WO2010072630A1 - Medizinische verwendung des ribosomalen proteins s19 (rps19) - Google Patents

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WO2010072630A1
WO2010072630A1 PCT/EP2009/067265 EP2009067265W WO2010072630A1 WO 2010072630 A1 WO2010072630 A1 WO 2010072630A1 EP 2009067265 W EP2009067265 W EP 2009067265W WO 2010072630 A1 WO2010072630 A1 WO 2010072630A1
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rps19
protein
rps
diseases
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PCT/EP2009/067265
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Andreas Meinhardt
Jörg KLUG
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Justus-Liebig-Universität Giessen
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    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders

Definitions

  • the present invention relates to the use of the ribosomal protein S19 (RPS19) for the treatment of inflammatory diseases, immune and cancer diseases in humans and mammals.
  • RPS19 ribosomal protein S19
  • Cytokines control the functions of our immune system and are therefore of great importance for the immune defense.
  • MIF cytokine macrophage migration inhibitory factor
  • MIF chemotactic effect of MIF on monocytes is an important step in the inflammatory cascade mediated by binding of MIF to the chemokine receptors CXCR2 and CXCR4. Interaction with different surface molecules can explain the broad spectrum of action of MIF on cellular signaling pathways. MIF is expressed not only by most leukocytes, but almost ubiquitously. MIF has unusual properties that sets it apart from other cytokines.
  • MIF is already preformed in cells, rather than de novo synthesized after stimulation. Since MIF has no signal sequence for transport into the endoplasmic reticulum (ER), the factor is found in the cytoplasm after synthesis and not in the ER, Golgi apparatus and secretion vesicles. MIF is therefore released from the cell via non-classical secretory pathways. In addition, MIF exhibits enzymatic functions as tautomerase and thiol-protein oxidoreductase, although it is currently unclear whether or not the catalytic properties of MIF mediate some of its effects.
  • ER endoplasmic reticulum
  • MIF has the property of reacting with enhanced, rather than inhibited, expression and subsequently reducing the suppressive effects of steroids on the production of tumor necrosis factor- ⁇ , interleukin (IL). -I ⁇ , IL-6 and IL-8 in lipopolysaccharide-stimulated macrophages.
  • IL interleukin
  • an essential function of MIF seems to be to regulate macrophage function and counteract the glucocorticoid inhibitory effect at the site of inflammation, thus modulating the onset and strength of an inflammatory response.
  • MIF has been recognized over the last decade as a pluripotent mediator whose function goes far beyond classical immunomodulation.
  • MIF is also associated with tumorigenesis and progression due to its proliferative and anti-apoptotic properties.
  • Effective blockade of MIF action on target cells is therefore an important therapeutic approach to providing a means of treating acute and chronic inflammatory diseases as well as cancers.
  • the prior art knows ways to block the effect of MIF.
  • DE 602004008889 discloses, for example, as an agent for inhibiting the tautomerase activity of MIF, D- and L-forms of an alpha-methyl-2-methyl-D-methyl ester and also DE 69731038, which describes a screening system, also mentions as alpha-methyldopachromo-methyl ester as active ingredients, as well as glutathione and type anothion.
  • the disadvantage of these two revelations is that it is for the
  • DE 102004029573 discloses as an effective way to prevent the MIF effect, for example on sepsis, an apheresis material, with the MIF from blood or others Body fluids of a patient can be removed.
  • This agent can not be applied directly to the patient, but it requires the extracorporeal contacting of serum with MIF-binding Apharesematehalien z. B. in a dialysis. In the application, this agent is much more complicated than the application of a MIF inhibitor.
  • DE 69737397 discloses the use of anti-MIF monoclonal antibodies, MIF antisense RNA molecules or a combination thereof as MIF antagonists for cancer therapy.
  • the disadvantages of this antisense strategy with antisense oligonucleotides are that the antisense molecules first have to be brought into the patient and then into the target cells.
  • DE 69737397 discloses the use of liposomes for this purpose, although this is not regarded as being very practicable medically since it is not certain that the antisense oligonucleotides also reach their target cells or their site of action in vivo with great efficiency.
  • the object of the present invention is to provide a substance for the preparation of an agent for the treatment of acute and chronic inflammatory diseases and cancers, which overcomes the disadvantages of the prior art.
  • the invention has the advantage that RPS19 significantly inhibits the proinflammatory and procarcinogenic effect of MIF and is effective as an agent for the treatment of acute and chronic inflammatory diseases and cancers.
  • RPS19 is highly conserved as a ribosomal protein and its production as a human protein is easily possible even in large quantities.
  • the production as a humanized protein saves the additional step of humanizing eg Anti-MIF antibodies that are used medically for the treatment of chronic diseases or cancer.
  • a standardized application eg by injection etc. is possible, which is of great importance for routine use.
  • RPS19 binds to MIF and blocks MIF binding to its receptors. It is hitherto unknown in the prior art to use RPS19 as a substance for the preparation of an agent for the treatment of acute and chronic inflammatory diseases as well as cancers, so that the pro-inflammatory and proparcinogenic effect of MIF is inhibited.
  • this protein is identified as RPS19.
  • RPS19 is also identified in an interactome screen in which tagged MIF, which is biotinylated intracellularly, is targeted.
  • MIF interacts directly with RPS19 ( Figures 2A and B).
  • RPS19 inhibits the binding of MIF to its receptor CD74, as well as the MIF-induced arrest of monocytes mediated by the chemokine receptor CXCR2.
  • IC50 mean inhibitory concentration
  • RPS19 inhibits nearly 50% binding of biotinylated MIF to purified, soluble CD74 immobilized on a plastic matrix even at a very low RPS19 concentration ( Figure 4).
  • HAoECs human aortic endothelial cells
  • MIF and control antibody two times more MonoMac ⁇ cells will adhere to the HAoEC cell lawn than if the HAoECs were incubated with MIF and anti-infective cells.
  • CXCR2 antibodies are pre-incubated.
  • RPS19 and MIF the number of adherent MonoMac ⁇ cells decreases significantly by 39%. This means that the arresting effect of MIF on mononuclear MonoMac ⁇ cells is significantly inhibited by RPS19 and the arresting effect is mediated by the chemokine receptor CXCR2 as described above.
  • RPS19 is primarily described as a protein of the small subunit of the ribosome, it is also known to be present in extracellular fluids. comes. Thus, a transglutaminase-crosslinked RPS19 dimer in rheumatoid arthritis is described as a chemotactic factor for monocytes released by apoptotic cells. Another ribosomal protein (L4) is also found outside the cell in the serum of patients with ovarian cancer.
  • RPS19 as a drug for the treatment of patients with disease groups in which MIF plays an important etiological role.
  • MIF diseases in which MIF plays an important etiological role.
  • acute inflammations such as sepsis and SIRS
  • chronic inflammations e.g.
  • Autoimmune diseases diseases of the rheumatic type (manifestations of, inter alia, skin, lung, kidney, vascular system, nervous system, connective tissue, musculoskeletal system, endocrine system), immediate allergic reactions and asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), arteriosclerosis, psoriasis and contact dermatitis, chronic Rejection reactions after organ and bone marrow transplantation but also cancers, in particular colon, liver and prostate carcinomas, melanoma, adenocarcinomas of the lungs as well as glioblastomas and lymphomas.
  • COPD chronic obstructive pulmonary disease
  • the term patient refers equally to humans and vertebrates.
  • the agent can be used in human and veterinary medicine.
  • the therapeutically effective RPS comprising agent of the present invention is administered to the patient as part of a pharmaceutically acceptable composition either orally, rectally, parenterally, intravenously, intramuscularly or subcutaneously, intracisternally, intravaginally, intraperitoneally, intravascularly, locally (powder, ointment or drops) or administered in spray form.
  • the pharmaceutically acceptable composition is to be selected according to the particular form of administration and known to the person skilled in the art.
  • Pharmaceutically acceptable compositions may include the modifications as salts, esters, amides, and prodrugs, provided that they do not cause excessive toxicity, irritation, or allergic reactions to the patient upon reliable medical judgment.
  • prodrug refers to compounds that are transformed to enhance uptake, such as by hydrolysis in the blood.
  • Dosage forms for topical administration of the vaccine of this invention include ointments, powders, sprays or inhalants.
  • the active component is mixed under sterile conditions with a physiologically acceptable carrier and possible preservatives, buffers or propellants, as needed.
  • the type of dosage is determined by the attending physician according to the clinical factors. It is known to the person skilled in the art that the type of dosage depends on various factors, such as e.g. Body size, weight, body surface, age, sex or general health of the patient, but also on the particular remedy to be administered, the duration and route of administration and other medications that may be administered in parallel.
  • FIG. 1A shows the MIF band at the lower gel end of the left lane (about 12 kDa).
  • FIG. 1B shows NIH 3T3 cell lysates after immunoprecipitation (IP) with an anti-MIF antibody (left), an anti-RPS19 antibody (right) or a control antibody (left and right). The precipitated proteins are separated and RPS19 and MIF are detected by Western blotting (WB).
  • IP immunoprecipitation
  • WB Western blotting
  • MIF protein Mutants and RPS19 Wild-Type MIF Protein is Expressed and Purified as described in Berndt, K. et al. (2008, Mol CeI .. Biochem 307, 265-271).
  • the MIF protein mutants used are purified on the basis of protocols from the prior art (Kleemann, R. et al. (2000) Eur J Biochem 267, 7183-7193).
  • the RPS19 cDNA sequence known to the person skilled in the art is amplified with suitable primer pairs by standard PCR using polymerase from an expression clone, for example the clone IRAKp961 E1430Q (www.imaqenes-bio.de).
  • pET21a (+) Merck Biosciences, Bad Soden was first cut with Ndel, and cut after tailing with Hindi 11.
  • the Hindi 11-cut PCR fragment for the RPS19-His clone which has a smooth end on the 5 ' side, is ligated into the prepared vector to give pRPS19-His, which is a His-tagged RPS19 protein in Bacteria expressed.
  • pGST-RPS19 and pRPS19-His are validated by DNA sequencing.
  • GST-RPS19 and RPS19-His are expressed in E. coli BL21 (DE3) by induction with 0.5 mM IPTG at 37 ° C for 3 hours.
  • the cells resuspended in PBS are lysed by sonication and treated with 1% (v / v) Triton X-100 for 30 min. After centrifugation at 12,000 G for 15 min, the supernatant with dissolved GST-RPS19 is purified by glutathione-Sepharose 4B Purified by chromatography. The purity of the protein is about 95% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • RPS19 is a highly conserved protein: mouse and rat RPS19 are identical and the rodent sequence differs in only one amino acid from human RPS19.
  • mouse RPS19 is also shown to interact with human MIF and also with rat MIF. It is therefore proposed to use human RPS or, alternatively, RPS of another mammalian species, eg mouse, as an agent for the preparation of a medicament for the treatment of patients with disease groups in which MIF plays an important etiological role.
  • RPS19 after overexpression via additional purification steps e.g. Chromatography method, in particular with gel and ion exchange chromatography, purified to homogeneity or desired purity. These steps and methods are known to those skilled in the art.
  • RPS19 does not necessarily require the entire RPS19 protein for the interaction and inhibition of MIF, it is also possible to prepare a truncated or mutated RPS19 protein and to use it as a pharmaceutical according to the invention.
  • an RPS19 peptide is used whose elements have at least 99%, 98%, 95%, 90%, or 80% homology to the mammalian amino acid sequence, all of the RPS19 peptides included having an inhibitory effect on wild-type MIF Own form.
  • RPS19 protein common post-translational polypeptide modifications known to the person skilled in the art are to be included, which in turn are used by the
  • Organism in which the polypeptide is produced depend. This is particularly relevant in the biotechnological production of polypeptides. These production methods, for example, purely chemically synthesized or expressed in a variety of eukaryotic or prokaryotic host cells and then isolated are known in the art. It is also known to the person skilled in the art how to prepare fusion proteins, for example to ensure transport of the polypeptide into a specific cell organelle or for later isolation by affinity chromatography. The skilled person is the most diverse expression systems, of microorganisms such as E.
  • coli K12 and Bacillus subtilis or filamentous Fungi (Aspergillus, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae) to insect, plant or mammalian cells (animal tumor cell lines, such as Chinese hamster ovarian (CHO) cell lines or mouse myeloma (NSO-GS) cells) be used as needed.
  • mammalian cells animal tumor cell lines, such as Chinese hamster ovarian (CHO) cell lines or mouse myeloma (NSO-GS) cells
  • Antibodies against His-tagged RPS19 and wild-type MIF rats are prepared in white New Zealand rabbits according to standard protocol.
  • the RPS19 antiserum is affinity purified via His-tagged RPS19 protein immobilized on Ni-NTA agarose, as described e.g. described Gu, J. et al. (1994) Biotechniques 17; 257, 260, 262.
  • the purified anti-RPS19 immunoglobulins are dialyzed against water for 1 h and then against PBS overnight at 4 ° C.
  • the MIF antibody is commercially available e.g. available from Invitrogen (# 36-7401).
  • biotinylated MIF Biot-rMIF
  • Biot-rMIF biotinylated MIF
  • RPS19-GST FIG. 2A, lanes 4-6
  • uncharged avidin beads are incubated with the same amounts of RPS19-GST (FIG. 2A, lanes 1-3).
  • the beads are washed according to the manufacturer's instructions, boiled in SDS application buffer and the bound proteins are separated in an SDS-polyacrylamide gel. Bound RPS19-GST is detected, for example, with an anti-GST Western Blot.
  • FIG. 2A shows His-tagged RPS19 immobilized on Ni-NTA agarose beads and incubated with various amounts of recombinant MIF ( Figure 2B lane 1 -3) or human MIF (see Figure 2B lane 4).
  • rat MIF is incubated with unloaded beads ( Figure 2B, lanes 5-7).
  • Figure 2C shows equal amounts of His-tagged RPS19 immobilized on Ni-NTA agarose beads and incubated with 2 ⁇ g recombinant human MIF or the MIF mutants P2A MIF, C60S MIF and ⁇ 4 MIF ( Figure 2C, lanes 5-8 ).
  • All MIF proteins are incubated with uncharged Ni-NTA agarose beads.
  • the beads are washed, boiled in SDS loading buffer, and the bound proteins separated in an SDS-polyacrylamide gel. MIF and RPS19 are subsequently detected by Western Blot.
  • FIG. 2C shows the interaction between RPS19 and recombinant MIF, which is followed in real time by biosensor analysis. Increasing concentrations of RPS19 (62-1000 nM) are passed through a sensor chip with immobilized MIF for 120 seconds (association phase). Subsequently, the river for
  • RPS19 has only a modest effect on the tautomerase activity of MIF.
  • MIF catalyzes the tautomerization of L-dopachrome methyl ester (DCME, orange color) to 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid (colorless).
  • the tautomerase assay is performed as described by Bendrat et al. (Bendrat, K. et al. (1997) Biochemistry 36, 15356-15362). Reaction kinetics are recorded spectrophotometrically at 475 nm for one minute. The reaction rate for the first four seconds is calculated and defined as tautomerase activity.
  • the activity of MIF in the absence of RPS19 is set to 100%.
  • the assay is performed in the presence of 1 ⁇ M MIF and after one hour preincubation of MIF with one, three, or five times (1: 1, 1: 3, 1: 5) molar excess of His-tagged RPS19 or His-tagged Control protein SCGB 2A1 performed.
  • the control protein is similar in size to MIF and has no enzymatic activity.
  • FIG. 3 shows the data as mean values +/- standard deviation. Differences with a P-value ⁇ 0.05 are considered statistically significant and are marked with an asterisk.
  • Human soluble CD74 e.g. by Santa Cruz company is immobilized on a plastic matrix.
  • the binding of biotinylated MIF to the immobilized receptor CD74 is measured after pre-incubation with increasing amounts of native MIF, denatured MIF and RPS19 with an ELISA.
  • An adhesion assay e.g. described by Bernhagen, J. et al. (2007, Nat. Med 13, 587-596) is performed with mononuclear MonoMac ⁇ cells on human aortic endothelial cells.
  • Human aortic endothelial cells HA oECs
  • MIF and control IgG, RPS19 and / or commercially available CXCR2 antibodies After preincubation, HAoECs are perfused with calcein-AM labeled mononuclear MonoMac ⁇ cells and the number of MonoMac ⁇ cells adherent to endothelial cells is determined.

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Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung des ribosomalen Proteins S19 (Symbol: RPS19, HGNC ID:10402, Alias: DBA), das die proinflammatorische und procarcinogene Wirkung von MIF inhibiert, als Stoff zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung akuter und chronisch entzündlicher Erkrankungen sowie Krebserkrankungen.

Description

Patentanmeldung
Medizinische Verwendung des ribosomalen Proteins S19 (RPS19)
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung des ribosomalen Protein S19 (RPS19) zur Behandlung von entzündlichen Erkrankungen, Immun- und Krebserkrankungen bei Mensch und Säugetieren.
Beschreibung und Einleitung des allgemeinen Gebietes der Erfindung
Cytokine steuern die Funktionen unseres Immunsystems und sind somit von großer Bedeutung für die Immunabwehr.
Das pro-inflammatorische Cytokin Makrophagen-Migrations-Inhibitions-Faktor (MIF) ist eines der am längsten bekannten Cytokine überhaupt. MIF ist ein in Struktur und Funktion einzigartiger Mediator im Immunsystem, dessen wichtige Funktionen bei entzündlichen Erkrankungen wie dem septischen Schock, chronischen Entzündungen und Autoimmunerkrankungen wie rheumatoider Arthritis, Glomerulonephritis, Autoimmun-Encephalitis, Autoimmundiabetes durch Inhibition (anti-MIF-Antikörper, synthetischer Inhibitor ISO-1 ) und Gendeletionsstudien bekannt ist. Es besteht Konsens, dass die Wirkung von MIF über Bindung an die Oberflächenmoleküle CD74 und CXCR2/CXCR4 vermittelt wird.
Die chemotaktische Wirkung von MIF auf Monocyten ist ein wichtiger Schritt in der Entzündungskaskade, der durch Bindung von MIF an die Chemokin-Rezeptoren CXCR2 und CXCR4 vermittelt wird. Die Interaktion mit verschiedenen Oberflächenmolekülen kann das breite Wirkspektrum von MIF auf zelluläre Signalwege erklären. Dabei wird MIF nicht nur von den meisten Leukozyten, sondern nahezu ubiquitär exprimiert. MIF hat ungewöhnliche Eigenschaften, die es von anderen Cytokinen unterscheidet.
In Zellen liegt MIF bereits präformiert vor, anstatt nach Stimulation erst de novo synthetisiert zu werden. Da MIF keine Signalsequenz für den Transport in das en- doplasmatische Retikulum (ER) besitzt, findet sich der Faktor nach der Synthese im Cytoplasma und nicht im ER, Golgi-Apparat sowie Sekretvesikeln. MIF wird folglich über nicht-klassische Sekretionswege aus der Zelle entlassen. Außerdem zeigt MIF enzymatische Funktionen als Tautomerase und Thiol- Protein-Oxidoreduktase, wobei derzeit unklar ist, ob die katalytischen Eigenschaften von MIF einen Teil seiner Wirkungen vermitteln oder nicht. Nach Behandlung von T-Lymphozyten und Makrophagen mit niedrigen Glucocorticoidkonzentratio- nen weist MIF die Eigenschaft auf, mit einer verstärkten, statt inhibierten, Expression zu reagieren und anschließend die supprimierenden Effekte der Steroide auf die Produktion von Tumor Nekrose Faktor-α, lnterleukin (IL)-I ß, IL-6 und IL-8 in Lipopolysaccharid-stimulierten Makrophagen aufzuheben. Im Immunsystem scheint somit eine wesentliche Funktion von MIF darin zu liegen, die Makrophagenfunktion zu regulieren und am Ort der Entzündung der inhibitorischen Wirkung der Glucocorticoide entgegen zu wirken und somit Beginn und Stärke einer entzündlichen Reaktion zu modulieren. Darüber hinaus wurde MIF in den letzten zehn Jahren als pluripotenter Mediator erkannt, dessen Funktion weit über die klassische Immunmodulation hinausgeht. So wird MIF durch seine pro- proliferativen und anti-apoptotischen Eigenschaften auch mit Tumorentstehung und -progression in Verbindung gebracht. Eine wirksame Blockade der MIF- Wirkung auf Zielzellen ist deshalb ein wichtiger therapeutischer Ansatz, um ein Mittel zur Behandlung akuter und chronisch entzündlicher Erkrankungen sowie Krebserkrankungen bereitzustellen. Der Stand der Technik kennt Möglichkeiten, die Wirkung von MIF zu blockieren. DE 602004008889 offenbart beispielsweise als Mittel, die Tautomeraseaktivität von MIF zu hemmen, D- und L-Formen eines alpha-Methyl-dopachrom- methylesters und auch DE 69731038, die ein Screeningsystem beschreibt, nennt als Wirkstoffe ebenfalls alpha-Methyl-dopachrom-methylester, sowie Gluthation und Typanothion. Nachteilig ist an diesen beiden Offenbarungen, dass es für die
Tautomeraseaktivität von MIF keine bekannten natürlichen Substrate gibt, nur synthetische Verbindungen. Zudem ist unklar, ob die Tautomeraseaktivität für die proinflammatorischen oder procarcinogenen Wirkungen von MIF überhaupt oder auch nur teilweise wesentlich ist. Das in DE 602004008889 offenbarte Mittel ISO- 1 [S,R-3-(4-hydroxyphenyl)-4,5-dihydro-5-isooxazolessigsäuremethylester] hat eine mittlere inhibitorische Konzentration (IC50) die so hoch ist, das ein klinischer Einsatz wenig erfolgversprechend erscheint.
DE 102004029573 offenbart als wirksame Möglichkeit die MIF-Wirkung z.B. auf Sepsis zu unterbinden, ein Apheresematerial, mit dem MIF aus Blut oder anderen Körperflüssigkeiten eines Patienten entfernt werden kann. Dieses Mittel kann dem Patienten nicht direkt appliziert werden, sondern es erfordert das extrakorporale Zusammenbringen von Serum mit MIF-bindenden Apharesematehalien z. B. bei einer Dialyse. In der Anwendung ist dieses Mittel sehr viel umständlicher als die Applikation eines MIF-Inhibitors.
DE 69737397 offenbart die Verwendung von anti-MIF monoklonalen Antikörpern, MIF antisense RNA-Molekülen oder einer Kombination davon als MIF- Antagonisten zur Krebstherapie. Die Nachteile dieser Antisense-Strategie mit An- tisense-Oligonuklotiden bestehen darin, dass die antisense Moleküle zunächst in den Patienten und dann auch in die Zielzellen gebracht werden müssen. DE 69737397 offenbart dazu die Verwendung von Liposomen, was allerdings medizinisch als nicht sehr praktikabel angesehen wird, da nicht sicher ist, dass die Anti- sense-Oligonuklotiden in vivo ihre Zielzellen oder ihren Wirkort auch mit großer Effizienz erreichen.
Aufgabe
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es einen Stoff zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung akuter und chronisch entzündlicher Erkrankungen sowie Krebserkrankungen bereitzustellen, der die Nachteile im Stand der Technik über- windet.
Lösung der Aufgabe
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch die Verwendung von Protein RPS19, das die proinflammatorische und procarcinogene Wirkung von MIF inhi- biert und als Stoff zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung akuter und chronisch entzündlicher Erkrankungen sowie Krebserkrankungen geeignet ist, gemäß der Ansprüche.
Die Erfindung hat den Vorteil, dass RPS19 die proinflammatorische und procarci- nogene Wirkung von MIF deutlich inhibiert und als Mittel zur Behandlung akuter und chronisch entzündlicher Erkrankungen sowie Krebserkrankungen wirksam ist. RPS19 ist als ribosomales Protein sehr hoch konserviert und die Herstellung als humanes Protein ist selbst in großen Mengen leicht möglich. Die Herstellung als humanisiertes Protein erspart den zusätzlich Schritt der Humanisierung den z.B. Anti-MIF Antikörper, die medizinisch zur Behandlung von chronischen Erkrankungen oder Krebs eingesetzt werden sollen, benötigen. Zusätzlich ist eine standardisierte Applikation z.B. durch Injektion etc möglich, was für den routinemäßigen Einsatz von großer Bedeutung ist. Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass anders, als bei alpha-Methyl-dopachrom- methylester, sowie Gluthation und Typanothion, der Wirkmechanismus von RPS19 auf MIF durch eigene Arbeiten dargelegt wird. RPS19 bindet an MIF und blockiert die MIF-Bindung an seine Rezeptoren. Es ist bisher im Stand der Technik nicht bekannt, RPS19 als Stoff zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung akuter und chronisch entzündlicher Erkrankungen sowie Krebserkrankungen einzusetzen, so dass die proinflammatorische und pro- carcinogene Wirkung von MIF inhibiert wird.
In eigenen wissenschaftlichen Arbeiten wurde überraschenderweise gefunden, dass das ribosomale Protein S19 (Symbol: RPS19, HGNC ID:10402, Alias: DBA) die proinflammatorische Wirkung des zentralen Entzündungsmediators Makrophagen-Migrations-Inhibitions-Faktor (MIF) rezeptorvermittelt inhibiert. Verschiedene eigene in vitro-Experimente der Erfinder belegen die Interaktion von MIF mit RPS19. Ko-Immunpräzipitationsexperimente mit Lysaten von NIH 3T3 Fibroblasten zei- gen, dass ein polyklonales gegen MIF gerichtetes Antiserum ein Protein kopräzipi- tiert, das in SDS-Polyacrylamidgelen als 16 kDa große Bande migriert (Fig. 1 A). Mittels MALDI-ToF Massenspektrometrie wird dieses Protein als RPS19 identifiziert. Ko-Immunpräzipitationen, die daraufhin mit einem RPS19 Antikörper durchgeführt werden, sind umgekehrt in der Lage MIF kozupäzipitieren (Fig. 1 B). Darüber hinaus wird RPS19 auch in einem Interaktom-Screen identifiziert, in dem getagtes MIF, das intrazellulär biotinyliert wird, als Target eingesetzt wird. In vitro Pull-down Experimente zeigen, dass MIF direkt mit RPS19 interagiert (Fig. 2A und B). So ist in vitro biotinyliertes und auf Avidin-Beads immobilisiertes MIF in der Lage RPS19 konzentrationsabhängig zu binden. Umgekehrt wird rekombinantes MIF von an Gluthation-Sepharose-Beads immobilisiertem RPS19-GST gebunden. Die Verwendung verschiedener MIF-Mutanten im in vitro Pull-down Experiment zeigt, dass das für die Tautomerase-Aktivität erforderliche Prolin in Position 2 der Aminosäurekette für die Interaktion mit RPS19 nicht erforderlich ist, wohl aber vermutlich das für die Oxidoreduktase-Aktivität von MIF benötigte Cystein 60 (Fig. 2C). Ein weiterer Beweis dafür, dass MIF mit RPS19 interagiert, stammt aus Echtzeit- Bindungsexperimenten (Oberflächen-Plasmon-Resonanz). Die Auswertung der kinetischen Daten zeigt, dass die Dissoziationskonstante des MIF-RPS19 Komplexes K0 = 1 ,3 x 10"6 M beträgt (Fig. 2D), ein typischer Wert für funktionelle Pro- tein-Protein-Wechselwirkungen. Die Konstanten für die Assoziations- und Dissoziationsraten lassen den Schluss zu, dass bei wechselnden Konzentrationen von MIF und/oder RPS19 das Bindungsgleichgewicht sehr schnell neu eingestellt wird. Wie von den MIF-RPS19 Interaktionsstudien mit MIF-Mutanten zu erwarten war, wird die Tautomeraseaktivität von MIF durch Bindung von RPS19 kaum beein- trächtigt (Fig. 3). Die funktionelle Bedeutung der Tautomeraseaktivität ist unklar. Zwar besitzt MIF strukturelle Ähnlichkeit mit einigen bakteriellen Tautomerasen ebenso wie mit Chorismatmutase, allerdings sind keine endogenen Enzymsubstrate, sondern nur einige zufällig entdeckte synthetische Substrate bekannt. Ein gut untersuchter Inhibitor der Tautomeraseaktivität ist die in DE 602004008889 offenbarte Substanz ISO-1 [S,R-3-(4-hydroxyphenyl)-4,5-dihydro-5-isooxazol- essigsäuremethylester] deren mittlere inhibitorische Konzentration (IC50) jedoch so hoch ist, das ein klinischer Einsatz wenig erfolgversprechend erscheint. Anders als ISO-1 inhibiert RPS19 die Bindung von MIF an dessen Rezeptor CD74, sowie den von MIF induzierten Arrest von Monozyten vermittelt durch den Chemokinrezeptor CXCR2. So inhibiert in vitro biotinyliertes MIF, das mit RPS19 vorinkubiert wird, bereits bei einer sehr niedrigen RPS19 Konzentration die Bindung von biotinyliertem MIF an aufgereinigtes, lösliches und auf einer Plastikmatrix immobilisiertes CD74 zu fast 50% (Fig. 4). Wenn mononukleäre MonoMacθ Zellen für zwei Minuten über konfluent gewachsene humane Endothelzellen aus der Aorta (HAoECs), die mit MIF und Kontrollantikörper vorinkubiert werden, fließen, dann adhärieren zweimal mehr MonoMacθ Zellen auf dem HAoEC-Zellrasen, als wenn die HAoECs mit MIF und anti-CXCR2 Antikörper vorinkubiert werden. Werden HAoECs dagegen mit RPS19 und MIF präinkubiert, erniedrigt sich die Zahl der adhäherenden MonoMacθ Zellen signifikant um 39%. Dies bedeutet, dass die Arrestwirkung von MIF auf mononukleäre MonoMacθ Zellen durch RPS19 signifikant inhibiert und die Arrestwirkung wie zuvor beschrieben durch den Chemokinrezeptor CXCR2 vermittelt wird.
RPS19 ist zwar primär als ein Protein der kleinen Untereinheit des Ribosoms beschrieben, jedoch ist auch bekannt, dass es in extrazellulären Flüssigkeiten vor- kommt. So wird ein durch Transglutaminase quervernetztes RPS19-Dimer bei Rheumatoider Arthritis als chemotaktischer Faktor für Monozyten beschrieben, der von apoptotischen Zellen freigesetzt wird. Auch ein anderes ribosomales Protein (L4) wird bereits außerhalb der Zelle im Serum von Patienten mit Eierstock- krebs gefunden.
Daraus ergibt sich unmittelbar die Anwendung von RPS19 als Mittel zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Patienten mit Erkrankungsgruppen, bei denen MIF eine wichtige ätiologische Rolle spielt. Hierzu gehören insbesondere akute Entzündungen wie Sepsis und SIRS, sowie chronische Entzündungen, wie z.B. Autoimmunerkrankungen, Erkrankungen des rheumatischen Formenkreises (Manifestationen an u. a. Haut, Lunge, Niere, Gefäßsystem, Nervensystem, Bindegewebe, Bewegungsapparat, endokrinem System), allergische Soforttypre- aktionen und Asthma, chronisch-obstruktive Lungenerkrankungen (COPD), Arteriosklerose, Psoriasis und Kontaktekzem, chronische Abstoßungsreaktionen nach Organ- und Knochenmarktransplantation aber auch Krebserkrankungen, insbesondere Colon-, Leber- und Prostatakarzinome, Melanom, Adenokarzinome der Lunge sowie Glioblastome und Lymphome.
Der Begriff Patient bezieht sich dabei gleichermaßen auf Menschen und Wirbeltie- re. Damit kann das Mittel in der Human- und Veterinärmedizin verwendet werden. Das therapeutisch wirksame RPS-umfassende Mittel der vorliegenden Erfindung wird den Patienten als Teil einer pharmazeutisch akzeptablen Komposition entweder oral, rektal, parenteral intravenös, intramuskulär oder subkutan, intracister- nal, intravaginal, intraperitoneal, intravasculär, lokal (Puder, Salbe oder Tropfen) oder in Sprayform verabreicht. Die pharmazeutisch akzeptable Komposition ist dabei entsprechend der jeweiligen Verabreichungsform auszuwählen und dem Fachmann bekannt. Pharmazeutisch akzeptable Kompositionen können die Modifikationen als Salze, Ester, Amide und "Prodrugs" beinhalten, sofern sie nach zuverlässiger medizinischer Beurteilung keine übermäßige Toxizität, Irritationen oder allergische Reaktionen am Patienten auslösen.
Der Terminus "Prodrug" bezieht sich auf Verbindungen, die zur Verbesserung der Aufnahme transformiert werden, wie beispielsweise durch Hydrolyse im Blut. Dosierungsformen für die örtliche Administration des Impfstoffes dieser Erfindung schließen Salben, Puder, Sprays oder Inhalationsmittel ein. Die aktive Komponente wird unter sterilen Bedingungen, mit einem physiologisch akzeptablen Trägerstoff und möglichen Stoffen zur Haltbarmachung, Puffern oder Treibmitteln, je nach Bedarf, vermischt.
Die Art der Dosierung wird vom behandelnden Arzt entsprechend den klinischen Faktoren bestimmt. Es ist dem Fachmann bekannt, dass die Art der Dosierung von verschiedenen Faktoren wie z.B. Körpergröße, Gewicht, Körperoberfläche, Alter, Geschlecht oder der allgemeinen Gesundheit des Patienten abhängig ist, aber auch von dem speziell zu verabreichenden Mittel, der Dauer und Art der Verabreichung und von anderen Medikamenten, die möglicherweise parallel ver- abreicht werden.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Beispielen näher erläutert, wobei diese Erfindung nicht diese Ausführungsformen allein beschränkt ist. Der Inhalt aller in dieser Anmeldung genannten Schriften, beinhaltend wissenschaftliche Abhandlungen, Patente und Patentanmeldungen, sind als Teil des Inhalts dieser Anmel- düng anzusehen, da es nicht zweckdienlich ist, den Stand der Technik in Bezug auf theoretische Erkenntnisse und hinsichtlich der praktischen Umsetzung von dem Fachmann bestens bekannten Techniken, zu wiederholen.
Ausführungsbeispiele
1. Ko-Immunpräzipitation von MIF und RPS19
Dazu werden Extrakte von Fibroblasten (z.B. NIH 3T3 Fibroblasten) vor Zugabe von Protein G-Sepharose Beads mit einem polyklonalen Kaninchen anti-Ratten MIF Antikörper oder einem polyklonalen IgG Kontrollantikörper inkubiert. Ko- immunpräzipierte sowie Protein G Sepharose gebundene Proteine werden auf Polyacrylamidgelen, z.B. 4-12%igen Bis-Ths Polyacrylamidgelen (Novex, Fa. In- vitrogen) aufgetrennt und gefärbt (z.B. mit Coomassie). Figur 1 A zeigt die MIF- Bande am unteren Gel-Ende der linken Spur (ca. 12 kDa). Die Bande bei ca. 16 kDa wird ausgeschnitten, mit Trypsin behandelt und durch MALDI-ToF Massenspektrometrie analysiert. Figur 1 B zeigt NIH 3T3 Zelllysate nach Immunpräzipitation (IP) mit einem anti-MIF Antikörper (links), einem anti- RPS19 Antikörper (rechts) oder einem Kontrollantikörper (links und rechts). Die präzipitierten Proteine werden aufgetrennt und RPS19 bzw. MIF werden mittels Westernblot (WB) detektiert.
2. Expression und Aufreinigung von MIF, MIF Proteinmutanten und RPS19 Wildtyp MIF Protein wird exprimiert und aufgereinigt, wie beschrieben bei Berndt, K. et al. (2008; Mol CeI.. Biochem 307, 265-271 ). Die verwendeten MIF Protein Mutanten werden in Anlehnung an Protokolle aus dem Stand der Technik aufgereinigt (Kleemann, R. et al. (2000) Eur J Biochem 267, 7183-7193). Die dem Fachmann bekannte RPS19 cDNA Sequenz z.B. von einem Säuger wie der Maus wird mit geeigneten Primerpaaren mittels Standard-PCR unter Verwendung von Polymerase aus einem Expressionsklon z.B. dem Klon IRAKp961 E1430Q (www.imaqenes-bio.de) amplifiziert. Für einen GST-RPS19 Klon mit den Primern: Forward Primer 5'- CGAGGAATTCCCATGCCCGGAGTTACTG-3' Reverse Primer δ'-CGCCTCGAGTAATGCTTCTTGTTGGC-S' Für einen RPS19-His Klon mit den Primern: Forward Primer 5'-CGCCATATGCCCGGAGTTACTGTAAAA-S' Reverse Primer 5'-GCGAAGCTTATGCTTCTTGTTGGCAGC-S' Eingeführte Restriktionsschnittstellen sind unterstrichen. EcoRI und Xhol geschnit- tene PCR-Fragmente werden in pGEX-4T-2 (GE Healthcare, Freiburg) kloniert, um den Klon pGST-RPS19 zu erhalten, der ein GST-RPS19 Fusionsprotein in Bakterien exprimiert.
Aufgrund einer internen Ndel-Schnittstelle in der RPS19 cDNA wird pET21 a(+) (Merck Biosciences, Bad Soden) zunächst mit Ndel geschnitten, und nach Glät- tung der Enden mit Hindi 11 nachgeschnitten. Das mit Hindi 11 geschnittene PCR- Fragment für den RPS19-His Klon, das auf der 5'-Seite ein glattes Ende aufweist, wird in den vorbereiteten Vektor ligiert, und es wird pRPS19-His erhalten, der ein His-getagtes RPS19 Protein in Bakterien exprimiert. pGST-RPS19 und pRPS19- His werden durch DNA-Sequenzierung validiert. GST-RPS19 und RPS19-His werden in E. coli BL21 (DE3) durch Induktion mit 0,5 mM IPTG bei 37°C über 3 h exprimiert. Im Falle des GST-Fusionsproteins werden die in PBS resuspendierten Zellen durch Ultraschallbehandlung lysiert und mit 1 % (v/v) Triton X-100 für 30 min behandelt. Nach Zentrifugation bei 12.000 G für 15 min wird der Überstand mit gelöstem GST-RPS19 durch Glutathion-Sepharose 4B Chromatographie aufgereinigt. Die Reinheit des Proteins beträgt SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese etwa 95%. RPS19 ist ein hoch konserviertes Protein: Maus und Ratten RPS19 sind identisch und die Nagersequenz unterscheidet sich in nur einer Aminosäure von humanem RPS19. Neben der Interaktion von humanes RPS19 mit humanem MIF, wird gezeigt, dass auch Maus RPS19 mit humanem MIF interagiert und zudem mit Ratten MIF. Daher wird vorgeschlagen, als Mittel zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Patienten mit Erkrankungsgruppen, bei denen MIF eine wichtige ätiologische Rolle spielt, humanes RPS oder alternativ RPS einer anderen Säugerspezies, z.B. Maus einzu- setzen.
Alternativ wird das RPS-19 Protein nach der Überexpression über zusätzliche Reinigungsschritte z.B. Chromatografieverfahren, insbesondere mit Gel- und lo- nenaustauschchromatografien, bis zur Homogenität oder gewünschten Reinheit aufgereinigt. Diese Schritte und Verfahren sind dem Fachmann bekannt. Da für die Interaktion und Inhibition von MIF durch RPS19 nicht unbedingt das gesamte RPS19 Protein benötigt wird, ist es möglich auch ein verkürztes oder mu- tiertes RPS19 Protein herzustellen und erfindungsgemäß als Arzneimittel einzusetzen. Vorzugsweise wird eine RPS19 Peptid verwendet, dessen Elemente gegenüber der Wildtyp-Form von Säugern eine Homologie der Aminosäurensequenz von mindestens 99%, 98%, 95%, 90% oder 80% aufweisen, wobei alle umfassten RPS19 Peptide eine inhibitorische Wirkung auf MIF der Wildtyp-Form besitzen.
Weiterhin sind für RPS19 Protein, dem Fachmann bekannte, gängige post- translationale Polypeptid-Modifikationen mit einzubeziehen, welche wiederum vom
Organismus, in dem das Polypeptid hergestellt wird, abhängen. Dies ist besonders relevant bei der biotechnologischen Herstellung von Polypeptiden. Diese Herstellungsverfahren, z.B. rein chemisch synthetisiert oder in einer Vielzahl von eukaryotischen oder prokaryotischen Wirtszellen exprimiert und dann isoliert sind dem Fachmann bekannt. Auch ist dem Fachmann bekannt, wie Fusionsproteine herzustellen sind z.B. um einen Transport des Polypeptids in ein bestimmtes Zellorganell sicherzustellen oder zwecks späterer Isolation durch Affinitätschromatographie. Dem Fachmann stehen verschiedenste Expressionssysteme, von Mikroorganismen wie E. coli K12 und Bacillus subtilis oder filamentöse Pilze (Aspergillus, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae) bis zu Insekten-, Pflanzen- oder Säugerzellen (tierische Tumorzelllinien, wie z. B. CHO-Zelllinien (Chinese hamster ovarian) oder MausMyelomzellen [NSO-GS]), zur Verfügung, welche je nach Bedarf verwendet werden.
Derzeit sind im Stand der Technik Autoantikörper gegen ribosomale Proteine der kleinen und großen Untereinheit des Ribosoms für einen therapeutischen Einsatz beim Menschen nicht bekannt sind. Da diese Proteine sehr stark konserviert sind, ist es äußerst schwierig hochaffine Antikörper gegen z.B. Maus oder Ratten RPS19 in einer vergleichsweise nahe verwandten Spezies wie dem Kaninchen herzustellen. Es ist daher davon auszugehen, dass RPS19 oder ein wirksames RPS19-Peptid bei einem therapeutischen Einsatz kaum oder keine immunogene Wirkung ausübt.
3. Herstellung von Antikörpern
Antikörper gegen His-getagtes RPS19 sowie Wildtyp Ratten MIF werden in weißen Neuseeländerkaninchen nach Standardprotokoll hergestellt. Das RPS19 An- tiserum wird über His-getagtes auf Ni-NTA-Agarose immobilisiertes RPS19 Protein affinitätsgereinigt, wie z.B. beschrieben Gu, J. et al. (1994) Biotechniques 17; 257, 260, 262. Die gereinigten Anti-RPS19 Immunglobuline werden für 1 h gegen Wasser dialysiert und anschließend gegen PBS über Nacht bei 4°C. Der MIF Antikörper ist kommerziell z.B. bei Invitrogen (#36-7401 ) erhältlich.
4. Pull-Down- und Oberflächen-Plasmonresonanz-Versuche zeigen eine direkte Interaktion zwischen MIF und RPS19 in vitro
Dazu wird biotinyliertes MIF (Biot-rMIF) auf Avidin Beads immobilisiert und mit steigenden Mengen RPS19-GST (Figur 2A, Spuren 4-6) inkubiert. Als Kontrolle werden unbeladene Avidin Beads mit den gleichen Mengen RPS19-GST (Figur 2A, Spuren 1 -3) inkubiert. Die Beads werden nach Herstellerangaben gewaschen, in SDS-Auftragspuffer gekocht und die gebundenen Proteine in einem SDS- Polyacrylamidgel aufgetrennt. Gebundenes RPS19-GST wird z.B. mit einem anti- GST Western Blot nachgewiesen. In Gegenwart eines 10-fachen molaren Überschusses an unmarkiertem MIF wird kein RPS19 mehr gebunden (Figur 2A, Spur 7), wogegen das Kontrollprotein z.B. ß-Lactoglobulin nicht mit RPS19 kompetitiert (Figur 2A, Spur 8). Figur 2B zeigt His-getagtes RPS19, das auf Ni-NTA-Agarose Beads immobilisiert und mit verschiedenen Mengen rekombinanten Ratten MIF (Figur 2B Spur 1 -3) oder humanem MIF inkubiert (s. Figur 2B Spur 4) wird. Als Kontrolle wird Ratten MIF mit unbeladenen Beads inkubiert (Figur 2B, Spuren 5-7). Die gewaschenen Beads werden in SDS-Auftragspuffer gekocht, und gebundene Proteine werden durch SDS-Gelelektrophorese aufgetrennt und angefärbt (z.B. mit Coomassie). Figur 2C zeigt gleiche Mengen von His-getagtem RPS19, das auf Ni-NTA- Agarose Beads immobilisiert und mit 2 μg rekombinantem humanem MIF oder den MIF-Mutanten P2A MIF, C60S MIF und Δ4 MIF inkubiert werden (Figur 2C, Spuren 5-8). Als Kontrolle werden alle MIF-Proteine mit unbeladenen Ni-NTA- Agarose Beads inkubiert. Die Beads werden gewaschen, in SDS-Auftragspuffer gekocht, und die gebundenen Proteine in einem SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt. MIF und RPS19 werden anschließend per Western Blot nachgewiesen. Figur 2C zeigt die Interaktion zwischen RPS19 und rekombinantem MIF, diese wird in Echtzeit durch Biosensor-Analyse verfolgt. Steigende Konzentrationen von RPS19 (62-1000 nM) werden für 120 Sekunden über einen Sensor-Chip mit im- mobilisiertem MIF geleitet (Assoziationsphase). Anschließend wird der Fluss für
120 Sekunden auf Puffer umgeschaltet (Dissoziationsphase). Die Konstanten für die Assoziations- und Dissoziationsraten (ka und kd) werden mit der BIAevaluation 4.1. Software und einem 1 :1 Kurvenanpassungsmodell errechnet. Die Tabelle in Figur 2 zeigt die Mittelwerte für ka und kd, sowie den Mittelwert der Gleichgewichts- Dissoziationskonstante K0 aus drei Biosensor-Experimenten.
5. Tautomerisierung
RPS19 hat nur eine moderate Wirkung auf die Tautomerase-Aktivität von MIF. MIF katalysiert die Tautomerisierung von L-Dopachrommethylester (DCME, Farbe orange) zu 5,6-Dihydroxyindol-2-carbonsäure (farblos). Der Tautomerase Assay wird durchgeführt, wie von Bendrat et al. beschrieben (Bendrat, K. et al. (1997) Biochemistry 36, 15356-15362). Die Reaktionskinetiken werden spektrophoto- methsch bei 475 nm über eine Minute aufgezeichnet. Die Reaktionsrate für die ersten vier Sekunden wird errechnet und als Tautomera- seaktivität definiert. Die Aktivität von MIF in Abwesenheit von RPS19 wird auf 100% gesetzt. Der Assay wird in Gegenwart von 1 μM MIF sowie nach einstündiger Vorinkubation von MIF mit einem ein-, drei- oder fünffachen (1 :1 , 1 :3, 1 :5) mo- laren Überschuß von His-getagtem RPS19 oder His-getagtem Kontrollprotein SCGB 2A1 durchgeführt. Das Kontrollprotein hat eine ähnliche Größe wie MIF und hat keine enzymatische Aktivität. Figur 3 zeigt die Daten als Mittelwerte +/- Standardabweichung. Unterschiede mit einem P-Wert <0,05 werden als statistisch signifikant betrachtet und sind mit einem Stern markiert.
6. Bindung von MIF an den Rezeptor CD74
Humanes lösliches CD74 z.B. von Firma Santa Cruz wird an einer Plastikmatrix immobilisiert. Die Bindung von biotinyliertem MIF an den immobilisierten Rezeptor CD74 wird nach Vorinkubation mit steigenden Mengen nativem MIF, denaturier- tem MIF und RPS19 mit einem ELISA gemessen.
Die Daten in Figur 4 zeigen die Mittelwerte +/- Standardweichung aus drei unabhängigen Experimenten. RPS19 inhibiert die Bindung von MIF an den Rezeptor CD74.
7. MIF-abhängiger Arrest von mononukleären Zellen
Ein Adhäsionsassay wie z.B. beschrieben bei Bernhagen, J. et al. (2007; Nat. Med 13, 587-596) wird mit mononukleären MonoMacθ Zellen auf humanen Aortenendothelzellen durchgeführt. Humane Endothelzellen aus der Aorta (HA- oECs) werden mit MIF und Kontroll-IgG, RPS19 und/oder kommerziell erhältli- ehern CXCR2 Antikörper vorinkubiert. Nach der Vorinkubation werden HAoECs mit Calcein-AM markierten mononukleären MonoMacθ Zellen perfundiert, und die Zahl der an Endothelzellen adhärenten MonoMacθ Zellen wird bestimmt. Die Daten in Figur 5 sind dargestellt als relative Steigerung im Vergleich zur Vorinkubation mit MIF und CXCR2 Antikörper, die gleich 1 gesetzt wird. Die Daten sind Mittelwerte +/- Standardabweichung aus der angegebenen Zahl von Experimenten. Unterschiede mit einem P-Wert <0,05 werden als statistisch signifikant erachtet. RPS19 inhibiert den MIF-abhängigen Arrest mononukleärer Zellen.

Claims

Ansprüche
1. Verwendung des RPS 19 Proteins zur Herstellung eines Mittels zur Behand- lung akuter und chronisch entzündlicher Erkrankungen sowie Krebserkrankungen.
2. Verwendung des RPS 19 Proteins gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die proinflammatorische und procarcinogene Wirkung von MIF inhi- biert wird.
3. Verwendung des RPS 19 Proteins gemäß der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die akuten entzündlichen Erkrankungen Sepsis und SIRS sind.
4. Verwendung des RPS 19 Proteins gemäß der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die chronisch entzündlicher Erkrankungen Autoimmunerkrankungen, Erkrankungen des rheumatischen Formenkreises, allergische Soforttypreaktionen, Asthma, chronisch-obstruktive Lungenerkran- kungen (COPD), Arteriosklerose, Psoriasis, Kontaktekzem, chronische Abstoßungsreaktionen nach Organ- und Knochenmarktransplantation sind.
5. Verwendung des RPS 19 Proteins gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Krebserkrankungen, Colon-, Leber- und Prostatakarzinome, Me- lanom, Adenokarzinome der Lunge sowie Glioblastome und Lymphome sind.
6. Verwendung des RPS 19 Proteins gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Dissoziationskonstante des MIF-RPS19 Komplexes K0 = 1 ,3 x 10"6 M beträgt.
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