WO2010043718A1 - Signature génique représentative de l'effet de la dhea sur la peau - Google Patents

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WO2010043718A1
WO2010043718A1 PCT/EP2009/063627 EP2009063627W WO2010043718A1 WO 2010043718 A1 WO2010043718 A1 WO 2010043718A1 EP 2009063627 W EP2009063627 W EP 2009063627W WO 2010043718 A1 WO2010043718 A1 WO 2010043718A1
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WO
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genes
expression
gene
skin
subject
Prior art date
Application number
PCT/EP2009/063627
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Inventor
Claire Deloche
Françoise Bernerd
Bruno Bernard
Original Assignee
L'oreal
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/148—Screening for cosmetic compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention is in the field of cosmetics, and more particularly in cosmetics applied to the skin. It is more generally part of the prevention and treatment of chronological aging and photoaging of the skin.
  • the invention is based on the identification, by the inventors, of specifically modulated genes within the dermis and the epidermis in response to DHEA (Dehydroepiandrosterone). These genes therefore constitute a gene signature.
  • the invention particularly relates to various uses of this gene signature characteristic of the effect of DHEA on the skin. Aging is a complex biological process that is accompanied by morphological changes in the skin under the combined action of intrinsic and extrinsic factors.
  • DHEA Dehydoepiandrosterone
  • DHEA sulfoconjugate form
  • DHEA could be administered sooner if one takes into account its rather early fall in the woman during aging.
  • Previous studies have shown that exogenous DHEA supplementation at physiological levels allows the biosynthesis of androgens and estrogens. All steroidogenesis enzymes are therefore present in human skin thus producing the enzymatic machinery necessary for the local production of sexually active steroids (Dihydrotestosterone (DHT); 17 ⁇ -estradiol (E2)) from the inactive precursor of secreted DHEA by the adrenal cortex.
  • DHT sexually active steroids
  • E2 17 ⁇ -estradiol
  • DHEA and DHEA-S are involved in the regulation and synthesis of extracellular matrix collagen and metalloproteinases on dermal fibroblasts (Lee et al, 2000) and on human skin. (Shin et al, 2005).
  • the present invention is therefore underpinned by the identification of this gene signature characterizing the effect of the topical application of DHEA.
  • the 13 genes constituting this gene signature namely SPARC, NOL3, SERPINB3, ERBP, JAG1, CLDN8, LEP7, MT1X, GBA / GBAP, EFNA1, PLLP, KRT1 B and SPRR2G, are hereinafter referred to as the genes of the invention.
  • the present application relates more specifically to methods for characterizing the effect on the skin of a subject, of a treatment with a given molecule, on screening methods. molecules mimicking the effect of DHEA on the skin and various methods to determine the effectiveness of a treatment on the skin.
  • the present invention also relates to a method for screening DHEA mimetic molecules that would modulate the expression of all or part of the genes described in the present invention.
  • This invention is part of the prevention or treatment of chronological aging or photoaging of the skin.
  • the gene expression signature in response to DHEA, particularly at the level of the epidermis, identified by the inventors, is indeed an obvious advantage for measuring the effect of a mimetic molecule of DHEA on the skin.
  • the invention relates to a method for characterizing the effect of a treatment by a given molecule on the skin of a patient.
  • a gene chosen from the genes constituting the gene signature of DHEA as evidenced by the inventors, that is to say a gene chosen from SPARC, NOL3, SERPINB3, ERBP, JAG1, CLDN8, LEP7, MT1X, GBA / GBAP, EFNA1, PLLP, KRT1B and SPRR2G genes.
  • Such a method makes it possible in particular to determine whether a given molecule produces on the skin of a subject a similar effect, similar to or different from the effect obtained by DHEA.
  • the variation in the level of expression of one of the genes of the invention is evaluated at the level of the skin, in particular in the dermis and the epidermis, in response to the treatment with the given molecule.
  • said method comprises evaluating the variation of the expression of at least two genes among the genes constituting the molecular signature of DHEA, that is, that is, at least two genes selected from SPARC, N0L3, SERPINB3, ERBP, JAG1, CLDN8, LEP7, MT1X, GBA / GBAP, EFNA1, PLLP, KRT1 B and SPRR2G.
  • the method comprises evaluating the expression variation of at least 3 genes, or even at least 5 genes among the genes of the invention, said variation being in response to the treatment with the given molecule.
  • the method comprises evaluating the expression variation of at least 8 genes among the genes of the invention.
  • the variation of the level of expression, in response to treatment, of the thirteen genes of the invention is examined.
  • the gene or genes whose variation of the level of expression is examined are chosen from the genes NOL3, SERPINB3, ERBP, JAG1, CLDN8, LEP7, MT1X, GBA / GBAP, EFNA1, PLLP, KRT1B and SPRR2G.
  • the method comprises the evaluation of the variation of the expression of at least one gene, of two or of three genes, chosen from the genes NOL3, SERPINB3, ERBP, JAG1, CLDN8, LEP7, MT1X, GBA. / GBAP, EFNA1, PLLP, KRT1 B and SPRR2G.
  • genes NOL3, SERPINB3, ERBP, JAG1, CLDN8, LEP7, MT1X, GBA / GBAP, EFNA1, PLLP, KRT1B and SPRR2G are in fact the genes expressed mainly in the epidermis of the skin, and hereinafter referred to as genes "Epidermic". Genes whose variation in level of expression is examined are preferably not involved in collagen metabolism.
  • Particularly preferred genes in the context of the invention are the SPARC genes,
  • the method comprises on the one hand the evaluation of the expression variation of the SPARC gene in response to the treatment, on the other hand the evaluation of the expression variation of at least one or even two or three genes selected from the so-called "epidermal” genes, namely NOL3, SERPINB3, ERBP, JAG1, CLDN8, LEP7, MT1X, GBA / GBAP, EFNA1, PLLP, KRT1 B and SPRR2G, in response to the treatment.
  • epimal namely NOL3, SERPINB3, ERBP, JAG1, CLDN8, LEP7, MT1X, GBA / GBAP, EFNA1, PLLP, KRT1 B and SPRR2G
  • Combinations more particularly contemplated in the context of the present invention include: at least one of the ERBP, JAG1 and EFNA1 genes combined with at least one of the genes LEP7, KRT1 B and SPRR2G and at least one of the genes SERPINB3 and CLDN8 genes, for example the combination ERBP, SPRR2G and SERPINB3 or the combination EFNA1, SPRR2G and SERPINB3 or else: ERBP, LEP7 and SERPINB3, or else: ERBP, SPRR2G and CLDN8, or for example: EFNA1, LEP7 and SERPINB3 .
  • the variation of gene expression is observed specifically within the epidermis of the subject.
  • the method comprises evaluating the expression variation of a gene within the epidermis, in response to treatment with a given molecule.
  • the gene, the expression of which is analyzed is preferably a gene chosen from the NOL3, SERPINB3, ERBP, JAG1, CLDN8, LEP7, MT1X, GBA / GBAP, EFNA1, PLLP, KRT1 B and SPRR2G genes.
  • the method comprises evaluating the expression variation of at least two genes among the NOL3, SERPINB3, ERBP, JAG1, CLDN8, LEP7, MT1X, GBA / GBAP, EFNA1, PLLP, KRT1 B and SPRR2G genes.
  • Particularly preferred genes in the context of the invention are the SERPINB3, JAG1, LEP7 and SPRR2G genes.
  • the method is therefore preferably a method of characterizing the effect of a treatment by a given molecule on the epidermis of a patient, in particular a human being.
  • the method of the invention may include evaluating the expression variation of a gene within the dermis, in response to treatment with a given molecule.
  • the gene whose expression is analyzed is preferably the SPARC gene.
  • the molecule of which the present invention makes it possible to characterize the effects on the skin may be any chemical molecule, known or new, alone or in combination. This may include molecules already used for topical applications but whose effect has never been characterized at the gene level. It can also act molecules generated by combinatorial chemistry, and whose structure is not necessarily elucidated.
  • the molecule to be tested can be both a natural and a synthetic molecule. It may be for example a molecule naturally extracted from plants. It can also be a complex of molecules or an association. Indeed, the method according to the present invention also makes it possible to characterize the effects of a treatment carried out using several molecules associated with each other.
  • these are molecules already authorized for topical applications or considered to be safe for the skin.
  • the treatment with a given molecule preferably consists in the topical application of said molecule on the skin of the subject.
  • the molecule to be characterized is preferably packaged in the form of a cream, a lotion, a gel or an oil which is applied to the skin. It is also conceivable that the treatment consists of the application of a patch, comprising the molecule to be characterized, said patch remaining in place for several minutes or hours, or the application of a mask. Other techniques or packages for applying the molecule to the skin and possibly to promote its penetration are well known to those skilled in the art.
  • the molecule whose effects are to be characterized on the skin is applied at least once a day, but preferably at least twice a day. It can also be applied three times a day.
  • the duration of the treatment is not fixed in the context of the invention; however, in order to be able to reliably characterize the expression variations of one or more genes of the invention, it is preferable that the treatment lasts at least one week, preferably at least two weeks before proceeding. evaluating the expression variation of the selected gene (s) induced by the molecule to be characterized.
  • any skin area may be treated to characterize the effect of a treatment according to the present invention. It is preferably the forehead, the face, the cleavage, the dorsal sides of the arms and forearms, the outer faces of the thighs and / or the outer faces of the legs. Any other zone may also advantageously be used in an evaluation method according to the present invention.
  • the selected area is a low hair area.
  • the skin zone is preferably a zone of healthy, uninjured or injured skin.
  • the subject in the context of the present invention is preferably a human being, a man, a woman or a child. It is particularly preferred that said subject is a person of at least 30 years, preferably at least 45 years old. Indeed, insofar as the present invention consists in particular in the identification of molecules whose effect on the skin is comparable to that of DHEA, the subject is preferably a person beginning to undergo a significant drop in DHEA production. endogenous.
  • the genes constituting the gene signature are indeed the genes specifically modulated by the application of exogenous DHEA, but also by the endogenous DHEA production. Therefore, a subject within the scope of the present invention is preferably a person suffering from an endogenously produced DHEA deficiency.
  • the subject is most preferably a woman and more particularly a woman at the threshold of menopause or already menopausal, for example a woman of at least 55 years or at least 60 years.
  • the variation of the expression of the selected gene (s) is quantified by analysis of the transcribed mRNA at the level of the epidermis and / or at the level of the dermis.
  • the transcriptional analysis is preferably performed at the level of the epidermis treated with the molecule whose effects are to be characterized.
  • the variation in the level of the expression of the gene chosen is normalized with reference to the expression of at least one gene selected from Atp ⁇ o, the genes coding for ⁇ - actin and ⁇ 2-microglobulin, the genes encoding the S28 and S9 ribosomal proteins, the gene coding for the ribosomal protein L13A, and the gene encoding GAPDH.
  • Gene expression is preferably quantified by analysis of messenger RNA (mRNA) transcribed within the dermis and epidermis, or within the epidermis only, or within the dermis only.
  • mRNA messenger RNA
  • the quantification of the transcribed mRNA is carried out for example using the Northern blot, dot blot, RT-PCR, hybridization on microarrays, SAGE method or by using microfluidic cards.
  • Other techniques for quantifying mRNA can of course be used. All these techniques are well known to those skilled in the art.
  • primers may be used for RT-PCR analysis of gene expression having the sequences shown in Table 1 ("Forward" and "Reverse" leader sequences).
  • the samples are preferably made by biopsy, or any other technique well known to those skilled in the art.
  • the effects on the skin or the epidermis preferably include cosmetic effects, that is to say, primarily aesthetic effects relating to the appearance of the skin, to the exclusion of any therapeutic or prophylactic effect.
  • a cosmetic effect on the skin or the epidermis is in particular an effect on the actinic aging and its consequences on the appearance of the skin.
  • the present application also relates to a method for evaluating the repairing effect, or rejuvenating effect, of a molecule on the skin of a subject.
  • the method comprises the characterization of a treatment by said molecule according to one of the implementations of the method described above.
  • the molecule can be any active, natural extract, or combination of assets for example.
  • molecule in the context of this invention is meant both an ingredient or an active agent in a more or less purified form, having an intrinsic activity in vitro or in vivo, a formulation comprising one or more of these ingredients and a support and adjuvants adapted to the intended application.
  • the present inventors by identifying the characteristic gene signature of the effect of DHEA, have thus identified the genes whose variation leads to the "rejuvenating" or "anti-aging” effects observed and already described obtained with the application topical DHEA.
  • the evaluation of the repairing effect of a treatment by a given molecule is considered positive, that is to say that said treatment has indeed a restorative effect, if the variation expression of the gene (s) chosen from the genes of the invention, is a repression of the expression if one or more genes are chosen from the genes NOL3, JAG1, CLDN8, LEP7, MT1X, GBA / GBAP, EFNA1, PLLP.
  • KRT1B and SPRR2G or stimulation of expression if one or more genes are selected from the SPARC, SERPINB3 and ERBP genes, preferably from the SERPINB3 and ERBP genes.
  • the treatment with the test molecule is a repression of the expression of a gene selected from the genes NOL3, JAG1, CLDN8, LEP7, MT1X, GBA / GBAP, EFNA1, PLLP, KRT1 B and SPRR2G or a stimulation of the expression of a gene selected from the SPARC, SERPINB3 and ERBP genes, preferably from the SERPINB3 and ERBP genes, then the effect obtained by the treatment is of the same nature as the treatment with DHEA, such as described for example in the experimental section of the present application.
  • the evaluation is considered positive if the variation of expression induced. by the given molecule is of the same nature as the variation induced by DHEA for at least two genes chosen from the genes of the invention, in particular from the NOL3, SERPINB3, ERBP, JAG1, CLDN8, LEP7, MT1X, GBA / GBAP genes.
  • the observed variation (suppression or stimulation of the expression, according to the chosen gene chosen) has a statistically significant amplitude, preferably at least 10%, preferably at least 20%, relative to the level of basal expression of the selected gene.
  • the variation observed for the expression of the chosen gene is at least 30%.
  • the variation of the expression level of the chosen gene can be normalized by reference to the expression of at least one gene chosen from Atp ⁇ o, the genes coding for ⁇ -actin and ⁇ 2-microglobulin, the genes coding for proteins. ribosomal S28 and S9, the gene encoding ribosomal protein L13A, and the gene encoding GAPDH.
  • the variation observed in the level of expression of the selected gene is at least equal to that observed with DHEA, under identical treatment conditions.
  • the subject in question is a person experiencing an endogenously produced DHEA deficiency preferably a person aged at least 30 years, preferably at least 40 or 45 years old. It is preferred that said person be at least 50, 55 or 60 years old.
  • a topic especially preferred in the context of the invention, to implement the evaluation method described, is a woman who is in the menopause or about to be.
  • the present invention therefore also provides a method for recommending a product by signaling its effect in a test protocol consisting of an evaluation method as described above.
  • the invention therefore also relates to a method for the promotion of a cosmetic product consisting in reporting an efficacy, action or property of said product demonstrated by at least one test operated as described above.
  • Such promotion of the product can be done by any communication channel. It may be made by the seller, directly on the point of sale, by radio and television, particularly in the context of commercials. It may also be done through the press, or through any other document, especially for advertising purposes (prospectus). It can also be done via the Internet, or any other appropriate computer network. It may also be made directly on the product, in particular on its packaging or on any explanatory note that may be associated with it. Also thanks to the identification by the inventors of a molecular molecular signature of the effect of a treatment with DHEA, the present invention also relates, in another aspect, to a screening method aimed at identifying molecules having a repairing or rejuvenating effect on the skin.
  • Such a method therefore comprises a step of characterizing the effect of the molecules to be screened on the skin of a subject according to the characterization method corresponding to the first aspect of the present invention.
  • the repairing or rejuvenating effect of the screened molecule is considered to be proven if the molecule induces, at the level of the skin of the subject, a variation of the expression of the one of the genes of the invention which is of the same nature as the variation of the expression of the same gene induced by DHEA.
  • variation of the expression of the same nature as the variation of the expression induced by DHEA is meant a repression of the expression if the gene chosen is the NOL3 gene, JAG1, CLDN8, LEP7, MT1X, GBA / GBAP, EFNA1, PLLP, KRT1 B or SPRR2G and stimulation of the expression if the selected gene is the SPARC, SERPINB3 or ERBP gene, preferably the SERPINB3 or ERBP gene.
  • the repairing effect is considered to be proven if the expression variation induced by the given molecule is of the same nature as the variation induced by the DHEA for at least two genes chosen from the genes of the invention, in particular from the genes NOL3, SERPINB3, ERBP, JAG1, CLDN8, LEP7, MT1X, GBA / GBAP, EFNA1, PLLP, KRT1B and SPRR2G, preferably for at least five or eight genes, and preferably for the set of NOL3 genes, SERPINB3, ERBP, JAG1, CLDN8, LEP7, MT1X, GBA / GBAP, EFNA1, PLLP, KRT1 B and SPRR2G, or all of the thirteen genes of the invention.
  • the amplitude of the variation induced by the molecule to be screened on the level of expression of a gene of the invention is statistically significant, preferably this amplitude is at least 10% of the level of basal expression (before treatment), preferably at least 20%. According to a preferred implementation, the amplitude of the variation is at least 30%.
  • the variation of the expression level of the chosen gene can be normalized by reference to the expression of at least one gene chosen from Atp ⁇ o, the genes coding for ⁇ -actin and ⁇ 2-microglobulin, the genes coding for proteins. ribosomal S28 and S9, the gene encoding ribosomal protein L13A, and the gene encoding GAPDH.
  • the variation of the level of expression of at least one gene of the invention induced by a screened molecule is at least equal to or greater than the variation in the level of expression of the same gene induced by DHEA, in the same treatment conditions.
  • the variation of the level of expression obtained by a treatment with DHEA is more particularly explained in the experimental part of the present application.
  • the present application also relates to a method for determining the effectiveness of a treatment with a given molecule.
  • the effect of the treatment is characterized according to the characterization method described according to the first aspect of the invention. In this way, the effect of the treatment on the level of expression of at least one of the 13 genes of the invention is determined in the skin of the subject after treatment.
  • a treatment is considered effective if it acts on the skin in such a way as to return properties, including appearance and structure, closer to those characteristics of a "young" skin, a person between 20 and 30 years.
  • treatment with the given molecule is considered effective if it is observed on the one hand a repression of the expression of at least one gene selected from NOL3, JAG1, CLDN8, LEP7, MT1X, GBA / GBAP, EFNA1, PLLP, KRT1 B and SPRR2G or the stimulation of the expression of at least one gene selected from the SPARC, SERPINB3 and ERBP genes, and preferably from the SERPINB3 and ERBP genes.
  • the treatment is considered effective if the expression variation induced by the given molecule is of the same nature as the variation induced by the DHEA for at least two genes chosen from the genes of the invention, in particular from the NOL3 genes. , SERPINB3, ERBP, JAG1, CLDN8, LEP7, MT1X, GBA / GBAP, EFNA1, PLLP, KRT1B and SPRR2G, preferably for at least five or eight genes, and preferably for the set of genes NOL3, SERPINB3, ERBP, JAG1, CLDN8, LEP7, MT1X, GBA / GBAP, EFNA1, PLLP, KRT1B and SPRR2G, or all of the thirteen genes of the invention.
  • the amplitude of the variation induced by the treatment on the level of expression of a gene of the invention is statistically significant, preferably this amplitude is at least 10% of the level of expression. basal (before treatment), preferably at least 20%. According to a preferred embodiment, the amplitude of the variation is at least 30% whether it is suppression or stimulation.
  • the variation in the level of the expression of the gene chosen may be normalized by reference to the expression of at least one gene chosen from Atp ⁇ o, the genes encoding ⁇ -actin and ⁇ 2-microglobulin, the genes coding for the S28 and S9 ribosomal proteins, the gene coding for the ribosomal protein L13A, and the gene coding for GAPDH.
  • the subject is preferably a human suffering from an endogenous DHEA deficiency, preferably a human being at least 30 years old, preferably at least 45 years old.
  • the subject is preferably at least 50, 55 or 60 years old.
  • the subject is a menopausal woman or about to be.
  • the various methods and methods according to the invention all comprise a method of characterizing the effect caused on the skin by a treatment with a given molecule, according to the first aspect of the invention. Consequently, the various implementations and parameters that are preferred in the context of this first aspect of the invention are equally applicable to all the other methods and methods of the invention.
  • the present invention also relates to a DNA chip comprising probes hybridizing specifically with the SPARC, NOL3, SERPINB3, ERBP, JAG1, CLDN8, LEP7, MT1X, GBA / GBAP, EFNA1, PLLP gene cDNAs.
  • KRT1 B and SPRR2G preferably probes hybridizing specifically with the cDNA of the NOL3, SERPINB3, ERBP, JAG1, CLDN8, LEP7, MT1X, GBA / GBAP, EFNA1, PLLP, KRT1 B and SPRR2G genes.
  • a chip also comprises probes hybridizing with at least one gene chosen from Atp ⁇ o, the genes coding for ⁇ -actin and ⁇ 2-microglobulin, the genes encoding the ribosomal proteins S28 and S9, the gene coding for ribosomal protein L13A, and the gene encoding GAPDH.
  • a chip according to the invention does not comprise probes hybridizing with genes other than the genes of the invention and the genes serving for the normalization of the variations of expression levels. .
  • FIG.1 Figure 1 illustrates that DHEA stimulates the expression of collagen 5A2 and A1, as well as SPARC.
  • the curves represent the Iog2 of expression variations (before and after treatment)
  • FIG. 2 illustrates the modulation of the level of expression of SPRR2G and SERPINB3 as a function of the dose of DHEA used.
  • the curves represent the Iog2 of expression variations (before and after treatment)
  • Fig. Figure 3 illustrates that DHEA inhibits the expression of the JAG1 and LEP7 genes.
  • the curves represent the Iog2 expression variations (before and after treatment) (Delta) as a function of the dose of DHEA used.
  • the initial data used were the raw intensity signals after normalization by the RMA method (Robust Multiarray
  • the objective of the present inventors was to investigate whether an increase in circulating DHEA levels could have a signature at the gene level through a large transcriptomic study according to the Affymetrix technique.
  • This randomized, double-blind, placebo-controlled clinical trial included 60 postmenopausal women aged 60 to 65, Caucasian, divided into 5 treatment groups.
  • Conditions of eligibility included the absence of any hormone replacement therapy in the 6 months preceding the study, the absence of endocrine disruption and treatment with lipid or glucose lowering agents.
  • each eligible subject was randomized to one of five DHEA emulsion treatment groups at concentrations: 0% (placebo), 0.1%, 0.3%, 1%, or 2%. % for thirteen weeks.
  • the treatment consisted of applying the cream twice a day (in the morning between 6.00am and 9.30am and in the evening between 6pm and 9.30pm) on the forehead and face (right side) for 0.3 ml, the neckline (0.3), the dorsal arms and forearms (0.3 mlx2), the outer thighs (0.6 ml x2) and the outer sides of the legs (0.3 ml x2) for a total dose of 3.0 ml of DHEA.
  • Two biopsies were obtained from the thighs of each patient, one before and one after the treatment.
  • the biopsies were performed on the outer thighs at 8 cm vertically under the trochanter, using the left or right side for the sample before treatment and the opposite side after 13 weeks of treatment.
  • the biopsies were immediately immersed and stored in liquid nitrogen until the RNA was extracted.
  • the samples were processed according to the Affymetrix II version of the Small Sample Labeling Protocol. This protocol is based on the principle of 2 cycles of cDNA synthesis (complementary DNA) and an in vitro transcription reaction for the amplification and labeling of 1 cRNA.
  • L 1 labeled cRNA was isolated using an RNeasy mini column kit (QIAGEN). 1
  • the quality of the total RNA, the synthesis of cRNA amplification and fragmentation of I 1 cRNA were verified by electrophoresis capilllaire (Bioanalizer 2100, Agilent Technologies).
  • the chips included 1,300,000 unique oligonucleotide motifs spanning more than 47,000 transcripts and variants, which represent approximately 39,000 of the best characterized human genes.
  • the images of the chips were extracted with GeneChip Operating software and analyzed with the Limma Kit. Chip quality control was performed using the AffyQCReport software; this control is necessary to be able to compare the results between each experiment.
  • the suppression of the background noise and the normalization of the signal intensity for each of the probes were performed using the Robust Multivariate Analysis (AMR) method.
  • AMR Robust Multivariate Analysis
  • RNAse A was added to the RNA in a reaction volume of 50 ⁇ l in the presence of 30 ⁇ g of oligo- (d) Tprimers, 300 U Superscript III Rnase H reverse transcriptase (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA), 500 ⁇ M deoxynucleotide triphosphate, 5 mM dithiothreitol, and 34 U RNase inhibitor (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ).
  • the reaction was stopped by adding 1 ⁇ g RNAse A at 37 ° C for 30 minutes, and then 1 cDNA was purified using PCR purification Kit (QIAGEN, Valencia, CA).
  • the level of modulation means the level of modulation relative to the control, between the beginning and the end of the DHEA treatment at concentrations of 1% and 2%, respectively.
  • Column A corresponds to the high density oligonucleotide hybridization assay. The last two columns present the results of the RT-qPCR analysis.
  • SERPIN B3 can act as a protease inhibitor to modulate the host immune response against tumor cells.
  • Estrogen Receptor Ligand Protein - ERBP It is a nuclear protein which interacts especially with ERa and which also binds to PPARY, RXR ⁇ and ER ⁇ . whose localization of ⁇ receptors and their high expression have been shown in epidermal keratinocytes in humans (Taylor et al, 2000, Thorton et al, 2003). - Jagged 1 - JAG1
  • Jagged 1 is the ligand for multiple Notch 1 receptors and involved in Notch signaling (Lindsell et al, 1995). In human skin, an increase in Notch and Jagged 1 levels was demonstrated at the beginning of differentiation.
  • - Claudine 8 - CLDN8 Claudines are localized in the cells of the granular layer of the epidermis and at the level of the tight junctions (Brandner et al, 2002) where they play a major role and for some claudines, in the formation of the function barrier of the skin.
  • Lep7 is induced in the terminal differentiation of keratinocytes and localized later in the envelope (Zhao et al, 1997).
  • metallothionein plays a role in the detoxification of heavy metals and free radicals.
  • This gene encodes a lysosomal membrane protein that cleaves the glycosylceramide beta-glucosidic bond, an intermediate in glycolipid metabolism. Mutations of this gene are the cause of Gaucher disease characterized by lysosomal accumulation.
  • Ephrin-A1 - EFNA1 This protein is part of the tyrosine kinase receptor family and is involved in cell signaling. Their involvement in development processes is well known. Ephrini is exclusively expressed in the epidermis. These molecules have important functions in homeostasis of the skin. Authors have reported that decreased expression may contribute to carcinogenesis of skin tumors (Guo et al, 2006).
  • Keratin 1B - KRT1 B It is a keratin cytoskeleton, expressed almost exclusively in the skin and contributes to its structural integrity. It belongs to the family of intermediate filaments. It is a marker of early differentiation of keratinocytes (Green et al, 1982). - Praline 2G rich in small praline - SPRR2G
  • the isoform 1 (essentially localized in the nucleus and the nucleolus) is involved in the maturation of the RNA (isoform 1) and the isoform 2 ( cytoplasmic) is involved in the inhibition of apoptosis by interacting, via a CSPase (CAspase Recruitment Domain) domain with caspase 2 and caspase 8.
  • CSPase CAspase Recruitment Domain
  • DHEA acts against age-related aging effects of the skin by stimulating collagen biosynthesis at the level of the dermis and modulating the epidermis at the level of the epidermis. the differentiation of keratinocytes.
  • Modulation means the level of modulation relative to the control, between the beginning and the end of treatment with DHEA at concentrations of 1% and 2%, respectively.
  • MoII I Organization and formation of the tight junction System in human epidermis and cultured keratinocytes. Eur J CeII Biol. 81 (5): 253-63, 2002.
  • Estrogen receptor beta is the predominant estrogen receptor in human scalp skin. Exp Dermatol .; 12 (2): 181-90, 2003.
  • Zhao XP Elder JT. Positional cloning of novel skin-specific genes from the human epidermal differentiation complex. Genomics .; 45 (2): 250-8, 1997.

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Abstract

La présente invention concerne une méthode de caractérisation de l'effet, sur la peau d'un sujet, d'un traitement par une molécule donnée, comprenant l'évaluation de la variation, induite par ledit traitement, de l'expression d'au moins un gène choisi parmi les gènes NOL3, SERPINB3, ERBP, JAG1, CLDN8, LEP7, MT1X, GBA/GBAP, EFNA1, PLLP, KRT1 B, SPRR2G et SPARC, au niveau de la peau dudit sujet. Elle concerne également différentes méthodes d'évaluation de l'effet réparateur d'une molécule sur la peau et des procédés de criblage de molécules ayant un effet réparateur sur la peau afin d'identifier des molécules mimétiques de la DHEA. L'invention a aussi trait à des puces susceptibles d'être utilisées dans ces différents procédés et méthodes.

Description

SIGNATURE GENIQUE REPRÉSENTATIVE DE L'EFFET DE LA DHEA SUR LA PEAU
La présente invention est dans le domaine cosmétique, et plus particulièrement dans la cosmétique appliquée à la peau. Elle s'inscrit plus généralement dans le cadre de la prévention et du traitement du vieillissement chronologique et du photovieillissement de la peau. L'invention repose sur l'identification, par les inventeurs, de gènes spécifiquement modulés au sein du derme et de l'épiderme en réponse à la DHEA (Dehydoépiandrostérone). Ces gènes constituent donc une signature génique. L'invention concerne tout particulièrement diverses utilisations de cette signature génique caractéristique de l'effet de la DHEA sur la peau. Le vieillissement est un processus biologique complexe qui s'accompagne, au niveau de la peau, de modifications morphologiques sous l'action combinée de facteurs intrinsèques et extrinsèques. Avec l'âge, la qualité de l'architecture de la peau se détériore sous l'action d'effets synergiques dus au vieillissement chronologique, à des facteurs environnementaux, au photovieillissement et au déficit cestrogénique caractéristique de la ménopause. Les modifications de la peau induites par le vieillissement hormonal s'apparentent à celles observées au cours du vieillissement chronologique : augmentation de la sécheresse de la peau, perte d'élasticité et de fermeté et augmentation du nombre de rides. Tous ces changements sont accélérés par la perte de production des stéroïdes sexuels (Punnonen et al, 1987, Jemec and Serup, 1989). La Dehydoépiandrostérone (DHEA) est le stéroïde dont la concentration plasmatique est la plus élevée chez l'homme et la femme. La zone réticulée de la corticosurrénale produit de grandes quantités de précurseurs inactifs, à savoir: la forme libre DHEA et la forme sulfoconjuguée (DHEA-S). Ces deux formes sont en interconversion métabolique permanente. Ces précurseurs sont ensuite convertis en androgènes et œstrogènes actifs dans les tissus périphériques (Labrie et al, 1988; Labrie, 1991 ; Labrie et al, 2005). La DHEA est essentiellement un précurseur androgénique. En effet, une étude récente, effectuée chez la femme ménopausée, a montré qu'après une administration exogène de DHEA, cette dernière était transformée préférentiellement en androgènes plutôt qu'en œstrogènes (Labrie et al, 2007). La concentration plasmatique de la DHEA et de ses dérivés évolue au cours de la vie. Les concentrations les plus élevées s'observent entre 18 et 45 ans avec une décroissance avec l'âge. La décroissance la plus importante est observée d'une part aux alentours de 20-30 ans et d'autre part vers 50-60 ans avec très peu de changements au-delà de 60 ans. Il est intéressant de noter que dans la tranche d'âge 50-60 ans, la concentration de DHEA s'est effondrée d'environ 70% par rapport aux pics observées chez les 20-30 ans (Labrie et al, 1997a). Ainsi, cette diminution de la sécrétion de la DHEA montre le rôle important de la DHEA dans les nombreux problèmes associés à l'âge et la ménopause. Chez la femme âgée après la ménopause, qui montre une diminution des concentrations plasmatiques des œstrogènes et des androgènes, l'administration topique ou systémique de la DHEA bénéficie donc d'un très grand intérêt dans la lutte contre le vieillissement. De manière encore plus intéressante, la DHEA pourrait être administrée plus tôt si on prend en considération sa chute assez précoce chez la femme au cours du vieillissement. Des études antérieures ont permis de montrer qu'une supplémentation de DHEA exogène à des taux physiologiques permet la biosynthèse d'androgènes et d'oestrogènes. Toutes les enzymes de la stéroïdogénèse sont donc présentes dans la peau humaine produisant ainsi la machinerie enzymatique nécessaire à la production locale de stéroïdes sexuels actifs (Dihydrotestostérone (DHT); 17β-estradiol (E2)) à partir du précurseur inactif de la DHEA sécrété par la corticosurrénale. Les androgènes et œstrogènes actifs ainsi synthétisés dans les tissus périphériques spécifiques exercent leur action au sein des mêmes cellules responsables de leur formation avec un relargage minime des stéroïdes actifs dans la circulation systémique (Labrie et al, 1991 ; Gingras et al, 2003; Labrie et al, 2005). Dans une étude récente (Labrie et al, 2007), la quantification des niveaux sériques des stéroïdes a montré une augmentation de la DHEA et de ses métabolites après application topique de DHEA chez des femmes ménopausées. Un plateau sérique a été atteint dès une semaine après administration montrant un retour à des taux physiologiques comparables à ceux observés chez la femme non ménopausée.
Des études in vitro et in vivo ont montré que la DHEA et le DHEA-S étaient impliqués dans la régulation et la synthèse du collagène et des métalloprotéinases de la matrice extracellulaire sur des fibroblastes dermiques (Lee et al, 2000) et sur la peau humaine (Shin et al, 2005).
L'effet de la DHEA sur la production de sébum a été montré de façon évidente dans plusieurs études et plus particulièrement chez les sujets âgés de plus de 70 ans généralement en hypo séborrhée. (Labrie et al, 1997b). Ce résultat est très probablement relié au fait que les glandes sébacées contiennent toutes les enzymes de la stéréoïdogénèse nécessaires à la transformation de la DHEA en DHT, androgène majeur qui stimule l'activité de la glande sébacée (Labrie et al, 2000).
Enfin, une étude randomisée en double aveugle, impliquant 280 sujets de 60 à 79 ans stratifiés selon le sexe et l'âge, a montré que l'administration per os de 50 mg par jour de DHEA versus placebo pendant 1 an (Beaulieu et al, 2000) provoquait des effets cutanés suggérant que la DHEA pourrait avoir un effet bénéfique sur l'atrophie cutanée, les rides, la sécheresse de la peau et les taches pigmentaires associées au vieillissement chronologique ou au photovieillissement. De nombreux brevets ont été déposés en vue d'applications cosmétiques et dermatologiques de la DHEA et de ses dérivés dans le domaine de la cosmétique et de la dermatologie, ils concernent des compositions cosmétiques ou dermatologiques les contenant pour réguler la pigmentation de la peau et des cheveux et/ou pour prévenir ou traiter le vieillissement de la peau (atrophie dermique, peau sèche, éclat de la peau, rides, photovieillissement ...).
Cependant, aucune étude n'a porté sur les aspects moléculaires de l'effet de la DHEA sur la peau, ni sur l'exploitation de ces aspects, notamment dans la recherche de molécules mimétiques de la DHEA. En effet, jusqu'à présent, très peu de données sont disponibles concernant les modifications géniques induites par la DHEA sur la peau. Aussi, l'objectif des présents inventeurs a été de rechercher si une augmentation des taux de DHEA circulants pouvait avoir une signature au niveau génique.
Cette étude a révélé que l'application topique de DHEA modifiait l'expression de gènes dans les deux compartiments de la peau, à savoir le derme et l'épiderme. S'il était soupçonné que le traitement par la DHEA induisait des modification au niveau dermique, la demanderesse a découvert de façon surprenante et inattendue que l'application topique de DHEA provoquait des modifications d'expression génique qui ne se limitait pas au derme mais impliquait aussi l'épiderme. L'étude a également permis de mettre en évidence les gènes dont l'expression était modifiée lors de l'application topique de DHEA et tout particulièrement les gènes SPARC, NOL3, SERPINB3, ERBP, JAG 1 , CLDN8, LEP7, MT1X, GBA/GBAP, EFNA1 , PLLP, KRT1 B et SPRR2G. La présente invention est donc sous-tendue par l'identification de cette signature génique caractérisant l'effet de l'application topique de DHEA. Les 13 gènes constituant cette signature génique, à savoir SPARC, NOL3, SERPINB3, ERBP, JAG1 , CLDN8, LEP7, MT1X, GBA/GBAP, EFNA1 , PLLP, KRT1 B et SPRR2G, sont appelés dans ce qui suit, les gènes de l'invention.
Les résultats obtenus par les inventeurs ont en effet permis de mettre en évidence le fait que la DHEA pourrait s'opposer au vieillissement de la peau dû à l'âge, en agissant simultanément sur les deux compartiments de la peau, au niveau du derme en stimulant la biosynthèse et le dépôt de collagène, et au niveau de l'épiderme en modulant la différentiation des kératinocytes.
Grâce à cette connaissance de la signature génique de la DHEA, la présente demande porte plus spécifiquement sur des méthodes de caractérisation de l'effet, sur la peau d'un sujet, d'un traitement par une molécule donnée, sur des méthodes de criblage de molécules mimant l'effet de la DHEA sur la peau et sur diverses méthodes visant à déterminer l'efficacité d'un traitement sur la peau.
La présente invention porte également sur un procédé de criblage de molécules mimétiques de la DHEA qui moduleraient l'expression de tout ou partie des gènes décrits dans la présente invention. Cette invention s'inscrit dans le cadre de la prévention ou du traitement du vieillissement chronologique ou photovieillissement de la peau. La signature d'expression génique en réponse à la DHEA, tout particulièrement au niveau de l'épiderme, identifiée par les inventeurs, constitue en effet un avantage évident pour mesurer l'effet d'une molécule mimétique de la DHEA sur la peau.
Selon un premier aspect, l'invention concerne une méthode permettant de caractériser l'effet d'un traitement par une molécule donnée sur la peau d'un patient. Afin de caractériser l'effet obtenu par ce traitement, il est observé la variation que ce traitement engendre sur l'expression d'un gène choisi parmi les gènes constituant la signature génique de la DHEA, telle qu'elle a été mise en évidence par les inventeurs, c'est-à-dire un gène choisi parmi les gènes SPARC, NOL3, SERPINB3, ERBP, JAG 1 , CLDN8, LEP7, MT1X, GBA/GBAP, EFNA1 , PLLP, KRT1B et SPRR2G. Une telle méthode permet notamment de déterminer si une molécule donnée produit sur la peau d'un sujet un effet semblable, similaire ou différent de l'effet obtenu par la DHEA. Selon cette méthode, la variation dans le taux d'expression de l'un des gènes de l'invention est évaluée au niveau de la peau, notamment au sein du derme et de l'épiderme, en réponse au traitement par la molécule donnée.
De préférence, ladite méthode comprend l'évaluation de la variation de l'expression d'au moins deux gènes parmi les gènes constituant la signature moléculaire de la DHEA, c'est- à-dire au moins deux gènes choisis parmi SPARC, N0L3, SERPINB3, ERBP, JAG1 , CLDN8, LEP7, MT1X, GBA/GBAP, EFNA1, PLLP, KRT1 B et SPRR2G. De préférence, la méthode comprend l'évaluation de la variation d'expression d'au moins 3 gènes, voire d'au moins 5 gènes parmi les gènes de l'invention, ladite variation étant en réponse au traitement par la molécule donnée.
Selon une mise en œuvre préférée de l'invention, la méthode comprend l'évaluation de la variation d'expression d'au moins 8 gènes parmi les gènes de l'invention. Selon une autre mise en œuvre, la variation du niveau d'expression, en réponse au traitement, des treize gènes de l'invention est examinée. Selon d'autres mises en œuvre préférées de la méthode, le ou les gènes dont la variation du niveau d'expression est examinée, sont choisis parmi les gènes NOL3, SERPINB3, ERBP, JAG1 , CLDN8, LEP7, MT1X, GBA/GBAP, EFNA1 , PLLP, KRT1B et SPRR2G. De préférence, la méthode comprend l'évaluation de la variation de l'expression d'au moins un gène, de deux ou bien de trois gènes, choisis parmi les gènes NOL3, SERPINB3, ERBP, JAG1 , CLDN8, LEP7, MT1X, GBA/GBAP, EFNA1, PLLP, KRT1 B et SPRR2G.
Les gènes NOL3, SERPINB3, ERBP, JAG1, CLDN8, LEP7, MT1X, GBA/GBAP, EFNA1 , PLLP, KRT1B et SPRR2G sont en effet les gènes exprimés principalement dans l'épiderme de la peau, et appelés dans ce qui suit les gènes « épidermiques ». Les gènes dont la variation du niveau d'expression est examinée sont de préférence non impliqués dans le métabolisme du collagène.
Des gènes particulièrement préférés dans le cadre de l'invention sont les gènes SPARC,
SERPINB3, JAG1 , LEP7 et SPRR2G, et tout particulièrement les gènes SERPINB3, JAG1 ,
LEP7 et SPRR2G.
Selon un autre mise en œuvre encore, la méthode comprend d'une part l'évaluation de la variation d'expression du gène SPARC en réponse au traitement, d'autre part l'évaluation de la variation d'expression d'au moins un, voire deux ou trois gènes choisis parmi les gènes dits « épidermiques », à savoir NOL3, SERPINB3, ERBP, JAG1 , CLDN8, LEP7, MT1X, GBA/GBAP, EFNA1, PLLP, KRT1 B et SPRR2G, en réponse au traitement. Des combinaisons plus particulièrement envisagées dans le cadre de la présente invention sont notamment : au moins un gène parmi les gènes ERBP, JAG1 et EFNA1 combiné à au moins un gène parmi les gènes LEP7, KRT1 B et SPRR2G et à au moins un gène parmi les gènes SERPINB3 et CLDN8, par exemple la combinaison ERBP, SPRR2G et SERPINB3 ou la combinaison EFNA1 , SPRR2G et SERPINB3 ou bien : ERBP, LEP7 et SERPINB3, ou bien : ERBP, SPRR2G et CLDN8, ou bien par exemple : EFNA1 , LEP7 et SERPINB3. De préférence, dans le cadre de la présente invention, la variation d'expression génique est observée spécifiquement au sein de l'épiderme du sujet. Les inventeurs ont en effet mis en lumière de manière parfaitement inattendue que la DHEA avait un effet au niveau de l'épiderme de la peau traitée. De préférence, la méthode comprend l'évaluation de la variation d'expression d'un gène au sein de l'épiderme, en réponse au traitement par une molécule donnée. Dans ce cas, le gène, dont l'expression est analysée, est de préférence un gène choisi parmi les gènes NOL3, SERPINB3, ERBP, JAG1 , CLDN8, LEP7, MT1X, GBA/GBAP, EFNA1 , PLLP, KRT1 B et SPRR2G. De préférence, la méthode comprend l'évaluation de la variation d'expression d'au moins deux gènes parmi les gènes NOL3, SERPINB3, ERBP, JAG1 , CLDN8, LEP7, MT1X, GBA/GBAP, EFNA1, PLLP, KRT1 B et SPRR2G. Des gènes particulièrement préférés dans le cadre de l'invention sont les gènes SERPINB3, JAG1 , LEP7 et SPRR2G. La méthode est par conséquent de préférence une méthode de caractérisation de l'effet d'un traitement par une molécule donnée sur l'épiderme d'un patient, notamment d'un être humain.
Alternativement, la méthode de l'invention peut comprendre l'évaluation de la variation d'expression d'un gène au sein du derme, en réponse au traitement par une molécule donnée. Dans un tel cas, le gène dont l'expression est analysée, est de préférence le gène SPARC.
La molécule dont la présente invention permet de caractériser les effets sur la peau, peut être toute molécule chimique, connue ou nouvelle, seule ou en combinaison. Il peut s'agir notamment de molécules déjà utilisées pour des applications topiques mais dont l'effet n'a jamais été caractérisé au niveau génique. Il peut également d'agir de molécules générées par chimie combinatoire, et dont la structure n'est pas nécessairement élucidée. La molécule à tester peut être aussi bien une molécule naturelle que synthétique. Il peut s'agir par exemple d'une molécule naturellement extraite de plantes. Il peut s'agir également d'un complexe de molécules ou d'une association. En effet, la méthode selon la présente invention permet également de caractériser les effets d'un traitement effectué à l'aide de plusieurs molécules associées entre elles.
De préférence, il s'agit de molécules déjà autorisées pour des applications topiques ou considérées comme sans danger pour la peau.
Dans le cadre de la présente invention, le traitement par une molécule donnée consiste de préférence en l'application topique de ladite molécule, sur la peau du sujet. La molécule à caractériser est de préférence conditionnée sous forme d'une crème, d'une lotion, d'un gel ou d'une huile qui est appliquée sur la peau. Il est également envisageable que le traitement consiste en l'application d'un patch, comprenant la molécule à caractériser, ledit patch restant en place plusieurs minutes ou heures, ou bien l'application d'un masque. D'autres techniques ou conditionnements permettant d'appliquer la molécule sur la peau et éventuellement de favoriser sa pénétration, sont bien connues de l'homme du métier.
Selon une mise en œuvre préférée de la présente invention, la molécule dont on cherche à caractériser les effets sur la peau, est appliquée au moins un fois par jour, mais préférentiellement au moins deux fois par jour. Elle peut également être appliquée trois fois par jour.
La durée du traitement n'est pas fixée dans le cadre de l'invention ; cependant, afin d'être en mesure de caractériser de manière fiable les variations d'expression d'un ou des gènes de l'invention, il est préférable que le traitement dure au moins une semaine, de préférence au moins deux semaines avant de procéder à l'évaluation de la variation d'expression du ou des gènes choisis, induite par la molécule à caractériser.
Dans le cadre de l'invention, il est préféré des traitements d'une durée d'au moins un mois, de préférence au moins cinq semaines, voire au moins dix, douze, treize ou quinze semaines ou bien un trimestre. Toute zone de peau peut être traitée afin de caractériser l'effet d'un traitement selon la présente invention. Il s'agit de préférence du front, du visage, du décolleté, des faces dorsales des bras et avant-bras, des faces externes des cuisses et/ou des faces externes des jambes. Toute autre zone peut également avantageusement servir dans une méthode d'évaluation selon la présente invention. De préférence, la zone choisie est une zone à faible pilosité. La zone de peau est de préférence une zone de peau saine, non lésée ou blessée.
Le sujet, dans le cadre de la présente invention, est de préférence un être humain, un homme, une femme ou un enfant. Il est particulièrement préféré que ledit sujet soit une personne âgée d'au moins 30 ans, de préférence d'au moins 45 ans. En effet, dans la mesure où la présente invention consiste notamment en l'identification de molécules dont l'effet sur la peau est comparable à celui de la DHEA, le sujet est de préférence une personne commençant à subir une baisse importante de production de DHEA endogène. Les gènes constituant la signature génique sont en effet les gènes spécifiquement modulés par l'application de DHEA exogène, mais également par la production de DHEA endogène. Par conséquent, un sujet dans le cadre de la présente invention est de préférence une personne subissant un déficit en DHEA produite de manière endogène.
Dans ce contexte, le sujet est tout préférentiellement une femme et plus particulièrement une femme au seuil de la ménopause ou bien déjà ménopausée, par exemple une femme d'au moins 55 ans ou d'au moins 60 ans.
Dans la méthode de l'invention telle que décrite précédemment, la variation de l'expression du ou des gènes choisis est quantifiée par analyse de l'ARNm transcrit au niveau de l'épiderme et/ou au niveau du derme. Comme vu précédemment, l'analyse transcriptionnelle est de préférence effectuée au niveau de l'épiderme traité par la molécule dont on cherche à caractériser les effets.
Selon un mode de réalisation préféré de la méthode de l'invention, la variation du niveau de l'expression du gène choisi est normalisée par référence à l'expression d'au moins un gène choisi parmi Atpδo, les gènes codant pour la β-actine et la β2-microglobuline, les gènes codant pour les protéines ribosomales S28 et S9, le gène codant pour la protéine ribosomale L13A, et le gène codant pour le GAPDH.
L'expression des gènes est de préférence quantifiée par analyse de l'ARN messager (ARNm) transcrit au sein du derme et de l'épiderme, ou bien au sein de l'épiderme uniquement, ou au sein du derme uniquement. La quantification de l'ARNm transcrit est réalisée par exemple à l'aide de la technique de Northern Blot, dot blot, RT-PCR, hybridation sur puces à ADN, méthode SAGE ou par utilisation de cartes microfluidiques. D'autres techniques permettant la quantification de l'ARNm peuvent bien entendu être utilisées. Toutes ces techniques sont bien connues de l'homme du métier. Par exemple, des amorces pourront être utilisés pour l'analyse par RT-PCR de l'expression génique ayant les séquences illustrées dans le tableau 1 (séquences des amorces « Forward » et « Reverse »).
Il est également possible de quantifier le taux de transcription des gènes par l'analyse du taux de traduction et donc la quantification de protéines produites. Des techniques appropriées à cet objectif sont également bien connues de l'homme du métier. Par conséquent la signature moléculaire mise en évidence par les inventeurs se reflète également au niveau des protéines codées par les 13 gènes de l'invention. Quand l'analyse du taux de transcription des gènes de l'invention est réalisée au sein de l'épiderme, des prélèvements d'épiderme ou de peau sont réalisés par exemple par la méthode décrite dans Marionnet C. et al, 2003, (prélèvements au dermatome, qui est un instrument permettant de prélever des bandes de peau très fines, de quelques dixièmes de millimètres d'épaisseur) ou toutes autres méthodes de prélèvement (biopsies, punch, kératome ou micro-kératome...).
Quand l'analyse du taux de transcription des gènes de l'invention est réalisée au niveau global du derme et de l'épiderme, les prélèvements sont de préférence réalisés par biopsie, ou toute autre technique bien connue de l'homme du métier.
Les effets sur la peau ou l'épiderme, caractérisés par la méthode de l'invention, s'entendent de préférence d'effets cosmétiques, c'est-à-dire d'effets principalement esthétiques relatifs à l'apparence de la peau, à l'exclusion de tout effet thérapeutique ou prophylactique. Un effet cosmétique sur la peau ou l'épiderme est notamment un effet sur le vieillissement actinique et ses conséquences sur l'apparence de la peau.
Selon un second aspect de l'invention, la présente demande concerne également une méthode d'évaluation de l'effet réparateur, ou effet rajeunissant, d'une molécule sur la peau d'un sujet. A cette fin, la méthode comprend la caractérisation d'un traitement par ladite molécule selon l'une des mises en œuvre de la méthode décrite précédemment.
La molécule peut être tout actif, extrait naturel, ou combinaison d'actifs par exemple. Par molécule, dans le cadre de cette invention, on entend aussi bien un ingrédient ou un actif sous une forme plus ou moins purifiée, présentant une activité intrinsèque in vitro ou in vivo, qu'une formulation comprenant un ou plusieurs de ces ingrédients et un support et des adjuvants adaptés à l'application visée.
Par effet réparateur ou effet rajeunissant, ou bien effet « anti-âge », on entend un effet identique ou similaire à l'effet obtenu par l'application de la DHEA, c'est-à-dire notamment une diminution des rides (profondeur et nombre), une peau plus ferme, présentant une meilleure élasticité, une meilleure hydratation, présentant un aspect extérieur plus jeune que son âge biologique.
En effet, les présents inventeurs, en identifiant la signature génique caractéristique de l'effet de la DHEA, ont ainsi identifié les gènes dont la variation conduit aux effets « rajeunissants » ou « anti-âge » observés et déjà décrits obtenus avec l'application topique de DHEA. Selon cet aspect de l'invention, l'évaluation de l'effet réparateur d'un traitement par une molécule donnée, est considérée comme positive, c'est-à-dire que ledit traitement a en effet un effet réparateur, si la variation d'expression du ou des gènes choisis parmi les gènes de l'invention, est une répression de l'expression si un ou des gènes sont choisis parmi les gènes NOL3, JAG1 , CLDN8, LEP7, MT1X, GBA/GBAP, EFNA1 , PLLP, KRT1B et SPRR2G ou une stimulation de l'expression si un ou des gènes sont choisis parmi les gènes SPARC, SERPINB3 et ERBP, de préférence parmi les gènes SERPINB3 et ERBP. En effet, si le traitement par la molécule à tester est une répression de l'expression d'un gène choisi parmi les gènes NOL3, JAG 1 , CLDN8, LEP7, MT1X, GBA/GBAP, EFNA1 , PLLP, KRT1 B et SPRR2G ou une stimulation de l'expression d'un gène choisi parmi les gènes SPARC, SERPINB3 et ERBP, de préférence parmi les gènes SERPINB3 et ERBP, alors l'effet obtenu par le traitement est de même nature que le traitement avec la DHEA, tel que décrit par exemple dans la section expérimentale de la présente demande. Afin de parvenir à une évaluation fiable, il est préférable d'analyser les variations d'expression d'au moins 2, 3 voire 5 gènes parmi les gènes mentionnés De préférence, l'évaluation est considérée comme positive si la variation d'expression induite par la molécule donnée est de même nature que la variation induite par la DHEA pour au moins deux gènes choisis parmi les gènes de l'invention, notamment parmi les gènes NOL3, SERPINB3, ERBP, JAG1 , CLDN8, LEP7, MT1X, GBA/GBAP, EFNA1 , PLLP, KRT1 B et SPRR2G, de préférence pour au moins cinq ou huit gènes, et de préférence pour l'ensemble des gènes NOL3, SERPINB3, ERBP, JAG 1 , CLDN8, LEP7, MT1X, GBA/GBAP, EFNA1 , PLLP, KRT1 B et SPRR2G, ou bien l'ensemble des treize gènes de l'invention. De préférence, la variation observée (répression ou stimulation de l'expression, selon le gène considéré choisi) a une amplitude statistiquement significative, de préférence d'au moins 10%, de préférence d'au moins 20%, par rapport au niveau d'expression basai du gène choisi. De préférence, la variation observée pour l'expression du gène choisi est d'au moins 30%.
La variation du niveau de l'expression du gène choisi peut être normalisée par référence à l'expression d'au moins un gène choisi parmi Atpδo, les gènes codant pour la β-actine et la β2-microglobuline, les gènes codant pour les protéines ribosomales S28 et S9, le gène codant pour la protéine ribosomale L13A, et le gène codant pour le GAPDH. Selon une mise en œuvre en préférée, la variation observée dans le niveau d'expression du gène choisi est au moins égale à celle observée avec la DHEA, dans des conditions de traitement identiques. Selon une mise en œuvre préférée de la méthode d'évaluation de l'effet réparateur, ou effet rajeunissant, d'une molécule sur la peau d'un sujet, le sujet en question est une personne connaissant un déficit en DHEA produite de manière endogène, de préférence une personne âgée d'au moins 30 ans, de préférence d'au moins 40 ou 45 ans. Il est préféré que ladite personne soit âgée d'au moins 50, 55 ou 60 ans. Un sujet tout particulièrement préféré dans le cadre de l'invention, pour mettre en œuvre la méthode d'évaluation décrite, est une femme ménopausée ou sur le point de l'être.
Grâce à cette méthode, il est ainsi possible d'évaluer la capacité de certains traitements, notamment des compositions cosmétiques pour application topique sur la peau à réaliser un « rajeunissement » de la peau. Par « rajeunissement » de la peau, on entend principalement l'amélioration de la fermeté et de l'élasticité de la peau telle que l'aspect extérieur et la résistance aux agressions de la peau redevient plus proche l'aspect et de la résistance d'une peau plus jeune. Du fait que les inventeurs ont déterminé une signature représentative de l'effet « anti-âge » de la DHEA, il est également possible, par les méthodes d'évaluation de la présente demande, d'objectiver l'action bénéfique d'un traitement, notamment d'un produit cosmétique, par exemple d'une composition cosmétique. Les méthodes d'évaluation décrites plus haut peuvent en effet être utilisées dans un protocole de test permettant de déterminer les produits susceptibles d'être qualifiés de « actifs réparateurs pour la peau » ou bien « ayant un effet anti-âge » ou « effet de rajeunissement de la peau ».
Par ailleurs, au moyen de ce test, il est possible de promouvoir le produit auprès de consommateurs, en mettant en avant les résultats obtenus avec ce produit dans les méthodes d'évaluation décrites dans la présente invention. L'évaluation de l'effet « anti- âge » sera basée sur l'étude de l'expression des gènes de l'invention ou des protéines encodées par ces gènes. La présente invention fournit donc également une méthode permettant de recommander un produit en signalant son effet dans un protocole de test constitué par une méthode d'évaluation telle que décrite précédemment. L'invention a donc également pour objet une méthode pour la promotion d'un produit cosmétique consistant à faire état d'une efficacité, action ou propriété dudit produit démontrée par au moins un test opéré tel que décrit précédemment.
Une telle promotion du produit pourra se faire par n'importe quel canal de communication. Elle pourra être faite notamment par la vendeuse, directement sur le point de vente, par la radio et la télévision, notamment dans le cadre de spots publicitaires. Elle pourra être faite également par le canal de la presse écrite, ou par le biais de tout autre document, en particulier à des fins publicitaires (prospectus). Elle pourra se faire également par Internet, ou par tout autre réseau informatique adéquat. Elle pourra être faite également directement sur le produit, notamment sur son packaging ou sur toute notice explicative qui peut lui être associée. Toujours grâce à l'identification par les inventeurs, d'une signature moléculaire génique de l'effet d'un traitement par la DHEA, la présente invention concerne également, selon un autre aspect, un procédé de criblage visant à identifier des molécules ayant un effet réparateur ou rajeunissant sur la peau. En effet, par l'observation des variations d'expression d'au moins un des gènes de l'invention, il est possible de caractériser l'effet du traitement par la molécule à cribler et de le comparer avec l'effet du traitement par la DHEA. Un tel procédé comprend donc une étape de caractérisation de l'effet des molécules à cribler sur la peau d'un sujet selon la méthode de caractérisation correspondant au premier aspect de la présente invention. Par le biais de ce procédé, il est ainsi possible d'identifier différentes molécules qui soient mimétiques de la DHEA, c'est-à-dire qu'elles provoquent sur la peau, un effet moléculaire très semblable à celui provoqué par la DHEA, notamment qu'elles entraînent des variations identiques ou similaires dur le niveau d'expression des gènes de l'invention, et plus particulièrement les gènes « épidermiques » de l'invention, à savoir NOL3, SERPINB3, ERBP, JAG1 , CLDN8, LEP7, MT1X, GBA/GBAP, EFNA1 , PLLP, KRT1 B et SPRR2G.
Comme explicité plus haut, l'effet réparateur ou rajeunissant de la molécule criblée, ou effet « anti-âge », est considéré comme avéré si la molécule induit, au niveau de la peau du sujet, une variation de l'expression de l'un des gènes de l'invention qui soit de même nature que la variation de l'expression du même gène induite par la DHEA. Par « variation de l'expression de même nature que la variation de l'expression induite par la DHEA », on entend une répression de l'expression si le gène choisi est le gène NOL3, JAG1 , CLDN8, LEP7, MT1X, GBA/GBAP, EFNA1 , PLLP, KRT1 B ou SPRR2G et une stimulation de l'expression si le gène choisi est le gène SPARC, SERPINB3 ou ERBP, de préférence le gène SERPINB3 ou ERBP. De préférence, l'effet réparateur est considéré comme avéré si la variation d'expression induite par la molécule donnée est de même nature que la variation induite par la DHEA pour au moins deux gènes choisis parmi les gènes de l'invention, notamment parmi les gènes NOL3, SERPINB3, ERBP, JAG1 , CLDN8, LEP7, MT1X, GBA/GBAP, EFNA1 , PLLP, KRT1B et SPRR2G, de préférence pour au moins cinq ou huit gènes, et de préférence pour l'ensemble des gènes NOL3, SERPINB3, ERBP, JAG1 , CLDN8, LEP7, MT1X, GBA/GBAP, EFNA1 , PLLP, KRT1 B et SPRR2G, ou bien l'ensemble des treize gènes de l'invention. De préférence, l'amplitude de la variation induite par la molécule à cribler sur le niveau d'expression d'un gène de l'invention, est statistiquement significative, de préférence, cette amplitude est d'au moins 10% du niveau d'expression basai (avant traitement), de préférence d'au moins 20%. Selon une mise en œuvre préférée, l'amplitude de la variation est d'au moins 30%.
La variation du niveau de l'expression du gène choisi peut être normalisée par référence à l'expression d'au moins un gène choisi parmi Atpδo, les gènes codant pour la β-actine et la β2-microglobuline, les gènes codant pour les protéines ribosomales S28 et S9, le gène codant pour la protéine ribosomale L13A, et le gène codant pour le GAPDH. Selon une situation préférée, la variation du niveau d'expression d'au moins un gène de l'invention induite par une molécule criblée est au moins égale voire supérieure à la variation du niveau d'expression du même gène induit par le DHEA, dans les mêmes conditions de traitement. La variation du niveau d'expression obtenue par un traitement avec de la DHEA est plus particulièrement explicitée dans la partie expérimentale de la présente demande.
Le procédé de l'invention peut également être mis en œuvre pour cribler des combinaisons de différentes molécules, afin de déterminer une combinaison dont les effets s'apparentent le plus aux effets induits par la DHEA.
Selon encore un autre aspect, la présente demande concerne également un procédé de détermination de l'efficacité d'un traitement par une molécule donnée. Afin de déterminer l'efficacité dudit traitement sur la peau d'un sujet, on caractérise l'effet du traitement selon la méthode de caractérisation décrite selon le premier aspect de l'invention. On détermine de cette manière l'effet du traitement sur le niveau d'expression de l'un au moins des 13 gènes de l'invention, au sein de la peau du sujet après traitement.
Un traitement est considéré comme efficace s'il agit sur la peau de telle manière à lui rendre des propriétés, notamment aspect et structure, plus proches de celles caractéristiques d'une peau « jeune », d'une personne entre 20 et 30 ans. Comme vu précédemment, le traitement par la molécule donnée est considéré comme efficace si il est observé d'une part une répression de l'expression d'au moins un gène choisi parmi NOL3, JAG1 , CLDN8, LEP7, MT1X, GBA/GBAP, EFNA1, PLLP, KRT1 B et SPRR2G ou la stimulation de l'expression d'au moins un gène choisi parmi les gènes SPARC, SERPINB3 et ERBP, et de préférence parmi les gènes SERPINB3 et ERBP. De préférence, le traitement est considéré comme efficace si la variation d'expression induite par la molécule donnée est de même nature que la variation induite par la DHEA pour au moins deux gènes choisis parmi les gènes de l'invention, notamment parmi les gènes NOL3, SERPINB3, ERBP, JAG1 , CLDN8, LEP7, MT1X, GBA/GBAP, EFNA1, PLLP, KRT1B et SPRR2G, de préférence pour au moins cinq ou huit gènes, et de préférence pour l'ensemble des gènes NOL3, SERPINB3, ERBP, JAG 1 , CLDN8, LEP7, MT1X, GBA/GBAP, EFNA1 , PLLP, KRT1B et SPRR2G, ou bien l'ensemble des treize gènes de l'invention. Une nouvelle fois, l'amplitude de la variation induite par le traitement sur le niveau d'expression d'un gène de l'invention, est statistiquement significative, de préférence, cette amplitude est d'au moins 10% du niveau d'expression basai (avant traitement), de préférence d'au moins 20%. Selon une mise en œuvre préférée, l'amplitude de la variation est d'au moins 30% qu'il s'agisse de répression ou de stimulation.
Comme déjà explicité, la variation du niveau de l'expression du gène choisi peut être normalisée par référence à l'expression d'au moins un gène choisi parmi Atpδo, les gènes codant pour la β-actine et la β2-microglobuline, les gènes codant pour les protéines ribosomales S28 et S9, le gène codant pour la protéine ribosomale L13A, et le gène codant pour le GAPDH.
Pour les raisons déjà explicitées, le sujet est de préférence un être humain subissant un déficit en DHEA endogène, de préférence un être humain âgé d'au moins 30 ans, de préférence d'au moins 45 ans. Le sujet est préférentiellement âgé d'au moins 50, 55 ou 60 ans. De manière toute préférentielle, le sujet est une femme ménopausée ou sur le point de l'être.
Il doit être noté que les différentes méthodes et procédés selon l'invention comprennent tous une méthode de caractérisation de l'effet provoqué sur la peau par un traitement avec une molécule donnée, selon le premier aspect de l'invention. Par conséquent les différentes mises en œuvre et paramètres préférés dans le cadre de ce premier aspect de l'invention sont également applicables à l'ensemble des autres méthodes et procédés de l'invention. Selon un dernier aspect, la présente invention concerne également une puce à ADN comprenant des sondes s'hybridant spécifiquement avec l'ADNc des gènes SPARC, NOL3, SERPINB3, ERBP, JAG1 , CLDN8, LEP7, MT1X, GBA/GBAP, EFNA1 , PLLP, KRT1 B et SPRR2G, de préférence des sondes s'hybridant spécifiquement avec l'ADNc des gènes NOL3, SERPINB3, ERBP, JAG1 , CLDN8, LEP7, MT1X, GBA/GBAP, EFNA1 , PLLP, KRT1 B et SPRR2G. De préférence une telle puce comprend également des sondes s'hybridant avec au moins un gène choisi parmi Atpδo, les gènes codant pour la β-actine et la β2-microglobuline, les gènes codant pour les protéines ribosomales S28 et S9, le gène codant pour la protéine ribosomale L13A, et le gène codant pour le GAPDH. Mis à part des éventuels contrôles positifs ou négatifs, une puce selon l'invention ne comprend pas de sondes s'hybridant avec d'autres gènes que les gènes de l'invention et les gènes servant à la normalisation des variations des niveaux d'expression. Légende des figures :
Fig.1 : La figure 1 illustre le fait que la DHEA stimule l'expression des collagènes 5A2 et 1 A1 , ainsi que de SPARC.
Les courbes représentent le Iog2 des variations d'expression (avant et après traitement)
(Delta) en fonction de la dose de DHEA utilisée. Les données initiales utilisées étaient les signaux d'intensité bruts après normalisation par la méthode de RMA (Robust Multiarray
Analysis). Les cercles pleins sur la courbe correspondent à une différence statistiquement significative (p<0,05).
Fig.2 : La figure 2 illustre la modulation du niveau d'expression de SPRR2G et SERPINB3 en fonction de la dose de DHEA utilisée.
Les courbes représentent le Iog2 des variations d'expression (avant et après traitement)
(Delta) en fonction de la dose de DHEA utilisée. Les données initiales utilisées étaient les signaux d'intensité bruts après normalisation par la méthode de RMA (Robust Multiarray
Analysis). Les cercles pleins sur la courbe correspondent à une différence statistiquement significative (p<0,05).
Fig. 3 : La figure 3 illustre le fait que la DHEA inhibe l'expression des gènes JAG1 et LEP7.
Les courbes représente le Iog2 des variations d'expression (avant et après traitement) (Delta) en fonction de la dose de DHEA utilisée. Les données initiales utilisées étaient les signaux d'intensité bruts après normalisation par la méthode de RMA (Robust Multiarray
Analysis). Les cercles pleins sur la courbe correspondent à une différence statistiquement significative (p<0,05).
EXEMPLES :
1. Introduction
L'objectif des présents inventeurs a été de rechercher si une augmentation des taux de DHEA circulants pouvait avoir une signature au niveau génique grâce à une large étude transcriptomique selon la technique Affymetrix. Cette étude clinique randomisée en double aveugle versus placebo a porté sur 60 femmes ménopausées âgées de 60 à 65 ans, de type caucasien, réparties en 5 groupes de traitement. Les conditions d'éligibilité incluaient notamment l'absence de tout traitement hormonal substitutif dans les 6 mois précédant l'étude, l'absence de dérèglement endocrinien et de traitement avec des agents abaissant les lipides ou le glucose.
Après avoir signé le consentement écrit, chaque sujet éligible a été randomisé dans l'un des 5 groupes de traitement de l'émulsion DHEA aux concentrations: 0% (placebo), 0,1 %, 0,3%, 1 % ou 2% pendant treize semaines. Le traitement consistait en l'application de la crème 2 fois par jour (le matin entre 6 00 et 9:30 et le soir entre 18 :00 et 21 :30) sur le front et le visage (côté droit) pour 0,3 ml, le décolleté (0,3), les faces dorsales bras et avant-bras (0,3 mlx2), les faces externes des cuisses (0,6 ml x2) et les faces externes des jambes (0,3 ml x2) pour une dose totale de 3,0 ml de DHEA.
Deux biopsies ont été obtenues à partir des cuisses de chacune des patientes, l'une avant et la seconde après le traitement. Les biopsies ont été réalisées sur la face externe des cuisses à 8 cm à la verticale sous le trochanter, en utilisant le côté gauche ou droit pour l'échantillon avant traitement et le côté opposé après 13 semaines de traitement. Afin de recueillir les biopsies à l'emporte-pièce, une anesthésie locale a été pratiquée et un morceau cylindrique de peau de 2 mm de diamètre a été prélevé. Les biopsies ont été immédiatement immergées et conservées dans de l'azote liquide jusqu'à l'extraction d'ARN.
2. Méthodologie
Analyse par Hybridation Oligonucléotidigue à haute densité
L'ARN total a été extrait en présence de Trizol (Invitrogen) à partir de chaque biopsie. Les échantillons ont été traités selon la version II du protocole Affymetrix de marquage d'échantillon de petite taille. Ce protocole repose sur le principe de 2 cycles de synthèse d'ADNc (ADN complémentaire) et d'une réaction de transcription in vitro pour l'amplification et la marquage de I1ARNc. L1ARNc marqué a été isolé en utilisant une colonne RNeasy mini kit (QIAGEN). L1ARNc purifié était fragmenté à 200-30 mer en utilisant un tampon de fragmentation. La qualité de l'ARN total, de la synthèse d'ARNc de l'amplification et de la fragmentation de I1ARNc ont été vérifiées par électrophorèse capilllaire (Bioanalizer 2100, Technologies Agilent). Quinze microgrammes d'ARNc fragmenté a été hybride en double exemplaire pendant 16 heures à 45°C avec une rotation constante, en utilisant la puce oligonucléotidique humaine U 133 Plus 2.0 (Genechip, Affymetrix GeneChip Fluidic Station 450 ; protocole EukGE-WSv5-450). Le marquage a été réalisé à l'aide de la streptavidine- phycoérythrine conjuguée (SAPE) (Molecular Probes), suivi d'une amplification avec un anticorps anti-streptavidine biotinylé (laboratoires Vector) et par un second tour de SAPE. Les puces ont été analysées en utilisant un scanner GeneChip 3000 G7 (Affymetrix) permettant une analyse à haute résolution. Les puces comprenaient 1 300 000 motifs oligonucléotidiques uniques couvrant plus de 47 000 transcrits et variants, lesquels, représentent approximativement 39 000 des gènes humains les mieux caractérisés. Les images des puces ont été extraites avec le logiciel GeneChip Operating et analysées avec le Kit Limma. Le contrôle qualité des puces a été réalisé au moyen du logiciel AffyQCReport ; ce contrôle est nécessaire pour pouvoir comparer les résultats entre chaque expérience. La suppression du bruit de fond et la normalisation de l'intensité du signal pour chacune des sondes ont été réalisées en utilisant la méthode de l'Analyse Multivariée Robuste (AMR). L'analyse a été réalisée en utilisant l'interface « affylmGUI Graphical User » pour le Kit Limma miccroarray.
Analyse RT-qPCR La synthèse des ADNc a été effectuée par transcription inverse, à 500C pendant 2 heures, à partir de l'ARN total dans un volume de réaction de 50 ul en présence de 30 ng d'oligo- (d)Tprimers, 300 U de Superscript III Rnase H-reverse transcriptase (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA), 500 μM deoxynucleotides triphosphate, 5 mM dithiothreitol, et 34 U d'inhibiteur de RNase (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ). La réaction a été stoppée en ajoutant 1 ug de RNAse A à 37°C pendant 30 minutes, puis I1ADNc a été purifié à l'aide du PCR purification Kit (QIAGEN, Valencia, CA).
Les réactions de PCR en temps réel ont été réalisées en triplicats en utilisant le kit LightCycler FastStart DNA Master Plus SYBRGreen (Roche Diagnostics). Le réactif LightCycler FastStart DNA Master Plus SYBRGreen I a été utilisé selon les recommandations du manufacturier. Les conditions de PCR utilisées ont été les suivantes : 50 cycles de dénaturation à 95°C pendant 10 secondes, annealing 59-65°C pendant 5 secondes, élongation à 72°C pendant 10-12 secondes et lecture à 78°C pendant 3 secondes. Le gène de ménage (housekeeping gène) Atpδo a été utilisé comme gène de référence. Les amorces utilisées sont décrites dans le tableau 1. La spécificité de l'amplification a été vérifiée par analyse de la courbe de fusion selon les recommandations du manufacturier. La quantification a été obtenue en utilisant le calcul de la dérivée seconde et de double correction et les résultats ont été analysés avec le programme LightCycler 3.5 (Roche). Seuls les gènes d'intérêt validés par RT-qPCR ont été retenus dans le cadre de la présente invention. Tableau 1 : amorces utilisées pour les expériences de RT-PCR
OO
Figure imgf000019_0001
CD
Figure imgf000020_0001
3. Résultats :
De façon attendue, (Shin et al, 2005), l'expression de certains gènes de la famille du collagène a été stimulée par le traitement à la DHEA, aux différentes doses utilisées (voir tableau 2). Les inventeurs ont de plus montré que la transcription du gène SPARC (ostéonectine) est elle aussi stimulée, ce qui est en accord avec son rôle dans le processus de maturation des fibres de collagène (Alexander et al, 1991 ). Voir le tableau 2 et la figure 1.
Tableau 2 : Modulation de l'expression de gènes « dermiques ».
Figure imgf000021_0001
Le niveau de modulation signifie la niveau de modulation par rapport au témoin, entre le début et la fin du traitement par la DHEA aux concentrations respectivement de 1 et 2%. La colonne A correspond à l'analyse par hybridation oligonucléotidique à haute densité. Les deux dernières colonnes présentent les résultats de l'analyse RT-qPCR.
De façon surprenante et inattendue, l'expression de certains gènes spécifiquement exprimés dans l'épiderme a aussi été modulée par le traitement à la DHEA. De façon intéressante, ces gènes sont associés au programme de différenciation épidermique et leur expression est majoritairement réprimée. Parmi ces gènes, comme illustré dans le tableau 3 et les figures 2 et 3, on peut citer:
- Inhibiteur de la protéinase Serine (ou cystéine) B3 - SERPINB3
Son expression est étroitement reliée à la différentiation cellulaire à la fois dans les cellules normales et les cellules squameuses malignes (Takeda et al. 2002). SERPIN B3 peut agir en tant qu'inhibiteur de protéase afin de moduler la réponse immune « host » contre les cellules tumorales.
- Protéine ligand du Récepteur aux estrogènes - ERBP II s'agit d'une protéine nucléaire qui interagit notamment avec ERa et qui se lie aussi à PPARY, RXRα et ER β. dont la localisation des récepteurs β et leur haute expression ont été montrées dans les kératinocytes épidermaux chez l'homme (Taylor et al, 2000, Thorton et al, 2003). - Jagged 1 - JAG1
Jagged 1 est le ligand des multiples récepteurs de Notch 1 et impliqué dans la signalisation de Notch (Lindsell et al, 1995). Dans la peau humaine, une augmentation du taux de Notch et de Jagged 1 a été démontrée au début de la différenciation. - Claudine 8 - CLDN8 Les claudines sont localisées dans les cellules de la couche granuleuse de l'épiderme et au niveau des jonctions serrées (Brandner et al, 2002) où elles jouent un rôle majeur et pour certaines claudines, dans la formation de la fonction barrière de la peau.
- Protéine 7 (enveloppe tardive) - LEP7
Lep7 est induit dans la différentiation terminale des kératinocytes et localisé plus tardivement dans l'enveloppe (Zhao et al, 1997). - Métallothionine 1X - MT1X
Ligand des métaux lourds, la métallothionéine joue un rôle dans la détoxification des métaux lourds et des radicaux libres.
- Glucosidase beta acide - GBA/GBAP Ce gène code pour une protéine membranaire lysosomale qui clive la liaison beta glucosidique du glycosylcéramide, un intermédiaire dans le métabolisme glycolipidique. Des mutations de ce gène sont la cause de la maladie de Gaucher caractérisée par une accumulation lysosomale.
- Ephrine-A1 - EFNA1 Cette protéine fait partie de la famille des récepteurs des tyrosines kinases et est impliquée dans la signalisation cellulaire. Leur implication dans les processus de développement est bien connue. Ephrini est exclusivement exprimé dans l'épiderme. Ces molécules ont des fonctions importantes dans l'homéostasie de la peau. Des auteurs ont rapporté que la diminution de son expression pourrait contribuer à la carcinogénèse de tumeurs de la peau (Guo et al, 2006).
- Plasmolipine - PLLP
Cette protéine semble être impliquée dans la myélinisation. Elle pourrait aussi induire la formation de ponts ioniques K+ dépendants. - Kératine 1B - KRT1 B II s'agit d'une kératine du cytosquelette, exprimée presque exclusivement dans la peau et qui contribue à son intégrité structurale. Elle appartient à la famille des filaments intermédiaires. Il s'agit d'un marqueur de la différentiation précoce des kératinocytes (Green ét al, 1982). - Protéine 2G riche en petite praline - SPRR2G
Ces protéines sont des constituants de l'enveloppe cornée.
- Protéine nucléolaire 3 - NOL 3 (Unigene AK092623, RefSeq NM_003946, PM 24 kDa): L'isoforme 1 (essentiellement localisée dans le noyau et le nucléole) est impliquée dans la maturation des ARN (isoforme 1) et l'isoforme 2 (cytoplasmique) est impliquée dans l'inhibition de l'apoptose en interagissant, via un domaine CARD (CAspase Recruitment Domain) avec la caspase 2 et la caspase 8.
Du fait qu'une part importante de ces gènes est associée, d'une manière ou d'une autre, à la différentiation des kératinocytes, leur répression sous l'effet de l'application topique de DHEA pourrait être associée à un retard dans la différentiation des kératinocytes.
Il semble, au vu de cette étude, que la DHEA agisse à rencontre des effets de vieillissement de la peau dû à l'âge, en stimulant au niveau du derme, la biosynthèse de collagène et en modulant, au niveau de l'épiderme, la différentiation des kératinocytes.
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« modulation » signifie la niveau de modulation par rapport au témoin, entre le début et la fin du traitement par la DHEA aux concentrations respectivement de 1 et 2%.
La colonne A correspond à l'analyse par hybridation oligonucléotidique à haute densité.
Références :
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Claims

REVENDICATIONS
1. Méthode de caractérisation de l'effet cosmétique, sur la peau d'un sujet, d'un traitement par une molécule donnée, comprenant l'évaluation de la variation, induite par ledit traitement, de l'expression d'au moins deux gènes choisis parmi les gènes
N0L3, SERPINB3, ERBP, JAG 1, CLDN8, LEP7, MT1X, GBA/GBAP, EFNA1 , PLLP, KRT1 B, SPRR2G et SPARC au niveau de la peau dudit sujet, où ledit sujet est un être humain.
2. Méthode de caractérisation selon la revendication 1 , où lesdits deux gènes sont choisis parmi les gènes NOL3, SERPINB3, ERBP, JAG 1, CLDN8, LEP7, MT1X, GBA/GBAP, EFNA1, PLLP, KRT1 B et SPRR2G.
3. Méthode de caractérisation selon la revendication 1, comprenant l'évaluation de la variation de l'expression d'au moins trois gènes choisis parmi les gènes NOL3,
SERPINB3, ERBP, JAG1 , CLDN8, LEP7, MT1X, GBA/GBAP, EFNA1 , PLLP, KRT1 B, SPRR2G et SPARC, de préférence d'au moins cinq gènes.
4. Méthode selon la revendication 1 , comprenant l'évaluation de la variation de l'expression du gène SPARC et d'au moins un gène choisi parmi les gènes NOL3,
SERPINB3, ERBP, JAG1 , CLDN8, LEP7, MT1X, GBA/GBAP, EFNA1 , PLLP, KRT1 B et SPRR2G.
5. Méthode selon la revendication 1, où ladite variation est observée au niveau de l'épiderme du sujet.
6. Méthode selon la revendication 1 , où ledit traitement consiste en l'application topique de la molécule sur la peau du sujet.
7. Méthode selon la revendication 6, où la molécule est appliquée au moins deux fois par jour, durant au moins deux semaines, avant l'évaluation de la variation d'expression du gène choisi, induite par la molécule.
8. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, où ledit sujet est âgé d'au moins 30 ans, de préférence d'au moins 45 ans.
9. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, où ledit sujet est une femme, de préférence une femme ménopausée.
10. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 où ladite variation d'expression est normalisée à l'aide du niveau d'expression d'un gène choisi parmi Atpδo, les gènes codant pour la β-actine et la β2-microglobuline, les gènes codant pour les protéines ribosomales S28 et S9, le gène codant pour la protéine ribosomale L13A , et le gène codant pour le GAPDH.
11. Méthode d'évaluation de l'effet réparateur d'une molécule sur la peau d'un sujet comprenant la caractérisation de l'effet d'un traitement par ladite molécule par une méthode selon l'une des revendications 1 à 10.
12. Méthode selon la revendication 11, où l'évaluation est considérée comme positive si la variation d'expression des gènes choisis est une répression de l'expression si un gène est choisi parmi les gènes NOL3, JAG 1 , CLDN8, LEP7, MT1X, GBA/GBAP, EFNA1 , PLLP, KRT1 B et
SPRR2G ou une stimulation de l'expression si un gène est choisi parmi les gènes SPARC, SERPINB3 et ERBP.
13. Méthode selon la revendication 11 , où la variation observée de l'expression des gènes choisis est d'au moins 30%.
14. Méthode selon la revendication 11 , ledit sujet est une personne âgée d'au moins 30 ans, de préférence au moins 45 ans.
15. Méthode selon la revendication 14 où le sujet est une femme, de préférence une femme ménopausée.
16. Procédé de criblage de molécules ayant un effet réparateur sur la peau, comprenant la caractérisation de l'effet desdites molécules sur la peau d'un sujet par une méthode selon l'une des revendications 1 à 10.
17. Procédé selon la revendication 16, où l'effet réparateur est avéré si la variation d'expression des gènes choisis est une répression d'au moins 30% de l'expression si un gène est choisi parmi les gènes NOL3, JAG1 , CLDN8, LEP7, MT1X, GBA/GBAP, EFNA1 , PLLP, KRT1 B et SPRR2G ou - une stimulation d'au moins 30% de l'expression si un gène est choisi parmi les gènes SPARC, SERPINB3 et ERBP.
18. Procédé de détermination de l'efficacité sur la peau d'un sujet, d'un traitement par une molécule donnée, comprenant la caractérisation de l'effet du traitement par une méthode selon l'une des revendications 1 à 10.
19. Procédé selon la revendication 18, où le traitement par la molécule donnée est considéré comme efficace si la variation d'expression des gènes choisis est: une répression d'au moins 30% de l'expression si un gène est choisi parmi les gènes NOL3, JAG1 , CLDN8, LEP7, MT1X, GBA/GBAP, EFNA1 , PLLP,
KRT1 B et SPRR2G ou une stimulation d'au moins 30% de l'expression si un gène est choisi parmi les gènes SPARC, SERPINB3 et ERBP.
20. Procédé selon la revendication 18, où ledit sujet est une femme ménopausée.
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