WO2010052814A1 - 硬組織再生治療用組成物 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention is S.I. mutans (Streptococcus mutans) and / or P. mutans.
  • the present invention relates to a composition for treating hard tissue regeneration comprising gingivalis (Porphyromonus gingivalis). More specifically, the present invention relates to the composition for treating hard tissue regeneration, which is contained as an active ingredient in a therapeutic agent for regeneration of dentin and / or periodontal tissue and bone tissue.
  • S.M. mutans is a causative agent of caries (Caries)
  • P. pneumoniae. gingivalis has been the causative agent of periodontal disease. Therefore, for the treatment and prevention of caries and periodontal disease, S.
  • a basic antibacterial peptide having a bactericidal activity against mutans and a cell proliferating effect of mesenchymal stem cells see, for example, Patent Document 1
  • P. coli containing polyphenol as an active ingredient for example, gingivalis adhesion inhibitor to periodontal tissue
  • Patent Document 2 P. gingivalis.
  • Immunogenic polypeptides containing specific amino acids for treating or preventing diseases and infections caused by gingivalis have been developed.
  • S. mutans and P.M. gingivalis is a bacterium that is resident in the oral cavity and does not necessarily cause caries or periodontal disease, but low-level infection of these bacteria can prevent caries and periodontal disease. It was thought to be triggered. In the clinical field, it has been observed that dentin regenerates at the stage where caries is induced, contrary to the progress of caries. This is thought to be caused by the dentin being melted by caries and the growth factors present in the dentin matrix stimulating the odontoblasts through the dentinal tubules.
  • the present inventors may activate the proliferation of cells such as dental pulp cells and periodontal ligament cells due to the infection with a low concentration of bacteria, which may promote the regeneration of dentin and periodontal tissue. Therefore, the present inventors examined a composition for treating hard tissue regeneration containing these bacteria.
  • the present invention is S.I. mutans and / or P. mutans. It is an object of the present invention to provide a composition for treating hard tissue regeneration containing gingivalis.
  • mutans and / or P. mutans When gingivalis is present at a high concentration, it acts as a causative agent of caries and periodontal disease, but when it is present at a low concentration, it promotes differentiation of dental pulp cells into odontoblasts or osteoblasts. I found out. Therefore, S.H. mutans and / or P. mutans. A composition for treating hard tissue regeneration containing a low concentration of gingivalis was obtained, and the present invention was completed.
  • the present invention relates to the following hard tissue regeneration treatment compositions (1) to (8).
  • a composition for treating hard tissue regeneration comprising gingivalis.
  • composition for treating hard tissue regeneration according to any one of the above (1) to (3), which is used for regeneration of dentin and / or periodontal tissue.
  • a pulp capping agent comprising the composition for treating hard tissue regeneration according to any one of (1) to (4) as an active ingredient.
  • a therapeutic agent for bone tissue regeneration comprising the composition for treating hard tissue regeneration according to any one of (1) to (4) as an active ingredient.
  • S.M. mutans and / or P. mutans A composition for promoting cell differentiation, comprising gingivalis.
  • S.M. mutans and / or P. mutans A composition for improving alkaline phosphatase (hereinafter referred to as ALP) activity of cells containing gingivalis.
  • ALP alkaline phosphatase
  • the composition for regenerating and treating hard tissue is S.I. mutans, P.M. It is a composition containing gingivalis or a combination thereof, and any composition can be used as long as it can be used for regeneration of hard tissues such as bones, teeth, hair, and nails. It is particularly preferable that it can be used for regeneration of dentin, periodontal tissue and the like.
  • mutans, P.M. As long as it is safe when administered to the human body or the like as a “hard tissue regeneration treatment composition”, any gingivalis, such as those stored in a bacterial depository or commercially available, can be used. Can be used.
  • patient-derived S.P. mutans, P.M. Gingivalis can also be collected and included per se.
  • composition for regenerating and treating hard tissue may be viable or killed if they are effective as the “composition for regenerating and treating hard tissue”. However, dead bacteria are more preferable in terms of safety.
  • bacteria contained in the “composition for regenerating and treating hard tissue” of the present invention are preferably contained so that the concentration of the protein contained in the disrupted cells is less than 100 ⁇ g / ml, and particularly 10 ⁇ g / ml or less. It is preferable that it is contained at a low concentration.
  • composition for regenerating and treating hard tissue is preferably one that can be used for regenerating hard tissues such as bones, teeth, hair, and nails, and particularly acts on pulp cells and periodontal ligament cells. It is preferable to be able to be used for regeneration of dentin, periodontal tissue, or any of these.
  • composition for regenerating and treating hard tissue of the present invention can be used as an active ingredient of a pulp capping agent or a therapeutic agent for regenerating bone tissue.
  • examples of the “dental pulp capping agent” include those using the “composition for regenerating and treating hard tissue” of the present invention as it is or those combined with calcium hydroxide or the like.
  • examples of the “treatment agent for bone tissue regeneration” include those using the “hard tissue regeneration treatment composition” of the present invention as they are, or those combined with growth factors such as collagen, BMP and FGF. It is done.
  • This “therapeutic agent for bone tissue regeneration” is a method of injecting into a bone defect part with a syringe in order to regenerate the bone tissue, or by soaking it in a collagen sponge or the like. It can be used for a transplanting method and the like. Furthermore, the “composition for regenerating and treating hard tissue” of the present invention can be used as a periodontal tissue regenerating agent in combination with a growth factor or the like.
  • These “dental pulp capping agents” and “therapeutic agents for bone tissue regeneration” are not particularly limited in the form of drugs, but in combination with generally known gels, moisturizers, thickeners, etc. It can also be provided as an agent or a coating agent.
  • composition for promoting differentiation refers to S.I. mutans and / or P. mutans. It includes gingivalis and includes any one that induces or promotes cell differentiation. For example, S. cerevisiae that promotes differentiation of dental pulp cells into odontoblasts or osteoblasts. mutans and / or P. mutans. A composition containing gingivalis is mentioned.
  • the “ALP activity-improving composition” of the present invention refers to S.P. mutans and / or P. mutans. It includes gingivalis, and any one that improves the ALP activity of cells. For example, S. cerevisiae that improves the ALP activity of human dental pulp-derived fibroblasts (hereinafter referred to as hDPF). mutans and / or P. mutans. A composition containing gingivalis is mentioned. EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is demonstrated further in detail, this invention is not limited to these.
  • composition for treating hard tissue regeneration comprising mutans a.
  • S. A composition for treating hard tissue regeneration containing mutans was prepared.
  • mutans MT8148R was cultured at 37 ° C. for 2 days under anaerobic conditions of 10% CO 2 , 10% H 2 and 80% N 2 .
  • b. The cells were collected by centrifugation (10,000 ⁇ g, 20 minutes, 4 ° C.) and washed twice with PBS (pH 7.4).
  • PBS pH 7.4
  • the bacterial cells were repeatedly disrupted for 60 minutes with ultrasonic disruption for 30 seconds and an interval of 1 minute. d.
  • the disrupted extract is centrifuged (10,000 ⁇ g, 20 minutes, 4 ° C.) It was used as a hard tissue regeneration treatment composition containing mutans (bacteria crushed material).
  • P. Composition for treating hard tissue regeneration containing gingivalis a. To d. The process of P. A composition for treating hard tissue regeneration containing gingivalis was prepared. a. P. gingivalis ATCC 33277 was inoculated into Tryptic Soy broth supplemented with hemin (5 mg / ml), menadione (0.5 mg / ml) and 10% defibrinated horse blood, 10% CO 2 , 10% The cells were cultured at 37 ° C. for 2 days under anaerobic conditions of H 2 and 80% N 2 . b. The cells were collected by centrifugation (10,000 ⁇ g, 20 minutes, 4 ° C.) and washed twice with PBS (pH 7.4). c.
  • Example 1 ⁇ Examination of hard tissue regeneration composition> 1.
  • Sample 1) Composition for Regenerating Hard Tissue Regeneration Treatment The concentration of protein contained in the crushed cells in each composition for regenerating hard tissue prepared in Example 1 was determined using a protein assay kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). ), And the final concentration of the protein contained in the disrupted cells was 100 ⁇ g / ml, 10 ⁇ g / ml, 1 ⁇ g / ml, 0.1 ⁇ g / ml or 0.01 ⁇ g / ml. . 2) Lipopolysaccharide (LPS) LPS produced by E. coli O55 was used as a comparative sample. The LPS concentration was adjusted to 10 ⁇ g / ml, 1 ⁇ g / ml, 0.1 ⁇ g / ml or 0.01 ⁇ g / ml and used.
  • LPS Lipopolysaccharide
  • HDPF high-density polypeptide
  • HBS solution Horbate II
  • FCS serum (JRH Bioscience, Lenexa, KS, USA), glutamine (Gibco, Invitrogen), 100 U / ml penicillin-streptomycin (Gibco, Invitrogen) and 100 ⁇ M ascorbic acid
  • FCS serum JRH Bioscience, Lenexa, KS, USA
  • glutamine Gibco, Invitrogen
  • 100 U / ml penicillin-streptomycin (Gibco, Invitrogen)
  • 100 ⁇ M ascorbic acid was cultured in a growth medium containing the ⁇ -MEM medium (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • d Cells sprinkled from the tissue were cultured, the medium was changed every 3 days, and the morphology of the subcultured hDPF was observed with a phase contrast microscope.
  • the confluent cells were detached with 0.05% trypsin and 0.02% EDTA, subcultured, and the second hDPF was used for the test
  • the number of cells on the 14th and 28th days of culture was determined by measuring the number of cells using WST-8 kit (Kishida Chemical Co., Ltd.) at an absorbance of 450 nm (SmartSpec TM 3000, BIO-RAD).
  • WST-8 kit Karlinsky Chemical Co., Ltd.
  • SmartSpec TM 3000 BIO-RAD
  • S.E. Mutans or P.M In the composition for treating hard tissue regeneration containing gingivalis, cell proliferation was less than that in the control.
  • the proliferation of cells was significantly low when the concentration of protein contained in the crushed cells was as high as 100 ⁇ g / ml. When LPS was used, the cells proliferated in the same manner as in the control. Mutans or P.M. It was suggested that the growth of hDPF was inhibited in the hard tissue regeneration composition containing gingivalis because of the involvement of LPS in the cell disruption solution.
  • ALP activity The second generation of hDPF was seeded in a culture dish so as to be 3 ⁇ 10 3 cells / well (12 wells), and the growth medium supplemented with the composition for treating hard tissue regeneration or LPS of the present invention was added. Culture was performed. In addition, the culture was performed using a composition for treating hard tissue regeneration or hDPF without addition of LPS as a control. ALP activity on day 14 and day 28 of culture was measured using SIGMA-FADT r-nitrophenol phosphate table set (Sigma, St. Louis, Mo, USA) with an enzyme reaction at an absorbance of 405 nm (SmartSpec TM 3000, BIO-RAD). Quantified by examining.
  • the concentration of the protein contained in the crushed cell is 10 ⁇ g / ml, but the concentration of the protein contained in the control or crushed cell is 100 ⁇ g / ml.
  • ALP activity was significantly higher than some.
  • a protein having a concentration of 1 ⁇ g / ml, 0.1 ⁇ g / ml, or 0.01 ⁇ g / ml in the disrupted bacterial cells has a higher ALP activity than these, and therefore, a low concentration of S. cerevisiae.
  • the composition for treating hard tissue regeneration containing mutans promotes differentiation into odontoblasts or osteoblasts by acting on hDPF and acts on dentin regeneration. Further, as shown in FIG.
  • the concentration of the protein contained in the disrupted bacterial cell is 0.01 ⁇ g / ml, while the concentration of the protein contained in the control or disrupted bacterial cell is The ALP activity was significantly higher than that at a high concentration of 100 ⁇ g / ml.
  • a protein having a concentration of 10 ⁇ g / ml, 1 ⁇ g / ml, or 0.1 ⁇ g / ml in the disrupted bacterial cells also has a higher ALP activity than these, and therefore, a low concentration of P. coli. It has been suggested that a composition for treating hard tissue regeneration containing gingivalis also promotes differentiation into dentin blasts or osteoblasts by acting on hDPF, and acts on dentin regeneration.
  • composition for regenerating and treating hard tissue of the present invention works for regeneration of dentin and / or periodontal tissue, it can be used as an active ingredient of a pulp capping agent or a therapeutic agent for regenerating bone tissue.

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Abstract

【課題】Ｓ．ｍｕｔａｎｓおよび／またはＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを含む硬組織再生治療用組成物を提供する。 【解決手段】Ｓ．ｍｕｔａｎｓおよび／またはＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを低濃度含ませることで、硬組織再生治療用組成物の提供を可能とした。

Description

硬組織再生治療用組成物
　本発明はＳ．ｍｕｔａｎｓ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓ）および／またはＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎｕｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）を含む硬組織再生治療用組成物に関する。さらに詳しくは、象牙質および／または歯周組織の再生や、骨組織の再生用治療剤に有効成分として含まれる当該硬組織再生治療用組成物に関する。
　従来から、Ｓ．ｍｕｔａｎｓはカリエス（虫歯）の原因菌、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓは歯周病の原因菌とされてきた。そのため、カリエスや歯周病の治療や予防等のために、Ｓ．ｍｕｔａｎｓに対する殺菌活性を有し、かつ間葉系幹細胞の細胞増殖効果を有する塩基性抗菌ペプチド（例えば、特許文献１参照）や、ポリフェノールを有効成分として含有するＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの歯周組織への付着阻害剤（例えば、特許文献２参照）、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓより引き起こされる疾病および感染を治療または予防するための特定のアミノ酸を含む免疫原性ポリペプチド（例えば、特許文献３参照）等が開発されてきた。
　しかし、Ｓ．ｍｕｔａｎｓやＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓは、口腔内に常在する菌であり、存在しているからといって必ずしもカリエスや歯周病になるわけではなく、これらの細菌が低濃度感染することで、カリエスや歯周病が惹起されると考えられた。
　臨床の現場において、カリエスが惹起された段階で、カリエスの進行とは逆に、象牙質が再生することが観察されている。これは、カリエスによって象牙質が融解され、象牙質のマトリックスに存在する増殖因子が象牙細管を通って象牙芽細胞に刺激を与えたことによって起こるものと考えられている。
　このことから、本発明者らは、低濃度の細菌の感染によって、歯髄細胞、歯根膜細胞等の細胞の増殖が活発化され、これによって象牙質や歯周組織の再生が促進される可能性があると考え、これらの細菌を含む硬組織再生治療用組成物について検討を行った。
　象牙質や歯周組織の再生剤としては、水酸化カルシウムによる歯髄覆罩剤や、増殖因子による歯周組織再生剤が提供されているが、いずれにおいても１００％の成功率を得ることは難しく、まだ、改良すべき点が残されているのが現状である。そこで、新たな硬組織再生治療用組成物が提供されることが期待されている。
〔先行文献〕
特開２００５－２８１２２５号公報 特許第３８３７１７２号公報 特表２００７－５２９１９５号公報
　本発明は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓおよび／またはＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを含む硬組織再生治療用組成物を提供することを課題とする。
　本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、Ｓ．ｍｕｔａｎｓおよび／またはＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓが高濃度で存在する場合には、カリエスや歯周病の原因菌として作用をするが、低濃度で存在する場合には、歯髄細胞の象牙芽細胞または骨芽細胞への分化を促進することを見出した。そこで、Ｓ．ｍｕｔａｎｓおよび／またはＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを低濃度含む硬組織再生治療用組成物を得て、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、次の（１）～（８）の硬組織再生治療用組成物等に関する。
（１）Ｓ．ｍｕｔａｎｓおよび／またはＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを含む硬組織再生治療用組成物。
（２）Ｓ．ｍｕｔａｎｓおよび／またはＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓが菌体破砕物である上記（１）に記載の硬組織再生治療用組成物。
（３）Ｓ．ｍｕｔａｎｓおよび／またはＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの菌体破砕物に含まれるタンパク質の濃度が１００μｇ／ｍｌ未満である上記（１）または（２）に記載の硬組織再生治療用組成物。
（４）象牙質および／または歯周組織の再生に用いる上記（１）～（３）のいずれかに記載の硬組織再生治療用組成物。
（５）上記（１）～（４）のいずれかに記載の硬組織再生治療用組成物を有効成分として含む歯髄覆罩剤。
（６）上記（１）～（４）のいずれかに記載の硬組織再生治療用組成物を有効成分として含む骨組織の再生用治療剤。
（７）Ｓ．ｍｕｔａｎｓおよび／またはＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを含む細胞の分化促進用組成物。
（８）Ｓ．ｍｕｔａｎｓおよび／またはＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを含む細胞のアルカリフォスファターゼ（以下、ＡＬＰとする）活性向上用組成物。
　本発明の硬組織再生治療用組成物によって象牙質および／または歯周組織の再生を行うことで、カリエスや歯周病等のＳ．ｍｕｔａｎｓおよび／またはＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓよって引き起こされる疾病や感染を治療または予防することが可能となる。
Ｓ．ｍｕｔａｎｓを含む硬組織再生治療用組成物のＡＬＰ活性を示した図である（試験例１）。 Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを含む硬組織再生治療用組成物のＡＬＰ活性を示した図である（試験例１）。 硬組織再生治療用組成物によるｈＤＰＦのＢＳＰ発現を示した図である（試験例１）。
　本発明の「硬組織再生治療用組成物」は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓまたはこれらを組合せて含む組成物であり、骨，歯，毛髪，爪等の硬組織の再生に利用できるものであればいずれのものも含まれる。象牙質や歯周組織等の再生に利用できるものであることが特に好ましい。
　本発明の「硬組織再生治療用組成物」に含まれるＳ．ｍｕｔａｎｓ、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓは、「硬組織再生治療用組成物」として人体等に投与した場合に安全なものであれば、細菌の寄託機関等に保管されているものや市販されているもの等、いずれのものも用いることができる。また、患者由来のＳ．ｍｕｔａｎｓ、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを採取して、それ自体を含ませることもできる。
　本発明の「硬組織再生治療用組成物」に含まれるこれらの細菌は、「硬組織再生治療用組成物」として効果があるものであれば、生菌でも、破砕等した死菌であっても良いが、安全面において死菌の方がより好ましい。
　本発明の「硬組織再生治療用組成物」に含まれるこれらの細菌は、菌体破砕物に含まれるタンパク質の濃度が１００μｇ／ｍｌ未満となるように含まれることが好ましく、特に１０μｇ／ｍｌ以下の低濃度で含まれることが好ましい。
　本発明の「硬組織再生治療用組成物」は、骨，歯，毛髪，爪等の硬組織の再生に用いることができるものであることが好ましく、特に歯髄細胞、歯根膜細胞等に作用し得る、象牙質、歯周組織またはこれらのいずれの再生にも用いることができるものであることが好ましい。
　本発明の「硬組織再生治療用組成物」は、歯髄覆罩剤や骨組織の再生用治療剤の有効成分として用いることができる。
　この「歯髄覆罩剤」としては、本発明の「硬組織再生治療用組成物」をそのまま用いたもの、または水酸化カルシウム等と組み合わせたもの等が挙げられる。また、「骨組織の再生用治療剤」としては、本発明の「硬組織再生治療用組成物」をそのまま用いたもの、またはコラーゲン、ＢＭＰやＦＧＦなどの増殖因子等と組み合わせたもの等が挙げられる。この「骨組織の再生用治療剤」は、骨組織の再生のために、ゲル状にして骨欠損部にシリンジにて注入する方法や、コラーゲンのスポンジなどに浸み込ませて骨欠損部に移植する方法等に用いることができる。
　さらに、本発明の「硬組織再生治療用組成物」は、増殖因子等と組合せて、歯周組織再生剤とすることもできる。
　これらの「歯髄覆罩剤」や「骨組織の再生用治療剤」等は薬剤としての形態は特に問わないが、一般に知られているゲル剤、保湿剤、増粘剤等と組合せて、軟膏剤、塗布剤として提供することもできる。
　本発明の「分化促進用組成物」とは、Ｓ．ｍｕｔａｎｓおよび／またはＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを含むものであり、細胞の分化を誘導し、または促進するものであればいずれのものも含まれる。例えば、歯髄細胞の象牙芽細胞または骨芽細胞への分化を促進するＳ．ｍｕｔａｎｓおよび／またはＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを含む組成物が挙げられる。
　本発明の「ＡＬＰ活性向上用組成物」とは、Ｓ．ｍｕｔａｎｓおよび／またはＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを含むものであり、細胞のＡＬＰ活性を向上するものであればいずれのものも含まれる。例えばヒト歯髄由来線維芽細胞（Ｈｕｍａｎ　ｄｅｎｔａｌ　ｐｕｌｐ－ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ：以下、ｈＤＰＦとする）のＡＬＰ活性を向上するＳ．ｍｕｔａｎｓおよび／またはＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを含む組成物が挙げられる。
　以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
＜硬組織再生治療用組成物の調製＞
１．Ｓ．ｍｕｔａｎｓを含む硬組織再生治療用組成物
　以下のａ．～ｄ．の工程によりＳ．ｍｕｔａｎｓを含む硬組織再生治療用組成物を調製した。
ａ．Ｔｏｄｄ　Ｈｅｗｉｔ　ｂｒｏｔｈ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ）に接種したＳ．ｍｕｔａｎｓ　ＭＴ８１４８Ｒを、１０％ＣＯ２，１０％Ｈ２および８０％Ｎ２の嫌気条件下で、３７℃で２日間培養した。
ｂ．菌体を遠心分離（１０，０００×ｇ、２０分間、４℃）によって回収し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２回洗浄した。
ｃ．超音波破砕機（Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ　ＵＣＤ－２００Ｔ，株式会社コスモバイオ）を用いて３０秒の超音波破砕と１分のインターバルで６０分間繰り返し菌体を破砕した。
ｄ．破砕抽出物を遠心分離（１０，０００×ｇ、２０分間、４℃）し、上清をＳ．ｍｕｔａｎｓ（菌体破砕物）を含む硬組織再生治療用組成物として用いた。
２．Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを含む硬組織再生治療用組成物
　以下のａ．～ｄ．の工程によりＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを含む硬組織再生治療用組成物を調製した。
ａ．Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　ＡＴＣＣ　３３２７７を、ヘミン（５ｍｇ／ｍｌ）、メナジオン（０．５ｍｇ／ｍｌ）および１０％脱線維素ウマ血液を添加したトリプティックソイ培地（Ｔｒｉｐｔｉｃ　Ｓｏｙ　ｂｒｏｔｈ）に接種し、１０％ＣＯ２，１０％Ｈ２および８０％Ｎ２の嫌気条件下で、３７℃で２日間培養した。
ｂ．菌体を遠心分離（１０，０００×ｇ、２０分間、４℃）によって回収し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２回洗浄した。
ｃ．超音波破砕機（Ｂｒａｓｏｎ，Ｄａｎｂｕｒｙ，ＣＴ，ＵＳＡ）を用いて出力１００Ｗ，３０秒の超音波破砕と１分間のインターバルで５分間繰り返し菌体を破砕した。
ｄ．破砕抽出物を遠心分離（１０，０００×ｇ、２０分間、４℃）し、上清をＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（菌体破砕物）を含む硬組織再生治療用組成物として用いた。
［試験例１］
＜硬組織再生治療用組成物の検討＞
１．試料
１）硬組織再生治療用組成物
　実施例１において調製した各硬組織再生治療用組成物における菌体破砕物に含まれるタンパク質の濃度をプロテインアッセイキット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて調べ、菌体破砕物に含まれるタンパク質の最終濃度が１００μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌまたは０．０１μｇ／ｍｌとなるように調製して用いた。
２）リポポリサッカリド（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃａｒｉｄｅ：ＬＰＳ）
　比較試料として大腸菌Ｏ５５が産生したＬＰＳを用いた。ＬＰＳ濃度が１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌまたは０．０１μｇ／ｍｌとなるように調製して用いた。
３）ｈＤＰＦ以下のａ．～ｅ．の工程によりｈＤＰＦを調製した。
ａ．歯列矯正術を受けている３人の患者から、矯正治療中にｈＤＰＦが含まれている下顎の３番目の臼歯を抜歯しｈＤＰＦを採取した。
ｂ．歯髄組織を歯から分離し、１ｍｍ３以下の小片に細分化した。それから、６０Ｕ／ｍｌのディスパーゼＩＩ（合同酒精株式会社）および２ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ（和光純薬工業株式会社）を含むＨＢＳ溶液（Ｈａｎｋ’ｓ　Ｂａｌａｎｃｅｄ　Ｓａｌｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で、３７℃で２０分間酵素処理した。
ｃ．少量の組織を１０ｃｍ培養皿に入れ、１０％ＦＣＳ血清（ＪＲＨ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳ，ＵＳＡ）、グルタミン（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１００μＭアスコルビン酸を添加したα－ＭＥＭ培地（和光純薬工業株式会社）を含む増殖培地で培養した。
ｄ．組織から這い出した細胞を培養し、３日ごとに培地を交換し、継代培養されたｈＤＰＦの形態を位相差顕微鏡で観察した。
ｅ．コンフレントになった細胞を０．０５％のトリプシンおよび０．０２％ＥＤＴＡで剥離し、継代培養を行い、２代目のｈＤＰＦを試験に用いた。
２．試験および結果
１）細胞増殖
　細胞カウントキット－８（ＷＳＴ－８；Ｄｏｊｉｎｄｏ，Ｋｕｍａｍｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて細胞増殖を測定した。即ち継代２代目のｈＤＰＦを１×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（１２ｗｅｌｌ）となるように培養皿に播種し、本発明の硬組織再生治療用組成物またはＬＰＳをそれぞれ添加した完全培地で培養を行った。また、硬組織再生治療用組成物またはＬＰＳを添加しないｈＤＰＦをコントロールとして、培養を行った。培養１４日目、２８日目の細胞数をＷＳＴ－８ｋｉｔ（キシダ化学株式会社）を用い、吸光度４５０ｎｍ（ＳｍａｒｔＳｐｅｃｋＴＭ　３０００，ＢＩＯ－ＲＡＤ）で測定後、細胞数を算定することで調べた。
　その結果、Ｓ．Ｍｕｔａｎｓ　またはＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを含む硬組織再生治療用組成物では、コントロールに比べて細胞の増殖が少なかった。特に、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを含む硬組織再生治療用組成物では、菌体破砕物に含まれるタンパク質の濃度が１００μｇ／ｍｌと高濃度のものにおいて、有意に細胞の増殖が少なかった。
　ＬＰＳを用いた場合にはいずれもコントロールと同様に細胞が増殖したことから、本発明のＳ．Ｍｕｔａｎｓ　またはＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを含む硬組織再生治療用組成物においてｈＤＰＦの増殖が抑制されたのは、菌体破砕液中のＬＰＳの関与によるものではないことが示唆された。
２）ＡＬＰ活性
　継代２代目のｈＤＰＦを３×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（１２ｗｅｌｌ）となるように培養皿に播種し、本発明の硬組織再生治療用組成物またはＬＰＳをそれぞれ添加した増殖培地で培養を行った。また、硬組織再生治療用組成物またはＬＰＳを添加しないｈＤＰＦをコントロールとして、培養を行った。培養１４日目、２８日目のＡＬＰ活性を、ＳＩＧＭＡ－ＦＡＤＴ　ｒ－ｎｉｔｏｒｏｐｈｅｎｙｌ　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｔａｂｌｅｔ　ｓｅｔｓ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ，ＵＳＡ）を用いて吸光度４０５ｎｍ（ＳｍａｒｔＳｐｅｃｋＴＭ　３０００，ＢＩＯ－ＲＡＤ）で酵素反応を調べることによって定量した。
　その結果、図１に示したように、Ｓ．ｍｕｔａｎｓを含む硬組織再生治療用組成物では、菌体破砕物に含まれるタンパク質の濃度が１０μｇ／ｍｌのものが、コントロールまたは菌体破砕物に含まれるタンパク質の濃度が１００μｇ／ｍｌと高濃度であるものと比べて有意にＡＬＰ活性が高かった。菌体破砕物に含まれるタンパク質の濃度が１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌまたは０．０１μｇ／ｍｌのものもこれらに比べてＡＬＰ活性が高いことから、低濃度のＳ．ｍｕｔａｎｓを含む硬組織再生治療用組成物がｈＤＰＦに作用することで象牙芽細胞または骨芽細胞への分化を促進し、象牙質の再生に働くことが示唆された。
　また、図２に示したように、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを含む硬組織再生治療用組成物を用いた場合には、菌体破砕物に含まれるタンパク質の濃度が０．０１μｇ／ｍｌのものが、コントロールまたは菌体破砕物に含まれるタンパク質の濃度が１００μｇ／ｍｌと高濃度であるものと比べて有意にＡＬＰ活性が高かった。菌体破砕物に含まれるタンパク質の濃度が１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌまたは０．１μｇ／ｍｌのものもこれらに比べてＡＬＰ活性が高いことから、低濃度のＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを含む硬組織再生治療用組成物も、ｈＤＰＦに作用することで象牙芽細胞または骨芽細胞への分化を促進し、象牙質の再生に働くことが示唆された。
３）硬組織形成細胞マーカー遺伝子の発現確認
　上記２．２）において、ＡＬＰ活性の増加がみられた菌体破砕物に含まれるタンパクの最終濃度が１μｇ／ｍｌとなるように調製したＳ．ｍｕｔａｎｓを含む硬組織再生治療用組成物、菌体破砕物に含まれるタンパクの最終濃度が０．０１μｇ／ｍｌとなるように調製したＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを含む硬組織再生治療用組成物をそれぞれ添加した増殖培地で、継代２代目のｈＤＰＦを１０日間培養し、硬組織形成細胞マーカーであるｂｏｎｅ　ｓｉａｌｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＳＰ）のｍＲＮＡの発現を調べた。硬組織再生治療用組成物を添加しないｈＤＰＦをコントロールとした。
　培養後の各細胞からＲＮＡを、トライゾール溶液（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて抽出し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＩＩ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によってｃＤＮＡに変換した。その後、Ｅｘ　Ｔａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ），と２０mＭ　ｐｒｉｍｅｒｓ（配列表配列番号１、２）によって増幅し、ＢＳＰのｍＲＮＡの発現量を比較解析した。
　その結果、菌体破砕液を添加していない細胞においては、ＢＳＰの発現がみられなかったが、菌体破砕物に含まれるタンパクの最終濃度が１μｇ／ｍｌとなるように調製したＳ．ｍｕｔａｎｓを含む硬組織再生治療用組成物、または菌体破砕物に含まれるタンパクの最終濃度が０．０１μｇ／ｍｌとなるように調製したＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを含む硬組織再生治療用組成物を用いた場合には、図３に示すようにＢＳＰの発現が増加することが示された。
　従って、この結果より、本発明のＳ．ｍｕｔａｎｓを含む硬組織再生治療用組成物およびＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを含む硬組織再生治療用組成物がｈＤＰＦに作用することで象牙芽細胞または骨芽細胞への分化を促進し、象牙質の再生に働くことが示唆された。
　本発明の硬組織再生治療用組成物は象牙質および／または歯周組織の再生に働くことから、歯髄覆罩剤や骨組織の再生用治療剤の有効成分として利用することができる。

Claims (8)

  1. Ｓ．ｍｕｔａｎｓおよび／またはＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを含む硬組織再生治療用組成物。
  2. Ｓ．ｍｕｔａｎｓおよび／またはＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓが菌体破砕物である請求項１に記載の硬組織再生治療用組成物。
  3. Ｓ．ｍｕｔａｎｓおよび／またはＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの菌体破砕物に含まれるタンパク質の濃度が１００μｇ／ｍｌ未満である請求項１または２に記載の硬組織再生治療用組成物。
  4. 象牙質および／または歯周組織の再生に用いる請求項１～３のいずれかに記載の硬組織再生治療用組成物。
  5. 請求項１～４のいずれかに記載の硬組織再生治療用組成物を有効成分として含む歯髄覆罩剤。
  6. 請求項１～４のいずれかに記載の硬組織再生治療用組成物を有効成分として含む骨組織の再生用治療剤。
  7. Ｓ．ｍｕｔａｎｓおよび／またはＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを含む細胞の分化促進用組成物。
  8. Ｓ．ｍｕｔａｎｓおよび／またはＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを含む細胞のアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）活性向上用組成物。
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