WO2010111892A1 - Angptl3作为卵巢癌的诊断标记物的用途 - Google Patents

Angptl3作为卵巢癌的诊断标记物的用途 Download PDF

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WO2010111892A1
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ovarian cancer
kit
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林标扬
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Zhejiang University ZJU
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57545—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer of the ovaries

Definitions

  • ANGPTL3 as a diagnostic marker for ovarian cancer
  • the invention belongs to the field of biomedical technology.
  • the present invention relates to a method for improving the accuracy of sample classification, and a kit for detecting ANGPTL3 protein in a sample. Background technique
  • Epithelial ovarian cancer ranks fifth among all causes of cancer death in women.
  • the incidence of ovarian malignancies in China is 2.4 - 5.6% in women with common malignant tumors. Its incidence is second only to cervical cancer in gynecological malignancies, ranking second. In recent years, its incidence has shown an upward trend.
  • ovarian cancer is the most common cause of death.
  • the American Cancer Society estimates that 21,650 new cases of ovarian cancer will be added in the United States in 2008, and approximately 15,520 patients will die from the disease (www.cancer.org).
  • EOC epithelial ovarian cancer
  • the present invention is based, in part, on the discovery that the ANGPTL3 content in the serum of ovarian cancer patients is significantly lower than the ANGPTL3 content in the serum of healthy subjects, and is statistically significant and can be used as a diagnostic marker for ovarian cancer.
  • Embodiment 1 A method of diagnosing ovarian cancer in a subject, comprising: detecting an ANGPTL3 content in a sample from a subject,
  • Whether the subject has ovarian cancer is determined based on the analysis result.
  • a method for improving the accuracy of sample classification including:
  • the samples are classified according to the analysis results.
  • Embodiment 3 A method for diagnosis, prognosis evaluation, therapeutic effect monitoring or course monitoring of ovarian cancer in a subject, comprising: detecting expression of ANGPTL3 in a blood sample of a subject.
  • a specific binding agent for ANGPTL3 is performed.
  • Embodiment 15 The kit of Embodiment 14, further comprising: a labeled antibody capable of binding to ANGPTL3.
  • Embodiment 17 The kit of Embodiment 16, wherein the antibody of ANGPTL3 is a monoclonal antibody.
  • An antibody marker for detection that can bind to an antibody to form a conjugate.
  • Embodiment 21 The kit of Embodiment 20, wherein the antibody marker is horseradish peroxidase or a fluorescent substance.
  • An optional auxiliary agent selected from the group consisting of a color developer, an enzyme inhibitor, a buffer, a stabilizer, a diluent, and a detergent reagent;
  • a specific binding agent for ANGPTL3 is immobilized on a solid support.
  • a method for improving the accuracy of sample classification comprising: determining a content of ANGPTL3 in a sample, and a change in the content of ANGPTL3 in time;
  • the ROC curve was drawn according to different thresholds for the sensitivity and specificity of cancer diagnosis, and the area under the curve AUC was calculated. The samples were classified according to AUC value, sensitivity and specificity.
  • a method for improving the accuracy of sample classification comprising: determining a content of ANGPTL3 and any highly expressed protein in ovarian cancer in a sample, and a change in their respective contents in time;
  • the ROC curve is plotted according to the sensitivity and specificity of the cancer diagnosis, and the area under the curve AUC is calculated;
  • Samples were classified according to AUC values, sensitivity, and specificity.
  • Figure 1 is a bar graph showing the comparison of ANGPTL3 expression levels in healthy volunteer serum (N1-N10) and ovarian cancer patient serum samples (C1-C10).
  • ANGPTL3 refers to angiopoietin-like protein 3 (angiopoietin-like protein 3, hereinafter referred to as ANGPTL3), the meaning of which is well known in the art.
  • ANGPTL3 is a member of the angiopoietin-like family of secreted proteins (1 1). It has a characteristic structure of angiopoietin, including a signal peptide, an N-terminal random coil domain, and a C-terminal-fibrinogen (FBN)-like domain.
  • ANGPTL3 may play a role in the regulation of angiogenesis (1 1).
  • ANGPTL3 is a regulator of lipid metabolism (12), but its role in cancer has not been studied.
  • subject refers to any mammal, for example, a mouse, a rat, a rabbit, a dog, a cow, especially a primate, such as a human. In certain preferred embodiments of the invention, the "subject” is a human. As used herein, the terms “subject” and “individual” are sometimes used interchangeably.
  • blood sample refers to a sample of blood from a subject, such as a whole blood, plasma or serum sample.
  • ANGPTL3 refers to an agent capable of specifically binding ANGPTL3, such as an antibody of ANGPTL3, a binding ligand (such as Aptmer), and the like.
  • specific binding means that the specific binding agent of the present invention specifically binds to the ANGPTL3 antigen.
  • affinity of an ANGPTL3 antibody to bind to an ANGPTL3 antigen is at least 2 times that of a non-specific antigen (e.g., BSA, casein) that binds to an ANGPTL3 antigen.
  • an "ANGPTL3 binding fragment” of an ANGPTL3 antibody refers to one or more fragments of an ANGPTL3 antibody that retain the ability to bind to an ANGPTL3 antigen, such as a Fab, F(ab,) 2 , Fv or single-chain Fv fragment. It has been shown that the antigen binding function of antibodies can be carried out by fragments of full length antibodies.
  • the "ANGPTL3 binding fragment” of an antibody includes (i) a Fab fragment which is composed of V L , V H , C!
  • the two domains VL and VH of the FV fragment are encoded by different genes, they can be joined by recombinant methods via a synthetic linker that makes VL and VH a single protein chain, where the VL and VH regions are paired to form a unit price.
  • Molecules referred to as single-chain Fv (scFv); see, for example, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883).
  • the term "monoclonal antibody” as used herein refers to a preparation of antibody molecules of a single molecular component.
  • Monoclonal antibody components show a single binding specificity and affinity for a particular epitope.
  • the term “monoclonal antibody” refers to an antibody that exhibits a single binding specificity.
  • a human monoclonal antibody is produced by a hybridoma comprising a B cell fused to an immortalized cell obtained from a transgenic non-human animal, eg, a transgenic mouse, the genome of the animal comprising Human heavy chain transgene and light chain transgene.
  • the preparation of antibodies is well known in the art, and those skilled in the art can readily prepare antibodies to ANGPTL3.
  • labeled antibody refers to an antibody which is labeled by a labeling molecule, such as an antibody labeled with a fluorophore, a chemiluminescent substance, horseradish peroxidase or the like.
  • optional means “optional” or “non-essential”.
  • optional carrying tool means that the carrying tool may or may not be present. This can be selected by a person skilled in the art depending on the situation.
  • the ELISA of the present invention is carried out using a kit, which allows for a quick operation, thereby avoiding the cumbersomeness of routine experimental testing.
  • a preferred ELISA kit of the invention comprises an ANGPTL3 assay kit.
  • the ANGPTL3 test kit which can measure the two sets of test results separately or simultaneously to achieve rapid efficacy.
  • a particularly preferred ANGPTL3 ELISA assay kit of the invention is available from Immuno-Biological Laboratories Co. Ltd.
  • the ANGPTL3 assay kit of the invention comprises at least:
  • the above kit may further comprise:
  • a standard consisting of a solution containing a known amount of ANGPTL3, which may be derived from genetically engineered bacterial expression, animal or human body fluids;
  • An antibody marker for detection for example, an enzyme label as a reporter method such as horseradish peroxidase, or a fluorescent label, which can bind to an antibody to form a conjugate.
  • the kit may further comprise at least one of the following: (5) a carrying tool, the space dividing into one or more containers, 96-well plates or slats, etc. a defined space, such as a vial, a test tube, and the like, each of which may contain a separate component for use in the method of the invention; (6) ancillary reagents, such as color developers, enzyme inhibitors, Buffers, stabilizers, diluents, washing reagents and the like; (7) instructions, which can be written on bottles, test tubes and the like, or on a separate piece of paper, or on the outside or inside of the container; It can also be in the form of multimedia, such as CDs, computer discs, videos, and so on.
  • a carrying tool the space dividing into one or more containers, 96-well plates or slats, etc. a defined space, such as a vial, a test tube, and the like, each of which may contain a separate component for use in the method of the
  • the antibody can be immobilized on a solid support to form a capture antibody. Capturing antibodies is particularly convenient in operation.
  • the antibody contained includes any antibody fragment capable of binding to ANGPTL3, and may be a recombinant, a chimeric antibody, a humanized antibody, and a murine antibody.
  • the antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, preferably a monoclonal antibody.
  • the antibody conjugate can be photometrically determined using an ELISA reader, such as a microplate reader.
  • the sample used in the present invention may comprise various forms such as whole blood, plasma, serum, urine, cerebrospinal fluid, saliva, or tears. Among them, serum is preferred.
  • Sample preparation can be carried out according to an ordinary method such as centrifugation or the like, for example, see the following documents:
  • the present invention can detect the protein ANGPTL3 of an individual sample using ELIS A or other protein quantification techniques.
  • detection can be carried out using a specific binding agent of ANGPTL3, such as an antibody of ANGPTL3.
  • the antibody of ANGPTL3 is immobilized on a solid support, for example as a capture antibody.
  • Enzyme linked immunosorbent assay It is a commonly used protein content analysis method in the field of molecular biology, which can be used for the determination of antigens, and can also be used for the determination of antibodies.
  • the invention can be used in a variety of different types, such as: double antibody sandwich method, two-site one-step method, indirect method for measuring antibodies, competition method, and capture method for measuring IgM antibody.
  • ELISA using avidin and biotin.
  • Quantitative Western blot is also a commonly used method for protein content analysis in the field of molecular biology.
  • Quantitative analysis of the degree of activity of the ANGPTL3 enzyme by chemical methods such as gelatin zymography or fluorescence detection can also be employed.
  • the concentration of ANGPTL3 in the sample is detected by ELISA
  • the ANGPTL3 concentration in the measured sample can be statistically processed by a mathematical analysis method, and a classification standard having the meaning of the sample classification is obtained.
  • Such mathematical methods are preferably performed by a computer, such as using these data to plot ROC curves to classify individual samples. For example, individuals can be classified into cancer or health, treatment response is good and bad, and long-term and short-term survival is predicted.
  • the ROC curve is called the receiver operator characteristic curve, also known as the receiver operating characteristic curve, and is mainly used for clinical biochemical diagnostic tests.
  • the ROC curve is a comprehensive index reflecting the true positive rate (sensitivity, also known as sensitivity, sensitivity) and false positive rate (1-specificity, specificity). It is a compositional method to reveal the correlation between sensitivity and specificity. It calculates a series of sensitivity and specificity by setting a series of different cut-off values (threshold or cut-off value, which is the boundary value separating the normal and abnormal results of the diagnostic test), and then calculating the sensitivity and specificity. For the ordinate, 1-specificity is plotted on the abscissa, the larger the area under the curve (AUC), the higher the diagnostic accuracy.
  • AUC area under the curve
  • the point closest to the upper left of the graph is the critical value with higher sensitivity and specificity.
  • the ROC curve AUC value is between 1.0 and 0.5. In the case of AUC > 0.5, the closer AUC is to 1, the better the diagnostic effect.
  • AUC has lower accuracy from 0.5 to 0.7, AUC has a certain accuracy from 0.7 to 0.9, and AUC has higher accuracy above 0.9.
  • the evaluation method of the ROC curve is different from the traditional evaluation method. According to the actual situation, the intermediate state is allowed, and the test results can be divided into multiple ordered classifications, such as: normal, general normal, suspicious, rough abnormalities and abnormalities.
  • the above ordered classification, for the diagnosis of diseases can be divided into: negative, uncertain, positive. Further, for cancer diagnosis, it can be divided into: cancer, health. 6
  • the method of the present invention for improving the accuracy of sample classification may include the following steps:
  • test sample cancer or health
  • the ROC curve can be drawn using software or systems in the prior art, such as: MedCalc 9.2.0.1 Medical Statistics Software, SPSS 9.0, ROCPOWER.SAS, DESIGNROC.FOR, MULTIREADER-POWER.SAS,
  • the present invention also provides a combined test kit for diagnosis, prognosis evaluation, therapeutic effect monitoring or course monitoring of ovarian cancer, comprising at least: (1) an antibody capable of binding ANGPTL3; and (2) when ANGPTL3 binds (1) When the antibody is defined, it is capable of binding to the labeled antibody of ANGPTL3.
  • the present invention provides a method for diagnosis, prognosis evaluation, therapeutic effect monitoring or course monitoring of ovarian cancer in a subject, comprising: detecting the expression level of ANGPTL3 and ANGPTL3 in a blood sample of the subject Changes in the amount of time (eg, different cancer development periods, pre-treatment and post-treatment, etc.).
  • the invention also provides a method for improving the accuracy of sample classification, which comprises: determining the content of ANGPTL3 in the sample, and the temporal change of the content of ANGPTL3 (eg, different cancer development periods, pre-treatment and post-treatment, etc.); Taking the change of ANGPTL3 protein content as a variable, the ROC curve was drawn according to different thresholds for the sensitivity and specificity of cancer diagnosis, and the area under the curve AUC was calculated. The samples were classified according to AUC value, sensitivity and specificity. For example, individuals can be classified into cancer or health, treatment response is good and bad, and long-term and short-term survival is predicted.
  • the ANGPTL3 content can be compared to a reference value from a healthy subject, and if significantly lower than the reference value, the subject is determined to have ovarian cancer.
  • the combination of low expression of ANGPTL3 and any protein highly expressed in ovarian cancer is further combined to calculate their ratio The difference in value, and the change in the ratio as a function of time, the ROC curve is drawn according to the sensitivity and specificity of the cancer diagnosis according to different thresholds, and the area under the curve AUC is calculated, and then the sample is classified into f.
  • highly expressed protein in ovarian cancer means that the expression level of the protein in ovarian cancer patients is significantly higher than that in normal subjects.
  • proteins that are highly expressed in ovarian cancer include: CA125, Mesothelin (Hassan R, Remaley AT, Sampson ML, Zhang J, Cox DD, Pingpank J, Alexander R, Willingham M, Pastan I, Onda M: Detection and quantitation Of serum mesothelin, a tumor marker for patients with mesothelioma and ovarian cancer.
  • the ELISA assay used a human angiopoietin-like protein 3 (ANGPTL3) ELISA kit (cat # 27409) developed by Immuno-Biological Laboratories Co. Ltd. ELISA analysis can be performed according to the manufacturer's instructions.
  • the ROC curve was analyzed using the GB STAT statistical package developed by Dynamic Microsystems.
  • the ELISA was performed using a Bio-Rad 680 microplate reader (USA), including:

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Description

ANGPTL3作为卵巢癌的诊断标记物的用 技术领域
本发明属于生物医学技术领域。 具体地说， 本发明涉及一种提高 样本分类准确性的方法、以及一种用于检测样本中 ANGPTL3蛋白的试 剂盒。 背景技术
上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer, EOC)在所有女性癌症死亡 原因中排名第五位。 在我国卵巢恶性肿瘤的发病率在女性常见恶性肿 瘤中所占的百分率为 2.4 - 5.6%。 其发病在妇科恶性肿瘤中仅次于宫 颈癌， 居第二位。 近年来其发病呈上升趋势。 在妇女生殖道癌瘤中， 卵巢癌是造成死亡原因最高的一种肿瘤。 美国癌症学会预计美国 2008 年将会新增 21650个卵巢癌病例， 同时大约有 15520例病患将死于该 疾病（www.cancer.org)。 EOC的高死亡率都是发生在起始阶段， 因为大 部分妇女在诊断时已是晚期 (stage III/IV),其中 15-20%的病人有 5年的 存活率 （ 1 ) 。 相比较而言， 被准确诊断为 stage I的小部分病人， 超过 90%有 5年的存活率（2 )。 当前 EOC检测的候选策略是建立在生物化 学肿瘤标志物的基础之上， 例如 CA125和通过超声或者卵巢的多普勒 显像得到的生物物理标记物。 不幸的是， 利用这些策略进行早期 EOC 检测的阳性预测值 (PPV)—致性小于 10% ( 3， 4 ) 。 通过利用 CA125 复杂算法 (complex longitudinal algorithms) ( 5-7 ) 、 串联测试 (sequential testing) ( 8，9 )和全新生物标记物（ 10 )的应用，在对上皮性卵巢癌 (EOC) 早期诊断中得到了一定的提高。 所以， 现在仍非常需要继续发展新的 血液循环系统中的生物标志物对卵巢癌进行早期诊断。 发明内容
本发明部分地基于以下发现：卵巢癌患者血清中的 ANGPTL3含量 明显低于健康受试者血清中的 ANGPTL3 含量， 并且具有统计学显著 性， 可用作卵巢癌的诊断标志物。
因此， 本发明提供了以下实施方案。 [实施方案 1] 一种诊断受试者中的卵巢癌的方法， 包括： 检测来自受试者的样本中的 ANGPTL3含量，
对所述 ANGPTL3含量进行分析， 和
根据分析结果确定所述受试者是否患有卵巢癌。
[实施方案 2] —种提高样本分类准确性的方法， 包括：
检测所述样本中的 ANGPTL3含量，
对所述 ANGPTL3含量进行分析， 和
根据所述分析结果， 对样本进行分类。
[实施方案 3] —种对受试者的卵巢癌进行诊断、 预后评估、 治疗 效果监测或病程监测的方法， 包括： 检测受试者血液样本中 ANGPTL3 的表达。
[实施方案 4] 实施方案 1-3之任一项的方法， 其中所述样本选自 由尿液、 脑脊液、 唾液和眼泪所构成的组。
[实施方案 5] 实施方案 1-3之任一项的方法， 其中所述样本为血 液样本。
[实施方案 6] 实施方案 1-3之任一项的方法， 其中所述样本为血 清样本。
[实施方案 7] 实施方案 1-6之任一项的方法， 其中所述检测采用 ELISA或定量 Western blot进行。
[实施方案 8] 实施方案 1-7之任一项的方法， 其中所述检测采用
ANGPTL3的特异结合剂进行。
[实施方案 9] 实施方案 8的方法， 其中所述 ANGPTL3的特异结 合剂为 ANGPTL3的抗体或其 ANGPTL3结合片段。
[实施方案 10] 实施方案 8的方法，其中所述 ANGPTL3的抗体为 单克隆抗体。
[实施方案 1 1] 实施方案 8的方法，其中所述 ANGPTL3的抗体为 多克隆抗体。
[实施方案 12] 实施方案 1-1 1之任一项的方法， 其中所述分析包 括绘制 ROC曲线， 其中以 ANGPTL3为变量， 根据不同的阈值绘制出 ROC曲线， 并计算曲线下面积 AUC， 并且按照期望的灵敏度和特异性 进行判断。
[实施方案 13] 实施方案 1-1 1 任一项的方法， 其中所述分析包 括将所述 ANGPTL3含量与来自健康受试者的参比值进行比较，如果明 显低于所述参比值则确定所述受试者患有卵巢癌。
[实施方案 14] 用于实施实施方案 1 -13 之任一项的方法的试剂 盒， 其包含： ANGPTL3的特异结合剂。
[实施方案 15] 实施方案 14 的试剂盒， 还包含： 能够结合 ANGPTL3的标记抗体。
[实施方案 16] 实施方案 14-15 之任一项的试剂盒， 其中所述
[实施方案 17] 实施方案 16的试剂盒， 其中所述 ANGPTL3的抗 体为单克隆抗体。
[实施方案 18] 实施方案 16的试剂盒， 其中所述 ANGPTL3的抗 体为多克隆抗体。
[实施方案 19] 实施方案 15-18之任一项的试剂盒，其中所述标记 抗体被辣根过氧化物酶或者荧光标记。
[实施方案 20] 实施方案 14-19之任一项的试剂盒， 还包含： 包含已知量 ANGPTL3溶液的标准样； 以及
用于检测的抗体标记物， 其可以与抗体结合形成偶联物。
[实施方案 21] 实施方案 20的试剂盒， 其中所述抗体标记物为辣 根过氧化物酶或者荧光物质。
[实施方案 22] 实施方案 14 - 21之任一项的试剂盒， 还包含： 任选的抗体 4禺联物 ( antibody conjugates);
任选的选自由显色剂、 酶抑制剂、 緩冲液、 稳定剂、 稀释剂、 洗 涤试剂构成的组的辅助试剂； 和
任选的说明书。
[实施方案 23] 实施方案 14-22 之任一项的试剂盒， 其中所述
ANGPTL3的特异结合剂被固定于固相载体上。
[实施方案 24] ANGPTL3的特异结合剂在制备用于诊断卵巢癌的 试剂中的用途。
[实施方案 25] 实施方案 24的用途， 其中所述 ANGPTL3的特异 结合剂为 ANGPTL3的抗体或其 ANGPTL3结合片段。
[实施方案 26] 实施方案 25的用途， 其中所述 ANGPTL3的抗体 为单克隆抗体。 [实施方案 27] 实施方案 25的用途， 其中所述 ANGPTL3的抗体 为多克隆抗体。
[实施方案 28] ANGPTL3作为卵巢癌诊断标志物的用途。
[实施方案 29] —种提高样本分类准确性的方法， 其包括： 测定样本中 ANGPTL3的含量，和 ANGPTL3的含量在时间上的变 化；
以 ANGPTL3含量在时间上的变化为变量，根据不同的阈值对癌症 诊断的灵敏度和特异性绘制出 ROC曲线， 并计算曲线下面积 AUC; 按照 AUC值、 灵敏度和特异性对样本进行分类。
[实施方案 30] —种提高样本分类准确性的方法， 其包括： 测定样本中 ANGPTL3和任一在卵巢癌中高表达蛋白的含量，以及 它们各自的含量在时间上的变化；
以 ANGPTL3和该高表达蛋白含量的比值在时间上的变化为变量， 根据不同的阈值对癌症诊断的灵敏度和特异性绘制出 ROC曲线， 并计 算曲线下面积 AUC;
按照 AUC值、 灵敏度和特异性对样本进行分类。
研究表明， 采用本发明的方法及试剂盒对个体的样本中蛋白 ANGPTL3进行联合检测， 可以有效提高癌症诊断的灵敏度、 特异性和 准确率， 并且可以推广至许多疾病的诊断、 预后评估、 治疗效果评估 及病程监测。 附图说明
图 1 是一幅柱状图， 显示了在健康志愿者血清 (N1-N10)和卵巢癌 患者血清样品 （C1-C10)中 ANGPTL3的表达水平的比较， T-检验具有 统计学显著性 (T-test, P=0.0009, tail 1， type 3)。 横坐标为样品 ID ( C =癌症， N -正常）； 纵坐标为浓度， 单位为纳克每毫升（柱形图加标 .准误差的 error bar ) ； 标题为人血管生成素样蛋白 3(卵巢癌 vs正常血 清)。 具体实施方式
术语
本文所用 的术语 "ANGPTL3"是指血管生成素样蛋白 3 (angiopoietin-like protein 3 , 简称 ANGPTL3), 其含义是本领域公知的。 ANGPTL3是分泌蛋白的血管生成素样家族的成员（1 1)。 它具有血管生 成素的特征性结构， 包括信号肽、 N-末端无规卷曲结构域以及 C-末端 -纤维蛋白原 (FBN)-样结构域。 ANGPTL3可能在血管生成的调节中发挥 作用（1 1)。 ANGPTL3 是脂类代谢的调节物（12)， 但是它在癌症中的作 用还没有被研究。
本文中使用的术语"受试者"， 指任意哺乳动物， 例如， 小鼠、 大鼠、 兔子、 狗、 牛， 特别是灵长类动物， 如人。 在本发明的某些优选实施 方式中， "受试者"是人。 在本文中， 术语"受试者 "和"个体"有时可互换 使用。
本文中使用的术语"血液样本"， 指来自受试者的血液的样本， 例如 全血、 血浆或者血清样本。
本文中使用的术语" ANGPTL3 的特异结合剂"， 指能够特异结合 ANGPTL3的试剂 , 例如 ANGPTL3的抗体、结合配体（如 Aptmer )等。
本文中使用的术语"特异结合"指本发明的特异结合剂专一性地结 合 ANGPTL3抗原。例如，通常情况下， ANGPTL3抗体结合 ANGPTL3 抗原的亲和力是结合 ANGPTL3抗原之外的非特异抗原 （例如， BSA、 酪蛋白） 的亲和力的至少 2倍。
ANGPTL3抗体的 "ANGPTL3结合片段"是指 ANGPTL3抗体的一 个或多个片段， 其保留结合 ANGPTL3抗原的能力， 例如 Fab、 F(ab，)2、 Fv或单链 Fv片段。已经表明通过全长抗体的片段可以实施抗体的抗原 结合功能。 抗体的 "ANGPTL3结合片段"包括 (i)Fab片段， 其是由 VL、 VH、 C!^。 CH1结构域组成的单价片段； （ii ) F(ab，)2片段， 其是含有在 铰链区通过二硫键连接的两个 Fab片段的二价片段； （ iii )由 VH和 CH1 结构域组成的 Fd片段； （iv)由抗体的单臂的 VL和 VH结构域组成的 Fv 片段， （V ) dAb 片段 (Ward等人， (1989)Nature 341 : 544-546)， 其由 VH结构域组成； 和 （vi )分离的互补决定区 （CDR ) 。 此外， 尽管 FV 片段的两个结构域 V L和 V H由不同的基因编码，它们可以经重组方法 通过合成的接头连接， 所述接头使得 VL和 VH成为一条蛋白质链， 其 中 VL和 VH区配对形成单价分子（称作单链 Fv(scFv);见， 例如， Bird 等人（1988)Science242: 423-426; 和 Huston等人（1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883)。 文中所用术语 "单克隆抗体 "指单一分子成分的抗体分子的制备物。 单克隆抗体成分显示出对特定表位的单一结合特异性和亲和性。 因此， 术语"单克隆抗体"指显示出单一结合特异性的抗体。 在一个实施方案 中， 通过杂交瘤产生人单克隆抗体， 所述杂交瘤包括从转基因非人动 物， 例如， 转基因小鼠中获得的、 与永生化细胞融合的 B细胞， 所述 动物的基因组包含人重链转基因和轻链转基因。 抗体的制备是本领域 公知的， 本领域技术人员可以容易地制备 ANGPTL3的抗体。
文中所用术语 "标记抗体"指通过标记分子进行标记的抗体，例如由 荧光团、 化学发光物质、 辣根过氧化物酶等标记的抗体。
本文所用的术语 "任选 "(optional, optionally)表示"可有可无"或"非 必需"等含义。 例如， "任选的携带工具"是指可以有该携带工具， 也可 以没有该携带工具。 这可以由本领域技术人员根据情况进行选择。
试剂盒
在一个优选实施方案中， 本发明的 ELISA使用试剂盒完成， 这样 可以实现快捷操作， 从而避免常规实验检测的繁瑣。 本发明的优选的 ELISA试剂盒包括 ANGPTL3检测试剂盒。 为提高疾病诊断的灵敏度、 特异性和准确率，优选使用 ANGPTL3检测试剂盒，其可以分别或同时 测得两组检测结果， 以达到快捷功效。 本发明的一种特别优选的 ANGPTL3 ELISA检测试剂盒购自 Immuno-Biological Laboratories Co. Ltd
在一个优选实施方案中， 本发明的 ANGPTL3 检测试剂盒至少包 含：
( 1 ) 能够结合 ANGPTL3的抗体； 以及
( 2 ) 当 ANGPTL3 结合于 （ 1 ) 中限定的抗体时， 能够结合于 ANGPTL3的标记抗体。
上述试剂盒还可包含：
( 3 ) 由含有已知量 ANGPTL3的溶液组成的标准样， 该标准样可 以来源于基因工程菌表达、 动物或人的体液； 以及
( 4 )用于检测的抗体标记物， 例如， 作为报告方法的酶标签比如 辣根过氧化物酶， 或者荧光标记， 其可以与抗体结合形成偶联物。
更优选地， 试剂盒还可进一步包括下述物品中的至少之一： （5 ) 携带工具， 其空间划分为可以收容一种或多种容器、 96孔板或板条等 的限定空间， 该容器例如是药瓶、 试管和类似物， 每样容器都可含有 一个单独的用于本发明方法的组分； （6 ) 辅助试剂， 比如， 显色剂、 酶抑制剂、 緩沖液、 稳定剂、 稀释剂、 洗涤试剂以及类似物； （7 )说 明书， 其可以写在瓶子、 试管和类似物上， 或者写在一张单独的纸上， 或者在容器的外部或内部； 也可以是多媒体的形式， 比如 CD、 电脑光 盘、 录像等等。
优选抗体可以固定于固相载体上， 形成捕获抗体。 捕获抗体在操 作上特别方便。
所含抗体包括任何能够结合 ANGPTL3的抗体片段，并且可以是重 组体、 嵌合抗体、 人源化抗体和鼠源性抗体。 所述抗体可以是单克隆 抗体或多克隆抗体， 优选单克隆抗体。
优选抗体偶联物能够用 ELISA阅读机， 比如， 酶标仪进行光度测 定。
样本
本发明所用样本可以包含多种形式， 比如全血、 血浆、 血清、 尿 液、 脑脊液、 唾液、 或眼泪。 其中优选血清。
样本制备可根据普通方法比如离心等进行， 例如， 参见如下文献：
Young, D. S. & Bermes, E. W. "Specimen collection and processing"in Tietz Textbook of Clinical Chemistry 2nd Edition" Eds. Burtis, C. A. & Ashwood, E. R.， Saunders (1994); Methods in Enzymology, H. Van Vunakis and J. J. Langone (Eds), 1981, 72(B); Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, P Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, R. J. Burden and P. H. Van Knippenberg (Eds), Elsevier, 1985; Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques, T. Chard, ibid, 3rd Edition, 1987; Methods in Enzymology, H. Van Vunakis and J. J. Langone (Eds) 1981， 74(C)。
检测方法
本发明可以使用 ELIS A或其它蛋白定量技术对个体的样本进行蛋 白 ANGPTL3的检测。 优选地， 可以采用 ANGPTL3的特异结合剂， 例 如 ANGPTL3的抗体进行检测。 在一个优选实施方式中， ANGPTL3的 抗体被固定在固相载体上， 例如作为捕获抗体使用。
酶联免疫吸附剂测定 ( enzyme linked immunosorbent assay, ELISA ) 是分子生物学领域常用的蛋白质含量分析方法， 其可用于测定抗原， 也可用于测定抗体。 根据试剂的来源、 样本的性状以及检测的具体条 件， 本发明可以采用多种不同类型， 比如： 双抗体夹心法、 双位点一 步法、 间接法测抗体、 竟争法、 捕获法测 IgM抗体、 以及应用亲和素 和生物素的 ELISA等。 定量 Western blot也是分子生物学领域常用的 蛋白质含量分析方法。
还可以采用通过化学方法测定 ANGPTL3 酶的活性程度的定量分 析如明胶原位醉 ΐ普 ( gelatin zymography)或荧光法检测。
ROC曲线
在用 ELISA检测出样本中 ANGPTL3的浓度后， 可用数学分析方 法对测得的样本中 ANGPTL3浓度进行统计学处理，在此基础上获得具 有样本分类意义的分级标准。 这样的数学方法优选由计算机完成， 比 如用这些数据绘制 ROC曲线， 从而对个体的样本进行分类。 例如， 可 以将个体分为癌症或健康， 治疗反应好和坏， 预测存活期长和短等。
ROC 曲线全称为受试者工作特征曲线 （ receiver operator characteristic curve ) , 又称为接收者操作特性曲线， 主要用于临床生化 诊断试验。 ROC曲线是反映真阳性率（灵敏度，又称敏感性， sensitivity ) 和假阳性率 （ 1-特异性， specificity ) 连续变量的综合指标， 是用构图 法揭示灵敏度和特异性的相互关系。 它通过设定一系列不同的分界值 (阈值或临界值， cut-off value, 是划分诊断试验结果正常与异常的界 值）作为连续变量， 从而计算出一系列灵敏度和特异性， 再以灵敏度 为纵坐标、 1-特异性为横坐标绘制曲线， 曲线下面积 （ AUC ) 越大， 诊断准确性越高。 在 ROC曲线上， 最靠近坐标图左上方的点为灵敏度 和特异性均较高的临界值。 ROC曲线 AUC值在 1.0和 0.5之间。在 AUC > 0.5的情况下， AUC越接近于 1， 说明诊断效果越好。 AUC在 0.5 ~ 0.7时有较低准确性， AUC在 0.7 ~ 0.9时有一定准确性， AUC在 0.9 以上时有较高准确性。
ROC曲线的评价方法与传统的评价方法不同， 根据实际情况， 允 许有中间状态， 可以把试验结果分为多个有序分类， 比如： 正常、 大 致正常、 可疑、 大致异常和异常五个等级。
上述有序分类， 对于疾病的诊断而言， 可分为： 阴性、 不确定、 阳性。 进一步地， 对于癌症诊断而言， 可分为： 癌症、 健康。 6
9 在一个实施方式中， 本发明提高样本分类准确性的方法， 可以包 括如下步骤：
( 1 ) 分别测定样本中蛋白 ANGPTL3的含量；
( 2 ) 以 ANGPTL3蛋白含量的比值为变量， 根据不同的阈值对癌 症诊断的灵敏度和特异性绘制出 ROC曲线， 并计算曲线下面积 AUC; 以及
( 3 )按照期望的灵敏度和特异性， 对测定样本进行分类 （癌症或 健康） 。
ROC 曲线的绘制可以使用现有技术中的软件或系统， 比如： MedCalc 9.2.0.1 医学统计软件、 SPSS 9.0、 ROCPOWER.SAS、 DESIGNROC.FOR 、 MULTIREADER— POWER.SAS 、
CREATE— ROC.SAS、 GB STAT V10.0 (Dynamic Microsystems, Inc. Silver Spring, MD, US A)等等。
卵巢癌的诊断、 预后评估、 治疗效果监测或病程监测
本发明还提供了一种用于卵巢癌的诊断、 预后评估、 治疗效果监 测或病程监测的联合测试试剂盒， 其至少包含： （ 1 ) 能够结合 ANGPTL3的抗体； 以及（ 2 ) 当 ANGPTL3结合于 （ 1 ) 中限定的抗体 时， 能够结合于 ANGPTL3的标记抗体。
在一个优选实施方式中， 本发明提供了一种对受试者的卵巢癌进 行诊断、 预后评估、 治疗效果监测或病程监测的方法， 包括： 检测受 试者血液样本中 ANGPTL3的表达量和 ANGPTL3的含量在时间上的变 化 （如， 不同癌症发展时期， 治疗前和治疗后等） 。 本发明还提供了 一种提高样本分类准确性的方法， 其包括： 测定样本中 ANGPTL3的含 量， 和 ANGPTL3的含量在时间上的变化（如， 不同癌症发展时期， 治 疗前和治疗后等）； 以 ANGPTL3蛋白含量在时间上的变化为变量， 根 据不同的阈值对癌症诊断的灵敏度和特异性绘制出 ROC曲线， 并计算 曲线下面积 AUC; 按照 AUC值、 灵敏度和特异性对样本进行分类。 例如， 可以将个体分为癌症或健康， 治疗反应好和坏， 预测存活期长 和短等。 在一个优选实施方式中， 例如， 可以将 ANGPTL3含量与来自 健康受试者的参比值进行比较， 如果明显低于所述参比值则确定所述 受试者患有卵巢癌。 在另一个优选实施方式中， 进一步结合 ANGPTL3 的低表达和任一在卵巢癌中高表达的蛋白的联合检测， 计算他们的比 值的差异， 并以比值在时间上的变化为变量， 根据不同的阈值对癌症 诊断的灵敏度和特异性绘制出 ROC曲线， 并计算曲线下面积 AUC， 进 而对样本进 f于分类。
此处所用的术语"在卵巢癌中高表达蛋白 "是指该蛋白在卵巢癌患 者中的表达量显著高于正常受试者。"在卵巢癌中高表达的蛋白"的实例 包括： CA125, Mesothelin (Hassan R, Remaley AT, Sampson ML, Zhang J， Cox DD， Pingpank J, Alexander R， Willingham M, Pastan I, Onda M: Detection and quantitation of serum mesothelin, a tumor marker for patients with mesothelioma and ovarian cancer. Clin Cancer Res 2006, 12(2):447-453.)， HE4, M-CSF, osteopontin, kallikrein(s), 和可溶性 EGF 受体 (soluble EGF receptor, Bast RC， Jr., Badgwell D, Lu Z, Marquez R, Rosen D, Liu J, Baggerly KA, Atkinson EN, Skates S, Zhang Z et al: New tumor markers: CA125 and beyond. Int J Gynecol Cancer 2005， 15 Suppl 3:274-281.)。
以下结合具体实施例， 对本发明作进一步说明。 应当理解， 以下 实施例仅用于说明本发明而不以任何形式用于限定本发明的范围。 实施例 1
以下以个体的血清为样本进行卵巢癌诊断为例， 对本发明作进一 步" ^"细说明。
样本的采集
收集卵巢癌患者的术前血清样本和年龄匹配的（34 - 82岁范围）的 健康女性的血清用作对照。 在静脉穿刺取血的 2 小时内， 通过离心收 集血清， 并将等分样品储存在 -80。C直至使用。
测 ANGPTL3含量
ELISA分析一运用了 Immuno-Biological Laboratories Co. Ltd.开发 的人血管生成素样蛋白 3 (ANGPTL3)ELISA 试剂盒 (cat # 27409)。 ELISA分析可根据生产商的说明书操作。 利用 Dynamic Microsystems 公司开发的 GB STAT统计包来分析 ROC曲线。
并且使用 Bio-Rad 680型酶标仪 （美国）进行 ELISA操作 , 包括：
1、 取出冷藏储存的试剂盒， 放置， 恢复温度至室温 (20-25°C)。 计 算要检测的标本总数和质控数。 每个标本需要一个抗原包被孔。 每次 实验都要做阳性对照、 阴性对照和校准品。 确定需要的微孔数量。 当 板条温度至室温时， 打开板条的保护袋， 拿出抗原包被的微孔板条。 本次实验不需要使用的试剂条应放入这个可重新密封的袋子， 密封， 重新存放在 2-8 °C。
2、 依次在微孔板上加入 20 的标准液、 对照液和血清样本。 此 过程务必在三十分钟内完成。
3、 在每个微孔中加入 100 μL的捕获液， 用移液器在孔中反复吹 打进行混匀。
4、 用微孔板盖盖好板， 在室温下（18-25 °C)进行温育 55 - 65分钟。 5、 按下述步骤手工洗板 3次：
A、 剧烈摇动并倒掉板中的液体；
B、 在孔中加满洗液。 保证孔中无残余气泡。
C、 再重复前两步骤两次。
D、 摇动并去除孔中的洗液。 把板翻转， 在纸巾上轻拍， 以便能拍 干所有洗液。 观察微孔板， 确保无残留的洗液。
6、 在酶标抗体复合物的瓶子里加入 7 mL的再生緩沖液， 存放于 室温下待用。
7、 按照同样的次序把稀释好的酶复合物加 100 到微孔板上
8、 用微孔板盖盖好板， 在室温下 （18-28°C )进行温育 55 - 65分 钟。
9、 配制底物， 在底物緩沖液中加入一片底物固体， 30-60 分钟后 溶解， 强烈摇晃， 使溶液完全混合。 '
10、 按照步骤 5中 A到 D的方法进行洗板。
1 1、 以同样的速度和次序把底物液加 100 到每孔中。
12、 微孔板在室温下（18-28°C)进行温育 55 - 65分钟。
13、 以同样的速度和次序在每个孔中加入 100 的终止液。 加了 终止液后应轻轻敲打微孔板， 确保样品全部混匀。
14、 设置酶标仪的检测波长在 405 nm处。 检测每个孔的 OD值。 应在加了终止液的 15钟之内进行读数。
15、 用一线性校准曲线 "Y=mx+b"来分析 ANGPTL3的结果。
16、 通过标准曲线来读出血清样本和对照液中 ANGPTL3的浓度。 结果 经上述步骤， 得到的检测结果如表 1所示。 表 1. ANGPTL3在正常人群和卵巢癌
病人血清中的表达
样品 浓度 ( ng/ml)
cl 25.06
c2 1 11.86
c3 14.21
c4 75.69
c5 343.33
c6 412.04
c7 64.84
c8 93.78
c9 28.68
clO 129.94
nl 419.28
n2 260.14
n3 549.48
n4 307.16
n5 415.66
n6 278.23
n7 701.38
n8 90.16
n9 357.79
nlO 451.83
*C代表癌症样品， N代表正常样品 由表 1可以看出， ANGPTL3的浓度与卵巢癌症状有密切的相关性， 即卵巢癌患者血清中 ANGPTL3 蛋白的含量明显低于健康志愿者血清 中的含量。
我们发现， 与所述 10个正常个体相比， 所述 10个卵巢癌血清样 本中血管生成素样蛋白 3 (ANGPTL3)的表达量更低 （T-test， P=0.0009， tail 1, type 3) (图 1)。
结果表明 ANGPTL3的浓度与卵巢癌症状有密切的相关性， 本文中所涉及的参考文献， 包括专利文件、 学术论文、 出版物等， 均以引用的方式将其全部内容包括在本文中。
应当理解， 在不偏离本发明的精神和范围的情况下， 本领域的普 通技术人员可以在形式和细节上对其做出各种改变和改进， 而这些均 被认为落入了本发明的保护范围。
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Claims

权 利 要 求
1. 一种诊断受试者中的卵巢癌的方法， 包括：
检测来自受试者的样本中的 ANGPTL3含量，
对所述 ANGPTL3含量进行分析， 和
根据分析结果确定所述受试者是否患有卵巢癌。
2. 一种提高样本分类准确性的方法， 包括：
检测所述样本中的 ANGPTL3含量，
对所述 ANGPTL3含量进行分析， 和
根据所述分析结果， 对样本进行分类。
3. 一种对受试者的卵巢癌进行诊断、 预后评估、 治疗效果监测或 病程监测的方法， 包括： 检测受试者血液样本中 ANGPTL3的表达。
4. 权利要求 1-3之任一项的方法， 其中所述样本选自由尿液、 脑 脊液、 唾液和眼泪所构成的组。
5. 权利要求 1-3之任一项的方法， 其中所述样本为血液样本。
6. 权利要求 1-3之任一项的方法， 其中所述样本为血清样本。
7. 权利要求 1-6之任一项的方法， 其中所述检测采用 ELISA或定 量 Western blot进行。
8. 权利要求 1-7之任一项的方法， 其中所述检测采用 ANGPTL3 的特异结合剂进行。
9. 权利要求 8 的方法， 其中所述 ANGPTL3 的特异结合剂为 ANGPTL3的抗体或其 ANGPTL3结合片段。
10. 权利要求 8的方法，其中所述 ANGPTL3的抗体为单克隆抗体。
1 1. 权利要求 8的方法，其中所述 ANGPTL3的抗体为多克隆抗体。
12. 权利要求 1-1 1之任一项的方法， 其中所述分析包括绘制 ROC 曲线， 其中以 ANGPTL3为变量， 根据不同的阔值绘制出 R0C曲线， 并计算曲线下面积 AUC, 并且按照期望的灵敏度和特异性进行判断。
13. 权利要求 1-1 1 之任一项的方法， 其中所述分析包括将所述 ANGPTL3含量与来自健康受试者的参比值进行比较，如果明显低于所 述参比值则确定所述受试者患有卵巢癌。
14. 用于实施权利要求 1-13之任一项的方法的试剂盒， 其包含： ANGPTL3的特异结合剂。
15. 权利要求 14的试剂盒， 还包含： 能够结合 ANGPTL3的标 i己
16. 权利要求 14-15之任一项的试剂盒， 其中所述 ANGPTL3的特 异结合剂为 ANGPTL3的抗体或其 ANGPTL3结合片段。
17. 权利要求 16的试剂盒， 其中所述 ANGPTL3的抗体为单克隆 抗体。
18. 权利要求 16的试剂盒， 其中所述 ANGPTL3的抗体为多克隆 抗体
19. 权利要求 15-18之任一项的试剂盒， 其中所述标记抗体被辣根 过氧化物酶或者荧光标记。
20. 权利要求 14-19之任一项的试剂盒， 还包含：
包含已知量 ANGPTL3溶液的标准样； 以及
用于检测的抗体标记物， 其可以与抗体结合形成偶联物。
21. 权利要求 20的试剂盒， 其中所 抗体标记物为辣根过氧化物 酶或者荧光物质。
22. 权利要求 14 - 21之任一项的试剂盒， 还包含：
任选的抗体偶联物；
任选的选自由显色剂、 酶抑制剂、 緩沖液、 稳定剂、 稀释剂、 洗 涤试剂构成的组的辅助试剂； 和
任选的说明书。
23. 权利要求 14-22之任一项的试剂盒， 其中所述 ANGPTL3的特 异结合剂被固定于固相载体上。
24. ANGPTL3的特异结合剂在制备用于诊断卵巢癌的试剂中的用 途。
25. 权利要求 24 的用途， 其中所述 ANGPTL3 的特异结合剂为
ANGPTL3的抗体或其 ANGPTL3结合片段。
26. 权利要求 25的用途， 其中所述 ANGPTL3的抗体为单克隆抗 体。
27. 权利要求 25的用途， 其中所述 ANGPTL3的抗体为多克隆抗 体。
28. ANGPTL3作为卵巢癌诊断标志物的用途。
29. —种提高样本分类准确性的方法， 其包括： 测定样本中 ANGPTL3的含量，和 ANGPTL3的含量在时间上的变 化；
以 ANGPTL3含量在时间上的变化为变量，根据不同的阈值对癌症 诊断的灵敏度和特异性绘制出 ROC曲线， 并计算曲线下面积 AUC; 按照 AUC值、 灵敏度和特异性对样本进行分类。
30. 一种提高样本分类准确性的方法， 其包括：
测定样本中 ANGPTL3和任一在卵巢癌中高表达蛋白的含量，以及 它们各自的含量在时间上的变化；
以 ANGPTL3和该高表达蛋白含量的比值在时间上的变化为变量， 根据不同的阈值对癌症诊断的灵敏度和特异性绘制出 ROC曲线， 并计 算曲线下面积 AUC;
按照 AUC值、 灵敏度和特异性对样本进行分类。
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