WO2010087466A1 - Ｐｃｒチャンバーの調製方法およびｐｃｒキット - Google Patents

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竹山春子
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Hitachi Ltd
Tokyo University of Agriculture and Technology NUC
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    • B01L3/52—Containers specially adapted for storing or dispensing a reagent

Definitions

  • the present invention relates to a method for preparing a PCR chamber used for PCR and a PCR kit.
  • next-generation sequencer (giga sequencer) having the ability to decode 1 billion (giga) base DNA at a time has been put into practical use.
  • One of the next-generation sequencers put into practical use is a next-generation sequencer developed by 454 Life Sciences, Inc., USA.
  • the next-generation sequencer of US 454 Life Science employs a technique for performing PCR using one molecule as a template (template) in parallel, and determines the sequence of one molecule of DNA without using cloning.
  • This next-generation sequencer of US 454 Life Science employs emulsion PCR.
  • Non-Patent Document 1 the concentration is adjusted so that one molecule of DNA template and one bead for capturing the PCR product are contained in an emulsion having an average particle size of about 100 ⁇ m, and the DNA template and beads are Enclosed in an emulsion (Non-Patent Document 1).
  • single-molecule template PCR in a small volume chamber has been reported previously (Non-Patent Document 2), and in Non-Patent Document 2, by adjusting the concentration of the template contained in the reaction solution, It has been shown that the number of molecules introduced into the chamber can be substantially controlled.
  • the shape of the chamber is limited by the bead diameter. That is, if at least one of the chamber diameter and the chamber depth is larger than the bead diameter, the possibility that two or more beads enter the chamber increases. In order to prevent this, when the diameter of the chamber is reduced or the depth of the chamber is reduced, the volume of the reaction solution that can be put into the chamber is reduced. As a result, the amount of the substrate containing the template (template) decreases, and a sufficient amplification product may not be obtained. Accordingly, there is a need for a PCR plate that can place a PCR reaction solution containing a sufficient base mass in a chamber and can control the placement of beads (carriers) in the PCR reaction solution. Yes.
  • the present invention provides a PCR chamber preparation method and a PCR kit capable of controlling the arrangement of the first carrier in the PCR reaction solution.
  • a method for preparing a PCR chamber according to one embodiment of the present invention includes: Filling the holes of the plate with holes with a PCR reaction solution containing a hydrogel material; Solidifying the PCR reaction solution to form a gel part in the hole; Disposing a first carrier on the gel part; Liquefying the gel part and placing the first carrier in the hole; including.
  • the PCR reaction solution in the step of filling the PCR reaction solution, includes a second carrier, and in the step of forming the gel portion, the gel portion includes the second carrier.
  • the second carrier can be disposed in the hole together with the first carrier.
  • the gel part may have a depression on the upper surface.
  • the hole may be a through hole.
  • the first carrier is a spherical bead
  • the hole has a circular cross section
  • the diameter of the hole is 1 to 1.5 times the average particle diameter of the bead.
  • the hydrogel material may be agarose.
  • the PCR chamber preparation method may further include a step of performing PCR after the step of filling the PCR reaction solution and before solidifying the PCR reaction solution.
  • a PCR kit according to another embodiment of the present invention is used in the method for preparing a PCR chamber, A plate with holes; A carrier; PCR reaction solution, A hydrogel material; including.
  • This specification includes the contents described in the specification and / or drawings of Japanese Patent Application No. 2009-015456, which is the basis of the priority of the present application.
  • FIG. 1A to FIG. 1E are cross-sectional views schematically illustrating a method for preparing a PCR chamber according to an embodiment of the present invention.
  • 2 (a) to 2 (e) are cross-sectional views schematically illustrating a modification of the PCR chamber preparation method shown in FIGS. 1 (a) to 1 (e).
  • FIG. 3 is a perspective view schematically illustrating a plate used in the method for preparing a PCR chamber according to an embodiment of the present invention.
  • 4 is a perspective view schematically showing an example of the plate shown in FIG. 3, and is a view cut along a plane perpendicular to the upper surface of the plate from the broken line in FIG.
  • FIG. 5 is a perspective view schematically showing another example of the plate shown in FIG.
  • FIG. 6 is an image showing a cross-section of the plate obtained in Example 1 of the present invention in which the gel part is formed in the hole (when the gel part is formed using a 0.7% agarose aqueous solution).
  • FIG. 7 is an image showing a cross section of a plate obtained by Example 1 of the present invention and having a gel portion formed in a hole (when a gel portion is formed using a 0.9% agarose aqueous solution).
  • FIG. 8 is a photograph showing the upper surface of the plate obtained in Example 2 of the present invention in which the first carrier (zirconia beads) is arranged on the upper surface of the gel part.
  • FIG. 9 is a photograph showing a fluorescently labeled PCR product on the first carrier (zirconia beads) obtained in Example 4 of the present invention.
  • 10A and 10B show the upper surface of the plate in which the PCR reaction solution having the first carrier (fluorescent beads) obtained in Example 5 of the present invention enters the hole (PCR chamber). It is a photograph shown.
  • FIG. 11 shows that both (A) and (B) show that the liquid obtained in Example 6 of the present invention containing the first carrier (zirconia beads) and the second carrier (fluorescent beads) is a hole (PCR chamber). It is a photograph which shows the upper surface of the plate which entered.
  • FIG. 12 is a graph showing the amount of ⁇ -biotin DNA immobilized on a carrier, measured in Example 6 of the present invention.
  • FIG. 13 is a graph showing the amount of ⁇ -biotin DNA immobilized on a carrier, measured in Example 7 of the present invention.
  • FIG. 1A to FIG. 1E are cross-sectional views schematically illustrating a method for preparing a PCR chamber according to an embodiment of the present invention.
  • the PCR chamber preparation method according to an embodiment of the present invention includes a PCR reaction including a hydrogel material in the hole 10 of the plate 100 having the hole 10.
  • Step 1 is a step of filling the hole 10 of the plate 100 having the hole 10 with the PCR reaction solution 20a containing the hydrogel material (see FIGS. 1A and 1B).
  • Step 1 is a step of filling the hole 10 of the plate 100 having the hole 10 with the PCR reaction solution 20a containing the hydrogel material (see FIGS. 1A and 1B).
  • 1.1.1.1. plate An example of the plate 100 used in step 1 is shown in FIGS.
  • the plate 100 has a plurality of arrayed holes 10. Moreover, it is preferable that the hole 10 is a through-hole, as FIG. 4 shows. Since the hole 10 is a through-hole, when the PCR reaction solution 20a is dropped on the plate 100 in a later step, the PCR reaction solution 20a can be reliably filled into the hole 10. That is, in this case, since the hole 10 is a through hole, the PCR reaction solution 20a that has fallen from the upper surface to the lower surface of the plate 100 rises in the hole 10 that is a through hole due to capillary action, and the hole 10 has a PCR reaction. Filled with liquid 20a.
  • the shape, size, depth, density, and sequence pattern of the holes 10 can be appropriately determined according to, for example, the amount of substrate and sample necessary for PCR, PCR conditions, and the like.
  • the diameter of the hole 10 is preferably larger than the average particle diameter of the first carrier 30.
  • the “average particle diameter” of the beads is measured by a sieving method.
  • the depth of the hole 10 is preferably larger than the average particle diameter of the first carrier 30.
  • the first carrier 30 can be disposed on the gel part 20 regardless of the depth of the hole 10 in step 3 to be described later. Regardless of the average particle size of the carrier 30, the depth of the hole 10 can be increased. Thereby, the quantity (base mass) of the PCR reaction liquid 20a put into the hole 10 can be increased.
  • FIG. 5 Another example of the plate 100 is shown in FIG. As shown in FIG. 5, the plate 100 may have a hole (concave portion) 12 that is not a through hole. 1.1.1-2.
  • Hydrogel material The hydrogel material is a polymer having a property of swelling when it contains water.
  • the hydrogel material has a property that does not affect PCR or a concentration within a range that does not affect PCR in the PCR reaction solution. Moreover, the hydrogel material is more preferable if it can form the gel part 20 which has the hollow 21 in the upper surface in the process 2 mentioned later.
  • a hydrogel material include agarose and gelatin.
  • agarose has the property of being easily dissolved in water by heating and easily gelled by cooling. For this reason, the gel part 20 can be easily formed by using agarose as a hydrogel material.
  • agarose has the property of not affecting PCR.
  • the hydrogel material is preferably a low melting point agarose in that the heating temperature when the gel part 20 is liquefied can be lowered.
  • the concentration of low melting point agarose in the PCR reaction solution 20a is preferably 0.6 to 4%, more preferably 0.7 to 0.9%. .
  • the concentration of the low melting point agarose exceeds 4%, the time required for liquefaction may not be long when the gel part 20 is liquefied in the step 4 described later.
  • Step 2 is a step of solidifying the PCR reaction solution 20a to form the gel part 20 in the hole 10 (see FIGS. 1B and 1C).
  • the gel part 20 is formed by solidifying the PCR reaction solution 20a.
  • the solidification means of the gel part 20 can be selected according to the kind of hydrogel material contained in the PCR reaction solution 20a, and examples thereof include cooling and addition of a gelling agent.
  • the gel part 20 can be solidified by cooling.
  • the gel part 20 obtained in the step 2 preferably has a depression 21 on the upper surface. By providing the depression 21 on the upper surface of the gel part 20, it is possible to prevent the first carrier 30 from being detached from the upper surface of the gel part 20 in Step 3 described later.
  • the first carrier 30 can be reliably put into the PCR reaction solution 20a in the hole 10.
  • a hydrogel material whose volume shrinks when solidified (gelled). That is, in the process in which the PCR reaction solution 20a containing such a hydrogel material is solidified in the hole 10, volume shrinkage occurs when the PCR reaction solution 20a (liquid) changes to the gel part 20 (solid). As a result, a recess 21 is formed on the upper surface of the gel part 20. As shown in FIG.
  • the recess 21 preferably has a shape that becomes deeper as the distance from the side surface of the hole 10 increases. This shape is presumed to be caused by the surface tension of the liquid (PCR reaction liquid 20a) with respect to the side surface of the hole 10 at the time of volume contraction.
  • the first carrier 30 can be reliably fastened to the upper surface of the gel portion 20.
  • the PCR reaction solution 20a can contain a DNA polymerase, a buffer, a forward primer, a reverse primer, a surfactant, and the like. Specific examples of the PCR reaction solution 20a include PCR reaction solutions used in the examples described later. 1.1.3.
  • Process 3 Step 3 is a step of arranging the first carrier 30 on the gel part 20 (see FIG. 1D).
  • the method for disposing the first carrier 30 on the gel part 20 is not particularly limited.
  • the suspension obtained by suspending the first carrier 30 in a dispersion medium water or an aqueous medium such as alcohol.
  • the method of dripping a thing on the plate 100 is mentioned.
  • the first carrier 30 include a carrier for capturing the template 22 or the PCR product in PCR, and beads (particles) are more preferable because they can be easily arranged on the plate 100.
  • the first carrier 30 is mainly composed of inorganic beads mainly composed of, for example, silica, alumina, zirconia, ceria, titania, magnesia and combinations thereof, such as acrylic and styrenic polymers.
  • Organic beads such as inorganic organic composite beads mainly composed of a composite material of the above inorganic material and the above organic material.
  • the first carrier 30 may be magnetic particles containing a magnetic material.
  • the first carrier 30 is made of zirconia beads in that the first carrier 30 can be surely dropped into the hole 10 in Step 4 to be described later.
  • the first carrier 30 has a size capable of entering the hole 10.
  • the diameter of the hole 10 is the first carrier 30. It is preferably 1 to 1.5 times the average particle diameter of the beads. In this case, if the diameter of the hole 10 is less than 1 times the average particle diameter of the beads, naturally the beads cannot be put into the hole 10, while the diameter of the hole 10 is 1. If it exceeds 5 times, the possibility of two or more beads entering the hole 10 increases. 1.1.4. Process 4 Step 4 is a step of liquefying the gel part 20 and disposing the first carrier 30 in the hole 10 (see FIG. 1E).
  • step 4 the gel part 20 is liquefied to return to the liquid (PCR reaction liquid 20 a), and the first carrier 30 falls into the PCR reaction liquid 20 a in the hole 10.
  • the plate 100 which has the hole (PCR chamber) 10 containing the PCR reaction liquid 20a containing the 1st support
  • carrier 30 can be obtained. Therefore, according to the method for preparing a PCR chamber according to this embodiment, the arrangement of the first carrier 30 in the hole 10 can be controlled. More specifically, the number of first carriers 30 arranged in the hole 10 can be controlled.
  • the plate 100 having the hole 10 having a sufficient depth can be obtained. Can be used. Thereby, the PCR reaction solution 20a containing a sufficient base mass can be disposed in the hole 10.
  • the first carrier 30 when the step of performing PCR is performed after step 1 and before step 2, the first carrier 30 has a function of immobilizing DNA amplified by PCR. It is preferable to have it. Thereby, DNA amplified by PCR can be immobilized on the first carrier 30, and the amount of the DNA can be measured by, for example, fluorescence spectroscopy.
  • the liquefaction means of the gel part 20 can be selected according to the type of hydrogel material used to form the gel part 20, and examples thereof include heating and addition of a solvent capable of dissolving the gel part. .
  • the gel part 20 can be liquefied by heating.
  • the heating temperature in this case is preferably 50 ° C. or higher.
  • Modified example 2 (a) to 2 (e) are diagrams schematically showing a modification of the method for preparing a PCR chamber according to the present embodiment. In the method for preparing a PCR chamber shown in FIGS. 2 (a) to 2 (e), the PCR reaction solution 20a containing the second carrier 32 is used, so that FIGS.
  • the PCR reaction solution 20a is the first in the step of filling the PCR reaction solution 20a into the hole 10 (see FIG. 2 (b)).
  • the first carrier 30 is disposed in the hole 10.
  • the PCR chamber shown in FIGS. 1A to 1E is prepared in that the second carrier 32 is disposed in the hole 10 together with the first carrier 30.
  • carrier 32 what was illustrated above as the 1st support
  • the first carrier 30 and the second carrier 32 may be the same, or may be different in at least one of, for example, shape, size, density, material, and function.
  • the second carrier 32 and the first carrier 30 in the PCR reaction solution 20a are stacked in this order (see FIG. 2 (e)). That is, two carriers can be arranged in one hole 10. Thereby, for example, two types of carriers having different functions can be reliably arranged in one hole.
  • the second carrier 32 may have a function of immobilizing the template
  • the first carrier 30 may have a function of capturing the amplified DNA.
  • two of the first carrier 30 and the second carrier 32 can be put into one hole 10 by a simple method. It is difficult to put two carriers in one hole 10 by the conventional method.
  • the method for preparing a PCR chamber according to the present modification this can be easily achieved.
  • the PCR chamber 10 obtained by the preparation method according to one embodiment of the present invention is 10 per plate, such as a giga plate.
  • PCR kit is used in the method for preparing a PCR chamber according to the above-described embodiment, and includes a plate 100 having holes 10, a first carrier 30, a PCR reaction solution 20a, hydro A gel material.
  • the plate 100, the first carrier 30, the PCR reaction solution 20a, and the hydrogel material those exemplified in the above embodiment can be used.
  • the plate 100, the first carrier 30, the PCR reaction solution 20a, and the hydrogel material may be present separately, or any of these may be mixed. May exist.
  • the hydrogel material may be contained in the PCR reaction solution 20a, or may be stored separately from the PCR reaction solution 20a and added to the PCR reaction solution 20a at the time of use. 3.
  • Example 1 gel part formation test
  • an agarose aqueous solution was placed in a hole (through hole) of a plate and solidified to form a gel part, and the surface of the obtained gel part was observed.
  • 0.7% and 0.9% agarose aqueous solutions were prepared, respectively.
  • low melting point agarose (trade name: NuSieve GTG Agarose, manufactured by Takara) was used as agarose.
  • Each aqueous solution was kept at 60 ° C., and a small amount of blue ink and red ink were dropped separately to be colored, and a hole having a circular cross section with a diameter of 25 ⁇ m and a depth of 1 mm (through hole) (3.6 ⁇ 10) 5 It was poured into a glass plate (thickness: 1 mm) (product name: capillary plate, manufactured by Hamamatsu Photonics Co., Ltd.) having 1 piece / piece.
  • This plate has the structure shown in FIGS.
  • PCR can be performed in the holes of the plate with an efficiency comparable to that of the normal efficiency.
  • the agarose aqueous solution was supplied to the upper surface of the plate, the agarose aqueous solution was filled in the holes by capillary action. That is, the agarose aqueous solution remained in the hole due to the surface tension.
  • the plate was moved onto ice and cooled to solidify the agarose aqueous solution, thereby forming a gel part in the hole.
  • Example 2 (Test for liquefying the gel part after placing the first carrier on the gel part)
  • carrier zirconia bead
  • Example 2 was arrange
  • the zirconia beads (average particle diameter of 22.6 ⁇ m, specific gravity of about 6) were mounted using the plate having the gel part formed using the 0.7% agarose aqueous solution obtained in Example 1. . Since the diameter of the hole (through hole) is 25 ⁇ m, two beads are not arranged in parallel on one gel part. Since zirconia beads have a specific gravity of about 6 and tend to aggregate, a bead suspension in which a large amount of milliQ (trade name) (100 ⁇ l) is added to the beads (10 mg) and suspended is dropped onto the upper surface of the plate. As a result, each bead was placed in a depression on the upper surface of the gel part (see FIG. 8).
  • FIG. 8 is a photograph of the upper surface of the plate in which zirconia beads (average particle diameter 22.6 ⁇ m) are arranged on the gel part. The left photograph was taken at a magnification of 40 times, and the right photograph was taken at a magnification of 450 times. According to FIG.
  • Example 3 (PCR efficiency confirmation test) In Example 3, the PCR efficiency in the presence of agarose was confirmed.
  • a PCR reaction solution was prepared by adding 25 ⁇ L of a 2.8% agarose aqueous solution to the solution having the composition shown in Table 1 (agarose concentration in the obtained PCR reaction solution: 0.7%). Further, an example in which a liquid having the composition shown in Table 1 was used as a PCR reaction liquid without adding an agarose aqueous solution was used as a comparative control. PCR was performed by 50 cycles of heat denaturation at 94 ° C. for 30 seconds, annealing at 56 ° C. for 30 seconds, and extension at 72 ° C.
  • Example 4 (PCR test)
  • the first carrier zirconia beads
  • the first reaction solution is obtained by liquefying the gel part. After dropping the carrier, PCR was performed.
  • zirconia beads whose surface was modified with a carboxyl group (average particle size 22 ⁇ m) (trade name bio beads (CBZ23-01-WS), manufactured by Hitachi Maxell) were used.
  • oligo DNA whose 5 ′ end is modified with an amino group (the base sequence of this oligo DNA is the same as the forward primer added to the PCR reaction solution) per particle.
  • 9 Modified with a covalent molecular bond.
  • the complementary strand (single strand) of the PCR product was captured by hybridization.
  • a PCR reaction solution with an agarose concentration of 0.7% was prepared in the same manner as in Example 3 above. After filling the PCR reaction solution into the hole of the plate, the PCR reaction solution was transferred to ice. Solidified to form a gel part in the hole.
  • FIG. 9 shows a photograph of the fluorescently labeled PCR product on the zirconia beads obtained in this example. According to FIG. 9, it can be seen that a fluorescently labeled PCR product (amplified DNA molecule) exists on the zirconia beads. In this example, the plate hole depth was 40 times the average particle size of the beads. Even in this case, it was confirmed that only one zirconia bead having a high specific gravity (specific gravity of about 6) could be placed in one hole, and that agarose did not affect the PCR efficiency. 3.5.
  • Example 5 (Method of putting two different carriers in the same hole)
  • fluorescent beads having an average particle diameter of 10 ⁇ m (trade name: FluoSpheres polystyrene microsphere, Invitrogen) as the first carrier.
  • the gel part was liquefied by heating in the same manner as in Example 2 except that the product was used to obtain a PCR reaction solution, and the first carrier was dropped into the PCR reaction solution.
  • FIG. 10 is a photograph of the upper surface of a plate having a hole (PCR chamber) containing a PCR reaction solution containing the first carrier, obtained in this example.
  • FIG. 10 shows that fluorescent beads are present in the PCR reaction solution placed in the hole.
  • FIG. 11 is a photograph of the upper surface of a plate having a hole (PCR chamber) containing a PCR reaction solution containing the first carrier and the second carrier obtained in this example.
  • the first carrier zirconia beads
  • the second carrier fluorescent beads
  • Example 6 (Recovery of PCR product by avidin-biotin reaction using carrier: preliminary experiment) ⁇ -actin DNA was amplified in a PCR tube using a PCR reaction solution shown in Table 2 using an F primer modified with biotin at the 5 ′ end (5 ′ biotin-tttttttttttttttttttttttagaaaaatctggccaccacc).
  • the carrier in the hole of the plate is extruded with mineral oil warmed to 70 ° C., 2 ⁇ B & W buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, 2.0 M NaCl, pH 7.5), 1 ⁇ PCR buffer, TE buffer, storage After washing in the order of buffer (50 mM Tris, 0.02% Tween 20), the carrier was dispersed in purified water.
  • the carrier was separated one by one using a manipulator, and real-time PCR (94 ° C. for 2 minutes, 94 ° C. for 30 seconds, 56 ° C. for 1 minute, The amount of ⁇ -actin DNA immobilized on the carrier was measured by 50 cycles of 72 ° C for 1 minute, 72 ° C for 10 minutes, 4 ° C ⁇ ).
  • a sample having the same composition as the sample of this example was prepared except that ⁇ -actin DNA was not contained, and the same treatment was performed. The measurement results are shown in FIG. In FIG.
  • Example 7 (Recovery of PCR product by avidin-biotin reaction using a carrier: this experiment) A PCR reaction solution having the composition shown in Table 3 was dropped onto the same glass plate used in Example 1, and then allowed to stand at room temperature to solidify to form a gel part. After coating this plate with mineral oil and capping with a cover glass, PCR (94 ° C. for 2 minutes ⁇ 94 ° C. for 30 seconds, 56 ° C. for 1 minute, 72 ° C.
  • the carrier in the hole of the plate is extruded with mineral oil warmed to 70 ° C., 2 ⁇ B & W buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, 2.0 M NaCl, pH 7.5), 1 ⁇ PCR buffer, TE buffer, storage buffer After washing in the order of (50 mM Tris, 0.02% Tween 20), the carrier was dispersed in purified water. Next, after dispersing this carrier in milliQ (trade name), the carrier was separated one by one using a manipulator, and real-time PCR (94 ° C. for 2 minutes, 94 ° C. for 30 seconds, 56 ° C.
  • the amount of ⁇ -actin DNA immobilized on the carrier was measured by 50 cycles of 72 ° C for 1 minute, 72 ° C for 10 minutes, 4 ° C ⁇ ).
  • a sample having the same composition as the sample of this example was prepared except that ⁇ -actin DNA was not contained, and the same treatment was performed.
  • the measurement results are shown in FIG. In FIG. 13, the left is the case where the carrier of this example is used (amplification efficiency: 5.4 ⁇ 10 5 Copy / hole), right shows the amount of immobilized ⁇ -actin DNA in each case of control.
  • FIG. 13 it can be seen that according to this example, ⁇ -actin DNA was efficiently captured on the carrier. This is the end of the description of the present embodiment.
  • the present invention is not limited to the above-described embodiments, and various modifications can be made.
  • the present invention also includes configurations that are substantially the same as the configurations described in the embodiments (for example, configurations that have the same functions, methods, and results, or configurations that have the same purposes and results).
  • the present invention includes a configuration in which a non-essential part of the configuration described in the embodiment is replaced.
  • the present invention includes a configuration that achieves the same effect as the configuration described in the embodiment or a configuration that can achieve the same object.
  • the invention includes a configuration in which a known technique is added to the configuration described in the embodiment.
  • the first carrier can be put in the PCR reaction solution in the hole of the plate. That is, according to the method for preparing a PCR chamber, the arrangement of the first carrier in the hole can be controlled. Moreover, according to the PCR chamber preparation method, since the depth of the hole in the plate is not limited by the size of the first carrier, a plate having a sufficiently deep hole can be used. Thereby, the PCR reaction liquid containing sufficient base mass can be arrange

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Abstract

　ＰＣＲ反応液中への第１の担体の配置を制御することができるＰＣＲチャンバーの調製方法およびＰＣＲキットを提供する。　ＰＣＲチャンバーの調製方法は、穴を有するプレートの前記穴に、ハイドロゲル材料を含むＰＣＲ反応液を充填する工程と、前記ＰＣＲ反応液を固化して、前記穴にゲル部を形成する工程と、前記ゲル部の上に第１の担体を配置させる工程と、前記ゲル部を液化させて、前記第１の担体を前記穴内に配置する工程と、を含む。

Description

ＰＣＲチャンバーの調製方法およびＰＣＲキット
　本発明は、ＰＣＲに使用されるＰＣＲチャンバーの調製方法およびＰＣＲキットに関する。
　近年、塩基配列解析技術は革命的に進歩しており、例えば、一度に１０億（ギガ）塩基のＤＮＡを解読できる能力を有する次世代シークエンサー（ギガシークエンサー）と呼ばれる技術が実用化されている。
　実用化された次世代シークエンサーの一つとして、米国４５４ライフサイエンス社によって開発された次世代シークエンサーが挙げられる。米国４５４ライフサイエンス社の次世代シークエンサーでは、１分子を鋳型（テンプレート）とするＰＣＲを並列に行なう技術を採用し、クローニングを介さずに１分子ＤＮＡの配列を決定している。
　この米国４５４ライフサイエンス社の次世代シークエンサーでは、エマルジョンＰＣＲを採用している。このエマルジョンＰＣＲでは、平均粒径１００μｍ程度のエマルジョンの中に、１分子のＤＮＡテンプレートと、ＰＣＲ産物を捕捉するためのビーズとが１個ずつ入るように濃度を調整して、ＤＮＡ鋳型およびビーズをエマルジョンに封入する（非特許文献１）。
　しかしながら、エマルジョンにＤＮＡ鋳型およびビーズがそれぞれ１個ずつ含まれるように制御することは通常困難であり、より効率が良いＰＣＲが求められている。
　一方、微小な体積のチャンバー内での１分子鋳型ＰＣＲは以前より報告されており（非特許文献２）、この非特許文献２には、反応液に含まれる鋳型の濃度を調整することによって、チャンバー内に投入する分子数をほぼ制御できることが示されている。
　しかしながら、このような微小な体積のチャンバー内に、エマルジョンＰＣＲと同様にＰＣＲ産物捕捉用のビーズを１個投入しようとした場合、チャンバーの形状がビーズの直径によって制限される。すなわち、チャンバーの径およびチャンバーの深さの少なくとも一方がビーズの直径より大きいと、ビーズがチャンバーに２個以上入る可能性が高くなる。これを防止するために、チャンバーの径を小さくしたりまたはチャンバーの深さを浅くしたりすると、チャンバーに入れることができる反応液の体積が小さくなる。その結果、鋳型（テンプレート）を含む基質の量が少なくなり、十分な増幅産物を得ることができない場合がある。
　そこで、十分な基質量を含有するＰＣＲ反応液をチャンバー内に配置することができ、かつ、ＰＣＲ反応液中へのビーズ（担体）の配置を制御することができるＰＣＲ用のプレートが求められている。
Ｇｅｎｏｍｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｉｎ　ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ　ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ　ｐｉｃｏｌｉｔｒｅ　ｒｅａｃｔｏｒｓ　Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｍ．Ｅｇｈｏｌｄ，Ｍ．ｅｔ　ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．２００５　Ｓｅｐ　１５；４３７（７０５７）：３２６−７） Ｏｎ−Ｃｈｉｐ　Ｎａｎｏｌｉｔｅｒ−Ｖｏｌｕｍｅ　Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　ＴａｑＭａｎ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　Ａ　Ｓｉｎｇｌｅ　Ｃｏｐｙ　Ｂａｓｅｄ　ｏｎ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｒｅｌｅａｓｅｄ　Ｍｉｃｒｏｃｈａｍｂｅｒｓ．Ｙａｓｕｔａｋａ　Ｍａｔｓｕｂａｒａ，Ｋａｇａｎ　Ｋｅｒｍａｎ，Ｍａｓａａｋｉ　Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｓｈｏｕｈｅｉ　Ｙａｍａｍｕｒａ，Ｙａｓｕｔａｋａ　Ｍｏｒｉｔａ，Ｙｕｚｕｒｕ　Ｔａｋａｍｕｒａ，ａｎｄ　Ｅｉｉｃｈｉ　Ｔａｍｉｙａ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７６（２１），６４３４−６４３９，２００４．
　本発明は、ＰＣＲ反応液中への第１の担体の配置を制御することができるＰＣＲチャンバーの調製方法およびＰＣＲキットを提供する。
　本発明の一態様に係るＰＣＲチャンバーの調製方法は、
　穴を有するプレートの前記穴に、ハイドロゲル材料を含むＰＣＲ反応液を充填する工程と、
　前記ＰＣＲ反応液を固化させて、前記穴にゲル部を形成する工程と、
　前記ゲル部の上に第１の担体を配置させる工程と、
　前記ゲル部を液化させて、前記第１の担体を前記穴内に配置する工程と、
を含む。
　上記ＰＣＲチャンバーの調製方法において、前記ＰＣＲ反応液を充填する工程において、該ＰＣＲ反応液は第２の担体を含み、前記ゲル部を形成する工程において、該ゲル部は前記第２の担体を含み、前記第１の担体を前記穴内に配置する工程において、該第１の担体とともに前記第２の担体を前記穴内に配置することができる。
　上記ＰＣＲチャンバーの調製方法において、前記ゲル部は、上面に窪みを有することができる。
　上記ＰＣＲチャンバーの調製方法において、前記穴は貫通穴であることができる。
　上記ＰＣＲチャンバーの調製方法において、前記第１の担体が球状のビーズであり、前記穴の断面が円形であり、前記穴の直径は、前記ビーズの平均粒径に対して１~１．５倍であることができる。
　上記ＰＣＲチャンバーの調製方法において、前記ハイドロゲル材料は、アガロースであることができる。
　上記ＰＣＲチャンバーの調製方法において、前記ＰＣＲ反応液を充填する工程の後、前記ＰＣＲ反応液を固化させる前に、ＰＣＲを行なう工程をさらに含むことができる。
　本発明の他の一態様に係るＰＣＲキットは、上記ＰＣＲチャンバーの調製方法で使用され、
　穴を有するプレートと、
　担体と、
　ＰＣＲ反応液と、
　ハイドロゲル材料と、
を含む。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００９−０１５４５６号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
　図１（ａ）~図１（ｅ）は、本発明の一実施形態に係るＰＣＲチャンバーの調製方法を模式的に説明する断面図である。
　図２（ａ）~図２（ｅ）は、図１（ａ）~図１（ｅ）に示されるＰＣＲチャンバーの調製方法の一変形例を模式的に説明する断面図である。
　図３は、本発明の一実施形態に係るＰＣＲチャンバーの調製方法にておいて使用されるプレートを模式的に説明する斜視図である。
　図４は、図３に示されるプレートの一例を模式的に示す斜視図であり、図３の破線からプレート上面に垂直な面で切断した図である。
　図５は、図３に示されるプレートの別の一例を模式的に示す斜視図であり、図３の破線からプレート上面に垂直な面で切断した図である。
　図６は、本発明の実施例１で得られた、穴にゲル部が形成されたプレートの断面を示す画像である（０．７％アガロース水溶液を用いてゲル部を形成した場合）。
　図７は、本発明の実施例１で得られた、穴にゲル部が形成されたプレートの断面を示す画像である（０．９％アガロース水溶液を用いてゲル部を形成した場合）。
　図８は、本発明の実施例２で得られた、ゲル部の上面に第１の担体（ジルコニアビーズ）が配置されたプレートの上面を示す写真である。
　図９は、本発明の実施例４で得られた、第１の担体（ジルコニアビーズ）上の蛍光標識ＰＣＲ産物を示す写真である。
　図１０は、（Ａ）および（Ｂ）ともに、本発明の実施例５で得られた、第１の担体（蛍光ビーズ）を有するＰＣＲ反応液が穴（ＰＣＲチャンバー）に入ったプレートの上面を示す写真である。
　図１１は、（Ａ）および（Ｂ）ともに、本発明の実施例６で得られた、第１の担体（ジルコニアビーズ）および第２の担体（蛍光ビーズ）を含む液が穴（ＰＣＲチャンバー）に入ったプレートの上面を示す写真である。
　図１２は、本発明の実施例６において測定された、担体に固定化されたβ−ビオチンＤＮＡの量を示すグラフである。
　図１３は、本発明の実施例７において測定された、担体に固定化されたβ−ビオチンＤＮＡの量を示すグラフである。
　以下、本発明の一実施形態に係るＰＣＲチャンバーの調製方法およびＰＣＲキットについて具体的に説明する。
　１．ＰＣＲチャンバーの調製方法
　１．１．調製方法
　図１（ａ）~図１（ｅ）は、本発明の一実施形態に係るＰＣＲチャンバーの調製方法を模式的に説明する断面図である。
　本発明の一実施形態に係るＰＣＲチャンバーの調製方法は、図１（ａ）~図１（ｅ）に示されるように、穴１０を有するプレート１００の穴１０に、ハイドロゲル材料を含むＰＣＲ反応液２０ａを充填する工程（工程１）と、ＰＣＲ反応液２０ａを固化させて、穴１０にゲル部２０ａを形成する工程（工程２）と、ゲル部２０の上に第１の担体３０を配置させる工程（工程３）と、ゲル部２０を液化させて、第１の担体３０を穴１０内に配置する工程（工程４）と、を含む。
　本実施形態に係るＰＣＲチャンバーの調製方法において、ＰＣＲを行なう工程は、工程１の後、工程２の前に行なうことができる。
　１．１．１．工程１
　工程１は、穴１０を有するプレート１００の穴１０に、ハイドロゲル材料を含むＰＣＲ反応液２０ａを充填する工程である（図１（ａ）および図１（ｂ）参照）。
　１．１．１−１．プレート
　工程１において使用するプレート１００の一例を図３および図４に示す。プレート１００は、複数の配列した穴１０を有する。また、穴１０は図４に示されるように、貫通穴であることが好ましい。穴１０が貫通穴であることにより、後の工程においてＰＣＲ反応液２０ａをプレート１００の上に滴下した際に、ＰＣＲ反応液２０ａを穴１０の内部に確実に充填させることができる。すなわち、この場合、穴１０が貫通穴であることにより、プレート１００の上面から下面に落ちたＰＣＲ反応液２０ａが、毛細管現象によって貫通穴である穴１０内を上昇し、穴１０内がＰＣＲ反応液２０ａで満たされる。
　穴１０の形状、大きさ、深さ、密度、および配列パターンは、例えばＰＣＲに必要な基質や試料の量、ＰＣＲ条件等に応じて適宜決定することができる。
　また、穴１０が円形であり、第１の担体３０が球状のビーズである場合、穴１０の直径は第１の担体３０の平均粒径より大きいことが好ましい。なお、本明細書におけるビーズの「平均粒径」は、ふるい分け法により測定されたものである。
　加えて、第１の担体３０が球状のビーズである場合、穴１０の深さは第１の担体３０の平均粒径より大きいことが好ましい。本実施形態に係るＰＣＲチャンバーの調製方法によれば、後述する工程３において、穴１０の深さに関わらず、第１の担体３０をゲル部２０上に配置することができるため、第１の担体３０の平均粒径に関わらず、穴１０の深さを大きくすることができる。これにより、穴１０に入れるＰＣＲ反応液２０ａの量（基質量）を増やすことができる。
　プレート１００の別の一例を図５に示す。プレート１００は図５に示されるように、貫通穴ではない穴（凹部）１２を有するものであってもよい。
　１．１．１−２．ハイドロゲル材料
　ハイドロゲル材料は水を含むことにより膨潤する性質を有するポリマーである。
　ハイドロゲル材料は、ＰＣＲに影響を与えない性質を有するものか、あるいは、ＰＣＲ反応液内でＰＣＲに影響を与えない範囲の濃度であることが好ましい。
　また、ハイドロゲル材料は、後述する工程２において、上面に窪み２１を有するゲル部２０を形成できるものであればより好ましい。このようなハイドロゲル材料としては、例えばアガロースやゼラチンが挙げられる。例えば、ハイドロゲル材料としてアガロースを使用することにより、固化するときにゲル部２０に体積収縮が生じるため、ゲル部２０の上面に窪み２１を形成することができる。また、アガロースは、加熱によって容易に水に溶解し、かつ、冷却によって容易にゲル化する性質を有する。このため、ハイドロゲル材料としてアガロースを使用することにより、ゲル部２０を容易に形成することができる。さらに、アガロースはＰＣＲに影響を与えない性質を有する。
　特に、ゲル部２０を液化する際の加熱温度を低くできる点で、ハイドロゲル材料は低融点アガロースであることが好ましい。ハイドロゲル材料として低融点アガロースを使用する場合、ＰＣＲ反応液２０ａ中における低融点アガロースの濃度は０．６~４％であることが好ましく、０．７~０．９％であることがより好ましい。低融点アガロースの濃度が４％を超えると、後述する工程４においてゲル部２０を液化する際に、液化に要する時間が長くなくなる場合がある。
　１．１．２．工程２
　工程２は、ＰＣＲ反応液２０ａを固化して、穴１０にゲル部２０を形成する工程である（図１（ｂ）および図１（ｃ）参照）。
　すなわち、工程２においては、ＰＣＲ反応液２０ａが固化することにより、ゲル部２０が形成される。
　ゲル部２０の固化手段は、ＰＣＲ反応液２０ａに含まれるハイドロゲル材料の種類に応じて選択することができ、例えば、冷却、ゲル化剤の添加等が挙げられる。例えばハイドロゲル材料がアガロースの場合、冷却によりゲル部２０を固化することができる。
　工程２において得られるゲル部２０は、上面に窪み２１を有することが好ましい。ゲル部２０の上面に窪み２１が設けられていることにより、後述する工程３において、ゲル部２０の上面から第１の担体３０が脱離するのを防止することができる。その結果、後述する工程４において、ゲル部２０を液化させる際に、第１の担体３０を穴１０内のＰＣＲ反応液２０ａ中に確実に入れることができる。
　上面に窪み２１を有するゲル部２０を得るためには、固化（ゲル化）すると体積が収縮するようなハイドロゲル材料を使用することが好ましい。すなわち、このようなハイドロゲル材料を含有するＰＣＲ反応液２０ａが穴１０内で固化する工程において、ＰＣＲ反応液２０ａ（液体）からゲル部２０（固体）へと変化する際に体積収縮が生じる。その結果、ゲル部２０の上面に窪み２１が生じる。
　この窪み２１は図１（ｃ）に示されるように、穴１０の側面から離れるにつれて深くなる形状を有することが好ましい。この形状は、体積収縮時における穴１０の側面に対する液体（ＰＣＲ反応液２０ａ）の表面張力によって生じると推測される。窪み２１がこのような形状を有することにより、第１の担体３０をゲル部２０の上面により確実に留めることができる。
　ＰＣＲ反応液２０ａはテンプレート２２のほか、ＤＮＡポリメラーゼ、バッファー、フォワードプライマー、リバースプライマー、界面活性剤等を含むことができる。ＰＣＲ反応液２０ａの具体例としては、例えば後述する実施例で用いられるＰＣＲ反応液が挙げられる。
　１．１．３．工程３
　工程３は、ゲル部２０の上に第１の担体３０を配置させる工程である（図１（ｄ）参照）。
　ゲル部２０の上に第１の担体３０を配置させる方法は特に限定されないが、例えば、第１の担体３０を分散媒（水またはアルコール等の水系媒体）に懸濁させて得られた懸濁物をプレート１００の上に滴下する方法が挙げられる。
　第１の担体３０としては、ＰＣＲにおけるテンプレート２２またはＰＣＲ産物を捕捉するための担体が挙げられ、プレート１００の上に均一に配置させやすい点で、ビーズ（粒子）であるのがより好ましい。より具体的には、第１の担体３０は、例えばシリカ、アルミナ、ジルコニア、セリア、チタニア、マグネシアおよびこれらの組み合わせから主に構成される無機ビーズ、例えばアクリル系、スチレン系のポリマーから主に構成される有機ビーズ、例えば上記無機材料と上記有機材料との複合材料から主に構成される無機有機複合ビーズが挙げられる。この場合、第１の担体３０は磁性体を含有する磁性粒子であってもよい。中でも、比重が比較的大きいため、窪み２１から抜けにくいのに加えて、後述する工程４において第１の担体３０を穴１０に確実に落とすことができる点で、第１の担体３０はジルコニアビーズであることがより好ましい。
　第１の担体３０は穴１０に入ることができる大きさを有する。
　また、本実施形態に係るＰＣＲチャンバーの調製方法では、穴１０の断面が円形であって、第１の担体３０が球状のビーズである場合、穴１０の直径は、第１の担体３０であるビーズの平均粒径に対して１~１．５倍であることが好ましい。この場合、穴１０の直径がビーズの平均粒径の１倍未満であると、当然に、穴１０にビーズを入れることができず、一方、穴１０の直径がビーズの平均粒径の１．５倍を超えると、穴１０にビーズが２個以上入る可能性が高くなる。
　１．１．４．工程４
　工程４は、ゲル部２０を液化させて、第１の担体３０を穴１０内に配置する工程である（図１（ｅ）参照）。
　すなわち、工程４においては、ゲル部２０が液化することにより、液体（ＰＣＲ反応液２０ａ）に戻るとともに、第１の担体３０が穴１０の中のＰＣＲ反応液２０ａに落ちる。これにより、本実施形態に係るＰＣＲチャンバーの調製方法によれば、第１の担体３０を含有するＰＣＲ反応液２０ａが入った穴（ＰＣＲチャンバー）１０を有するプレート１００を得ることができる。
　したがって、本実施形態に係るＰＣＲチャンバーの調製方法によれば、穴１０内への第１の担体３０の配置を制御することができる。より具体的には、穴１０内に配置される第１の担体３０の個数を制御することができる。
　また、本実施形態に係るＰＣＲチャンバーの調製方法によれば、プレート１００の穴１０の深さが第１の担体３０の大きさによって制限されないため、十分な深さの穴１０を有するプレート１００を使用することができる。これにより、十分な基質量を含有するＰＣＲ反応液２０ａを穴１０に配置することができる。
　本実施形態に係るＰＣＲチャンバーの調製方法において、ＰＣＲを行なう工程を工程１の後でかつ工程２の前に行なう場合、第１の担体３０は、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡを固定化させる機能を有するものであることが好ましい。これにより、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡを第１の担体３０に固定化させ、例えば蛍光分光法等によって該ＤＮＡの量を測定することができる。
　ゲル部２０の液化手段は、ゲル部２０を形成するために用いられるハイドロゲル材料の種類に応じて選択することができ、例えば、加熱や、ゲル部を溶解可能な溶媒の添加等が挙げられる。例えばハイドロゲル材料がアガロースの場合、加熱によりゲル部２０を液化することができる。この場合の加熱温度は５０℃以上であるのが好ましい。
　１．２．変形例
　図２（ａ）~図２（ｅ）は、本実施形態に係るＰＣＲチャンバーの調製方法のー変形例を模式的に示す図である。
　図２（ａ）~図２（ｅ）に示されるＰＣＲチャンバーの調製方法では、第２の担体３２を含むＰＣＲ反応液２０ａを使用する点で、図１（ａ）~図１（ｅ）に示されるＰＣＲチャンバーの調製方法と異なる。
　すなわち、図２（ａ）~図２（ｅ）に示されるＰＣＲチャンバーの調製方法では、ＰＣＲ反応液２０ａを穴１０に充填する工程（図２（ｂ）参照）において、ＰＣＲ反応液２０ａが第２の担体３２を含む点、ゲル部２０を形成する工程（図２（ｃ）参照）において、ゲル部２０が第２の担体３２を含む点、第１の担体３０を穴１０内に配置する工程（図２（ｄ）参照）において、第１の担体３０とともに第２の担体３２を穴１０内に配置する点で、図１（ａ）~図１（ｅ）に示されるＰＣＲチャンバーの調製方法と異なる。
　第２の担体３２としては、例えば、第１の担体３０として上記に例示したものを用いることができる。また、第１の担体３０および第２の担体３２は同じものであってもよいし、あるいは、例えば形状、大きさ、密度、材質および機能のうち少なくとも１つが異なるものであってもよい。
　図２（ａ）~図２（ｅ）に示されるＰＣＲチャンバーの調製方法で得られたＰＣＲチャンバー１０を有するプレート１００では、ＰＣＲ反応液２０ａの中で第２の担体３２および第１の担体３０がこの順で積み上げられている（図２（ｅ）参照）。すなわち、１つの穴１０に２個の担体を配置させることができる。これにより、例えば、機能が異なる２種類の担体を１つの穴に確実に配置させることができる。この場合、例えば、第２の担体３２がテンプレートを固定化する機能を有し、第１の担体３０が増幅されたＤＮＡを捕捉する機能を有していてもよい。
　これに対して、本変形例に係るＰＣＲチャンバーの調製方法によれば、１つの穴１０に第１の担体３０および第２の担体３２の２個を簡便な方法にて入れることができる。
　１つの穴１０に２個の担体を入れることは従来の方法では困難である。これに対して、本変形例に係るＰＣＲチャンバーの調製方法によれば、これを容易に達成することができる。
　本発明の一実施形態に係る調製方法によって得られたＰＣＲチャンバー１０は、例えばギガプレートのような、１枚あたり１０１２個以上の穴１０を有するプレート１００を用いるＰＣＲにおいて、多数の穴１０に第１の担体３０を効率良く入れることができる点で有用である。
　２．ＰＣＲキット
　本発明の他の一実施形態に係るＰＣＲキットは、上記実施形態に係るＰＣＲチャンバーの調製方法に使用され、穴１０を有するプレート１００と、第１の担体３０と、ＰＣＲ反応液２０ａと、ハイドロゲル材料と、を含む。
　プレート１００、第１の担体３０、ＰＣＲ反応液２０ａ、およびハイドロゲル材料としては、上記実施形態で例示したものを使用することができる。
　本実施形態に係るＰＣＲキットにおいて、プレート１００、第１の担体３０、ＰＣＲ反応液２０ａ、およびハイドロゲル材料はそれぞれ別個に存在してもよいし、あるいは、これらのうちのいずれかが混合した状態で存在していてもよい。例えば、ハイドロゲル材料はＰＣＲ反応液２０ａに含有された状態であってもよいし、あるいは、ＰＣＲ反応液２０ａとは別に保存され、使用時にＰＣＲ反応液２０ａに添加してもよい。
　３．実施例
　以下、本発明を、実施例を挙げてさらに具体的に説明する。本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。なお、実施例および比較例中の「％」および「部」は特記しない限り、それぞれ質量％および質量部であることを示している。
　３．１．実施例１（ゲル部の形成試験）
　実施例１では、アガロース水溶液をプレートの穴（貫通穴）に配置し、固化してゲル部を形成し、得られたゲル部の表面の観察を行なった。
　まず、０．７％および０．９％のアガロース水溶液をそれぞれ調製した。本実施例では、アガロースとして低融点アガロース（商品名：ＮｕＳｉｅｖｅ　ＧＴＧ　Ａｇａｒｏｓｅ、Ｔａｋａｒａ社製）を使用した。それぞれの水溶液を６０℃に保持し、青インクおよび赤インクを別々に少量垂らして着色し、直径２５μｍの円形断面を有し、かつ深さ１ｍｍの穴（貫通穴）（３．６×１０５個／１枚あたり）を有するガラス製プレート（厚さ１ｍｍ）（商品名：キャピラリプレート、浜松ホトニクス社製）に流し込んだ。このプレートは、図３および図４に示される構造を有する。なお、このプレートの穴内では、通常の効率と遜色ない効率でＰＣＲを行なうことができることを確認している。
　次に、アガロース水溶液をプレート上面に供給したところ、アガロース水溶液は毛細管現象により穴に充填された。すなわち、アガロース水溶液は表面張力によって穴内に留まっていた。次に、このプレートを氷上に移動して冷却することにより、アガロース水溶液を固化して、穴内にゲル部を形成した。
　次いで、穴内にゲル部が形成されたプレートの上面を、顕微鏡（型名「ＧＸ５１」、オリンパス製）で焦点深度を自動で１μｍずつ変えながら観察し、その断面図をコンピューターソフト（商品名「ＶＨＸ」、キーエンス製）を用いて合成して、３Ｄ画像を得た。
　その結果、図６および図７に示されるように、プレート上面において、ゲル部の上面に窪みが観察された。この窪みは、液体（アガロース水溶液）から固体（ゲル部）へと固化する際の体積収縮により生じたと推測される。
　図６および図７において、左図はプレートの上面近傍の断面の深度測定の結果を示し、右図は前記深度測定を３次元的に行なった結果に基づいて作成された３Ｄ合成画像である。
　ゲル部上面の窪みの深さは、０．７％アガロース水溶液を用いて得られたゲル部（図６）と０．９％アガロース水溶液を用いて得られたゲル部（図７）とでほぼ同じであり、いずれも平均３．５μｍ程度であった。
　３．２．実施例２（ゲル部上に第１の担体を配置した後、ゲル部を液化させる試験）
　実施例２では、ゲル部の上に第１の担体（ジルコニアビーズ）を配置し、その表面の観察を行なった。
　本実施例では、実施例１において得られた、０．７％アガロース水溶液を用いて形成されたゲル部を有するプレートを用い、ジルコニアビーズ（平均粒径２２．６μｍ、比重約６）をマウントした。穴（貫通穴）の直径は直径２５μｍであるため、１つのゲル部の上にビーズが並列に２個配置されることはない。また、ジルコニアビーズは比重が約６と重く、凝集しやすいため、ビーズ（１０ｍｇ）に多量のｍｉｌｌｉＱ（商品名）（１００μｌ）を加えて懸濁状態としたビーズ懸濁物をプレートの上面に滴下したところ、各ビーズはそれぞれゲル部上面の窪みに配置された（図８参照）。
　ゲル部上面の窪みの深さ（平均３．５μｍ）から判断すると、ビーズの平均粒径の約１／８が穴内に位置していると推測される。また、プレートの上面に平行な方向から水を流したところ、ゲル部上面の窪みからビーズが出ることなく、ビーズはゲル部上面に留まっていた。さらに、プレート上面の穴以外に配置された余分なビーズは、キムワイプ（商品名）で払い落として除去することができた。一方、ゲル部上面に配置されたビーズは、キムワイプ（商品名）で払ってもゲル部上面に留まったままであった。なお、キムワイプ（商品名）による払いは、プレート上面に残る水分除去にも有効であり、懸濁に用いたｍｉｌｌｉＱがゲル部を希釈することはほぼなかった。
　さらに、ビーズがゲル部の上面に配置されているプレートをホットプレートに移動させて７０℃程度の熱を加えると、ゲル部は溶けてＰＣＲ反応液に戻り、ビーズは穴内のＰＣＲ反応液中に落ちたことを確認した。
　図８は、ゲル部上にジルコニアビーズ（平均粒径２２．６μｍ）が配置されたプレート上面の写真であり、左の写真は倍率４０倍、右の写真は倍率４５０倍でそれぞれ撮影された。図８によれば、赤で着色されたゲル部上にビーズ（白色部分）が配置されているのが分かる。
　３．３．実施例３（ＰＣＲ効率の確認試験）
　実施例３では、アガロース存在下でのＰＣＲ効率を確認した。表１に示す組成を有する液に、２．８％アガロース水溶液２５μＬを加えてＰＣＲ反応液を調製した（得られたＰＣＲ反応液中のアガロース濃度：０．７％）。また、アガロース水溶液を添加しないで、表１に示す組成を有する液をＰＣＲ反応液として用いた例を比較対照とした。
　ＰＣＲは、熱変性９４℃３０秒、アニーリング５６℃３０秒、伸長７２℃１分を５０サイクル行った。反応終了後、バイオアナライザーアジレントテクノロジー製を用いて増幅産物を定量した。その結果、本実施例と比較対照との間に結果の差はほとんどなく、ＰＣＲ阻害はアガロースによって阻害されないことが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
　３．４．実施例４（ＰＣＲ試験）
　実施例４では、アガロースを含むＰＣＲ反応液を用いて形成されたゲル部上に第１の担体（ジルコニアビーズ）を配置し、ゲル部を液化させて得られたＰＣＲ反応液中に第１の担体を落とした後、ＰＣＲを行った。
　実施例４では、表面がカルボキシル基修飾されたジルコニアビーズ（平均粒径２２μｍ）（商品名バイオ用ビーズ（ＣＢＺ２３−０１−ＷＳ）、日立マクセル社製）を用いた。この表面に対して、５’末端をアミノ基で修飾したオリゴＤＮＡ（このオリゴＤＮＡの塩基配列は、ＰＣＲ反応液に添加するフォワードプライマーと同一である。）を１粒子あたり１０９分子共有結合で修飾した。この修飾オリゴＤＮＡによって、ＰＣＲ産物の相補鎖（１本鎖）をハイブリダイゼーションによって捕捉した。
　上述の実施例３と同様の方法にて、アガロース濃度が０．７％であるＰＣＲ反応液を調製し、このＰＣＲ反応液をプレートの穴に充填した後、氷上に移して該ＰＣＲ反応液を固化して、穴内にゲル部を形成した。次に、１０ｍｇのジルコニアビーズおよび１００μＬのｍｉｌｌｉＱ（商品名）の懸濁物をプレート上面に滴下して、ピペットマンで均一に攪拌し、ゲル部上にビーズを配置させた。以降の処理を上述の実施例２と同様に行って、ＰＣＲ反応液中にビーズを落とした後、ＰＣＲを行った。
　ＰＣＲ終了後、ビーズを回収し、表１に示すＰＣＲ反応液のバッファーで１回、０．１％　Ｔｗｅｅｎ−２０を含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）で２回洗浄を行い、ビーズを１個ずつマニュピレートによって拾い、ビーズに捕捉された増幅ＤＮＡ分子をリアルタイムＰＣＲで定量した。その結果、１ビーズあたり３×１０５個のＤＮＡ分子が捕捉されていた。
　図９は、本実施例で得られた、ジルコニアビーズ上の蛍光標識ＰＣＲ産物の写真を示す。図９によれば、ジルコニアビーズ上に蛍光標識されたＰＣＲ産物（増幅ＤＮＡ分子）が存在していることがわかる。
　本実施例では、プレートの穴の深さはビーズの平均粒径の４０倍であった。この場合においても、比重の重いジルコニアビーズ（比重約６）を１個の穴に１個のみ配置させることができ、かつ、アガロースはＰＣＲ効率にも影響を与えないことが確認された。
　３．５．実施例５（異なる２担体を同一孔にいれる方法）
　実施例５では、実施例１と同様の方法でゲル部をプレートの穴（貫通穴）に形成した後、第１の担体として平均粒径１０μｍの蛍光ビーズ（商品名ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓポリスチレンマイクロスフェア、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いた以外は実施例２と同様の方法にて、ゲル部を加熱により液化させてＰＣＲ反応液を得て、第１の担体をＰＣＲ反応液中に落とした。
　図１０は、本実施例で得られた、第１の担体を含むＰＣＲ反応液が入った穴（ＰＣＲチャンバー）を有するプレートの上面の写真である。図１０によれば、穴に配置されたＰＣＲ反応液中に蛍光ビーズが存在していることがわかる。
　次に、実施例２と同様の方法にて、第２の担体（平均粒径２２μｍのジルコニアビーズ）をゲル部上に配置した後、ゲル部を加熱により液化させてＰＣＲ反応液を得た。これにより、第１の担体および第２の担体を含むＰＣＲ反応液が入った穴（ＰＣＲチャンバー）を有するプレートが得られた。
　図１１は、本実施例で得られた、第１の担体および第２の担体を含むＰＣＲ反応液が入った穴（ＰＣＲチャンバー）を有するプレートの上面の写真である。本実施例で得られた穴（ＰＣＲチャンバー）に含まれるＰＣＲ反応液中では、図２（ｅ）に示されるように、第２の担体（蛍光ビーズ）の上に第１の担体（ジルコニアビーズ）が配置されている。
　図１１によれば、第２の担体（蛍光ビーズ）から生じる蛍光が第１の担体（ジルコニアビーズ）の隙間から観察されたことから、ＰＣＲ反応液中において、第２の担体の上に第１の担体が配置されていることがわかる。
　３．６．実施例６（担体を用いたアビジン−ビオチン反応によるＰＣＲ産物の回収：予備実験）
　５’末端がビオチン修飾されたＦプライマー（５’ｂｉｏｔｉｎ−ｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔａｇａａａａｔｃｔｇｇｃａｃｃａｃａｃｃ）を用いて、表２に示されるＰＣＲ反応液を用いて、ＰＣＲチューブ内でβ−アクチンＤＮＡを増幅した。増幅産物量を測定した後、これにアガロース溶液を加え（終濃度０．７％）、２×１０１２コピー／１００μｌ（１×１０７コピー／穴）の濃度に調整したものを、実施例１で用いたものと同じガラス製プレートに毛細管現象を利用して充填した後、室温で静置して固めてゲル部を形成した。このプレートをミネラルオイルに浸し、キムワイプでふき取った後、アビジン修飾された担体（ジルコニアビーズ）４ｍｇ（１×１０５個）をプレート上に重層した。
　次に、得られたプレートの上下をミネラルオイルでコーティングし、カバーガラスでフタをした後に、サーマルサイクラーにより温度を変遷させて（７０℃２０分，３７℃１０分，５０℃１０分，３７℃１０分，５０℃∞）、ゲル部を溶解させると共に、アビジンとビオチンとを結合させた後、ビオチン化β−アクチンＤＮＡが固定化された担体を回収した。
　次いで、プレートの穴内にある担体を、７０℃に温めたミネラルオイルで押し出し、２×Ｂ＆Ｗバッファー（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ，１ｍＭ　ＥＤＴＡ，２．０Ｍ　ＮａＣｌ，ｐＨ７．５）、１×ＰＣＲバッファー、ＴＥバッファー、保存バッファー（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ，０．０２％　Ｔｗｅｅｎ２０）の順番で洗浄した後に、該担体を精製水に分散させた。
　次いで、この担体をｍｉｌｌｉＱ（商品名）に分散させた後、マニピュレータを用いて該担体を１個ずつ分取して、リアルタイムＰＣＲ法（９４℃２分，９４℃３０秒，５６℃１分，７２℃１分を５０サイクル、７２℃１０分，４℃∞）により、担体に固定化されたβ−アクチンＤＮＡの量を測定した。
　また、コントロールとして、β−アクチンＤＮＡが入っていない以外は本実施例のサンプルと同じ組成を有するサンプルを調製し、同様の処理を行った。
　測定結果を図１２に示す。図１２では、左が本実施例の担体を用いた場合、右がコントロールの場合のそれぞれにおける固定化されたβ−アクチンＤＮＡの量を示している。図１２に示されるように、本実施例によれば、担体にβ−アクチンＤＮＡを効率良く捕捉できたことがわかる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 　３．７．実施例７（担体を用いたアビジン−ビオチン反応によるＰＣＲ産物の回収：本実験）
　実施例１で用いたものと同じガラス製プレートに、表３に示される組成を有するＰＣＲ反応液を滴下した後、室温で静置して固めてゲル部を形成した。このプレートをミネラルオイルでコーティングし、カバーガラスでフタをした後に、サーマルサイクラーによりＰＣＲ（９４℃２分→９４℃３０秒，５６℃１分，７２℃１分：５０サイクル→７２℃１０分→４℃∞）を行った。
　反応終了後、プレート表面をキムワイプで拭いてミネラルオイルを除去した後、アビジン修飾された担体（ジルコニアビーズ）４ｍｇ（１×１０５個）をゲル部上に重層した。
　このプレートをミネラルオイルでコーティングし、カバーガラスでフタをした後に、サーマルサイクラーにより温度を変遷させ（７０℃２０分，３７℃１０分，５０℃１０分，３７℃１０分，５０℃∞）、ゲル部を溶解させると共に、ビオチン化β−アクチンＤＮＡが固定化された担体を回収した。
　次いで、プレートの穴内にある担体を７０℃に温めたミネラルオイルで押し出し、２×Ｂ＆Ｗバッファー（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ，１ｍＭ　ＥＤＴＡ，２．０Ｍ　ＮａＣｌ，ｐＨ７．５）、１×ＰＣＲバッファー、ＴＥバッファー、保存バッファー（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ，０．０２％　Ｔｗｅｅｎ２０）の順番で洗浄した後に、該担体を精製水に分散させた。
　次いで、この担体をｍｉｌｌｉＱ（商品名）に分散させた後、マニピュレータを用いて該担体を１個ずつ分取して、リアルタイムＰＣＲ法（９４℃２分，９４℃３０秒，５６℃１分，７２℃１分を５０サイクル、７２℃１０分，４℃∞）により、担体に固定化されたβ−アクチンＤＮＡの量を測定した。
　また、コントロールとして、β−アクチンＤＮＡが入っていない以外は本実施例のサンプルと同じ組成を有するサンプルを調製し、同様の処理を行った。
　測定結果を図１３に示す。図１３では、左が本実施例の担体を用いた場合（増幅効率：５．４×１０５コピー／穴）、右がコントロールの場合のそれぞれにおける固定化されたβ−アクチンＤＮＡの量を示している。図１３に示されるように、本実施例によれば、担体にβ−アクチンＤＮＡを効率良く捕捉できたことがわかる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
　本実施形態に係る説明は以上である。本発明は、上述した実施形態に限定されるものではなく、さらなる種々の変形が可能である。また本発明は、実施形態で説明した構成と実質的に同一の構成（例えば、機能、方法および結果が同一の構成、あるいは目的および結果が同一の構成）を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成または同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。
　上記ＰＣＲチャンバーの調製方法によれば、ゲル部の上に第１の担体を配置させる工程と、ゲル部を液化させて、第１の担体を穴内に配置する工程とを含むことにより、例えば穴の断面が微小な場合であっても、プレートの穴にあるＰＣＲ反応液中に第１の担体を入れることができる。すなわち、上記ＰＣＲチャンバーの調製方法によれば、穴内への第１の担体の配置を制御することができる。
　また、上記ＰＣＲチャンバーの調製方法によれば、プレートの穴の深さが第１の担体の大きさによって制限されないため、十分な深さの穴を有するプレートを使用することができる。これにより、十分な基質量を含有するＰＣＲ反応液を穴に配置することができる。
　１００…プレート、１０，１２…穴（チャンバー）、２０…ゲル部、２０ａ…ＰＣＲ反応液、２１…窪み、２２…テンプレート、３０…第１の担体（ビーズ）、３２…第２の担体（ビーズ）
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (8)

  1. 　穴を有するプレートの前記穴に、ハイドロゲル材料を含むＰＣＲ反応液を充填する工程と、
    　前記ＰＣＲ反応液を固化させて、前記穴にゲル部を形成する工程と、
    　前記ゲル部の上に第１の担体を配置させる工程と、
    　前記ゲル部を液化させて、前記第１の担体を前記穴内に配置する工程と、
    を含む、ＰＣＲチャンバーの調製方法。
  2. 　前記ＰＣＲ反応液を充填する工程において、該ＰＣＲ反応液は第２の担体を含み、
    　前記ゲル部を形成する工程において、該ゲル部は前記第２の担体を含み、
    　前記第１の担体を前記穴内に配置する工程において、該第１の担体とともに前記第２の担体を前記穴内に配置する、請求項１に記載のＰＣＲチャンバーの調製方法。
  3. 　前記ゲル部は、上面に窪みを有する、請求項１または２に記載のＰＣＲチャンバーの調製方法。
  4. 　前記穴は貫通穴である、請求項１ないし３のいずれか１項に記載のＰＣＲチャンバーの調製方法。
  5. 　前記第１の担体が球状のビーズであり、
    　前記穴の断面が円形であり、
    　前記穴の直径は、前記ビーズの平均粒径に対して１~１．５倍である、請求項１ないし４のいずれか１項に記載のＰＣＲチャンバーの調製方法。
  6. 　前記ハイドロゲル材料は、アガロースである、請求項１ないし５のいずれか１項に記載のＰＣＲチャンバーの調製方法。
  7. 　前記ＰＣＲ反応液を充填する工程の後、前記ＰＣＲ反応液を固化させる前に、ＰＣＲを行なう工程をさらに含む、請求項１ないし６のいずれか１項に記載のＰＣＲチャンバーの調製方法。
  8. 　請求項１ないし７のいずれか１項に記載のＰＣＲチャンバーの調製方法に使用され、
    　穴を有するプレートと、
    　担体と、
    　ＰＣＲ反応液と、
    　ハイドロゲル材料と、
    を含む、ＰＣＲキット。
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