WO2010050604A1

WO2010050604A1 - 光造形法によって作製され細胞適合化処理を施された３次元物体

Info

Publication number: WO2010050604A1
Application number: PCT/JP2009/068734
Authority: WO
Inventors: 幸士生田; 佳則井上
Original assignee: 独立行政法人科学技術振興機構
Priority date: 2008-10-30
Filing date: 2009-10-26
Publication date: 2010-05-06
Also published as: US8845948B2; JP5114362B2; EP2351825A1; US20110268948A1; EP2351825A4; JP2010104285A; EP2351825B1

Abstract

光造形法にて作製された３次元物体を無毒化し、細胞適合性を付与された３次元構造物を提供することにある。細胞適合性とは、材料が細胞に対して無毒性であり細胞の生存活動に悪影響を与えない材料の性質を指す。光造形法で成形した３次元物体を１時間ＵＶランプに照射し硬化を促進させる。その３次元物体を少なくとも１７５℃にて少なくとも６時間の加熱処理を行う。この際加熱処理温度が採用材料の熱軟化温度の指標であるガラス転移温度を上回る温度であっても問題ない。本発明は光造形法で成形された微細構造を持つ３次元物体を対象としている。微小な構造体であれば寸法則により熱処理した際に問題となる自重による変形が減少される。その結果本発明によって得られる３次元物体の寸法は熱処理の前後でほとんど変化しない。

Description

光造形法によって作製され細胞適合化処理を施された３次元物体

　本発明は光造形法が属する固体自由形状製造法分野、それに用いられる光硬化性材料分野、及び材料の細胞適合性付与分野の技術に関するものであり、特に物体が長期にわたり単離された細胞と接触しながら細胞適合性に関して無毒化された物体に関するものである。

　マイクロ光造形法は光硬化性樹脂にレーザ照射して任意の立体的なマイクロ構造を作製可能な微細加工の手法である。１９９２年、本発明者である生田らにより世界で初めて５μｍの３次元分解能が達成され（非特許文献１参照）、その後多くの研究が展開されてきた（非特許文献２参照）。さらにサブミクロンの分解能を有したナノ光造形法も開発されている。近年では微細流路内で化学反応や分析を行うμ−ＴＡＳやＭＥＭＳデバイスの開発に応用も試みられ始めている（非特許文献３~５参照）。
　しかし、市販されている光造形樹脂には生体適合性がないため、生体や細胞に直接触れるデバイスには使用できないという根本的な問題があった（非特許文献６~８参照）。
　この問題を解決するため、本発明者らは生体適合性を持ち、かつ十分な硬化特性と硬化精度を有する新規の光硬化性樹脂を開発する研究アプローチではなく、光硬化特性が保証され、特性が安定している市販のエポキシ系光造形樹脂に細胞適合性を付与するという、より汎用性と実用性にこだわった研究アプローチに挑戦した。
　従来、光造形物が直接細胞や生体と接触する応用としては、以下の研究が存在する。
　第１の研究は、細胞毒性の高い光重合開始剤を避け、ｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅやｐｏｌｙ（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ　ｆｕｍａｒａｔｅ）などの生分解性の高分子を素材に使用して光造形を行う手法である（非特許文献８~１１参照）。この手法は樹脂の合成工程や調合工程が不可欠となる。さらに、再生医療用の生分解性の細胞の足場作製を目的にしているため、本研究の目的である非分解性のデバイスには適用できない。
　第２の研究は、Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｇｒｙｃｏｌなどのｈｙｄｒｏｇｅｌを材料に細胞の足場を作製する手法である（非特許文献７、１３参照）。ｈｙｄｒｏｇｅｌの表面や内部で細胞培養が可能であることが報告されているが、ｈｙｄｒｏｇｅｌは強度が低いため、デバイス作製には適用困難である。
さらに、乾燥収縮に起因した加工精度の問題もあり本研究の目的を満たさない。
　第３の研究は市販の光造形樹脂を用いて立体的な格子構造の表面に細胞を培養した研究がある。しかし平面構造での細胞培養には失敗している（非特許文献１４）。
Ｉｋｕｔａ　Ｋ，Ｈｉｒｏｗａｔａｒｉ　Ｋ．Ｒｅａｌ　ｔｈｒｅｅ　ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ　ｍｉｃｒｏ　ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ　ｕｓｉｎｇ　ｓｔｅｒｅｏ　ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ　ａｎｄ　ｍｅｔａｌ　ｍｏｌｄｉｎｇ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＩＥＥＥ　Ｗｏｒｋｓｈｏｐ　ｏｎ　Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＥＭＳ’９３．１９９３：４２−４７．Ｂｅｒｔｓｃｈ　Ａ，Ｊｉｇｕｅｔ　Ｓ，Ｂｅｒｎｈａｒｄ　Ｐ，Ｒｅｎａｕｄ　Ｐ．Ｍｉｃｒｏｓｔｅｒｅｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ：ａ　Ｒｅｖｉｅｗ．Ｍａｔ．Ｒｅｓ．Ｓｏｃ．Ｓｙｍｐ．Ｐｒｏｃ．２００３，ＬＬ１．１．１−ＬＬ１．１．１３Ｍａｒｕｏ　Ｓ，Ｉｋｕｔａ　Ｋ，Ｋｏｒｏｇｉ　Ｈ．Ｓｕｂｍｉｃｒｏｎ　ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ　ｔｏｏｌｓ　ｄｒｉｖｅｎ　ｂｙ　ｌｉｇｈｔ　ｉｎ　ａ　ｌｉｑｕｉｄ．Ａｐｐｌ　Ｐｈｙｓ　Ｌｅｔｔ　２００３；８２：１３３−１３５Ｋａｗａｔａ　Ｓ，Ｓｕｎ　ＨＢ，Ｔａｎａｋａ　Ｔ，Ｔａｋａｄａ　Ｋ．Ｆｉｎｅｒ　ｆｅａｔｕｒｅｓ　ｆｏｒ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ　２００１；４１２：６９７−６９８Ｍａｒｕｏ　Ｓ，Ｉｋｕｔａ　Ｋ．Ｓｕｂｍｉｃｒｏｎ　ｓｔｅｒｅｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｒｅｅｌｙ　ｍｏｖａｂｌｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ｓｉｎｇｌｅ−ｐｈｏｔｏｎ　ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｓｅｎｓｏｒ　Ａｃｔｕａｔ　Ａ−ｐｈｙｓ　２００２；１００：７０−７６．Ｌｕ　Ｙ，Ｃｈｅｎ　ＳＣ．Ｍｉｃｒｏ　ａｎｄ　ｎａｎｏ−ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ　ｐｏｌｙｍｅｒｓ　ｆｏｒ　ｄｒｕｇ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ａｄｖ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖ　Ｒｅｖ．２００４；１１：１６２１−３３．Ｔｓａｎｇ　ＶＬ，Ｂｈａｔｉａ　ＳＮ．Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ　ｔｉｓｓｕｅ　ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ．Ａｄｖ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖ　Ｒｅｖ．２００４；１１：１６３５−４７．Ｐｏｐｏｖ　ＶＫ，Ｅｖｓｅｅｖ　ＡＶ，Ｉｖａｎｏｖ　ＡＬ，Ｒｏｇｉｎｓｋｉ　ＶＶ，Ｖｏｌｏｚｈｉｎ　ＡＩ，Ｈｏｗｄｌｅ　ＳＭ．Ｌａｓｅｒ　ｓｔｅｒｅｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ　ａｎｄ　ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌ　ｆｌｕｉｄ　ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　ｆｏｒ　ｃｕｓｔｏｍ−ｄｅｓｉｇｎｅｄ　ｉｍｐｌａｎｔ　ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ．Ｊ　Ｍａｔｅｒ　Ｓｃｉ　Ｍａｔｅｒ　Ｍｅｄ．２００４；２：１２３−８．Ｌｅｅ　ＪＷ，Ｌａｎ　ＰＸ，Ｋｉｍ　Ｂ，Ｌｉｍ　Ｇ，Ｃｈｏ　ＤＷ．３Ｄ　ｓｃａｆｆｏｌｄ　ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ＰＰＦ／ＤＥＦ　ｕｓｉｎｇ　ｍａｃｒｏ−ｓｔｅｒｅｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ．Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｎ　Ｅｎｇ　２００７；８４：１７０２−１７０５．Ｍａｔｓｕｄａ　Ｔ，Ｍｉｚｕｔａｎｉ　Ｍ．Ｌｉｑｕｉｄ　ａｃｒｙｌａｔｅ−ｅｎｄｃａｐｐｅｄ　ｂｉｏｄｅｇｒａｂｌｅ　ｐｏｌｙ（ｅ−ｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎ−ｃｏ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｒｅｎｅ　ｃａｒｂｏｎａｔｅ）．ＩＩ．Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−ａｉｄｅｄ　ｓｔｅｒｅｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｉｃ　ｍｉｃｒｏａｒｃｈｉｔｅｃｔｕａｌ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｐｈｏｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ．Ｊ　Ｂｉｏｍｅｄ　Ｍａｔｅｒ　Ｒｅｓ．２００２；３：３９５−４０３．Ｌｅｅ　ＫＷ，Ｗａｎｇ　Ｓ，Ｆｏｘ　ＢＣ，Ｒｉｔｍａｎ　ＥＬ，Ｙａｓｚｅｍｓｋｉ　ＭＪ，Ｌｕ　Ｌ．Ｐｏｌｙ（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ　ｆｕｍａｒａｔｅ）ｂｏｎｅ　ｔｉｓｓｕｅ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｓｃａｆｆｏｌｄ　ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ　ｕｓｉｎｇ　ｓｔｅｒｅｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ：ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｒｅｓｉｎ　ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　ｌａｓｅｒ　ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２００７；４：１０７７−８４．Ｃｏｏｋｅ　ＭＮ，Ｆｉｓｈｅｒ　ＪＰ，Ｄｅａｎ　Ｄ，Ｒｉｍｎａｃ　Ｃ，Ｍｉｋｏｓ　ＡＧ．Ｕｓｅ　ｏｆ　ｓｔｅｒｅｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ　ｔｏ　ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ　ｃｒｉｔｉｃａｌ−ｓｉｚｅｄ　３Ｄ　ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ　ｓｃａｆｆｏｌｄｓ　ｆｏｒ　ｂｏｎｅ　ｉｎｇｒｏｗｔｈ．Ｊ　Ｂｉｏｍｅｄ　Ｍａｔｅｒ　Ｒｅｓ　Ｂ　Ａｐｐｌ　Ｂｉｏｍａｔｅｒ．２００３；２：６５−９．Ａｒｃａｕｔｅ　Ｋ，Ｍａｎｎ　ＢＫ，Ｗｉｃｋｅｒ　ＲＢ，Ｓｔｅｒｅｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ　ｏｆ　Ｔｈｒｅｅ−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ　Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ　Ｐｏｌｙ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ　Ｇｌｙｃｏｌ）Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ　ｗｉｔｈ　Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ　Ｃｅｌｌｓ．Ａｎｎ　Ｂｉｏｍｅｄ　Ｅｎｇ　２００６；３４：１４２９−１４４１．Ｌｅｅ　ＳＪ，Ｋａｎｇ　ＨＷ，Ｋａｎｇ　ＴＹ，Ｋｉｍ　Ｂ，Ｌｉｍ　Ｇ，Ｒｈｉｅ　ＪＷ，Ｃｈｏ　ＤＷ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｓｃａｆｆｏｌｄ　ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｕｓｉｎｇ　ａｎ　ａｘｉｏｍａｔｉｃ　ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｊ　Ｍｉｃｒｏｍｅｃｈ　Ｍｉｃｒｏｅｎｇ　２００７；１７：１４７−１５３．Ｊｏｎｅｓ　ＣＥ，Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ　ＣＫ，Ｃｏｕｌｓｏｎ　ＥＪ，Ｔａｙｌｏｒ　ＰＪ．Ｃｏｐｐｅｒ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｏｘｉｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ：ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ａｎｄ　ｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｊ　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ　２００７；１０２：１０３５−１０４３．

　前述したように、従来光造形法を用いて作製した３次元物体は、反応時の硬化時の不均一性や光硬化性材料そのものに含まれているモノマー、オリゴマー、光重合開始剤、フリーラジカル、ポリオールや安定剤などにより、それらが細胞毒性を示すことが以前より報告されている（特許文献１）。
　また、生体に長期間にわたって接触する用途に対しては多くの生分解性材料が、生体適合性材料として提案されている（特許文献２、非特許文献１０、１２）。このように従来の技術では材料の無毒化をおこなうことではなく無毒性の材料を作製することに主眼が置かれてきた。ほかには、光造形法を用いて作製した３次元物体を後処理で無毒化をしようとする試みが行われている（特許文献１）がその適用は少なくとも長期にわたる皮膚接触生体適合性である。
特開２００３−１０３１２特開２００７−２８４５５０

　そこで、本発明者等は上記研究結果から、光造形物の細胞毒性は光造形物に含まれる未硬化のモノマや光重合開始剤であると推定した。未硬化のモノマの重合を促進し、かつ光重合開始剤の影響を抑える目的で、各種の「ポストキュア」（光造形後にさらに重合硬化を進行させることを意味する）によって、細胞毒性を抑制する手法を検討した。
　光造形法で成形された３次元物体は、それらの有する細胞毒性のために製品としての応用範囲が限定される。一般に毒性のある材料を生体に接触が起こる製品に使用する場合、無毒化するプロセスを追加して施す必要がある。また、従来材料に毒性がある場合でも３次元加工自体の精度は保証されているので新規に光硬化性材料を開発する場合に比して産業応用のメリットが大きい。
　そのため、本発明の目的は、光造形法にて作製された３次元物体を無毒化し、細胞適合性を付与された３次元構造物を提供することにある。細胞適合性とは、材料が細胞に対して無毒性であり細胞の生存活動に悪影響を与えない材料の性質を指す。

　このため、本発明が採用した技術解決手段は、
　マイクロ光造形法により作製された微小構造の３次元物体であって、前記物体が少なくとも生体外において単離培養された細胞が前記物体表面で接触培養可能な細胞適合性に関して無毒化されており、さらにその無毒化は、前記物体を紫外線によって硬化させた後、少なくとも物体のガラス転移点温度にすることによって行なわれていることを特徴とする３次元物体である。
　また、前記物体の成型材料は主剤をアクリレート、エポキシ、アクリレート・エポキシ複合体、オキセタンからなる群より選択される光硬化性物質から成形されていることを特徴とする３次元物体である。
　また、前記転移点温度は約１７５°Ｃ~２００°Ｃ、かつ６時間~２４時間加熱する条件下で行なわれることを特徴とする３次元物体である。
　また、前記物体は物体の少なくとも１つの部位のｘ、ｙ、ｚのいずれかの寸法が少なくとも１ｍｍ未満の部分を有し、かつ物体の温度が物体の少なくともガラス転移温度を超えた場合に自重によって生じる変形を、寸法則の効果により減少させることを特徴とする３次元物体である。

　本発明によれば、光造形によって作製された３次元物体は市販されている細胞培養皿と同等の水準の細胞適合性を持つことが確認された。本発明により、光造形法で作製された３次元物体を細胞適合性が求められる製品への応用可能性が拓かれる。
　また本発明によればこれまで不可能であったマイクロ光造形法を用いたテーラーメイド体内埋込デバイスの設計や、３次元配置された細胞デバイス、化学ＩＣチップなどのマイクロ化学デバイスの細胞応用が可能になる。本発明は生体医用分野に新しい応用の道を拓くキーテクノロジーとなる。

　図１は光造形法により３次元物体を作製する説明図である。
　図２は細胞播種後４８時間の位相差顕微鏡像である。Ｐ）は市販の細胞培養ディッシュに播種した条件である。ａはポストキュア温度が１５０°Ｃであり加熱時間が６時間（ａ−１）と１２時間（ａ−２）が示してある。またｂ−１、２、３は加熱温度が１７５°Ｃであり、加熱時間がそれぞれ６、１２、２４時間である。またｃ−１、２、３は加熱温度が２００°Ｃであり、加熱時間がそれぞれ３、６、１２時間である。細胞増殖率はｂ−３、ｃ−２、ｃ−３がＰと統計的に同等の細胞増殖率を示している。すべての写真のバーは５０μｍを示している。
　図３は光造形法で作製した細胞培養容器内で培養した細胞の４８時間後の各種ポストキュア条件における細胞増殖率のグラフである。＊は、ポジティブコントロール群である、市販の細胞培養皿上の細胞と細胞増殖率が統計的に有意な差がないことを示している（α＝０．０５）。
　図４は各ポストキュア条件の表である。実施例において各種ポストキュア条件を表にしたものである。
　図５は光造形物を４０時間漬した水の吸光度を示している。ポストキュアをしていない光造形物を漬した水には２４９ｎｍと２００ｎｍ近傍をピークとする吸収スペクトルがみられる。これは光造形物から溶出があり、その物質の吸光度が測定されていると考察される。一方ポストキュア処理を行なった光造形物からはそのような吸光度をもった物質は水に溶出しないことが確認されている。
　図６は細胞播種後４８時間の位相差顕微鏡像である。種々の樹脂への適用を検討するためにｄ）ＳＣＲ７５１、ｅ）ＳＣＲ７０１、ｆ）ＳＣＲ１１１２０で培養試験を行なった。添え字１）はポストキュアなし、添え字２）はポストキュアありの光硬化性樹脂上に細胞を播種している。全ての樹脂でポストキュアが有効であることがわかる。写真のバーは全て５０μｍである。

１　　　ＵＶレーザ
２　　　液体樹脂
３　　　固体ポリマー

　光造形法で成形した３次元物体を１時間ＵＶランプに照射し硬化を促進させる。その３次元物体を少なくとも１７５°Ｃでは少なくとも２４時間、少なくとも２００°Ｃでは６時間の加熱処理を行う。この際加熱処理温度が採用材料の熱軟化温度の指標であるガラス転移温度を上回る温度であっても問題ない。本発明は光造形法で成形された微細構造を持つ３次元物体を対象としている。微小な構造体（たとえば物体の少なくとも１つの部位のｘ、ｙ、ｚのいずれかの寸法が少なくとも１ｍｍ未満の部分を有しているもの）であれは寸法則により熱処理した際に問題となる自重による変形が減少される。その結果本発明によって得られる３次元物体の寸法は熱処理の前後でほとんど変化しない。この３次元物体上で細胞適合性試験を行ったところ、３次元物体に細胞適合性が付与されたことが確認された。
実施形態

〔ポストキュアによる細胞適合性化実験〕
（材料と方法）
　光造形法
　本発明の３次元物体の形成手法が図１に示されている。
　マイクロ光造形法の手順は以下のようである。
１．３次元ＣＡＤに３次元造形モデルを設計データを元に入力する。
２．３次元造形モデルをＺ軸に水平な面で切り取ったｎ層のＸ−Ｙ平面データに変換する。
３．１層目からＸ−Ｙ平面でレーザーを走査させて樹脂を硬化させる。
４．１層レーザの走査が終わる毎に次の未硬化樹脂層を張り、ｎ層まで繰り返す（図１）。
　以上の行程で作製された光造形物は、超音波洗浄機にてＧｌｙｃｏｌ　ｅｔｈｅｒ　ｅｓｔｅｒ中で３分、その後引き続いて９９．５％　Ｅｔｈａｎｏｌ中で３分間洗浄した。光造形物はその後デシケータ内で保管した。
　マイクロ光造形装置の光源にはＨｅ−Ｃｄ　レーザー（３２５ｎｍ，ＫＩＭＭＯＭ　ＫＯＨＡ　Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を用いた。
　光造形で使用した各条件はレーザパワー１５ｍＷ、レーザスキャン速度８００ｍｍ／ｓ、スキャン間隔１５μｍ、積層間隔１００μｍでおこなった。
　光造形法を用いて作製した培養容器での細胞適合性を評価するために細胞培養容器を作製した。細胞培養容器は外径１６ｍｍ、内径１５ｍｍ、底面厚さ０．８ｍｍ、高さ２ｍｍで作製した。
　光硬化性樹脂
　光造形にはエポキシ系の汎用光硬化性樹脂（ＳＣＲ−７５１，Ｄ−Ｍｅｃ：臨界露光量　２０ｍｊ／ｃｍ２、硬化後のガラス転移温度　１０８℃）を使用した。
種々の樹脂での特性を調べるため汎用光硬化性樹脂に加え、エポキシ系の汎用、耐湿光硬化性樹脂（ＳＣＲ−７０１，Ｄ−Ｍｅｃ）、この樹脂の臨界露光量は３３ｍｊ／ｃｍ２、硬化後のガラス転移温度は８１℃である。エポキシ系の耐水靭性光硬化性樹脂（ＳＣＲ１１１２０、Ｄ−Ｍｅｃ）この樹脂の臨界露光量は１２ｍｊ／ｃｍ２、ガラス転移温度は４３℃である。これら２種類を加えた３種類の樹脂をＸｅランプで硬化させた培養試験に使用した。
　なお光硬化性樹脂として上記の他に主剤をアクリレート、エポキシ、アクリレート・エポキシ複合体、オキセタンからなる群より選択される光硬化性物質を使用することができる。
細胞培養
　神経毒の評価の際にモデル細胞としてよく用いられるラット褐色腫由来細胞株（ＰＣ１２，ＲＢＣ０００９，Ｒｉｋｅｎ　Ｃｅｌｌ　ｂａｎｋ，Ｔｓｕｋｕｂａ）を使用した１５）。使用培地はＤＭＥＭ（ＭＥＤ−００６，ＩＷＡＫＩ）＋１０％　Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ＋１０％　Ｈｏｒｓｅ　Ｓｅｒｕｍで、５．１ｘ１０^２ｃｅｌｌ／ｍｍ^２に細胞懸濁液を調整し、３７℃、ＣＯ_２　５％環境で培養をおこなった。
　ポジティブコントロールは９６ｗｅｌｌ　ＭｉｃｒｏＷｅｌｌｐｌａｔｅ（３８６０−０９６，ＩＷＡＫＩ）で培養した。
経過観察と計数および評価
　マイクロ光造形で作製した培養容器内に播種した細胞の観察は位相差顕微鏡でおこなった。培養容器底面の中心から３、４．５、６ｍｍの位置で位相像を撮影した。この写真から細胞の形態を観察し、細胞密度を計測した。初期濃度の分散の影響を低減させるために、細胞増殖率とポストキュアの条件の関係を評価した。細胞増殖率γは、播種後１時間後の細胞密度ｘと、４８時間後の細胞密度ｙを測定し、γ＝ｙ／ｘ×１００で算出した。
細胞適合性
　本報で検討する細胞適合性とは、光硬化性樹脂の表面に細胞が接着し、増殖することと定義する。
統計
　得られた細胞増殖率のデータはｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ−ｔｅｓｔを用いて統計処理をおこなった。ポジティブコントロールと比較してα＜０．０５において有意に差があるとした。各条件のサンプル数はｎ＝１２である。
（ポストキュア手法の検討）
　重合反応を完全に終了させるために後工程を行うポストキュアには、マイクロ光造形終了後に水銀ランプ等にあてる「後露光法」と環境温度をあげて硬化を促進させる「ポストベイク法」の２種類がある。
　本研究ではマイクロ光造形法で作製した培養容器を、後露光とポストベイクの両者を併用したポストキュア処理を行った。具体的には造形終了後Ｘｅｎｏｎランプ（Ｌ２４２３，Ｈａｍａｍａｔｓｕ　Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ）に１時間露光する。その後さらにオーブン（ＤＲＤ３６０ＤＡ，Ａｄｖａｎｔｅｃ）で室温、１５０、１７５、２００°Ｃの温度で０．５、３、６、９、１２、２４時間の各条件で処理をおこなった（図４）。これら培養容器は、細胞培養試験に使用する前に滅菌のためにＵＶライト下で１時間滅菌処理してから培養試験に使用した。
　Ｘｅｎｏｎランプで硬化させた培養プレートは２００°Ｃ、６時間のポストベイク処理を行った。
（実験結果）
　後露光とポストベイクを経た光造形培養容器はうすい褐色に変色していた。ポストキュア前の光硬化時点の樹脂はうすい黄色の透明であるが、ポストベイクの温度が高いほど、また加熱時間が長くなるほどに褐色が濃くなり光の透過性が低くなっていた。
　培養実験の結果は以下である。
　１）ポストキュア処理を行わなかった光造形培養容器内では３時間後に大半の細胞は死滅した。
　２）図２に示すように光造形培養容器にポストキュアをおこなったサンプルでは、条件により細胞の生存が確認された。４８時間後に図２−Ｐに示すようにポジティブコントロール群では細胞がほぼコンフルエントになり、同様に１７５°Ｃで２４時間以上加熱した条件、及び２００°Ｃで６時間以上加熱した条件で細胞がコンフルエントに達していることが観察された。（図２、ｂ−３、ｃ−２、ｃ−３）
　３）図３（ａ）に示すようにポストベイクの温度が１５０°Ｃでは加熱時間によらずポジティブコントロールの細胞増殖率との間には有意な差が認められた。
　４）図３（ｂ）に示すようにポストベイクの温度が１７５°Ｃでは３０分から１２時間加熱の条件の細胞の増殖率はポジティブコントロールと有意な差が認められたが、２４時間の加熱を行った条件では差は認められなかった。
　５）２００°Ｃのポストベイクをした条件では図３（ｃ）に示すように６時間以上の加熱をした条件でポジティブコントロールと細胞増殖率の差が見られなかった。
　以上の結果から、加熱時間が最短で、市販の細胞培養ディッシュと同じ増殖率を得るポストベイクの最適条件は２００°Ｃ、６時間であることが示された。
〔光造形物からの溶出物の検定〕
　前述の実験により、重合開始剤を除去することが細胞適合化の条件であるとする独自の仮説に立脚したポストキュアの有効性と、その条件が明確になった。これを、より精密に検証するため、光造形物からの溶出物質の検出の有無を確認した。
（材料と方法）
　マイクロ光造形法を用いて、表面４９６．８ｍｍ^２体積１３５．９ｍｍ^３の培養容器形状を作製した。その他の条件は前記段落〔００１１〕に同じである。この培養容器を前章で明確となった最適条件である少なくとも１７５°Ｃでは少なくとも２４時間、少なくとも２００°Ｃでは６時間のポストベイクによるポストキュアを行った。
　比較のためポストキュア処理培養容器と、未処理培養容器を５ｍｌのｍｉｌｌｉＱ水にそれぞれ１つ（Ｖｏｌ．＝１３５．９ｍｍ^３）と２つ（Ｖｏｌ．＝２７１．８ｍｍ^３）の条件で４０時間浸けた。この水を紫外吸収分光器（ＢｉｏＳｐｅｃ−１６００，Ｓｈｉｍａｄｚｕ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて吸光度を測定し、吸収スペクトルを得た。吸光度は水の吸収スペクトルが０になるように補正した。光路長は１ｃｍで測定した。
（実験結果）
　前述の通りポストキュア手法によって光造形樹脂の硬化が促進された場合、細胞毒性の原因と仮定した光重合開始剤や未硬化モノマの溶出が抑制されていることが推察される。前述の細胞適合化試験により、光造形樹脂を細胞適合化する条件が明確になったため、ポストキュア処理と光造形樹脂から水への溶出の関係を調べた。紫外吸収分光法を用いた。その結果、図５に示すようにポストキュア処理前の硬化した光造形樹脂からは、２４９ｎｍ、及び２００ｎｍ近傍の吸収スペクトルを持つ溶出物が確認された。吸収スペクトルの吸光度ピークの大きさは溶媒中の樹脂体積に相関しているので該物質は樹脂からの溶出物であると推定される。反面ポストキュア処理後の光造形樹脂からはそれらの吸収スペクトルは検出されなかった。
　本実験で使用した光造形樹脂は軟化が始まるガラス転移温度が１０８°Ｃであるため、負荷時や自重でポストベイク工程中に変形する可能性がある。しかし、マイクロ光造形法では数ミクロンから１ｍｍ程度の微小構造物が主体となるため、「スケール効果」により体積力が表面積力に比べて十分小さくなる。その結果熱変形は無視できる程度に小さくなる。本手法はマイクロスケールでは対象物の形状に制限がなく適用可能である。
　以上のようにポストキュアを施さなかった光造形培養容器を浸した水からは、２４９ｍｍと２００ｍｍ近辺にピークを持つ吸収スペクトルが検出され、また光造形樹脂の体積が多くなると吸光度が大きく、すなわち溶出物の濃度が高くなった（図５参照）。
　一方ポストキュアをおこなった光造形培養容器を浸けた水からは、これら２つのピークは検出されなかった。以上の結果は溶出物が細胞増殖を阻害していることを示しており、我々の仮説と解決策が正しいことを証明するものである。
〔ポストキュアの汎用性検討〕
　次に本ポストキュア手法が他種の光硬化樹脂にも有効であるかを実験的に検討した。
（材料と方法）
　前述のＳＣＲ−７５１に加え、エポキシ系の汎用、耐湿光硬化性樹脂（ＳＣＲ−７０１、Ｄ−Ｍｅｃ：臨界露光量　３３ｍｊ／ｃｍ２、硬化後のガラス転移温度　８１℃）及びエポキシ系の耐水靭性光硬化性樹脂（ＳＣＲ１１１２０、Ｄ−Ｍｅｃ：臨界露光量　１２ｍｊ／ｃｍ２、ガラス転移温度　４３℃）のこれら２種類を加えた３種類の樹脂をＸｅｎｏｎランプで硬化させ培養試験に使用した。
　３種の光硬化性樹脂をそれぞれシリコンゴムの鋳型に光硬化性樹脂を流し込みφ１６ｍｍ厚さ０．８ｍｍの円形プレートをＸｅｎｏｎランプで露光、硬化させた。その後ポストベイクを２００°Ｃ、６時間行って細胞培養試験をおこない（図４：２１−２６）、細胞播種後４８時間後の細胞の様子を位相差顕微鏡像で観察した。
（実験結果）
　試料のエポキシ系光造形樹脂はどの種も、ポストキュアをおこなわずに細胞培養試験をおこなうと細胞がプレート表面に接着できずに死滅していた（図６：ｄ−１、ｅ−１、ｆ−１）。一方、ポストキュアをおこなった場合、実験に使用した３種類すべての光造形樹脂のプレート上で細胞が生存していた（図６：ｄ−２、ｅ−２、ｆ−２）。この結果から、ポストキュア処理の汎用性が実証された。
〔考察〕
　エポキシ系光造形樹脂に細胞適合性を付与するためには光造形物を２００°Ｃで６時間のポストキュアおこなえばよいことが明確になった。これはマイクロ光造形法で作製した光造形物に直接細胞を接着させて市販の細胞培養皿と同等の培養に成功した世界で初めての成果である。２００°Ｃよりも高い温度でポストベイクをおこなうと光造形培養容器内が観察困難なほどに褐色に変色した。変質を最小限にするため、最短時間での光造形物への細胞適合性を付与するプロセスは２００°Ｃ、６時間であった。
　Ｐｏｐｏｖらは光硬化性ポリマとＨｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ複合体の光造形物から炭酸ガスの超臨界洗浄を用いて細胞毒を取り除いたと報告している（非特許文献８）。また、Ａｒｃａｕｔｅらは光重合開始剤の濃度と細胞毒性の相関を報告している（非特許文献１３）。Ｌｅｅらは光造形樹脂で作製した足場の形状で細胞活性が変動すると報告している（非特許文献１４）。しかしこれらの報告は通常の培養法で得られた細胞活性と比較されているわけではなく、培養成績が向上する１つの条件を提示しているにすぎず、日常的に用いられている細胞培養ディッシュと遜色のない細胞適合性を達成した本研究の成果とは比較するべきものではない。
　上述したポストベイク温度は光造形樹脂のガラス転移点を超えており、荷重がかかった状態や自重が重い構造の場合はポストベイク行程で形状が変形する可能性がある。しかし、マイクロ光造形法の場合、数ミクロンから１ｍｍ程度の微小構造の作製が主体となる。
このような微小領域では、「スケール効果（寸法則）」により重力などの体積力が表面積力に比べ作用が小さくなるため、ポストキュア処理での熱変形は大幅に小さくなる。そのため本手法はマイクロスケールでは対象物の形状に制限がなく様々な応用が可能になる。
　図５に示すように、ポストキュアにより光造形物から水への溶出物が激減することが紫外線分光法によって観測された。本論文の最初に立てた仮説である「未硬化モノマや光重合開始剤といった低分子が、ポストキュアによって溶出しなくなる」を裏付けるデータとなった。
　３種の市販エポキシ系光造形樹脂にすべて同じ条件で細胞適合性を付与できた。この試験によって本手法の妥当性と一般性が示された。
実施例１
　光造形法を用いて３次元形状の細胞培養容器を成形した。より詳細には、外径１６ｍｍ、内径１５ｍｍ、壁面高さ２ｍｍ、底面厚さ０．８ｍｍの形状の細胞培養容器を成形した。この際材料はＳＣＲ７５１（ガラス転移温度１０８°Ｃ、株式会社ディーメック、東京都中央区）を用いた。作製した細胞培養容器に硬化を促進するために水銀キセノンランプ（Ｌ２４２３、浜松ホトニクス、静岡県浜松市）を１時間照射した。その後それぞれ温度の条件１５０、１７５、２００°Ｃ、加熱時間の条件０．５、３、６、９、１２、２４時間の１８通りの条件で熱処理をおこなった。これら細胞培養容器内にＰＣ１２細胞（ラット褐色種由来細胞株）を播種し４８時間後の細胞数を比較したところ図２に示すように、２００°Ｃにて６時間以上、及び１７５°Ｃにて２４時間加熱した細胞培養容器内部の４８時間後の細胞数と播種直後の細胞数の比と別途培養した市販の細胞培養皿上の４８時間後の細胞数と播種直後の細胞数の比は統計的に検定したところ有意な差がなかった。この関係を図３に示す＊印にて示した。これをもって２００°Ｃ、６時間以上の加熱処理を行うことで、光造形法で形成された細胞培養容器に細胞適合性が付与されたことが示された。
　さらに本発明の手法が光造形法で形成された細胞培養容器からの毒性物質の溶出を防止していたことを示すために、光造形法を用いて成形した細胞培養容器で、２００°Ｃ、６時間の熱処理をおこなったものと熱処理を行っていないものを水中に４０時間保存した。これらの細胞培養容器を保存した水に対して紫外吸収分光法を用いて吸収スペクトルを測定した。その結果、図３に示すように未処理の光造形法で形成された細胞培養容器を漬した水は２４９ｍｍ、及び２００ｎｍ近辺の波長の吸収スペクトルの図３の２に示すピークが見られたが、熱処理をおこなった細胞培養容器を漬した水からはそれらピークは３のように検出されなかった。これは即ち本発明の熱処理によって該３次元物体から水への毒性物質の溶出が防止されたことを示している。
　次に本発明が他種の光硬化性樹脂にも有効であることを検討するためにＳＣＲ７５１に加えてＳＣＲ１１１２０（ガラス転移温度４３°Ｃ、ディーメック）、ＳＣＲ７０１（ガラス転移温度８１°Ｃ、ディーメック）について本発明の効果を検討した。水銀キセノンランプで硬化させたこれら３種を２００°Ｃ、６時間の熱処理をおこなった。この光硬化性樹脂上で細胞培養試験をおこなったところ本発明の効果が確認された。
　以上詳細に説明したように本発明では光造形物に細胞適合性を付与する汎用的手法を開発しその有効性を示した。本発明によって光造形物は市販の細胞培養ディッシュとほぼ同じ水準の細胞適合性を持つことを定量的に検証した。また、ポストキュア工程で光造形物内部の組成が変化したことを紫外吸収分光法により明らかにし、細胞毒性低減の原因を示した。他の光硬化樹脂に用いた検証実験を行い、本手法が種々の樹脂で有効であることを示した。
　以上実施例をあげて本発明について説明したが、本発明は上記実施例に限定されることはない。

　本発明によればこれまで不可能であったマイクロ光造形法を用いたテーラーメイド体内埋込デバイスの設計や、３次元配置された細胞デバイス、化学ＩＣチップなどのマイクロ化学デバイスの細胞応用が可能になる。生体医用分野に新しい応用の道を拓くキーテクノロジーとなる。

Claims

マイクロ光造形法により作製された微小構造の３次元物体であって、前記物体が少なくとも生体外において単離培養された細胞が前記物体表面で接触培養可能な細胞適合性に関して無毒化されており、さらにその無毒化は、前記物体を紫外線によって硬化させた後、少なくとも物体のガラス転移点温度にすることによって行なわれていることを特徴とする３次元物体。
前記物体の成型材料は主剤をアクリレート、エポキシ、アクリレート・エポキシ複合体、オキセタンからなる群より選択される光硬化性物質から成形されていることを特徴とする請求項１に記載の３次元物体。
前記転移点温度は約１７５°Ｃ~２００°Ｃ、かつ６時間~２４時間加熱する条件下で行なわれることを特徴とする請求項１または２に記載の３次元物体。
前記物体は物体の少なくとも１つの部位のｘ、ｙ、ｚのいずれかの寸法が少なくとも１ｍｍ未満の部分を有し、かつ物体の温度が物体の少なくともガラス転移温度を超えた場合に自重によって生じる変形を、寸法則の効果により減少させることを特徴とする請求項１に記載の３次元物体。