WO2010079731A1 - 蛍光検出装置及び蛍光検出方法 - Google Patents

蛍光検出装置及び蛍光検出方法 Download PDF

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土井恭二
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Definitions

  • the present invention relates to a fluorescence detection apparatus and a fluorescence detection method for processing a fluorescence fluorescence signal emitted when a measurement object having a fluorescent dye attached to an analysis object is irradiated with laser light.
  • This flow cytometer uses a photoelectric converter such as a photomultiplier or an avalanche photodiode to receive fluorescence emitted from a measurement object by irradiating a laser beam, and the types of measurement objects such as cells and genes Analyze frequency and characteristics.
  • a photoelectric converter such as a photomultiplier or an avalanche photodiode to receive fluorescence emitted from a measurement object by irradiating a laser beam
  • the types of measurement objects such as cells and genes Analyze frequency and characteristics.
  • the flow cytometer creates a measurement object by labeling an analysis object such as a biological substance such as a cell, DNA, RNA, enzyme, protein or the like with a fluorescent reagent, and applies a pressure within approximately 10 m per second.
  • a laminar sheath flow is formed by flowing an object to be measured into a sheath liquid flowing in a pipe line at a speed.
  • the flow cytometer irradiates the measurement object in the flow with laser light
  • the flow cytometer receives the fluorescence emitted by the fluorescent dye attached to the analysis target portion, and identifies this fluorescence as a label for analysis. Identify the object.
  • This flow cytometer can measure, for example, the relative amounts of intracellular DNA, RNA, enzymes, proteins, and the like, and can analyze their functions in a short time. Further, the flow cytometer discriminates a predetermined type of cell or chromosome by fluorescence, and selects and collects only the identified cell or chromosome in a living state in a short time using a cell sorter or the like. In the use of such a flow cytometer, it is required to specify more measurement objects accurately from fluorescent information in a short time.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2006-226698 discloses that many measurement objects are short by calculating the fluorescence lifetime (fluorescence relaxation time) of fluorescence emitted from a fluorescent dye bonded to the measurement object by laser light irradiation. Fluorescence detection devices and methods are described that can be accurately specified in time. According to the publication, the fluorescence detection device irradiates a measurement object with laser light intensity modulated, and obtains the phase delay of the fluorescence signal of the fluorescence from the measurement object relative to the modulation signal used for laser light intensity modulation. From this phase delay, it is described that the fluorescence relaxation time is calculated.
  • the fluorescence emitted from the measurement object includes autofluorescence emitted from the analysis object itself such as cells, in addition to the fluorescence emitted from the fluorescent dye bound to the analysis object such as cells.
  • the fluorescence intensity of such autofluorescence is often smaller than the fluorescence intensity of the fluorescent dye, but there are also cases where the fluorescence intensity of the fluorescence emitted by the fluorescent dye that receives the light is small. In such a case, the influence of the received autofluorescence cannot be ignored, and there is a problem that the calculation of the phase delay and the calculation of the fluorescence relaxation time cannot be performed accurately.
  • the present invention provides accurate measurement when a fluorescent fluorescent signal emitted when a measurement target with a fluorescent dye attached to the analysis target is irradiated with laser light.
  • An object is to provide a fluorescence detection apparatus and a fluorescence detection method capable of calculating a high fluorescence relaxation time.
  • One embodiment of the present invention is a fluorescence detection device that performs signal processing on a fluorescence fluorescence signal emitted when a measurement object having at least one fluorescent dye attached to an analysis object is irradiated with laser light.
  • the device is With the first laser light intensity modulated by the modulation signal of frequency f 1, the second laser light, and intensity modulated by the modulation signal of frequency f 1 and a different frequency f 2, the first laser beam modulated
  • a light source unit for emitting the modulated second laser light
  • a first light-receiving element that receives fluorescence in a first wavelength band emitted from the first laser light and the second laser light in a first wavelength band and outputs a first fluorescence signal
  • a light receiving unit comprising: a second light receiving element that receives the fluorescence of the measurement object in a second wavelength band different from the first wavelength band and outputs a second fluorescence signal;
  • a first processing unit that generates second fluorescence data P 2 including phase and intensity information by mixing with Using the fluorescence data obtained by subtracting the result obtained by multiplying the second fluorescence data P 2 by the second constant from the result obtained by multiplying the first fluorescence data P 1 by the first constant, the fluorescence is obtained.
  • a second processing unit for calculating the fluorescence relaxation time of the dye.
  • Another aspect of the present invention is a fluorescence detection method in which a measurement object with a fluorescent dye attached to an analysis object performs signal processing on a fluorescence signal of fluorescence emitted when irradiated with laser light.
  • the method is A fluorescence detection method in which a measurement object having a fluorescent dye attached to an analysis object is subjected to signal processing of a fluorescence signal of fluorescence emitted by being irradiated with laser light, With the first laser light intensity modulated by the modulation signal of frequency f 1, the second laser light, and intensity modulated by the modulation signal of frequency f 1 and a different frequency f 2, the first laser beam modulated And emitting the modulated second laser light;
  • the fluorescent light of the measurement object emitted by being irradiated with the first laser light and the second laser light is received in a first wavelength band, and a first fluorescence signal is output, and the measurement object Receiving fluorescence in a second wavelength band different from the first wavelength band and outputting a second
  • the fluorescence detection device and the fluorescence detection method of the above aspect when the measurement object processes the fluorescence signal of the fluorescence emitted by being irradiated with the laser beam, the calculation of the fluorescence relaxation time with high accuracy is achieved.
  • FIG. 1 is a schematic configuration diagram of a flow cytometer 10 using a fluorescence detection apparatus using intensity-modulated laser light according to the present invention.
  • the flow cytometer 10 includes a signal processing device 20 and an analysis device (computer) 80.
  • the signal processing device 20 irradiates the sample 12 to be measured with laser light, detects the fluorescence signal of the fluorescence emitted by the sample 12, and performs signal processing.
  • the analyzer (computer) 80 calculates the fluorescence intensity and the fluorescence relaxation time from the processing result obtained by the signal processor 20.
  • the sample 12 will be described in later by using the configured measurement object by fluorescent protein (fluorescent dye) cells with a X 1 (analyte) X 2.
  • a fluorescent dye other than the fluorescent protein can be used.
  • the analysis target may be a biological material such as DNA, RNA, enzyme, protein, or the like, or artificially produced microbeads that emit fluorescence.
  • the sample 12 shown in FIG. 1, the fluorescent protein X 1 is a configuration attached to the cell X 2 by straps or the like, this is intended to schematically shown.
  • Sample 12 for example, a fluorescent protein X 1 enters into the cell X 2, may be configured to fluorescent protein X 1 are dispersed is taken up into cells X 2. Further, the fluorescent protein X 1 attached to the cell X 2 is not limited to one and may be plural.
  • the signal processing device 20 includes a laser light source unit 22, light receiving units 24 and 26, a control / processing unit 28, and a conduit 30.
  • the control / processing unit 28 includes a control unit that modulates the intensity of the laser light from the laser light source unit 22 at a predetermined frequency, and a signal processing unit that processes the fluorescence signal of the fluorescence emitted from the sample 12.
  • the pipe line 30 is included in a sheath liquid that forms a high-speed flow, and flows the sample 12 to form a flow.
  • a recovery container 32 is provided at the outlet of the conduit 30.
  • a cell sorter for separating a biological material such as a predetermined cell in the sample 12 is arranged in a short time by irradiation with laser light, and is configured to be separated into separate collection containers. You can also.
  • the laser light source unit 22 emits two laser beams having different wavelengths.
  • a lens system is provided so that the laser beam is focused at a predetermined position in the pipe line 30, and a measurement point of the sample 12 is formed at this focusing position.
  • FIG. 2 is a diagram illustrating an example of the configuration of the laser light source unit 22.
  • the laser light source unit 22 emits an intensity-modulated laser beam having a wavelength in the visible light band.
  • the laser light source unit 22 includes a light source 22a and a light source 22b.
  • Light source 22a is a light absorption characteristic of the fluorescent protein X 1 (light absorption coefficient) has a wavelength within the wavelength band in the higher position than the cell light absorption characteristics of the (analyte) X 2 (light absorption coefficient)
  • One laser beam L 1 is emitted as a CW (continuous wave) laser beam, and the intensity of the CW laser beam L 1 is emitted while being intensity-modulated with a modulation signal of a predetermined frequency f 1 .
  • the second laser beam L 2 CW (continuous having a wavelength within the wavelength band in the optical absorption characteristics of the fluorescent protein X 1 is at a position lower than the light absorption properties of cells (analyte) X 2 Wave) is emitted as laser light, and the intensity of the CW laser light L 2 is emitted while being intensity-modulated with a modulation signal having a predetermined frequency f 2 .
  • the laser light source unit 22 includes a dichroic mirror 23a, a lens system 23b, and laser drivers 34a and 34b.
  • a half mirror may be used instead of the dichroic mirror 23a.
  • the dichroic mirror 23a transmits laser light in a specific wavelength band and reflects laser light in other wavelength bands.
  • Lens system 23b focuses the laser beam L 1 + L 2 consisting of the laser beam L 1 and L 2 in the measurement point in the conduit 30.
  • Laser drivers 34a and 34b drive the light source 22a and the light source 22b, respectively.
  • a semiconductor laser is used as a light source for emitting these laser beams.
  • the laser beam outputs about 5 to 100 mW.
  • the frequency (modulation frequency) used for intensity modulation of the laser beams L 1 and L 2 has a slightly longer period than the fluorescence relaxation time, for example, 10 to 50 MHz.
  • the frequencies of intensity modulation of the laser beams L 1 and L 2 are different. This is because the signal processing device 20 knows which laser beam excitation the received fluorescence is derived from by making the frequencies of the fluorescence emitted by the sample 12 excited by the laser light different from each other. This is for separation.
  • the dichroic mirror 23a transmits the laser light L 1, is a mirror that reflects the laser beam L 2. With this configuration, the laser beams L 1 and L 2 are combined to form one irradiation beam for irradiating the sample 12 at the measurement point.
  • the light sources 22a and 22b oscillate in a predetermined wavelength band so that the laser beams L 1 and L 2 excite the fluorescent dye to emit fluorescence in a specific wavelength band.
  • the fluorescent protein X 1 is fluorescent at a specific wavelength by receiving the laser beams L 1 and L 2 at the measurement point.
  • Cell X 2 also emits autofluorescence.
  • the light receiving unit 24 is disposed so as to face the laser light source unit 22 with the pipe line 30 interposed therebetween.
  • the light receiving unit 24 includes a photoelectric converter that outputs a detection signal indicating that the sample 12 passes through the measurement point by receiving laser light scattered forward by the sample 12 passing through the measurement point.
  • the detection signal output from the light receiving unit 24 is supplied to the control / processing unit 28 and the analyzer 80, and a trigger signal that informs the timing at which the sample 12 passes through the measurement point in the pipe line 30; Used as an OFF signal.
  • the light receiving unit 26 is arranged in a direction perpendicular to the emitting direction of the laser light emitted from the laser light source unit 22 and perpendicular to the moving direction of the sample 12 in the pipe 30. And a plurality of photoelectric converters for receiving fluorescence emitted from the sample 12 irradiated at the measurement point.
  • FIG. 3 is a schematic configuration diagram illustrating a schematic configuration of an example of the light receiving unit 26.
  • the 3 includes a lens system 26a that focuses a fluorescent signal from the sample 12, a dichroic mirror 26b, bandpass filters 26c 1 and 26c 2, and a photoelectric converter (light receiving element) such as a photomultiplier tube. 27a, 27b.
  • the lens system 26a is configured to focus the fluorescence incident on the light receiving unit 26 on the light receiving surfaces of the photoelectric converters 27a and 27b.
  • the dichroic mirror 26b is a mirror that reflects fluorescence in a wavelength band within a predetermined range and transmits the others.
  • the reflection wavelength band of the dichroic mirror 26b and the transmission wavelength band of the band-pass filters 26c 1 and 26c 2 are so filtered that the photoelectric converters 27a and 27b capture the fluorescence of the predetermined wavelength band by filtering with the band-pass filters 26c 1 and 26c 2. Is set.
  • the bandpass filters 26c 1 and 26c 2 are filters that are provided in front of the light receiving surfaces of the photoelectric converters 27a and 27b and transmit only fluorescence in a predetermined wavelength band.
  • the wavelength band R 1 and the wavelength band R 2 of the transmitted fluorescence are set corresponding to the wavelength bands of the fluorescence emitted by the fluorescent protein X 1 and the autofluorescence emitted by the cell X 2 .
  • the wavelength band is, for example, a wavelength band R 1 of 474 nm to 514 nm for mainly receiving fluorescence emitted by irradiation with the laser beam L 1 of 408 nm emitted from the light source 22a.
  • the wavelength band is, for example, a wavelength band R 2 of 530 nm to 570 nm that mainly receives fluorescence emitted by irradiation with the 455 nm laser light L 2 emitted from the light source 22b.
  • the ratio of the fluorescence intensity of the fluorescence fluorescence intensity and cell X 2 fluorescence emitted fluorescent protein X 1 is emitted, in the wavelength band R 2, and the fluorescence intensity of the fluorescence fluorescent protein X 1 is emitted it is preferably different from the ratio of the fluorescence intensity of the fluorescence cell X 2 emitted.
  • the fluorescence intensity of the fluorescence emitted by the fluorescent protein X 1 in the sample 12 irradiated with the laser light L 1 is higher than the fluorescence intensity of the autofluorescence emitted by the cell X 2.
  • it is preferably set to correspond to the fluorescent protein X 1.
  • the fluorescence intensity of the autofluorescence emitted from the cell X 2 in the sample 12 irradiated with the laser light L 2 is higher than the fluorescence intensity of the fluorescence emitted from the fluorescent protein X 1.
  • it is preferably set in accordance with autofluorescence.
  • Autofluorescence refers to fluorescence that occurs outside the fluorescent dye that is the subject of fluorescence measurement, which becomes background noise and interferes with fluorescence measurement, and is a broad wavelength emitted by unstained cells. Fluorescence distributed in the band.
  • the photoelectric converters 27a and 27b are light receiving elements that include sensors such as photomultiplier tubes, for example, and convert light received by the photocathode into electrical signals.
  • the received fluorescence is based on excitation of laser light that has undergone intensity modulation at a predetermined frequency, so that the output fluorescence signal is also a signal whose intensity varies at the predetermined frequency. This fluorescence signal is supplied to the control / processing unit 28.
  • the control / processing unit 28 includes a signal generation unit 40, a signal processing unit 42, and a signal control unit 44.
  • the signal generator 40 generates a modulation signal for modulating the intensity of the laser beams L 1 and L 2 at a predetermined frequency.
  • the signal generation unit 40 includes oscillators 46a and 46b, power splitters 48a and 48b, and amplifiers 50a, 50b, 52a, and 52b.
  • the signal generation unit 40 supplies the generated modulation signals to the laser drivers 34 a and 34 b of the laser light source unit 22 and also supplies them to the signal processing unit 42.
  • the reason why the modulation signal is supplied to the signal processing unit 42 is to use it as a reference signal for detecting the fluorescence signal output from the photoelectric converters 27a and 27b, as will be described later.
  • the modulation signal is a signal in which a sine wave signal having a predetermined frequency is placed on a DC component, and is set to a frequency in the range of 10 to 50 MHz.
  • the oscillator 46a and the oscillator 46b oscillate signals having different frequencies f 1 and f 2 and generate modulated signals having different frequencies.
  • the signal processing unit 42 uses the fluorescence signals output from the photoelectric converters 27a and 27b to extract the phase delay information of the fluorescence emitted by the laser light irradiation.
  • the signal processing unit 42 includes amplifiers 54a and 54b, IQ mixers 58a and 58b, and a low-pass filter 62.
  • the amplifiers 54a and 54b amplify the fluorescence signals output from the photoelectric converters 27a and 27b.
  • the IQ mixers 58a and 58b are devices that mix the fluorescence signals supplied from the photoelectric converters 27a and 27b using the modulation signal supplied from the signal generation unit 40 as a reference signal. Specifically, each of the IQ mixers 58a and 58b multiplies the reference signal by the fluorescence signal (RF signal), the I signal including a component in phase with the modulation signal of the fluorescence signal, and the modulation signal of the fluorescence signal. And a Q signal including a component whose phase is shifted by 90 degrees. The I signal including the in-phase component is generated by mixing the modulated signal and the fluorescent signal, and the Q signal including the component shifted by 90 degrees is mixed with the modulated signal shifted by 90 degrees and the fluorescent signal. Is generated by As a result, the fluorescent fluorescent signal excited by the laser light L 2 and received in the wavelength band R 1 is removed, and the fluorescent fluorescent signal excited by the laser light L 1 and received in the wavelength band R 2 is removed.
  • RF signal fluorescence signal
  • the low-pass filter 62 is a part that filters the low-frequency signals of the I signal and the Q signal generated by the IQ mixers 58a and 58b. By this filtration, a component of the fluorescence signal in phase with the modulation signal (Re component) and a component of the fluorescence signal shifted in phase by 90 degrees (Im component) are extracted as fluorescence data. Each extracted component is sent to the signal control unit 44. Since the Re component and the Im component are obtained for each of the wavelength bands R 1 and R 2 set in the photoelectric converters 27a and 27b, the set of the Re component and the Im component of the wavelength band R 1 and the wavelength band R 2 The Re component and Im component set are sent to the signal control unit 44.
  • the frequency down conversion process including the mixing process by the IQ mixers 58a and 58b and the filtering process by the low-pass filter 62 is referred to, and data obtained by this process is referred to as fluorescence data.
  • the signal control unit 44 amplifies the Re component and the Im component of the fluorescence signal sent from the signal processing unit 42, and performs AD conversion.
  • the signal control unit 44 gives instructions for controlling the operation of each part, and manages the system controller 60 that manages all operations of the flow cytometer 10, the Re component generated by the signal processing unit 42, An amplifier 64 that amplifies the Im component and an A / D converter 66 that samples the amplified Re component and Im component are included.
  • the analyzer 80 obtains the phase delay angle of the fluorescence with respect to the laser light from the Re component and the Im component obtained by AD conversion by the signal control unit 44, and further calculates a fluorescence relaxation time constant (fluorescence relaxation time) from the phase delay angle. ) And fluorescence intensity.
  • FIG. 5 is a diagram showing a schematic configuration of the analyzer 80.
  • the analysis device 80 is configured by a computer including a CPU 82 and a memory 84.
  • the analyzer 80 further includes an autofluorescence removal unit 86, a fluorescence intensity calculation unit 90, a phase delay calculation unit 92, and a fluorescence relaxation time calculation unit 94.
  • Each of these parts is a software module that exhibits a function by starting the software on the computer. Of course, these parts can also be constituted by dedicated circuits.
  • the autofluorescence removal unit 86 is a part that uses the Re component and Im component supplied from the signal control unit 44 to remove autofluorescence emitted by the cell X 2 and calculates fluorescence data of the fluorescence emitted by the fluorescent protein X 1. is there.
  • the Re component and Im component supplied to the analyzer 80 are excited by the laser light L 1 , and fluorescence emitted from the fluorescent protein X 1 and autofluorescence emitted from the cell X 2 are received in the wavelength band R 1.
  • the information obtained by receiving light in the wavelength band R 2 , the fluorescence excited by the laser light L 2 and emitted from the fluorescent protein X 1 and the autofluorescence emitted from the cell X 2 including.
  • the analyzer 80 is excited by the laser light L 1 and removes information on autofluorescence emitted by the cell X 2 from the measured fluorescence data in order to calculate information on fluorescence emitted by the fluorescent protein X 1. . Specifically, the analyzer 80 obtains and stores the following four fluorescence data in advance, and uses these fluorescence data to obtain the fluorescence data of the Re component and Im component supplied from the signal control unit 44. The autofluorescence emitted from the cell X 2 is removed from the measured fluorescence data, and the fluorescence data of the fluorescence emitted from the fluorescent protein X 1 is calculated.
  • the fluorescent protein X 1 and the cell X 2 are caused to flow as separate samples to the conduit 30, and the signal processing device 20 causes the fluorescent protein X 1 to emit fluorescence (first fluorescence),
  • the fluorescence (second fluorescence) emitted from the cell X 2 is received in the wavelength band (first wavelength band) R 1 and the wavelength band (second wavelength band) R 2 .
  • the signal processing device 20 performs a mixing process on the fluorescence signal in the wavelength band R 1 and the fluorescence signal in the wavelength band R 2 using the modulation signal of the frequency f 1 and the modulation signal of the frequency f 2 , respectively. That is, frequency down conversion processing is performed.
  • the analyzer 80 obtains four fluorescence data including phase and intensity information. More specifically, the fluorescence data generated by mixing the fluorescence signal obtained by receiving the fluorescence emitted by the fluorescent protein X 1 in the wavelength band R 1 with the modulation signal of the frequency f 1 (third fluorescence data) and a 3. Fluorescence data (fifth fluorescence data) generated by mixing the fluorescence signal obtained by receiving the fluorescence emitted from the fluorescent protein X 1 in the wavelength band R 2 with the modulation signal of the frequency f 2 is A 5 . To do.
  • the fluorescence data (fourth fluorescence data) generated by mixing the fluorescence signal obtained by receiving the fluorescence emitted by the cell X 2 in the wavelength band R 1 with the modulation signal of the frequency f 1 is A 4.
  • Fluorescence data (sixth fluorescence data) generated by mixing the fluorescence signal obtained by receiving the fluorescence emitted by the cell X 2 in the wavelength band R 2 with the modulation signal of the frequency f 2 is A 6 .
  • These fluorescence data A 3 to A 6 are represented by complex numbers including values of Re component and Im component. These complex numbers are stored in the analyzer 80 in advance.
  • the values of the fluorescence data A 3 to A 6 are obtained by flowing the fluorescent protein X 1 and the cell X 2 through the pipe 30 as separate samples.
  • accurate fluorescence data is measured using a filter suitable for each of the fluorescent protein X 1 and the cell X 2 , and this measurement result is corrected using the filter characteristics used in the flow cytometer 10 to obtain fluorescence data.
  • the values A 3 to A 6 may be obtained in advance and stored in the analyzer 80. Moreover, you may perform this measurement using another apparatus.
  • fluorescence data corresponding to the frequency f 1 supplied from the signal control unit 44 that is, fluorescence obtained by performing a mixing process on the modulation signal of the frequency f 1 and representing the Re component and the Im component as complex numbers.
  • P 1 be the data.
  • the fluorescence data, i.e., Re component mixing process is obtained is carried out in the modulation signal of the frequency f 2, the fluorescence data representing Im component a complex number corresponding to the frequency f 2, It is referred to as P 2.
  • fluorescence data P of fluorescence emitted from the fluorescent protein X 1 and from which autofluorescence emitted from the cell X 2 is removed is calculated according to the following formula (1).
  • (A 3 / A 4 ) / ⁇ (A 3 / A 4 ) ⁇ (A 5 / A 6 ) ⁇ is the first constant related to the first fluorescence data P 1
  • (A 3 / A 6 ) / ⁇ (A 3 / A 4 ) ⁇ (A 5 / A 6 ) ⁇ is the second constant related to the second fluorescence data P 2
  • the fluorescence data P is obtained by subtracting the result of multiplying the fluorescence data P 2 by the second constant from the result of multiplying the fluorescence data P 1 by the first constant.
  • the first constant and the second constant are determined from the fluorescence data A 3 to A 6 .
  • the fluorescence data of autofluorescence can be removed using the above equation (1) is based on the following idea.
  • the sample 12 having a configuration in which the fluorescent protein X 1 is attached to the cell X 2 emits autofluorescence in addition to the fluorescence emitted by the fluorescent protein X 1 .
  • the fluorescence signal produced in the wavelength region R 1 the fluorescence data P 1 is generated using a modulation signal of frequency f 1
  • the fluorescence of the fluorescence by the fluorescent protein X 1 data P 1X1 'and cell X 2 This is expressed by addition to autofluorescence fluorescence data P 1X2 ′.
  • the fluorescence signals generated in the wavelength region R 2 is generated using a modulation signal of frequency f 2
  • the cell X 2 and fluorescence of fluorescence data P 2X1 'by the fluorescent protein X 1 It is expressed by addition of autofluorescence fluorescence data P 2X2 ′.
  • the fluorescence intensity varies for each sample 12 that passes through, depending on the passing position in the width direction of the sample 12 that passes through the measurement point where the laser beam L 1 and the laser beam L 2 converge.
  • the sample 12 passing through the measurement point 12 passes through the end portion of the irradiation light (the portion where the intensity of the laser light is reduced), and the other sample 12 that follows is the central portion of the irradiation light (the laser light It passes through the part where the intensity is maximum.
  • the coefficient of variation representing such a variation in the fluorescence intensity is C (0 or more and 1 or less), and the fluorescence data when the sample 12 passes through the central portion of the irradiation light is the fluorescence data P 1X1 ′ and P 1X2 ′, respectively.
  • the fluorescence data are P 1X1 and P 1X2 , the following expressions (2) and (3) are obtained.
  • the fluorescence emitted by the fluorescent protein X 1 is expressed as n ⁇ P 1x1 and n ⁇ P 2x1 on the assumption that a plurality of (n) fluorescent proteins X 1 emit fluorescence per cell X 2 . ing.
  • P 1x1 and P 1x2 in the formula (2) correspond to the above-described fluorescence data A 3 and A 4
  • P 2x1 and P 2x2 in the formula (3) represent the above-described fluorescence data A 5 and A 4, respectively.
  • Corresponds to 6 The values of these fluorescence data A 3 to A 6 are stored in the analyzer 80 in advance. Therefore, C and n can be determined using equations (2) and (3).
  • the expression (1) takes into consideration that the fluorescence intensity varies according to the passage position of the sample 12 passing through the measurement point and the fluorescence emitted by a plurality of fluorescent dyes X 1 for one cell X 2 .
  • autofluorescence can be removed and fluorescence data of fluorescence emitted only by the fluorescent protein X 1 can be calculated.
  • Fluorescence intensity calculation unit 90 calculates the fluorescence data P of the fluorescent protein X 1 calculated by the autofluorescence removing unit 86, by obtaining the absolute value of a complex number, and calculates the fluorescence intensity of the fluorescent protein X 1.
  • the phase lag calculation unit 92 calculates the complex argument (tan ⁇ 1 (Im component of fluorescence data / Re component of fluorescence data)) for the fluorescence data P of the fluorescent protein X 1 calculated by the autofluorescence removal unit 86. Calculated as the phase delay angle ⁇ .
  • f 1 is a frequency used for intensity modulation of the laser light L 1 .
  • the calculated fluorescence intensity, phase delay angle ⁇ , and fluorescence relaxation time ⁇ of the fluorescent protein X 1 are output as result information to a printer or display (not shown).
  • the result information is subjected to statistical processing as a result measured every time the sample 12 passes the measurement point of the pipe 30.
  • the flow cytometer 10 is configured as described above.
  • the flow cytometer 10 has a plurality of wavelengths of laser light L 1 , prepared so that one light absorption is higher than the other light absorption for each of the fluorescent protein X 1 and the cell X 2 .
  • L 2 is intensity-modulated at a plurality of different frequencies (f 1 , f 2 ) and emitted from the light source unit 22 as irradiation light.
  • the light receiving unit 26 having the wavelength bands R 1 and R 2 receives the fluorescence and outputs a fluorescence signal.
  • the wavelength band R 1 the ratio of the fluorescence intensity of the fluorescence fluorescence intensity and cell X 2 fluorescence emitted fluorescent protein X 1 is emitted
  • the wavelength band R 2 the ratio of the fluorescence intensity of the fluorescence fluorescent protein X 1 is emitted it is preferably different from the ratio of the fluorescence intensity of the fluorescence cell X 2 emitted.
  • the fluorescence intensity of one of the fluorescent protein X 1 and the cell X 2 is higher than the fluorescence intensity of the other fluorescence
  • the fluorescence intensity of the one fluorescence is higher.
  • the wavelength bands R 1 and R 2 are preferably set so as to be lower than the fluorescence intensity of the other fluorescence.
  • the control / processing unit 28 mixes each of the output fluorescence signals with a modulation signal that modulates the intensity of the laser beams L 1 and L 2, thereby obtaining fluorescence data including the phase delay angle and the intensity amplitude of the fluorescence signal with respect to the modulation signal. P 1 and P 2 are generated.
  • the analyzer 80 calculates the fluorescence data P from the generated fluorescence data P 1 and P 2 according to the above equation (1).
  • This fluorescence data P is fluorescence data of fluorescence emitted from the fluorescent protein X 1 and is fluorescence data from which autofluorescence emitted from the cell X 2 has been removed. Furthermore, the analyzer 80 uses the fluorescence data P to calculate the fluorescence intensity, the phase delay angle ⁇ , and the fluorescence relaxation time ⁇ of the fluorescence emitted by the fluorescent protein X 1 .
  • the values of the fluorescence data A 3 to A 6 used in equation (1) are stored and held in the analyzer 80. These values are obtained in advance by measuring the fluorescent protein X 1 and the cell X 2 alone or together using the flow cytometer 10.
  • the analyzer 80 can remove the fluorescence data of the autofluorescence emitted from the cell X 2 from the measured fluorescence data before calculating the fluorescence relaxation time ⁇ , so that the calculated fluorescence relaxation time ⁇ is accurate. Becomes higher.
  • the first constant and the second constant used for calculation of fluorescence data are determined by using four fluorescence data obtained by separately measuring the fluorescent dye and the analyte.
  • the measurement object sets the measurement point. It is possible to remove a variation factor that causes the fluorescence data to vary depending on the passing position.

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Abstract

　分析対象物に蛍光色素が付いた測定対象物を用いて蛍光色素の蛍光緩和時間を求めるとき、第１のレーザ光を周波数ｆ1の変調信号で強度変調するとともに、第２のレーザ光を、周波数ｆ1と異なる周波数ｆ2の変調信号で強度変調して、レーザ光を出射する。レーザ光の照射によって発する測定対象物の蛍光を第１の波長帯域で受光して、第１の蛍光信号を得、第２の波長帯域で受光して、第２の蛍光信号を得る。第１の蛍光信号を周波数ｆ1の変調信号とミキシングし、第２の蛍光信号を周波数ｆ2の変調信号とミキシングすることにより、第１の蛍光データＰ1と、第２の蛍光データＰ2を生成する。第１の蛍光データＰ１に第１の定数を乗算した結果から、第２の蛍光データＰ2に第２の定数を乗算した結果を減算することにより得られた蛍光データを用いて蛍光色素の蛍光緩和時間を算出する。

Description

蛍光検出装置及び蛍光検出方法
　本発明は、分析対象物に蛍光色素が付いた測定対象物が、レーザ光の照射を受けることにより発する蛍光の蛍光信号を信号処理する蛍光検出装置および蛍光検出方法に関する。
　医療、生物分野では、フローサイトメータが広く用いられている。このフローサイトメータは、レーザ光を照射することにより測定対象物が発する蛍光をフォトマルチプライヤやアバランシュフォトダイオード等の光電変換器を用いて受光して、細胞や遺伝子等の測定対象物の種類や頻度や特性を分析する。
　具体的には、フローサイトメータは、細胞、ＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素、蛋白等の生体物質等の分析対象物を蛍光試薬でラベル化して測定対象物を作り、圧力を与えて毎秒略１０ｍ以内の速度で管路内を流れるシース液に測定対象物を流してラミナーシースフローを形成する。このフロー中の測定対象物にフローサイトメータがレーザ光を照射することにより、フローサイトメータは、分析対象部に付着した蛍光色素が発する蛍光を受光し、この蛍光をラベルとして識別することで分析対象物を特定する。
　このフローサイトメータは、例えば、細胞内のＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素、蛋白質等の細胞内相対量を計測し、またこれらの働きを短時間で解析することができる。また、フローサイトメータは、所定のタイプの細胞や染色体を蛍光によって判別し、判別した細胞や染色体のみを、セル・ソータ等を用いて、生きた状態で短時間で選別収集する。
　これのフローサイトメータの使用においては、より多くの測定対象物を、短時間に正確に蛍光の情報から特定することが要求されている。
　特開２００６－２２６６９８号公報には、レーザ光の照射による測定対象物に結合された蛍光色素から発せられる蛍光の蛍光寿命（蛍光緩和時間）を算出することにより、多くの測定対象物を、短時間に正確に特定することができる蛍光検出装置および方法が記載されている。
　当該公報によると、蛍光検出装置は、レーザ光を強度変調して測定対象物に照射し、測定対象物からの蛍光の蛍光信号の、レーザ光の強度変調に用いた変調信号に対する位相遅れを求め、この位相遅れから、蛍光緩和時間を算出することが記載されている。
　しかし、測定対象物が発する蛍光は、細胞等の分析対象物に結合した蛍光色素が発する蛍光の他に、細胞等の分析対象物自体が発する自家蛍光を含む。このような自家蛍光の蛍光強度は、蛍光色素の蛍光強度に比べて小さい場合が多いが、受光する蛍光色素の発する蛍光の蛍光強度が小さい場合もある。このような場合、受光される自家蛍光の影響は無視できなくなり、正確な位相遅れの算出、さらには蛍光緩和時間の算出ができない、といった問題がある。
　そこで、本発明は、上記問題点を解決するために、分析対象物に蛍光色素が付いた測定対象物が、レーザ光の照射を受けることにより発する蛍光の蛍光信号を信号処理するとき、精度の高い蛍光緩和時間の算出を行うことのできる蛍光検出装置および蛍光検出方法を提供することを目的とする。
　本発明の一態様は、分析対象物に少なくとも１つの蛍光色素が付いた測定対象物が、レーザ光の照射を受けることにより発する蛍光の蛍光信号を信号処理する蛍光検出装置である。
　当該装置は、
　第１のレーザ光を周波数ｆ1の変調信号で強度変調するとともに、第２のレーザ光を、周波数ｆ1と異なる周波数ｆ2の変調信号で強度変調して、変調した前記第１のレーザ光及び変調した前記第２のレーザ光を出射する光源部と、
　前記第１のレーザ光および前記第２のレーザ光に照射されて発する測定対象物の蛍光を第１の波長帯域で受光して、第１の蛍光信号を出力する第１の受光素子と、前記測定対象物の前記蛍光を前記第１の波長帯域と異なる第２の波長帯域で受光して、第２の蛍光信号を出力する第２の受光素子と、を備える受光部と、
　前記第１の蛍光信号を前記周波数ｆ1の変調信号とミキシングすることにより、位相および強度の情報を含む第１の蛍光データＰ１と、前記第２の蛍光信号を前記周波数ｆ2の変調信号とミキシングすることにより、位相および強度の情報を含む第２の蛍光データＰ2を生成する第１の処理部と、
　前記第１の蛍光データＰ１に第１の定数を乗算した結果から、第２の蛍光データＰ2に第２の定数を乗算した結果を減算することにより得られた蛍光データを用いて前記蛍光色素の蛍光緩和時間を算出する第２の処理部と、を有する。
　本発明の他の態様は、分析対象物に蛍光色素が付いた測定対象物が、レーザ光の照射を受けることにより発する蛍光の蛍光信号を信号処理する蛍光検出方法である。
　当該方法は、
　分析対象物に蛍光色素が付いた測定対象物が、レーザ光の照射を受けることにより発する蛍光の蛍光信号を信号処理する蛍光検出方法であって、
　第１のレーザ光を周波数ｆ1の変調信号で強度変調するとともに、第２のレーザ光を、周波数ｆ1と異なる周波数ｆ2の変調信号で強度変調して、変調した前記第１のレーザ光及び変調した前記第２のレーザ光を出射するステップと、
　前記第１のレーザ光および前記第２のレーザ光に照射されて発する測定対象物の蛍光を第１の波長帯域で受光して、第１の蛍光信号を出力するとともに、前記測定対象物の前記蛍光を前記第１の波長帯域と異なる第２の波長帯域で受光して、第２の蛍光信号を出力するステップと、
　前記第１の蛍光信号を前記周波数ｆ1の変調信号とミキシングすることにより、位相および強度の情報を含む第１の蛍光データＰ１と、前記第２の蛍光信号を前記周波数ｆ2の変調信号とミキシングすることにより、位相および強度の情報を含む第２の蛍光データＰ2を生成するステップと、
　前記第１の蛍光データＰ１に第１の定数を乗算した結果から、第２の蛍光データＰ2に第２の定数を乗算した結果を減算することにより得られた蛍光データを用いて前記蛍光色素の蛍光緩和時間を算出するステップと、を有する。
　上記態様の蛍光検出装置および蛍光検出方法では、測定対象物が、レーザ光の照射を受けることにより発する蛍光の蛍光信号を信号処理するとき、精度の高い蛍光緩和時間の算出が達成される。
本発明の強度変調したレーザ光による蛍光検出装置を用いたフローサイトメータの一例を示す概略構成図である。 図１に示すフローサイトメータに用いる光源部の一例を示す概略構成図である。 図１に示すフローサイトメータに用いる受光部の一例を示す概略構成図である。 図１に示すフローサイトメータに用いる制御・処理部の一例を示す概略構成図である。 図１に示すフローサイトメータに用いる分析装置の一例を示す概略構成図である。
　１０　フローサイトメータ
　１２　試料
　２０　信号処理装置
　２２　レーザ光源部
　２２ａ，２２ｂ　光源
　２３ａ，２６ｂ　ダイクロイックミラー
　２３ｂ．２６ａ　レンズ系
　２４，２６　受光部
　２６ｃ1，２６ｃ2　バンドパスフィルタ
　２７ａ，２７ｂ　光電変換器
　２８　制御・処理部
　３０　管路
　３２　回収容器
　３４ａ，３４ｂ　レーザドライバ
　４０　信号生成部
　４２　信号処理部
　４４　信号制御部
　４６ａ，４６ｂ　発振器
　４８ａ，４８ｂ　パワースプリッタ
　５０ａ，５０ｂ，５２ａ，５２ｂ，５４ａ，５４ｂ，６４　アンプ
　５８ａ，５８ｂ　ＩＱミキサ
　６０　システムコントローラ
　６２　ローパスフィルタ
　６６　Ａ／Ｄ変換器
　８０　分析装置
　８２　ＣＰＵ
　８４　メモリ
　８６　自家蛍光除去部
　８８　蛍光信号補正部
　９０　蛍光強度算出部
　９２　位相遅れ算出部
　９４　蛍光緩和時間算出部
　以下、本発明の強度変調したレーザ光による蛍光検出装置を好適に用いたフローサイトメータを基に詳細に説明する。
　図１は、本発明の強度変調したレーザ光による蛍光検出装置を用いたフローサイトメータ１０の概略構成図である。
　フローサイトメータ１０は、信号処理装置２０と、分析装置（コンピュータ）８０とを有する。信号処理装置２０は、測定対象とする試料１２にレーザ光を照射し、試料１２が発する蛍光の蛍光信号を検出して信号処理をする。分析装置（コンピュータ）８０は、信号処理装置２０で得られた処理結果から蛍光強度や蛍光緩和時間を算出する。試料１２の例として、蛍光蛋白（蛍光色素）Ｘ1を付けた細胞（分析対象物）Ｘ2により構成される測定対象物を用いて以降説明する。本実施形態では、蛍光蛋白以外の蛍光色素を用いることもできる。分析対象物も、細胞以外に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素、蛋白等の生体物質の他、人工的に作製された蛍光を発するマイクロビーズ等を用いることもできる。なお、図１に示す試料１２は、蛍光蛋白Ｘ1が紐等によって細胞Ｘ2に付着した構成であるが、これは模式的に示したものである。試料１２は、例えば、細胞Ｘ2内に蛍光蛋白Ｘ1が進入し、蛍光蛋白Ｘ1が細胞Ｘ2内に取り込まれて分散した構成であってもよい。また、細胞Ｘ2に付着する蛍光蛋白Ｘ1は１つには限定されず、複数であってもよい。
　信号処理装置２０は、レーザ光源部２２と、受光部２４、２６と、制御・処理部２８と、管路３０と、を有する。
　制御・処理部２８は、レーザ光源部２２からのレーザ光を所定の周波数で強度変調させる制御部、及び試料１２が発する蛍光の蛍光信号を処理する信号処理部を含む。管路３０は、高速流を形成するシース液に含ませて試料１２を流してフローを形成する。
　管路３０の出口には、回収容器３２が設けられている。フローサイトメータ１０には、レーザ光の照射により短時間内に試料１２中の所定の細胞等の生体物質を分離するためのセル・ソータを配置して別々の回収容器に分離するように構成することもできる。
　レーザ光源部２２は、波長の異なる２つのレーザ光を出射する部分である。レーザ光は、管路３０中の所定の位置に集束するようにレンズ系が設けられ、この集束位置で試料１２の測定点が形成される。
　図２は、レーザ光源部２２の構成の一例を示す図である。
　レーザ光源部２２は、可視光帯域の波長を有し、強度変調したレーザ光を出射する。
　レーザ光源部２２は、光源２２ａと光源２２ｂを有する。光源２２ａは、蛍光蛋白Ｘ1の光吸収特性（光吸収係数）が細胞（分析対象物）Ｘ2の光吸収特性（光吸収係数）に比べて高い位置にある波長帯域内の波長を有する第１のレーザ光Ｌ1をＣＷ（連続波）レーザ光として出射し、かつこのＣＷレーザ光Ｌ1の強度を所定の周波数ｆ1の変調信号で強度変調しながら出射する。光源２２ｂは、蛍光蛋白Ｘ1の光吸収特性が細胞（分析対象物）Ｘ2の光吸収特性に比べて低い位置にある波長帯域内の波長を有する第２のレーザ光Ｌ2をＣＷ（連続波）レーザ光として出射し、かつこのＣＷレーザ光Ｌ2の強度を所定の周波数ｆ2の変調信号で強度変調しながら出射する。
　さらに、レーザ光源部２２は、ダイクロイックミラー２３ａと、レンズ系２３ｂと、レーザドライバ３４ａおよび３４ｂと、を有する。なお、ダイクロイックミラー２３ａの替わりにハーフミラーを用いることもできる。
　ダイクロイックミラー２３ａは、特定の波長帯域のレーザ光を透過し、他の波長帯域のレーザ光を反射する。レンズ系２３ｂは、レーザ光Ｌ1およびＬ2からなるレーザ光Ｌ1＋Ｌ2を管路３０中の測定点に集束させる。レーザドライバ３４ａおよび３４ｂは、光源２２ａおよび光源２２ｂそれぞれを駆動する。
　これらのレーザ光を出射する光源として例えば半導体レーザが用いられる。レーザ光は、例えば５～１００ｍＷ程度を出力する。
　一方、レーザ光Ｌ1およびＬ2の強度変調に用いる周波数（変調周波数）は、その周期が蛍光緩和時間に比べてやや長く、例えば１０～５０ＭＨｚである。レーザ光Ｌ1およびＬ2の強度変調の周波数は異なる。これは、レーザ光で励起された試料１２が発する蛍光の周波数を互いに異ならせることにより、信号処理装置２０は、受光した蛍光がどのレーザ光の励起に由来するものかを知り、蛍光の情報を分離するためである。
　ダイクロイックミラー２３ａは、レーザ光Ｌ1を透過し、レーザ光Ｌ2を反射するミラーである。この構成によりレーザ光Ｌ1およびＬ2が合成されて、測定点の試料１２を照射する１つの照射光となる。
　光源２２ａ，２２ｂは、レーザ光Ｌ1，Ｌ2が蛍光色素を励起して特定の波長帯域の蛍光を発するように、予め定められた波長帯域で発振する。レーザ光Ｌ1，Ｌ2によって励起される試料１２は管路３０の測定点を通過する際、測定点でレーザ光Ｌ1，Ｌ2の照射を受けて特定の波長で蛍光蛋白Ｘ1が蛍光を発するとともに、細胞Ｘ2も自家蛍光を発する。
　受光部２４は、管路３０を挟んでレーザ光源部２２と対向するように配置されている。受光部２４は、測定点を通過する試料１２によって前方散乱したレーザ光を受光することにより、試料１２が測定点を通過する旨の検出信号を出力する光電変換器を備える。この受光部２４から出力される検出信号は、制御・処理部２８および分析装置８０に供給され、試料１２が管路３０中の測定点を通過するタイミングを知らせるトリガ信号、処理開始のＯＮ信号、ＯＦＦ信号として用いられる。
　一方、受光部２６は、レーザ光源部２２から出射されるレーザ光の出射方向に対して垂直方向であって、かつ管路３０中の試料１２の移動方向に対して垂直方向に配置されており、測定点にて照射された試料１２が発する蛍光を受光する複数の光電変換器を備える。
　図３は、受光部２６の一例の概略の構成を示す概略構成図である。
　図３に示す受光部２６は、試料１２からの蛍光信号を集束させるレンズ系２６ａと、ダイクロイックミラー２６ｂと、バンドパスフィルタ２６ｃ１，２６ｃ２と、光電子増倍管等の光電変換器（受光素子）２７ａ,２７ｂと、を有する。
　レンズ系２６ａは、受光部２６に入射した蛍光を光電変換器２７ａ，２７ｂの受光面に集束させるように構成されている。
　ダイクロイックミラー２６ｂは、所定の範囲の波長帯域の蛍光を反射させて、それ以外は透過させるミラーである。バンドパスフィルタ２６ｃ１，２６ｃ２でフィルタリングして光電変換器２７ａ，２７ｂが所定の波長帯域の蛍光を取り込むように、ダイクロイックミラー２６ｂの反射波長帯域およびバンドパスフィルタ２６ｃ１，２６ｃ２の透過波長帯域が設定されている。
　バンドパスフィルタ２６ｃ１，２６ｃ２は、各光電変換器２７ａ，２７ｂの受光面の前面に設けられ、所定の波長帯域の蛍光のみが透過するフィルタである。透過する蛍光の波長帯域Ｒ1、波長帯域Ｒ2は、蛍光蛋白Ｘ1の発する蛍光と細胞Ｘ2の発する自家蛍光の波長帯域に対応して設定されている。波長帯域は、例えば、光源２２ａから出射した４０８ｎｍのレーザ光Ｌ1の照射によって発する蛍光を主に受光するための４７４ｎｍ～５１４ｎｍの波長帯域Ｒ1である。また、波長帯域は、例えば、光源２２ｂから出射した４５５ｎｍのレーザ光Ｌ2の照射によって発する蛍光を主に受光する５３０ｎｍ～５７０ｎｍの波長帯域Ｒ2である。
　その際、波長帯域Ｒ1における、蛍光蛋白Ｘ1が発する蛍光の蛍光強度と細胞Ｘ2が発する蛍光の蛍光強度の比が、波長帯域Ｒ2における、蛍光蛋白Ｘ1が発する蛍光の蛍光強度と細胞Ｘ2が発する蛍光の蛍光強度の比と異なることが好ましい。
　例えば、波長帯域Ｒ1は、レーザ光Ｌ1で照射された試料１２のうち、蛍光蛋白Ｘ1の発する蛍光の蛍光強度が、細胞Ｘ2が発する自家蛍光の蛍光強度に比べて高くなるように、蛍光蛋白Ｘ1に対応して設定されることが好ましい。そのとき、波長帯域Ｒ2は、レーザ光Ｌ2で照射された試料１２のうち、細胞Ｘ2の発する自家蛍光の蛍光強度が、蛍光蛋白Ｘ1が発する蛍光の蛍光強度に比べて高くなるように、自家蛍光に対応して設定されることが好ましい。自家蛍光とは、蛍光の測定対象となる蛍光色素以外の部分が蛍光を発生し、これが背景ノイズとなって蛍光測定の障害になるものをいい、染色されていない細胞等が自ら発する、広い波長帯域で分布する蛍光をいう。
　光電変換器２７ａ，２７ｂは、例えば光電子増倍管等のセンサを備え、光電面で受光した光を電気信号に変換する受光素子である。ここで、受光する蛍光は、所定の周波数で強度変調を受けたレーザ光の励起により基づくものなので、出力される蛍光信号も所定の周波数で強度が変動する信号となる。この蛍光信号は、制御・処理部２８に供給される。
　制御・処理部２８は、図４に示すように、信号生成部４０と、信号処理部４２と、信号制御部４４と、を有する。
　信号生成部４０は、レーザ光Ｌ1，Ｌ2の強度を所定の周波数で変調するための変調信号を生成する。
　具体的には、信号生成部４０は、発振器４６ａ，４６ｂ、パワースプリッタ４８ａ，４８ｂ及びアンプ５０ａ，５０ｂ，５２ａ，５２ｂを有する。信号生成部４０は、生成される各変調信号を、レーザ光源部２２のレーザドライバ３４ａ，３４ｂに供給するとともに、信号処理部４２に供給する。信号処理部４２に変調信号を供給するのは、後述するように、光電変換器２７ａ，２７ｂから出力される蛍光信号を検波するための参照信号として用いるためである。なお、変調信号は、ＤＣ成分に所定の周波数の正弦波信号が載った信号であり、１０～５０ＭＨｚの範囲の周波数に設定される。発振器４６ａと発振器４６ｂは、互いに異なる周波数ｆ1，ｆ2の信号を発振し、異なる周波数の変調信号を生成する。
　信号処理部４２は、光電変換器２７ａ，２７ｂから出力される蛍光信号を用いて、レーザ光の照射により発する蛍光の位相遅れ情報を抽出する。信号処理部４２は、アンプ５４ａ，５４ｂと、ＩＱミキサ５８ａ、５８ｂと、ローパスフィルタ６２と、を有する。アンプ５４ａ，５４ｂは、光電変換器２７ａ，２７ｂから出力される蛍光信号を増幅する。
　ＩＱミキサ５８ａ，５８ｂは、光電変換器２７ａ，２７ｂから供給される蛍光信号を、信号生成部４０から供給される変調信号を参照信号としてミキシングする装置である。具体的には、ＩＱミキサ５８ａ，５８ｂのそれぞれは、参照信号を蛍光信号（ＲＦ信号）と乗算して、蛍光信号の、変調信号と同相の成分を含むＩ信号と、蛍光信号の、変調信号に対して９０度位相のシフトした成分を含むＱ信号とを生成する。同相の成分を含むＩ信号は、変調信号と蛍光信号をミキシングすることにより生成され、９０度位相のシフトした成分を含むＱ信号は、９０度位相のシフトした変調信号と蛍光信号をミキシングすることにより生成される。これにより、レーザ光Ｌ2で励起され、波長帯域Ｒ1で受光される蛍光の蛍光信号が除去され、レーザ光Ｌ1で励起され、波長帯域Ｒ2で受光される蛍光の蛍光信号が除去される。
　ローパスフィルタ６２は、ＩＱミキサ５８ａ，５８ｂで生成されたＩ信号、Ｑ信号の低周波信号をろ過する部分である。このろ過により、蛍光信号の、変調信号と同相の成分（Ｒｅ成分）と、蛍光信号の、変調信号に対して９０度位相のシフトした成分（Ｉｍ成分）が、蛍光データとして取り出される。取り出された各成分は、信号制御部４４に送られる。Ｒｅ成分およびＩｍ成分は、光電変換器２７ａ，２７ｂに設定された波長帯域Ｒ1および波長帯域Ｒ2毎に得られるので、波長帯域Ｒ1のＲｅ成分およびＩｍ成分の組と、波長帯域Ｒ2のＲｅ成分およびＩｍ成分の組とが信号制御部４４に送られる。以降では、ＩＱミキサ５８ａ，５８ｂによるミキシング処理とローパスフィルタ６２によるフィルタリング処理を含めて周波数ダウン変換処理といい、この処理により得られるデータを蛍光データという。
　信号制御部４４は、信号処理部４２から送られた蛍光信号のＲｅ成分およびＩｍ成分を増幅し、ＡＤ変換を行う。
　具体的には、信号制御部４４は、各部分の動作制御のための指示を与えるとともに、フローサイトメータ１０の全動作を管理するシステムコントローラ６０と、信号処理部４２で生成されたＲｅ成分およびＩｍ成分を増幅するアンプ６４と、増幅されたＲｅ成分およびＩｍ成分をサンプリングするＡ／Ｄ変換器６６と、を有する。
　分析装置８０は、信号制御部４４にてＡＤ変換されて得られるＲｅ成分、Ｉｍ成分から、レーザ光に対する蛍光の位相遅れ角を求め、さらに、この位相遅れ角から蛍光緩和時定数（蛍光緩和時間）及び蛍光強度を求める。図５は、分析装置８０の概略の構成を示す図である。
　分析装置８０は、ＣＰＵ８２およびメモリ８４を備えるコンピュータで構成される。分析装置８０は、さらに、自家蛍光除去部８６と、蛍光強度算出部９０と、位相遅れ算出部９２と、蛍光緩和時間算出部９４とを有する。これらの各部分は、コンピュータ上でソフトウェアを起動させることにより、機能を発揮するソフトウェアモジュールである。勿論、これらの部分を専用回路で構成することもできる。
　自家蛍光除去部８６は、信号制御部４４から供給されたＲｅ成分、Ｉｍ成分を用いて、細胞Ｘ2が発する自家蛍光を除去し、蛍光蛋白Ｘ1の発する蛍光の蛍光データを算出する部分である。
　分析装置８０に供給されるＲｅ成分およびＩｍ成分は、レーザ光Ｌ１で励起されて、蛍光蛋白Ｘ１が発する蛍光と、細胞Ｘ2が発する自家蛍光とが、波長帯域Ｒ１で受光されることにより得られた情報と、レーザ光Ｌ2で励起されて、蛍光蛋白Ｘ１が発する蛍光と、細胞Ｘ2が発する自家蛍光とが、波長帯域Ｒ2で受光されることにより得られた情報を含む。このため、分析装置８０は、レーザ光Ｌ１で励起されて、蛍光蛋白Ｘ１が発する蛍光の情報を算出するために、測定された蛍光データから細胞Ｘ2が発する自家蛍光の情報を除去する。
　具体的には、分析装置８０は、以下の４つの蛍光データを予め求めて記憶しておき、これらの蛍光データを用いて、信号制御部４４から供給されたＲｅ成分、Ｉｍ成分の蛍光データを用いて、細胞Ｘ2が発する自家蛍光を測定された蛍光データから除去し、蛍光蛋白Ｘ1の発する蛍光の蛍光データを算出する。
　すなわち、フローサイトメータ１０において、蛍光蛋白Ｘ1と細胞Ｘ2とが別々の試料として管路３０に流され、信号処理装置２０が、蛍光蛋白Ｘ1の発する蛍光（第１の蛍光）と、細胞Ｘ2の発する蛍光（第２の蛍光）とを、波長帯域（第１の波長帯域）Ｒ1と波長帯域（第２の波長帯域）Ｒ2で受光する。このとき、信号処理装置２０は、波長帯域Ｒ1における蛍光信号と、波長帯域Ｒ2における蛍光信号とを、周波数ｆ1の変調信号と周波数ｆ2の変調信号でそれぞれミキシング処理を行い、フィルタリング処理を行う、すなわち周波数ダウン変換処理を行う。これにより、分析装置８０は、位相および強度の情報を含む４つの蛍光データを得る。
　より具体的に説明すると、蛍光蛋白Ｘ1の発する蛍光を波長帯域Ｒ1で受光して得られる蛍光信号が周波数ｆ1の変調信号でミキシング処理されることにより生成される蛍光データ（第３の蛍光データ）をＡ3とする。蛍光蛋白Ｘ1の発する蛍光を波長帯域Ｒ2で受光して得られる蛍光信号が周波数ｆ2の変調信号でミキシング処理されることにより生成される蛍光データ（第５の蛍光データ）をＡ5とする。さらに、細胞Ｘ2の発する蛍光を波長帯域Ｒ1で受光して得られる蛍光信号が周波数ｆ1の変調信号でミキシング処理されることにより生成される蛍光データ（第４の蛍光データ）をＡ4とする。細胞Ｘ2の発する蛍光を波長帯域Ｒ2で受光して得られる蛍光信号が周波数ｆ2の変調信号でミキシング処理されることにより生成される蛍光データ（第６の蛍光データ）をＡ6とする。これらの蛍光データＡ3～Ａ6は、Ｒｅ成分、Ｉｍ成分の値を含む、複素数で表される。これらの複素数が、分析装置８０に予め記憶されている。
　なお、本実施形態では、蛍光データＡ3～Ａ6の値は、蛍光蛋白Ｘ1と細胞Ｘ2とを別々の試料として管路３０に流して求めたものである。しかし、蛍光蛋白Ｘ1と細胞Ｘ2のそれぞれに適したフィルタを用いて正確な蛍光データの計測を行い、この計測結果を、フローサイトメータ１０に用いるフィルタ特性を用いて補正を行って蛍光データＡ3～Ａ6の値を予め求めて分析装置８０に記憶するようにしてもよい。また、この計測を他の装置を用いて行ってもよい。
　この状態で、信号制御部４４から供給された、周波数ｆ1に対応する蛍光データ、すなわち、周波数ｆ1の変調信号でミキシング処理が行われて得られるＲｅ成分、Ｉｍ成分を複素数で表した蛍光データ、をＰ1とする。一方、信号制御部４４から供給された、周波数ｆ2に対応する蛍光データ、すなわち、周波数ｆ2の変調信号でミキシング処理が行われて得られるＲｅ成分、Ｉｍ成分を複素数で表した蛍光データ、をＰ2とする。
　このとき、蛍光蛋白Ｘ1が発する蛍光であって、細胞Ｘ2が発する自家蛍光が除去された蛍光の蛍光データＰは、下記式（１）に従って算出される。
　Ｐ　＝（Ａ3／Ａ4）／｛（Ａ3／Ａ4）－（Ａ5／Ａ6）｝・Ｐ1
　　　－（Ａ3／Ａ6）／｛（Ａ3／Ａ4）－（Ａ5／Ａ6）｝・Ｐ2　　（１）
　ここで、式（１）中、（Ａ3／Ａ4）／｛（Ａ3／Ａ4）－（Ａ5／Ａ6）｝が第１の蛍光データＰ１に係る第１の定数となり、（Ａ3／Ａ6）／｛（Ａ3／Ａ4）－（Ａ5／Ａ6）｝が第２の蛍光データＰ2に係る第２の定数となっている。このように、蛍光データＰ１に上記第１の定数を乗算した結果から、蛍光データＰ2に第２の定数を乗算した結果を減算することにより蛍光データＰが得られる。なお、第１の定数および前記第２の定数は、蛍光データＡ3～Ａ6から定められる。
　上述の式（１）を用いて自家蛍光の蛍光データを除去できるのは、以下のような考えに基づくものである。
　一般に、細胞Ｘ2に蛍光蛋白Ｘ1が付いた構成の試料１２は、蛍光蛋白Ｘ1の発する蛍光の他に自家蛍光も発する。このため、波長領域Ｒ1で生成される蛍光信号と、周波数ｆ1の変調信号とを用いて生成される蛍光データＰ1は、蛍光蛋白Ｘ1による蛍光の蛍光データＰ1X1’と細胞Ｘ2による自家蛍光の蛍光データＰ1X2’との加算で表される。同様に、波長領域Ｒ2で生成される蛍光信号と、周波数ｆ2の変調信号とを用いて生成される蛍光データＰ2は、蛍光蛋白Ｘ1による蛍光の蛍光データＰ2X1’と細胞Ｘ2による自家蛍光の蛍光データＰ2X2’の加算で表される。
　さらに、レーザ光Ｌ1とレーザ光Ｌ2が収束する測定点を通過する試料１２の幅方向の通過位置に応じて、通過する１つ１つの試料１２毎に、蛍光強度が変動する。例えば、測定点１２を通過する試料１２が照射光の端の部分（レーザ光の強度が低下している部分）を通過し、後続する他の試料１２は、照射光の中央部分（レーザ光の強度が最大となる部分）を通過する。
　このような蛍光強度の変動を表す変動係数をＣ（０以上１以下）とし、試料１２が、照射光の中央部分を通過したときの蛍光データを、蛍光データＰ1X1’，Ｐ1X2’のそれぞれに対応して蛍光データＰ1X1，Ｐ1X2としたとき、下記式（２）、（３）のように表される。なお、蛍光蛋白Ｘ1が発する蛍光は、１つの細胞Ｘ2に対して複数（ｎ個）の蛍光蛋白Ｘ1の蛍光が発することを想定して、ｎ・Ｐ1x1，ｎ・Ｐ2x1と表している。
　Ｐ1＝Ｃ・（ｎ・Ｐ1X1＋Ｐ1X2）　　　　　　（２）
　Ｐ2＝Ｃ・（ｎ・Ｐ2X1＋Ｐ2X2）　　　　　　（３）
　ここで、式（２）中のＰ1x1，Ｐ1x2は、上述した蛍光データＡ3，Ａ4に対応し、式（３）中のＰ2x1，Ｐ2x2は、上述した蛍光データＡ5，Ａ6に対応する。これらの蛍光データＡ3～Ａ6の値は、分析装置８０に予め記憶されている。したがって、式（２）、（３）を用いて、Ｃ，ｎを定めることができる。一方、蛍光データＰ1から算出すべき蛍光蛋白Ｘ1のレーザ光Ｌ1の励起により発する蛍光の蛍光データは、Ｃ・ｎ・Ｐ1x1であるので、このＣ・ｎ・Ｐ1x1を蛍光データＡ3～Ａ6と、Ｐ1，Ｐ2とを用いて表すと、上述した式（１）となる。
　このように、式（１）は、測定点を通過する試料１２の通過位置に応じて蛍光強度が変動することと、１つの細胞Ｘ2に対して複数の蛍光色素Ｘ1が発する蛍光も考慮に入れて、自家蛍光を除去し、蛍光蛋白Ｘ1のみが発する蛍光の蛍光データを算出することができる。
　蛍光強度算出部９０は、自家蛍光除去部８６で算出された蛍光蛋白Ｘ1の蛍光データＰについて、複素数の絶対値を求めることで、蛍光蛋白Ｘ1の蛍光強度を算出する。
　位相遅れ算出部９２は、自家蛍光除去部８６で算出された蛍光蛋白Ｘ1の蛍光データＰについて、複素数の偏角（ｔａｎ-1（蛍光データのＩｍ成分／蛍光データのＲｅ成分)）を、位相遅れ角θとして算出する。
　蛍光緩和時間算出部９４は、位相遅れ算出部９２で算出されたθを用いて、蛍光蛋白Ｘ1の蛍光緩和時間τをτ＝１／（２πｆ1）・ｔａｎ（θ）の式にしたがって算出する。ここで、ｆ1は、レーザ光Ｌ1の強度変調に用いた周波数である。蛍光緩和時間τをτ＝１／（２πｆ1）・ｔａｎ（θ）の式にしたがって算出することができるのは、蛍光現象が、１次の緩和過程に沿った変化を示すからである。
　算出された蛍光蛋白Ｘ1の蛍光強度、位相遅れ角θおよび蛍光緩和時間τは、図示されないプリンタやディスプレイに結果情報として出力される。また、この結果情報は、試料１２が管路３０の測定点を通過する度に測定される結果として、統計処理の対象とされる。
　フローサイトメータ１０は以上のように構成される。
　次に、フローサイトメータ１０で行われる蛍光検出方法について説明する。
　まず、フローサイトメータ１０は、蛍光蛋白Ｘ1および細胞Ｘ2のそれぞれに対して、一方の光吸収が、他方の光吸収に比べて高くなるように用意した複数の波長のレーザ光Ｌ1,Ｌ2を、異なる複数の周波数(ｆ1，ｆ2)で強度変調して、照射光として、光源部２２から出射する。
　次に、波長帯域Ｒ1およびＲ2を有する受光部２６は、蛍光を受光して蛍光信号を出力する。
　このとき、波長帯域Ｒ1における、蛍光蛋白Ｘ1が発する蛍光の蛍光強度と細胞Ｘ2が発する蛍光の蛍光強度の比が、波長帯域Ｒ2における、蛍光蛋白Ｘ1が発する蛍光の蛍光強度と細胞Ｘ2が発する蛍光の蛍光強度の比と異なることが好ましい。例えば、波長帯域Ｒ1において、蛍光蛋白Ｘ1および細胞Ｘ2のうち一方の蛍光の蛍光強度が他の蛍光の蛍光強度に比べて高く、波長帯域Ｒ2において、前記一方の蛍光の蛍光強度が前記他の蛍光の蛍光強度に比べて低くなるように、波長帯域Ｒ1およびＲ2は設定されることが好ましい。
　制御・処理部２８は、出力した蛍光信号のそれぞれを、レーザ光Ｌ1，Ｌ2を強度変調する変調信号とミキシングすることにより、変調信号に対する蛍光信号の位相遅れ角と強度振幅を含む蛍光データＰ1，Ｐ2を生成する。
　分析装置８０は、生成した蛍光データＰ1，Ｐ2から、上記式（１）に従って蛍光データＰを算出する。この蛍光データＰが、蛍光蛋白Ｘ1が発する蛍光の蛍光データであって、細胞Ｘ2が発する自家蛍光が除去された蛍光データである。さらに、分析装置８０は、この蛍光データＰを用いて、蛍光蛋白Ｘ1が発する蛍光の蛍光強度、位相遅れ角θおよび蛍光緩和時間τを算出する。
　なお、式（１）において用いる蛍光データＡ3～Ａ6の値は、分析装置８０に記憶保持されたものである。これらの値は、予め、フローサイトメータ１０を用いて、蛍光蛋白Ｘ1及び細胞Ｘ2を単独あるいは一緒に測定して得られたものである。
　このように、分析装置８０は、蛍光緩和時間τを算出する前、細胞Ｘ2が発する自家蛍光の蛍光データを測定した蛍光データから除去することができるので、算出される蛍光緩和時間τは精度が高くなる。
　本実施形態は、２つの波長の異なるレーザ光を用い、一方のレーザ光は、蛍光色素の吸収特性が他のレーザ光に比べて低いので、分析対象物が発する自家蛍光を除去することができる。このとき、好ましい態様として、蛍光データの算出に用いる第１の定数及び第２の定数は、蛍光色素および分析対象物を別々に測定することにより得られた４つの蛍光データを用いることにより定められる。この場合、第１の定数および第２の定数と、同一のレーザ光の励起条件と同一の受光条件にて得られた蛍光データＰ1，Ｐ2とを用いるので、測定対象物が測定点を通過する通過位置に応じて蛍光データが変動する変動要因を除去することができる。
　以上、本発明の蛍光検出装置および蛍光検出方法について詳細に説明したが、本発明は上記実施形態に限定されず、本発明の主旨を逸脱しない範囲において、種々の改良や変更をしてもよいのはもちろんである。

Claims (12)

  1. 　分析対象物に少なくとも１つの蛍光色素が付いた測定対象物が、レーザ光の照射を受けることにより発する蛍光の蛍光信号を信号処理する蛍光検出装置であって、
    　第１のレーザ光を周波数ｆ1の変調信号で強度変調するとともに、第２のレーザ光を、周波数ｆ1と異なる周波数ｆ2の変調信号で強度変調して、変調した前記第１のレーザ光及び変調した前記第２のレーザ光を出射する光源部と、
    　前記第１のレーザ光および前記第２のレーザ光に照射されて発する測定対象物の蛍光を第１の波長帯域で受光して、第１の蛍光信号を出力する第１の受光素子と、前記測定対象物の前記蛍光を前記第１の波長帯域と異なる第２の波長帯域で受光して、第２の蛍光信号を出力する第２の受光素子と、を備える受光部と、
    　前記第１の蛍光信号を前記周波数ｆ1の変調信号とミキシングすることにより、位相および強度の情報を含む第１の蛍光データＰ１と、前記第２の蛍光信号を前記周波数ｆ2の変調信号とミキシングすることにより、位相および強度の情報を含む第２の蛍光データＰ2を生成する第１の処理部と、
    　前記第１の蛍光データＰ１に第１の定数を乗算した結果から、第２の蛍光データＰ2に第２の定数を乗算した結果を減算することにより得られた蛍光データを用いて前記蛍光色素の蛍光緩和時間を算出する第２の処理部と、を有することを特徴とする蛍光検出装置。
  2. 　前記第１のレーザ光は、前記蛍光色素の光吸収特性が前記分析対象物の光吸収特性に比べて高い波長帯域内の波長を有し、前記第２のレーザ光は、前記蛍光色素の光吸収特性が前記分析対象物の光吸収特性に比べて低い波長帯域内の波長を有する、請求項１に記載の蛍光検出装置。
  3. 　前記第１の波長帯域における、前記蛍光色素が発する蛍光の蛍光強度と前記分析対象物が発する蛍光の蛍光強度の比が、前記第２の波長帯域における、前記蛍光色素が発する蛍光の蛍光強度と前記分析対象物が発する蛍光の蛍光強度の比と異なる、請求項１または２に記載の蛍光検出装置。
  4. 　前記第２の処理部は、前記蛍光色素の発する第１の蛍光と、前記分析対象物の発する第２の蛍光とを別々に前記第１の波長帯域で受光して得られる２つの蛍光信号を、前記周波数ｆ1の変調信号とミキシングすることにより生成される、位相および強度の情報を含む２つの蛍光データＡ3,Ａ4を予め記憶するとともに、さらに、前記蛍光色素の発する前記第１の蛍光と、前記分析対象物の発する前記第２の蛍光とを別々に前記第２の波長帯域で受光して得られる２つの蛍光信号を、前記周波数ｆ2の変調信号とミキシングすることにより、位相および強度の情報を含む２つの蛍光データＡ5,Ａ6を予め記憶しており、
    　前記蛍光緩和時間を算出するとき、記憶している前記蛍光データＡ3,Ａ4，Ａ5,Ａ6を用いて、前記第１の定数および前記第２の定数を定める、請求項１～３のいずれか１項に記載の蛍光検出装置。
  5. 　前記第２の処理部は、前記蛍光データＡ3,Ａ4，Ａ5,Ａ6を用いて下記式に従って算出される蛍光データＰを用いて蛍光緩和時間を算出する、請求項２に記載の蛍光検出装置。
    　Ｐ　＝（Ａ3／Ａ4）／｛（Ａ3／Ａ4）－（Ａ5／Ａ6）｝・Ｐ1
    　　　－（Ａ3／Ａ6）／｛（Ａ3／Ａ4）－（Ａ5／Ａ6）｝・Ｐ2
  6. 　前記測定対象物の蛍光は、前記蛍光色素が発する蛍光と、前記分析対象物自体が発する自家蛍光を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の蛍光検出装置。
  7. 　前記分析対象物は生体物質である、請求項６に記載の蛍光検出装置。
  8. 　分析対象物に蛍光色素が付いた測定対象物が、レーザ光の照射を受けることにより発する蛍光の蛍光信号を信号処理する蛍光検出方法であって、
    　第１のレーザ光を周波数ｆ1の変調信号で強度変調するとともに、第２のレーザ光を、周波数ｆ1と異なる周波数ｆ2の変調信号で強度変調して、変調した前記第１のレーザ光及び変調した前記第２のレーザ光を出射するステップと、
    　前記第１のレーザ光および前記第２のレーザ光に照射されて発する測定対象物の蛍光を第１の波長帯域で受光して、第１の蛍光信号を出力するとともに、前記測定対象物の前記蛍光を前記第１の波長帯域と異なる第２の波長帯域で受光して、第２の蛍光信号を出力するステップと、
    　前記第１の蛍光信号を前記周波数ｆ1の変調信号とミキシングすることにより、位相および強度の情報を含む第１の蛍光データＰ１と、前記第２の蛍光信号を前記周波数ｆ2の変調信号とミキシングすることにより、位相および強度の情報を含む第２の蛍光データＰ2を生成するステップと、
    　前記第１の蛍光データＰ１に第１の定数を乗算した結果から、第２の蛍光データＰ2に第２の定数を乗算した結果を減算することにより得られた蛍光データを用いて前記蛍光色素の蛍光緩和時間を算出するステップと、を有することを特徴とする蛍光検出方法。
  9. 　前記第１のレーザ光は、前記蛍光色素の光吸収特性が前記分析対象物の光吸収特性に比べて高い波長帯域内の波長を有し、前記第２のレーザ光は、前記蛍光色素の光吸収特性が前記分析対象物の光吸収特性に比べて低い波長帯域内の波長を有する、請求項８に記載の蛍光検出方法。
  10. 　前記第１の波長帯域における、前記蛍光色素が発する蛍光の蛍光強度と前記分析対象物が発する蛍光の蛍光強度の比が、前記第２の波長帯域における、前記蛍光色素が発する蛍光の蛍光強度と前記分析対象物が発する蛍光の蛍光強度の比と異なる、請求項８または９に記載の蛍光検出方法。
  11. 　前記第１の定数及び前記第２の定数は、予め得られた４つの蛍光データを用いて定められ、
    　前記蛍光検出方法は、前記４つの蛍光データを得るためのステップを有し、
    　前記４つの蛍光データを得るためのステップは、
    　前記蛍光色素の発する第１の蛍光と、前記分析対象物の発する第２の蛍光とを別々に前記第１の波長帯域で受光して得られる２つの蛍光信号を、前記周波数ｆ1の変調信号とミキシングすることにより、位相および強度の情報を含む２つの蛍光データＡ3,Ａ4を求めて記憶するステップと、
    　前記蛍光色素の発する前記第１の蛍光と、前記分析対象物の発する前記第２の蛍光とを別々に前記第２の波長帯域で受光して得られる２つの蛍光信号を、前記周波数ｆ2の変調信号とミキシングすることにより、位相および強度の情報を含む２つの蛍光データＡ5,Ａ6を求めて記憶するステップと、を含む、請求項８～１０のいずれか１項に記載の蛍光検出方法。
  12. 　前記第２の処理部は、前記蛍光データＡ3,Ａ4，Ａ5,Ａ6を用いて下記式に従って算出される蛍光データＰを用いて蛍光緩和時間を算出する、請求項１１に記載の蛍光検出方法。
    　Ｐ　＝（Ａ3／Ａ4）／｛（Ａ3／Ａ4）－（Ａ5／Ａ6）｝・Ｐ1
    　　　－（Ａ3／Ａ6）／｛（Ａ3／Ａ4）－（Ａ5／Ａ6）｝・Ｐ2
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