WO2010044451A1 - 魚類のスクーチカ症予防治療ワクチン - Google Patents

魚類のスクーチカ症予防治療ワクチン Download PDF

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nakajima
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真一 北村
準榮 宋
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Meiji Seika Kaisha Ltd
Ehime University NUC
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Ehime University NUC
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    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to a vaccine effective for the prevention or treatment of scotchosis.
  • Non-patent Document 3 the insecticidal effect by immersion with formalin
  • Patent Document 1 the effect of a treatment method using a chemical bath containing hydrogen peroxide
  • Patent Document 2 the formalin-inactivated vaccine of the worm is effective for scourtosis
  • Patent Document 3 Non-Patent Documents 4 and 5
  • an object of the present invention is to provide a vaccine that can be effectively prevented and treated against scourtosis, particularly infection with P. dicentrarchi having a high mortality rate.
  • the inventors of the present invention have dramatically improved the effectiveness against P. dicentrarchi by combining the vaccines obtained by combining vaccines obtained from three different serotypes of the worm.
  • the present inventors have found that effective prevention and treatment can be exerted even against infection of a worm that cannot be prevented by a single vaccine, and have completed the combination vaccine of the present invention.
  • the present invention [1] (1) Inactivated product of the same serotype as Philasterides dicentrarchi Iyo I strain, (2) Strain of the same serotype as Philasterides dicentrarch Nakajima strain An inactivated product, and (3) a mixed vaccine for prevention or treatment of scotchosis, comprising as an active ingredient an inactivated product of a strain exhibiting the same serotype as the Filasterides decent rat Mie0301; [2]
  • the strain having the same serotype as the Filasterides decent rat Iyo I strain is a strain selected from the group consisting of Iyo I strain, JF05To strain, RF05To strain, and SK05Kyo strain.
  • a method for preventing or treating scourtosis comprising administering the combined vaccine of [1] or [2] in an effective amount to a subject in need of prevention or treatment of scotchosis; [4] (1) strains having the same serotype as the Filasterides decent rat Iyo I strain, (2) strains having the same serotype as the Nakajima strain, and (3) phyllasterides Use of a strain exhibiting the same serotype as that of Decentrarch Mie0301 in the manufacture of a combination vaccine for the prevention or treatment of succinicosis; [5] (1) strains exhibiting the same serotype as the Filasterides decent rat Iyo I strain, (2) strains exhibiting the same serotype as the fibrasterides decent rat Nakajima strain, and (3) phyllasterides.
  • a step of inactivating a strain exhibiting the same serotype as that of the decent rat Mie0301 strain alone or in combination of two or more and
  • the present invention relates to a method for producing a mixed vaccine according to [1] or [2], comprising a step of mixing the obtained inactivated product.
  • the present invention is a highly effective vaccine for the prevention and treatment of succiticosis including infection with P. dicentrarchi with a high mortality rate. More specifically, according to the present invention, it is possible to provide a safe fish vaccine that can be safely administered to cultured fish that are raised on the premise of food.
  • the inactivated vaccine of the present invention can be produced by a simple and low-cost process because P. dicentrarchi can be easily mass-produced in the process of obtaining the antigen and the inactivation method is also simple.
  • the vaccine produced can induce the ability to protect against scourtosis caused by P. dicentrarchi. Therefore, it can greatly contribute to productivity and quality improvement in the aquaculture industry and related industries, and environmental hygiene improvement in aquaculture.
  • FIG. 3 shows the results of Western blotting using sera of Nakajima strain and Mie0301 strain.
  • A, B, C, and D in the figure are reaction profiles of sera of anti-Iyo I strain, SK05Kyo strain, Nakajima strain, and Mie0301 strain, respectively.
  • the leftmost lane in FIG. 1 represents a molecular weight marker.
  • ⁇ , ⁇ , ⁇ , and ⁇ indicate Iyo I strain, Nakajima strain, Mie strain, and MEM control. It is the graph which showed the daily cumulative mortality change of the attack test by the Iyo I stock
  • ⁇ indicates a mixed vaccination group of three species, and ⁇ indicates a MEM control group.
  • the inactivated product of each strain used in the present invention can be prepared according to a conventional method, for example, as follows.
  • P. dicentrarchi hereinafter referred to as “Homoptera” fed fish cell line CHSE-214 (ATCC No. CRL-1681; distributed by Prof. Nagamori Yoshimizu, Hokkaido University graduate School of Fisheries Sciences) Incubate at 20 ° C. for 5 days.
  • the fish cell line CHSE-214 is obtained by using a medium for CHSE-214 cells [Eagle MEM (Minimum Essential Medium) medium formulated with 10% fetal bovine serum (manufactured by Nissui Pharmaceutical: product code 05900) with sodium bicarbonate at pH 7.3.
  • the worms cultured in this manner are collected by centrifugation, and inactivated by adding an inactivating agent such as formalin, glutaraldehyde, ⁇ -propiolactone or the like.
  • an inactivating agent such as formalin, glutaraldehyde, ⁇ -propiolactone or the like.
  • formalin 35% formalin solution is added to a final concentration of 0.3% and inactivated at a temperature of 4 ° C. overnight.
  • inactivation conditions are relaxed if antigenicity is impaired by inactivation.
  • the deactivation agent can be reduced, the pH buffering agent can be added, and the inactivation temperature can be lowered.
  • the protozoa used here are (1) a strain showing the same serotype as Philasterides dicentrarchi Iyo I strain, (2) a strain showing the same serotype as Nakajima strain, and (3) a strain showing the same serotype as Mie0301 strain. That is, three strains showing different serotypes are used.
  • a strain showing the same serotype as the Iyo I strain for example, the JF05To strain, the RF05To strain, and the SK05Kyo strain can be used. These strains were isolated and identified by the group of the present inventors, and the details are shown in Table 1.
  • Iyo type I (cellotype I type)
  • FIGS. 1A and 1B when Western blotting is performed using an anti-Iyo I strain rabbit antibody (FIGS. 1A and 1B), a protein that strongly reacts with 30 kDa is detected (lanes 1 to 4).
  • such proteins are not detected with the anti-Nakajima strain rabbit antibody (FIG. 1C) and the anti-Mie0301 strain rabbit antibody (FIG. 1D).
  • Nakajima type (cellotype II type)
  • a protein strongly reacting with 38 kDa was detected (lane 5).
  • Mie0301 type (cellotype III type), when Western blotting was performed using anti-Nakajima strain rabbit antibody and anti-Mie0301 strain rabbit antibody (FIGS. 1C and 1D), a protein strongly reacting with 34 kDa was detected (lane 6). ).
  • the morphological features of the worms used in the present invention are approximately 30 ⁇ 400 ⁇ m oval and have cilia. Unlike other ciliates, it is tissue phagocytic and feeds not only bacteria but also animal cells (eg, fish cell lines). The worms are also classified taxonomically as Scuticociliatida, Philasterina, and Philasteridae.
  • the subculture of the worms used in the present invention is subcultured to fresh cells once a month under storage at 20 ° C. At least once every few days, the worms are observed under a microscope. If the worms become smaller, they are passaged even within one month. It has been confirmed that the pathogenic change due to the passage is stable for 5 years. In addition, no change in antigenicity due to passage is observed.
  • the three-type mixed vaccine of the present invention is a combination of three inactivated vaccines (preferably formalin-inactivated vaccine) having different serotypes.
  • the ratio of the combination is not particularly limited, but for example, each single vaccine is used in an amount of 1 to 5 times, preferably 1 to 3 times the number of cells for the smallest single vaccine. It is particularly preferable that each single vaccine is mixed at a ratio of 1: 1: 1.
  • the concentration of the combination vaccine of the present invention is not particularly limited. The concentration can be adjusted appropriately according to the usage scene. In particular, if the total amount of each vaccine is 10 5 cells / fish or more, sufficient effectiveness can be obtained.
  • the fish species to which the combination vaccine of the present invention can be applied is not particularly limited as long as it is a fish species with the possibility of developing scotchosis, but flounder, turbot, red sea bream, sea bream, sea bream, maita flounder Etc.
  • any fish species can be used for fish of any age or any size that may be infected. Examples of the usage include oral administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intraperitoneal administration, and immersion treatment. Among them, intraperitoneal administration can induce sufficient immunity with a small amount of antigen.
  • Reference example 1 In order to compare the antigenicity of Philasterides dicentrarchi isolated in different fish species and different regions, an immobilization assay and Western blotting were performed.
  • Immobilization assay Isolates of Philasterides dicentrarchi Iyo I, Nakajima, Mie0301, and SK05Kyo were selected to prepare rabbit serum.
  • test strains Iyo I strain, Nakajima strain, Mie0301 strain, JF05To strain, RF05To strain, and SK05Kyo strain were used.
  • the above antisera diluted 20, 40, 80, 160, 320, 640, 1280 and 2560 times were sensitized with each strain of Philasterides dicentrarchi (about 100 worms).
  • the agglutination and immobilization were observed under a microscope, and the deactivation titer was determined.
  • the results are shown in Table 2.
  • the anti-Iyo I strain serum (antibody) exhibited an aggregate antibody titer of 80 times or more against the Iyo I, JF05To, RF05To, and SK05Kyo strains. However, it was 20 times or less in Nakajima strain and Mie0301 strain.
  • the anti-Nakajima strain serum (antibody) showed an aggregation antibody titer 1280 times that of the Nakajima strain, but was 20 times or less for the remaining 5 strains.
  • the anti-Mie0301 sera (antibody) similar to the results of the anti-Nakajima sera (antibody), high immobilization was observed only in the homozygous Mie0301 strain.
  • SDS-polyacrylamide gel electrophoresis sample buffer containing the same amount of 10% sodium dodecyl sulfate (SDS) was mixed with the suspension, and heated on a heat block at 100 ° C. for 3 minutes. Proteins were separated on the gel from the suspension by SDS-PAGE. This gel was stained with Coomassie Brilliant Blue (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) containing 25% methanol-10% acetic acid.
  • the protein separated on SDS-PAGE was transferred to a polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane, and the membrane was blocked with TBS-T containing 10% skim milk for 2 hours and washed with TBS-T.
  • TBS-T Tris-Buffered Saline-Tween
  • a peroxidase-labeled goat anti-rabbit IgG was used as a secondary antibody for 1 hour.
  • the membrane was washed with TBS-T, and the band was visualized with an HRP (horseradish peroxidase) Conjugate substrate kit (manufactured by Bio-Rad Laboratories).
  • Example 1 Efficacy test of three types of mixed vaccine (1) Preparation of vaccine (a) Test fish 200 larvae of flounder were used as feeds for marine seedlings for otohime flounder (manufactured by Nisshin Marubeni Feed Co., Ltd.) The animals were fed for 2 weeks and preliminarily raised to an average weight of 10.3 g.
  • Vaccination 100 ⁇ L of the formalin-inactivated vaccine prepared in (1) above was inoculated intraperitoneally to flounder (average body weight 10.3 g) so as to have a concentration of 6.76 ⁇ 10 5 cells / fish. Two weeks later, immunization was performed as a booster at a concentration of 9.85 ⁇ 10 5 cells / fish. As a control, 100 ⁇ L of the MEM medium itself used in cell culture was inoculated intraperitoneally.
  • test fish was housed in a 10-liter aquarium and kept under running water for 2 months to confirm the safety. During the breeding period, the animals were fed in the same manner as described above.
  • the Mie0301 strain was inoculated intraperitoneally in the same manner at 4.03 ⁇ 10 5 cells / fish because the pathogenicity of the Mie0301 strain was found to be lower than the other two strains.
  • the effectiveness of the vaccine was determined as an effective rate according to the formula: (1—mortality in the vaccination group / mortality in the control group) ⁇ 100%.
  • Comparative Example 1 Efficacy Test of Single Vaccine (1) Production of Vaccine Test fish and worms were cultured in the same manner as in the Examples. Formalin-inactivated vaccine was prepared from 1.65 ⁇ 10 6 to 9.85 ⁇ 10 6 cells of the cultured worms (Iyo I strain, Nakajima strain and Mie0301 strain) at a final concentration of 0.3%. 35% formalin (manufactured by Nacalai Tesque) was added and inactivated overnight at 4 ° C. to prepare three types of formalin inactivated vaccines.
  • test fish was housed in a 10-liter aquarium and kept under running water for 2 months to confirm the safety. During the breeding period, the animals were fed in the same manner as described above.
  • FIG. 5 attack by Iyo I strain
  • FIG. 6 attack by Nakajima strain
  • FIG. 7 attack by Mie0301 strain
  • the flounder vaccinated with the Iyo I strain was effective against each protozoan attack (Iyo I strain, Nakajima strain and Mie0301 strain) with an effective rate of 41.7%, 0%, and 0% for 13 days of attack, respectively. Yes, even the same serotype was less effective. Only the Iyo I strain was significantly different from the control group at a risk rate of 1% or less.
  • flounder vaccinated with the Nakajima strain is effective against each protozoan attack (Iyo I strain, Nakajima strain and Mie0301 strain), with an effective rate of 0%, 21.4%, and 0% after 13 days of attack.
  • the effect was low even with the same serotype. All strains were not significantly different from the control group.
  • flounder vaccinated with the Mie0301 strain was effective against each protozoan attack (Iyo I strain, Nakajima strain, and Mie0301 strain), with an effective rate of 33.3%, 25.0%, and 13 days of attack, respectively. The effect was low even with the same serotype. Only the Mie0301 strain and the Iyo I strain were significantly different from the control group at a risk rate of 5% or less.
  • Example 2 Efficacy test of three types of mixed vaccine by high-concentration single immunization (1) Preparation of vaccine (a) Test fish 160 larvae of juvenile larvae, feed for marine seedlings for Otohime flounder (Nisshin Marubeni) Feeding Company) was used for 2 weeks and pre-bred to an average body weight of 12.5 g.
  • test fish was housed in a 10-liter aquarium, and was observed for 2 months under running water to confirm safety. During the breeding period, the animals were fed in the same manner as described above.

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Abstract

　スクーチカ症、特に、斃死率の高いPhilasterides dicentrarchiに対して、感染防御をもつ有効的な予防・治療のワクチンを提供する。 　前記ワクチンは、（１）P. dicentrarchi Iyo I株と同じ血清型を示す株の不活化物、（２）P. dicentrarchi Nakajima株と同じ血清型を示す株の不活化物、及び（３）P. dicentrarchi Mie0301株と同じ血清型を示す株の不活化物を有効成分とする。

Description

魚類のスクーチカ症予防治療ワクチン
　本発明は、スクーチカ症の予防又は治療に有効なワクチンに関するものである。
　魚類寄生虫病の１つであるスクーチカ症は、日本では1990年に初めてヒラメで発症が認められている。我が国の2004年の養殖ヒラメ生産額は約93億円である。このうち約20%を占める愛媛県の魚病指導センターにおけるヒラメ魚病診断件数に占めるスクーチカ症の診断率は年間15～20%程度と高く、本症による死亡率は30～70%と推定されている。本症に対する治療・予防法は確立されておらず、本症の発生が原因でヒラメ養殖の廃業を余儀なくされる業者もあるなど、ヒラメ養殖業にとって重要な魚病となっているのが現状である。その後、日本国内だけではなく、韓国においてもヒラメの養殖場において発症例が確認されている。そのため、ヒラメの養殖現場において最も開発が望まれている感染症である。これまで本症の原因となるスクーチカ虫は、Uronema marinumであると報告されていたが、その後、スクーチカ症のヒラメから様々な種類のスクーチカ虫が分離されている。
　近年、本発明者のグループが形態学的・遺伝子的同定を行った結果、Philasterides dicentrarchi（本学名はMiamiensis avidusとシノニムである）が本症の主原因であることを明らかにした（非特許文献１）。さらには、本発明者のグループは、P. dicentrarchiを用いた実験感染により、ヒラメに対する本虫の高い病原性を確認している（非特許文献２）。
　このP. dicentrarchiを含むスクーチカ虫を駆除するために、種々の治療方法が試験されている。例えば、ホルマリンなどによる浸漬による殺虫効果（非特許文献３）を確認したり、過酸化水素を含む薬浴による治療方法による効果（特許文献１）を確認したりしているが、P. dicentrarchiの場合は内部寄生性で宿主魚類の脳内にまで侵入するために、十分な効果が得られているとは言えない。
　そのような状況の中で本虫のホルマリン不活化ワクチンがスクーチカ症に有効であること（特許文献２、非特許文献４および５）や特定の金属を欠如させた淡水浴による予防・治療方法が報告されている（特許文献３）。
特許第３８８２９３９号明細書 国際公開第ＷＯ２００８／０８４１２５号公報 特開２００６－３０６８３４号公報
平成１６年度日本魚病学会大会講演要旨集、６５頁、２００４年 Diseases of Aquatic Organisms、７３巻、２２７～２３４頁、２００７年 愛媛県水産試験場研究報告、第６号、６５～７０頁、１９９７年 平成１７年度日本魚病学会大会講演要旨集、Ａ－２９、３７頁、２００５年 Journal of Fish Pathology,（韓国）,１９巻、２号、１７３～１８１頁、２００６年
　しかしながら、スクーチカ症に有効であるといわれる従来のワクチンであっても、その効果は十分なものであるとは言えず、更なる有効性の高いワクチンの開発が望まれている。特に、本発明者のグループは、本発明において、P. dicentrarchiに３つの血清型が存在し、単一のワクチンでは、その他の血清型の本虫の感染を予防できないことを明らかにした。そこで、本発明は、スクーチカ症、特には、斃死率の高いP. dicentrarchiの感染に対して、有効的に予防・治療可能なワクチンを提供することを目的とするものである。
　本発明者らは鋭意研究を進めた結果、３種類の異なる血清型の本虫によって得られるワクチンを組合せてなる本発明の混合ワクチンが、P. dicentrarchiに対する有効性を飛躍的に向上させるものであり、単一のワクチンでは予防できない本虫の感染に対しても、有効な予防・治療を発揮することを見出し、本発明の混合ワクチンを完成させたものである。
　本発明は、
［１］（１）フィラステリデス・ディセントラーチ（Philasterides dicentrarchi）Iyo I株と同じ血清型を示す株の不活化物、（２）フィラステリデス・ディセントラーチ Nakajima株と同じ血清型を示す株の不活化物、及び（３）フィラステリデス・ディセントラーチ Mie0301株と同じ血清型を示す株の不活化物を有効成分とする、スクーチカ症の予防又は治療用の混合ワクチン；
［２］フィラステリデス・ディセントラーチ Iyo I株と同じ血清型を示す株が、Iyo I株、JF05To株、RF05To株、及びSK05Kyo株からなる群から選んだ株である、［１］に記載の混合ワクチン；
［３］［１］又は［２］に記載の混合ワクチンを、スクーチカ症の予防又は治療の必要な対象に、有効量で投与することを含む、スクーチカ症の予防又は治療方法；
［４］（１）フィラステリデス・ディセントラーチ Iyo I株と同じ血清型を示す株、（２）フィラステリデス・ディセントラーチ Nakajima株と同じ血清型を示す株、及び（３）フィラステリデス・ディセントラーチ Mie0301株と同じ血清型を示す株の、スクーチカ症の予防又は治療用の混合ワクチンの製造における使用；
［５］（１）フィラステリデス・ディセントラーチ Iyo I株と同じ血清型を示す株、（２）フィラステリデス・ディセントラーチ Nakajima株と同じ血清型を示す株、及び（３）フィラステリデス・ディセントラーチ Mie0301株と同じ血清型を示す株を、それぞれ単独で、あるいは、２つ以上を組合せて、不活化する工程、並びに、
得られた不活化物を混合する工程
を含むことを特徴とする、［１］又は［２］に記載の混合ワクチンの製造方法
に関する。
　本発明は、斃死率の高いP. dicentrarchiの感染を含むスクーチカ症の予防・治療に対する有効性の高いワクチンである。より詳細には、本発明によれば、食品を前提に飼育されている養殖魚類に投与しても問題のない安全な魚類用ワクチンを提供できる。本発明の不活化ワクチンは、その抗原を得る過程においてP. dicentrarchiが容易に量産できること、及び不活化方法も単純であることから簡便かつ低コストの工程で製造することができる。さらに、製造されたワクチンは、P. dicentrarchiに起因するスクーチカ症に対する感染防御能力を誘導することができる。したがって、養殖産業とその関連産業における生産性と品質向上、および養殖における環境衛生の改善に多大に寄与できる。
Iyo I株（レーン１）、JF05To株（レーン２）、RF05To株（レーン３）、SK05Kyo株（レーン４）、Nakajima株（レーン５）、Mie0301株（レーン６）および抗Iyo I株、SK05Kyo株、Nakajima株、Mie0301株血清を用いたウエスタンブロッティングの結果を示した図である。図のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄはそれぞれ抗Iyo I株、SK05Kyo株、Nakajima株、Mie0301株血清の反応プロファイルである。なお、図１の最左側のレーンは分子量マーカーを表す。 ３種混合ワクチンを接種したヒラメへのIyo I株（4.03×104cells/fish）による攻撃試験の経日的累積死亡率変化を示したグラフである。■は3種混合ワクチン接種区を示し、◆はＭＥＭ対照区を示している。 ３種混合ワクチンを接種したヒラメへのNakajima株（4.03×104cells/fish）による攻撃試験の経日的累積死亡率変化を示したグラフである。■は3種混合ワクチン接種区を示し、◆はＭＥＭ対照区を示している。 ３種混合ワクチンを接種したヒラメへのMie0301株（4.03×105cells/fish）による攻撃試験の経日的累積死亡率変化を示したグラフである。■は3種混合ワクチン接種区を示し、◆はＭＥＭ対照区を示している。 Iyo I、Nakajima及びMie0301の各単一ワクチンを接種したヒラメへのIyo I株（6.12×105cells/fish）による攻撃試験の経日的累積死亡率変化を示したグラフである。●、■、▲、○は、Iyo I株、Nakajima株、Mie株、ＭＥＭ対照区を示している。 Iyo I、Nakajima及びMie0301の各単一ワクチンを接種したヒラメへのNakajima株（6.12×105cells/fish）による攻撃試験の経日的累積死亡率変化を示したグラフである。●、■、▲、○は、Iyo I株、Nakajima株、Mie株、ＭＥＭ対照区を示している。 Iyo I、Nakajima及びMie0301の各単一ワクチンを接種したヒラメへのMie株（6.12×105cells/fish）による攻撃試験の経日的累積死亡率変化を示したグラフである。●、■、▲、○は、Iyo I株、Nakajima株、Mie株、ＭＥＭ対照区を示している。 ３種混合ワクチンを接種したヒラメへのIyo I株（3.06×105cells/fish）による攻撃試験の経日的累積死亡率変化を示したグラフである。●は3種混合ワクチン接種区を示し、■はＭＥＭ対照区を示している。
　本発明に使用される各株の不活化物、すなわち、不活化ワクチンは、常法に従って調製することができ、例えば、次のように調製することができる。P. dicentrarchi（以下、本虫という。）に魚類株化細胞ＣＨＳＥ－２１４（ATCC No. CRL-1681；北海道大学大学院水産科学研究院海洋応用生命科学部門　吉水永守教授より分与）を摂食させ、２０℃で５日間静置培養する。魚類株化細胞ＣＨＳＥ－２１４は、ＣＨＳＥ－２１４細胞用培地［１０％牛胎児血清を処方したイーグルＭＥＭ（Minimum Essential Medium）培地（日水製薬製：製品コード05900）を炭酸水素ナトリウムでｐＨ７．３に調整したもの］を用いて２０℃で単層になるまで培養する。このように培養した本虫を遠心分離により集め、不活化剤、例えば、ホルマリン、グルタルアルデヒド、β－プロピオラクトンなどを加えて不活化する。たとえば、ホルマリンの例では、３５％ホルマリン液を終濃度が０．３％となるように加え、４℃の温度下で一晩不活化する。ただし、不活化により、抗原性が損なわれる場合は不活化条件を緩和する。たとえば、不活化剤の減量、pH緩衝剤の添加、不活化温度を低下する等が挙げられる。
　ここで使用する原虫としては、（１）Philasterides dicentrarchi Iyo I株と同じ血清型を示す株、（２）Nakajima株と同じ血清型を示す株、及び（３）Mie0301株と同じ血清型を示す株、すなわち、互いに異なる血清型を示す３種類の株を使用する。Iyo I株と同じ血清型を示す株としては、例えば、JF05To株、RF05To株、SK05Kyo株を使用することができる。
　これらの株は、本発明者のグループが単離・同定したものであり、その詳細を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　Iyo I型（セロタイプＩ型）では、抗Iyo I株ウサギ抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った時（図１Ａ及び図１Ｂ）、30kDaに強く反応するタンパク質が検出される（レーン１～４）。一方、抗Nakajima株ウサギ抗体（図１Ｃ）および抗Mie0301株ウサギ抗体（図１Ｄ）では、このようなタンパク質が検出されない。
　Nakajima型（セロタイプII型）では、抗Nakajima株ウサギ抗体および抗Mie0301株ウサギ抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った時（図１Ｃ及び図１Ｄ）、38kDaに強く反応するタンパク質が検出される（レーン５）。
　Mie0301型（セロタイプIII型）では、抗Nakajima株ウサギ抗体および抗Mie0301株ウサギ抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った時（図１Ｃ及び図１Ｄ）、34kDaに強く反応するタンパク質が検出される（レーン６）。
　本発明で用いる本虫の形態学的特徴は、約３０×４００μｍの楕円形で、繊毛を有する。他の繊毛虫と異なり、組織食性であり、細菌類だけではなく、動物細胞（例：魚類株化細胞）を摂食する。また、本虫は分類学上、アンキスツルム目（Scuticociliatida）、フィラスタ亜目（Philasterina）、フィラスター科（Philasteridae）に分類される。
　本発明で用いる本虫の継代培養は、２０℃の保存下で一ヶ月に一度、フレッシュな細胞に継代する。少なくとも数日に一度、顕微鏡下で本虫を観察し、虫体が小さくなってきた場合には、一ヶ月以内でも継代を行う。前記継代による病原性変化は５年間安定であることを確認している。また、継代による抗原性の変化も認められていない。
　本発明の３種混合ワクチンとは、上記血清型の異なる３種類の不活化ワクチン（好ましくはホルマリン不活化ワクチン）を組み合わせたものである。その組合せの比率は特に限定されるものではないが、例えば、最も少量の単一ワクチンに対して、細胞数に関して１～５倍、好ましくは１～３倍の量で、各単一ワクチンを使用することができ、特に好ましくは、各々単一ワクチンが１：１：１の比率で混合されたものがよい。
　本発明の混合ワクチンの濃度としては、特に限定する必要はない。使用場面に応じて適宜濃度を調整して使用することができる。特に、各ワクチンの合計量として、１０５cells／fish以上であれば、十分な有効性が得られる。
　なお、出願人は、Philasterides dicentrarchiのIyo I株、Nakajima株、Mie0301株の各株を平成２０年７月２４日付で、Philasterides dicentrarchiのJF05To株、RF05To株、SK05Kyo株の各株を平成２０年１０月７日付で、特許庁長官の指定する寄託機関である独立行政法人産業技術総合研究所の特許生物寄託センターへ寄託申請を行ったところ、平成２０年８月１日付並びに平成２０年１０月１６日付で受託できないとして寄託受託証不交付通知を受けた。よって、本発明で用いられる原虫は自己寄託として取扱い、特許法施行規則第２７条の３の分譲については出願人が保証するものとする。
　本発明の混合ワクチンを適応することができる魚種としては、スクーチカ症が発症する可能性のある魚種である限り特に限定されるものではないが、ヒラメ、ターボット、マダイ、イシダイ、イシガキダイ、メイタガレイなどが挙げられる。また、いずれの魚種についても、感染の可能性がある任意の年齢または任意のサイズの魚類に使用できる。使用法は、たとえば、経口投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与、浸漬処理などの方法が挙げられる。その中でも、腹腔内投与は少ない抗原量で十分な免疫を誘導することができる。
　本発明の混合ワクチンによって有効な予防・治療ができる原虫としては、Philasterides dicentrarchi Iyo I株、Nakajima株、Mie0301株、JF05To株、RF05To株、SK05Kyo株などが挙げられる。
　以下、実施例に基づいて、更に本発明を具体的に説明するが、本発明を限定するものではない。
参考例１
　異なる魚種、異なる地域で分離されたPhilasterides dicentrarchiの抗原性を比較するために、非動化アッセイおよびウエスタンブロッティングを行った。
（１）非動化アッセイ
　Philasterides dicentrarchiのIyo I、Nakajima、Mie0301、SK05Kyoの各分離株を選択し、家兎血清を作製した。供試株には、Iyo I株、Nakajima株、Mie0301株、JF05To株、RF05To株、SK05Kyo株を用いた。非動化アッセイには、上記の抗血清を２０、４０、８０、１６０、３２０、６４０、１２８０および２５６０倍に希釈したものを、Philasterides dicentrarchiのそれぞれの株（約１００虫体）と感作し、顕微鏡下で凝集および非動化を観察し、非動化力価を求めた。
　その結果を表２に示した。抗Iyo I株血清（抗体）は、Iyo I株、JF05To株、RF05To株、SK05Kyo株に対して、それぞれ８０倍以上の凝集抗体価を示した。しかし、Nakajima株およびMie0301株においては２０倍以下であった。一方、抗Nakajima株血清（抗体）は、Nakajima株に対しては1280倍の凝集抗体価を示したものの、残りの５株に対しては、２０倍以下であった。抗Mie0301株血清（抗体）においても抗Nakajima株血清（抗体）の結果と同様に、ホモの系であるMie0301株のみで高い非動化が認められた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（２）ウエスタンブロッティング
　ウエスタンブロッティングは定法により以下の方法で行った。抗血清および株は上記の非動化アッセイと同様のものを用いた。
　本虫を、イーグルＭＥＭ培地「ニッスイ」（日水製薬株式会社製）に１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を配合し、７．５％の炭酸水素ナトリウム水でｐＨ７．３に調整した培地で単層に培養した魚類株化細胞ＣＨＳＥ－２１４細胞上で、５日間培養した。
　本虫を培養後、遠心分離（５００×ｇ、２０℃、５分）にて本虫を回収し、ＦＢＳを含まないイーグルＭＥＭ培地で洗浄後、Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ緩衝液に懸濁させた。懸濁液に同量の１０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含むＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）サンプルバッファーを混合し、ヒートブロック上で１００℃、３分加熱した。その懸濁液からＳＤＳ－ＰＡＧＥによりゲル上でタンパク質を分離した。このゲルを２５％メタノール－１０％酢酸含有のクマシーブリリアントブルー（和光純薬製）で染色した。
　その後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で分離したタンパク質をポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に転写し、その膜を１０％のスキムミルク含有ＴＢＳ－Ｔで２時間ブロッキングし、ＴＢＳ－Ｔで洗浄した。
　次に、ブロッキングした膜を一次抗体として抗血清ともに１時間反応させ、ＴＢＳ－Ｔ（Tris-Buffered Saline-Tween）で洗浄した。さらに、二次抗体として、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧを用いて１時間反応させた。その膜をＴＢＳ－Ｔで洗浄し、ＨＲＰ（horseradish peroxidase）Conjugate substrateキット（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社製）でバンドを可視化した。
　その結果は、非動化アッセイを支持する結果となった（図１）。すなわち、Iyo I株（図１のレーン１）、JF05To株（レーン２）、RF05To株（レーン３）、SK05Kyo株（レーン４）の３０ｋＤａのタンパク質が、抗Iyo I株血清（図１Ａ）および抗SK05Kyo株血清（図１Ｂ）の各抗体において、強い反応性を示した。しかし、Nakajima株（レーン５）およびMie0301株（レーン６）ではこのバンドは認められなかった。また、抗SK05Kyo抗体（Ｂ）では、Mie0301株において３４ｋＤａに強い反応が認められた。
　一方、抗Nakajima株血清（図１Ｃ）および抗Mie0301株血清（図１Ｄ）を用いた場合には、Nakajima株、Mie0301株でそれぞれ３８ｋＤａ、３４ｋＤａで強いバンドを示した。
　これらの非動化アッセイおよびウエスタンブロッティングの結果から、Philasterides dicentrarchiは少なくとも３つのセロタイプが存在することが明らかになった（serotype I; Iyo I、JF05To株、RF05To株、SK05Kyo株、serotype II; Nakajima株、serotype III; Mie0301株）。
実施例１：３種混合ワクチンの有効性試験
（１）ワクチンの作製
（ａ）供試魚
　ヒラメの稚魚２００匹を、おとひめヒラメ用海産種苗用飼料（日清丸紅飼料社製）を用いて２週間給餌して、平均体重１０．３ｇになるまで予備飼育したものを使用した。
（ｂ）本虫の培養
　本虫は、イーグルＭＥＭ培地「ニッスイ」（日水製薬株式会社製）に１０％牛胎児血清を配合し、７．５％の炭酸水素ナトリウム水でｐＨ７．３に調整した培地で単層に培養した魚類株化細胞ＣＨＳＥ－２１４細胞上で、５日間培養した。
（ｃ）ホルマリン不活化ワクチンの調製
　上記培養した本虫（Iyo I株、Nakajima株及びMie0301株）１．６５×１０６～９．８５×１０６cellsを、終濃度が０．３％となるように３５％ホルマリン（ナカライテスク製）を加え、４℃で一昼夜不活化させて、３種類のホルマリン不活化ワクチンを調製した。そして、上記の３種類のワクチンを同一比率で加えて混合ワクチンを調製した。
（２）ワクチン接種
　上記（１）で作製したホルマリン不活化ワクチンをヒラメ（平均体重１０．３ｇ）に６．７６×１０５cells／fishの濃度となるように、１００μＬを腹腔内接種した。そして、２週間後、追加免疫として９．８５×１０５cells／fishの濃度で免疫を行った。
　また、対照として細胞培養で用いたＭＥＭ培地そのものを１００μＬ腹腔内に接種した。
（３）安全性試験
　ワクチン接種後、供試魚を１０Ｌの水槽に収容し、流水を行いながら、２ヶ月間飼育観察を行い、安全性を確認した。飼育期間中は前記と同様に給餌した。
（４）攻撃試験（有効性の判定）
　最終免疫して４日目に、混合ワクチンで免疫したヒラメ（ワクチン接種区）および免疫を行わなかったヒラメ（対照区）を、それぞれ４つの区に分け、各区１５匹で試験を行った。Iyo I株、Nakajima株及びMie0301株の各株により感染させた。また、比較するため、ワクチン接種区および対照区に本虫を感染させない区を入れた。Iyo I株およびNakajima株では、４．０３×１０４cells／fishで１００μＬとなるように腹腔内接種した。また、Mie0301株では、予備試験の結果から他の2株よりも病原性が低いことが明らかにされたことから４．０３×１０５cells／fishで同様に腹腔内接種した。
　ワクチンの有効性は（１－ワクチン接種区の死亡率／対照区の死亡率）×１００％の式により、有効率として求めた。
（５）試験結果
　結果（経日的累積死亡率の変化）を図２（Iyo I株による攻撃）、図３（Nakajima株による攻撃）、図４（Mie0301株による攻撃）に示す。
　３種混合ワクチンを接種したヒラメは各原虫の攻撃（Iyo I株、Nakajima株及びMie0301株）に対し、１４日間の攻撃日数での有効率はそれぞれ７５％、７３．３％及び９２．９％とともに良好な免疫効果を示した。Iyo I株及びNakajima株では５％以下の危険率で有意差が認められた。Mie0301株では１％以下の危険率で有意差が認められた。
比較例１：単一ワクチンの有効性試験
（１）ワクチンの作製
　供試魚および本虫の培養は実施例と同様の方法で行った。ホルマリン不活化ワクチンの調製は上記培養した本虫（Iyo I株、Nakajima株及びMie0301株）１．６５×１０６～９．８５×１０６cellsを、終濃度が０．３％となるように３５％ホルマリン（ナカライテスク製）を加え、４℃で一昼夜不活化させて、３種類のホルマリン不活化ワクチンを調製した。
（２）ワクチン接種
　上記（１）で作製した３種のホルマリン不活化ワクチンをヒラメ（平均体重１０．０５ｇ）に１．６５×１０５cells／fishの濃度となるように、１００μＬを腹腔内接種した。そして、２週間後、追加免疫として３×１０５cells／fishの濃度で免疫を行った。
　また、対照として細胞培養で用いたＭＥＭ培地そのものを１００μＬ腹腔内に接種した。
（３）安全性試験
　ワクチン接種後、供試魚を１０Ｌの水槽に収容し、流水を行いながら、２ヶ月間飼育観察を行い、安全性を確認した。飼育期間中は前記と同様に給餌した。
（４）攻撃試験（有効性の判定）
　最終免疫して４日目に、３種のホルマリン不活化ワクチンで各々免疫したヒラメ（ワクチン接種区）および免疫を行わなかったヒラメ（対照区）を、それぞれ４つに分け、１６区とし、各区１５匹で試験を行った。Iyo I株、Nakajima株及びMie0301株の各株により感染させた。感染力価は、６．１２×１０５cells／fishで１００μＬとなるように腹腔内接種した。
　ワクチンの有効性は（１－ワクチン接種区の死亡率／対照区の死亡率）×１００％の式により、有効率として求めた。
（５）試験結果
　結果（経日的累積死亡率の変化）を図５（Iyo I株による攻撃）、図６（Nakajima株による攻撃）、図７（Mie0301株による攻撃）に示す。
　Iyo I株によるワクチンを接種したヒラメは各原虫の攻撃（Iyo I株、Nakajima株及びMie0301株）に対し、１３日間の攻撃日数での有効率はそれぞれ４１．７％、０％及び０％であり、同じ血清型のものでも効果が低くかった。Iyo I株だけが対照区に対して、１％以下の危険率で有意差が認められた。
　また、Nakajima株によるワクチンを接種したヒラメは各原虫の攻撃（Iyo I株、Nakajima株及びMie0301株）に対し、１３日間の攻撃日数での有効率は０％、２１．４％、及び０％であり、同様に同じ血清型のものでも効果が低くかった。全ての株とも対照区に対して、有意差はなかった。
　さらに、Mie0301株によるワクチンを接種したヒラメは各原虫の攻撃（Iyo I株、Nakajima株及びMie0301株）に対し、１３日間の攻撃日数での有効率はそれぞれ３３．３％、２５．０％及び３３．３％であり、同じ血清型のものでも効果が低くかった。Mie0301株及びIyo I株だけが対照区に対して、５％以下の危険率で有意差が認められた。
実施例２：高濃度一回免疫による３種混合ワクチンの有効性試験
（１）ワクチンの作製
（ａ）供試魚
　ヒラメの稚魚１６０匹を、おとひめヒラメ用海産種苗用飼料（日清丸紅飼料社製）を用いて２週間給餌して、平均体重１２．５ｇになるまで予備飼育したものを使用した。
（ｂ）本虫の培養
　本虫は、イーグルＭＥＭ培地「ニッスイ」（日水製薬株式会社製）に１０％牛胎児血清を配合し、７．５％の炭酸水素ナトリウム水でｐＨ７．３に調整した培地で単層に培養した魚類株化細胞ＣＨＳＥ－２１４細胞上で、５日間培養した。
（ｃ）ホルマリン不活化ワクチンの調製
　上記培養した本虫（Iyo I株、Nakajim株及びMie030株）４．３０×１０６～８．８５×１０６cellsを、終濃度が０．３％となるように３５％ホルマリン（ナカライテスク製）を加え、４℃で一昼夜不活化させて、３種類のホルマリン不活化ワクチンを調製した。そして、上記の３種類のワクチンを同一比率で加えて混合ワクチンを調製した。
（２）ワクチン接種
　上記（１）で作製した各種のホルマリン不活化ワクチンをヒラメに２．１５×１０６cells／fishの濃度となるように、１００μＬを腹腔内接種した。
また、対照として細胞培養で用いたＭＥＭ培地そのものを１００μＬ腹腔内に接種した。
（３）安全性試験
　ワクチン接種後、供試魚を１０Ｌの水槽に収容し、流水で、２ヶ月間飼育観察を行い、安全性を確認した。飼育期間中は前記と同様に給餌した。
（４）攻撃試験（有効性の判定）
　免疫して１１日目に、混合ワクチンで免疫したヒラメ（ワクチン接種区）および免疫を行わなかったヒラメ（対照区）を、それぞれ２つの区に分け、各区３０匹で試験を行った。３．６×１０５cells／fishでIyo I株を腹腔内接種で感染させた。また、ワクチン接種区および対照区に本虫を感染させない区を入れた。
　ワクチンの有効性は（１－ワクチン接種区の死亡率／対照区の死亡率）×１００％の式により、有効率として求めた。
（５）試験結果
　結果（経日的累積死亡率の変化）を図８に示す。
　３種混合ワクチンを接種したヒラメはIyo I株の攻撃に対し、１４日間の攻撃日数での有効率はそれぞれ６８．５％と良好な免疫効果を示し、５％以下の危険率で有意差が認められた。３種混合ワクチンおよび対照区の非感染区は、斃死が認められなかったため、図８から省略した。
 
　以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。

Claims (5)

  1. 　（１）フィラステリデス・ディセントラーチ（Philasterides dicentrarchi）Iyo I株と同じ血清型を示す株の不活化物、（２）フィラステリデス・ディセントラーチ Nakajima株と同じ血清型を示す株の不活化物、及び（３）フィラステリデス・ディセントラーチ Mie0301株と同じ血清型を示す株の不活化物を有効成分とする、スクーチカ症の予防又は治療用の混合ワクチン。
  2. 　フィラステリデス・ディセントラーチ Iyo I株と同じ血清型を示す株が、Iyo I株、JF05To株、RF05To株、及びSK05Kyo株からなる群から選んだ株である、請求項１に記載の混合ワクチン。
  3. 　請求項１又は２に記載の混合ワクチンを、スクーチカ症の予防又は治療の必要な対象に、有効量で投与することを含む、スクーチカ症の予防又は治療方法。
  4. 　（１）フィラステリデス・ディセントラーチ Iyo I株と同じ血清型を示す株、（２）フィラステリデス・ディセントラーチ Nakajima株と同じ血清型を示す株、及び（３）フィラステリデス・ディセントラーチ Mie0301株と同じ血清型を示す株の、スクーチカ症の予防又は治療用の混合ワクチンの製造における使用。
  5. 　（１）フィラステリデス・ディセントラーチ Iyo I株と同じ血清型を示す株、（２）フィラステリデス・ディセントラーチ Nakajima株と同じ血清型を示す株、及び（３）フィラステリデス・ディセントラーチ Mie0301株と同じ血清型を示す株を、それぞれ単独で、あるいは、２つ以上を組合せて、不活化する工程、並びに、
    得られた不活化物を混合する工程
    を含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載の混合ワクチンの製造方法。
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