位の連続するアミノ酸残基からなるアミノ酸配列（配列番号２３）および５９６～６４０位の連続するアミノ酸残基からなるアミノ酸配列（配列番号２４）の領域に存在する２以上の不連続配列から成るエピトープに特異的に結合する、抗体もしくはその抗原結合性断片。
  4. 　請求項２に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片であって、ＨＣＭＶ-ｇＢ糖タンパク質のＡＤ1領域にある配列番号２５のアミノ酸配列、配列番号２６のアミノ酸配列、および配列番号２７のアミノ酸配列から成る不連続配列をエピトープとして認識する、抗体もしくはその抗原結合性断片。
  5. 　請求項３または４に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片であって、
    （ｉ）
    　　(a)配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、
    　　(b)配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、および、
    　(c)配列番号２２のアミノ酸配列からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに
    （ｉｉ）
    　　(a)配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、
    　　(b)配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、および、
    　　(c)配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列、
    を含有する抗体もしくはその抗原結合性断片。
  6. 　請求項５に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片であって、
    （ｉ）
    　　(a)配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、
    　　(b)配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、および、
    　　(c)配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに
    （ｉｉ）
    　　(a)配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、
    　　(b)配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、および、
    　　(c)配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列、
    を含有する、抗体もしくはその抗原結合性断片。
  7. 　請求項２に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片であって、
    　(a) 配列番号１０のアミノ酸配列、配列番号１０のアミノ酸配列中１～数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加、もしくはこれらのいずれか２つ以上の組み合わせの変異を有するアミノ酸配列、または配列番号１０のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、ならびに
    　(b) 配列番号１２のアミノ酸配列、配列番号１２のアミノ酸配列中１～数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加、もしくはこれらのいずれか２つ以上の組み合わせの変異を有するアミノ酸配列、または配列番号１２のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含有する、抗体もしくはその抗原結合性断片。
  8. 　請求項７に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片であって、
    (a)配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、および
    (b) 配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含有する、抗体もしくはその抗原結合性断片。
  9. 　請求項２に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片であって、
    　(a) 配列番号２もしくは６のアミノ酸配列、配列番号２もしくは６のアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加、もしくはこれらのいずれか２つ以上の組み合わせの変異を有するアミノ酸配列、または配列番号２もしくは６のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列で示される重鎖（Ｈ鎖）、ならびに
    　(b) 配列番号４もしくは８のアミノ酸配列、配列番号４もしくは８のアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加、もしくはこれらのいずれか２つ以上の組み合わせの変異を有するアミノ酸配列、または配列番号４もしくは８のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列で示される軽鎖（Ｌ鎖）を含有する、抗体もしくはその抗原結合性断片；
  10. 　請求項９に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片であって、
    (a)配列番号２または６のアミノ酸配列を含む重鎖（Ｈ鎖）、および
    (b)配列番号４または８のアミノ酸配列を含む軽鎖（Ｌ鎖）を含有する、抗体もしくはその抗原結合性断片。
  11. 　前記抗体がヒトモノクローナル抗体である、請求項１～１０のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
  12. 　前記抗体のクラス（サブクラス）がＩｇＧ１（λ）である、請求項１～１１のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
  13. 　ＨＣＭＶの実験室株（ＡＤ１６９）に対するヒト繊維芽細胞下での５０％プラーク形成阻止濃度が０．０５μｇ／ｍＬ（約０．３nＭ）以下である請求項１～１２のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
  14. 　ヒト繊維芽細胞（ＭＲＣ－５）にあらかじめＨＣＭＶの実験室株(ＡＤ１６９)を感染させた系で、０．２μｇ／ｍＬ（約１．３ｎＭ）以下で５０%以上の細胞間感染阻止能を有する請求項１～１３のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
  15. 　請求項１～１４のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片および薬学的に許容可能な担体を含む、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）が関与する疾患を予防または治療するための医薬組成物。
  16. 　ＨＣＭＶが関与する疾患が、（ａ）免疫不全状態におけるＨＣＭＶの再活性化による間質性肺炎、網膜炎、胃腸炎、もしくは脳炎、（ｂ）妊婦から胎児へＨＣＭＶ感染が波及することによる先天性ＣＭＶ感染症、（ｃ）前記先天性ＣＭＶ感染症により引き起こされる流産、死産、生後間もない死亡、（ｄ）前記先天性ＣＭＶ感染症により死亡しない場合における低出生体重、肝脾腫、黄疸、血小板減少性紫斑病、小頭症、精神発育障害、知能発達遅延、脈絡網膜炎、もしくは聴覚障害、または（ｅ）新生児もしくは乳児期におけるＨＣＭＶ感染により発症する肝機能異常、間質性肺炎、もしくは単核症である、請求項１５に記載の医薬組成物。
  17. 　ＨＣＭＶｇＢ糖タンパク質のＡＤ1領域に特異的に結合し、その生物活性を中和し得る抗ＨＣＭＶモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片をコードする核酸であって、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１３～１８、および２２からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸、および該核酸と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸から選択される単離された核酸。
  18. 　請求項１７に記載の核酸を組込んだベクター。
  19. 　請求項１８に記載のベクターが導入された宿主細胞。
  20. 　請求項１９に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、請求項１～１４のいずれかに記載の抗体または抗原結合性断片の作製方法。
     
PCT/JP2010/056037 2009-04-01 2010-04-01 ヒトサイトメガロウイルスｇＢ糖タンパク質のＡＤ１領域に存在する特定の不連続エピトープに結合するモノクローナル抗体ならびにその抗原結合性断片 WO2010114106A1 (ja)

Priority Applications (15)

Application Number Priority Date Filing Date Title
MX2011010382A MX2011010382A (es) 2009-04-01 2010-04-01 Anticuerpo monoclonal capaz de unirse a epitopo discontinuo especifico que ocurre en la region ad1 de la glicoproteina gb de citomegalovirus humano y fragmento de union a antigeno del mismo.
ES10758877.4T ES2539751T3 (es) 2009-04-01 2010-04-01 Anticuerpo monoclonal capaz de unirse con epítopo discontinuo específico que aparece en la región AD1 de la glucoproteína gB de citomegalovirus humano, y fragmento de unión a antígeno del mismo
RU2011144113/10A RU2542472C2 (ru) 2009-04-01 2010-04-01 Моноклональное антитело, способное связываться со специфическим прерывистым эпитопом, расположенным в области ad1 гликопротеина gb цитомегаловируса человека, и его антигенсвязывающий фрагмент
BRPI1013648-7A BRPI1013648B1 (pt) 2009-04-01 2010-04-01 Anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno, composição farmacêutica e método para produção do anticorpo ou o fragmento de ligação de antígeno
AU2010232202A AU2010232202B2 (en) 2009-04-01 2010-04-01 Monoclonal antibody capable of binding to specific discontinuous epitope occurring in AD1 region of human cytomegalovirus gB glycoprotein, and antigen-binding fragment thereof
DK10758877.4T DK2420572T3 (en) 2009-04-01 2010-04-01 MONOCLONAL ANTIBODY THAT CAN BIND TO SPECIFIC discontinuous EPITOPE, OCCURRING IN AD 1 REGION OF HUMAN cytomegalovirus GB-glycoprotein AND ANTIBODY-binding fragment thereof.
SI201030942T SI2420572T1 (sl) 2009-04-01 2010-04-01 Monoklonsko protitelo, ki je sposobno vezave na specifični diskontinuirani epitop, ki se pojavi pri regiji ad1 glikoproteina gb človeškega citomegalovirusa, in njegov antigen-vezavni fragment
US13/262,061 US8492529B2 (en) 2009-04-01 2010-04-01 Monoclonal antibody capable of binding to specific discontinuous epitope occurring in AD1 region of human cytomegalovirus GB glycoprotein, and antigen-binding fragment thereof
EP10758877.4A EP2420572B1 (en) 2009-04-01 2010-04-01 Monoclonal antibody capable of binding to specific discontinuous epitope occurring in ad1 region of human cytomegalovirus gb glycoprotein, and antigen-binding fragment thereof
JP2011507298A JP4981192B2 (ja) 2009-04-01 2010-04-01 ヒトサイトメガロウイルスｇＢ糖タンパク質のＡＤ１領域に存在する特定の不連続エピトープに結合するモノクローナル抗体ならびにその抗原結合性断片
KR1020117025880A KR101390015B1 (ko) 2009-04-01 2010-04-01 인간 사이토메갈로바이러스 ｇＢ 당단백질의 ＡＤ1 영역에 존재하는 특정한 불연속 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체 및 그의 항원 결합성 단편
CN2010800149887A CN102378814B (zh) 2009-04-01 2010-04-01 与存在于人巨细胞病毒gB糖蛋白的AD1区域的特定的不连续表位结合的单克隆抗体及其抗原结合片段
CA2756889A CA2756889C (en) 2009-04-01 2010-04-01 Monoclonal antibody capable of binding to specific discontinuous epitope occurring in ad1 region of human cytomegalovirus gb glycoprotein, and antigen-binding fragment thereof
IL215439A IL215439A (en) 2009-04-01 2011-09-27 A monoclonal antibody that can bind to a specific non-continuous epitope located in the 1ad region of human cytomegalovirus gb glycoprotein and its antigen-binding site
HRP20150623TT HRP20150623T1 (hr) 2009-04-01 2015-06-10 Monoklonalno protutijelo sposobno za vezivanje na specifiäśni diskontinuirani epitop koji se pojavljuje u podruäśju ad1 od humanog glikoproteina citomegalovirusa gb, te njegov fragment koji se veže na antigen

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2009-089442 2009-04-01
JP2009089442 2009-04-01

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2010114106A1 true WO2010114106A1 (ja) 2010-10-07

Family

ID=42828394

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2010/056037 WO2010114106A1 (ja) 2009-04-01 2010-04-01 ヒトサイトメガロウイルスｇＢ糖タンパク質のＡＤ１領域に存在する特定の不連続エピトープに結合するモノクローナル抗体ならびにその抗原結合性断片
PCT/JP2010/056033 WO2010114105A1 (ja) 2009-04-01 2010-04-01 ヒトサイトメガロウイルスｇＢ糖タンパク質のＡＤ２領域に結合するモノクローナル抗体ならびにその抗原結合性断片

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2010/056033 WO2010114105A1 (ja) 2009-04-01 2010-04-01 ヒトサイトメガロウイルスｇＢ糖タンパク質のＡＤ２領域に結合するモノクローナル抗体ならびにその抗原結合性断片

Country Status (16)

Country Link
US (1) US8492529B2 (ja)
EP (1) EP2420572B1 (ja)
JP (1) JP4981192B2 (ja)
KR (1) KR101390015B1 (ja)
CN (1) CN102378814B (ja)
AU (1) AU2010232202B2 (ja)
BR (1) BRPI1013648B1 (ja)
CA (1) CA2756889C (ja)
DK (1) DK2420572T3 (ja)
ES (1) ES2539751T3 (ja)
HR (1) HRP20150623T1 (ja)
IL (1) IL215439A (ja)
MX (1) MX2011010382A (ja)
RU (1) RU2542472C2 (ja)
SI (1) SI2420572T1 (ja)
WO (2) WO2010114106A1 (ja)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011076883A1 (en) 2009-12-23 2011-06-30 4-Antibody Ag Binding members for human cytomegalovirus
US10611800B2 (en) 2016-03-11 2020-04-07 Pfizer Inc. Human cytomegalovirus gB polypeptide
RU2738001C1 (ru) * 2020-03-23 2020-12-07 Борис Сергеевич Першин Способ определения риска развития цитомегаловирусного (ЦМВ) ретинита после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток
WO2021110126A1 (zh) 2019-12-04 2021-06-10 珠海泰诺麦博生物技术有限公司 抗人巨细胞病毒抗体及其用途
US11629172B2 (en) 2018-12-21 2023-04-18 Pfizer Inc. Human cytomegalovirus gB polypeptide
US11857622B2 (en) 2020-06-21 2024-01-02 Pfizer Inc. Human cytomegalovirus GB polypeptide

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012149197A2 (en) 2011-04-27 2012-11-01 Abbott Laboratories Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins
US9067990B2 (en) 2013-03-14 2015-06-30 Abbvie, Inc. Protein purification using displacement chromatography
US9181572B2 (en) 2012-04-20 2015-11-10 Abbvie, Inc. Methods to modulate lysine variant distribution
WO2013158279A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Abbvie Inc. Protein purification methods to reduce acidic species
WO2013177118A2 (en) * 2012-05-21 2013-11-28 Abbvie Inc. Novel purification of non-human antibodies using protein a affinity chromatography
US20140154270A1 (en) * 2012-05-21 2014-06-05 Chen Wang Purification of non-human antibodies using kosmotropic salt enhanced protein a affinity chromatography
US9512214B2 (en) 2012-09-02 2016-12-06 Abbvie, Inc. Methods to control protein heterogeneity
WO2014061783A1 (ja) 2012-10-19 2014-04-24 株式会社イーベック クロストリジウム・ディフィシルの毒素に特異的なヒト抗体もしくはその抗原結合性断片
EP2830651A4 (en) 2013-03-12 2015-09-02 Abbvie Inc HUMAN ANTIBODIES THAT BIND TNF-ALPHA AND PREPARATION METHODS
WO2014151878A2 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Abbvie Inc. Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using monosaccharides and oligosacharides
US9017687B1 (en) 2013-10-18 2015-04-28 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same using displacement chromatography
US9598667B2 (en) 2013-10-04 2017-03-21 Abbvie Inc. Use of metal ions for modulation of protein glycosylation profiles of recombinant proteins
US9085618B2 (en) 2013-10-18 2015-07-21 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same
US9181337B2 (en) 2013-10-18 2015-11-10 Abbvie, Inc. Modulated lysine variant species compositions and methods for producing and using the same
US20150139988A1 (en) 2013-11-15 2015-05-21 Abbvie, Inc. Glycoengineered binding protein compositions
WO2023039242A2 (en) * 2021-09-13 2023-03-16 Achelois Biopharma, Inc. Multivalent interferon particles compositions and methods of use
CN114853886B (zh) * 2022-05-23 2023-11-28 南昌大学 一种高亲和力抗人巨细胞病毒的全人源单克隆抗体及其用途
CN116162154B (zh) * 2022-10-21 2024-06-11 珠海泰诺麦博制药股份有限公司 抗人巨细胞病毒抗体及其用途

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1987003602A1 (en) 1985-12-06 1987-06-18 Teijin Limited Anticytomegaloviral human monoclonal antibody and process for its preparation
WO1993021952A1 (en) 1992-04-23 1993-11-11 Bioinvent International Ab Human monoclonal antibodies against cytomegalovirus and method for preparation thereof
JPH08502403A (ja) 1992-10-15 1996-03-19 スコットゲン リミティド 組換ヒト型サイトメガロウィルス抗体
JPH08506325A (ja) 1993-01-28 1996-07-09 サンド ファーマスーティカル コーポレーション サイトメガロウイルスに対するヒトモノクローナル抗体
WO2007094423A1 (ja) 2006-02-15 2007-08-23 Evec Incorporated ヒトサイトメガロウイルスに結合するヒトのモノクローナル抗体並びにその抗原結合部分

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5750106A (en) 1993-01-28 1998-05-12 Novartis Ag Human monoclonal antibodies to cytomegalovirus
JPH0859509A (ja) * 1994-08-16 1996-03-05 Teijin Ltd サイトメガロウイルス抗原血症治療剤およびサイトメガロウイルス感染症治療剤
AUPR593101A0 (en) * 2001-06-26 2001-07-19 Council Of The Queensland Institute Of Medical Research, The Cytomegalovirus t cell epitopes
RU2239453C2 (ru) * 2002-12-03 2004-11-10 Федеральное государственное унитарное предприятие " Научно-производственное объединение по медицинским иммунобиологическим препаратам " Микроген" Препарат иммуноглобулина человека против цитомегаловируса и способ его получения
AU2006322445B2 (en) * 2005-12-05 2011-05-12 Symphogen A/S Anti-orthopoxvirus recombinant polyclonal antibody
GB0700133D0 (en) 2007-01-04 2007-02-14 Humabs Llc Human cytomegalovirus neutralising antibodies and use thereof
WO2009003975A1 (en) 2007-07-04 2009-01-08 Ribovax Biotechnologies Sa Antibodies against human cytomegalovirus (hcmv)
EP2190876A1 (en) 2007-08-22 2010-06-02 Ribovax Biotechnologies SA Antibodies against human cytomegalovirus (hcmv)

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1987003602A1 (en) 1985-12-06 1987-06-18 Teijin Limited Anticytomegaloviral human monoclonal antibody and process for its preparation
WO1993021952A1 (en) 1992-04-23 1993-11-11 Bioinvent International Ab Human monoclonal antibodies against cytomegalovirus and method for preparation thereof
JPH08502403A (ja) 1992-10-15 1996-03-19 スコットゲン リミティド 組換ヒト型サイトメガロウィルス抗体
JPH08506325A (ja) 1993-01-28 1996-07-09 サンド ファーマスーティカル コーポレーション サイトメガロウイルスに対するヒトモノクローナル抗体
WO2007094423A1 (ja) 2006-02-15 2007-08-23 Evec Incorporated ヒトサイトメガロウイルスに結合するヒトのモノクローナル抗体並びにその抗原結合部分

Non-Patent Citations (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"CSL Behring, CytoGam Cytomegalovirus immune globulin intravenous", PRESCRIBING INFORMATION, July 2008 (2008-07-01)
"Curr Protoc Immunol.", May 2001
"Package insert for anti-cytomegalovirus chemotherapeutic agent, Denosine for intravenous infusion, 500 mg, ganciclovir formulation", October 2007, MITSUBISHI TANABE PHARMA
"Package insert for anti-cytomegalovirus chemotherapeutic agent, Valixa tablet (4500 mg), valganciclovir hydrochloride formulation", October 2007, MITSUBISHI TANABE PHARMA
"Package insert for antiviral agent for drip injection, Foscavir, 24 mg/mL, foscarnet sodium hydrate injection", June 2007, ASTRAZENECA
ABAI ET AL., JOURNAL OF IMMUNOLOGICAL METHODS, vol. 322, 2007, pages 82 - 93
ALTSCHUL SF ET AL., J MOL BIOL, vol. 215, 1990, pages 403
BRITT, W.J. ET AL.: "Antigenic domain is required for oligomerization of human cytomegalovirus glycoprotein B", J.VIROL., vol. 79, 2005, pages 4066 - 4079
DAI WANG ET AL., J. VIROL., vol. 79, 2005, pages L0330 - 10338
DAVISON, A.J. ET AL.: "The human cytomegalovirus genome revisited: comparison with the chimpanzee cytomegalovirus genome", J. GEN. VIROL., vol. 84, 2003, pages L7 - 28
DEMMLER, G.J.: "Congential cytomegalovirus infection and disease. Seminars in Pediatric Infection Diseases", SEMINARS IN PEDIATRIC INFECTIOUS DISEASES, vol. 10, 1999, pages 195 - 200
DOLAN, A. ET AL.: "Genetic content of wild-type human cytomegalovirus", J. GEN. VIROL., vol. 85, 2004, pages 130I - 1312
FREITAS,VR. ET AL.: "Activity of 9-(1,3-dihydroxy-2-Propoxymethel)guanine compared with that of acyclovir against human, monkey, and rodent cytomegaloviruses", ANTI. AGENT CHEMO., vol. 28, 1985, pages 240 - 245
GRIFFITHS, P.D.: "The treatment of cytomegalovirus infection", J. ANTI. CHEMO., vol. 49, 2002, pages 243 - 253
ISAACSON, M.K. ET AL.: "Human cytomegalovirus glycoprotein B is required for virus entry and cell-to-cell spread but not for virion attachment, assembly, or egress", J.VIROLOGY, vol. 83, 2009, pages 3891 - 3903
J. GEN. VIROL., vol. 73, 1992, pages 2375 - 2383
J. VIROL., vol. 65, 1991, pages 138 - 146
J. VIROL., vol. 66, 1992, pages 5290 - 5297
J. VIROL., vol. 67, 1993, pages 703 - 710
J.SAMBROOK ET AL.: "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 1989, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS, article "Conditions for Hybridization of Oligonucleotide Probes"
J.VIROL, vol. 67, 1993, pages 703 - 710
KANDA S. ET AL., GLYCOBIOLOGY, vol. 17, 2007, pages 104 - 118
KARLIN, ALTSCHUL, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 87, 1990, pages 2264 - 2268
KEIKO TAYA: "Discussion of Infection: Cytomegalovirus infection", INFECTIOUS DISEASES WEEKLY REPORT JAPAN, vol. 15, 2003, pages 10 - 14
KIMBERLIN,D. W ET AL.: "Effect of ganciclovir therapy on hearing in symptomatic congental cytomegalovirus disease involving the central nervous system; randomized, controlled trial", J. PEDIATR., vol. 143, 2003, pages 16 - 25
KNIESS, N. ET AL.: "Distribution of linear antigenic sites on glycoprotein gp55 of human cytomegalovirus", JOURNAL OF VIROLOGY, vol. 65, no. 1, 1991, pages 138 - 46, XP008153627 *
MASUHO, Y ET AL., J. GEN. VIROL., vol. 68, 1987, pages 1457 - 1461
MASUHO, Y. ET AL., J. GEN. VIROL., vol. 68, 1987, pages L457 - 1461
MASUHO,T.: "Human monoclonal antibodies neutralizing human cytomegalovirus", J.GEN.VIROL, vol. 68, 1987, pages L457 - 1461
NATURE, vol. 312, 1984, pages 643
NATURE, vol. 321, 1986, pages 522
NAVARRO ET AL., VIROLOGY, vol. 197, 1993, pages L43 - 158
NAVARRO, D. ET AL.: "Glycoprotein B of human cytomegalovirus promotes virion penetration into cells, transmission of infection from cell to cell, and fusion of infected cells", VIROLOGY, vol. 197, 1993, pages L43 - 158
NAVARRO, D. ET AL.: "Glycoprotein B of human Cytomegalovirus promotes virion penetration into cells, transmission of infection from cell to cell, and fusion of infected cells", VIROLOGY, vol. 197, no. 1, 1993, pages 143 - 158, XP003017135 *
NIWA R. ET AL., CLIN.CANCER RES., vol. 10, 2004, pages 6248 - 6255
OHIZUMI, Y. ET AL.: "Neutralizing mechanisms of two human monoclonal antibodies against human cytomegalovirus glycoprotein 130/55", JOURNAL OF GENERAL VIROLOGY, vol. 73, no. 10, 1992, pages 2705 - 2707, XP008154082 *
OHIZUMI, Y.: "Neutralizing mechanism of two human monoclonal antibodies against human cytomegalovirus glycoprotein 130/55", J. GEN. VIROL., vol. 73, 1992, pages 2705 - 2707
OHLIN, M. ET AL.: "Fine specificity of the human immune response to the major neutralization epitopes expressed on cytomegalovirus gp58/116 (gB), as determined with human monoclonal antibodies", JOURNAL OF VIROLOGY, vol. 67, no. 2, 1993, pages 703 - 710, XP002544755 *
OMASA T., J. BIOSCI. BIOENG., vol. 94, 2002, pages 600 - 605
PROC NATL ACAD SCI USA, vol. 90, 1993, pages 5873
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 87, 1990, pages 2264 - 2268
QADRI, I. ET AL.: "Assembly of conformational-dependent neutralizing domains on glycoprotein B of human cytomegalovirus", J.GEN.VIROL, vol. 73, 1992, pages 2913 - 2921
RIECHMANN L ET AL.: "Reshaping human antibodies for therapy", NATURE, vol. 332, 1988, pages 323 - 327
SAMBROOK ET AL.: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Third Edition)", 2001, COLD SPRING HARBOUR LABORATORY PRESS
See also references of EP2420572A4
SINZGER, C. ET AL., CURR TOP MICROBIOL IMMUNOL., vol. 325, 2008, pages 63 - 83
SINZGER, C. ET AL., CURR TOP MICROBIOL TMMUNOL., vol. 325, 2008, pages 63 - 83
WAGNER ET AL., JOURNAL OF VIROLOGY, vol. 66, no. 9, September 1992 (1992-09-01), pages 5290 - 5297
WAGNER, B. ET AL.: "A continuous sequence of more than 70 amino acids is essential for antibody binding to the dominant antigenic site of glycoprotein gp58 of human cytomegalovirus", JOURNAL OF VIROLOGY, vol. 66, no. 9, 1992, pages 5290 - 5297, XP003017153 *
YASUGI, RYUITI, KOZEKI, HARUO, HURUYA, MASAKI, HIDAKA, TOSITAKA: "Iwanami Biological Dictionary", 1996

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011076883A1 (en) 2009-12-23 2011-06-30 4-Antibody Ag Binding members for human cytomegalovirus
US10611800B2 (en) 2016-03-11 2020-04-07 Pfizer Inc. Human cytomegalovirus gB polypeptide
US11629172B2 (en) 2018-12-21 2023-04-18 Pfizer Inc. Human cytomegalovirus gB polypeptide
WO2021110126A1 (zh) 2019-12-04 2021-06-10 珠海泰诺麦博生物技术有限公司 抗人巨细胞病毒抗体及其用途
JP2023505514A (ja) * 2019-12-04 2023-02-09 トリノマブ バイオテック カンパニー リミテッド 抗ヒトサイトメガロウイルス抗体及びその用途
JP7458484B2 (ja) 2019-12-04 2024-03-29 チューハイ トリノマブ ファーマシューティカル カンパニー リミテッド 抗ヒトサイトメガロウイルス抗体及びその用途
RU2738001C1 (ru) * 2020-03-23 2020-12-07 Борис Сергеевич Першин Способ определения риска развития цитомегаловирусного (ЦМВ) ретинита после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток
US11857622B2 (en) 2020-06-21 2024-01-02 Pfizer Inc. Human cytomegalovirus GB polypeptide

Also Published As

Publication number Publication date
US20120093810A1 (en) 2012-04-19
JPWO2010114106A1 (ja) 2012-10-11
CN102378814B (zh) 2013-06-12
HRP20150623T1 (hr) 2015-07-03
KR101390015B1 (ko) 2014-04-29
BRPI1013648A2 (pt) 2020-09-15
JP4981192B2 (ja) 2012-07-18
RU2011144113A (ru) 2013-05-10
EP2420572A1 (en) 2012-02-22
ES2539751T3 (es) 2015-07-03
BRPI1013648B1 (pt) 2023-05-09
IL215439A0 (en) 2011-12-29
RU2542472C2 (ru) 2015-02-20
EP2420572A4 (en) 2013-01-23
MX2011010382A (es) 2012-01-12
IL215439A (en) 2016-03-31
KR20120035142A (ko) 2012-04-13
CA2756889C (en) 2017-09-05
CA2756889A1 (en) 2010-10-07
AU2010232202B2 (en) 2013-08-29
US8492529B2 (en) 2013-07-23
DK2420572T3 (en) 2015-06-15
WO2010114105A1 (ja) 2010-10-07
SI2420572T1 (sl) 2015-10-30
CN102378814A (zh) 2012-03-14
AU2010232202A1 (en) 2011-10-27
EP2420572B1 (en) 2015-03-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4981192B2 (ja) ヒトサイトメガロウイルスｇＢ糖タンパク質のＡＤ１領域に存在する特定の不連続エピトープに結合するモノクローナル抗体ならびにその抗原結合性断片
US8153129B2 (en) Antibodies against human cytimegalovirus (HCMV)
WO2017059878A1 (en) Antibodies that potently neutralize hepatitis b virus and uses thereof
US10759847B2 (en) Antibodies that potently neutralize RSV and uses thereof
WO2009024445A1 (en) Antibodies against human cytomegalovirus (hcmv)
US20100074906A1 (en) Antibodies Specific for Varicella Zoster Virus
KR20220121820A (ko) 인간 사이토메갈로바이러스에 대한 항체 및 이의 용도
WO2014115893A1 (ja) ヒト・メタニューモウイルスに特異的なヒト抗体もしくはその抗原結合性断片
CN112778413A (zh) 抗水痘-带状疱疹病毒的抗体
JP2024509933A (ja) 抗水痘帯状疱疹ウイルスの抗体およびその使用
WO2010074218A1 (ja) 抗ヒトミッドカイン抗体
CN116162154B (zh) 抗人巨细胞病毒抗体及其用途
WO2022250107A1 (ja) ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２野生株および変異株に対するヒト中和抗体およびその抗原結合性断片
WO2023008463A1 (ja) ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２野生株および変異株に対する中和ヒト抗体およびその抗原結合性断片
Landolfo Gribaudo, Giorgio
NZ578413A (en) Antibodies against human cytomegalovirus (hcmv)

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 201080014988.7

Country of ref document: CN

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 10758877

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

DPE1 Request for preliminary examination filed after expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2756889

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2011507298

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: MX/A/2011/010382

Country of ref document: MX

Ref document number: 12011501974

Country of ref document: PH

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 7306/CHENP/2011

Country of ref document: IN

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2010758877

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2010232202

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20100401

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20117025880

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2011144113

Country of ref document: RU

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 13262061

Country of ref document: US

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: PI1013648

Country of ref document: BR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: PI1013648

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20110930