WO2010083956A2 - Begasungssystem - Google Patents

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WO2010083956A2
WO2010083956A2 PCT/EP2010/000124 EP2010000124W WO2010083956A2 WO 2010083956 A2 WO2010083956 A2 WO 2010083956A2 EP 2010000124 W EP2010000124 W EP 2010000124W WO 2010083956 A2 WO2010083956 A2 WO 2010083956A2
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WO
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gas
bubble column
distributor
vector
medium
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PCT/EP2010/000124
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Joerg Kauling
Björn FRAHM
Andre Pütz
Markus Schindler
Original Assignee
Bayer Technology Services Gmbh
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Publication date
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Priority to EP10700704A priority patent/EP2389430A2/de
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Publication of WO2010083956A3 publication Critical patent/WO2010083956A3/de

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/12—Cyclic peptides, e.g. bacitracins; Polymyxins; Gramicidins S, C; Tyrocidins A, B or C
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01F—MIXING, e.g. DISSOLVING, EMULSIFYING OR DISPERSING
    • B01F23/00—Mixing according to the phases to be mixed, e.g. dispersing or emulsifying
    • B01F23/20—Mixing gases with liquids
    • B01F23/23—Mixing gases with liquids by introducing gases into liquid media, e.g. for producing aerated liquids
    • B01F23/232—Mixing gases with liquids by introducing gases into liquid media, e.g. for producing aerated liquids using flow-mixing means for introducing the gases, e.g. baffles
    • B01F23/2323—Mixing gases with liquids by introducing gases into liquid media, e.g. for producing aerated liquids using flow-mixing means for introducing the gases, e.g. baffles by circulating the flow in guiding constructions or conduits
    • B01F23/23231—Mixing gases with liquids by introducing gases into liquid media, e.g. for producing aerated liquids using flow-mixing means for introducing the gases, e.g. baffles by circulating the flow in guiding constructions or conduits being at least partially immersed in the liquid, e.g. in a closed circuit
    • B01F23/232311—Mixing gases with liquids by introducing gases into liquid media, e.g. for producing aerated liquids using flow-mixing means for introducing the gases, e.g. baffles by circulating the flow in guiding constructions or conduits being at least partially immersed in the liquid, e.g. in a closed circuit the conduits being vertical draft pipes with a lower intake end and an upper exit end
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01F—MIXING, e.g. DISSOLVING, EMULSIFYING OR DISPERSING
    • B01F23/00—Mixing according to the phases to be mixed, e.g. dispersing or emulsifying
    • B01F23/20—Mixing gases with liquids
    • B01F23/23—Mixing gases with liquids by introducing gases into liquid media, e.g. for producing aerated liquids
    • B01F23/233—Mixing gases with liquids by introducing gases into liquid media, e.g. for producing aerated liquids using driven stirrers with completely immersed stirring elements
    • B01F23/2331—Mixing gases with liquids by introducing gases into liquid media, e.g. for producing aerated liquids using driven stirrers with completely immersed stirring elements characterised by the introduction of the gas along the axis of the stirrer or along the stirrer elements
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    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01F—MIXING, e.g. DISSOLVING, EMULSIFYING OR DISPERSING
    • B01F27/00—Mixers with rotary stirring devices in fixed receptacles; Kneaders
    • B01F27/80—Mixers with rotary stirring devices in fixed receptacles; Kneaders with stirrers rotating about a substantially vertical axis
    • B01F27/86—Mixers with rotary stirring devices in fixed receptacles; Kneaders with stirrers rotating about a substantially vertical axis co-operating with deflectors or baffles fixed to the receptacle
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
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    • B01F27/00—Mixers with rotary stirring devices in fixed receptacles; Kneaders
    • B01F27/80—Mixers with rotary stirring devices in fixed receptacles; Kneaders with stirrers rotating about a substantially vertical axis
    • B01F27/90—Mixers with rotary stirring devices in fixed receptacles; Kneaders with stirrers rotating about a substantially vertical axis with paddles or arms 
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01F—MIXING, e.g. DISSOLVING, EMULSIFYING OR DISPERSING
    • B01F31/00—Mixers with shaking, oscillating, or vibrating mechanisms
    • B01F31/10—Mixers with shaking, oscillating, or vibrating mechanisms with a mixing receptacle rotating alternately in opposite directions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/06—Nozzles; Sprayers; Spargers; Diffusers

Definitions

  • the invention relates to a novel fumigation system which can be used in particular but not exclusively in biotechnology for the supply of oxygen to animal or plant cells and / or microorganisms.
  • the invention furthermore relates to a bioreceptor comprising the novel fumigation system and to a process for fumigating a liquid medium, preferably an aqueous suspension containing cells and / or microorganisms.
  • Animal cells which have no cell wall in contrast to microorganisms, are usually characterized by a high shear sensibility.
  • the oxygen input in the stainless steel reactors used in the pharmaceutical industry is usually ensured by a coarse bubble gassing.
  • Rhackorgane do not have the task of bubble dispersion due to the limited shear tolerance of the cells, but serve the distribution of the gas bubbles, as well as the mixing of the reactor and the suspension of the cells. As a result, the oxygen input and thus the cultivable cell density under these conditions is considerably limited.
  • membrane gassing systems see, for example, WO85 / 02195, DE102004029709B4 use in gassing stirrers or baskets which are covered with membrane tubes and oscillated in the fermentation solution or on membrane stacks (see, for example, US Pat. No. 6,708,957 B2), which are present in the fermentation solution be panned.
  • these membrane gasification systems are characterized by the fact that they can only be conditionally converted to an industrially relevant scale.
  • the bubble gassing can be combined with a dispersive stirring system (see, for example, WO2005 / 104706A2, WO2005 / 108546A2, WO2005 / 118771A2) or by a circulating flow (see, for example, US Pat WO2005 / 067498A2) are superimposed.
  • the maximum process volume of a blown unit is currently up to 1000 liters.
  • stirrers which can also be designed as one-way systems (see, for example, WO2005 / 104706 A2, WO2005 / 108546A2), process volumes of up to 10000 L are achieved.
  • foam problems may require the use and subsequent costly removal of antifoam agents in the downstream processing.
  • Cell stress during bubble formation, superficial bursting of gas bubbles and, in particular, foam destruction is problematical in cell culture systems, since the cells can be sustainably damaged by the high shear forces introduced in the process. This is even more so when the bubble gassing is done with a dispersing, i. a mixing system which comminutes the gas bubbles is combined.
  • the destroyed cells release proteins, the removal of which can lead to significant product losses during processing.
  • the oxygen input into the bioreactors presented and thus also the achievable cell density must be limited. The limited cell density ultimately reduces the space-time yield of the fermenters and the capacity of the overall plant.
  • US Pat. No. 5,057,429 describes a system in which an inner, cell-filled, semipermeable, flat bag is surrounded by another bag which is filled with nutrient solution and enriched with oxygen. Nutrient and oxygen transport are intensified by a tilting movement of the bags.
  • the maximum process volume of a unit is only a few liters.
  • the oxygen input is considerably limited by the low oxygen solubility in the master medium and the comparatively small surface area of the membrane.
  • In comparison to standard membrane gassing see eg WO2005 / 111192A1 with specific exchange surfaces in the order of magnitude of 30 m 2 / m 3 in 100 L reactors, with this arrangement only a maximum of 10% of this exchange surface can be realized. In both cases, the available exchange area is also proportional to the scale-up.
  • the object is to provide a gassing system for bioreactors, which can be scaled up to a large industrial scale of 1 m 3 - 10 m 3 .
  • the gassing system should be usable in particular in biotechnological, pharmaceutical applications, and have very good properties in terms of mixing, suspending, solubilizing, mass and heat transport or combinations thereof even in large reactor scales. It should preferably be easy to handle, meet the high cleaning and sterile requirements of the pharmaceutical industry.
  • the use of the fumigation system for the cultivation of cells and microorganisms is intended to limit the amounts of waste produced during production and to increase the process robustness and to increase the space-time yield.
  • this object can be achieved by a gassing system in which an oxygen vector within a vessel with culture medium is cyclically transported between the culture medium and a bubble column.
  • the oxygen vector is enriched with oxygen.
  • the oxygen vector is added via a distributor in the form of drops on the liquid surface of the culture medium.
  • the drops sink to the bottom and release at least a portion of the oxygen to the culture medium. They coalesce in a collecting device at the bottom of the vessel and from there are returned to the bubble column.
  • the mixing of oxygen vector drops and culture medium is preferably intensified by relative movement of the culture medium relative to the vessel.
  • the subject matter of the present invention is therefore at least a gassing system for supplying a liquid medium in a vessel with gas
  • a distributor at the upper end of the bubble column with at least one outlet opening characterized in that distributor and bubble column are designed as a hollow body and connected to each other, so that a vector can be introduced through the Ansaugöffhung in the aeration system and can leave the gassing system in the form of drops again through the manifold.
  • the present invention further provides a process for fumigation of a liquid medium in a vessel, characterized in that a vector is enriched in a cyclic process in a bubble column by an upward flow of a gas with at least one component of the gas, via a distributor in Form of drops is added to the liquid surface of the medium, in which medium sinks to the bottom, collected in a collecting device and sucked back into the bubble column.
  • the fumigation system according to the invention and the method according to the invention are preferably used for fumigation of culture media with oxygen in bioreactors.
  • the present invention furthermore relates to a bioreactor comprising at least one vessel for a culture medium, an oxygen vector collecting device and a gassing system according to the invention.
  • culture medium a suspension of cells (e.g., plant, animal or human) or microorganisms (e.g., bacteria, fungi or viruses) in a liquid medium, preferably in an aqueous medium. It is also conceivable that the cells or microorganisms are present as Immobilisate in the culture medium.
  • cells e.g., plant, animal or human
  • microorganisms e.g., bacteria, fungi or viruses
  • Vector is understood as meaning a liquid substance under the considered process conditions which is immiscible or only slightly miscible with the medium, which has a higher density than the medium under the considered process conditions and which has a higher solubility for a gas under the considered process conditions as the medium.
  • perfluorocarbons are particularly suitable because of their chemical stability and oxygen solubility which is almost 20 times greater than that of water. Immiscible with water, these substances sediment to the ground due to their increased water density in a cell culture solution.
  • Suitable and preferably used perfluorocarbons are, for example, perfluorodecalin, Hostinert or FC40. Their density is almost twice as high as that of an aqueous one Culture medium. They have over other organic phases, such as Sihkonölen, the decisive advantage that cells do not accumulate in the organic phase, where they would no longer be supplied with nutrient media and would be exposed in the bubble column of the gasification system according to the invention much too high shear loads.
  • the gassing system according to the invention serves to supply a medium with a gas.
  • a vector is used as a transport for the gas.
  • the gassing system according to the invention comprises a bubble column with at least one intake opening which projects into a collecting device.
  • the collection device is preferably attached to the bottom of the vessel for the medium.
  • the bubble column is designed as a hollow, preferably tubular body.
  • a vector is enriched with a gas.
  • a gas inlet can be introduced, can be given by the gas in the bubble column.
  • the gas inlet is preferably mounted slightly above the at least one suction opening of the bubble column.
  • the gas inlet can be introduced from the side into the bubble column.
  • the gas inlet can also be introduced from above or preferably through a Ansaugöffhung in the bubble column.
  • a nozzle is used, through which the gas can be pressed in the form of bubbles in the bubble column.
  • ImpulsTMvor ⁇ chtung are all fluidically useful designed devices that ensure an efficient mammoth pump drive. It. It is also possible to use commercially available gas ejectors.
  • the cross-section of the bubble column in the region of the gas inlet can also have fluidically advantageous cross-sectional constrictions, such as e.g. Ventu ⁇ -Prof ⁇ le have.
  • the gas inlet in the bubble column is centrally centered with respect to the cross section and arranged as an outlet opening or as an annular gap, and the outlet cross sections for the gas fed into the bubble column are preferably directed in the direction of the distributor.
  • the gas inlet may be connected to the bubble column; but it can also be embodied as a separate element which is arranged in a bioreactor according to the invention in such a way that it projects into the BIAS column, e.g. via an intake opening.
  • a distributor is attached at the upper end of the bubble column.
  • the distributor is used for the separation of gas and liquid phase, the generation of droplets and / or the distribution of the droplets on the liquid surface of a medium to be fumigated.
  • the distributor comprises 1 to 20 distributor arms.
  • the distributor comprises 2 to 10 distributor arms.
  • the distributor arms are hollow, preferably tubular, bodies which are connected to the bubble column in such a way that a vector can flow / be injected through the bubble column into the distributor arms.
  • the distributor arms are arranged radially around the bubble column.
  • Adjacent spreader arms preferably enclose an angle of about (360 ° / n) in a centric arrangement of the bubble column within the bioreactor when n is the number of spreader arms present, i. the distributor arms are preferably distributed uniformly around the bubble column. For uniform distribution of the distributor arms in an eccentric arrangement in a corner of the rectangular reactor angle should be reduced to 90 ° / n.
  • the individual distributor arms enclose an angle of between 110 ° and 70 °, preferably between 100 ° and 80 ° (angle of attack).
  • the diameter of the distributor arms is preferably made smaller than the diameter of the bubble tubes.
  • the sum of the flow cross sections of all distributor arms preferably corresponds approximately to the flow cross section of the bubble column or is greater than the flow cross section of the bubble column in order to reduce pressure losses.
  • Each distributor arm has at least one outlet opening, through which a vector in droplet form can leave the distributor.
  • the outlet opening may be attached to the outer end of a distributor arm.
  • a tubular distributor arm is designed to be open at the end. It is also conceivable to attach one or more outlet openings at the end or along the distributor arm.
  • One or more exit ports are preferably attached to the side or bottom of a spreader arm.
  • the outlet openings have a diameter in the range of 1 to 100 mm, preferably in the range of 3 to 15 mm.
  • distributor ring-shaped or spiral-shaped In addition to the above-described star-shaped or radial arrangement of distributor arms, it is also conceivable to make the distributor ring-shaped or spiral-shaped. In such an embodiment, outlet openings are preferably arranged distributed uniformly over the ring or the spiral.
  • Other forms of the distributor are conceivable.
  • the distributor is preferably adapted to the shape of the vessel for the medium.
  • the distributor is also preferably attached to his Position adjusted with respect to the vessel.
  • the distributor is preferably designed so that it distributes the vector in the form of droplets as evenly as possible on the surface of the medium.
  • Distributor and bubble column can be made in one piece; but they can also be made of different pieces and connected to each other via a reversible or irreversible connection fertil.
  • bubble column and manifold are made of different pieces.
  • the bubble column and distributor are preferably connected to one another via a reversible connection.
  • the manifold and the bubble column are interlocked for connection.
  • Distributor and bubble column may e.g. be made of metal, plastic or glass.
  • Distributor and bubble column are preferably designed as disposable articles made of plastic, in order to ensure maximum remission and ste ⁇ ltechnischer process reliability.
  • Suitable plastics are e.g. PVC, polyolefins, polyesters, polyethylene, polypropylene, peek, etc. , as well as their combinations.
  • the inventive method for gassing a medium in a vessel with a gas is characterized in that a vector is transported in a cyclic Prozcss between the medium and a bubble column.
  • the enrichment of the vector with at least one component of the gas takes place.
  • the gas in the form of bubbles is pressed into the bubble column.
  • the dispersion of vector and gas bubbles rises in the bubble column due to a reduced density and reaches a distributor.
  • the vector and the gas largely separate.
  • the gas leaves the distributor and enters the headspace of the vessel, where it can be sucked off.
  • the vector enriched with gas (or a component of the gas) is applied via the distributor in the form of drops on the liquid surface of the medium.
  • the vector drops sink down in the medium and at least partially release the at least one component of the gas to the medium.
  • the drops coalesce in a collection device, from where they return to the bubble column.
  • the mass transfer between the vector drops and the medium is assisted by relative movement of the medium relative to the vessel.
  • the gassing system according to the invention and the method according to the invention make it possible to supply a medium with gas in a very simple, easily scalable and extremely gentle manner, and are therefore particularly suitable for supplying biological cultures - preferably human, animal or plant cells - with oxygen.
  • the present invention therefore also relates to the use of the fumigation system according to the invention and of the method according to the invention in a bioreactor for fumigation of the culture medium with oxygen.
  • bioreactor is understood a system that serves the growing and / or rearing and / or storage of living cells and / or microorganisms.
  • the gassing system according to the invention and the method according to the invention also serve to remove gaseous metabolic products, such as e.g. Carbon dioxide.
  • gaseous metabolic products such as e.g. Carbon dioxide.
  • an oxygen vector is used as a transport for oxygen and / or gaseous metabolites.
  • the process of the invention for supplying cells or microorganisms in a bioreactor according to the invention with oxygen is characterized in that an oxygen vector in a bubble column, in which an oxygen-containing gas is introduced, is enriched with oxygen, rises in the bubble column, is applied at the upper end of the bubble column via a distributor in the form of drops on the liquid surface of the culture medium, sinks in the liquid to the bottom of the vessel, collects in a collecting device and is sucked from there back into the bubble column.
  • a reservoir of the oxygen vector is present in a collecting device in the bottom region of the biorefractor.
  • the organic phase is introduced into a bubble column via at least one suction opening which extends into the scupper device and is sufficiently overlaid by the single-phase oxygen vector.
  • an oxygen-enriched gas is preferably pressed into the bubble column via an upwardly directed nozzle piece.
  • comparatively high gas blanket velocities 0.01-10 m / s, preferably 0.1-3 m / s, are required in the bubble column for transport, which can vary with small bubble column diameters.
  • the high gassing intensities in the bubble column do not have an adverse effect on the shear-sensitive biological culture.
  • the gas-oxygen vector dispersion is passed through the distributor arms to the outer walls of the vessel.
  • the cross-sections of all internals including the distributor arms can be chosen so large that a blockage of the lines can be excluded.
  • the oxygen vector is applied to the liquid surface of the culture medium as a droplet dispersion with a comparatively low droplet size in the lower mm range. Too small droplet sizes are avoided by the dimensioning of the outlet cross sections.
  • surfactants such as e.g. Pluronic, which also prevent attachment of the organic cells to the organic phase.
  • This gas and liquid vapor conjugate has the great advantages of an additionally increased gas exchange capacity and a reduced rate of sinking of the liquid droplets. In addition, this results in an enlarged exchange surface for the mass transfer between the organic phase and the culture medium.
  • a moving unit which produces relative movement of the culture medium relative to the vessel.
  • a flow is transferred to the culture medium which prevents premature coalescence of the oxygen vector droplets both on the liquid surface and within the vessel and, moreover, reduces the liquid-side mass transfer resistance on the outside of the drop.
  • the organic phase is gently distributed over the reactor cross-section despite the punctual addition points of the distributor, thus fulfilling an essential prerequisite for effective scale transmission.
  • the droplet dispersion of the oxygen vector sediments in the culture medium. Arrived at the container bottom, the drops are collected in a collecting device, which is preferably configured as one or more conical, pyramidal or on one or more reactor corners aligned bottom depressions, and coalesced into a continuous phase.
  • the amount of oxygen vector to be stored is very small in the gassing system according to the invention, comprising at least a bubble column and a distributor due to the small dimensions of the elements. Therefore, even a small addition amount of oxygen vector in the low single-digit vol% range of 0.3% by volume to 10% by volume, preferably 0.5% to 2% by volume, based on the volume of the culture medium, is sufficient for sufficient oxygen supply in many cases.
  • a bioreactor according to the invention comprises a vessel for receiving cells or microorganisms, which are usually present in an aqueous suspension.
  • the bioreactor according to the invention also comprises the fumigation system according to the invention, which serves to supply the cells or microorganisms with oxygen and to remove gaseous metabolic products from the culture medium.
  • the bioreactor according to the invention further comprises at least one collecting device, which projects at least partially into a bubble column of the gassing system.
  • the collection device is preferably located at the bottom of the bioreactor vessel.
  • a depression is introduced at the bottom of the bioreactor.
  • the depression is preferably made narrowing downwards.
  • the depression is, for example, conical, tetrahedral, pyramidal or inclined planes in one or more reactor corners. Other forms are conceivable.
  • the recess may be mounted centrally or on one side of the vessel bottom. In the depression at least partially protrudes the bubble column.
  • the bubble column may be attached to the bottom of the bioreactor via a bottom holder, to side holders on one or more sides of the bioreactor, or to a head holder at the top of the bottom reactor. It is also conceivable to couple the bubble column outside the reactor via sockets to the bottom recesses. In one embodiment, as a disposable reactor may result in an external coupling of the bubble column advantages in packaging. For a space-saving packaging, it would be advantageous to construct the bubble column unit itself also from flexible materials or from a combination of rigid and flexible elements which are deployed to a vertical column for putting the bioreactor into operation. Also could be a sterile, off Stiff elements constructed bubble column Ste ⁇ lanschl ⁇ sse be coupled to the bioreactor only immediately before startup.
  • the bubble column rotatably mounted within a hollow shaft.
  • the shaft is preferably connected via a sterile shaft coupling, preferably a magnetic coupling or mechanical seal with the external drive.
  • One or more gas inlets in the bubble column are e.g. supplied with an oxygen-containing gas via a feed port at the head of the bioreactor and / or a hose between supply port and gas inlet. It is also conceivable to introduce the gas inlet via a nozzle at the bottom of the reactor in the bubble column.
  • the bubble column is preferably arranged at low points centrally in the bioreactor and / or on its sides inside or outside the reactor corners.
  • the distributor is preferably mounted in the headspace of the bioreactor above the liquid surface of the culture medium.
  • the distance between the outlet openings of the distributor and the liquid surface is preferably in the range between 0.01 ⁇ D to 0.3 ⁇ D or preferably between 10 mm and 500 mm, preferably between 20 mm and 100 mm.
  • the indication of the height difference relates to the completely filled reactor. In the case of static installation of the gas distributor, this distance to the start of fermentation, e.g. after inoculation at low filling levels, be a multiple of the optimum distance, so that an effective promotion of the oxygen vector is no longer guaranteed.
  • the surface gassing of the oscillating moving reactor is completely adequately dimensioned with a cell concentration which is limited by a suitable feeding strategy.
  • the connection of the oxygen vector gassing is recommended in this case from reaching a minimum number of cells, which is only sought after the reactor is filled to the optimum level.
  • the distributor vertically variable in the reactor.
  • the position of the distributor can be accomplished, for example, mechanically by a level-controlled regulation or by a floating mounting on the liquid surface.
  • a pump installed between the bubble column and manifold can ensure operation of the reactor at low levels.
  • the distributor is preferably adapted to the geometry of the bioreactor. When using radially arranged, tubular distributor arms with open ends, they cover between 30 ° and 90 ° of half the reactor cross-section.
  • the bioreactor according to the invention is designed in particular as a disposable reactor, which can be thrown away after use.
  • the reactor vessel may be made of a stable, preferably multilayer or plastic, which is applied to stabilizing network structures and supports the intended basic procedural operation.
  • the reactor vessel is connected to a housing which is at least partially adapted to the shell shape of the reactor.
  • the reactor is preferably made of single or multi-layered film materials. These are designed in such a way that the delivery of film ingredients (extractables or leachables) is minimized.
  • In the area of the reactor walls which may be partially or permanently in contact with the oxygen vector, it may be necessary to make these walls from special materials or to laminate or coat them with special impermeable layers.
  • the bioreactor according to the invention is combined with a movement unit.
  • the moving unit serves to generate a relative movement of the culture medium with respect to the reactor vessel. This relative movement promotes mixing of the oxygen vector drops and the culture medium. It improves the mass transfer between the. Oxygen vector drops and the culture medium.
  • the movement unit is a drive unit to which the reactor vessel is coupled.
  • the bioreactor can be set by the drive unit about a stationary, preferably vertical axis of the reactor in an oscillating, rotational movement.
  • the oscillating, rotational movement has a reversal of motion. Due to inertia, the culture medium lags behind the movement of the bioreactor, resulting in relative movement of the culture medium relative to the vessel, causing good mixing of the culture medium and good distribution of the oxygen vector drops within the culture medium.
  • the bioreactor in a preferred embodiment, at least partially an angular, preferably two- to octagonal, more preferably three- to quadrangular cross-section perpendicular to the axis of rotation.
  • the cross-sectional shape can also change over the height of the reactor in the axial direction (along the axis of rotation).
  • the reactor may be cylindrical or square in the upper region and rectangular, square, pyramidal, tetrahedral, etc. in a lower region.
  • the bioreactor is positively coupled to the drive unit such that the acceleration and deceleration of the rotational motion occurs at a substantially constant angular acceleration or deceleration.
  • the rotational speed of the reactor changes linearly with time in each phase of the rotational oscillation.
  • Intermediate control modules are not required in this simple reactor movement, so that, for example, according to a preferred embodiment for the realization of oszillato ⁇ schen movement a pendulum can be used.
  • the release of electromagnetic radiation which may cause interference from sensors, for example, be drastically reduced.
  • constant peak values of the hydrodynamic shear forces on suspended particles are kept relatively lower than in other forms of movement of the reactor by the constant wetting of the balls in each phase of a rotationally oscillating movement.
  • the bioreactor according to the invention has a gasification unit at the bottom of the vessel, which serves as a movement unit.
  • This gassing unit comprises at least one gassing tube, which is preferably mounted in the lower region of the vessel.
  • the gassing tube comprises a gas inlet, via which the gassing tube can be supplied with gas.
  • the gassing tube further comprises openings through which gas from the gasification tube can be pressed into the medium. Depending on requirements, the openings are designed so that a fem- or coarse-bubble fumigation is possible.
  • fine gas bubbles gas bubbles are understood which have a low tendency to coalescence in the culture medium used.
  • special sintered bodies made of metallic or ceramic materials, filter plates or laser-perforated plates which have pores or holes with a diameter of generally smaller than 15 ⁇ m are suitable for fumaceous fumigation.
  • very fine gas bubbles are produced, which have a low tendency to coalesce in the media normally used in cell culture. Larger bubbles are produced by correspondingly larger holes.
  • the fumigation creates a circulation vortex that moves the culture medium relative to the vessel and produces a good mixing.
  • the relative movement of the culture medium with respect to the vessel is generated by means of a stirring device within the vessel as a movement unit.
  • Stirring device and bubble column are preferably combined with one another here:
  • a shaft is introduced into the bioreactor through a sterile coupling on the head of the bioreactor.
  • the bubble column, distributor and agitator blades are attached to the shaft.
  • the gas inlet within the bubble column is preferably introduced via the bottom of the bioreactor.
  • the shaft is driven by a motor that causes the distributor, bubble column and stirring blades to move.
  • the movement can be continuous or discontinuous. It can be oscillating. Additional internals within the bioreactor can be used as baffles that promote mixing.
  • the bioreactor allows working with culture media in the filled state at a ratio of liquid height to average diameter of 0.2-3.0, preferably 0.6-1.8 and particularly preferably 0.8-1.2.
  • the bioreactor in the rearing phase are also operated with partial fillings.
  • the headspace above the liquid in the filled state is about 10 - 30% of the liquid height. Due to the low filling levels compared to commercially available bioreactors, overturning moments caused by imbalances, for example, can be reduced, and an operating possibility from above can be ensured despite an installation area requirement which can also be realized without difficulty on a large scale. Compared to those introduced in biotechnology With a broad reactor design, slender reactors have the opportunity to dispense with expensive high-rise buildings for the placement of the reactors in favor of installation in less expensive indoor facilities.
  • the bioreactor according to the invention can be designed as a heat-settable reactor, preferably made of stainless steel or glass, or preferably as a disposable reactor made of plastic.
  • the bioreactor according to the invention has at least one sensor which is preferably intended for single use, with the aid of which in particular a pH value and / or an oxygen concentration and / or the temperature of the reactor contents can be detected.
  • a preferred embodiment of a bioreactor according to the invention is shown.
  • the bioreactor comprises a vessel (100), in the center of which a fumigation unit according to the invention is installed.
  • a bubble column (40) is arranged, which is equipped with a gas nozzle (50) for gas distribution.
  • the downwardly hm open bubble column (40) protrudes into the pyramidal bottom (20) of the rectangular reactor. It falls below it by an excess cover height (3) the level of the oxygen vector in the reservoir (2).
  • the oxygen vector deposits there as a result of its increased compared to the fermentation medium density, the drops (1) merge or coalesce into a continuous phase.
  • the ground angle (21) should be sufficiently large to ensure a rapid accumulation of the drops (1) of the oxygen vector and its safe removal from the reservoir (2) with sufficient liquid coating (3) of the suction port of the bubble column (40) without a short-circuit current to the fermentation medium.
  • the avoidance of short circuit current introduced into the bubble column is particularly important to prevent destruction of the cells in the very high shear rate bubble column (40).
  • the organic phase or the oxygen vector are passed through the nozzle (50), which via a hose (103) via feed nozzle (101) is gassed with the oxygen-enriched gas (91) to enrich it with oxygen and strip the carbon dioxide taken up from the fermentation solution.
  • the fumigation is so intense that the average density of gas and oxygen vector can be surprisingly lowered to well below the average density of the fermentation solution so that the oxygen vector can even be raised to a distance (11) above the liquid level of the fermenter.
  • the gas empty tube velocities for conveying the oxygen vector are in the range of 0.01 to 10 m / s, preferably 0.1 to 3 m / s.
  • Ansch manend the oxygen vector is applied via the distributor arms (10) as a drop suspension on the liquid surface.
  • drops (1) as they enter the fermentation solution, include a gas bubble in the presence of suitable surfactants (e.g., Pluronic).
  • suitable surfactants e.g., Pluronic.
  • the reversible conjugate of gas bubble and oxygen vector has the advantage of a reduced density difference to the culture medium with the consequence of a better homogenization and an increased gas content and an increased exchange area.
  • Favorable angles of attack (12) are between 90 ° and 70 °.
  • Favorable addition positions of the distribution tubes are between 0.45 to 0.95 times the reactor width D.
  • Fig. Ib is shown how the bioreactor described in Fig. Ia can be designed as a disposable reactor in a plastic bag.
  • the bubble column (40) can be held from the outside via a connecting element (461) with a holder (460) extending through the plastic bag (100) and centered on the vertical axis.
  • the bottom shape results from the support of the easily deformable plastic container on a correspondingly shaped bottom element (26) which is fixed on the rotationally oscillating moving plate (25).
  • FIG. 2 shows how a gassing system according to the invention in a bioreactor can be combined with a bubble-gassing-induced fluid movement.
  • the holder of the bubble column (40) can take place via a nozzle tube (50) which is mounted in the bottom holder (55) and supplied with gas through it.
  • the oxygen-enriched oxygen vector is introduced via a distributor tube (10) via the outlet openings (15) at a distance (11) above the liquid level (5) into the fermenter chamber.
  • the mixing of the oxygen vector which is applied as a droplet dispersion on the liquid surface (5), is carried out by a large-scale fluid vortex (161).
  • Fluid swirl (161) is driven by the linear bubble gassing via the aerator (201).
  • the line aerator (201) is favorably chosen such that the height and the width of the fluid vortex (161) are as equal as possible.
  • the gassing pipes can be anchored to the bubble column relatively easily from the outside by means of the fastening elements (210).
  • the shape of the bottom (20) is favorably determined by selecting suitable angles of incidence (21) so that the accumulation and transport of the oxygen vector to the bubble column (40) is facilitated and this with sufficient coverage (3) while avoiding a short circuit current to the fermentation solution in the Bubble column (40) can be registered.
  • FIG. 3 shows how the aeration system according to the invention can be combined in a bioreactor with an agitator.
  • the stirrer shaft (420) which is connected to the motor (350) via a radial coupling (450), the bubble column (40) for the oxygen vector can be fixed in the axial symmetry.
  • the bubble column (40) projecting on the suction side to the reservoir (2) for the oxygen stoffveki ⁇ i hhurn and is covered there to ⁇ ranging from the oxygen vector phase.
  • the oxygen vector is accumulated in the conical bottom (20) with the angle of attack (21) of the reactor and coalesced.
  • the fumigation nozzle (50) which is preferably connected to the nozzle (101), can be introduced into the slow-rotating bubble column (40) without contact, for example, from below via the cone or pyramid tip or from the center of a dished or round bottom.
  • one or more vertical stirring blades or blades (400) attached to the vertical axis are fastened at one or more altitudes, which ensures a gentle distribution of the oxygen-enriched droplet dispersion of the oxygen vector in the fermentation medium added above the liquid surface (5).
  • the reactor (100) can be equipped with baffles (470) to prevent rotational flow.
  • baffles (470) instead of the distributor arms (10), cone-shaped or cylindrical distributor assemblies or distributor plates are also suitable for discharging the oxygen vector.
  • FIGS. 4a to 4g show a reactor with external gassing and external transport of the oxygen vector. This results in the advantage of a reduced design effort and packaging volume requirement, which in particular the use of the reaction vessel (100) as One-way reactor significantly simplified.
  • the oxygen vector is transported to the bubble column (40) in the region of the lowest container position of the bottom via an external connection (42) installed in the reactor vessel (100).
  • the gas supply (91) via the nozzle (50).
  • the bubble column (40) can be connected directly to the external transfer line (45) leading to the distributor arms (10).
  • the oxygen vector can then be distributed by means of the distributor nozzles (15) on the surface (5).
  • the decrease of the oxygen vector takes place at a corner of the reaction vessel (100) with constant soil pitch angles (23).
  • the decrease takes place on a container axis with different ground angles (22) and (23).
  • fumigation and transport of the oxygen vector are decoupled. In this way, the required gas quantities can be reduced to the need for oxygen enrichment, while the flow rate through the hermetic pump (48) can be adjusted independently of the gas volume flow.
  • hermetically acting pumps (48) are, for example, peristaltic pumps, which can be connected to the process ⁇ ll ⁇ endangering the sterility by inserting the sterilized pump tubing for fermentation.
  • the pump hoses are part of the external transfer line (45), which is connected to the gas separator (47).

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Abstract

Gegenstand der Erfindung ist ein neuartiges Begasungssystem, das insbesondere aber nicht ausschließlich in der Biotechnologie zur Versorgung von Zellen oder Mikroorganismen mit Sauerstoff einsetzbar ist. Das Begasungssystem umfasst eine Blasensäule und einen Verteiler. In dem Gefäß befindet sich ferner ein flüssiges Medium, das mit Gas versorgt werden soll. Es wird ein Vektor als Transportmittel für das Gas eingesetzt. Das Gas wird in die Blasensäule eingetragen und hier von dem Vektor aufgenommen. Der Vektor wird in Tropfenform über den Verteiler auf die Flüssigkeitsoberfläche aufgetragen, sinkt in dem Medium nach unten und gibt einen Teil des aufgenommenen Gases an das Medium ab. Am Boden des Gefäßes befindet sich eine Sammelvorrichtung, in der die Vektortropfen koaleszieren und wieder in die Blasensäule gelangen. Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Bioreaktor umfassend das neuartige Begasungssystem. Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Begasung eines flüssigen Mediums, vorzugsweise einer Zellen oder Mikroorganismen enthaltenden wässrigen Suspension.

Description

Begasungssystem
Gegenstand der Erfindung ist ein neuartiges Begasungssystem, das insbesondere aber nicht ausschließlich in der Biotechnologie zur Versorgung von tierischen oder pflanzlichen Zellen und/oder Mikroorganismen mit Sauerstoff einsetzbar ist. Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Biore- aktor umfassend das neuartige Begasungssystem sowie ein Verfahren zur Begasung eines flüssigen Mediums, vorzugsweise einer Zellen und/oder Mikroorganismen enthaltenden wässπgen Suspension.
Zur Herstellung von hoch glykosyherten, therapeutischen Proteinen, monoklonalen Antikörpern und Vaccinen hat sich die tierische und pflanzliche Zellkultur in der pharmazeutischen Industrie durchgesetzt. Tierische Zellen, die im Gegensatz zu Mikroorganismen keine Zellwand besitzen, zeichnen sich in der Regel durch eine hohe Scherempfindhchkeit aus. Der Sauerstoffeintrag m den in der Pharmaindustrie verwendeten Edelstahlreaktoren wird üblicherweise durch eine grobblasige Begasung sichergestellt. Rührorgane besitzen wegen der eingeschränkten Schertoleranz der Zellen nicht die Aufgabe der Blasendispergierung, sondern dienen der Verteilung der Gasblasen, sowie der Durchmischung des Reaktors und der Suspendierung der Zellen. Hierdurch ist der Sauerstoffeintrag und damit die unter diesen Bedingungen kultivierbare Zelldichte erheblich begrenzt.
Zur schonenden Sauerstoffversorgung von Zellkulturen wird u.a. die Membranbegasung eingesetzt. Als Membranen werden gasdurchlässige Sihkonschläuche auf einen zylindrischen Membranstator gewickelt, die von einem radialfördernden Ankerrührer angeströmt werden (siehe z.B. WO2005/111192 Al). Eine Vergrößerung der Austauschfläche und damit eine deutliche Erhöhung des Stofftransportes kann durch eine Parallehsierung der Membranstatoren erreicht werden.
Andere Membranbegasungssysteme (siehe z.B. WO85/02195, DE102004029709B4) setzen bei der Begasung auf Rührer oder Körbe, welche mit Membranschläuchen bezogen sind und in der Fer- mentationslösung pendelnd bewegt werden, oder auf Membranstapel (siehe z.B. US 6,708,957 B2), welche in der Fermentationslösung geschwenkt werden. Diese Membranbegasungssysteme zeichnen sich aber dadurch aus, dass sie nur bedingt in einen industriell relevanten Maßstab überführt werden können.
Um der Forderung an ein schnelles und flexibles Neubeschicken der Produktionsanlage unter Wah- rung maximaler Sauberkeit und Sterilität gerecht zu werden, erfreuen sich auf dem Markt Konzepte für Einweg-Reaktoren eines ständig wachsenden Interesses. Es gibt eine Vielzahl von Patentanmeldungen und Patenten für die Anwendung der Einwegtechnologie im Bereich der Feimen- tationstechnik. Dabei wird bei den meisten Systemen die Durchmischung und Sauerstoffversorgung über eine Blasenbegasung erreicht, ohne dass weitere Mischsysteme vorgesehen sind (siehe z.B. US 5,565,015 , WO 98/13469A1, US 6,432,698 Bl, WO2005/049785A1 , EP1602715A2 , WO2005/080544A2). Ist ein höherer Sauerstoffbedarf bei der Kultur notwendig, welcher nicht alleme über eine Blasenbegasung realisiert werden kann, kann die Blasenbegasung mit einem dispergierenden Rührsystem kombiniert werden (siehe z.B. WO2005/104706A2, WO2005/108546A2, WO2005/118771A2) oder durch eine Umpumpströmung (siehe z.B. WO2005/067498A2) überlagert werden. Das maximale Prozessvolumen einer blasenbegasten Einheit hegt derzeit bei bis zu 1000 Liter. Bei Systemen mit herkömmlichen Rührern, welche aber auch als Einwegsysteme ausgeführt werden können (siehe z.B. WO2005/104706 A2, WO2005/108546A2), werden Prozessvolumina von bis zu 10000 L erreicht.
Bei der Blasenbegasung können Schaumprobleme den Einsatz und die anschließende aufwändige Entfernung von Antischaummitteln in der Aufreinigung (Downstream Processing) erforderlich machen. Die Zellbeanspruchung beim Blasenaufstieg, beim oberflächlichen Zerplatzen der Gas- blasen und insbesondere bei der Schaumzerstörung ist bei Zellkultursystemen problematisch, da die Zellen durch die dabei eingetragenen hohen Scherkräfte nachhaltig geschädigt werden können. Dies gilt um so mehr, wenn die Blasenbegasung mit einem dispergierenden, d.h. einem die Gasblasen zerkleinernden Rührsystem kombiniert wird. Von den zerstörten Zellen werden Proteine freigesetzt, deren Entfernung bei der Aufarbeitung zu erheblichen Produktverlusten führen kann. Zur Aufrechterhaltung akzeptabler Zellvitahtäten muss der Sauerstoffeintrag in die vorgestellten Bioreaktoren und somit auch die erreichbare Zelldichte begrenzt werden. Die begrenzte Zelldichte reduziert letztendhch die Raum-Zeitausbeute der Fermenter und die Kapazität der Gesamtanlage. Da die Voraussetzung für eine sichere Maßstabsvergrößerung in den meisten Fällen technisch als nicht erfüllt anzusehen ist, muss bei vielen blasenbegasten Einwegreaktoren die Volumenvergröße- rung durch eine aufwändige Parallehsierung der Systeme erreicht werden. Werden die Fermenter wie vorgeschlagen mit Standardrührsystemen betrieben, so steigt zwar das prozessierbare Volumen in den Bereich der fest installierten Anlagen, das Kontaminationsπsiko kann dann aber nur mit vergleichbarem technischen Aufwand, z.B. durch Einsatz von bedämpften Gleitringdichtun- gen, beherrscht werden. Der große technische und personelle Aufwand derartiger Installationen hebt jedoch die Vorteile des Einwegkonzeptes zum großen Teil wieder auf.
Andere Einwegsysteme stellen die notwendige Begasungsrate der Kultur mittels Membran- oder Oberflächenbegasung zur Verfügung. Hierbei wird die notwendige Austauschfläche für den Gastransport entweder über eine für die zu übertragenden Gase durchlässige Membran oder durch eine freie Grenzfläche zu einem Gasraum bereitgestellt. Da keine direkte Begasung der Zellkulturmedien erfolgt, ist die Partikelbeanspruchung in diesen Reaktoren als geringer einzustufen.
In der Patentschrift US 5,057,429 wird ein System beschrieben, in welchem ein innen liegender, mit Zellsuspension gefüllter, semipermeabler, flacher Beutel von einem weiteren Beutel umgeben ist, welcher mit Nährlösung gefüllt und mit Sauerstoff angereichert ist. Nährstoff- und Sauerstofftransport werden über eine Kippbewegung der Beutel intensiviert. Das maximale Prozessvolumen einer Einheit liegt lediglich bei wenigen Litern. Der Sauerstoffeintrag wird durch die geringe Sau- erstofflöslichkeit im Vorlagemedium und die vergleichsweise kleine Oberfläche der Membran erheblich eingeschränkt. Im Vergleich zu Standardmembranbegasern (siehe z.B. WO2005/111192A1) mit spezifischen Austauschflächen in der Größenordnung von 30 m2/m3 in 100L Reaktoren, sind bei dieser Anordnung nur maximal 10% dieser Austauschfläche realisierbar. In beiden Fällen geht die verfügbare Austauschfläche darüber hinaus proportional mit der Maßstabsvergrößerung zurück.
Andere Oberflächenbegasungssysteme arbeiten ebenfalls mit einem flachen Beutel, der auf einer Schüttelapparatur eingespannt ist. Der Beutel ist lediglich teilweise gefüllt, so dass eine freie O- berfläche mit einem darüber liegenden Gasraum entsteht. Durch eine Wippbewegung oder exzentrische Rotationsbewegung wird das Kulturmedium durchmischt, die zugeführten Nährstoffe verteilt, die Zellsedimentation unterbunden und die Oberfläche bewegt (siehe z.B. US6, 190,913Bl, WO00/66706A1, US6,544,788B2). Bei dieser Technologie wird die Kultur über die freie Oberflä- che mit Sauerstoff versorgt. Die Bewegung ist stets so angepasst, dass die Strömung schonend ist und die Zellen keiner zu starken Scherung ausgesetzt sind. Das maximale Prozessvolumen einer Einheit liegt derzeit bei 580 Liter. Diese Technologie stellt zwar einen schonenden Begasungsmechanismus bereit, ist jedoch begrenzt bei der Übertragung in den industriellen Maßstab. Die Höhe des Beutels muss näherungsweise konstant gehalten werden, so dass eine Volumenvergrößerung bei kon- stantem Oberfläche-zu-Volumen-Verhältnis lediglich in den beiden horizontalen Raumrichtungen erfolgen kann. Die Maßstabsvergrößerung kann daher nur über eine technisch aufwändige Paralleli- sierung erreicht werden.
In der Veröffentlichung DEl 02006018824A1 werden vielversprechende, zur Oberflächen- und Membranbegasung geeignete Einwegreaktoren beschrieben, die rotatorisch um eine zentrale Achse oszillieren und von außen angetrieben werden. Der Stofftransport erfolgt durch die Krafteinwirkung rechteckiger Außenwände bzw. der im Reaktor aufgehängten Membranen auf das träge Fluid. Der Stofftransport wird durch eine Bewegung der Flüssigkeitsoberfläche und/oder die Relativbewegung zwischen Fluid und Membran intensiviert. Während sich der zur Oberflächenbegasung geeignete Rechteckreaktor wegen der mit dem Scale-up rückläufigen spezifischen Austauschfläche nur bis zu mittleren Volumina scherarm betreiben lässt, erlaubt der membranbegaste Reaktor eine Maßstabsvergrößerung bei konstanter Scherbeanspruchung bis in technisch relevante Produktionsmaßstäbe von mehreren Kubikmetern hinein. Das hat den Vorteil, dass bei der Produktentwicklung die prozessrelevanten Einflussgrößen weitgehend konstant gehalten werden können und beim Technologietransfer von der Klinikmusterfertigung in die Produktion keine Überbrückungsstudien erforderlich werden. Allerdings muss bei der Projektierung der zum Aufbau des Membranreaktors erforderliche erhebliche Konstruktions- und Kostenaufwand sowie ein im Vergleich zur oberflächenbegasten Variante wesentlich komplizierterer Installationsaufwand durch das Bedienungspersonal in Kauf genommen werden.
In der Literatur wird als schonendes Verfahren für den Stofftransport in Zellkulturen der Einsatz von Sauerstoffvektoren empfohlen. Besonders geeignet sind wegen ihrer chemischen Stabilität und einer gegenüber Wasser ca. 20-fach größeren Sauerstofflöslichkeit die olefinischen Perfluorcarbone (PFC). Nicht mischbar mit Wasser sedimentieren diese Chemikalien aufgrund ihrer gegenüber Wasser erhöhten Dichte in der Zellkulturlösung zu Boden. Bei Menge et al. (Appl. Microb. Biotech. (2001) 55, 41 lff.) wird der Einsatz einer durch Rühren zu erzeugenden Gas-Flüssig-Flüssig-Dispersion bei Fun- gi-Fermentationen in einem mit Gasblascn begaεten Fjührfermenter beschrieben. Es werden vergleichsweise hohe Einsatzkonzentrationen für PFC von mehr als 10% vorgeschlagen. Der hohe Massenanteil macht allerdings einen Einsatz der teuren Sauerstoffvektoren für eine Einwegtechnologie unwirtschaftlich. Daher wird von den Autoren die Wiederverwendung der Chemikalie vorgeschlagen, was allerdings den GMP-Produktionsprinzipien (GMP = Good Manufacturing Practice) eines einzuschränkenden Kreuzkontaminationsrisikos zuwiderläuft. Eine Dispersion der organischen Phase durch das Rührorgan ist zudem aus Gründen einer zu hohen Scherbelastung der Zellkultur nicht möglich. Die überwiegende Anzahl der Literaturstellen schlagen ein aus zwei separaten Reaktoren, dem Fermenter und einem Begasungsreaktor für den Sauerstoffvektor bestehendes Reaktorsystem vor, das mittels eines Umpumpkreislaufes zu einem Loop-Reaktorsystem verschaltetet wird. Bei Takeshi et al. (Biochem. Engng. J., 8 (2001) 165 ff.) wird das mit Sauerstoff angereicherte PFC als Fallfüm schonend in die Zellkultur eingeleitet. Neben dem Stofftransport wird auch eine Umwälzung des Reaktorinhalts über eine innere Schlaufe erreicht. Die Maßstabsvergrößerung des Konzeptes in den technischen Produktionsmaßstab ist wegen der rückläufigen spezifischen Austauschfläche allerdings nicht möglich. Zur proportionalen Maßstabsvergrößerung ist eine Verteilung des Sauerstoffvektors im Reaktorvolumen erforderlich, wie dies z.B. bei Reschke (Chem. Ing. Tech. 66 (1994) 3, 369ff.) mittels eines Verteilerbodens gelöst wird, mit dem der Sauerstoffvektor über den Fermenterquerschnitt verteilt werden kann und als Tropfendispersion durch den Fermenter hindurchregnet. Probleme könnten sich im Langzeiteinsatz infolge der Verstopfung der Verteilerböden ergeben. Pumpen sowie die zusätzlich erforderliche externe Aufsättigungsstation vergrößern zudem die Komplexität und reduzie- ren gleichzeitig die Robustheit der Anlage. Da eine derartige Anlage nicht für die Einwegtechnologie geeignet ist, ist ein hoher Reinigungs- und Vahdierungsaufwand erforderlich.
Bei der Anwendung der oben aufgeführten Begasungssysteme und Bioreaktoren müssen somit trotz zum Teil vielversprechender innovativer Ansätze Einbußen bei der Leistungsfähigkeit, Maß- stabsübertragbarkeit, Langzeitstabilität, Robustheit und/oder Bedienbarkeit in Kauf genommen werden. Ein ökonomischer Nutzen kann abgesehen von der mangelnden Leistungsfähigkeit ohne eine ausreichende Skaherbarkeit in vielen Fällen nicht gewährleistet werden.
Es stellt sich damit ausgehend vom Stand der Technik die Aufgabe, ein Begasungssystem für Bioreaktoren, die bis in den industriellen Großmaßstab von 1 m3 - 10 m3 skaliert werden können, be- reitzustellen. Das Begasungssystems soll insbesondere in biotechnologischen, pharmazeutischen Anwendungen einsetzbar sein, und auch in großen Reaktormaßstäben sehr gute Eigenschaften hinsichtlich des Mischens, des Suspendierens, des Solubilisierens, des Stoff- und Wärmetransportes bzw. deren Kombinationen aufweisen. Es soll vorzugsweise einfach zu handhaben sein, den hohen reinigungs- und steriltechnischen Anforderungen der pharmazeutischen Industrie gerecht werden. Der Einsatz des Begasungssystem zur Kultivierung von Zellen und Mikroorganismen soll die bei der Produktion anfallenden Abfallmengen begrenzen und zur Vergrößerung der Prozessro- bustheit sowie zur Steigerung der Raum-Zeit-Ausbeute beitragen.
Überraschend wurde gefunden, dass diese Aufgabe durch ein Begasungssystem gelöst werden kann, bei dem ein Sauerstoffvektor innerhalb eines Gefäßes mit Kulturmedium zyklisch zwischen dem Kulturmedium und einer Blasensäule transportiert wird. In der Blasensäule erfolgt die Anreicherung des Sauerstoffvektors mit Sauerstoff. Der Sauerstoffvektor wird über einen Verteiler in Form von Tropfen auf die Flüssigkeitsoberfläche des Kulturmediums gegeben. Die Tropfen sinken zu Boden und geben zumindest einen Teil des Sauerstoffs an das Kulturmedium ab. Sie koaleszie- ren in einer Sammelvorrichtung am Gefäßboden und werden von dort wieder der Blasensäule zu- geführt. Die Vermischung von Sauerstoffvektortropfen und Kulturmedium wird vorzugsweise durch eine relative Bewegung des Kulturmediums in Bezug zum Gefäß intensiviert.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Begasungssystem zur Versorgung eines flüssigen Mediums in einem Gefäß mit Gas mindestens umfassend
a. eine Blasensäule mit mindestens einer Ansaugöffnung am unteren Ende der BIa- sensäule,
b. einen Verteiler am oberen Ende der Blasensäule mit mindestens einer Austrittsöffnung, dadurch gekennzeichnet, dass Verteiler und Blasensäule als hohle Körper ausgeführt und miteinander verbunden sind, so dass ein Vektor durch die Ansaugöffhung in das Begasungssystem eingebracht werden kann und über den Verteiler das Begasungssystem in Tropfenform wieder verlassen kann.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Begasung eines flüssigen Mediums in einem Gefäß, dadurch gekennzeichnet, dass ein Vektor in einem zyklischen Prozess in einer Blasensäule durch einen aufwärts gerichteten Strom eines Gases mit mindestens einem Bestandteil des Gases angereichert wird, über einen Verteiler in Form von Tropfen auf die Flüssig- keitsoberfiäche des Mediums gegeben wird, in dem Medium zu Boden sinkt, in einer Sammelvorrichtung aufgefangen und wieder in die Blasensäule gesaugt wird.
Das erfϊndungsgemäße Begasungssystem und das erfindungsgemäße Verfahren werden vorzugsweise zur Begasung von Kulturmedien mit Sauerstoff in Bioreaktoren eingesetzt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Bioreaktor mindestens umfassend ein Gefäß für ein Kulturmedium, eine Sammelvorrichtung für einen Sauerstoffvektor und ein erfindungsgemäßes Begasungssystem,.
Unter Medium wird allgemein eine unter den betrachteten Prozessbedingungen flüssige Substanz verstanden.
Unter Kulturmedium wird eine Suspension von Zellen (z.B. pflanzliche, tierische oder humane) oder Mikroorganismen (z.B. Bakterien, Pilze oder Viren) in einem flüssigen Medium, vorzugsweise in einem wässrigen Medium verstanden. Es ist auch denkbar, dass die Zellen oder Mikroorganismen als Immobilisate in dem Kulturmedium vorliegen.
Unter Vektor wird eine unter den betrachteten Prozessbedingungen flüssige Substanz verstanden, die mit dem Medium nicht oder nur in geringem Umfang mischbar ist, die unter den betrachteten Prozessbedingungen eine höhere Dichte als das Medium aufweist und die unter den betrachteten Prozessbedingungen eine höhere Löslichkeit für ein Gas aufweist als das Medium.
Als Sauerstoffvektoren sind wegen ihrer chemischen Stabilität und einer gegenüber Wasser beinahe 20-fach größeren Sauerstofflöslichkeit Perfluorcarbone (PFC) besonders geeignet. Nicht mischbar mit Wasser sedimentieren diese Substanzen aufgrund ihrer gegenüber Wasser erhöhten Dichte in einer Zellkulturlösung zu Boden. Geeignete und bevorzugt verwendete Perfluorcarbone sind z.B. Perfluordecalin, Hostinert oder FC40. Ihre Dichte ist fast doppelt so hoch wie die eines wässrigen Kulturmediums. Sie besitzen gegenüber anderen organischen Phasen, wie z.B. Sihkonölen, den entscheidenden Vorteil, dass sich Zellen nicht in der organischen Phase anreichern, wo diese nicht mehr mit Nährmedien zu versorgen und in der Blasensäule des erfindungsgemäßen Begasungssystems viel zu hohen Scherbelastungen ausgesetzt wären.
Das erfindungsgemäße Begasungssystem dient der Versorgung eines Mediums mit einem Gas. Als Transportmittel für das Gas wird ein Vektor eingesetzt. Das erfindungsgemäße Begasungssystem umfasst eine Blasensäule mit mindestens einer Ansaugöffhung, die in eine Sammelvorrichtung hineinragt. Die Sammelvorrichtung ist vorzugsweise am Boden des Gefäßes für das Medium angebracht. Die Blasensäule ist als hohler, vorzugsweise rohrförmiger Körper ausgeführt. In der BIa- sensäule wird ein Vektor mit einem Gas angereichert.
In die Blasensäule kann ein Gaseinlass eingebracht werden, durch den Gas in die Blasensäule gegeben werden kann. Der Gaseinlass wird bevorzugt etwas oberhalb der mindestens einen Ansaugöffnung der Blasensäule angebracht. Der Gaseinlass kann von der Seite in die Blasensäule eingebracht sein. Der Gaseinlass kann aber auch von oben oder bevorzugt durch eine Ansaugöffhung in die Blasensäule eingebracht werden. Bevorzugt wird zur Verbesserung des Impulsaustausches eine Düse verwendet, durch die das Gas in Form von Blasen in die Blasensäule eingepresst werden kann. Als Impulsaustauschvorπchtung eignen sich alle strömungstechnisch sinnvoll gestalteten Vorrichtungen, die einen effizienten Mammutpumpenantrieb gewährleisten. Es. können auch handelsüblich erhältliche Gasejektoren eingesetzt werden. Auch kann der Querschnitt der Blasensäule im Bereich der Gaseinleitung strömungstechnisch vorteilhafte Querschnittsverengungen, wie z.B. Ventuπ-Profϊle aufweisen. Vorzugsweise wird der Gaseinlass in der Blasensäule bezüglich des Querschnitts mittig zentriert und als Austrittsöffnung oder als Rmgspalt angeordnet und die Austrittsquerschnitte für das in die Blasensäule eingespeiste Gas ist vorzugsweise in die Richtung des Verteilers gerichtet. Es kann bei größeren Reaktormaßstäben aber auch vorteilhaft sein, das Gas über mehrere Öffnungen gleichmäßig über den Blasensäulenquerschnitt verteilt zuzugeben. Auch kann es zur effizienteren Nutzung des Treibgases vorteilhaft sein, die Maßstabsvergroßerung durch ein Numbeπng-up, d.h. die Vergrößerung der Blasensäulenanzahl, sicherzustellen.
Der Gaseinlass kann mit der Blasensäule verbunden sein; er kann aber auch als separates Element ausgeführt sein, das in einem erfindungsgemäßen Bioreaktor so angeordnet ist, dass es in die BIa- sensäule hineinragt, z.B. über eine Ansaugöffhung.
Es ist denkbar, am Gaseinlass eine Fπtte oder ähnliches zu verwenden, um die Größe der Gasblasen, die in die Blasensäule eingebracht werden sollen, den Bedürfhissen anzupassen. Am oberen Ende der Blasensäule ist ein Verteiler angebracht. Der Verteiler dient der Trennung von Gas- und Flüssigphase, der Erzeugung von Tröpfchen und/oder der Verteilung der Tröpfchen auf die Flüssigkeitsoberfläche eines zu begasenden Mediums.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Verteiler 1 bis 20 Verteilerarme. Besonders bevorzugt umfasst der Verteiler 2 bis 10 Verteilerarme. Die Verteilerarme sind hohle, vorzugsweise rohrförmige Körper, die mit der Blasensäule derart verbunden sind, dass ein Vektor durch die Blasensäule in die Verteilerarme einströmen/eingepresst werden kann. Vorzugsweise sind die Verteilerarme radial um die Blasensäule angeordnet. Benachbarte Verteilerarme schließen bei einer zentrischen Anordnung der Blasensäule innerhalb des Bioreaktors vorzugsweise einen Winkel von etwa (360°/n) ein, wenn n die Zahl der vorhandenen Verteilerarme ist, d.h. die Verteilerarme sind vorzugsweise gleichmäßig um die Blasensäule verteilt angeordnet. Zur gleichmäßigen Verteilung der Verteilerarme bei einer exzentrischer Anordnung in einer Ecke des Rechteckreaktors wäre der Winkel auf 90°/n zu verringern. Mit der Längsachse der Blasensäule schließen die einzelnen Verteilerarme einen Winkel zwischen 110° und 70°, vorzugsweise zwischen 100° und 80° ein (An- Stellwinkel). Der Durchmesser der Verteilerarme ist vorzugsweise kleiner ausgeführt als der Durchmesser der Blasensäυle Die Summe der Strömungsquerschnitte aller Verteilerarme entspricht vorzugsweise etwa dem Strömungsquerschnitt der Blasensäule oder ist größer als der Strömungsquerschnitt der Blasensäule, um Druckverluste zu vermindern. Jeder Verteilerarm besitzt mindestens eine Austrittsöffhung, durch die ein Vektor in Tropfenform den Verteiler verlassen kann. Die Austrittsöffnung kann am äußeren Ende eines Verteilerarms angebracht sein. Im einfachsten Fall ist ein rohrförmiger Verteilerarm am Ende offen ausgeführt. Ebenso ist es denkbar, ein oder mehrere Austrittsöffhungen am Ende oder entlang des Verteilerarmes anzubringen. Eine oder mehrere Austrittsöffhungen sind bevorzugt an der Seite oder der Unterseite eines Verteilerarmes angebracht.
Die Austrittsöffnungen haben einen Durchmesser im Bereich von 1 bis 100 mm, bevorzugt im Bereich von 3 bis 15 mm. Beim Einsatz von Pumpen insbesondere in Verbindung mit einer Gasvorabscheidung zur Unterstützung der Förderung des Sauerstoffvektors ist außerdem die Verwendung von Düsensystemen mit kleineren Austrittsquerschnitten sowie die Anwendung einer zentral angeordneten Düse zur Erzeugung kegelförmiger Flüssigkeitsfilme denkbar.
Neben der oben beschriebenen sternförmigen oder strahlenförmigen Anordnung von Verteilerarmen, ist es auch denkbar, den Verteiler ring- oder spiralförmig auszuführen. In einer solchen Ausführungsform sind Austrittsöffnungen vorzugsweise gleichmäßig über den Ring oder die Spirale verteilt angeordnet. Weitere Formen des Verteilers sind denkbar. Der Verteiler ist bevorzugt an die Form des Gefäßes für das Medium angepasst. Der Verteilers wird ebenso vorzugsweise an seine Position in Bezug zum Gefäß angepasst. Der Verteiler ist vorzugsweise so ausgeführt, dass er den Vektor in Form von Tröpfchen möglichst gleichmäßig auf die Oberfläche des Mediums verteilt.
Verteiler und Blasensäule können aus einem Stück gefertigt sein; sie können aber auch aus verschiedenen Stücken gefertigt sein und miteinander über eine reversible oder irreversible Verbin- düng verbunden sein. Bevorzugt sind Blasensäule und Verteiler aus verschiedenen Stücken gefertigt. Bevorzugt werden Blasensäule und Verteiler über eine reversible Verbindung miteinander verbunden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden der Verteiler und die Blasensäule zur Verbindung ineinander gesteckt.
Verteiler und Blasensäule können z.B. aus Metall, Kunststoff oder Glas gefertigt sein. Verteiler und Blasensäule sind bevorzugt als Einwegartikel aus Kunststoff ausgeführt, um ein Höchstmaß an remigungs- und steπltechnischer Prozesssicherheit zu gewährleisten. Geeignete Kunststoffe sind z.B. PVC, Polyolefϊne, Polyester, Polyethylen, Polypropylen, Peek, u.a. , sowie deren Kombinationen.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Begasung eines Mediums in einem Gefäß mit einem Gas ist dadurch gekennzeichnet, dass ein Vektor in einem Zyklischen Prozcss zwischen Medium und einer Blasensäule transportiert wird. In der Blasensäule erfolgt die Anreicherung des Vektors mit mindestens einem Bestandteil des Gases. Dazu wird das Gas m Form von Blasen in die Blasensäule eingepresst. Die Dispersion aus Vektor und Gasblasen steigt m der Blasensäule aufgrund einer verringerten Dichte nach oben und gelangt in einen Verteiler. In dem Verteiler separieren der Vek- tor und das Gas größtenteils. Das Gas verlässt den Verteiler und gelangt in den Kopfraum des Gefäßes, wo es abgesaugt werden kann. Der mit Gas (oder einem Bestandteil des Gases) angereicherte Vektor wird über den Verteiler in Tropfenform auf die Flüssigkeitsoberfläche des Mediums aufgegeben. Die Vektortropfen sinken in dem Medium nach unten und geben den mindestens einen Bestandteil des Gases an das Medium zumindest teilweise ab. Die Tropfen koaleszieren in einer Sammelvorrichtung, von wo aus sie wieder in die Blasensäule gelangen. Der Stoffaustausch zwischen den Vektortropfen und dem Medium wird unterstützt durch eine relative Bewegung des Mediums in Bezug auf das Gefäß.
Das erfindungsgemäße Begasungssystem und das erfindungsgemäße Verfahren erlauben eine sehr einfache, gut skalierbare und äußerst schonende Versorgung eines Mediums mit Gas und sind da- her besonders zur Versorgung von biologischen Kulturen - vorzugsweise humaner, tierischer oder pflanzlicher Zellen - mit Sauerstoff geeignet. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch die Verwendung des erfindungsgemäßen Begasungssystems und des erfindungsgemäßen Verfahrens in einem Bioreaktor zur Begasung des Kulturmediums mit Sauerstoff. Unter Bioreaktor wird ein System verstanden, das der An- und/oder Aufzucht und/oder Lagerung von lebenden Zellen und/oder Mikroorganismen dient.
Neben der Versorgung der Zellen oder Mikroorganismen mit Sauerstoff dienen das erfindungsgemäße Begasungssystem und das erfindungsgemäße Verfahren auch dem Abtransport gasförmiger Stoffwechselprodukte wie z.B. Kohlendioxid. Als Transportmittel für Sauerstoff und/oder gasförmige Stoffwechselprodukte wird ein Sauerstoffvektor eingesetzt.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Versorgung von Zellen oder Mikroorganismen in einem erfindungsgemäßen Bioreaktor mit Sauerstoff ist dadurch charakterisiert, dass ein Sauerstoffvektor in einem zyklischen Verfahren in einer Blasensäule, in die ein sauerstoffhaltiges Gas eingebracht wird, mit Sauerstoff angereichert wird, in der Blasensäule nach oben steigt, am oberen Ende der Blasensäule über einen Verteiler in Form von Tropfen auf die Flüssigkeitsoberfläche des Kulturmediums aufgebracht wird, in der Flüssigkeit zum Boden des Gefäßes sinkt, sich in einer Sammelvorrichtung sammelt und von dort wieder in die Blasensäule gesaugt wird.
Ein Reservoir des Sauerstoffvektors hegt in einer Sammelvorrichtung im Bodenbereich des Biore- aktors vor. Über mindesrens eine in die Scuiunclvonichtung hineinreichende und ausreichend vom einphasigen Sauerstoffvektor überschichtete Ansaugöffnung wird die organische Phase in eine Blasensäule eingetragen. Dazu wird knapp oberhalb der Ansaugöffnung ein sauerstoffangereichertes Gas vorzugsweise über ein aufwärts gerichtetes Düsenstück in die Blasensäule gepresst. Für den Transport werden je nach Art und Dichte des Sauerstoffvektors oder des beabsichtigten Um- wälzvolumenstroms vergleichsweise hohe Gasleerrohrgeschwindigkeiten von 0,01 - 10 m/s, bevorzugt 0,1 - 3 m/s in der Blasensäule benötigt, die sich mit kleinen Blasensäulendurchmesser-zu- Gefäßdurchmesser-Verhältnissen von 0,01 < d/D < 0,1 mit moderaten Gasvolumenströmen realisieren lassen. Im Falle des Numbeπng-up sollte der Innendurchmesser der Blasensäulen d im Bereich von 3 mm < d < 50 mm und bevorzugt zwischen 5 und 10 mm, liegen Im optimalen Betriebs- punkt wird für den Transport des Sauerstoffvektors gerade soviel Gas in den Gasemlass der Blasensäule eingetragen, wie es zur Sauerstoffsättigung bzw. zur Kohlendioxidstrippung der organischen Phase erforderlich ist. Da dieser optimale Betriebspunkt nicht immer erreichbar ist und in der Regel ein Gasüberschuss für die Flüssigkeitsförderung erforderlich ist, kann es aus Kostengründen sinnvoll sein, einen Teil des Abgases in den Treibgasstrom zurückzuführen. Um die Komplexität des Verfahrens einzugrenzen und seine Robustheits- und Steπlitätsanforderung zu erfüllen, ist es empfehlenswert, die Gasrückführung ebenfalls mit statischen, nicht-invasiven Elementen durchzuführen. Selbstansaugende Gasejektoren, die mit dem Gaszufuhrstrom angetrieben werden, sind für diese Aufgabe gut geeignet. Auch kann es sinnvoll sein, die Förderung des Sauerstoffvektors durch eine zwischen Blasensäule und Verteiler geschaltete Pumpe, vorzugsweise eine extern angeordnete nicht invasive Schlauchpumpe oder eine mit geeigneten z.B. magnetischen oder dampfüberlagerten Sterilkupplungen intern anzutreibenden Kreiselpumpe, zusätzlich zu unterstützen. Hierzu wäre unter Umständen eine separate Gasvorabscheidung vor der Pumpe empfehlenswert.
Im Übrigen zeigen wegen der räumlichen Trennung zum Kulturmedium die hohe Begasungsintensitäten in der Blasensäule keine nachteilige Wirkung auf die scherempfindliche biologische Kultur. Am Kopf der Blasensäule wird die Gas-Sauerstoffvektor-Dispersion durch die Verteilerarme zu den Außenwänden des Gefäßes geleitet. Die Querschnitte aller Einbauten einschließlich der Verteilerarme können so groß gewählt werden, dass eine Verstopfung der Leitungen ausgeschlossen werden kann. Am Ausgang der Verteilerarme wird der Sauerstoffvektor als Tropfendispersion mit einer vergleichsweise niedrigen Tropfengröße im unteren mm-Bereich auf die Flüssigkeitsoberfläche des Kulturmediums aufgetragen. Zu kleine Tropfengrößen werden durch die Dimensionierung der Austrittquerschnitte vermieden. Diese Tropfen laufen Gefahr, mit dem Gasstrom aus dem Gefäß ausgetragen zu werden und müssten daher ersetzt werden. Erstaunlicherweise haben die Expe- rimente gezeigt, dass die Tropfen beim Durchtritt durch die Flüssigkeitsoberfläche des Kulturmediums eine Gasblase einkapseln können.
Vorteilhaft ist in diesem Zusammenhang der Einsatz von Tensiden wie z.B. Pluronic, die außerdem eine Anlagerung der organischen Zellen an die organische Phase unterbinden. Dieses Konju- gat aus Gas- und Flüssighase besitzt die großen Vorteile einer zusätzlich vergrößerten Gasaus- tauschkapazität und einer herabgesetzten Sinkgeschwindigkeit der Flüssigkeitstropfen. Außerdem ergibt sich hieraus eine vergrößerte Austauschfläche für den Stofftransport zwischen organischer Phase und dem Kulturmedium.
Vorzugsweise wird eine Bewegungseinheit eingesetzt, die eine relative Bewegung des Kulturmediums in Bezug zum Gefäß erzeugt. Durch die Bewegung wird eine Strömung auf das Kulturmedi- um übertragen, die sowohl an der Flüssigkeitsoberfläche als auch innerhalb des Gefäßes eine vorzeitige Koaleszenz der Sauerstoffvektortropfen verhindert und zudem den flüssigkeitsseitigen Stofftransportwiderstand auf der Tropfenaußenseite reduziert. Außerdem wird die organische Phase trotz der punktuellen Zugabestellen des Verteilers schonend über den Reaktorquerschnitt verteilt und damit eine für eine effektive Maßstabsübertragung essentielle Voraussetzung erfüllt.
Die Tropfendispersion des Sauerstoffvektors sedimentiert im Kulturmedium. Am Behälterboden angekommen werden die Tropfen in einer Sammelvorrichtung, die vorzugsweise als eine oder mehrere konische, pyramidale oder auf eine oder mehrere Reaktorecken ausgerichtete Bodenvertiefungen ausgestaltet ist, gesammelt und zu einer kontinuierlichen Phase koalesziert. Die zu bevorratende Menge an Sauerstoffvektor ist m dem erfindungsgemäßen Begasungssystem, mindestens umfassend eine Blasensäule und einen Verteiler aufgrund der geringen Abmessungen der Elemente sehr klein. Daher reicht bereits eine kleine Zugabemenge an Sauerstoffvektor im niedrigen einstelligen Vol%-Bereich von 0,3 Vol% bis 10 Vol% bevorzugt 0,5 bis 2 Vol% bezo- gen auf das Volumen des Kulturmediums in vielen Fällen für eine ausreichende Sauerstoffzufuhr aus. Trotz der vergleichsweise hohen Chemikahenkosten bietet sich dadurch die Möglichkeit, den Sauerstoffvektor ohne das Risiko der Kreuzkontamination für den Einmalgebrauch einzusetzen, womit diese Technologie u.a. für den Aufbau von Emweg-Bioreaktoren geeignet ist. Durch die relative Bewegung des Kulturmediums werden neben der schonenden Verteilung der Tropfendis- persion, der Verringerung des Stofftransportwiderstandes flüssig-flüssig (Sauerstoffvek- tor/Kulturmedium) ebenfalls die schonende Durchmischung des Kulturmediums sowie die Suspendierung der Zellen, Zellimmobilisate oder Mikroorganismen erreicht.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Bioreaktor. Em erfindungsgemäßer Bioreaktor umfasst ein Gefäß zur Aufnahme von Zellen oder Mikroorganismen, die gewöhnlich in einer wässπgen Suspension vorliegen Der erfindungsgemäße Bioreaktor umfasst weiterhin das erfindungsgemäße Begasungssystem, das der Versorgung der Zellen oder Mikroorganismen mit Sauerstoff sowie dem Abtransport gasförmiger Stoffwechselprodukte aus dem Kulturmedium dient. Der erfindungsgemäße Bioreaktor umfasst ferner mindestens eine Sammelvorrichtung, m die eine Blasensäule des Begasungssystems zumindest teilweise hineinragt.
Da der Sauerstoffvektor in einem Kulturmedium aufgrund seiner höheren Dichte zu Boden sinkt, ist die Sammelvorrichtung bevorzugt am Boden des Bioreaktorgefäßes angeordnet. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemaßen Bioreaktors ist am Boden des Bioreaktors eine Vertiefung eingebracht. Die Vertiefung ist bevorzugt nach unten verengend ausgeführt. Die Vertiefung ist z.B. konisch, tetraedπsch, pyramidal oder als schiefe Ebenen in einer oder mehrerer Reak- torecken ausgeführt. Weitere Formen sind denkbar. Die Vertiefung kann mittig oder an einer Seite des Gefäßbodens angebracht sein. In die Vertiefung ragt zumindest teilweise die Blasensäule ein. Die Blasensäule kann über einen Bodenhalter am Boden des Bioreaktors, an Seitenhaltern an einer oder mehreren Seiten des Bioreaktors oder an einem Kopfhalter am Kopf des Bodenreaktors befestigt sein. Ebenso ist es denkbar, die Blasensäule außerhalb des Reaktors über Stutzen an die Bo- denvertiefungen anzukoppeln. Bei einer Ausführung als Einwegreaktor können sich durch eine externe Ankopplung der Blasensäule Vorteile bei der Verpackung ergeben. Für eine raumsparende Verpackung wäre es vorteilhaft, die Blasensäuleneinheit selbst ebenfalls aus flexiblen Materialien oder aus einer Kombination aus starren und flexiblen Elementen aufzubauen, die zur Inbetriebnahme des Bioreaktors zu einer vertikalen Säule entfaltet werden. Auch könnte eine sterile, aus steifen Elementen aufgebaute Blasensäule über Steπlanschlύsse erst unmittelbar vor Inbetriebnahme an dem Bioreaktor gekoppelt werden. Bei in-situ dampfsteπlisierbaren oder extern autokla- vierten Systemen ist es denkbar, die Blasensäule innerhalb einer Hohlwelle drehbar gelagert auszuführen. Die Welle wird bevorzugt über eine sterile Wellenkupplung, bevorzugt eine Magnetkupp- lung oder Gleitringdichtung mit dem externen Antrieb verbunden.
Ein oder mehrere Gaseinlässe in der Blasensäule werden z.B. über einen Zufuhrstutzen am Kopf des Bioreaktors und/oder einem Schlauch zwischen Zufuhrstutzen und Gaseinlass mit einem sauerstoffhaltigen Gas versorgt. Ebenso ist es denkbar, den Gaseinlass über einen Stutzen am Boden des Reaktors in die Blasensäule einzuführen.
Die Blasensäule ist bevorzugt an tiefliegenden Punkten mittig im Bioreaktor und/oder an dessen Seiten innerhalb oder außerhalb der Reaktorecken angeordnet. Der Verteiler ist bevorzugt im Kopfraum des Bioreaktors oberhalb der Flüssigkeitsoberfläche des Kulturmediums angebracht. Der Abstand zwischen den Austrittsöffnungen des Verteilers und der Flüssigkeitsoberfläche hegt bevorzugt im Bereich zwischen 0,01 x D bis 0,3 x D bzw. bevorzugt zwischen 10 mm und 500 mm, bevorzugt zwischen 20 mm und 100 mm. Die Angabe der Höhendifferenz bezieht dabei sich auf den vollständig gefüllten Reaktor. Bei statischem Einbau des Gasverteilers kann dieser Abstand zu Fermentationsbeginn, z.B. nach der Inokkulation bei niedrigen Füllstränden, ein Vielfaches des optimalen Abstandes betragen, so dass eine effektive Förderung des Sauerstoffvektors nicht mehr gewährleistet ist. Zur Deckung des Sauerstoffbedarfs in der Anzuchtphase ist bei einer durch geeignete Fütterstrategie zu limitierenden Zeilkonzentration die Oberflächenbegasung des oszillierend bewegten Reaktors völlig ausreichend bemessen. Die Zuschaltung der Sauerstoffvektorbegasung empfiehlt sich in diesem Fall ab dem Erreichen einer Mindestzellzahl, die erst angestrebt wird, nachdem der Reaktor auf den optimalen Füllstand aufgefüllt ist.
Es ist ebenso denkbar, den Verteiler höhenvariabel im Reaktor zu platzieren. Die Lage des Vertei- lers kann beispielsweise mechanisch durch eine füllstandskontrollierte Regelung oder durch eine schwimmende Lagerung auf der Flüssigkeitsoberfläche bewerkstelligt werden. Auch kann eine zwischen Blasensäule und Verteiler installierte Pumpe einen Betrieb des Reaktors bei niedrigen Füllständen sicherstellen.
Der Verteiler ist bevorzugt an die Geometrie des Bioreaktors angepasst. Bei Verwendung von ra- dial angeordneten, rohrförmigen Verteilerarmen mit offenen Enden überstreichen diese zwischen 30° und 90° des halben Reaktorquerschnitts. Der erfindungsgemäße Bioreaktor ist insbesondere als Einweg-Reaktor ausgeführt, der nach erfolgter Verwendung weggeworfen werden kann. Hierzu kann das Reaktorgefäß aus einem stabilen, vorzugsweise mehrlagigen oder aus einem auf stabilisierenden Netzstrukturen aufgebrachten und die beabsichtigte verfahrenstechnische Grundoperation unterstützenden Kunststoff hergestellt sein. Vorzugsweise ist das Reaktorgefäß mit einem an die Mantelform des Reaktors zumindest teilweise angepassten Gehäuse verbunden. Der Reaktor ist bevorzugt aus ein oder mehrlagigen Folienmaterialien ausgeführt. Diese sind so ausgeführt, dass die Abgabe von Folieninhaltsstoffen (Extrac- tables oder Leachables) auf ein Mindestmaß reduziert wird. Im Bereich der teilweise oder dauerhaft mit dem Sauerstoffvektor in Kontakt stehenden Reaktorwände kann es erforderlich sein, diese Wände aus speziellen Werkstoffen herzustellen oder diese mit speziellen undurchlässigen Schichten zu laminieren oder zu beschichten.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird der erfindungsgemäße Bioreaktor mit einer Bewegungseinheit kombiniert. Die Bewegungseinheit dient der Erzeugung einer relativen Bewegung des Kulturmediums in Bezug zum Reaktorgefäß. Diese relative Bewegung fördert die Durchmischung der Sauerstoffvektortropfen und des Kulturmediums. Sie verbessert den Stofftransport zwischen der. Sauerstoffvektortropfen und dem Kulturmedium.
In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Bewegungseinheit eine Antriebseinheit dar, mit der das Reaktorgefäß gekoppelt ist. Der Bioreaktor kann durch die Antriebseinheit um eine ortsfeste, vorzugsweise vertikale Achse des Reaktors in eine oszillierende, rotatorische Bewegung ver- setzt werden. Die oszillierende, rotatorische Bewegung weist eine Bewegungsumkehr auf. Aufgrund der Trägheit hinkt das Kulturmedium der Bewegung des Bioreaktors nach, was zu einer relativen Bewegung des Kulturmediums in Bezug zum Gefäß führt, die eine gute Durchmischung des Kulturmediums und eine gute Verteilung der Sauerstoffvektortropfen innerhalb des Kulturmediums verursacht.
Durch eine geeignete Mantelform des Bioreaktors und / oder Einbauten innerhalb des Gefäßes kann der Leistungseintrag in das Kulturmedium erhöht und damit die Durchmischung verbessert werden. Bevorzugt weist der Bioreaktor in einer bevorzugten Ausführungsform daher zumindest teilweise einen eckigen, vorzugsweise zwei- bis achteckigen, besonders bevorzugt drei- bis viereckigen Querschnitt senkrecht zur Drehachse auf. Hierbei kann sich die Querschnittsform auch über die Höhe des Reaktors in axialer Richtung (entlang der Drehachse) ändern. So kann der Reaktor beispielsweise im oberen Bereich zylinderförmig oder quadratisch und in einem unteren Bereich rechteckig, quadratisch, pyramidal, tetraedrisch etc. ausgeführt sein. Durch eine Rotationsbewegung des so ausgestalteten Reaktors können Flüssigkeitsströmungen in dem Kulturmedium erzeugt werden. Vorzugsweise ist der Bioreaktor derart mit der Antriebseinheit zwangsgekoppelt, dass das Beschleunigen und Abbremsen der rotatorischen Bewegung mit einer im Wesentlichen konstanten Winkelbeschleunigung bzw. -Verzögerung erfolgt. Dadurch ändert sich die Drehgeschwindigkeit des Reaktors in jeder Bewegungsphase der rotatorischen Oszillation linear mit der Zeit. Zwischen- geschaltete Steuermodule sind bei dieser einfachen Reaktorbewegung nicht erforderlich, so dass beispielsweise gemäß einer bevorzugten Ausführungsform für die Realisierung der oszillatoπschen Bewegung ein Pendelgetriebe verwendet werden kann. Dadurch kann z.B. die Freisetzung von elektromagnetischen Strahlen, die z.B. Störungen von Sensoren verursachen können, drastisch reduziert werden. Insbesondere werden durch die konstante Wmkelbeschleumgung in jeder Phase einer rotatorisch oszillierenden Bewegung momentane Spitzenwerte der hydrodynamischen Scherkräfte auf suspendierte Partikel (z.B. tierische Zellen) vergleichsweise geringer gehalten als bei anderen Bewegungsformen des Reaktors.
Es ist auch denkbar, anstelle einer rotatorisch oszillierenden Bewegung eine Pendel- oder Kippoder eine kombinierte Dreh-/Pendel- und/oder Kippbewegung auszuführen. Entscheidend ist, dass die Bewegung diskontinuierlich verlauft, d.h. das Gefäß beschleunigte oder abgebremste Bewegungen ausführt, bei denen das Kulturmedium aufgrund der Trägheit der Bewegung des Gefäßes nachhinkt. Dem Fachmann ist bekannt, wie eine entsprechende Bewegungsemheit ausgestaltet und mit dem Gefäß gekoppelt werden muss, um eine entsprechende Bewegung auszuführen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist der erfindungsgemäße Bioreaktor eine Be- gasungseinheit am Boden des Gefäßes auf, die als Bewegungseinheit dient. Diese Begasungseinheit umfasst mindestens ein Begasungsrohr, das vorzugsweise im unteren Bereich des Gefäßes angebracht ist. Das Begasungsrohr umfasst einen Gasemlass, über den das Begasungsrohr mit Gas beschickt werden kann. Das Begasungsrohr umfasst weiterhin Öffnungen, durch die Gas vom Be- gasungsrohr in das Medium gedrückt werden kann. Je nach Anforderung sind die Öffnungen so ausgeführt, dass eine fem- oder grobblasige Begasung möglich ist.
Unter feinen Gasblasen werden Gasblasen verstanden, die in dem eingesetzten Kulturmedium eine geringe Neigung zur Koaleszenz aufweisen. Zur femblasigen Begasung eignen sich beispielsweise spezielle Sinterkörper aus metallischen oder keramischen Werkstoffen, Filterplatten oder laserperforierten Platten, die Poren oder Löcher mit einem Durchmesser von in der Regel kleiner als 15 μm aufweisen. Bei kleinen Gasleerrohrgeschwmdigkeiten von weniger als 0,5 m h"1 werden sehr feine Gasblasen erzeugt, die in den in der Zellkultur normalerweise eingesetzten Medien eine geringe Neigung zur Koaleszenz aufweisen. Grobere Blasen werden durch entsprechend größere Löcher erzeugt. Die Begasung erzeugt einen Umlaufwirbel, der das Kulturmedium relativ zum Gefäß bewegt und eine gute Durchmischung erzeugt.
Auf eine Wellendurchführung kann bei den vorgestellten Konzepten ebenso verzichtet werden, wie auf Pumpen oder auf komplizierte, verstopfungsanfalhge Verteilerböden. Es werden abgesehen von einem möglichen Verdichter für die Gaszufuhr und ggf. eines Antriebs für die vorzugsweise oszillierende Bewegung des Gefäßes, keine weiteren extern anzutreibenden, mit dem Produkt in Verbindung stehenden Installationen (z.B. Rührer oder Pumpen) für die Förderung der Medien benötigt. Bei begrenztem Gasmengenstrom können Kultivierungen auch bei einer Direkt- begasung sehr scherarm durchgeführt werden.
Letzteres ist insbesondere von entscheidender Bedeutung bei scherempfindlichen Kulturen mit tierischen Zellen, die z.B. während einer Fermentation mit Sauerstoff versorgt werden müssen. Wegen der hohen Scherkräfte kann hier eine zu intensive Blasenbegasung häufig nicht eingesetzt werden, so dass m der Regel die erfindungsgemäße scherärmere Methode mittels Gas angereicher- ter organischer Sauerstoffvektoren Anwendung findet.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die relative Bewegung des Kulturmediums in Bezug auf das Gefäß mittels einer Rührvorrichtung innerhalb des Gefäßes als Bewegungseinheit erzeugt. Vorzugsweise sind dabei Rührvorrichtung und Blasensäule miteinander kombiniert: Durch eine sterile Kupplung am Kopf des Bioreaktors ist eine Welle in den Bioreaktor eingeführt. An der Welle sind die Blasensäule, der Verteiler und Rührblätter angebracht. Der Gaseinlass innerhalb der Blasensäule ist bevorzugt über den Boden des Bioreaktors eingebracht. Die Welle wird über einen Motor angetrieben, der Verteiler, Blasensäule und Rührblätter in eine Bewegung versetzt. Die Bewegung kann kontinuierlich oder diskontinuierlich sein. Sie kann oszillierend sein. Zusatzliche Einbauten innerhalb des Bioreaktors können als Strombrecher eingesetzt werden, die eine Durchmischung fördern.
Der Bioreaktor erlaubt das Arbeiten mit Kulturmedien im gefüllten Zustand bei einem Verhältnis von Flüssigkeitshöhe zu durchschnittlichem Durchmesser von 0,2 - 3,0, bevorzugt 0,6 - 1,8 und besonders bevorzugt 0,8 - 1,2 Natürlich kann der Bioreaktor in der Aufzuchtphase auch bei Teil- füllungen betrieben werden. Der Kopfraum über der Flüssigkeit beträgt im gefüllten Zustand etwa 10 - 30% der Flüssigkeitshöhe. Durch die im Vergleich zu handelsüblichen Bioreaktoren niedrigen Füllhöhen können z.B. durch Unwuchten verursachte Kippmomente reduziert werden und es wird trotz eines auch im Großmaßstab problemlos realisierbaren Aufstellungsflächenbedarfs eine Bedienungsmöglichkeit von oben gewährleistet. Gegenüber den in der Biotechnologie eingeführten schlanken Reaktoren bietet sich durch ein breites Reaktordesign die Möglichkeit, bei der Unterbringung der Reaktoren auf teure Hochbauten zugunsten der Aufstellung in preiswerteren hallen- förmigen Anlagen zu verzichten.
Der erfindungsgemäße Bioreaktor kann als hitzesteπlisierbarer Reaktor vorzugsweise aus Edel- stahl oder Glas oder bevorzugt als Einwegreaktor aus Kunststoff ausgeführt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist der erfindungsgemäße Bioreaktor mindestens einen bevorzugt für den Einmalgebrauch bestimmten Sensor auf, mit dessen Hilfe insbesondere ein pH- Wert und/oder eine Sauerstoffkonzentration und/oder die Temperatur des Reaktoπnhalts detektiert werden kann.
Die Erfindung wird nachstehend anhand von Beispielen näher erläutert, ohne sie jedoch auf diese zu beschränken.
Beispiele
In Fig. Ia ist eine bevorzugte Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Bioreaktors gezeigt. Der Bioreaktor umfasst ein Gefäß (100), in dessen Zentrum eine erfindungsgemäße Begasungseinheit eingebaut ist. Auf der Vertikalachse des Bioreaktors ist eine Blasensäule (40) angeordnet, die mit einer Gasdüse (50) zur Gasverteilung ausgerüstet ist. Die nach unten hm offene Blasensäule (40) ragt in den pyramidalen Boden (20) des Rechteckreaktors. Sie unterschreitet dort um eine Überde- ckungshόhe (3) den Füllstand des Sauerstoffvektors im Reservoirs (2). Der Sauerstoffvektor lagert sich dort infolge seiner gegenüber dem Fermentationsmedium vergrößerten Dichte ab, wobei die Tropfen (1) zu einer kontinuierlichen Phase verschmelzen bzw. koaleszieren. Der Bodenanstellwinkel (21) sollte ausreichend groß dimensioniert werden, um eine zügige Akkumulation der Tropfen (1) des Sauerstoffvektors sowie dessen gefahrlose Entnahme aus dem Reservoir (2) bei einer ausreichenden Flüssigkeitsüberschichtung (3) der Ansaugöffnung der Blasensäule (40) zu gewähr- leisten, ohne dass ein Kurzschlussstrom zum Fermentationsmedium entsteht. Die Vermeidung in die Blasensäule eingetragenen Kurzschlussstroms ist besonders wichtig, um eine Zerstörung der Zellen in der mit sehr hohen Scherraten betriebenen Blasensäule (40) zu verhindern. Die Überdeckung (3) sollte zur Minimierung des Bedarfs an Sauerstoffvektor aus Kostengründen minimiert werden. Bei geringen dynamischen Unterdrücken in der Ansaugzone reichen wenige Zentimeter im Bereich der Überschichtungshöhe (3) zur Höhe des Flüssigkeitsspiegeis (5) der wässπgen Phase von Δh/H = 0,01 - 0,1 aus, um Kurzschlussströmungen zu verhindern. Die organische Phase bzw. der Sauerstoffvektor werden durch die Düse (50), die über einen Schlauch (103) über Zufuhr- stutzen (101) verbunden ist, mit dem sauerstoffangereicherten Gas (91) begast, um diesen mit Sauerstoff anzureichern und das aus der Fermentationslösung aufgenommenen Kohlendioxid auszu- strippen. Die Begasung ist derart intensiv, dass die mittlere Dichte aus Gas- und Sauerstoffvektor überraschenderweise bis weit unter die mittlere Dichte der Fermentationslösung derart gesenkt werden kann, so dass der Sauerstoffvektor sogar bis zu einer Distanz (11) oberhalb des Flüssigkeitsspiegels des Fermenterraumes angehoben werden kann. Die Gasleerrohrgeschwindigkeiten zur Förderung des Sauerstoffvektors liegen im Bereich von 0,01 bis 10 m/s, bevorzugt 0,1 - 3 m/s. Anschießend wird der Sauerstoffvektor über die Verteilerarme (10) als Tropfensuspension auf die Flüssigkeitsoberfläche aufgetragen. Günstige Zugabepositionen befinden sich bei einem oszillato- risch von außen angetriebenen Reaktor auf den lotrechten Horizontalachsen zu den Behälterwänden, weil an diesen Positionen eine besonders gute Bewegung der Flüssigkeitsoberfläche erfolgt und somit eine günstige Verteilung der Tropfensuspension im Reaktor ermöglicht wird.
Überraschenderweise schließen die Tropfen (1) bei ihrem Eintritt in die Fermentationslösung in Anwesenheit geeigneter Tenside (z.B. Pluronic) eine Gasblase ein. Das reversible Konjugat aus Gasblase und Sauerstoffvektor besitzt den Vorteil eines verringerten Dichteunterschiedes zum Kulturmedium mit der Konsequenz einer besseren Homogenisierbarkeit und eines erhöhten Gasanteils und einer vergrößerten Austauschfläche. Zur besseren Blasendispersion kann es günstig sein, den Anstellwinkel (12) der Verteilerarme (10) leicht zu reduzieren. Günstige Anstellwinkel (12) liegen zwischen 90° und 70°. Günstige Zugabepositionen der Verteilerrohre liegen zwischen dem 0,45- bis 0,95-fachem der Reaktorbreite D.
In Fig. Ib ist gezeigt, wie der in Fig. Ia beschriebene Bioreaktor als Einwegreaktor in einem Kunststoffbeutel ausgeführt werden kann. In diesem Fall kann die Blasensäule (40) über ein Verbindungselement (461) mit einem durch den Kunststoffbeutel (100) hindurchreichenden Halter (460) von außen gehaltert und auf der Vertikalachse zentriert werden. Die Bodenform ergibt sich durch die Auflage des leicht verformbaren Kunststoffbehälters auf ein entsprechend geformtes Bodenelement (26), das auf dem rotatorisch oszillierend bewegten Teller (25) befestigt ist.
In Fig. 2 ist gezeigt, wie ein erfindungsgemäßes Begasungssystem in einem Bioreaktor mit einer blasenbegasungsinduzierten Flüssigkeitsbewegung kombiniert werden kann. Die Halterung der Blasensäule (40) kann über ein Düsenrohr (50) erfolgen, das im Bodenhalter (55) gelagert und durch dieses hindurch mit Gas versorgt wird. Der mit Sauerstoff angereicherte Sauerstoffvektor wird über ein Verteilerrohr (10) über die Austrittsöffnungen (15) in einer Distanz (11) oberhalb des Flüssigkeitsspiegels (5) in den Fermenterraum eingeleitet. Die Vermischung des Sauerstoffvektors, der als Tropfendispersion auf die Flüssigkeitsoberfläche (5) aufgetragen wird, erfolgt durch einen großräumigen Flüssigkeitswirbel (161). Der in der Seitenansicht in Fig. 2b dargestellte Flüssigkeitswirbel (161) wird durch die linienförmige Blasenbegasung über den Begaser (201) angetrieben. Dieser wird beispielsweise mittels eines Schlauches (103) von außen über den Stutzen (101) mit sauerstoffangereichertem Gas (91) versorgt. Zum energiearmen Betrieb des Flüssig- keitswirbels wird günstigerweise eine asymmetrische Positionierung des Linienbegasers (201) dergestalt gewählt, dass die Höhe und die Breite des Flüssigkeitswirbeis (161) möglichst gleich groß sind. Die Begasungsrohre lassen sich wie in Fig. 2c gezeigt mittels der Befestigungselemente (210) von außen relativ einfach an der Blasensäule verankern. Die Form des Bodens (20) ist durch Wahl geeigneter Anstellwinkel (21) gunstigerweise so festzulegen, dass die Akkumulation und der Transport des Sauerstoffvektors zur Blasensäule (40) erleichtert wird und dieser bei ausreichender Überdeckung (3) unter Vermeidung eines Kurzschlussstroms zur Fermentationslösung in die Blasensäule (40) eingetragen werden kann.
In Fig. 3 ist gezeigt, wie das erfindungsgemäße Begasungssystem in einem Bioreaktor mit einem Rührwerk kombiniert werden kann. An der über eine Steπlkupplung (450) mit dem Motor (350) verbundenen Rührwelle (420) kann die Blasensäule (40) für den Sauerstoffvektor achsensymmet- πsch befestigt werden. Die Blasensäule (40) ragt saugseitig in das Reservoir (2) für den Sauer- stoffvekiυi hniein und wird dort anςreichend von der Sauerstoffvektor-Phase überdeckt. Der Sauerstoffvektor wird im kegelförmigen Boden (20) mit dem Anstellwinkel (21) des Reaktors akkumuliert und koalesziert. Die bevorzugt mit dem Stutzen (101) verbundene Begasungsdüse (50) kann beispielsweise von unten über die Kegel- oder Pyramidenspitze oder aus dem Zentrum eines Klöpper- oder Rundbodens heraus berührungslos in die langsam rotierende Blasensäule (40) eingeführt sein. Auf der Außenseite der Blasensäule sind in einer oder mehreren Höhenlagen eine oder mehrere senkrechte oder gegenüber der Vertikalachse angestellte Rührschaufeln (400) befestigt, die für eine schonende Verteilung der oberhalb der Flüssigkeitsoberfläche (5) zugegebenen, mit Sauerstoff angereicherten Tropfendispersion des Sauerstoffvektors im Fermentationsmedium sor- gen. Hierbei kann es vorteilhaft sein, eine Ebene an Rührblättern (400) knapp unterhalb der Flüs- sigkeitsoberfläche zu platzieren und die Tropfendispersion über dem Nachlaufgebiet der Rühr- schaufeln auf die Flüssigkeitsoberfläche (5) zuzuführen, um auf diese Weise eine besonders intensive Tropfenverteilung im Fermentationsmedium zu ermöglichen. Der Reaktor (100) kann zur Verhinderung von Rotationsströmungen mit Strombrechern (470) ausgerüstet werden. Anstelle der Verteilerarme (10) eignen sich auch kegelförmige oder zylindrische Verteilerembauten oder Ver- teilerböden zur Aufgabe des Sauerstoffvektors.
In Fig. 4a bis 4g wird ein Reaktor mit externer Begasung und externem Transport des Sauerstoffvektors gezeigt. Hierdurch entsteht der Vorteil, eines reduzierten Konstruktionsaufwandes und Packungsvolumenbedarfes, was insbesondere die Verwendung des Reaktionsgefäßes (100) als Einwegreaktor deutlich vereinfacht. Wie Fig. 4d zeigt, wird der Sauerstoffvektor im Bereich der tiefsten Behälterposition des Bodens über einen im Reaktorgefäß (100) installierten externen An- schluss (42) zur Blasensäule (40) transportiert. In der Blasensäule (40) erfolgt die Gaszufuhr (91) über die Düse (50). Wie die Ansichten für Vorderansicht und Aufsicht einer Reaktorkonfiguration mit extern begastem Sauerstoffvektor in den Fig. 4a. und 4b sowie Fig. 4e und 4f zeigen, kann die Blasensäule (40) unmittelbar an die externe Transferleitung (45) angeschlossen werden, die zu den Verteilerarmen (10) führt. Nach erneutem Passieren der Behälterwand des Reaktionsgefäßes (100) kann der Sauerstoffvektor anschließend mittels der Verteilerdüsen (15) auf die Oberfläche (5) verteilt werden. Beim Reaktionsgefäß in Fig. 4a und 4b erfolgt die Abnahme des Sauerstoffvektors an einer Ecke des Reaktionsgefäßes (100 ) mit konstanten Bodenanstellwinkeln (23). In den Fig. 4e und 4f erfolgt die Abnahme auf einer Behälterachse mit unterschiedlichen Bodenanstellwinkeln (22) und (23). In einer bevorzugten Anwendung der externen Sauerstoffanreicherung des Sauerstoffvektors, die in Fig. 4g dargestellt ist, werden Begasung und Transport des Sauerstoffvektors entkoppelt. Auf diese Weise lassen sich die benötigten Gasmengen auf den Bedarf für die Sauer- Stoffanreicherung reduzieren, während der Förderstrom durch die hermetische Pumpe (48) unabhängig vom Gasvolumenstrom eingestellt werden kann. Als hermetisch wirkende Pumpen (48) eignen sich zum Beispiel Schlauchpumpen, die υliπe Gefährdung der Sterilität durch Einlegen der sterilisierten Pumpenschläuche zur Fermentation an den Prozess angeschlossen werden können. Die Pumpenschläuche sind Teil der externen Transferleitung (45), die an den Gasabscheider (47) angeschlossen wird.
Bezugszeichen
1 Sauerstoffvektortropfen
2 Sauerstoffvektorreservoir
3 Überdeckungshöhe 5 Flüssigkeitsspiegel des Kulturmediums
10 Verteiler
11 Distanz der Austrittsöffnungen des Verteilers zur Flüssigkeitsoberfläche des Kulturmediums
12 Verteileranstellwinkel 15 Austrittsöffhung am Verteiler
20 Gefäßboden
21 Bodenanstellwinkel
22 Bodenanstellwinkel
23 Bodenanstellwinkel 25 Teller 26 Bodenelement
30 Gasblase
40 Blasensäule
45 Transferleitung
47 Gasabscheider
48 hermetische Pumpe
50 Gaseinlass
55 Bodenhalter
91 Gaszufuhr
92 Gasabfuhr
100 Gefäß
101 Gaszufuhrstutzen
102 Gasabfuhrstutzen
103 Schlauch zur Gasversorgung
150 rotatorisch oszillierende Bewegung
161 Zirkulationsströmung
201 Begasungsrohr
210 Befestigungselement
300 Behälterwand
350 Motor
400 Rührblatt
420 Rührwelle
450 Steπlkupplung
460 Halter
461 Verbindungselement
470 Strombrecher

Claims

Patentansprüche
1. Begasungssystem zur Versorgung eines flüssigen Mediums in einem Gefäß mit Gas mindestens umfassend
a. eine Blasensäule mit mindestens einer Ansaugöffhung am unteren Ende der BIa- sensäule,
b. einen Verteiler am oberen Ende der Blasensäule mit mindestens einer Austrittsöffnung,
dadurch gekennzeichnet, dass Verteiler und Blasensäule als hohle Körper ausgeführt und miteinander verbunden sind, so dass ein Vektor durch die Ansaugöffhung in das Begasungssystem eingebracht werden kann und über den Verteiler das Begasungssystem in Tropfenform wieder verlassen kann.
2. Begasungssystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Verteiler über 2 bis 10 Verteilerarme verfugt, die radial von der Blasensäule wegragen und mit der Längsachse der Blasensäule einen Winkel von 110° bis 70° einschließen.
3. Begasungssystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Verteiler πng- oder spiralförmig ausgeführt ist und über gleichmäßig über die Länge des Verteilers verteilte Austrittsöffnungen am Verteilerboden verfugt.
4. Verwendung eines Begasungssystems gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Versorgung von Zellen oder Mikroorganismen mit Sauerstoff.
5. Bioreaktor, mindestens umfassend ein Gefäß zu Aufnahme eines Kulturmediums, ein
Begasungssystem gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 und eine Sammelvorrichtung, dadurch gekennzeichnet, dass die Ansaugöffhung der Blasensäule in die am Boden des Gefäßes befindliche Sammelvorrichtung hineinragt.
6. Bioreaktor nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Sammelvorrichtung durch einen sich nach unten verengenden Boden des Bioreaktors mit konischer, tetraedπscher oder pyramidaler Form gebildet wird.
7. Bioreaktor nach Anspruch 5 oder 6 weiterhin umfassend einen Gasemlass, der oberhalb der Ansaugöffhung der Blasensäule m die Blasensäule mittig zentriert oder über einen Ringspalt am Umfang eingeführt ist.
8. Bioreaktor nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass eine Anreicherung des Vektors mit Gas und eine Förderung des angereicherten Vektors in den Verteiler entkoppelt voneinander ablaufen, indem die Förderung des Vektors durch eine Pumpe vorgenommen oder unterstützt wird.
9. Bioreaktor nach einem der Ansprüche 5 bis 8 weiterhin umfassend eine Bewegungseinheit, die eine relative Bewegung des Mediums in Bezug zum Gefäß erzeugt.
10. Bioreaktor nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Bewegungseinheit als Antriebseinheit ausgeführt ist, die mit dem Gehäuse gekoppelt ist und eine diskontinuierliche Bewegung des Gehäuses erzeugt.
11. Bioreaktor nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Bewegungseinheit als
Rührwerk ausgeführt ist, wobei eine Rührwelle durch den Kopf des Bioreaktors geführt wird, an der der Verteiler, die Blasensäule und Rührblätter direkt oder indirekt befestigt sind.
12. Bioreaktor nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Bewegungseinheit als Gasverteilungseinheit zur Blasenbegasung ausgeführt ist, die eine Umwälzströmung des Kulturmediums innerhalb des Gefäßes erzeugt.
13. Verfahren zur Versorgung eines Mediums in einem Gefäß mit einem Gas, dadurch gekennzeichnet, dass ein Vektor in einem zyklischen Prozess in einer Blasensäule durch einen aufwärts gerichteten Strom eines Gases mit mindestens einem Bestandteil des Gases angereichert wird, über einen Verteiler in Form von Tropfen oder Strahlen auf die Oberfläche des Mediums gegeben wird, in dem Medium zu Boden sinkt, in einer Sammelvorrichtung aufgefangen und wieder in die Blasensäule gesaugt wird.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass mittels einer Bewegungseinheit eine relative Bewegung des Mediums in Bezug zum Gefäß erzeugt wird, die ei- ne bessere Durchmischung von Vektortropfen und Medium bewirkt.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass als Vektor ein Perfluorcarbon, als Gas ein sauerstoffhaltiges Gas und als Medium ein wässriges Kulturmedium mit Zellen oder Mikrooganismen verwendet wird.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass ein Tensid eingesetzt wird, das die Anlagerung von Zellen oder Mikroorganismen an den
Vektor unterbindet.
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