WO2010076349A2 - Procedimiento para la obtención de células madre mesenquimales a partir de la fracción mononuclear de la médula ósea humana - Google Patents

Procedimiento para la obtención de células madre mesenquimales a partir de la fracción mononuclear de la médula ósea humana Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a process for obtaining mesenchymal stem cells. More specifically, the present invention relates to a method of obtaining mesenchymal stem cells from the mononuclear fraction of human bone marrow cells. Said method comprises the stages of obtaining said bone marrow mononuclear fraction, the stage of recovery and pre-expansion of the mesenchymal stem cells, and the stage of expansion of the mesenchymal stem cells until obtaining the necessary clinical dose for its possible Therapeutic use.
  • CMM Mesenchymal stem cells
  • the bone marrow mononuclear fraction (CMN) is obtained by a separation operation based on the centrifugation of blood from the bone marrow.
  • CMN is a heterogeneous set of cells, among which, in addition to mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells can be found. These two populations are in a very low concentration with respect to mature hematopoietic cells, also present in CMN.
  • Fridenshtein et al. (Fridenshtein AJ, Deriglazova UF, Kulagina NN et al. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. Exp. Hematol. 1974 VoI. 2. P. 83-92) obtained for the first time mesenchymal stem cells from bone marrow, based on the ability of mesenchymal stem cells to adhere to plastic surfaces, property that most hematopoietic cells do not possess.
  • the disadvantage of this method is the low yield obtained in the recovery of mesenchymal cells attributable to the low prevalence of this cell type in the bone marrow, which is estimated between 0.001 to 0.01% (Alhadlag A and Mao J. Mesenchymal Stem Cells: Isolation and Therapeutics, Stem Cells and Development 2004. 13: 436-448 (3)
  • adherence to plastics has been established as a starting point to continue improving the methods of obtaining mesenchymal stem cells.
  • Another disadvantage of this method is that to obtain sufficient amounts of mesenchymal stem cells for clinical use, the cells must be cultured between 4 and 6 weeks, and even in some circumstances, such as in patients with diseases of bone metabolism, time Cultivation may be higher.
  • the reason why these high culture times are needed, as mentioned above, is the small amount of mesenchymal cells that can be obtained from the bone marrow.
  • a long period of cell culture can increase the risk of contamination and significantly increases the maintenance costs of the culture.
  • the number of duplications increases, there is a risk that the cells lose multipotentiality or enter senescence, which compromises their therapeutic capacity.
  • the methodology commonly used to find a decrease in the culture times of mesenchymal cells focuses on factors such as supplements of the culture medium, the type of plastic surface, the sowing dose and the culture media used (Sotiropolou PA, Pérez SA, Salagianni M, Baxevanis CN, Papamichail M. Characterization of the optimal culture conditions for clinical scale production of human mesenchymal stem cells. Stem Cells 2006; 24: 462-471).
  • An objective of the present invention is to give Knowing a method of ex vivo culture of mesenchymal stem cells from human bone marrow in which the time and number of duplications necessary for obtaining the clinical dose of mesenchymal stem cells is reduced, when compared to traditional methods.
  • This procedure is based on the synergistic effect from combining very specific conditions of isolation of mesenchymal cells from the mononuclear fraction of bone marrow, with the use of human serum from blood group AB as a supplement to the culture medium. This is used instead of expensive and poorly reproducible fetal bovine serum.
  • human AB serum has the advantages of being cheaper and having greater reproducibility than fetal bovine serum.
  • the proposed isolation conditions facilitate the recovery of a greater number of mesenchymal cells of the mononuclear fraction with respect to the conditions used in conventional strategies. This fact is of special relevance if one takes into account that the higher the initial number of available isolated mesenchymal cells, the less time and resources required to obtain the required clinical dose.
  • Another objective of the present invention is to provide a method that allows for an identical backup of the stem cells.
  • mesenchymal which have the same characteristics of the initial mesenchymal stem cells in terms of proliferation and differentiation capacity.
  • the method of the present invention can be applied to obtain mesenchymal cells from other sources, such as adipose tissue, pancreas, liver, skeletal muscle, dermis, synovial membrane, trabecular bone, umbilical cord blood, lung tissue, dental pulp and periodontal ligament.
  • sources such as adipose tissue, pancreas, liver, skeletal muscle, dermis, synovial membrane, trabecular bone, umbilical cord blood, lung tissue, dental pulp and periodontal ligament.
  • the initial treatment of the sample will be different, adapting for each cell type that is used as the source.
  • an objective of the present invention is to provide a method for obtaining mesenchymal stem cells from the human bone marrow mononuclear fraction, obtained by density gradient centrifugation, characterized in that it comprises stages of: a) Recovery and pre-expansion of mesenchymal stem cells, through a primary culture, in which the bone marrow mononuclear cells are sown in DMEM culture medium supplemented with human AB serum (10%) following the following scheme of culture:
  • trypsinization of the primary culture is performed at 12 days. These cells are conditioned for transfer to the operating room.
  • the culture medium used, both in primary and secondary culture is Dulbecco's Modified Eagle (DMEM) with a 10% human serum AB (v / v) supplement.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle
  • the process of the present invention is advantageous in that it is possible to obtain a high number of mesenchymal stem cells, between 40.10 6 and 50.10 6 , with a reduced number of duplications, between 6 and 8, and a time interval (around 20 days) less than in traditional processes.
  • an additional advantage is that it is achieved, by freezing the mesenchymal stem cells obtained in the secondary culture (step (b)), generating the required dose of cells in case of loss of the process due to accidental causes or having a copy Identical safety mesenchymal stem cells.
  • the process of the present invention also has the additional advantages of simple handling and reduced costs, as extensive culture is not required, nor is fetal bovine serum used.
  • bone marrow mononuclear cells were inoculated per square centimeter, obtained by centrifugation gradient of a bone marrow blood sample, in a 636 cm 2 commercial culture flask, containing DMEM medium supplemented with human AB serum
  • the cells were cultured for 8 days, in which two changes of medium (days 3 and 6) were performed, using DMEM medium supplemented with human AB serum (10%) with a culture area / volume ratio of medium (3/1 ).
  • Non-adhered cells in the primary culture which were seeded in a secondary culture (step (b)), were washed 5 days after the start of the secondary culture (step (b)) and the wash was discarded.
  • the culture medium was changed and culture medium (DMEM supplemented with human AB serum (10%)) with a culture area / volume ratio of medium (3/1) was added.
  • DMEM supplemented with human AB serum (10%) with a culture area / volume ratio of medium (3/1) was added.
  • After 12 days a trypsinization of the culture was performed and between 3,10 6 and 6,10 6 mesenchymal stem cells were obtained with a purity of about 65%.
  • the cells obtained were frozen in nitrogen tanks.
  • the cells obtained in the primary culture showed an immunophenotypic profile with co-expression of markers 105, 90, 73 and lack of expression of the markers CD45, CD31, HLA-DR, usually associated with mesenchymal stem cells from bone marrow. In addition, the cells obtained showed differentiation capacity towards the bone lineage, a fact that puts I manifest the maintenance of multipotential capacity.
  • the cells obtained in the secondary culture showed an immunophenotypic profile with co-expression of markers 105, 90, 73 and lack of expression of markers CD45, CD31, HLA-DR, usually associated to mesenchymal stem cells from bone marrow. In addition, the cells obtained showed differentiation capacity towards the bone and adipose lineage, thus maintaining their multipotential capacity.

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Abstract

La presente invención se refiere a un procedimiento de obtención de células madre mesenquimales a partir de la fracción mononuclear de células de médula ósea humana que utiliza como suplemento suero humano del tipo AB. Dicho procedimiento comprende las etapas de obtención de dicha fracción mononuclear de médula ósea, la etapa de recuperación y pre-expansión de las células madre mesenquimales, y la etapa de expansión de las células madres mesenquimales hasta la obtención de la dosis clínica necesaria para su uso terapéutico.

Description

PROCEDIMIENTO PARA LA OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE MESENQUIMALES A PARTIR DE LA FRACCIÓN
MONONUCLEAR DE LA MÉDULA ÓSEA HUMANA
DESCRIPCIÓN
La presente invención se refiere a un procedimiento para la obtención de células madre mesenquimales . Más específicamente, la presente invención se refiere a un procedimiento de obtención de células madre mesenquimales a partir de la fracción mononuclear de células de médula ósea humana. Dicho procedimiento comprende las etapas de obtención de dicha fracción mononuclear de médula ósea, la etapa de recuperación y pre-expansión de las células madre mesenquimales, y la etapa de expansión de las células madres mesenquimales hasta la obtención de la dosis clínica necesaria para su posible uso terapéutico.
Las células madre mesenquimales (CMM) son células multipotentes, que han mostrado su eficacia en el tratamiento de lesiones musculoesqueléticas y en el mejoramiento de la función cardiaca en enfermedades cardiovasculares (Le Blanc K., Pittenger M. Mesenchymal stem cells: progress toward promise. Cytotherapy 2005; 7 : 36-45) . Las CMM pueden ser aisladas de varios tejidos de adultos, entre los que se encuentran la médula ósea, tejido adiposo y sangre del cordón umbilical. Además, dichas células pueden ser expandidas ex vivo.
La fracción de mononuclear médula ósea (CMN) se obtiene mediante una operación de separación basada en la centrifugación de sangre proveniente de la médula ósea. La CMN es un conjunto heterogéneo de células, entre las que se pueden encontrar, además de las células madre mesenquimales, las células hematopoyéticas progenituras. Estas dos poblaciones se encuentran en una concentración muy baja respecto a las células hematopoyéticas maduras, también presentes en las CMN.
Fridenshtein y otros (Fridenshtein A. J., Deriglazova U. F., Kulagina N. N. et al. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. Exp. Hematol. 1974 VoI. 2. P. 83-92) obtuvieron por primera vez células madre mesenquimales a partir de médula ósea, basándose en la capacidad de las células madre mesenquimales para adherirse a superficies plásticas, propiedad que no poseen la mayoría de las células hematopoyéticas. La desventaja de este método es el bajo rendimiento obtenido en la recuperación de células mesenquimales atribuible a la baja prevalencia de este tipo celular en la médula ósea, que se estima entre el 0,001 al 0,01% (Alhadlag A and Mao J. Mesenchymal Stem Cells: Isolation and Therapeutics . Stem Cells and Development. 2004. 13: 436-448 (3) . Sin embargo, la adhesión a plásticos se ha establecido como punto de partida para seguir mejorando los métodos de obtención de células madre mesenquimales.
Heynesworth y otros han logrado obtener células madre mesenquimales con una alta capacidad de adherencia, elevada tasa de proliferación y el mantenimiento de la multipotencialidad durante un periodo de tiempo largo
(Heynesworth S. E., Goshima J., Goldberg V. M., Calpián A.
I. Characterization of cells with osteogenic potential from the human bone marrow//Bone . 1995. VoI. 13. P. 81- 85.) utilizando suero fetal bovino como suplemento del medio de cultivo. La desventaja de este método consiste en que el hecho de que la búsqueda de un lote adecuado para el cultivo de las células y el análisis correspondiente del suero fetal bovino conlleva mucho tiempo y es muy trabajoso. Además, debido a la gran variación lote a lote que presenta el suero fetal bovino, no es posible garantizar la reproducibilidad de los resultados.
Otra desventaja de este método es que para obtener las cantidades suficientes de células madres mesenquimales para su uso clínico, las células deben ser cultivadas entre 4 y 6 semanas, e incluso en algunas circunstancias, tales como en pacientes con enfermedades del metabolismo óseo, el tiempo de cultivo puede ser superior. La razón por la que se necesitan estos tiempos tan elevados de cultivo, como se ha mencionado anteriormente, es la poca cantidad de células mesenquimales que es posible obtener de la médula ósea.
Un periodo largo de cultivo celular puede aumentar el riesgo de contaminación y aumenta considerablemente los costes de mantenimiento del cultivo. Además, a medida que aumenta el número de duplicaciones se corre el riesgo de que las células pierdan multipotencialidad o entren en senescencia, lo que compromete su capacidad terapéutica.
La metodología utilizada habitualmente para buscar una disminución de los tiempos de cultivo de células mesenquimales centra su atención en factores tales como los suplementos del medio de cultivo, el tipo de superficie plástica, la dosis de siembra y los medios de cultivo empleados (Sotiropolou PA, Pérez SA, Salagianni M, Baxevanis CN, Papamichail M. Characterization of the optimal culture conditions for clinical scale production of human mesenchymal stem cells. Stem Cells 2006; 24: 462- 471) .
Un objetivo de la presente invención es dar a conocer un procedimiento de cultivo ex vivo de células madre mesenquimales a partir de médula ósea humana en el que se reduce el tiempo y el número de duplicaciones necesarias para la obtención de la dosis clínica de células madres mesenquimales, cuando se compara con los métodos tradicionales. Este procedimiento se basa en el efecto sinérgico a partir de combinar unas condiciones muy especificas de aislamiento de células mesenquimales a partir de la fracción mononuclear de médula ósea, con la utilización de suero humano del grupo sanguíneo AB como suplemento del medio de cultivo. Este se usa en sustitución de costoso y poco reproducible suero fetal bovino. Además, el suero AB humano presenta las ventajas de ser más económico y tener mayor reproducibilidad que el suero fetal bovino. A su vez, las condiciones de aislamiento propuestas facilitan la recuperación de un mayor número de células mesenquimales de la fracción mononuclear con respecto a las condiciones utilizadas en las estrategias convencionales. Este hecho es de especial relevancia si se tiene en cuenta que cuando más elevado sea el número inicial de células mesenquimales aisladas disponibles menor es el tiempo y recursos necesarios para la obtención de la dosis clínica requerida.
Dichas condiciones de aislamiento se han obtenido mediante el estudio sistemático de la influencia sobre la recuperación de células mesenquimales a partir del inoculo y el tiempo de lavado de las células mononucleares de médula ósea en medios de cultivo suplementados con suero humano AB . Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un procedimiento que permita disponer de una copia idéntica de seguridad de las células madres mesenquimales, que poseen las mismas características de las células madre mesenquimales iniciales en cuanto a capacidad de proliferación y diferenciación.
El procedimiento de la presente invención puede ser aplicado para la obtención de células mesenquimales provenientes de otras fuentes, tales como tejido adiposo, páncreas, higado, músculo esquelético, dermis, membrana sinovial, hueso trabecular, sangre de cordón umbilical, tejido pulmonar, pulpa dental y ligamento periodontal. En el caso que la fuente de células mesenquimales sea diferente a la médula ósea, el tratamiento inicial de la muestra será diferente, adecuándose para cada tipo celular que se utilice como fuente.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En consecuencia, un objetivo de la presente invención es dar a conocer un procedimiento para la obtención de células madre mesenquimales a partir de la fracción mononuclear de médula ósea humana, obtenida mediante centrifugación en gradiente de densidad, caracterizado porque comprende las etapas de: a) Recuperación y pre expansión de las células madre mesenquimales, mediante un cultivo primario, en el que las células mononucleares de médula ósea se siembran en medio de cultivo DMEM suplementado con suero AB humano (10%) siguiendo el siguiente esquema de cultivo:
- las células mononucleares del cultivo se lavan en el dia 5 con solución salina y se añade medio de cultivo suplementado con suero humano AB (10%) . - se recambia el medio de cultivo a los 9 dias por el mismo medio anteriormente mencionado
- se realiza una tripsinización del cultivo primario a los 12 dias . Estas células generan el cultivo de expansión (c) . b) Cultivo secundario: resiembra de las células mononucleares lavadas en (a) en medio de cultivo suplementado con suero AB humano (10%) siguiendo el siguiente esquema de cultivo:
- el cultivo se lava en el dia 5 con solución salina y se añade medio de cultivo suplementado con suero humano AB (10%) . - se recambia el medio de cultivo por el mismo medio anteriormente mencionado el dia 9. se realiza una tripsinización del cultivo primario a los 12 dias. Se recuperan las células madre mesenquimales que son congeladas y almacenada en depósitos de nitrógeno. c) Cultivo de expansión: expansión de las células mesenquimales asiladas en (a) a los 12 dias. Se resiembran y expanden estas células en medio de cultivo suplementado con suero AB humano (10%) siguiendo el siguiente esquema de cultivo:
- se recambia el medio de cultivo a los 3 y 6 dias por el mismo medio anteriormente mencionado.
- se realiza una tripsinización del cultivo primario a los 12 dias. Estas células se acondicionan para su traslado a quirófano.
En una realización preferente en el cultivo primario se siembran entre 200 000 y 400 000 células por centímetro cuadrado de superficie. Además, preferentemente el medio de cultivo utilizado, tanto en el cultivo primario como en el secundario (etapa b) , es Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con un suplemento de suero AB humano al 10% (v/v) . El procedimiento de la presente invención es ventajoso en cuanto a que se logra obtener un elevado número de células madre mesenquimales, entre 40.106 y 50.106, con un número reducido de duplicaciones, entre 6 y 8, y un intervalo de tiempo (alrededor de 20 dias) menor que en los procesos tradicionales.
Además, una ventaja adicional es que se logra, mediante la congelación de las células madre mesenquimales obtenidas en el cultivo secundario (etapa (b) ) , generar la dosis requerida de células en caso de pérdida del proceso por causas accidentales o de poseer una copia idéntica de seguridad células madre mesenquimales.
El procedimiento de la presente invención también posee las ventajas adicionales de una manipulación sencilla y costes reducidos, al no necesitarse un cultivo extensivo, ni utilizarse suero fetal bovino.
La presente invención es descrita en lo adelante en más detalle en referencia a un ejemplo. Este ejemplo, sin embargo, no está destinado a limitar el alcance técnico de la presente invención. EJEMPLO 1
Se inocularon 300 000 células mononucleares de médula ósea por centímetro cuadrado, obtenidas mediante gradiente de centrifugación de una extracción de sangre de médula ósea, en un frasco de cultivo comercial de 636 cm2, que contenia medio DMEM suplementado con suero AB humano
(10%) . A los 5 dias se lavó el cultivo y el sobrenadante se resembró en un segundo frasco de cultivo comercial de
636 cm2, que contenia medio DMEM suplementado con suero AB humano (10%) . Al cultivo primario se le añadió medio de cultivo (DMEM suplementado con suero AB humano (10%) ) con una relación área de cultivo/volumen de medio (3/1) . A los 9 días se cambió el medio de cultivo y se añadió medio de cultivo (DMEM suplementado con suero AB humano (10%)) con una relación área de cultivo/volumen de medio (3/1) . A los 12 días se realizó una tripsinización del cultivo y se obtuvieron entre 15.106 y 20.106 células madre mesenquimales con una pureza de alrededor de 80%. Estas células se sembraron en dos frascos de cultivo comercial de 636 cm2, que contenían medio DMEM suplementado con suero AB humano (10%), con una densidad de 4000 células/cm2. Se cultivaron las células durante 8 días, en los que se realizó dos recambios de medio (días 3 y 6) , empleando medio DMEM suplementado con suero AB humano (10%) con una relación área de cultivo/volumen de medio (3/1) . Las células no adheridas en el cultivo primario, que fueron sembradas en un cultivo secundario (etapa (b) ) , fuero lavadas a los 5 días desde el inicio del cultivo secundario (etapa (b) ) y el lavado fue desechado. El día 9 se cambió el medio de cultivo y se añadió medio de cultivo (DMEM suplementado con suero AB humano (10%)) con una relación área de cultivo/volumen de medio (3/1) . A los 12 días se realizó una tripsinización del cultivo y se obtuvieron entre 3.106 y 6.106 células madre mesenquimales con una pureza de alrededor de 65%. Las células obtenidas fueron congeladas en tanques de nitrógeno.
Las células obtenidas en el cultivo primario mostraron un perfil inmunofenotípico con co-expresión de los marcadores 105, 90, 73 y falta de expresión de los marcadores CD45, CD31, HLA-DR, asociados habitualmente a las células madre mesenquimales provenientes de médula ósea. Además, las células obtenidas mostraron capacidad de diferenciación hacia el linaje óseo, hecho que pone de manifiesto el mantenimiento de la capacidad multipotencial . Por otro lado, las células obtenidas en el cultivo secundario (etapa (b) ) mostraron un perfil inmunofenotipico con co-expresión de los marcadores 105, 90, 73 y falta de expresión de los marcadores CD45, CD31, HLA-DR, asociados habitualmente a las células madre mesenquimales provenientes de médula ósea. Además, las células obtenidas mostraron capacidad de diferenciación hacia el linaje óseo y adiposo, manteniendo, por lo tanto, su capacidad multipotencial.
Si bien la invención se ha descrito con respecto a ejemplos de realizaciones preferentes, éstos no se deben considerar limitativos de la invención, que se definirá por la interpretación más amplia de las siguientes reivindicaciones.

Claims

REIVINDICACIONES
1.- Procedimiento para la obtención de células madre mesenquimales a partir de la fracción mononuclear de médula ósea humana obtenida mediante centrifugación en gradiente de densidad, caracterizado porque comprende las etapas de: a) Recuperación y pre expansión de las células madre mesenquimales, mediante un cultivo primario, en el que las células mononucleares de médula ósea se siembran en medio de cultivo DMEM suplementado con suero AB humano
(10%) siguiendo el siguiente esquema de cultivo: i. las células mononucleares del cultivo se lavan en el dia 5 con solución salina y se añade medio de cultivo suplementado con suero humano AB (10%) . ii. se recambia el medio de cultivo a los 9 dias por el mismo medio anteriormente mencionado iii. se realiza una tripsinización del cultivo primario a los 12 dias. Estas células generan el cultivo de expansión (c) . b) Cultivo secundario: resiembra de las células mononucleares lavadas en (a) en medio de cultivo suplementado con suero AB humano (10%) siguiendo el siguiente esquema de cultivo: iv. el cultivo se lava en el dia 5 con solución salina y se añade medio de cultivo suplementado con suero humano AB (10%) . v. se recambia el medio de cultivo por el mismo medio anteriormente mencionado el dia 9. vi. se realiza una tripsinización del cultivo primario a los 12 dias. Se recuperan las células madre mesenquimales que son congeladas y almacenada en depósitos de nitrógeno. c) Cultivo de expansión: expansión de las células mesenquimales asiladas en (a) a los 12 dias. Se resiembran y expanden estas células en medio de cultivo suplementado con suero AB humano (10%) siguiendo el siguiente esquema de cultivo: vii. se recambia el medio de cultivo a los 3 y 6 dias por el mismo medio anteriormente mencionado. viii. se realiza una tripsinización del cultivo primario a los 12 dias. Estas células se acondicionan para su traslado a quirófano.
2.- Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la cantidad de células mononucleares de médula ósea inoculadas en la etapa (a) es de entre 200 000 y 400 000 células por centímetro cuadrado de superficie.
3.- Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la cantidad de células madre mesenquimales inoculadas en la etapa (b) es de entre 3 000 y 5 000 células por centímetro cuadrado de superficie.
4.- Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que en el cultivo primario de la etapa (a) se obtienen entre 15.106 y 20.106 células madre mesenquimales.
5.- Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que en el cultivo secundario (etapa (b) ) se obtienen entre 3.106 y 6.106 células madre mesenquimales.
6.- Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la pureza de las células madre mesenquimales obtenidas en el cultivo primario de la etapa (a) es de 80%.
7.- Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la pureza de las células madre .mesenquimales obtenidas en el cultivo secundario (etapa (b) ) es de 65%.
8.- Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que en la etapa (c) se obtienen entre 40.106 y 50.106 de células madre mesenquimales .
9.- Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el número de duplicaciones celulares se encuentra entre 6 y 8.
10.- Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el tiempo total de obtención de las células madre mesenquimales no sobrepasa los 21 dias.
11.- Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el cultivo secundario (etapa (b) ) se congela y se mantiene como copia de seguridad.
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