WO2010100238A1 - Agents de reticulation - Google Patents
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- WO2010100238A1 WO2010100238A1 PCT/EP2010/052773 EP2010052773W WO2010100238A1 WO 2010100238 A1 WO2010100238 A1 WO 2010100238A1 EP 2010052773 W EP2010052773 W EP 2010052773W WO 2010100238 A1 WO2010100238 A1 WO 2010100238A1
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- 0 CC=C(C(*)=O)C#N Chemical compound CC=C(C(*)=O)C#N 0.000 description 1
- VOABBQIQCAKTIC-UHFFFAOYSA-N OC(CN(CC(O)=O)C(OCc1ccccc1)=O)=O Chemical compound OC(CN(CC(O)=O)C(OCc1ccccc1)=O)=O VOABBQIQCAKTIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZVNMHAVTBVZBCK-HKOYGPOVSA-N [NH-]/C(/C(/C#N)=C/c(cc1)ccc1O)=[O]\[O](C(CCc(cc1)ccc1C(c1ccccc1)=O)=O)N(C(CC1)=O)C1=O Chemical compound [NH-]/C(/C(/C#N)=C/c(cc1)ccc1O)=[O]\[O](C(CCc(cc1)ccc1C(c1ccccc1)=O)=O)N(C(CC1)=O)C1=O ZVNMHAVTBVZBCK-HKOYGPOVSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D207/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
- C07D207/46—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with hetero atoms directly attached to the ring nitrogen atom
Definitions
- the invention relates to the field of structural analyzes of proteins by mass spectrometry.
- the analysis of the three-dimensional structures of proteins and their interactions with their environment e.g. DNA, proteins, membranes
- their environment e.g. DNA, proteins, membranes
- NMR and XRD are commonly used analytical methods.
- these methods are very limited by certain constraints: protein crystallization, use of large amount of material (5 to 10 mg of proteins).
- This approach consists in carrying out an enzymatic digestion of the proteins of the reaction medium after carrying out the crosslinking reaction in solution.
- the peptide mixture obtained is then analyzed by mass spectrometry in order to identify the peptides modified by the crosslinking agents. Structural data are then obtained from this identification. This strategy has been used in low-resolution structural studies of proteins or protein-protein interactions.
- the chemical crosslinking agents have one or two reactive functions connected by a spacer arm. These reactive functions are able to react with the side chains of amino acids of proteins. After identification of the amino acid residues of the proteins modified by the two reactive functions, distance constraints within these proteins can be determined by virtue of the known length of the spacer arm of the chemical crosslinking agent. Homobifunctional agents, such as bis-imido esters or dialkyl halides, were developed and used on proteins as early as the 1950s.
- the crosslinking experiment is carried out with an equimolar mixture of two crosslinking agents of identical structure but one of which is modified by stable isotopes.
- the isotopes used are deuterium and oxygen 18. This type of labeling will have the effect of creating a resolution of the crosslinked peptide signal by virtue of the difference in mass between the two types of crosslinking agents, which makes it easier to detect modified peptides.
- cleavable function within the crosslinking agent makes it possible to facilitate the identification of the crosslinked peptides by comparison between the mass spectrum of all the peptide signals of interest and that obtained after cleavage of the agent. crosslinking. It is thus possible to identify the signals that have been reached by the cleavage and thus to deduce the masses of the products modified by the crosslinking agent. Cleavage can be induced either by chemical treatment or directly in tandem mass spectrometric (MS / MS) analyzes. - Fluorescent marking
- crosslinking agent labeled with a fluorescent motif is to facilitate the detection of crosslinked peptides during purification by chromatography. - Affinity purification
- HCCA or HCCA derivatives make it possible to identify by MALDI-TOF mass spectrometry peptides of interest of a protein in a complex peptide mixture by labeling in solution whereas said peptides are not visible on the MALDI-TOF mass spectrum of the protein. This selective effect is further accentuated by the use of the HCCE matrix.
- the subject of the invention is therefore a crosslinking agent for proteins of formula
- R 1 is an aryl group optionally substituted one or more times with a group selected from the group consisting of hydroxy, C 1 -C 4 alkyl, OBoc, SO 3 Na, Deu, C 1 -C 4 alkoxy,
- n and m are identical or different integers between 0 and 10, preferably between 1 and 5 p is an integer between 0 and 5, k is 0, 1, 2 or 3,
- X and X ' which are identical or different, are a reactive function of the proteins.
- Another subject of the invention is a process for preparing a crosslinking agent according to the invention.
- Another object of the invention is the use of a crosslinking agent according to the invention for the analysis of the three-dimensional structure of a protein in mass spectrometry.
- Another object of the invention is a method of structural analysis of a protein or a protein complex comprising the following steps: a) crosslinking the protein or the protein complex on the crosslinking agent according to one of the following: any of claims 1 to 8 by the X and / or X 'functions, b) enzymatic digestion of the protein or protein complex attached to the crosslinking agent according to any one of claims 1 to 8, c) analysis by mass spectrometry.
- alkyl Ci -1 O means a saturated hydrocarbon chain, linear or branched, having 1 to 10 carbon atoms, such as a group methyl, ethyl, isopropyl, tert-butyls, pentyl, etc.
- C 2 -C 4 alkenyl is meant a hydrocarbon chain, linear or branched, comprising at least one unsaturation and containing from 2 to 10 carbon atoms, for example an ethenyl, propenyl or 2,4-hexadienyl group, etc.
- aryl group is meant an aromatic group, preferably comprising from 5 to 10 carbon atoms, comprising one or more rings and optionally comprising a heteroatom, in particular an oxygen, a nitrogen or a sulfur, for example a grouping phenyl, furan, indole, pyridine, naphthalene, etc.
- halogen refers to fluorine, bromine, chlorine or iodine.
- Boc refers to an amine protecting group of the formula t-butyloxycarbonyl.
- Deu denotes deuterium
- (Ci-Ce) alkoxy is understood within the meaning of the present invention, a (Ci-C ⁇ 5) alkyl, as defined above, bonded to the molecule via a oxygen atom.
- a (Ci-C ⁇ 5) alkyl as defined above, bonded to the molecule via a oxygen atom.
- tBu refers to tert-butyl.
- the crosslinking agent of the proteins of the invention has the formula (I)
- R 1 is an aryl group optionally substituted one or more times with a group selected from the group consisting of hydroxy, C 1 -C 4 alkyl, OBoc, SO 3 Na, Deu, Ci-C 4 alkoxy,
- R 2 is N, , or n and m are identical or different integers between 0 and 10, preferably between 1 and 5, p is an integer between 0 and 5, k is 0, 1, 2 or 3,
- X and X ' which are identical or different, are a reactive function of the proteins.
- n m.
- R 1 is a phenyl group optionally substituted one or more times with a group selected from the group consisting of hydroxy, C 1 -C 4 alkyl, OBoc, SO 3 Na, Deu, C 1 -C 4 alkoxy.
- R 1 is a phenoxy group, most preferably a para-hydroxyphenyl group.
- R 2 is N, or
- crosslinking agent according to the invention has formula (II), (III) or (IV)
- X and X ' which are identical or different, are chosen from the group consisting of imidoester, N-hydroxysuccinimide ester, isocyanate, isothiocyanate, N-maleimide, disulfide, 1,2-dicarbonyl, benzophenone and arylazide functions.
- the crosslinking agent of the invention comprises two reactive functions of the X and X 'proteins. It is possible to design a very large variety of crosslinking agents depending on the nature of the reactive functions used which may be identical or not (i.e. homo or heterobifunctional agent).
- crosslinking of the protein or protein complex on the solid support crosslinking agent of the invention is the reaction of one or more reactive functional groups X and / or X 'of the crosslinking agent A with one or more several groups of the protein or protein complex resulting in the covalent attachment of said protein or protein complex to the crosslinking agent A.
- the homobifunctional crosslinking agents have two identical reactive functions that can react with the same type of function.
- one of the two reactive functions reacts on a side chain of an amino acid residue.
- the second reactive function then reacts either intramolecularly on another nearby side chain, or on a side chain of an amino acid residue belonging to another protein. Since the two reactive functions are identical, the reaction protocol is in a single step.
- the heterobifunctional crosslinking agents have two reactive functions targeting different amino acids.
- crosslink proteins are generally used to crosslink proteins in two steps (e.g. crosslinking agents having a nonspecific and specific reactive function). Once the first fixation has been carried out, it is therefore possible to carry out purification of the modified proteins before carrying out the reaction of the second reactive function. This may favor intramolecular reactions and may provide more diverse data than with homobifunctional crosslinking agents.
- REACTIVE FUNCTIONS X and X ' are specific reactive functions of proteins capable of reacting with a reactive group of proteins.
- X and X ' which are identical or different, are chosen from the group consisting of the specific reactive functions of the amines, the specific reactive functions of the carboxylic acids, the specific reactive functions of the thiols, the specific reactive functions of the guanidines and the non-reactive functional groups. specific.
- the specific reactive functions of the amines react with the primary amines present on the proteins.
- Three types of functions are commonly used for this purpose: imidoesters, N-hydroxysuccinimide esters ( ⁇ HS), isocyanates (and isothiocyanates). They are all electrophilic activated agents with a good leaving group by nucleophilic substitution.
- the specific reactive functions of the carboxylic acids are present in the Asp, Glu and C-terminal residues of the proteins. These functions are not reactive per se and require activation.
- This activation is usually carried out with carbodiimides.
- the O-acylurea formed by this activation makes it possible to react with a primary amine and form an amide bond.
- the specific reactive functions of the thiols are the N-maleimide and disulfide functions.
- the thiol function is the most reactive nucleophilic function within a protein.
- the side chains of the cysteine residues are often engaged in disulfide bridges which prevents their reaction with chemical crosslinking agents. Therefore, a reduction reaction (with ethanedithiol or EDT) of these bonds is generally necessary in order to recover free thiol functions.
- EDT ethanedithiol
- the pKa of the thiols of the cysteine residues are approximately 8.6, their reactivity increases when the thiolate ion is formed at a pH greater than 8.6.
- the specific reactive functions of guanidines are the 1,2-dicarbonyl compounds which react specifically with the side chains of arginines.
- Non-specific reactive functions react on molecules by exposure to UV light.
- An ideal photoreactive agent must have different qualities: - It has a high reactivity
- reaction mechanism of these functions are generally radical which allows to act indifferently on various residues.
- chemical crosslinking agents having a nonspecific reactive function also have a specific reactive function. In this way, it is possible to target residues of interest with a first fixing step involving the specific reactive function and then to mark all the residues present in a certain perimeter (defined by the length of the spacer arm linking the two functions reactive) through the action of the non-specific reactive function.
- the crosslinking agents of the invention are preferably prepared in the following manner.
- the process for preparing the crosslinking agents of the invention comprises three steps.
- Step (a) consists of a peptide coupling between the amine RR'NH and the carboxylic acid R 1
- R 1 having the meaning given above with R and R 'representing: both - (alkyl) -COOY
- one of the two H's and the other with Y is H or tBu.
- Z is C1-C8 alkyl
- Step (a ') comprises steps (i), (ii) and (iii)
- Step (i) consists of the reaction of RR 'NH with O where HaI is a halogen atom in the presence of a base to give
- Step (ii) consists of the RR'N reaction
- Step (iii) consists of the reaction of RR'N with RiCHO in the presence of a base to give
- Step (b) consists in the optional hydrolysis of the ester obtained in step (a) or (a ') to give R 1
- Step (c) consists in reacting the compound obtained in the preceding step (b) to obtain a reactive function of the proteins.
- This reactive function of the proteins is preferably an NHS ester function.
- Peptide coupling with a carboxylic acid is preferably carried out in the presence of a coupling agent, such as diisopropylcarbodiimide (DIC), dicyclohexylcarbodiimide (DCC), hydrochloride of 1- (3-dimethylaminopropyl) -3- ethylcarbodiimide (EDC), carbonyldiimidazole (CDI), 2-H-benzotriazol-1-yl) - 1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU), 2- (1H-benzotriazol-1-yl) 1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate (TBTU) or else O- (7-azobenzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU), optionally combined with a coupling aid such as N-hydroxy succinimide (NHS), N-hydroxy
- the supported chemical crosslinking agent is placed in the presence of the protein dissolved in a saline buffer in order to approach the physiological conditions. This results in a covalent attachment of the protein to the crosslinking agent via the reactive functions X and / or X '. Enzymatic digestion
- the crosslinked proteins are digested.
- the mixture is placed in the presence of an enzyme (e.g., trypsin) solubilized, preferably in a salt buffer.
- an enzyme e.g., trypsin
- the mass spectrometric analysis is carried out by MALDI-TOF spectrometry.
- the samples are deposited either in dried drop or thin layer. Deposition in dried drop is preferred. It is carried out by co-crystallization of a drop of matrix solution and a drop of an analyte solution.
- MASS SPECTROMETRY DATA ANALYSIS SOFTWARE
- data from mass spectrometry analysis of peptide mixtures are analyzed by software.
- the purpose of these software is to quickly provide a list of potential peptides unmodified or modified by the crosslinking agent used, corresponding to each m / z value of the mass spectrum.
- the experimental values are compared with the theoretical values calculated from an in silico digestion of the studied protein model.
- MSX-3D a prediction software, called MSX-3D, has been created within the Institute of Biology and Protein Chemistry (IBCP) in Lyon.
- HCCA is commonly used in MALDI-TOF peptide mass spectrometry analyzes. It is able to absorb UV light from the MALDI source laser. The energy that it absorbs is restored in the form of thermal energy and allows the desorption of the co-crystallized compounds with the matrix.
- HCCE methyl ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamate ester
- ⁇ -CNME methyl ester of the HCCA matrix. Due to their close structures, they both have similar characteristics: - Molecular weights (189 g / mol for HCCA and 203 g / mol for HCCE)
- the HCCA matrix has two distinct pKa acid functional groups: the carboxylic acid function of pKai equal to 2 and the phenolic alcohol function of pKa 2 equal to 8.
- the HCCE matrix has only one acid function: the phenolic alcohol function of pKai equal to 8.
- the HCCA matrix thus has a carboxylic acid function that makes it possible to act as a proton donor during the ionization process involved in the MALDI source: this is why it is called an acid matrix.
- Figure 1 Analysis of an equimolar mixture of the five model peptides JMV3346 to JMV3350 with the HCCA matrix.
- FIG. 2 Mass spectrum of the peptide mixture resulting from tryptic digestion of unmodified cytochrome c (with HCCA matrix).
- Figure 5 Mass spectrum of the peptide mixture from the trypsic digestion of unmodified apomyoglobin (with HCCA matrix).
- the following examples illustrate the invention without limiting its scope.
- the five model peptides are C-terminal amidated decapeptides having the same amino acid sequence in order not to influence their intrinsic ionization capacity in MALDI-TOF mass spectrometry. They were synthesized on solid support in Fmoc strategy. A first peptide JMV3346 is not labeled and serves as a reference for evaluating the effect of spectral discrimination.
- Model peptides JMV3347, JMV3348 and JMV3349 were synthesized by coupling HCCA and two derivatives at position 4 (ie, ⁇ -cyanocinnamic acid or
- Spacer arm 6.2 A ( ⁇ ) The direct coupling between the carboxylic acid function of HCCA and the secondary amine of diethyl iminodiacetate ester was first considered in order to synthesize JMV3378.
- HCCA Unlike basic treatments, HCCA does not appear to be sensitive to TFA.
- MALDI-TOF and model peptides labeled with HCCA supported the use of concentrated solutions of TFA.
- Lane No. 1 has three steps.
- the secondary amine of iminodiacetic diacid is first protected with a benzyloxycarbonyl group in order to obtain compound 1.
- This reaction is carried out using a solution of benzyl chloroformate in sodium hydroxide in quantitative yield.
- An esterification reaction of the compound 1 carried out at 55 ° C. in a solution of dimethylacetamide (DMAC) containing benzyltriethylammonium chloride, potassium bicarbonate and tert-butyl bromide afforded compound 2 in 17% yield.
- DMAC dimethylacetamide
- deprotection of the amine to give compound 4 was carried out with a yield of 50% by hydrogenolysis performed in methanol with hydrogen bubbling catalysed by palladium on carbon.
- Lane # 2 has only two steps.
- Compound 3 is obtained directly by a double nucleophilic substitution of the primary amine of benzylamine on two molecules of tert-butyl 2-bromoacetate. This reaction is carried out with a yield of 99% in a solution of dimethylformamide (DMF) containing potassium bicarbonate at 45 ° C.
- DMF dimethylformamide
- the hydrogenolysis of the benzyl group leading to the compound 4 was carried out quantitatively using bubbling hydrogen and palladium on carbon in 95% ethanol.
- Route No. 2 seems to be more interesting because it makes it possible to obtain the final diester 4 in two stages of very good yield and uses a commercial tert-butyl ester.
- the preparation of the tert-butyl ester is the limiting step in the No. 1 route.
- this channel has one more step and does not make it possible to obtain the diester with as good a yield as the channel N ° 2.
- SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) potentially be involved in intermolecular side reactions and react with an active ester of another molecule.
- Compound 4 is first acylated with 2-chloroacetyl chloride in a mixture of sodium hydroxide and tetrahydrofuran (THF) quantitatively.
- the substitution of chlorine with potassium cyanide in dimethylsulfoxide (DMSO) at 65 ° C. makes it possible to obtain compound 6.
- DMSO dimethylsulfoxide
- a Knoevenagel reaction between compound 6 and 4-hydroxybenzaldehyde carried out in a mixture of pyridine and piperidine with 5O 0 C provides the compound 7 with a yield of 74%. During this reaction, the aldehyde can be used in large excess in order to optimize the yield of the reaction.
- JMV3378 is synthesized by activating the two carboxylic acids with dicyclohexylcarbodiimide (DCC) and N-hydroxysuccimmide in THF with a yield of 69%
- DCC dicyclohexylcarbodiimide
- N-hydroxysuccimmide in THF with a yield of 69%
- the chemical crosslinking agent JMV3378 was thus obtained through a seven-step synthetic route with an overall yield of 31%.
- a second homobifunctional crosslinking agent having two NHS ester functions has been synthesized N-hydroxysuccimmidyl 5- ( ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamido) isophthalate (see scheme 8).
- This crosslinking agent has a spacer arm of similar length. to that of the compound JMV3378, however its structure is rigid because of the isophthalic aromatic ring. This rigidity can make it possible to obtain new structural information during crosslinking experiments on proteins
- Figure 9 Synthetic route of the homobifunctional agent with 5-aminoisophthalic pattern.
- the synthesis route is directly initiated by the acylation of 5-aminoisophthalic acid with 2-chloroacetyl chloride in a mixture of sodium hydroxide and THF.
- Compound 9 is recovered by flash precipitation in petroleum ether with a yield of 96%.
- Substitution of the chlorine atom of 9 with potassium cyanide in water in the presence of potassium bicarbonate provides compound 10 in 77% yield.
- the diacid 11 is then obtained in a yield of 99% by means of a Knoevenagel reaction with 4-hydroxybenzaldehyde in a mixture of pyridine and piperidine at 50 ° C.
- the compound is synthesized by activation of the two carboxylic acids with dicyclohexylcarbodiimide (DCC) and N- hydroxysuccinimide in THF.
- DCC dicyclohexylcarbodiimide
- N- hydroxysuccinimide in THF.
- the purification conditions of this compound are identical to those of JMV3155.
- a heterobifunctional crosslinking agent having a nonspecific reactive function can provide many more diverse information than a homobifunctional crosslinking agent.
- a crosslinking agent having both an NHS ester function and a benzophenone photoactivatable function has been synthesized: N-hydroxysuccinimidyl (S) -3- (4-benzoylphenyl) -2- ( ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamido) propanoate or JMV3480 (see Figure 10).
- Scheme 11 Synthetic route of the heterobifunctional agent JMV3480.
- Example 3 Applications of the crosslinking agent JMV3378 to study model proteins Cytochrome c and horse heart apomyoglobin were used as model proteins.
- the protein samples were analyzed by MALDI-TOF mass spectrometry using the sinapinic acid matrix as a dried drop deposit. After checking the degree of crosslinking obtained, the samples were digested with trypsin. Each peptide mixture obtained was analyzed by mass spectrometry with the HCCA acid matrix in dried drop type deposition and with the HCCE matrix in thin layer type deposition.
- Table 1 List of experimental masses and predicted peptides crosslinked by the
- the detected signals may correspond to different types of peptide crosslinks (type 0, 1 and 2). After verifying the theoretical distances between the side chains of cytochrome c lysines, a total of 8 types of crosslinking reactions of type 1 and 2 were identified (see Figure 12).
- Table 2 List of experimental masses and predicted peptides crosslinked by JMV3378.
- LSDGEWQQV 10 LNVWGkVEAD 20 IAGHGQEVLI 30 RLFTGHPETL 40 EKFDkFKHLj- 50
- the spectrometer is equipped with a SCOUT source and the desorption / ionization is carried out using a nitrogen laser with a wavelength of 337 nm and the frequency used is 50 Hz.
- the laser power can be modulated thanks to an attenuator.
- the calibration of the MALDI - TOF spectrometric analyzes was carried out in external mode. Two calibration kits were used:
- the external calibration is performed by depositing one of these commercial mixtures with a suitable matrix (eg ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid (HCCA) for the “standard calibration peptide II", sinapinic acid (AS) for the “Standard Protein Calibration I”) near the deposit (s) to be analyzed.
- a suitable matrix eg ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid (HCCA) for the “standard calibration peptide II", sinapinic acid (AS) for the “Standard Protein Calibration I
- Samples are deposited on a Bruker Daltonics MTP 384 target plate in polished steel using two methods.
- Dried Drop Deposition has been preferred in most assays using the HCCA matrix. It is carried out by co-crystallization of a drop of matrix solution and a drop of an analyte solution. Each deposit can contain between 0.5 and 1 ⁇ L of each solution.
- HCCA matrix solutions are prepared by saturation in a water / ACN / TFA solution (50: 50: 0.1).
- HCCE consists of depositing 0.5 ⁇ L of a saturated solution of HCCE acetone in band on two targets marked on the deposit plate.
- 0.5 ⁇ L of analyte solution is deposited on a target containing the dried matrix deposition. Due to the difficulty of reproducing the deposit aspect by this method, it is preferable to renew the deposit a second time for each analysis.
- 0.5 ⁇ L (0.5 pmol) of peptide solution at 1 ⁇ M in a water / ACN / TFA mixture (50: 50: 0.1) are co-crystallized on a deposit of 0.25 ⁇ L of saturated neutral HCCE matrix in acetone.
- the model peptides JMV3346, JMV3347, JMV3348, JMV3349 and JMV3350 were manually synthesized on a solid support according to an Fmoc strategy.
- Peptide 3 was synthesized on a solid support according to an Fmoc strategy using a microwave synthesizer.
- the three peptides were synthesized with as coupling agent HBTU in the presence of NMM on a Fmoc-Rink-amide-aminomethyl-polystyrene resin (100-200 mesh, 0.7 mmol / g).
- the medium is placed in an ice bath to stabilize its temperature at 0 0 C. 2 times
- 0.800 g of compound 1 are dissolved in the presence of 1.640 g of benzyltriethylammonium chloride in 75 ml of DMAC under argon. 10 g of K 2 CO 3 are introduced into the medium and then 30 ml of tert-butyl bromide are added. The medium is stirred vigorously at 55 ° C. for 30 hours. The medium is cooled in the open air to room temperature.
- the medium is placed in an ice bath and 400 ml of cold water are added.
- the aqueous phase is extracted with 5 times 100 ml of AE.
- Each organic phase is then extracted with 3 times 50 ml of saturated aqueous NaHCO 3 solution and 2 times 50 ml of water.
- the combined organic phases are dried with MgSO4, filtered on a frit then the solvent is evaporated under reduced pressure.
- the compound is purified by column chromatography with the following eluent:
- the balloon is purged with argon.
- the medium is filtered on celite and rinsed several times with methanol.
- the solvent is then evaporated off under reduced pressure and the medium is then taken up in 100 ml of EA and extracted with twice 50 ml of a saturated aqueous solution of NaHCO 3 then 2 times 50 ml of water.
- the organic phase is dried with MgSO 4 and filtered on a frit. The solvent is then evaporated under reduced pressure.
- the compound is purified by column chromatography with eluent: EP / AE (95: 5).
- the reaction is stopped after 1 hour by the addition of 400 ml of water.
- the solvent is then evaporated under reduced pressure.
- the medium is taken up with 200 mL of water and then extracted with 4 times 200 mL of EA. Each organic phase is washed with 250 mL of brine.
- the organic phases are combined and then dried with MgSO 4 and filtered on a frit.
- the solvent is evaporated under reduced pressure.
- the crude reaction product is purified by column chromatography using an AE / EP mixture (3: 7) as eluent.
- 250 mg of compound 7 are dissolved in 50 ml of a TFA / TIS / H 2 O mixture (95: 2.5: 2.5) with magnetic stirring. After 1 hour, the solvent is evaporated under reduced pressure. The medium is taken up in 50 ml of a water / ACN mixture (50:50), frozen with liquid nitrogen and freeze-dried.
- Synthesis protocol 775 mg of compound 8 are dissolved in 100 mL of THF and 2.115 g of DCC are added. After 10 minutes, the medium is cloudy and 715 mg of HOSu are added.
- the solvent is evaporated under reduced pressure and the medium is taken up with a minimum of cold DMF and placed in an ice bath for 10 minutes. Dicyclohexylurea precipitates to a white powder. The medium is filtered on a sinter of porosity 4 cold. The process is repeated a second time. The solvent is then evaporated under reduced pressure. The precipitate is dissolved in 300 mL of EA and extracted with 2 times 100 mL of an aqueous solution of 1M KHSO4. The organic phase is dried with MgSO 4, filtered on frit and the solvent is evaporated under reduced pressure.
- the solvent is evaporated under reduced pressure.
- the medium is taken up with 200 ml of EA and then extracted with 3 times 80 ml of an aqueous solution of KHSO 4 IM.
- the organic phase is then dried with MgSO 4 and then filtered on a frit.
- the solvent is evaporated under reduced pressure.
- the compound is purified by preparative HPLC with the following gradient:
- fractions containing the purified compound are pooled, frozen with liquid nitrogen and lyophilized.
- the dicyclohexylurea precipitated to a white powder is filtered on a sinter of porosity 4 cold.
- the solvent is then evaporated off under reduced pressure and then the medium is taken up in 150 ml of EA and extracted with 4 times 100 ml of an aqueous solution of 1M KHSO 4 .
- the organic phase is dried with MgSO4, filtered on frit and the solvent is evaporated under reduced pressure.
- 3,516 of 5-aminoisophthalic acid are dissolved in 150 ml of THF containing 20 ml of a 10% aqueous sodium hydroxide solution. After 5 minutes with magnetic stirring, the diacid is completely solubilized. 7.729 mL of 2-chloroacetyl chloride are slowly added to the medium and the pH of the solution is maintained at 10 by addition of 1N sodium hydroxide solution under strong magnetic stirring. The reaction is exothermic. After stirring for 5 minutes, the THF is evaporated under reduced pressure. The medium is taken up with 400 ml of EA and then extracted with 2 times 100 ml of an aqueous solution of KHSO 4 IM. The aqueous phases are extracted with 2 times 100 ml of AE.
- the reaction is stopped and the medium is acidified by adding a few milliliters of a 6N aqueous HCl solution to a pH below 3.
- the medium is then extracted with 8 times 100 ml of AE.
- Each organic phase is washed with 100 mL of an aqueous solution of KHSO 4 IM.
- the organic phases are combined and dried with MgSO 4 and filtered on a frit. The solvent is evaporated under reduced pressure.
- 500 mg of compound 10 are dissolved in 200 ml of pyridine and 100 ⁇ l of piperidine are added. After 5 minutes, 246 mg of 4-hydroxybenzaldehyde are added and the medium is placed in an oil bath at 50 ° C. for 3 hours. The medium is cooled slowly to room temperature. It is added dropwise to 150 ml of an aqueous solution of KHSO 4 IM. The pH is below 4. A yellow precipitate appears and the solution is triturated with a spatula. The precipitate is filtered on a porosity frit 4 and then dissolved in DMF. The solvent is evaporated under reduced pressure. The solid is taken up in 150 ml of an aqueous solution of KHSO 4 IM and then triturated and filtered as above.
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Abstract
L'invention concerne Agent de réticulation des protéines de formule (I) dans laquelle R1 est un groupe aryle éventuellement substitué une ou plusieurs fois par un groupement choisi dans le groupe constitué des groupements hydroxy, C1-C4 alkyle, OBoc, SO3Na, Deu, C1-C4 alcoxy, R2 est N, (II), (III), ou (IV), n et m sont des entiers identiques ou différents compris antre 0 et 10, p est un entier compris entre 0 et 5, k est 0, 1, 2 ou 3, X et X', identiques ou différents, sont une fonction réactive des protéines; ainsi qu'une méthode d'analyse structurale d'une protéine ou d'un complexe de protéines.
Description
AGENTS DE RETICULATION
L'invention concerne le domaine des analyses structurales des protéines par spectrométrie de masse. L'analyse des structures tridimensionnelles des protéines et de leurs interactions avec leur environnement (e.g. ADN, protéines, membranes) est très importante pour la compréhension des fonctions biologiques des protéines dans leur milieu naturel.
Afin d'obtenir ces données structurales à haute résolution, la RMN et la DRX sont des méthodes d'analyse couramment utilisées. Cependant, ces méthodes sont très limitées par certaines contraintes : cristallisation de protéine, utilisation de grande quantité de matériel (5 à 10 mg de protéines).
L'utilisation d'agents de réticulation chimique conjointement à la spectrométrie de masse est une méthode de plus en plus fréquente pour la détermination de données structurales à basse résolution permettant de s'affranchir des contraintes précédentes.
Cette approche consiste à effectuer une digestion enzymatique des protéines du milieu réactionnel après avoir réalisé la réaction de réticulation en solution. Le mélange de peptides obtenu est alors analysé par spectrométrie de masse afin d'identifier les peptides modifiés par les agents de réticulation. Des données structurales sont alors obtenues de cette identification. Cette stratégie a été utilisée dans le cadre d'études structurales à basse résolution de protéines ou d'interactions protéine-protéine.
Les agents de réticulation chimique possèdent une ou deux fonctions réactives reliées par un bras espaceur. Ces fonctions réactives sont capables de réagir avec les chaînes latérales des aminoacides de protéines. Après identification des résidus aminoacides des protéines modifiés par les deux fonctions réactives, des contraintes de distances au sein de ces protéines peuvent être déterminées grâce à la longueur connue du bras espaceur de l'agent de réticulation chimique.
Des agents homobifonctionnels, tels que les esters bis-imido ou les halogénures dialkyles furent mis au point et utilisés sur des protéines dès les années 1950.
Toutefois, l'utilisation d'agents de réticulation des protéines en solution pose un problème majeur de détection de peptides d'intérêts dans un milieu mixte complexe comprenant à la fois les peptides modifiés et non modifiés par les agents de réticulation.
En effet, au nombre important de type de produits de réticulation, s'ajoute la complexité du mélange peptidique résultant de la digestion enzymatique. Par conséquent, l'intensité des signaux des peptides d'intérêt est souvent très faible. Pour palier à cette difficulté, de nombreuses stratégies mettant en jeu le marquage d'agents de réticulation chimique ont été développées. Elles permettent soit l'enrichissement des peptides réticulés à l'aide de méthodes de purification soit la discrimination de leurs signaux lors des analyses par spectrométrie de masse. Parmi ces méthodes, on peut citer :
- Marquage isotopique
L'expérience de réticulation est effectuée avec un mélange équimolaire de deux agents de réticulation de structure identique mais dont l'un des deux est modifié par des isotopes stables. Les isotopes utilisés sont le deutérium et l'oxygène 18. Ce type de marquage aura pour effet de créer un dédoublement du signal du peptide réticulé grâce à la différence de masse entre les deux types d'agents de réticulation ce qui permet de faciliter la détection de peptides modifiés.
- Agent de réticulation clivable
L'utilisation d'une fonction clivable au sein de l'agent de réticulation permet de faciliter l'identification des peptides réticulés par comparaison entre le spectre de masse de tous les signaux de peptides d'intérêt et celui obtenu après clivage de l'agent de réticulation. Il est ainsi possible d'identifier les signaux ayant été atteints par le clivage et donc d'en déduire les masses des produits modifiés par l'agent de réticulation. Le clivage peut être induit soit par un traitement chimique ou directement lors d'analyses en spectrométrique de masse en tandem (MS/MS).
- Marquage fluorescent
L'utilisation d'un agent de réticulation marqué avec un motif fluorescent a pour but de faciliter la détection de peptides réticulés lors de la purification par chromatographie . - Purification par affinité
Le marquage d'un agent de réticulation trifonctionnel avec un motif biotine permet d'effectuer une purification par affinité avec des billes d'avidine. Cette méthode permet donc d'enrichir l'échantillon en peptides réticulés après l'étape de digestion enzymatique. - Marqueur UV-absorbant
L'utilisation d'un marquage de peptides avec un composé UV-absorbant afin d'améliorer la détection en spectrométrie de masse MALDI-TOF a été divulguée dans la demande WO03/087839. Cette étude a montré que le marquage de peptides avec le marqueur HCCA permet d'augmenter l'intensité de leurs signaux. II existe donc un besoin en une nouvelle méthode permettant d'améliorer la sensibilité de détection de peptides d'intérêt en spectrométrie de masse MALDI-TOF et la discrimination de leur signal dans le cas de mélanges complexes, en particulier pour l'étude de structures tridimensionnelles basse résolution de protéines par exemple en identifiant des contraintes de distances entre différentes chaînes latérales. Le Demandeur a précédemment montré (Lascoux et al., Discrimination and
Sélective Enhancement of Signais in the MALDI Mass Spectrum of a Protein by Combining a Matrix-Based Label for Lysine Residues with a Neutral Matrix, Angew. Chem. 2007, 119, 5690-5693) que l'utilisation conjointe de l'acide α-cyano-4- hydroxycinnamique (HCCA) comme marqueur de peptides et une matrice neutre de structure similaire, l'α-cyano-4-hydroxycinnamate de méthyle (HCCE), lors des analyses par spectrométrie de masse MALDI-TOF, permet d'augmenter le signal de peptides marqués en faible proportion dans un mélange de peptides non marqués, et d'obtenir un effet de discrimination de leur signal appelé « effet de discrimination HCCA/HCCE ».
HCCA HCCE PM = 189,18 g/mol PM = 203,20 g/mol
De manière inattendue et surprenante, le Demandeur a maintenant montré que des agents de réticulation bifonctionnels marqués HCCA ou un dérivé de HCCA permettent d'identifier par spectrométrie de masse MALDI-TOF des peptides d'intérêt d'une protéine dans un mélange peptidique complexe par marquage en solution alors que lesdits peptides ne sont pas visibles sur le spectre de masse MALDI-TOF de la protéine. Cet effet sélectif est encore accentué par l'utilisation de la matrice HCCE.
Résumé de l'invention
L'invention a donc pour objet un agent de réticulation des protéines de formule
(I)
Ri est un groupe aryle éventuellement substitué une ou plusieurs fois par un groupement choisi dans le groupe constitué des groupements hydroxy, Ci-C4 alkyle, OBoc, SO3Na, Deu, Ci-C4 alcoxy,
X et X', identiques ou différents, sont une fonction réactive des protéines.
Un autre objet de l'invention est un procédé de préparation d'un agent de réticulation selon l'invention.
Un autre objet de l'invention est l'utilisation d'un agent de réticulation selon l'invention pour l'analyse de la structure tridimensionnelle d'une protéine en spectrométrie de masse.
Un autre objet de l'invention est une méthode d'analyse structurale d'une protéine ou d'un complexe de protéines comprenant les étapes suivantes : a) réticulation de la protéine ou du complexe protéique sur l'agent de réticulation selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 par les fonctions X et/ou X', b) digestion enzymatique de la protéine ou complexe de protéines fixé à l'agent de réticulation sur selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, c) analyse par spectrométrie de masse.
Description détaillée DEFINITIONS
Par groupement « Ci-1O alkyle », on entend une chaîne hydrocarbonée saturée, linéaire ou ramifiée, comportant de 1 à 10 atomes de carbone, comme par exemple un groupement, méthyle, éthyle, isopropyle, tertio-butyls, pentyle, etc. Par groupement « C2-io alcényle », on entend une chaîne hydrocarbonée, linéaire ou ramifiée, comportant au moins une insaturation et comportant de 2 à 10 atomes de carbone, comme par exemple un groupement éthényle, propényle, 2,4- hexadiényle, etc.
Par groupement « aryle », on entend un groupement aromatique, comportant de préférence de 5 à 10 atomes de carbone, comprenant un ou plusieurs cycles et comprenant éventuellement un hétéroatome, en particulier un oxygène, un azote ou un soufre, comme par exemple un groupement phényle, furane, indole, pyridine, naphtalène, etc.
Le terme « halogène » désigne un fluor, un brome, un chlore ou un iode.
Boc désigne un groupement protecteur d'aminé de formule t- butyloxycarbonyle.
Deu désigne deutérium.
Par groupement « (Ci-Ce)alcoxy », on entend, au sens de la présente invention, un groupe (Ci-C<5)alkyle, tel que défini ci-dessus, lié à la molécule par l'intermédiaire d'un atome d'oxygène. A titre d'exemple, on peut citer les groupes méthoxy, éthoxy, propoxy, isopropoxy, butoxy ou encore tert-butoxy. tBu désigne tert-butyle.
LES AGENTS DE RETICULATION
L'agent de réticulation des protéines de l'invention présente la formule (I)
Ri
Ri est un groupe aryle éventuellement substitué une ou plusieurs fois par un groupement choisi dans le groupe constitué des groupements hydroxy, C1-C4 alkyle, OBoc, SO3Na, Deu, Ci-C4 alcoxy,
R2 est N,
, ou
n et m sont des entiers identiques ou différents compris antre 0 et 10, de préférence compris entre 1 et 5 p est un entier compris entre 0 et5, k est 0, 1, 2 ou 3,
X et X', identiques ou différents, sont une fonction réactive des protéines.
Avantageusement, n = m.
De préférence, Ri est un groupe phényle éventuellement substitué une ou plusieurs fois par un groupement choisi dans le groupe constitué des groupements hydroxy, Ci-C4 alkyle, OBoc, SO3Na, Deu, Ci-C4 alkcoxy.
De manière particulièrement préférée, Ri est un groupe phénoxy, tout particulièrement un groupe para-hydroxy-phényle.
De préférence, R2 est N,
ou
Avantageusement, l'agent de réticulation selon l'invention présente la formule (II), (III) ou (IV)
(H)
(III)
(IV)
Avantageusement, X et X', identiques ou différents, sont choisis dans le groupe constitué des fonctions imidoester, ester N-hydroxysuccinimide, isocyanate, isothiocyanate, N-maléimide, disulfure, 1 ,2-dicarbonyle, benzophénone et arylazide. L'agent de réticulation de l'invention comprend deux fonctions réactives des protéines X et X'. Il est possible de concevoir une variété très importante d'agents de réticulation suivant la nature des fonctions réactives utilisées qui peuvent être identiques ou pas (i.e. agent homo ou hétérobifonctionnel).
On appelle « réticulation de la protéine ou du complexe protéique sur l'agent de réticulation sur support solide de l'invention » la réaction d'une ou plusieurs fonctions réactives X et/ou X' de l'agent de réticulation A avec un ou plusieurs groupements de la protéine ou du complexe protéique résultant en la fixation covalente de ladite protéine ou dudit complexe protéique à l'agent de réticulation A.
Les agents de réticulation homobifonctionnels possèdent deux fonctions réactives identiques pouvant réagir avec le même type de fonction.
Lors d'expériences de réticulation sur des protéines, une des deux fonctions réactives réagit sur une chaîne latérale d'un résidu aminoacide. La seconde fonction réactive réagit ensuite soit de façon intramoléculaire sur une autre chaîne latérale avoisinante, soit sur une chaîne latérale d'un résidu aminoacide appartenant à une autre protéine. Etant donné que les deux fonctions réactives sont identiques, le protocole de réaction se fait en une seule étape.
Les agents de réticulation hétérobifonctionnels possèdent deux fonctions réactives ciblant différents aminoacides.
Ils sont généralement utilisés pour réticuler des protéines en deux étapes (e.g. agents de réticulation possédant une fonction réactive non-spécifique et spécifique). Une fois la première fixation effectuée, il est donc possible d'effectuer une purification des protéines modifiées avant d'effectuer la réaction de la deuxième fonction réactive. Ceci peut favoriser les réactions intramoléculaires et peut permettre d'obtenir des données plus diversifiées qu'avec des agents de réticulation homobifonctionnels .
LES FONCTIONS REACTIVES X et X' sont des fonctions réactives spécifiques des protéines capables de réagir avec un groupement réactif des protéines.
Avantageusement, X et X', identiques ou différents, sont choisies dans le groupe constitué des fonctions réactives spécifiques des aminés, des fonctions réactives spécifiques des acides carboxyliques, des fonctions réactives spécifiques des thiols, des fonctions réactives spécifiques des guanidines, des fonctions réactives non spécifiques.
Les fonctions réactives spécifiques des aminés réagissent avec les aminés primaires présentes sur les protéines. Il existe deux types d'aminés primaires au sein d'une protéine : N-terminale et N-ε des lysines. Des études ont montré qu'il est possible de les cibler de façon indépendante grâce à leur différence de valeur de pKa respectif (pKaN_terminale = 8 et pKaN_e des lysines = 10,5).
Trois types de fonctions sont couramment utilisées dans ce but : les imidoesters, les esters N-hydroxysuccinimide (ΝHS), les isocyanates (et isothiocyanates). Ce sont tous des agents activés électrophiles possédant un bon groupe partant par substitution nucléophile. Les fonctions réactives spécifiques des acides carboxyliques sont présentes dans les résidus Asp, Glu et en partie C-terminale des protéines. Ces fonctions ne sont pas réactives en soi et nécessitent une activation.
Cette activation est généralement effectuée avec des carbodiimides. La O- acylurée formée par cette activation permet de réagir avec une aminé primaire et de former une liaison amide.
Les fonctions réactives spécifiques des thiols sont les fonctions N-maléimide et disulfure.
La fonction thiol est la plus réactive des fonctions nucléophiles au sein d'une protéine. Cependant, les chaînes latérales des résidus cystéines sont souvent engagées dans des ponts disulfures ce qui empêche leur réaction avec des agents de réticulation chimique. Par conséquent, une réaction de réduction (avec de l'éthanedithiol ou EDT) de ces liaisons est généralement nécessaire afin de retrouver les fonctions thiols libres. Le pKa des thiols des résidus cystéines étant d'environ 8,6, leur réactivité augmente lorsque l'on forme l'ion thiolate à pH supérieur à 8,6. Les fonctions réactives spécifiques des guanidines sont les composés 1,2- dicarbonyl qui réagissent spécifiquement avec les chaînes latérales des arginines.
Les fonctions réactives non spécifiques réagissent sur des molécules par exposition à la lumière UV. Un agent idéal photoréactif doit avoir différentes qualités : - II a une forte réactivité
- Il est capable de réagir indifféremment sur n'importe quel type de résidu
- Il est stable dans le noir
- Il réagit avec une lumière dont la longueur d'onde ne cause aucun dommage photolytique à l'échantillon biologique - Le produit de sa réaction doit être stable.
Les mécanismes de réaction de ces fonctions sont généralement radicalaires ce qui permet d'agir indifféremment sur divers résidus. D'une manière générale, les agents de réticulation chimique ayant une fonction réactive non-spécifique possèdent aussi une fonction réactive spécifique. De cette manière, il est possible de cibler des résidus d'intérêt avec une première étape de fixation mettant en jeu la fonction réactive spécifique puis de marquer tous les résidus présents dans un certain périmètre (défini par la longueur du bras espaceur liant les deux fonctions réactives) grâce à l'action de la fonction réactive non-spécifique.
Il existe deux types de fonctions couramment utilisées dans ce but : les benzophénones et les arylazides.
PROCEDE DE PREPARATION
Les agents de réticulation de l'invention sont préférentiellement préparés de la façon suivante. Le procédé de préparation des agents de réticulation de l'invention comprend trois étapes.
La première étape de ces trois étapes consiste en l'étape (a) ou (a'). L'étape (a) consiste en un couplage peptidique entre l'aminé RR'NH et l'acide carboxylique R1
l'un des deux H et l'autre
l'un des deux H et l'autre
avec Y est H ou tBu. où Z signifie un groupe alkyle en Ci à Cs
L'étape (a') comprend les étapes (i), (ii) et (iii)
HaI
HaI
L'étape (i) consiste en la réaction de RR 'NH avec O où HaI est un atome d'halogène en présence d'une base pour donner
O
HaI
L'étape (ii) consiste en la réaction de RR'N
O
CN avec un cyanure, tel que KCN, pour donner RR'N
O
CN
L'étape (iii) consiste en la réaction de RR'N avec RiCHO en présence d'une base pour donner
L'étape (b) consiste en l'hydrolyse éventuelle de l'ester obtenu à l'étape (a) ou (a') en acide pour donner R1
avec R2 et R2' représentant : - tous deux -(alkyl)-COOH
-
l'un des deux H et l'autre où Z signifie un groupe alkyle en Ci à Cs
L'étape (c) consiste en la réaction du composé obtenu à l'étape (b) précédente pour obtenir une fonction réactive des protéines.
Cette fonction réactive des protéines est préférentiellement une fonction ester NHS.
Un couplage peptidique avec un acide carboxylique est réalisé de préférence en présence d'un agent de couplage, tel que le diisopropylcarbodiimide (DIC), le dicyclohexylcarbodiimide (DCC), le chlorhydrate de l-(3-diméthylaminopropyl)-3-
éthylcarbodiimide (EDC), le carbonyldiimidazole (CDI), le 2-H-benzotriazole-l-yl)- 1,1,3,3-tétraméthyluronium hexafluorophosphate (HBTU), le 2-(lH-benzotriazole- 1 - yl)-l,l,3,3-tétraméthyluronium tétrafluoroborate (TBTU) ou encore le O-(7- azobenzotriazol- 1 -yl)- 1 , 1 ,3,3-tétraméthyluronium hexafluorophosphate (HATU), éventuellement associé à un auxiliaire de couplage tel que le N-hydroxy succinimide (NHS), le N-hydroxy benzotriazole (HOBt), le 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-l,2,3- benzotriazole (HOOBt), le l-hydroxy-7-azabenzotriazole (HOAt) ou le N- hydroxysylfosuccinimide (sulfo ΝHS).
Les réactions de protection/déprotection des fonctions aminé et les réactions de couplage peptidique sont des réactions bien connues de l'homme du métier.
METHODE DE RETICULATIOΝ DE PROTEINES EN SOLUTION POUR ANALYSE STRUCTURALE PAR SPECTROMETRIE DE MASSE *> Réticulation de protéine L'agent de réticulation chimique en solution est mis en présence de la protéine dissoute.
Avantageusement, l'agent de réticulation chimique supporté est mis en présence de la protéine dissoute dans un tampon salin afin de s'approcher des conditions physiologiques. II en résulte une fixation covalente de la protéine sur l'agent de réticulation par l'intermédiaire des fonctions réactives X et/ou X' »> Digestion enzymatique
Les protéines réticulées sont digérées. Pour ce faire, le mélange est mis en présence d'une enzyme (e.g. la trypsine) solubilisée, de préférence dans un tampon salin.
*> Analyse par spectrométrie de masse
SPECTROMETRIE DE MASSE
De préférence, l'analyse par spectrométrie de masse est effectuée par spectrométrie MALDI - TOF.
Les échantillons sont déposés soit en goutte séchée, soit sur couche mince.
Le dépôt en goutte séchée est préféré. Il est réalisé par co-cristallisation d'une goutte de solution matricielle et d'une goutte d'une solution d'analyte.
LOGICIEL D'ANALYSE DES DONNEES DE SPECTROMETRIE DE MASSE Avantageusement, les données de l'analyse par spectrométrie de masse des mélanges de peptides sont analysées par un logiciel.
En effet, l'analyse par spectrométrie de masse des mélanges de peptides fournis par l'étape de digestion enzymatique apporte généralement une quantité importante de données. Afin de faciliter l'identification des peptides détectés lors de ces expériences, de nombreux logiciels de prédiction ont été créés (e.g. Pro-
CrossLink, VirtualMSLab, SearchXLink et MS2Assign).
Le but de ces logiciels est de fournir rapidement une liste de peptides potentiels non modifiés ou modifiés par l'agent de réticulation utilisé, correspondant à chaque valeur m/z du spectre de masse. Les valeurs expérimentales sont comparées aux valeurs théoriques calculées à partir d'une digestion in silico du modèle protéique étudié.
Dans le cadre de la présente invention, un logiciel de prédiction, appelé MSX- 3D, a été créé au sein de l'Institut de Biologie et de Chimie des Protéines (IBCP) à Lyon.
MATRICES MALDI-TOF
La matrice HCCA est couramment utilisée lors d'analyses par spectrométrie de masse MALDI-TOF de peptides. Elle est capable d'absorber la lumière UV du laser de la source MALDI. L'énergie qu'elle absorbe est restituée sous forme d'énergie thermique et permet la désorption des composés co-cristallisés avec la matrice.
L'ester α-cyano-4-hydroxycinnamate de méthyle, appelé HCCE ou α-CNME, est une matrice relativement peu utilisée en analyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF. C'est l'ester méthylique de la matrice HCCA. Du fait de leurs structures proches, elles présentent toutes deux des caractéristiques similaires : - Poids moléculaires (189 g/mol pour l'HCCA et 203 g/mol pour l'HCCE)
- Mêmes aspects physiques : poudres jaunes cristallines
- Structures aromatiques similaires leur conférant des propriétés d'absorption comparables.
Cependant, il existe un facteur important pouvant les différencier : leur capacité à donner un proton. En effet, la matrice HCCA possède deux fonctions acides de pKa distincts : la fonction acide carboxylique de pKai égal à 2 et la fonction alcool phénolique de pKa2 égal à 8. Par contre, la matrice HCCE ne possède qu'une seule fonction acide : la fonction alcool phénolique de pKai égal à 8.
La matrice HCCA possède donc une fonction acide carboxylique permettant de jouer un rôle de donneur de proton lors du processus d'ionisation impliqué dans la source MALDI : c'est pourquoi elle est appelée matrice acide. La matrice HCCE est beaucoup moins efficace dans ce même rôle car elle ne possède qu'une seule fonction faiblement acide (i.e. alcool phénolique de pKa3 = 8). Elle est donc appelée matrice neutre.
FIGURES
Figure 1 : Analyse d'un mélange équimolaire des cinq peptides modèles JMV3346 à JMV3350 avec la matrice HCCA.
Figure 2 : Spectre de masse du mélange peptidique issu de la digestion trypsique du cytochrome c non modifié (avec matrice HCCA).
Figure 3 : Spectre de masse de la digestion trypsique après réticulation du cytochrome c à 100 μM avec R = 0,5 (avec matrice HCCA) : "Φ" signal de peptide potentiellement modifié par le JMV3378.
Figure 4 : Spectre de masse de la digestion trypsique après réticulation du cytochrome c à 100 μM avec R = 0,5 (avec matrice neutre HCCE) : "Φ" signal de peptide potentiellement modifié par le JMV3378.
Figure 5 : Spectre de masse du mélange peptidique issu de la digestion trypsique de l'apomyoglobine non modifiée (avec matrice HCCA).
Figure 6 : Spectre de masse de la digestion trypsique après réticulation de l'apomyoglobine à 100 μM avec R = 0,2 (avec matrice HCCA) : Hh signal de peptide potentiellement modifié par l'agent de réticulation JMV3378. Figure 7 : Spectre de masse de la digestion trypsique après réticulation de l'apomyoglobine à 100 μM avec R = 0,2 (avec matrice neutre HCCE) : » signal de peptide potentiellement modifié par l'agent de réticulation JMV3378. Les exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée.
EXEMPLES
Exemple 1 : Influence de la fonction alcool du marqueur HCCA
Les cinq peptides modèles sont des décapeptides amidés en position C- terminale possédant la même séquence aminoacide dans le but de ne pas influencer leur capacité d'ionisation intrinsèque en spectrométrie de masse MALDI-TOF. Ils ont été synthétisés sur support solide en stratégie Fmoc. Un premier peptide JMV3346 n'est pas marqué et sert de référence pour évaluer l'effet de discrimination spectrale.
Les peptides modèles JMV3347, JMV3348 et JMV3349 ont été synthétisés par couplage de l'HCCA et deux dérivés en position 4 (i.e. acide α-cyanocinnamique ou
CCA, acide α-cyano-4-méthoxycinnamique) avec le décapeptide entièrement protégé et fixé sur le support solide. Le peptide JMV3350 a été obtenu par acétylation de la fonction alcool phénolique de l'HCCA couplé au décapeptide entièrement protégé et fixé sur le support solide.
Synthèse peptidique sur support solide Stratégie Fmo
H-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Gly-Pro-Leu-ile-Gly-Ala-Phe— N— — Q
JMV3348 JMV3350
H-Arg-Lys-Asn-Gly-Pro-Leu-ιle-Gly-Ala-Phe-NH2 JMV3346
CCa-Arg-Lys-Asn-Gly-Pro-Leu-ile-Gly-Ala-Phe-NH2 JMV3347
HCCa-Arg-Lys-Asn-Gly-Pro-Leu-ile-Gly-Ala-Phe-NH2 JMV3348
MCCa-Arg-Lys-Asn-Gly-Pro-Leu-ile-Gly-Ala-Phe-NH2 JMV3349
ACCa-Arg-Lys-Asn-Gly-Pro-Leu-ile-Gly-Ala-Phe-NH2 JMV3350
Schéma 1 : Synthèses de 5 peptides modèles marqués ou non avec l'HCCA et des dérivés.
Pour cela, une analyse d'un mélange équimolaire des cinq peptides modèles (JMV3346 à JMV3350) a été effectuée avec la matrice HCCA.
Cette analyse montre que le marqueur HCCA permet d'obtenir une augmentation optimale de l'intensité de signal. De plus, malgré une légère amélioration de la détection des peptides JMV3347, JMV3349 et JMV3350 par rapport au peptide non-marqué, on observe que l'absence de la fonction alcool phénolique ou sa modification par méthylation ou acétylation engendre une forte diminution (environ 2/3 du signal par rapport au signal du JMV3348) de la détection des peptides marqués. Cette diminution peut être due à une hydrophobicité supérieure des marqueurs CCA, MCCA et ACCA induite par la perte du proton de la fonction alcool.
Exemple 2 : Elaboration d'agents de réticulation bifonctionnels marqués par THCCA
2-1 - Synthèse d'un agent homobifonctionnel
2 - 1 - a - Agent JMV3378 avec un motif iminodiacétique
Le N-(α-cyano-4-hydroxycinnamyl)iminodiacétate de N- hydroxysuccinimidyle ou JMV3378 a été préparé (Formule (H)).
PM = 498,40 g/mol
Bras espaceur : 6,2 A (π)
Le couplage direct entre la fonction acide carboxylique de l'HCCA et l'aminé secondaire de l'ester iminodiacétate de diéthyle a tout d'abord été envisagé afin de synthétiser le JMV3378.
Schéma 2 : Première approche pour la synthèse du JMV3378 par couplage direct entre l'HCCA et l'ester iminodiacétate de diéthyle.
Cette voie de synthèse n'a pu aboutir. En effet, l'étape de saponification a entraîné une dégradation du diester de départ.
Afin d'éviter l'étape de saponification des esters éthyliques, une nouvelle approche utilisant les esters tert-butyles a été envisagée (cf. Schéma 3). Ces esters sont facilement hydrolysables dans une solution d'acide trifluoroacétique (TFA).
Contrairement aux traitements basiques, l'HCCA ne semble pas être sensible au TFA.
En effet, les préparations d'échantillons avec l'HCCA en spectrométrie de masse
MALDI-TOF ainsi que les peptides modèles marqués avec l'HCCA (JMV3348) ont supporté l'utilisation de solutions concentrées de TFA.
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26)
Schéma 3 : Deuxième approche pour la synthèse du JMV3378 par couplage direct entre l'HCCA et l'ester iminodiacétate de di-terf-butyle.
Le composé clef de cette approche est l'ester iminodiacétate de di-te/t-butyle 4. Deux voies de synthèse ont été élaborées (cf. Schéma 4).
VOIE N°1
I
O i
H ,I\L 1
HO' "OH
Schéma 4 : Synthèse de l'ester iminodiacétate de di-te/t-butyle.
La voie N°l comporte trois étapes. L'aminé secondaire du diacide iminodiacétique est tout d'abord protégée avec un groupement benzyloxycarbonyle afin d'obtenir le composé 1. Cette réaction est effectuée à l'aide d'une solution de chloroformiate de benzyle dans la soude avec un rendement quantitatif. Une réaction d'estérifïcation du composé 1 effectuée à 55°C dans une solution de
diméthylacétamide (DMAC) contenant du chlorure de benzyltriéthylammonium, du bicarbonate de potassium et du bromure de tert-butyle, a permis d'obtenir le composé 2 avec un rendement de 17%. Enfin, la déprotection de l'aminé permettant d'aboutir au composé 4, a été réalisée avec un rendement de 50% grâce à une hydrogénolyse effectuée dans du méthanol avec un bullage d'hydrogène catalysé par du palladium sur charbon.
La voie N°2 ne compte que deux étapes. Le composé 3 est obtenu directement par une double substitution nucléophile de l'aminé primaire de la benzylamine sur deux molécules de 2-bromoacétate de tert-butyls. Cette réaction est réalisée avec un rendement de 99% dans une solution de diméthylformamide (DMF) contenant du bicarbonate de potassium à 45°C. L'hydrogénolyse du groupe benzyle conduisant au composé 4 a été effectuée quantitativement à l'aide d'un bullage d'hydrogène et de palladium sur charbon dans de l'éthanol à 95%.
La voie N°2 semble être plus intéressante car elle permet d'obtenir le diester final 4 en deux étapes de très bon rendement et utilise un ester tert-butylique commercial. La préparation de l'ester tert-butyle est l'étape limitante dans la voie N°l . D'autre part, cette voie compte une étape en plus et ne permet pas d'obtenir le diester avec un aussi bon rendement que la voie N°2.
L'élaboration de ces deux voies a pu permettre d'envisager une voie de synthèse permettant d'obtenir des agents homologues (cf. Schéma 5). Dans ce cas, l'étape d'estérifïcation est nécessaire car les esters tert-butyliques homologues supérieurs du 2-bromoacétate ne sont pas commerciaux.
Schéma 5 : Agents de réticulation chimique homologues au JMV3378.
La synthèse du composé 7 a tout d'abord été envisagée par couplage direct entre l'acide HCCA et l'aminé secondaire du composé 4 (cf. Schéma 6).
Schéma 6 : Tests de couplage du composé 4 avec 1ΗCCA pour la synthèse du composé 7.
Différentes méthodes de couplage ont été testées mais aucune n'a permis d'aboutir à la formation du composé 7. Deux hypothèses peuvent être faites pour expliquer cet échec. L'encombrement des deux esters tert-butyle peut entraîner une
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26)
potentiellement être engagé dans des réactions secondaires intermoléculaires et réagir avec un ester actif d'une autre molécule.
Une autre approche a donc été élaborée basée sur une condensation de Knœvenagel. Cette fois, le motif HCCA a été synthétisé en trois étapes à partir du composé 4 (cf. Schéma 7).
hyde
Schéma 7 : Voie de synthèse du JMV3378 à partir du composé 4.
Le composé 4 est d'abord acylé avec du chlorure de 2-chloroacétyle dans un mélange de soude et de tétrahydrofurane (THF) de manière quantitative. La substitution du chlore avec du cyanure de potassium dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) à 65°C permet d'obtenir le composé 6. Une réaction de Knœvenagel entre le composé 6 et du 4-hydroxybenzaldéhyde effectuée dans un mélange de pyridine et de pipéridine à 5O0C fournit le composé 7 avec un rendement de 74%. Lors de cette réaction, l'aldéhyde peut être utilisé en large excès afin d'optimiser le rendement de la réaction. L'excès d'aldéhyde à la fin de la réaction peut être retiré facilement en fin de réaction par extraction liquide/liquide dans une phase aqueuse saturée en sulfite de sodium acidifiée par ajout d'acide acétique (pH ~ 5) Les esters teτt-butyles du
composé 7 sont hydrolyses dans un mélange de TFA/TIS/eau (95 • 2,5 • 2,5) afin d'obtenir le diacide 8 avec un rendement de 82% Le triisopropylsilane (TIS) est un piégeur (ou scavenger) des carbocations teτt-butyliques. Il permet d'éviter une réaction secondaire d'alkylation de Friedel-Craft en position 3,3' du phénol Enfin, le JMV3378 est synthétisé grâce à une activation des deux acides carboxyliques avec de la dicyclohexylcarbodiimide (DCC) et de la N-hydroxysuccimmide dans du THF avec un rendement de 69% Les conditions de purification de ce composé sont identiques à celles du JM V3155.
L'agent de réticulation chimique JMV3378 a donc été obtenu grâce à une voie de synthèse en sept étapes avec un rendement global de 31%.
2 - 1 - b - Agent de réticulation chimique avec un motif 5-aminoιsophtalιque
Un deuxième agent de réticulation homobifonctionnel possédant deux fonctions esters NHS a été synthétisé le 5-(α-cyano-4- hydroxycinnamido)isophthalate de N-hydroxysuccimmidyle (cf. schéma 8) Cet agent de réticulation possède un bras espaceur d'une longueur similaire à celui du composé JMV3378, cependant sa structure est rigide à cause du cycle aromatique isophtalique. Cette rigidité peut permettre d'obtenir de nouvelles informations structurales lors d'expériences de réticulation sur des protéines
PM = 546,44 g/mol Bras espaceur . 6,2 A
Schéma 8 : 5-(α-cyano-4-hydroxycinnamido)isophthalate de N-hydroxysuccinimidyle
Afin de synthétiser ce composé, une voie similaire à celle développée pour la synthèse du JMV3378 a été utilisée (cf. Schéma 9).
Schéma 9 : Voie de synthèse de l'agent homobifonctionnel avec motif 5- aminoisophtalique.
La voie de synthèse est directement initiée par l'acylation du diacide 5- aminoisophtalique avec du chlorure de 2-chloroacétyle dans un mélange de soude et de THF. Le composé 9 est récupéré grâce à une précipitation instantanée dans de l'éther de pétrole avec un rendement de 96%. Une substitution de l'atome de chlore du composé 9 avec du cyanure de potassium dans de l'eau en présence de bicarbonate de potassium permet d'obtenir le composé 10 avec un rendement de 77%. Le diacide 11 est ensuite obtenu avec un rendement de 99% grâce à une réaction de Knœvenagel avec du 4-hydroxybenzaldéhyde dans un mélange de pyridine et de pipéridine à 500C.
Enfin, le composé est synthétisé grâce à une activation des deux acides carboxyliques avec de la dicyclohexylcarbodiimide (DCC) et de la N-
hydroxysuccinimide dans du THF. Les conditions de purification de ce composé sont identiques à celles du JMV3155.
2-2 - Synthèse d'un agent hétérobifonctionnel
Un agent de réticulation hétérobifonctionnel possédant une fonction réactive non spécifique peut permettre d'obtenir de nombreuses informations plus diversifiées qu'un agent de réticulation homobifonctionnel.
Un agent de réticulation possédant à la fois une fonction ester NHS et une fonction photoactivable benzophénone a été synthétisé : le (S)-3-(4-benzoylphényl)-2- (α-cyano-4-hydroxycinnamido)propanoate de N-hydroxysuccinimidyle ou JMV3480 (cf. schéma 10).
PM = 537,52 g/mol Bras espaceur: 10,8 A
Schéma 10 : Agent de réticulation hétérobifonctionnel JMV3480.
La voie de synthèse de ce composé est présentée dans le schéma 11 ci-dessous.
Schéma 11 : Voie de synthèse de l'agent hétérobifonctionnel JMV3480.
Un couplage aminoacide entre l'agent mono fonctionnel JMV3155 et l'acide (S)-/>benzoylphénylalanine dans une solution de DMF contenant de la NN- diisopropyléthylamine (DIEA) conduit au composé 12 avec un rendement de 52%. Enfin, l'activation de la fonction acide en ester ΝHS conduisant au JMV3480, a été effectuée avec de la DCC et du N-hydroxysuccinimide dans du THF à 00C avec un rendement de 93%.
Ces différentes synthèses ont donc permis d'obtenir deux nouveaux agents de réticulation chimique marqués avec le motif UV-absorbant HCCA : un premier agent homobifonctionnel possédant deux fonctions esters ΝHS spécifiques aux aminés primaires - le JMV3378 - et un agent hétérobifonctionnel possédant une fonction ester ΝHS et une fonction non spécifique benzophénone - le JMV3480.
Exemple 3 ; Applications de l'agent de réticulation JMV3378 à l'étude de protéines modèles Le cytochrome c et l'apomyoglobine de cœur de cheval ont été utilisées comme protéines modèles.
Plusieurs expériences de réticulation, faisant varier la concentration en protéine et le ratio molaire R = [JMV3378]/[Lys+Νter], ont été réalisées afin d'évaluer les conditions optimales pouvant permettre d'obtenir à la fois un taux de réticulation satisfaisant et un bon effet de discrimination de détection des peptides réticulés par rapport aux peptides non modifiés après digestion enzymatique.
Pour chaque test, la protéine a été dissoute dans un tampon PBS à pH 7,5 et l'agent de réticulation a été dissous dans du DMSO. Le composé JMV3378 a été introduit dans le milieu protéique avec un ratio volumique PBS/DMSO (95 : 5) afin de ne pas perturber la structure de la protéine. Chaque expérience de réticulation a été effectuée à température ambiante pendant 2 minutes avant d'être congelée ou directement analysée.
Après réticulation, les échantillons de protéines ont été analysés par spectrométrie de masse MALDI-TOF en utilisant la matrice acide sinapinique en dépôt de type goutte séchée. Après vérification du taux de réticulation obtenu, les échantillons ont été digérés avec de la trypsine. Chaque mélange peptidique obtenu a été analysé par spectrométrie de masse avec la matrice acide HCCA en dépôt de type goutte séchée et avec la matrice HCCE en dépôt de type couche mince.
3 -1 - Application à l 'étude du cytochrome c
<* Evaluation de l'effet de discrimination HCCA/HCCE
Un spectre de masse MALDI-TOF de référence du cytochrome c non modifié digéré avec de la trypsine et effectuée avec de la matrice HCCA en dépôt goutte séchée, est présenté ci-dessous (cf. Figure 2). Le spectre de masse du mélange peptidique issu de la digestion trypsique de l'échantillon réticulé précédente ([Cytoc] = 100 μM et R = 0,5) préparé dans la matrice acide HCCA en dépôt goutte séchée est présenté dans la figure 3.
Six signaux non apparents sur le spectre de référence de la digestion du cytochrome c non modifié sont visibles sur ce spectre avec une intensité relative assez faible. Des signaux correspondant à des peptides non modifiés (e.g. m/z : 1296,
1633,1840 Da) sont détectés avec des intensités relatives plus hautes que celles des signaux nouvellement apparus.
Le même échantillon a été analysé en utilisant la matrice neutre HCCE en dépôt de type couche mince. Le spectre obtenu est présenté dans la figure 4 ci- dessous.
Ce spectre montre cette fois l'apparition de 9 signaux non détectés dans le spectre de référence de la digestion du cytochrome c non modifié et donc trois de plus qu'avec la matrice HCCA. De plus, certains de ions sont détectés avec une meilleure résolution que lorsque la matrice HCCA est utilisée (e.g. m/z : 1944 et 2249 Da). Enfin, nombres d'ions correspondant à des peptides non modifiés sont peu visibles lors que la matrice HCCE est utilisée (e.g. m/z : 1297, 1351, 1433, 1840 Da). Seul l'ion de valeur m/z 1633 Da correspondant au peptide non modifié préchargé grâce à Thème complexant un atome de fer est encore détecté avec une bonne résolution.
Cette analyse montre donc que la réticulation effectuée avec le JMV3378 permet d'obtenir un bon effet de discrimination HCCA/HCCE et facilite la détection de peptides modifiés d'intérêt.
La liste de ces nouveaux ions détectés a été soumise au logiciel de prédiction MSX-3D. Les résultats sont présentés dans le tableau suivant.
Tableau 1 : Liste de masses expérimentales et prédites de peptides réticulés par le
JMV3378.
1521,06 1519,72 -879 6 - 13 2 x TO
1719,87 1719,84 -20 26 - 38 TO
1892,98 -18 87 - 99 TO
1893,01 1892,98 -18 88 - 91 92 - 100 T2
1892,98 -18 88 - 100 TO
1943,99 1943,96 -14 23 - 38 Tl
2248,03 -435 23 - 38 2 x TO
2248,99 -7 9 - 22
2249,01 2249,11 45 73 - 87 TO + Tl
2249,11 45 74 - 88 TO + Tl
2413,07 2413,04 -14 39 - 55 2 x TO
2495,29 2495,18 -44 56 - 73 TO
2495,35 23 73 - 79 80 - 91 T2
2495,35 23 73 -86 87- 91 T2
2495 ,35 23 73 -87 88- 91 T2
2535 ,05 -444 9 -22 TO
2536, 18 2536 ,34 64 6 - 13 80- 88 T0 + T2
Les signaux détectés peuvent correspondre à différents types de réticulations de peptides (type 0, 1 et 2). Après avoir vérifié les distances théoriques entre les chaînes latérales des lysines du cytochrome c, un total de 8 possibilités de réaction de réticulation de type 1 et 2 ont été répertoriées (cf. schéma 12).
ATNE104
Schéma 12 : 8 réticulations potentielles avec le composé JMV3378 (les lysines modifiées par le JMV3378 sont indiquées en rouge).
Ces résultats ont mis en évidence que certaines chaînes latérales de lysines (Lys 5, 55, 100) n'ayant pas réagi avec le composé JMV3378 sont peu accessibles.
3 - 2 - Application à l 'étude de l 'apomyoglobine
Des expériences de réticulation avec le composé JMV3378 ont été réalisées avec l'apomyoglobine. Les tests ainsi que les analyses par spectrométrie de masse MALDI-TOF ont été réalisées selon les mêmes protocoles que pour les expériences effectuées sur le cytochrome c.
<* Evaluation de l'effet de discrimination HCCA/HCCE
En point de comparaison pour les spectres obtenus avec les digestions enzymatiques des expériences de réticulation, l'analyse d'un mélange peptidique issu
d'une digestion trypsique de l'apomyoglobine non modifié est présentée dans la figure
5 ci-dessous.
L'expérience de réticulation précédente a été digérée avec de la trypsine puis analysée une première fois avec la matrice acide HCCA (cf. Figure 6). Une comparaison directe avec l'analyse du mélange peptidique issu de la digestion du l'apomyoglobine native montre que l'on observe 5 nouveaux signaux peu intenses avec la matrice HCCA.
Le même échantillon a été analysé une deuxième fois avec la matrice neutre
HCCE (cf. Figure 7). Dans ce cas, 13 nouveaux signaux intenses peuvent être nettement observés grâce à l'effet de discrimination de détection de peptides réticulés avec le composé
JMV3378 et à l'utilisation de la matrice neutre HCCE. De même, l'intensité du signal de valeur m/z 1885 correspondant à un peptide non modifié a diminué de manière conséquente. Après avoir analysé avec le logiciel MSX-3D les masses correspondant aux nouveaux signaux observés, une liste de prédiction a été obtenue et est présentée dans le tableau 2 ci-dessous.
Tableau 2 : Liste de masses expérimentales et prédites de peptides réticulés par le JMV3378.
[M + H]+ Déviation Séquence Séquence
Modification(s) Expérimental Calculé (ppm) 1 2
1997,89 1997,92 16 48 - 62 Tl
2101,89 2101,96 33 1 - 16 TO
2518,08 2518,14 23 119 -139 TO
2622,03 2622,39 136 99 - 118 TO
2765,04 2765,32 103 32 - 47 78 - 79 TO + Tl
2886,96 2887,37 141 32 - 50 TO
3402,70 3402,78 23 48 - 56 63 - 79 T0 + T2
3460,63 3462,64 581 57 - 63 80 - 98 T0 + T2
3566,57 3566,74 46 46 - 56 134 - 147 T0 + T2
3566,93 101 57 - 78 97 - 102 T0 + T2
3583,96 -168 63 - 79 140 - 153 T2
3584,56
3584,77 57 43 - 62 140 - 147 T2
3688,47 3688,84 99 48 - 56 63 - 79 2 x TO + T2
3766,08 -89 46 - 50 78 - 102 T2
3766,42 3766,70 74 46 - 62 140 - 147 2 x TO + T2
3869,87 -106 78 - 98 146 - 153 T0 + T2
3870,29 3870,02 -68 63 - 79 140 - 153 T0 + T2
Les données fournies par cette analyse ont été vérifiées avec la structure cristalline de la protéine. Un total de 7 possibilités de réticulation (type 1 et 2) en accord avec la structure cristalline modèle de la protéine ont été répertoriées (cf. schéma 13).
,LSDGEWQQV10 LNVWGkVEAD20 IAGHGQEVLI30 RLFTGHPETL40 EKFDkFKHLj- 50
TEAEMRASED60 LKkHGTWLT70 ALGGILkK KGG850' HHEAELkPLA90 QSHATKHKIP100
IKYLEFISDAl jυ HHVLHSkHP120 GDFGADAQGA"" MTkALELFRN140 DIAAkYKELG1 FQG153
Schéma 13 : 7 réticulations potentielles avec le composé JMV3378 (les lysines rouges modifiées par le JMV3378 sont indiquées en rouge).
De plus, d'après les prédictions, 16 lysines ont été modifiées avec le composé JMV3378. Les lysines 16 et 118 n'ont pas été données comme accessibles.
L'identification par spectrométrie de masse MALDI-TOF/TOF des peptides réticulés est en cours.
Exemple 4 : Partie expérimentale
4-1 Analyses par spectrométrie de masse MALDI-TOF
Le spectromètre de masse qui a été utilisé est de la gamme Bruker : Ultraflex Daltonics. Les logiciels d'acquisition de spectre et d'exploitation de données sont respectivement : Flexcontrol et Flexanalysis version 2.2.
Le spectromètre est équipé d'une source SCOUT et la désorption/ionisation est effectuée à l'aide d'un laser à azote de longueur d'onde 337 nm et la fréquence utilisée est de 50 Hz. La puissance du laser est modulable grâce à un atténuateur.
4 - 1 -1 L'étalonnage
L'étalonnage des analyses par spectrométrie MALDI - TOF a été effectué en mode externe. Deux kits d'étalonnage ont été utilisés :
- « Peptide calibration standard II » (Bruker #222570) : allant de 700 à 3200 Th
- « Protein calibration standard I » (Bruker #206355) : allant de 5000 à 17500 Th
L'étalonnage externe est effectué en faisant un dépôt de l'un de ces mélanges commerciaux avec une matrice appropriée (e.g. acide α-cyano-4-hydroxycinnamique (HCCA) pour le « Peptide calibration standard II », acide sinapinique (AS) pour le « Protein calibration standard I ») à proximité du ou des dépôt(s) à analyser.
4 -1 - 2 - Préparation de l'échantillon
Les échantillons sont déposés sur une plaque Bruker Daltonics MTP 384 cibles en acier poli, suivant deux méthodes.
*t* Le dépôt en goutte séchée Le dépôt goutte séchée a été préféré dans la plupart des analyses utilisant la matrice HCCA. Il est réalisé par co-cristallisation d'une goutte de solution matricielle et d'une goutte d'une solution d'analyte. Chaque dépôt peut contenir entre 0,5 et 1 μL de chaque solution.
Les solutions de matrice HCCA sont préparées par saturation dans une solution eau/ACN/TFA (50 : 50 : 0,1).
- Analyses avec la matrice acide HCCA de tests de modifications sur protéines après digestion enzymatique :
0,5 μL (0,5 pmol) de solution peptidique à 1 μM dans un mélange eau/ACN/TFA (50 : 50 : 0,1) sont co-cristallisés avec 0,5 μL d'acide HCCA saturé dans un mélange eau/ACN/TFA (50 : 50 : 0,1).
*t* Le dépôt sur couche mince Le dépôt sur couche mince a été utilisé pour chaque dépôt utilisant la matrice
HCCE. Il consiste à déposer 0,5 μL d'une solution saturé dans l'acétone de HCCE en bande sur deux cibles marquées sur la plaque de dépôt.
0,5 μL de solution d'analyte sont déposés sur une cible contenant le dépôt séché de matrice. Du fait de la difficulté à reproduire l'aspect du dépôt par cette méthode, il est préférable de renouveler le dépôt une deuxième fois pour chaque analyse.
- Analyses avec la matrice neutre HCCE de tests de modifications sur protéines après digestion enzymatique :
0,5 μL (0,5 pmol) de solution peptidique à 1 μM dans un mélange eau/ACN/TFA (50 : 50 : 0,1) sont co-cristallisés sur un dépôt de 0,25 μL de matrice neutre HCCE saturé dans de l'acétone.
4-2 Synthèse de peptides modèles
Les peptides modèles JMV3346, JMV3347, JMV3348, JMV3349 et JMV3350 ont été synthétisés manuellement sur support solide selon une stratégie Fmoc. Le peptide 3 a été synthétisé sur support solide selon une stratégie Fmoc à l'aide d'un synthétiseur micro-ondes.
Les trois peptides ont été synthétisés avec comme agent de couplage l'HBTU en présence de NMM sur une résine Fmoc-Rink-Amide - aminométhyl-polystyrène (100-200 mesh, 0,7 mmol/g).
o Synthèse du peptide JMV3346 :
Code 3 lettres : H-Arg-Lys-Asn-Gly-Pro-Leu-Ile-Gly-Ala-Phe-NH2
Caractérisation du composé : Aspect : poudre blanche
Formule brute : C49H82N16O11
Masse molaire moyenne = 1071,28 g/mol
Masse molaire moyenne + 3 TFA = 1413,34 g/mol
Masse molaire mono isotopique = 1070,63 g/mol
Temps de rétention (HPLC) = 1 ,04 min
[M+2H]2+ exp : m/z : 536,3 Th
o Synthèse dupeptide JMV3347 :
Code 3 lettres : CCA-AIg-LyS-ASn-GIy-PrO-LeU-IIe-GIy-AIa-PlIe-NH2 Caractérisation du composé :
Aspect : poudre blanche
Formule brute : C59H87N17O12
Masse molaire moyenne = 1226,43 g/mol
Masse molaire moyenne + 3 TFA = 1454,47 g/mol Masse molaire mono isotopique = 1225,67 g/mol
Temps de rétention (HPLC) = 1 ,26 min
[M+2H]2+ eexxpp : m/z : 613,9Th
o Synthèse dupeptide JMV3348 :
Code 3 lettres : HCCA-Ar8-LyS-ASn-GIy-Pr0-LeU-IIe-GIy-AIa-PhC-NH2
Caractérisation du composé :
Aspect : poudre blanche
Formule brute : C59H87N17O13 Masse molaire moyenne = 1242,43 g/mol
Masse molaire moyenne + 2 TFA = 1470,47 g/mol
Masse molaire mono isotopique = 1241,67 g/mol
Temps de rétention (HPLC) = 1,17 min [M+2H]2+ eXp : m/z : 621,9 Th
o Synthèse du peptide JMV3349 :
Code 3 lettres : MCCA-Arg-Lys-Asn-Gly-Pro-Leu-Ile-Gly-Ala-Phe-NH2
Caractérisation du composé : Aspect : poudre blanche Formule brute : C60H89N17O13
Masse molaire moyenne = 1256,45 g/mol
Masse molaire moyenne + 2 TFA = 1484,49 g/mol
Masse molaire mono isotopique = 1255,69 g/mol
Temps de rétention (HPLC) = 1 ,20 min
[M+2H]2+ exp : m/z : 629,0 Th
o Synthèse du peptide JMV3350 :
Code 3 lettres : ACCA-Arg-Lys-Asn-Gly-Pro-Leu-Ile-Gly-Ala-Phe-NH2 Caractérisation du composé :
Aspect : poudre blanche
Formule brute : CβiHsgNπOπ
Masse molaire moyenne = 1284,46 g/mol
Masse molaire moyenne + 2 TFA = 1512,50 g/mol Masse molaire mono isotopique = 1283,68 g/mol
Temps de rétention (HPLC) = 1 ,26 min
[M+2H]2+ exp : m/z : 643,1 Th
o Synthèse du peptide 3 :
Code 3 lettres : H-Arg-Lys-Gly-Lys-Leu-Ala-Phe-NH2
Caractérisation du composé : Aspect : poudre blanche Formule brute : C38H67N13O7
Masse molaire moyenne = 818,02 g/mol
Masse molaire moyenne + 4 TFA = 1274,10 g/mol Masse molaire mono isotopique = 817,53 g/mol
Temps de rétention (HPLC) = 0,91 min [M+H]+ eχp : m/z : 818,7 Da
4-3 Synthèse des agents bifonctionnels en solution
4 - 3 - 1 - Synthèse du Λ/-(α-cyano-4-hydroxycinnamyl)iminodiacétate de /V- hydroxysuccinirriidyle (JMV3378)
o Synthèse de l'acide N'-(benzyloxycarbonyl)iminodiacéticιue (composé 1)
Tableau récapitulatif des réactifs :
PM
Réactifs n (mmol) éq m (g) v (mL) d (g/mL)
(g/mol)
Acide
133,1 7,50 1,0 0.999 - - iminodiacétique
ZCl 170,60 28,02 3,7 4,780 4,0 1,195
Protocole de synthèse :
0,999 g d'acide iminodiacétique sont dissous sous agitation magnétique dans 7,5 mL d'une solution aqueuse de soude 2N. Le pH du milieu est alors supérieur à 10.
Le milieu est placé dans un bain de glace afin de stabiliser sa température à 00C. 2 fois
2 mL de chloroformiate de benzyle sont successivement ajoutés. Le pH du milieu à 10 est maintenu par l'ajout d'environ 7 mL d'une solution aqueuse de soude 2N.
La réaction est laissée sous agitation pendant 2 jours puis le milieu est extrait avec 4 fois 100 mL d'éther diéthylique. Un flux d'argon est mis en place dans le milieu qui est en suite acidifié avec une solution aqueuse d'HCl 6N jusqu'à atteindre un pH compris entre 1 et 3. Un gel blanc apparaît alors. Le milieu est alors extrait par 4 fois 100 mL d'AE. Les phases organiques sont rassemblées et séchées avec du MgS04 puis filtré sur fritte. Le solvant est évaporé sous pression réduite.
2 g (28 mmol) d'une huile incolore sont récupérés.
Caractérisaîion du composé :
Aspect : huile incolore
Rendement = 100%
Formule brute : CI2HI3NOO
Masse molaire moyenne = 267,23 g/mol Masse molaire mono isotopique = 267,07 g/mol
Temps de rétention (HPLC) = 1,18 min [M+H]+ exp : m/z : 268,2 Da Rf (DCM/MeOH/AA - 90 : 10: 0,1; A B) = 0,2
RMN 1H (300 MHz, CDCl3, 3000K) : δ(ppm) 4,07 (2H, s, CH2-CO) ; 4,12 (2H, s, CH2-CO) ; 5,11 (2H, s, CH2-O) ; 7,27 (5H, s large, phényle) ; 7,86 (2H, s large, CO2H).
RMN 13C, Jmod (75 MHz, CDCl3, 3000K) : δ(ppm) 50,4 (CH2-CO) ; 68,4 (CH2-O) ; 127,8 (C2l6 phényle) ; 128,2 (C4 phényle) ; 128,5 (C3,5 phényle) ; 135,5 (Ci phényle) ; 156,2 (N-CO) ; 173,2 (CO2H).
o Synthèse du N-(benzyloxycarbonyl)iminodiacétate de tert-butyle (composé 2) :
Tableau récapitulatif des réactifs :
Réactifs PM (g/mol) n (mmol) éq m (g) v (mL) d (g/mL)
Composé 1 267,23 2,99 1,0 0,800 - -
Bromure de
137,03 266,22 89,0 36,480 30,000 1,216 tert-butyle
K2CO3 138.00 72,46 24,2 10,000 - -
BTEAC 227,78 7,20 2,4 1,640 - -
Protocole de synthèse :
0,800 g de composé 1 sont dissous en présence de 1,640 g de chlorure de benzyltriéthylammonium dans 75 rriL de DMAC sous argon. 10 g de K2CO3 sont introduits dans le milieu puis 30 mL de bromure de tert-butyle sont ajoutés. Le milieu est laissé sous agitation magnétique vive à une température de 55°C pendant 30 heures. Le milieu est refroidi à l'air libre jusqu'à température ambiante.
Après 15 jours, le milieu est placé dans un bain de glace puis 400 mL d'eau froide sont ajoutés. La phase aqueuse est extraite avec 5 fois 100 mL d'AE. Chaque phase organique est alors extraite avec 3 fois 50 mL d'une solution aqueuse de NaHCO3 saturée et 2 fois 50 mL d'eau. Les phases organiques rassemblées sont séchées avec du MgSÛ4, filtré sur fritte puis le solvant est évaporé sous pression réduite.
Le composé est purifié par chromatographie sur colonne avec comme éluant :
DCM/MeOH/AA (98 : 2 : 0,1). 193 mg (0,51 mmol) d'une huile incolore sont récupérés.
Caractérisation du composé :
Aspect : huile incolore Rendement = 17% Formule brute : C20H29NO6 Masse molaire moyenne = 379,45 g/mol Masse molaire mono isotopique = 379,20 g/mol
Temps de rétention (HPLC) = 1 ,99 min [M+H]+ exp : m/z : 380,1 Da Rf (DCM/MeOH/AA - 90 : 10: 0,1 ; A B) = 0,86
RMN 1H (300 MHz, CDCl3, 3000K) : δ(ppm) 1,40 (9H, s, CH3 tert-butyle) ; 1,46 (9H, s, CH3 tert-butyle) ; 3,96 (2H, s, CH2-CO) ; 4,05 (2H, s, CH2-CO) ; 5,15 (2H, s, CH2- O) ; 7,32 (5H, s large, phényle).
RMN 13C, Jmod (75 MHz, CDCl3, 3000K) : δ(ppm) 27,9 (CH3 tert-butyle) ; 28,1 (CH3 tert-butyle) ; 49,9 (CH2-CO) ; 50,2 (CH2-CO) ; 67,7 (CH2-O) ; 81,9 (Cquaternaire tert-butyle) ; 127,7 (C2,6 phényle) ; 127,9 (C4 phényle) ; 128,4 (C3,5 phényle) ; 136,3 (Ci phényle) ; 168,5 (N-CO) ; 168,7 (CO2tBu).
o Synthèse de l'iminodiacétate de tert-butyle (composé 4) à partir du composé
2 :
Tableau récapitulatif des réactifs :
Réactifs PM (g/mol) n (mmol) éq m (g) v (mL) d (g/mL)
Composé 2 379,45 0,60 1,0 0,227
Protocole de synthèse :
227 mg de composé 2 sont dissous dans 60 mL de méthanol. 30 mg de palladium sur charbon sont introduits. Un bullage d'hydrogène est mis en place dans le milieu. La réaction est laissée sous agitation magnétique pendant 10 heures.
Le ballon est purgé à l'argon. Le milieu est filtré sur célite et rincé plusieurs fois avec du méthanol.
Le solvant est alors évaporé sous pression réduite puis le milieu est repris avec 100 mL d'AE et extrait avec 2 fois 50 mL d'une solution aqueuse saturée en NaHCCh puis 2 fois 50 mL d'eau. La phase organique est séchée avec du MgSC>4 et filtré sur fritte. Le solvant est alors évaporé sous pression réduite.
73 mg (0,3 mmol) d'une huile incolore sont récupérés.
Caractérisation du composé : Aspect : huile incolore
Rendement = 50%
Formule brute : C12H23NO4
Masse molaire moyenne = 245,32 g/mol
Masse molaire mono isotopique = 245,16 g/mol
Temps de rétention (HPLC) = 1 ,09 min
[M+H]+ exp : m/z : 246,4 Da
Rf (AcOEt/EP - 2 : 8 ; A B C) = 0,37
RMN 1H (300 MHz, DMSO-d6, 3000K) : δ(ppm) 1,41 (9H, s, CH3 tert-butyle) ; 1,42 (9H, s, CH3 tert-butyle) ; 3,32 (4H, s, CH2-CO).
RMN 13C, Jmod (75 MHz, DMSO-d6, 3000K) : δ(ppm) 27,6 (CH3 tert-butyle) ; 49,5 (CH2-CO) ; 80,5 (Cquaternaire tert-butylé); 170,1 (CO2tBu).
o Synthèse du N-benzyliminodiacétate de tert-butyle (composé 3) :
Tableau récapitulatif des réactifs :
Réactifs PM (g /mol) n (mmol) éq m (g) V (mL) d ( g/mL)
2-bromoacétate
195 ,06 35,75 3,0 6,975 5 ,280 1 ,321
Benzylamine 107 ,16 11,92 1,0 1,277 1 ,302 O ,981
K2CO3 138 ,00 64,13 5,4 8,850 - -
Protocole de synthèse :
5,280 mL de 2-bromoacétate de tert-butyle sont dissous dans 100 mL de DMF. 8,850 g de K2CO3 sont ajoutés et le milieu est mis sous agitation magnétique forte à une température de 45°C. 1,302 mL de benzylamine sont ajoutés.
La réaction est arrêtée après 3 heures et le solvant est évaporé sous pression réduite. 400 mL d'eau distillée sont ajoutés au milieu qui est extrait avec 4 fois 250 mL d'AE. Chaque phase organique est lavée avec 200 mL d'eau et 200 mL de saumure. Les phases organiques sont rassemblées et séchées avec du MgSU4 puis filtré sur fritte.
Le composé est purifié par chromatographie sur colonne avec comme éluant : EP/AE (95 : 5).
3,990 g (11,89 mmol) d'une poudre blanche sont récupérés.
Caractérisation du composé : Aspect : poudre blanche Rendement = 99% Formule brute : C19H29NO4
Masse molaire moyenne = 335,44 g/mol Masse molaire mono isotopique = 335,21 g/mol
Temps de rétention (HPLC) = 1 ,65 min [M+H]+ exp : m/z : 336,1 Da
Rf (AE/EP - 5 : 95 ; A B) = 0,33 Point de fusion = 45-500C
RMN 1H (300 MHz, CDCl3, 3000K) : δ(ppm) 1,44 (18H, s, CH3 tert-butyle) ; 3,39 (4H, s, CH2-CO) ; 3,88 (2H, s, CH2-0) ; 7,31 (5H, m, phényle).
RMN 13C, Jmod (75 MHz, CDCl3, 3000K) : δ(ppm) 28,2 (CH3 tert-butyle) ; 55,2 (CH2-CO) ; 57,6 (CH2-O) ; 80,9 (Cquaternaire tert-butylo) ; 127,2 (C4 phényle) ; 128,8 (C3,5 phényle) ; 129,1 (C2,6 phényle) ; 138,6 (Ci phényle) ; 170,6 (CO).
o Synthèse du composé 4 à yatir du composé 3 :
Tableau récapitulatif des réactifs :
Réactifs PM (g/mol) n (mmol) éq m (g) v (mL) d (g/mL)
Composé 3 335,44 23,65 1,0 7,932
Protocole de synthèse :
7,932 g de composé 3 sont dissous dans 200 mL d'éthanol à 95% sous agitation magnétique. 200 mg de palladium sur charbon sont introduits dans le milieu. Puis une bullage d'hydrogène est mis en place dans le ballon.
Après 4 heures, le ballon est purgé à l'argon. Le milieu est filtré sur célite et rincé avec du méthanol. Le solvant est alors évaporé sous pression réduite. 5,771 g (23,52 mmol) d'une huile incolore sont récupérés.
Caractérisation du composé :
Aspect : huile incolore Rendement = 99,5% Formule brute : C12H23NO4 Masse molaire moyenne = 245,32 g/mol
Masse molaire mono isotopique = 245,16 g/mol
Temps de rétention (HPLC) = 1,09 min [M+H]+ exp : m/z : 246,4 Da Rf (AcOEt/EP - 2 : 8 ; A B C) = 0,37
RMN 1H (300 MHz, DMSO-d6, 3000K) : δ(ppm) 1,41 (9H, s, CH3 tert-butyle) ; 1,42 (9H, s, CH3 tβrt-butyio) ; 3,32 (4H, s, CH2-CO).
RMN 13C, Jmod (75 MHz, DMSO-d6, 3000K) : δ(ppm) 27,6 (CH3 tert-butyle) ; 49,5 (CH2-CO) ; 80,5 (Cquaternaire tert-butylë); 170,1 (CO2tBu).
o Synthèse du N-(2-chloroacétyl)iminodiacétate de tert-butyle (composé 5) :
I O u O I
Tableau récapitulatif des réactifs :
Réactifs PM (g/mol) n (mmol) éq m (g) v (mL) d (g/mL)
Composé 5 245,32 5,01 1,0 1,230 - -
Chlorure de
2_ 112,94 25,07 5,0 2,832 1,997 1,418 chloroacétyle
Protocole de synthèse :
1,230 g de composé 5 sont dissous dans 40 mL de THF et 3 mL d'une solution aqueuse de soude 2,5 M sont ajoutés. Le milieu est placé sous forte agitation magnétique. 1,997 mL de chlorure de 2-chloroacétyle sont ajoutés lentement et de la soude IN est régulièrement ajoutée pour maintenir le pH de la solution en dessous de
8.
Après 5 minutes d'agitation, le THF est évaporé sous pression réduite. 150 mL d'AE sont ajoutés au milieu qui est ensuite extrait avec 4 fois 100 mL d'eau distillée. La phase organique est ensuite séchée avec du MgSO4, filtrée sur fritte et le solvant est évaporé sous pression réduite.
1,605 g (4,99 mmol) d'une huile incolore sont récupérés.
Caractérisation du composé :
Aspect : huile incolore
Rendement = 99,5%
Formule brute : Ci4H24ClNO5
Masse molaire moyenne = 321,80 g/mol Masse molaire mono isotopique = 321,13 g/mol
Temps de rétention (HPLC) = 1,78 min [M+H]+ exp : m/z : 322,4 DA Rf (AE/EP - 3 : 7 ; A B) = 0,47
RMN 1H (300 MHz, CDCl3, 3000K) : δ(ppm) 1,44 (9H, s, CH3 tert-buty\e) ; 1,47 (9H, s, CH3 tert-butyle) ; 4,05 (2H, s, CH2-CO) ; 4,06 (2H, s, CH2-CO) ; 4,07 (2H, s, CH2Cl).
RMN 13C, Jmod (75 MHz, CDCl3, 3000K) : δ(ppm) 27,9 (CH3 tert-butyle) ; 27,9 (CH3 tert-butyle) ; 40,7 (CH2Cl) ; 49,2 (CH2-CO); 51,7 (CH2-CO); 82,2 (Cquaternaire tert- butyle) ; 82,9 (Cquaternaire tert-butyle) ; 166,9 (N-CO) ; 167,5 (CO2tBu); 167,7 (CO2tBu).
o Synthèse du N-(2-cvanoacétyl)iminodiacétate de tert-butyle (composé 6) :
Tableau récapitulatif des réactifs :
Réactifs PM (g /mol) n (mmol) éq m (g) v (mL) d (g/mL)
Composé 5 321 ,80 5,76 1,0 1,854 - -
KCN 65, OO 6,34 1,1 0,412 - -
Protocole de synthèse :
1,854 g de composé 5 sont dissous dans 80 mL de DMSO sous argon et sous agitation magnétique. 412 mg de cyanure de potassium sont ajoutés au milieu qui est mis à une température de 65°C.
La réaction est arrêtée après 1 heure par l'ajout de 400 mL d'eau. Le solvant est ensuite évaporé sous pression réduite. Le milieu est repris avec 200 mL d'eau puis extrait avec 4 fois 200 mL d'AE. Chaque phase organique est lavée avec 250 mL de saumure. Les phases organiques sont rassemblées puis séchées avec du MgSÛ4 et filtrées sur fritte. Le solvant est évaporé sous pression réduite.
Le brut réactionnel est purifié par chromatographie sur colonne avec comme éluant un mélange AE/EP (3 : 7).
1,355 g (4,34 mmol) d'une huile incolore sont récupérés.
Caractérisation du composé : Aspect : huile incolore Rendement = 76% Formule brute : C15H24N2O5 Masse molaire moyenne = 312,36 g/mol Masse molaire mono isotopique = 312,17 g/mol
Temps de rétention (HPLC) = 1 ,66 min [M+H]+ exp : m/z : 313,5 Da Rf (AE/EP - 3 : 7 ; A B) = 0,37
RMN 1H (300 MHz, CDCl3, 3000K) : δ(ppm) 1,45 (9H, s, CH3 tert-butyle) ; 1,48 (9H, s, CH3 tert-bulyle) ; 3,55 (2H, s, CH2-CN) ; 3,97 (2H, s, CH2-CO) ; 4,06 (2H, s, CH2- CO).
RMN 13C, Jmod (75 MHz, CDCl3, 3000K) : δ(ppm) 24,7 (CH2-CN) ; 27,9 (CH3 tert- butyle) ; 27,9 (CH3 ter?-butyle) ; 49,5 (CH2-CO); 51,5 (CH2-CO); 82,6 (Cquaternaire tert-hviylé) ; 83,6 (Cquaternaire tert-hutyle) ; 162,6 (N-CO) ; 166,9 (CO2tBu); 167,4 (CO2tBu). o Synthèse du N-(<l-cvano-4-hvdroxycinnamyl)iminodiacétate de tert-butyle (Composé 7) :
Tableau récapitulatif des réactifs :
PM
Réactifs n (mmol) éq m (g) v (mL) d (g/mL)
(g/mol)
Composé 6 312,36 0,64 1,0 0,199 - -
4-hydroxy benzaldéhyd 122,12 0,64 1,0 0,078 - - e pyridine 79,10 83,20 130,0 6,581 6,729 0,978 pipéridine 85,15 0,32 0,5 0,028 0,032 0,861
Protocole de synthèse :
199 mg de composé 6 sont dissous dans 6,729 mL de pyridine et 32 μL de pipéridine. 78 mg de 4-hydroxybenzaldéhyde sont ajoutés au milieu sous agitation magnétique à 500C. Après 15 heures, le solvant est évaporé sous pression réduite. Le milieu est alors repris avec 100 mL d'AE puis extrait avec 4 fois 100 mL d'une solution aqueuse de KHSO4 IM et 3 fois 50 mL d'une solution aqueuse saturée en sulfite de sodium et acidifiée avec quelques millilitres d'acide acétique. Un dernier lavage est effectué avec 3 fois 100 mL de saumure. La phase organique est séchée avec du MgSC>4, filtrée sur fritte et le solvant est évaporé sous pression réduite. 258 mg (0,47 mmol) d'une poudre jaune sont récupérés.
Caractérisation du composé :
Aspect : poudre jaune Rendement = 74% Formule brute : C22H28N2OO
Masse molaire moyenne = 416,47 g/mol Masse molaire mono isotopique = 416,19 g/mol
Temps de rétention (HPLC) = 1,85 min [M+H]+ exp : m/z : 417,38 Da
Rf (CHCl3/MeOH/AA - 120 : 10 : 5 ; A B) = 0,43 Point de fusion = 57-590C
RMN 1H (300 MHz, CDCl3, 3000K) : δ(ppm) 1,49 (9H, s, CH3 tert-butyle) ; 1,50 (9H, s, CH3 tβrt-butylo) ; 4,16 (2H, s, CH2-CO) ; 4,21 (2H, s, CH2-CO) ; 6,64 (2H, d, J0 = 9Hz, H6,8 cinnamyle) ; 7,20 (2H, d, J0 = 9Hz, H5,9 cinnamyle) ; 7,67 (IH, s, H3 cinnamyle).
RMN 13C, Jmod (75 MHz, CDCl3, 3000K) : δ(ppm) 27,9 (CH3 tert-butyle) ; 28,1 (CH3 tert-butyle) ; 48,7 (CH2-CO) ; 51,5 (CH2-CO) ; 82,8 (Cquaternaire tert-butyl€) ; 102,2 (C2 cinnamyle) ; 116,3 (C6,s cinnamyle) ; 116,6 (CN) ; 123,9 (C4 cinnamyle) ; 132,6 (C5,9 cinnamyle) ; 149,8 (C3 cinnamyle) ; 159,9 (C7 cinnamyle) ; 164,5 (Ci cinnamyle) ; 166,8 (CO2tBu) ; 167,4 (CO2IBu).
o Synthèse de l'acide N'-(a-cvano-4-hvdroxycinnamyl)iminodiacétique
(composé 8) :
Tableau récapitulatif des réactifs :
Réactifs PM (g/mol) n (mmol) éq m (g) v (mL) d (g/mL)
Composé 7 416,47 0,60 1,0 0,250
Protocole de synthèse :
250 mg de composé 7 sont dissous dans 50 mL d'un mélange TFA/TIS/H2O (95 : 2,5 : 2,5) sous agitation magnétique. Après 1 heure, le solvant est évaporé sous pression réduite. Le milieu est repris dans 50 mL d'un mélange eau/ACN (50 : 50), congelé avec de l'azote liquide et lyophilisé.
150 mg (0,49 mmol) d'une poudre jaune pâle sont récupérés.
Caractérisation du composé :
Aspect : poudre jaune pâle Rendement = 82% Formule brute : C14H12N2O6 Masse molaire moyenne = 304,26 g/mol Masse molaire mono isotopique = 304,07 g/mol
Temps de rétention (HPLC) = 0,89 min
[M+H]+ exp : m/z : 305,1 Da
Rf (CHCl3/MeOH/AA - 85 : 10 : 5 ; A B) = 0,47
Point de fusion = 2060C
RMN 1H (300 MHz, DMSOd6, 3000K) : δ(ppm) 4,07 (2H, s, CH2-CO) ; 4,34 (2H, s, CH2-CO) ; 6,92 (2H, d, J0 = 9Hz, H6,8 cinnamyle) ; 7,64 (IH, s, H3 cinnamyle) ; 7,83 (2H, d, J0 = 9Hz, H5,9 cinnamyle).
RMN 13C, Jmod (75 MHz, DMSO-d6, 3000K) : δ(ppm) 48,7 (CH2-CO) ; 51,1 (CH2- CO) ; 100,0 (C2 cinnamyle) ; 116,1 (C6,8 cinnamyle) ; 116,4 (CN) ; 123,1 (C4 cinnamyle) ; 132,5 (Cs,9 cinnamyle) ; 150,9 (C3 cinnamyle) ; 161,6 (C7 cinnamyle) ; 164,8 (Ci cinnamyle) ; 169,8 (CO2H).
o Synthèse du N-(a-cvano-4-hvdroxycinnamyl)iminodiacétate de N- hvdroxysuccinimidyle (JMV3378) :
Tableau récapitulatif des réactifs :
Réactifs PM (g/mol) n (mmol) éq m (g) v (mL) d (g/mL)
Composé 8 304,25 2,48 1,0 0,755 - -
DCC 206,30 10,25 4,1 2,115 - -
HOSu 115,09 6,21 2,5 0,715 - -
Protocole de synthèse :
775 mg de composé 8 sont dissous dans 100 mL de THF et 2,115 g de DCC sont ajoutés. Après 10 minutes, le milieu se trouble et 715 mg d'HOSu sont additionnés.
Après 1 heure, le solvant est évaporé sous pression réduite et le milieu est repris avec un minimum de DMF froid et placé dans un bain de glace pendant 10 minutes. La dicyclohexylurée précipite en une poudre blanche. Le milieu est filtré sur un fritte de porosité 4 à froid. Le procédé est répété une deuxième fois. Le solvant est alors évaporé sous pression réduite. Le précipité est dissous dans 300 mL d'AE et extrait avec 2 fois 100 mL d'une solution aqueuse de KHSO4 IM. La phase organique est séchée avec du MgSO/i, filtrée sur fritte et le solvant est évaporé sous pression réduite.
0,850 g (1,71 mmol) d'une poudre jaune pâle sont récupérés.
Caractérisation du composé :
Aspect : poudre jaune pâle
Rendement = 69%
Formule brute : C22H18N4O10
Masse molaire moyenne = 498.40 g/mol Masse molaire mono isotopique = 498,10 g/mol
Temps de rétention (HPLC) = 1 ,27 min [M+H]+ exp : m/z : 499,1 Da Rf (DCM/MeOH - 9 : 1 ; A B) = 0,45
RMN 1H (300 MHz, DMSO-d6, 3000K) : δ(ppm) 2,82 (8H, s, CH2 succinimidyle) ; 3,30 (4H, s, N-CH2-CO) ; 6,91 (2H, d, J0 = 9Hz, H6,8 cinnamyle) ; 7,59 (IH, s, H3 cinnamyle) ; 7,87 (2H, d, J0 = 9Hz, H5,9 cinnamyle) ; 10,56 (IH, s, OH).
RMN 13C, Jmod (75 MHz, DMSO-d6, 3000K) : δ(ppm) 25,7 (CH2 succinimidyle) ; 25,9 (CH2 succinimidyle) ; 60,2 (CH2-CO) ; 99,6 (C2 cinnamyle) ; 116,5 (C6,8
cinnamyle) ; 116,7 (CN) ; 122,8 (C4 cinnamyle) ; 133,3 (C5,9 cinnamyle) ; 151,0 (C3 cinnamyle) ; 162,4 (C7 cinnamyle) ; 165,6 (Ci cinnamyle) ; 170.0 (CO succinimidyle) ; 170,2 (CH2-CO).
4 - 3 - 2 - Synthèse du (S)-3-(4-benzoylphényl)-2-(α-cyano-4- hydroxycinnamido)propanoate de /V-hydroxysuccinimidyle (JMV3480)
o Synthèse de l'acide (S)-3-(4-benzoylphényl)-2-(c/L-cvano-4- hvdroxycinnamidojpropanoique (composé 12) :
Tableau récapitulatif des réactifs :
Réactifs PM (g/mol) n (mmol) éq m (g) v (mL) d (g/mL)
JMV3155 286,25 0,75 1,1 0,215 - -
H-Bpa-OH 269,30 0,68 1,0 0,183 - -
DIEA 129,25 0,82 1,2 0,106 0,140 0,755
Protocole de synthèse :
183 mg d'acide 4-benzoyl-L-phénylalanine (H-Bpa-OH) sont dissous dans 15 mL de DMF sous agitation magnétique après ajout de 140 μL de DIEA. Après 5 minutes, 215 mg de JMV3155 sont ajoutés au milieu.
Après 24 heures, le solvant est évaporé sous pression réduite. Le milieu est repris avec 200 mL d'AE puis extrait avec 3 fois 80 mL d'une solution aqueuse de
KHSO4 IM. La phase organique est alors séchée avec du MgSθ4 puis filtrée sur fritte. Le solvant est évaporé sous pression réduite.
Le composé est purifié par HPLC préparative avec comme gradient :
- 0% → 20% ACN en 2 min - 20% → 50% ACN en 30 min.
Les fractions contenant le composé purifié sont rassemblées, congelées avec de l'azote liquide et lyophilisées.
156 mg (0,36 mmol) d'une poudre jaune sont récupérés.
Caractérisaîion du composé :
Aspect : poudre jaune
Rendement = 52%
Formule brute : C26H20N2O5
Masse molaire moyenne = 440.45 g/mol Masse molaire mono isotopique = 440,14 g/mol
Temps de rétention (HPLC) = 1,53 min
[M+H]+eχp : m/z : 441,0 Da
Rf (CHCl3/MeOH/AA - 85 : 10 : 5 ; A B) = 0,47
RMN 1H (300 MHz, DMSOd6, 3000K) : δ(ppm) 3,28 - 3,36 (2H, m, Hp) ; 4,61 - 4,68 (IH, m, H0) ; 6,67 (2H, d, J0 = 9 Hz, H6,8 cinnamyle) ; 6,96 (2H, d, J0 = 9 Hz, H5,9 cinnamyle) ; 7,47 (2H, d, J0 = 9 Hz, H3,5 /?-méthylbenzoyle) ; 7,63 - 7,70 (5H, m, H2,6 /?-méthylbenzoyle et H3^5 benzoyle) ; 7,86 (2H, d, J0 = 9 Hz, H2,6 benzoyle) ; 7,87 (IH, s, H3 benzoyle) ; 8,51 (IH, s, OH).
RMN 13C, Jmod (75 MHz, DMSO-d6, 3000K) : δ(ppm) 36,1 (Cp) ; 53,9 (C11) ; 100,7 (C2 cinnamyle) ; 116,2 (C6,8 cinnamyle) ; 116,9 (CN) ; 122,7 (C4 cinnamyle) ; 128,5 (C5,9 cinnamyle) ; 129,3 (C3,5 p-méthylbenzoyle) ; 129,4 (C3,5 benzoyle) ; 129,6 (C p- méthylbenzoyle) ; 132,5 (C4 benzoyle) ; 132,9 (C2,6 benzoyle) ; 135,2 (Ci p- méthylbenzoyle) ; 137,2 (Ci benzoyle) ; 143,1 (C4 ^-méthylbenzoyle) ; 150,7 (C3
cinnamyle) ; 161,7 (C7 cinnamyle) ; 161,9 (Ci cinnamyle) ; 172,2 (CO2H) ; 195,4 (CO-0).
o Synthèse du JMV3480 :
Tableau récapitulatif des réactifs :
PM
Réactifs n (mmol) éq m (g) v (mL) d (g/mL) (g/mol)
Composé 12 440,45 0,12 1,0 0,052
DCC 206,30 0,28 2,3 0,058
HOSu 115,09 0,29 2,4 0,033
Protocole de synthèse :
52 mg de composé 12 sont dissous dans 5 mL de THF et 58 mg de DCC sont ajoutés sous agitation magnétique. La température du milieu est baissée à 00C puis 33 mg de HOSu sont additionnés.
Après 5 heures, la dicyclohexylurée précipité en une poudre blanche est filtrée sur un fritte de porosité 4 à froid. Le solvant est alors évaporé sous pression réduite puis milieu est repris avec 150 mL d'AE et extrait avec 4 fois 100 mL d'une solution aqueuse de KHSO4 IM. La phase organique est séchée avec du MgSÛ4, filtré sur fritte et le solvant est évaporé sous pression réduite.
60 mg (0,11 mmol) d'une poudre jaune sont récupérés.
Caractérisation du composé :
Aspect : poudre jaune Rendement = 93%
Formule brute : C30H23N3O7
Masse molaire moyenne = 537,52 g/mol
Masse molaire mono isotopique = 537,15 g/mol
Temps de rétention (HPLC) = 1 ,69 min [M+H]+ exp : m/z : 538,2 Da Rf (CHCl3/MeOH/AA - 85 : 10 : 5 ; A B) = 0,7
4 - 3 - 3 Synthèse de l'acide 5-(α-cyano-4-hydroxycinnamido)isophthalique (composé 11)
o Synthèse de l'acide 5-(2-chloroacétamido)isoOhthaliaue (composé 9) :
Tableau récapitulatif des réactifs :
PM
Réactifs n (mmol) éq m (g) v (mL) d (g/mL) (g/mol) acide 5-amino-
181,15 19,41 1,0 3,516 - - isophtalique chlorure de 112,94 97,04 5,0 10,960 7,729 1,418
2- chloroacétyle
Protocole de synthèse :
3,516 d'acide 5-aminoisophtalique sont dissous dans 150 mL de THF contenant 20 mL d'une solution aqueuse de soude à 10% massique. Après 5 minutes sous agitation magnétique, le diacide est totalement solubilisé. 7,729 mL de chlorure de 2-chloroacétyle sont ajoutés lentement dans le milieu et le pH de la solution est maintenu à 10 par ajout d'une solution de soude IN sous agitation magnétique forte. La réaction est exothermique. Après 5 minutes d'agitation, le THF est évaporé sous pression réduite. Le milieu est repris avec 400 mL d'AE puis extrait avec 2 fois 100 mL d'une solution aqueuse de KHSO4 IM. Les phases aqueuses sont extraites avec 2 fois 100 mL d'AE. Les phases organiques sont rassemblées puis séchées avec du MgS04 et filtré sur fritte. Le milieu est concentré jusqu'à saturation de la solution (environ 300 mL). Le composé est alors précipité par l'ajout de 300 mL d'EP. Le solide est filtré sur un fritte de porosité 4.
4,762 g (18,49 mmol) d'une poudre blanche sont récupérés.
Caractérisation du composé : Aspect : poudre blanche Rendement = 96%
Formule brute : CI0H8CINO5
Masse molaire moyenne = 257,63 g/mol
Masse molaire mono isotopique = 257,01 g/mol
Temps de rétention (HPLC) = 0,95 min [M+H]+ exp : m/z : 258,0 Da Rf (CHCl3/MeOH/AA - 40 : 10 : 5 ; A B) = 0,63
RMN 1H (300 MHz, DMSO-d6, 3000K) : δ(ppm) 4,29 (2H, s, CH2Cl) ; 8,20 (IH, s, H4 5-aminoisophtalique) ; 8,43 (2H, s, H2,6 5-aminoisophtalique) ; 10,66 (2H, s, CO2H).
RMN 13C, Jmod (75 MHz, DMSO-d6, 3000K) : δ(ppm) 43,5 (CH2Cl) ; 123,7 (C2,6 5- aminoisophtalique) ; 125,1 (C4 5-aminoisophtalique) ; 131,9 (C3,5 5- aminoisophtalique) ; 139,1 (Ci 5-aminoisophtalique) ; 165,2 (NH-CO) ; 166,3 (CO2H).
o Synthèse de l'acide 5-(2-cvanoacétamido)isophthaliaue (composé 10)
Tableau récapitulatif des réactifs :
Réactifs PM (g/mol) n (mmol) éq m (g) v (mL) d (g/mL)
Composé 9 257,63 18,48 1,0 4,762 - -
KCN 65,00 74,34 4,0 4,832 - -
K2CO3 138,00 27,51 1,5 3,796 - -
Protocole de synthèse :
A, 162 g de composé 9 sont placés dans 150 mL d'eau distillée et 3,796 g de K2CO3 sont ajoutés sous agitation magnétique vive. La solution devient homogène après 5 minutes d'agitation. 4,832 g de cyanure de potassium sont ajoutés lentement. La solution se colore rapidement en rouge.
Après 2 jours, la réaction est arrêtée et le milieu est acidifié par ajout de quelques millilitres d'une solution aqueuse de HCl 6N jusqu'à un pH inférieur à 3. Le milieu est alors extrait avec 8 fois 100 mL d'AE. Chaque phase organique est lavée
avec 100 mL d'une solution aqueuse de KHSO4 IM. Les phases organiques sont rassemblées et séchées avec du MgSC>4 et filtrées sur fritte. Le solvant est évaporé sous pression réduite.
3,511 g (14,15 mmol) d'une poudre blanche sont récupérés.
Caractérisation du composé : Aspect : poudre blanche Rendement = 77% Formule brute : C11H8N2O5 Masse molaire moyenne = 248,19 g/mol
Masse molaire mono isotopique = 248,04 g/mol
Temps de rétention (HPLC) = 0,83 min [M+H]+ exp : m/z : 249,2 Da Rf (CHCl3/MeOH/AA - 40 : 10 : 5 ; A B) = 0,30
RMN 1H (300 MHz, DMSO-d6, 3000K) : δ(ppm) 3,94 (2H, s, CH2-CN) ; 8,20 (IH, s,
H4 5-aminoisophtalique) ; 8,38 (2H, s, H2,6 5-aminoisophtalique) ; 10,67 (2H, s,
CO2H).
RMN 13C, Jmod (75 MHz, DMSOd6, 3000K) : δ(ppm) 26,8 (CH2Cl) ; 115,6 (CN) ;
123,6 (C2,6 5-aminoisophtalique) ; 152,1 (C4 5-aminoisophtalique) ; 131,9 (C3,s 5- aminoisophtalique) ; 138,9 (Ci 5-aminoisophtalique) ; 161,6 (NH-CO) ; 166,3
(CO2H).
o Synthèse de l'acide 5-(<X-cvano-4-hvdroxycinnamido)isophthalique (composé U) :
Tableau récapitulatif des réactifs :
PM
Réactifs n (mmol) éq m (g) v (mL) d (g/mL) (g/mol)
Composé 10 248,19 2,01 1,0 0,500 - -
4-hydroxy
122,12 2,01 1,0 0,246 - - benzaldéhyde pipéridine 85,15 1,01 0,5 0,086 0,100 0,861 pyridine 79,10 262,10 130,4 20,732 21,198 0,978
Protocole de synthèse :
500 mg de composé 10 sont dissous dans 200 mL de pyridine et 100 μL de pipéridine sont ajoutés. Après 5 minutes, 246 mg de 4-hydroxybenzaldéhyde sont ajoutés et le milieu est placé dans un bain d'huile à 500C pendant 3 heures. Le milieu est refroidi lentement jusqu'à température ambiante. Il est additionné goutte à goutte à 150 mL d'une solution aqueuse de KHSO4 IM. Le pH est inférieur à 4. Un précipité jaune apparaît et la solution est triturée avec une spatule. Le précipité est filtré sur un fritte de porosité 4 puis dissous dans du DMF. Le solvant est évaporé sous pression réduite. Le solide est repris dans 150 mL d'une solution aqueuse de KHSO4 IM puis trituré et filtré comme précédemment. Le solide est alors dissous dans un mélange eau/ACN 50%, congelé dans l'azote liquide puis lyophilisé. 700 mg (1,99 mmol) d'une poudre jaune sont récupérés.
Caractérisation du composé : Aspect : poudre jaune Rendement = 99% Formule brute : C18H12N2O6 Masse molaire moyenne = 352,30 g/mol
Masse molaire mono isotopique = 352,07 g/mol
Temps de rétention (HPLC) = 1,30 min [M+H]+ exp : m/z : 353,0 Da Rf (CHCl3/MeOH/AA - 40 : 10 : 5 ; A B) = 0,6
RMN 1H (300 MHz, DMSOd6, 3000K) : δ(ppm) 6,98 (2H, d, J0 = 9 Hz, HM cinnamyle) ; 7,94 (2H, d, J0 = 9 Hz, H5,9 cinnamyle) ; 8,23 (2H, s, H2,6 5- aminoisophtalique) ; 8,55 (IH, s, H4 5-aminoisophtalique) ; 8,55 (IH, s, H3 cinnamyle) ; 10,60 (2H, s, CO2H).
RMN 13C, Jmod (75 MHz, DMSO-d6, 3000K) : δ(ppm) 101,8 (C2 cinnamyle) ; 116,4 (C-6,8 cinnamyle) ; 116,8 (CN) ; 122,8 (C4 cinnamyle) ; 124,9 (C2,e 5- aminoisophtalique) ; 125,3 (C4 5-aminoisophtalique) ; 131,7 (C3,s 5- aminoisophtalique) ; 133,1 (Cs,9 cinnamyle) ; 139,2 (Ci 5-aminoisophtalique) ; 151,1 (C3 cinnamyle) ; 161,6 (C7 cinnamyle) ; 162,1 (Ci cinnamyle) ; 166,4 (CO2H).
Claims
1. Agent de réticulation des protéines de formule (I) R1
Ri est un groupe aryle éventuellement substitué une ou plusieurs fois par un groupement choisi dans le groupe constitué des groupements hydroxy, C1-C4 alkyle, OBoc, SO3Na, Deu, Ci-C4 alcoxy,
X et X', identiques ou différents, sont une fonction réactive des protéines.
2. Agent de réticulation selon la revendication 1, où n = m.
3. Agent de réticulation selon la revendication 1 ou 2, où Ri est un groupe phénoxy.
4. Agent de réticulation selon l'une quelconque des revendications précédentes,
5. Agent de réticulation selon l'une quelconque des revendications précédentes, où X et X', identiques ou différents, sont choisis dans le groupe constitué des fonctions imidoester, ester N-hydroxysuccinimide, isocyanate, isothiocyanate, N- maléimide, disulfure, 1 ,2-dicarbonyle, benzophénone et arylazide.
6. Agent de réticulation selon l'une quelconque des revendications précédentes, de formule
)l A (H)
7. Agent de réticulation selon l'une quelconque des revendications précédentes, de formule 
A (ni)
8. Agent de réticulation selon l'une quelconque des revendications précédentes, de formule
A
(IV)
9. Procédé de préparation d'un agent de réticulation selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, comprenant les étapes suivantes :
(a) couplage peptidique entre l'aminé RR'NH et l'acide carboxylique R1
- l'un des deux H et l'autre C00 
OOY
- l'un des deux H et l'autre 
avec Y est H ou tBu, et Z signifie un groupe alkyle en Ci à C1
HaI
HaI ou (a') (i) réaction de RR'NH avec O où HaI est un atome d'halogène en présence d'une base pour donner 
O
HaI
(ii) réaction de RR' N O
CN avec un cyanure, tel que KCN, pour donner RR1N
(iii) réaction de 
avec RiCHO en présence d'une base pour donner
(b) hydrolyse éventuelle de l'ester obtenu à l'étape (a) ou (a') en acide pour donner
R1
avec R2 et R2' représentant : - tous deux -(alkyl)-COOH
- l'un des deux H et l'autre
- l'un des deux H et l'autre 
où Z signifie un groupe alkyle en Ci à G (c) réaction du composé obtenu à l'étape (b) précédente avec une fonction réactive des protéines.
10. Utilisation d'un agent de réticulation selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 pour l'analyse de la structure tridimensionnelle d'une protéine en spectrométrie de masse.
11. Méthode d'analyse structurale d'une protéine ou d'un complexe de protéines comprenant les étapes suivantes : d) réticulation de la protéine ou du complexe protéique sur l'agent de réticulation selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 par les fonctions X et/ou
X', e) digestion enzymatique de la protéine ou complexe de protéines fixé à l'agent de réticulation sur selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, f) analyse par spectrométrie de masse.
12. Méthode selon la revendication 11, l'analyse par spectrométrie de masse étant réalisée avec la matrice HCCE.
13. Méthode selon l'une quelconque des revendications 11 à 12, la digestion enzymatique étant réalisée par la trypsine.
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