WO2010037352A1 - Composición farmacéutica utilizando combinaciones de variantes de la hormona liberadora de las gonadotropinas (gnrh ) como immunógeno - Google Patents

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Eddy Emilio Bover Fuentes
Franklin Fuentes Aguilar
Eulogio Pimentel Vazquez
Roberto Basulto Baker
Gerardo Enrique GUILLÉN NIETO
Yovisleidys Lopez Saez
Hilda Elisa Garay Perez
Lesvia Calzada Aguilera
María CASTRO SANTANA
Niurka Oneysi Arteaga More
Luis Alberto Aguero Barrocal
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Definitions

  • the present invention relates to the field of immunology, endocrinology, oncology and reproduction, and in particular it is based on the simultaneous generation of a potent immune response against the entire GnRH molecule and especially against the amino and carboxyl ends of this hormone.
  • GnRH - Gonodatropin-Releasing Hormone also known as the Luteinizing Hormone-Releasing Hormone (LHRH)
  • LHRH Luteinizing Hormone-Releasing Hormone
  • FSH follicle-stimulating hormone
  • LH Luteinising hormone
  • LHRH The role played by LHRH in the regulation of fertility is well known.
  • diseases are related to gonadotropins and gonadal steroid hormones, particularly estrogens and testosterone.
  • diseases include breast, uterine and other types of gynecological cancer, endometriosis, uterine fibrosis, prostate cancer and benign prostatic hyperplasia, among others.
  • Castration or surgical or chemical gonadectomy is one of the most effective methods in the therapeutic intervention of hormone-dependent neoplasms (Huggins C, Hodges CV. Studies on prostatic cancer. I. The effect of castration, of estrogen and of androgen injection on serum phosphatases in metastatic carcinoma of the prostate. Cancer Researh 1941; 1: 293-7). In livestock production, castration is used to avoid the bad smell and taste of meats from adult male animals of economic interest. Proc. Soc. Exp. Biol. Med 175: 259-281, 1984. Meloen RH et al. Efficient ⁇ mmunocastration of male piglets by immunoneutralization of GnRH using a new GnRH-like peptide.
  • GnRH analogues are among the most used drugs in the treatment of prostate, ovarian and breast cancer, which exert their action through androgenic or estrogenic deprivation and / or the direct effect on cancer cells.
  • the direct mechanism through which these analogues and antagonists of GnRH exert their action has been related to "deinsitization" and the deregulation of GnRH receptors when they are administered chronically.
  • GnRH / LHRH analogs are the active immunization with the native hormone or with its peptide-mimetics, which can serve as vaccines when they are bound to more immunogenic molecules such as tetanus, diphtheria toxoid or their epitopes, Ia KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) or BSA (Bovine serum albumin), among others.
  • Ia KLH Keyhole Limpet Hemocyanin
  • BSA Bovine serum albumin
  • the construction process of the proposed molecules contemplates the chemical union by synthesis, the conjugation or the cloning in the form of fusion protein of the GnRH or its mimetics with carrier molecules.
  • the carrier molecules can be complete proteins, or their fragments or epitopes, say Tetanus Toxoid (TT), Neisseria Meningitides P64K protein, hepatitis B surface antigen, or hepatitis B virus envelope antigen, etc.
  • TT Tetanus Toxoid
  • Neisseria Meningitides P64K protein Neisseria Meningitides P64K protein
  • hepatitis B surface antigen hepatitis B virus envelope antigen
  • the present invention is based on the combination in the same immunization scheme of 2 variants of the natural GnRH / LHRH hormone and / or its mimetics, including retro-inverse variants, synthesized based on D amino acids, where the GnRH variants are they generate, through chemical synthesis, the conjugation or the use of DNA chimeras of the GnRH interchangeably linked by the carboxyl and amino terminal ends to a carrier molecule of the TT type, or its epitopes, in order to achieve a more potent and rapid immune response against endogenous GnRH.
  • the carboxyl and amino terminal variants (referred to the binding site of the GnRH to the carrier molecule) can be administered in unison in the same preparation or separated, sequentially or alternately in the same immunization schedule .
  • the novelty of this invention lies in the synergistic effect that it produces on the immune system, the active immunization with the 2 GnRH variants mentioned above and which we refer to as: terminal carboxyl (variant in which the carrier is attached to the terminal carboxyl of GnRH or its mimetics) and amino terminal (variant in which the carrier is attached to the amino terminal end of the GnRH or its mimetics), once they are administered as part of the same formulation, producing a rapid and potent ablation of sex hormones male and female (androgens and estrogens respectively), which results in a vigorous immunocastratory action and hence its effectiveness in the immunocastration of animals of economic interest and pet animals, in the control of fertility in humans, as well as in the treatment of hormone-sensitive tumors;
  • the combination described not only represents the sum of the action of the two types of variants (carboxyl terminal and amino terminal) but also supposes a synergism in its action on the immune system that translates into a similar effect on target organs , once both variants are administered in the combinations described above.
  • the present invention has the advantage over the similar ones described above, a faster and more potent action on the target organs (testicles, prostate, ovaries ... etc) and / or on sex hormone dependent tumors (prostate, breast, ovaries, endometrium, salivary glands, testicles, etc); thanks to the synergism achieved with the mixture of the carboxyl and amino terminal variants.
  • the GnRH molecule in its natural form or its mimetics can be directly linked in the process of peptide synthesis to a carrier molecule, or chemically conjugated or cloned in the form of a fusion protein to molecules of recognized immunogenic power, to form two different variants; terminal carboxyl and amino terminal.
  • These variants can use as carriers, some of the most frequently reported proteins for this purpose or their epitopes, say Tetanus Toxoid, Dimeric Toxoid, Neisseria meningitides P64K protein, Hepatitis B surface antigen, Hepatite B envelope antigen , etc., so that this mixture causes a rapid and powerful immunological response, whose synergism, leads to the ablation of the GnRH and the hormones involved in the GnRH / LH-FSH / Testosterone / Estrogen cascade.
  • Tetanus Toxoid Dimeric Toxoid
  • Neisseria meningitides P64K protein Hepatitis B surface antigen
  • Hepatite B envelope antigen etc.
  • the variants, carboxyl terminal and amino terminal can be used in the same formulation in different proportions, where the ratio between the carboxyl terminal variant with respect to the amino terminal varies from 10:90 to 80:20 (weight / weight).
  • the GnRH molecule that has the carrier linked by its terminal carboxyl end constitutes in all cases at least 10% of the total amount of the mixture, and in turn the amino terminal variant represents 20% of the mixture at least total
  • the GnRH, carboxyl and terminal amino molecules can be linked to the same carrier, either in one case by the amino and in the other by their terminal carboxyl or, conversely, a variant, say the terminal carboxyl, can be be attached to a carrier molecule and the other, say amino terminal, can be linked to another.
  • the immunogenic mixture can be constituted, for example, by GnRH or its mimetics linked in one case to a carrier such as TT or one of its epitopes and in the other to the p64K protein of the Neisseria meningitides bacteria or the antigen of Ia hepatitis B envelope or its epitopes or other carrier molecule of proven immunogenicity.
  • a carrier such as TT or one of its epitopes and in the other to the p64K protein of the Neisseria meningitides bacteria or the antigen of Ia hepatitis B envelope or its epitopes or other carrier molecule of proven immunogenicity.
  • This type of combination allows the carboxyl and amino terminal variants of GnRH to be mixed with oily adjuvants of the Montanide type, or Water-soluble adjuvants of the alumina type, QS 21 or others, a faster and more potent immune response against GnRH is obtained than that observed using other immunogen variables.
  • the potential of the described formulation can be significantly increased, if immunostimulants such as very small size proteoliposomes (VSSP), obtained from the mixture of the lipoproteins of the wall, are also added to the preparation.
  • immunostimulants such as very small size proteoliposomes (VSSP), obtained from the mixture of the lipoproteins of the wall, are also added to the preparation.
  • VSSP very small size proteoliposomes
  • This invention can be used for the immunization of a wide range of vertebrates and especially its use as an immunogen in mammals for the sterilization of pet animals, such as dogs, cats, etc., or for the control of the fertility of wild species like rodents, squirrels and
  • the proposed combination ensures a higher percentage of homogeneity in immunocastration, as for example. pigs, goats, etc. to avoid the unpleasant smell that occurs in the meat and fat of these animals. It also allows to produce controlled sterilization or the decrease in the aggressiveness of animals of economic importance in the herds, as is the case of bulls, buffalo, horses and other mammals.
  • the use of this invention has direct application in the treatment of prostate and breast cancer, as well as in cancer of the uterus, ovary, testis, submaxillary gland, pituitary pathologies, and other types of hormone sensitive neoplasms. Obtaining an immunogenic preparation of the carboxyl terminal type as one of the components of the combination.
  • the carboxyl-terminal variant can be constituted in one of the cases by the natural GnRH molecule or one of its mimetics, say the GnRHmI molecule of sequence QHWSYPLRPG linked to the epitope T helper of the tetanus toxoid 830-844 , QYIKANSKFIGITEL, to the 0 P48-P64K peptide of the Neisseria meningitides of the IPGVAYTSPEVAWVG sequence, or to the complete P64K molecule or other carriers such as the diphtheria toxoid, the hepatitis B surface antigen, the hepatitis B envelope antigen, antigens of the circumsporozoite, etc.
  • the natural GnRH molecule or one of its mimetics say the GnRHmI molecule of sequence QHWSYPLRPG linked to the epitope T helper of the tetanus toxoid 830-844 , QYI
  • GnRH a natural GnRH molecule or some of its mimetics, such as the case of the GnRHmI described above linked by its amino terminal end to the epitope 830-844 tetanus toxoid to form the molecule (QYIKANSKFIGITELGGQHWSYPLRPG) or the union of This is because of its amino-terminal to the P48 peptide of the P64K protein of the Neisseria Meningitides bacterium (IPGVAYTSPEVAWVGGGGQHWSYPLRP), or another carrier molecule of the type mentioned above, constitutes an active principle with a much greater potential for immunogenicity against the endogenous GnRH hormone, that produced by the carboxyl terminal variant described above.
  • Testimony 1 this is that individuals immunized with the variant TT-GnRHmI seroconvert 'against Ia natural hormone GnRH after only one immunization, reaching titers ranging from 1: 6000 to 1: 12000 after Ia 3rd or 4th immunization and in turn, the immunization with the amino-terminal variant (P48-P64K-GnRHm1) generates a significant antibody response in 90% of the animals after only one immunization and anti GnRH antibody titers between 1: 5000 and 1: 12000 after 4 administrations.
  • Figure 1 Schematic representation of the amino acid sequence of the natural GnRH, the variant GnRHmI -TT, TT-GnRHmI, GnRHmI -P48-P64K and P48-P64K-GnRHmL Figure. 2. Mean of the natural anti-GnRH seroconversion of animals immunized with the different GnRH variants linked to the TT carrier molecule.
  • Figure. 4 Evaluation of the size of the testicles at slaughter (100 days). Statistical evaluation LSD of the Stat-Graphic. 1 - Placebo, 2- GnRHmI-TT, 3- TT- GnRHmI, 4- Combination 2 + 3 (50/50), 5- Combination 2 + 3 (70/30), 6- Alternate scheme Figure. 5. Evaluation of the size of the prostate at sacrifice (100 days). Statistical evaluation LSD of the Stat-Graphic. 1. Placebo, 2. GnRHmI -TT, 3. TT-GnRHmI, Combination 2 + 3 (50/50), 5-Combination 2 + 3 (70/30), 6. Alternate scheme. Figure 6.
  • the groups represented from left to right are: 1 ero - Placebo, 2nd - GnRHmI -TT (CT), 3rd - TT- GnRHmI (AT), 4th - Combination [CT] + [AT] (50/50), 5th - Combination [CT] + [AT] (70/30) and 6th - Alternate scheme (AIt.).
  • Figure 7 Mean of the natural anti GnRH seroconversion of animals immunized with the different GnRH variants linked to the carrier molecule P48-P64K.
  • Figure 8. Evaluation of anti-GnRH antibody titers in healthy Copenhagen rats immunized with different GnRH variants bound to the TP48-P64K carrier molecule.
  • Figure. 10 Evaluation of the size of the prostate at sacrifice (100 days). Statistical evaluation LSD of the Stat-Graphic. 1- Placebo, 2- GnRHm1-P48-P64K, 3- P48-P64K- GnRHmI 1 4- Combination 2 + 3 (50/50), 5- Combination 2 + 3 (70/30), 6- Alternate scheme.
  • Example 1 Immunogenicity of the carboxyl and amino-terminal I O variants of GnRHmI using TT as a carrier molecule.
  • Testosterone level determination Testosterone levels were determined using the TESTO CT2 kit (CisBio, International, France). 5 For this procedure, 25 ⁇ l of serum was taken from each sample and dispensed directly into pre-coated tubes. The samples were incubated in duplicate. Finally the tubes were washed with distilled water and read in a gamma counter. The results were expressed in nmol / L.
  • the GnRH molecule as explained, by sharing 100% homology in all mammals and at a high level in the upper vertebrates, and being very small (only ten amino acids), gives this peptide very little
  • the group immunized with the amino terminal variant with the peptide had a 100% seroconversion after the first immunization, while the group immunized with the carboxyl variant
  • Figure 3 relates the anti GnRH antibody titers of the sera of each of the experimental groups.
  • the 5 TT-GnRHmI group was the one that showed the highest speed in the appearance of anti-GnRH titles, which ranged between 1/6000 and 1/12000, between 75 and 100 days after the experiment began .
  • vahante (50/50) and (70/30) showed similar titers of anti GnRH antibodies.
  • the variant (50/50) was the one that showed the highest speed 0 of the appearance of the titles.
  • Example 2 Immunogenicity of the carboxyl and amino-terminal variants of GnRHmI using the P48-P64K peptide as a carrier molecule. 2.1. Experimental Groups 1 - Placebo
  • the group immunized with the amino terminal variant with the peptide (P48-P64K-GnRHm1) had 100% serocoriversion after the first immunization, while the group immunized with the carboxyl terminal variant represented by the peptide ( GnRHmI -P48-P64K), showed between 70-80% seroconversion, only after the 3rd immunization.
  • the combination (50/50) of the mixed carboxyl and amino terminal variants had 100% seroconversion after the second immunization.
  • the combination of the carboxyl and amino terminal variants in the proportion (70/30), and the alternate immunization scheme developed 100% seroconversion, after the third immunization (Fig. 7).
  • Figure 8 lists the anti-GnRH antibody titers of the sera of each of the experimental groups. In this graph it is observed that the group P48-P64K-GnRHm1 was the one that showed the highest speed in the appearance of the anti GnRH titles, which ranged between 1/5000 and 1/8 000, at the end of the experiment. Of the combined variants, the variant (50/50) and (70/30), showed similar titers of anti GnRH antibodies. However, the variant (50/50) was the one that showed the highest speed of appearance of the titles.
  • the alternative immunization scheme with the variants GnRHm1-P48-P64K and P48-P64K-GnRHm1 showed levels of immunogenicity similar to those awakened when the variant was used (70/30), although it was not possible to maintain the titles at levels as high as the first.
  • the titles appeared later than the rest of the experimental groups, and did not reach levels higher than 1/1000 in the best cases.
  • the carboxyl and amino terminal variants mixed in different proportions in the same immunization scheme achieve an immunological response significantly higher than that obtained with the individual carboxyl 5 terminal peptide, and although lower than the titles obtained with the use of Ia aminoterminal variant, the biological effect is significantly superior to the 2 variants administered individually. Similar results were observed when both peptides were inoculated in the same immunization scheme alternately (Fig. 8, 9 and 10). 0 Example 3. Correlation of the humoral response awakened against different areas of the hormone GnRH and its effect on target organs. The combination of these effects. Once the antibody titres were analyzed, a correlation analysis between them and the effect on the target organs (prostate and testicles) was performed.
  • the Effect of the treatment was considered as the unit minus the ratio of the average of the weight of the organs (prostate and testicles) in the treated animals (PTreatment) and the average of the weight of the organs target in placebos animals (PPIacebo).
  • ETreatment 1 - (PTreatment / PPIacebo) (1)
  • Tables No. 1 a and 1 b for the combination carboxyl + amino terminal (50/50), the experimental effect on the prostate and the testicles, was superior to the theoretical or expected effect, the synergistic effect of this combination being demonstrated in the reduction of the size of these organs using any of the carrier molecules described in Figure 1.
  • Example 4 Therapy experiments using the individual GnRHmI-TT and TT-GnRHmI variants and their combinations (GnRHmI-TT + TT-GnRHmI) in adult Copenhagen rats implanted with the Dunning R3327-H cell line.
  • Tumor fragments (2 x 2 x 2 mm) of the Dunning R3327-H murine tumor model were transplanted subcutaneously (sc). in the distal area of the right posterior limb of adult Copenhagen rats weighing between 150 and 200 g. (CENPALAB, Cuba). This is a highly differentiated, hormone-dependent tumor line, with a replication time, (VDT) of English, (volume doublimng time) of 17 days.
  • VDT replication time
  • the tumors were routinely measured once a week.
  • the tumor volume was calculated using the formula 4/3 ⁇ r 3 where r is the mean of the radius.
  • the animals were kept on a commercial diet and fresh water at libitum.
  • Treatment of animals The treatment of animals was carried out using a therapeutic model, in which fragments of the Dunning R3327-H tumor line were inoculated, as described in section 3.1.1. The therapeutic intervention (immunizations), began when the tumors
  • I O reached a diameter of approximately 10 mm. Immunizations were performed with a biweekly interval.

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Abstract

Composición farmacéutica utilizando combinaciones de la hormona GnRH nativa y/o alguno de sus miméticos, unidos indistintamente por sus extremos amino o carboxilo a una molécula portadora, en un caso por su extremo carboxilo y en el otro por su amino terminal, generando una rápida y potente respuesta inmunológica contra la hormona GnRH endógena que conduce finalmente a la ablación de la GnRH y por tanto del resto de las hormonas involucradas en la cascada GnRH/LH-FSH/Testosterona-(estrógenos) y facilitando la exposición al sistema inmune de un mayor número de epítopes de la GnRH o sus miméticos y minimizando el impedimento estérico que producen los portadores. Esta invención tiene una aplicación directa en la castración de animales de interés económico y animales mascotas, en el control de la fertilidad en humanos, y en el tratamiento de tumores hormonosensibles; de próstata, mama, ovario, endometrio, testículo, hipófisis, glándulas salivales y otros tipos de tumores humanos.

Description

COMPOSICIÓN FARMACÉUTICA UTILIZANDO COMBINACIONES DE VARIANTES DE LA HORMONA LIBERADORA DE LAS GONADOTROPINAS
(GNRH) COMO IMMUNÓGENO.
Campo técnico:
La presente invención se relaciona con el campo de Ia inmunología, Ia endocrinología, Ia oncología y Ia reproducción, y en particular se basa en Ia generación simultánea de una respuesta inmune potente contra toda Ia molécula GnRH y especialmente contra los extremos amino y carboxilo de esta hormona. Para ello se aprovecha Ia mejor exposición al sistema inmune de Ia hormona GnRH en su forma nativa y/o sus miméticos, incluyendo las variantes basadas en D aminoácidos, cuando estas son unidas a una molécula portadora, en un caso por el carboxilo terminal y en el otro por el amino terminal, para formar 2 inmunomoléculas diferentes que denominaremos en Io adelante variante carboxilo terminal y variante amino terminal, respectivamente. Técnica Anterior:
La Hormona Liberadora de Gonodatropinas (GnRH - Gonodatropin-Releasing Hormone), también conocida como Hormona Liberadora de Ia Hormona Luteinizante (LHRH - Luteinizing Hormone Releasing Hormone), es un decapéptido hipotalámico, que actúa sobre Ia hipófisis anterior, causando Ia liberación de FSH (follicle- stimulating hormone) y LH (luteinising hormone) hacia Ia sangre, las cuales a su vez estimulan Ia síntesis de esteroides testiculares y con ello el desarrollo de las gónadas masculinas en los animales jóvenes y en los varones adolescentes. En el sexo femenino esta hormona estimula el desarrollo de los ovarios, los folículos, y Ia síntesis de los esteroides ováricos y Ia ovulación.
Es bien conocido el papel que juega Ia LHRH en Ia regulación de Ia fertilidad. Así, un número importante de enfermedades se encuentran relacionadas con las gonadotropinas y las hormonas esteroides gonadales, particularmente los estrógenos y Ia testosterona. Tales enfermedades incluyen el cáncer de mama, útero y otros tipos de cáncer ginecológicos, endometriosis, fibrosis uterina, cáncer de próstata e hiperplasia prostática benigna, entre otras.
La castración o gonadectomía quirúrgica o química constituye uno de los métodos más efectivos en Ia intervención terapéutica de las neoplasias dependientes de hormonas (Huggins C, Hodges CV. Studies on prostatic cáncer. I. The effect of castration, of estrogen and of androgen injection on serum phosphatases in metastatic carcinoma of the prostate. Cáncer Researh 1941 ; 1 :293-7). En Ia producción pecuaria, Ia castración se utiliza para evitar el mal olor y sabor de las carnes provenientes de animales adultos machos de interés económico. Proc. Soc. Exp. Biol. Med 175:259-281 , 1984. Meloen RH et al. Efficient ¡mmunocastration of male piglets by immunoneutralization of GnRH using a new GnRH-like peptide. Vaccine 1994;12:741-747. Crowley WF, Vale WW, Rivier J, MacArthur JW: LHRH in hypogonadotropic hypogonadism. In ZatuchniGI, Shelton JD, Sciarra JJ (eds): "LHRH Peptides as Female and Male Contraceptives". Philadelphia: Harper & Row Publishers, 1981 , pp 321-333).
Los análogos de GnRH se encuentran dentro de las drogas más usadas en el tratamiento del cáncer de próstata, ovario y mama, los cuales ejercen su acción a través de Ia deprivación androgénica o estrogénica y/o el efecto directo sobre las células cancerosas. (Schally, Comaru-Schally AM, Redding TW: Anti-tumour effects of analogues of hypothalamic hormones in endocrine-dependent cancers). El mecanismo directo a través del cual estos análogos y antagonistas de GnRH ejercen su acción se ha relacionado con Ia "desinsitización" y Ia desregulación de los receptores de GnRH cuando éstos son administrados de forma crónica. Muchos de estos análogos y antagonistas potentes han sido reportados por difererentes autores (Waxman JH, Wass JAH, Hendry WF, Whitfield HN, Besser GM, Malpas JS, Oliver RTD: Treatment with gonadotropin releasmg hormone analogue in advanced prostate cáncer. Br. Med. J. 286:1309-1312, 1983. Alien JM, O'Shea JP, Mashiter K, Williams G, Bloom SR: Advanced carcinoma of the prostate: Treatment with a gonadotropin releasing hormone agonist. Br. Med. J. 286:1607-1609, 1983). (Couillard S. Labrie C. Belanger A. Candas B. Pouliot F. Labrie F. "Effect of dehydroepiandrosterone and the antiandrogen EM-800 on growth of human ZR-75-1 breast cáncer xenografts". J. Nat. Cáncer Inst., May 20, 772-778, 1998; KoIIe S. et al.: "Expression of growth hormone receptor in human prostatic carcinoma and hyperplasia". Int. J. Oncol., vol. 14, No. 5, p 91 1 -916, 1999). Una variante alternativa en el uso de análogos de GnRH/LHRH es Ia inmunización activa con Ia hormona nativa o con sus péptido-miméticos, los cuales pueden servir como vacunas cuando éstos son unidos a moléculas más inmunogénicas tales como el toxoide tetánico, diftérico o sus epítopes, Ia KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) o BSA (Albúmina sérica de bovinos), entre otros. (Gual C, Garza- Flores J, Menjivar M, Gutierrez-Najar A, Pal R, Talwar GP. Ability of an anti- luteinizing hormone-releasing hormone vaccine to inhibit gonadotropins in postmenopausal women. Fértil Steril 1997;67:404-7). En Ia literatura existen diferentes reportes de vacunación usando Ia GnRH/LHRH como antígeno propio, ej. en US 5,897,863, o US 6,132,720. Sin embargo, uno de los problemas que ha estado presente desde los inicios de esta práctica, es su insuficiente capacidad en Ia producción de una potente respuesta inmune que induzca niveles efectivos de anticuerpos anti-GnRH, debido fundamentalmente a su pequeña talla y Ia naturaleza autóloga en todos los mamíferos de este decapéptido. Es por ello que desde los primeros intentos siempre se han aprovechado Ia experiencia existente con moléculas similares y el uso de portadores que aumentan Ia "visibilidad" de estos péptidos ante el sistema inmune.
Experimentos realizados con candidatos vacunales basados en Ia hormona GnRH o sus miméticos unidos a moléculas portadoras del tipo del TT, han sido ensayadas en cerdos, roedores y primates, donde han demostrado atrofia en testículos, y próstata en machos y de ovarios en hembras. (Talwar GP, Raina K, Gupta J. C, Ray R, Wadhwa S, AIi MM. A recombinant luteinising-hormone-releasing hormone immunogen bioeffective in causing prostatic atrophy. Vaccine 2004; 22:3713-372. Millar RP, King JA, Davidson JS, Milton RC. Gonadotrophin-releasing hormone- diversity of functions and clinical applications. S Afr Med J 1987;72:748-755). Otra de las desventajas que con frecuencia se mencionan con el empleo de inmunógenos a base de GnRH/LHRH como vacunas contra Ia fertilidad en animales de interés económico y mascotas, es Ia gran variabilidad en los resultados que se observa entre los individuos de un grupo inmunizado, aún cuando se utilizan grandes dosis. A esto se añade Ia problemática del uso de adyuvantes muy reactogénicos como el adyuvante completo de Freund. (Hoskinson et al, Austr. J. Biotech; 4, 166-170 (1990); Bonneau et al., J. Anim. Sci. 72, 14-20 (1994); U.S. Pat. No. 4,608,251 ; Int. patent appl. WO 88205109; Caraty et al., C. R. Acad. Sc. Paris, t. 303, Serie III, No. 16, 673-676 (1986); Falvo et al.; J. Anim. Sci. 63, 986-994 (1986).
De forma similar en Ia patente WO 98/2711 1 "Preparado vacunal para Ia inmunocastración reversible de mamíferos" de R. Bringas y cois., se obtuvieron resultados positivos en Ia inmunocastración de cerdos prepubers utilizando Ia hormona GnRH mutada, unida en el proceso de síntesis al TT y emulsionada en ACF, sin embargo, Ia utilización extensiva de este preparado vacunal, no mostró una homogeneidad semejante a Ia observada en los animales pubers.
Los primeros ensayos clínicos en pacientes con cáncer de próstata avanzado y en mujeres postmenopáusicas para investigar Ia inhibición de las gonadotropinas se realizaron por primera vez en Ia década de los años 90 del siglo pasado, los cuales fueron publicados por Talwar GP y cois. (Talwar GP. Vaccines for control of fertility and hormone-dependent cancers. Immunology and CeII Biology 1997;75:184-189. Gual C, Garza-Flores J, Menjivar M, Gutierrez-Najar A, Pal R, Talwar GP. Ability of an anti-luteinizing hormone-releasing hormone vaccine to inhibit gonadotropins in postmenopausal women. Fértil Steril 1997;67:404-7). Además de Io mencionado anteriormente, los candidatos que han usado Ia LHRH conjugada químicamente al TT (toxoide tetánico) y al DT (toxoide diftérico) como portadores, producen frecuentemente inmunosupresión anti-hapténica. (Schutze M-P, Leclerc C, Jolivet M, Audibert F, Chedid L. Carrier-induced epitopic suppression, a major issue for future synthetic vaccines. J immunoi 1985;135:2319-22. Gaur A1 Arunan K, Singh OM1 Talwar GP. By pass by an altérnate carrier of acquired unresponsiveness to hCG upon repeated immunization with tetanus conjugated vaccine. Int Immunology 1990;2(2):151 -5. Sad S, Gupta HM1 Talwar GP, Raghupathy R. Carrier induced suppression of the antibody response to self hapten. Immunlogy 1991 ;74:223-7), además de las pérdidas propias reportadas en el proceso de conjugación. (Gual C, Garza-Flores J, Menjivar M, Gutierrez-Najar A, Pal R, Talwar GP. Ability of an anti- luteinizing hormone-releasing hormone vaccine to inhibit gonadotropins in postmenopausal women. Fértil Steril 1997;67:404-7). Recientemente, un grupo de investigadores en Estados Unidos ha utilizado múltiples epítopes T cooperadores proveniente de antígenos de microorganismos que producen frecuentemente enfermedades infecciosas en los infantes y los han unido a Ia GnRH por su extremo amino terminal en el propio proceso de síntesis química en aras de encontrar una respuesta mucho más potente y universal (Finstad CL, Wang CY, Kowalsky J1 Zhang M1 Li M1 Li X1 Xia W1 Bosland M1 Murthy k.k, Walfield A, Koff W. C, Zamb TJ. Synthetic luteinizing hormone releasing hormone (LHRH) vaccine for effective androgen deprivation and its application to prostate cáncer immunotherapy. Vaccine 2004;22:1300-1313). No obstante Ia buena respuesta inmunológica encontrada gracias al uso de 4 epítopes T cooperadores en un mismo inmunógeno, fue necesario el uso de inmunizaciones repetidas utilizando para ello adyuvantes oleosos. La formulación reportada constituye además un proceso de difícil reproducción, de alto costo y difícil de llevar a cabo en Ia práctica en un proceso industrial a gran escala. En este particular, se explota solo Ia potenciación de Ia respuesta inmunológica a costa de Ia diversidad de las moléculas portadoras y no Ia potencialidad que tendría una mezcla donde se expongan el amino y el carboxilo libres de Ia GnRH ó sus miméticos.
Finalmente, es importante señalar que a pesar de que en Ia literatura se alude a Ia capacidad ¡nmunogénica de los diferentes inmunoconjugados de GnRH o sus miméticos y de los resultados variables obtenidos por diferentes autores, utilizando inmunomoléculas de GnRH conjugadas por sus extremos amino y carboxilo terminal, incluyendo Ia utilización de aminoácidos adicionales para facilitar Ia conjugación; el uso de disímiles moléculas portadoras unidas a uno de sus extremos, Ia construcción por vía convencional de síntesis de péptidos o de recombinación del ADN de moléculas complejas en forma de "tándem" y MABS, no se ha reportado sin embargo, el efecto sinérgico que tiene sobre Ia respuesta inmune, los niveles de hormonas sexuales y del efecto sobre los órganos dianas (próstata, testículos, mama, ovarios), cuando se utiliza una formulación de 2 variantes de GnRH acopladas a Ia molécula portadora, una a través del amino y otra por el carboxilo terminal cuando son utilizadas en una misma preparación farmacéutica.
El proceso de construcción de las moléculas propuestas contempla Ia unión química por síntesis, Ia conjugación o el clonaje en forma de proteína de fusión de Ia GnRH o sus miméticos con moléculas portadoras. Las moléculas portadoras pueden ser proteínas completas, o sus fragmentos o epítopes, dígase Toxoide Tetánico (TT), proteína P64K de Neisseria Meningitides, antígeno de superficie de Ia hepatitis B, o antígeno de Ia envoltura del virus de Ia hepatitis, etc. La preparación farmacéutica reportada aquí, administrada en una misma formulación, genera una respuesta inmunológica sinérgica dirigida contra los extremos amino y carboxilo libres de Ia GnRH. Como resultado, se obtiene una rápida y significativa ablación de las hormonas sexuales masculinas y femeninas, según el caso (andrógenos y estrógenos respectivamente), Io cual se traduce en una vigorosa inmunocastración. Esta formulación tendría una aplicación directa en Ia inmunocastración de animales de interés económico y animales macotas, en el control de Ia fertilidad en humanos, así como en el tratamiento de tumores hormonosensibles; de próstata, mama, ovario, endometrio, testículos, hipófisis, glándulas salivales y otros tipos de tumores, Io cual se expresa como reducción del volumen de los órganos dianas, de Ia masa tumoral y en el aumento de Ia sobrevida de los individuos.
Divulgación de Ia Invención.
La presente invención se basa en Ia combinación en un mismo esquema de inmunización de 2 variantes de Ia hormona GnRH/LHRH natural y/o sus miméticos, incluyendo las variantes retro-inversas, sintetizadas a base de D aminoácidos, donde las variantes de GnRH se generan a través de Ia síntesis química, Ia conjugación o el uso de quimeras de ADN de Ia GnRH unidas indistintamente por los extremos carboxilo y amino terminales a una molécula portadora del tipo del TT, o sus epítopes, con el objetivo de lograr una más potente y rápida respuesta inmunológica contra Ia GnRH endógena. En el caso que nos ocupa, las variantes carboxilo y amino terminales (referidas al sitio de unión de Ia GnRH a Ia molécula portadora) pueden ser administradas al unísono en una misma preparación o separadas, de forma secuencial o alterna en un mismo esquema de inmunización. La novedad de esta invención radica en el efecto sinérgico que produce sobre el sistema inmune, Ia inmunización activa con las 2 variantes de GnRH mencionadas anteriormente y que referimos como: carboxilo terminal (variante en Ia cual el portador es unido al carboxilo terminal de Ia GnRH o sus miméticos ) y amino terminal (variante en Ia cual el portador es unido al extremo amino terminal de Ia GnRH o sus miméticos), una vez que son administradas como parte de una misma formulación, produciendo una rápida y potente ablación de las hormonas sexuales masculinas y femeninas (andrógenos y estrógenos respectivamente), Io cual se traduce en una vigorosa acción inmunocastradora y de ahí su efectividad en Ia inmunocastración de animales de interés económico y animales mascotas, en el control de Ia fertilidad en humanos, así como en el tratamiento de tumores hormonosensibles; próstata, mama, ovario, endometrio, testículos, hipófisis, glándulas salivales y otros tipos de tumores, Io cual se expresa como reducción del volumen de los órganos diana, de Ia masa tumoral y en el aumento de Ia sobrevida de los individuos. La combinación descrita, no solo representa Ia sumatoria de Ia acción de los dos tipos de variantes (carboxilo terminal y amino terminal) sino que supone además, un sinergismo en su acción sobre el sistema inmunológico que se traduce en un efecto similar sobre los órganos dianas, una vez que ambas variantes son administradas en las combinaciones descritas anteriormente.
La presente invención tiene como ventaja sobre las similares descritas anteriormente, una acción más rápida y potente sobre los órganos dianas (testículos, próstata, ovarios..etc) y/o sobre los tumores dependientes de las hormonas sexuales (próstata, mama, ovarios, endometrio, glándulas salivales, testículos, etc); gracias al sinergismo logrado con Ia mezcla de las variantes carboxilo y amino terminal.
La combinación de las variantes propuestas, exhiben una estrecha relación entre los títulos de anticuerpos anti-GnRH generados, Ia reducción de los niveles de las hormonas sexuales (andrógenos y estrógenos) hasta niveles de castración, y de éstos a su vez, con el efecto producido sobre los órganos dianas. Estos resultados, además de los claros efectos que presupone con el uso de adyuvantes oleosos del tipo del Montanide, permite como ventaja adicional, el uso de adyuvantes mucho menos potentes, como las sales de aluminio y otros adyuvantes no considerados "potentes", pero más inocuos, en el proceso de preparación de vacunas. Estos aspectos ofrecen una ventaja considerable a Ia mezcla de las variantes amino y carboxilo terminales de GnRH sobre cualquiera de los inmunógenos basados en Ia hormona GnRH reportados hasta el momento.
Descripción Detallada de Ia Invención. En estudios realizados en ratas adultas sanas, Ia generación de respuesta inmune usando las variantes peptídicas de Ia GnRH carboxilo y amino-terminal en una misma formulación o preparado vacunal, ha permitido obtener resultados superiores a los comparados con los esquemas de inmunización donde se usa sólo una variante (carboxilo o amino-terminal), de forma independiente. Los resultados descritos demuestran un sinergismo, tanto en Ia inmunocastración como en el tratamiento de enfermedades proliferativas benignas (ej. endometriosis), o malignas (cáncer de próstata, mama, endometrio, ovario, testículos, glándulas submaxilares) y otras sensibles a Ia depleción hormonal. En Ia presente invención, a diferencia de las técnicas practicadas anteriormente, Ia molécula de GnRH en su forma natural o sus miméticos, especialmente Ia variante denominada GnRHmI , puede ser unida directamente en el proceso de síntesis peptídica a una molécula portadora, o conjugada químicamente o clonada en forma de proteína de fusión a moléculas de reconocido poder inmunogénico, para formar dos variantes diferentes; carboxilo terminal y amino terminal. Estas variantes pueden utilizar como portadores, algunas de las proteínas más frecuentemente reportadas con este fin o sus epítopes, dígase Toxoide Tetánico, Toxoide Diftérico, proteína P64K de Neisseria meningitides, Antígeno de superficie de Ia hepatitis B, antígeno de Ia envoltura de Ia hepatitos B, etc., de modo que esta mezcla provoque una rápida y potente respuesta inmunológica, cuyo sinergismo, conduce a Ia ablación de Ia GnRH y de las hormonas involucradas en Ia cascada GnRH/LH- FSH/Testosterona/Estrógenos. Las variantes, carboxilo terminal y amino terminal pueden ser usadas en una misma formulación en diferentes proporciones, donde Ia relación entre Ia variante carboxilo terminal respecto a Ia amino terminal varía desde 10:90 hasta 80:20 (peso/peso). De esta forma, Ia molécula GnRH que tiene unido el portador por su extremo carboxilo terminal, constituye en todos los casos al menos el 10% de Ia cantidad total de Ia mezcla, y a su vez Ia variante amino terminal representa el 20% de Ia mezcla total como mínimo.
Los mejores resultados en Ia combinación de las variantes carboxilo y amino- terminal, se obtienen cuando estas son mezcladas en una proporción del 50% (peso/peso) de cada una de las variantes. De forma similar, las moléculas de GnRH, carboxilo y amino terminal, pueden estar unidas a un mismo portador indistintamente en un caso por el amino y en el otro por su carboxilo terminal o por Io contrario, una variante, dígase Ia carboxilo terminal, puede estar unida a una molécula portadora y Ia otra, dígase amino terminal, puede estar unida a otra. Así, Ia mezcla inmunogénica puede estar constituida por ejemplo, por Ia GnRH o sus miméticos unidos en un caso a un portador como el TT o uno de sus epítopes y en el otro a Ia proteína p64K de Ia bacteria Neisseria meningitides o el antígeno de Ia envoltura de Ia hepatitis B o sus epítopes u otra molécula portadora de comprobada inmunogenicidad.
Este tipo de combinación permite que al ser mezcladas las variantes carboxilo y amino terminal de GnRH con adyuvantes oleosos del tipo del Montanide, o adyuvantes hidrosolubles del tipo de Ia alúmina, QS 21 u otros, se obtenga una respuesta inmunológica más rápida y potente contra Ia GnRH que Ia observada utilizando otras variables de inmunógeno.
La potencialidad de Ia formulación descrita puede ser aumentada de forma 5 ostensible, si se adicionan además al preparado, inmunoestimulantes como los proteoliposomas de muy pequeño tamaño (VSSP, del inglés Very Small size Proteoliposoms), obtenidos de Ia mezcla de las lipoproteínas de Ia pared de Ia Neisseria meningitides con el gangliósido N-Acetil o N glicolil GM3, o de forma similar cuando esta es mezclada con adyuvantes hidrosolubles como cocleatos y
I O arginatos.
Esta invención, puede ser usada para Ia inmunización de un amplio rango de vertebrados y especialmente es de particular interés su uso como inmunógeno en mamíferos para Ia esterilización de animales mascotas, tales como perros, gatos, etc, o para el control de Ia fertilidad de especies salvajes como roedores, ardillas y
15 otros. La combinación propuesta asegura un mayor porciento de homogeneidad en Ia inmunocastración, como por ej. cerdos, chivos, etc. para evitar el desagradable olor que se produce en las carnes y grasa de estos animales. También permite producir esterilización controlada o Ia disminución de Ia agresividad de animales de importancia económica en los rebaños, como es el caso de toros, búfalos, equinos y 0 otros mamíferos. En Ia medicina humana, el uso de esta invención tiene aplicación directa en el tratamiento del cáncer de próstata y de mama, así como en el cáncer de útero, ovario, de testículo, de glándula submaxilar, en patologías hipofisarias, y en otros tipos de neoplasias hormonosensibles. Obtención de una preparación inmunogénica del tipo carboxilo terminal como 5 uno de los componentes de Ia combinación.
Uno de los componentes de Ia vacuna, Ia variante carboxilo-terminal puede estar constituida en uno de los casos por Ia molécula GnRH natural o uno de sus miméticos, dígase Ia molécula GnRHmI de secuencia QHWSYPLRPG unida al epítope T cooperador del toxoide tetánico 830-844, QYIKANSKFIGITEL, al péptido 0 P48-P64K de Ia Neisseria meningitides de secuencia IPGVAYTSPEVAWVG, o a Ia molécula completa P64K u otros portadores como el toxoide diftérico, el antígeno de superficie de Ia hepatitis B, el antígeno de Ia envoltura de Ia hepatitis B, antígenos del circunsporozoito, etc o su uso como proteína de fusión obtenida a través de un sistema de expresión por construcciones genéticas. La síntesis química de los péptidos QHWSYPLRPGGGQYIKANSKFIGITEL y QHWSYPLRPGGGIPGVAYTSPEVAWVG y su emulsificación con un adyuvante oleoso del tipo del Montanide, ha demostrado tener un potente efecto de ablación sobre Ia testosterona, en solo 2 inmunizaciones en animales prepubers y de 3 a 4 inmunizaciones cuando este es administrado a animales adultos. Los títulos de anticuerpos específicos contra Ia hormona GnRH natural usando ambas variantes como inmunógeno, suelen ser de alrededor de 1/1000-1/2000 para Ia mayoría de los individuos después de Ia 4ta inmunización. El porciento de seroconversión suele estar en alrededor del 90%. Amino terminal, el segundo componente de Ia combinación.
De forma similar, Ia construcción de una molécula de GnRH natural o alguno de sus miméticos, como el caso de Ia GnRHmI descrita anteriormente unida por su extremo amino terminal al epítope 830-844 toxoide tetánico para formar Ia molécula (QYIKANSKFIGITELGGQHWSYPLRPG) O Ia unión de esta por su amino-terminal al péptido P48 de Ia proteína P64K de Ia bacteria Neisseria Meningitides (IPGVAYTSPEVAWVGGGGQHWSYPLRP), U otra molécula portadora del tipo de las mencionadas anteriormente, constituye un principio activo con un potencial mucho mayor de inmunogenicidad contra Ia hormona GnRH endógena, que el producido por Ia variante carboxilo terminal descrita anteriormente. Testimonio de1 ello, es que los individuos inmunizados con Ia variante TT-GnRHmI seroconvierten ' contra Ia hormona GnRH natural después de solo una inmunización, alcanzando títulos que oscilan entre 1 :6000 y 1 :12 000 después de Ia 3ra o 4ta inmunización y a su vez, Ia inmunización con Ia variante amino-terminal (P48-P64K-GnRHm1 ) genera una respuesta de anticuerpos significativa en el 90% de los animales después de solo una inmunización y títulos de anticuerpos anti GnRH entre 1 :5000 y 1 :12000 después de 4 administraciones. Estos títulos pueden considerarse como muy significativos, si se tiene en cuenta el pequeño tamaño de Ia molécula GnRH y además, que Ia misma constituye una molécula autóloga e idéntica en todos los mamíferos. Esta variante Amino terminal, no suele producir sin embargo, un efecto significativamente superior a Ia vahante carboxilo-terminal, cuando se analiza su efecto sobre los órganos diana (próstata y testículos en machos u ovarios en hembras).
Descripción de las Figuras Figura 1. Representación esquemática de Ia secuencia aminoacídica de Ia GnRH natural, Ia variante GnRHmI -TT, TT-GnRHmI , GnRHmI -P48-P64K y P48-P64K- GnRHmL Figura. 2. Media de Ia seroconversión anti GnRH natural de los animales inmunizados con las diferentes variantes de GnRH unidas a Ia molécula portadora TT.
Figura 3. Evaluación de los títulos de anticuerpos anti-GnRH en ratas Copenhagen sanas inmunizadas con diferentes variantes de GnRH unidas a Ia molécula portadora TT .
Figura. 4. Evaluación del tamaño de los Testículos al sacrificio (100días). Evaluación estadística LSD del Stat -Graphic. 1 - Placebo, 2- GnRHmI-TT, 3- TT- GnRHmI , 4- Combinación 2+3 (50/50), 5- Combinación 2+3(70/30), 6- Esquema alterno Figura. 5. Evaluación del tamaño de Ia próstata al sacrificio (100días). Evaluación estadística LSD del Stat -Graphic. 1. Placebo, 2. GnRHmI -TT, 3. TT-GnRHmI , Combinación 2+3 (50/50), 5-Combinación 2+3(70/30), 6. Esquema alterno. Figura 6. Aspecto macroscópico de los testículos y Ia próstata de todos los animales que fueron evaluados en el ensayo (n =10). Los grupos representados de izquierda a derecha son: 1 ero - Placebo, 2do - GnRHmI -TT (C-T), 3ro - TT- GnRHmI (A-T), 4to - Combinación [C-T] + [A-T] (50/50), 5to - Combinación [C-T] + [A-T] (70/30) y 6to - Esquema alterno (AIt.).
Figura 7. Media de Ia seroconversión anti GnRH natural de los animales inmunizados con las diferentes variantes de GnRH unidas a Ia molécula portadora P48-P64K. Figura 8. Evaluación de los títulos de anticuerpos anti-GnRH en ratas Copenhagen sanas inmunizadas con diferentes variantes de GnRH unidas a Ia molécula portadora TP48-P64K.
Figura. 9. Evaluación del tamaño de los Testículos al sacrificio (100días). Evaluación estadística LSD del Stat -Graphic. 1 - Placebo, 2- GnRHm1-P48-P64K, 3- P48-P64K-GnRHm1 , A- Combinación 2+3 (50/50), 5- Combinación 2+3(70/30), 6- Esquema alterno
Figura. 10. Evaluación del tamaño de Ia próstata al sacrificio (100días). Evaluación estadística LSD del Stat -Graphic. 1- Placebo, 2- GnRHm1-P48-P64K, 3- P48-P64K- GnRHmI 1 4- Combinación 2+3 (50/50), 5- Combinación 2+3(70/30), 6- Esquema alterno. Figura 11. Evaluación del crecimiento tumoral de Ia línea Dunning R3327-H implantada en ratas Copenhagen previo a Ia inmunización de los animales.
EJEMPLOS DE REALIZACIÓN:
5 Experimentos de inmunogenicidad y efecto sobre órganos diana con el péptido GnRHmI en las variantes carboxilo y amino terminal con diferentes moléculas portadoras.
Ejemplo 1. Inmunogenicidad de las variantes carboxilo y amino-terminal I O de GnRHmI utilizando el TT como molécula portadora.
La secuencia de los péptidos GnRH y TT sintetizados y usados en los ensayos biológicos, carboxilo y amino terminal, se encuentran descritos en Ia Fig.i a y 1 b.
1.1. Grupos Experimentales
1 - Placebo
15 2-Carboxilo terminal (GnRHmI -TT) 750 μg de péptido total. 3- Amino terminal (TT-GnRHmI ) 750 μg de péptido total
4-Combinación 50/50 (peso/peso) en una misma emulsión del carboxilo terminal - (GnRHmI -TT) + el amino terminal (TT-GnRHmI ). Se usaron 375 μg de cada uno a sumar 750 μg totales 0 5- Combinación 70/30 (peso/peso) en una misma emulsión de las variantes carboxilo (GnRHmI -TT) y amino terminal (TT-GnRHmI ). Se utilizaron: (525 μg del GnRHmI-TT y 225 μg del TT-GnRHmI ) para un total de 750 μg. 6- Inmunización alterna con 2 y 3, es decir se inmunizó con 750 μg de Ia variante carboxilo terminal (GnRHmI -TT) a los tiempos 0, 30 y 60 días y luego con 750 μg 5 de amino terminal (TT-GnRHmI ) en los tiempos 15 y 45 días.
En total se realizaron 5 inmunizaciones subcutáneas para cada variante, usando el adyuvante Montanide
1.2. Desarrollo experimental
1.2.1. Preparación de los inmunógenos, inmunización de los animales y 0 chequeo de los resultados:
1.2.2. Adyuvación: El péptido carboxilo terminal GnRHmI -TT y/o el péptido amino terminal TT-GnRHmI fueron pesados de acuerdo a Ia dosis propuesta y resuspendidos individualmente en agua para inyección. Posteriormente se realizó una mezcla 50% (v/v) de los péptidos resuspendidos con igual volumen de adyuvante oleoso. La mezcla fue finalmente agitada en un mezclador mecánico durante 20 minutos hasta que se formó una emulsión de color blanco lechosa, lista para ser administrada.
5 1.2.3. Inmunización: La emulsión fue cargada en jeringuillas desechables de 1 mL e inyectada por vía subcutánea en Ia región dorsal de ratas Copenhagen de 9-12 semanas de edad, usando un esquema quincenal.
1.2.4.Titulación de anticuerpos Anti-GnRH: Los anticuerpos circulantes anti GnRH obtenidos por Ia vacunación fueron determinados usando un sistema ELISA,
I O del inglés (Enzyme-linked-immunoassay). Para ello, fueron recubiertas placas de poliestireno de 96 pozos con el péptido nativo GnRH a una concentración de 5 μg/ml en 100 mM Na2CÜ3 (pH 9.6) e incubado toda Ia noche a 4 °C. Después de varios lavados con PBS 1 x (pH 7.4), las placas fueron saturadas durante una hora con 2 % BSA in PBS. El suero de los animales se diluyó (rango: 1/60 hasta 1/2000) en PBS •
15 conteniendo 1 % BSA, Tween 20 (0.01 %, peso/vol) e incubadas por 3h a 37 0C. Las placas fueron lavadas varias veces con PBS y puestas a reaccionar con anticuerpos , anti -IgG de rata conjugado con peroxidasa de rábano picante (Sigma Biochemical, USA). Después de otra operación de lavado, las placas se hicieron reaccionar con • una mezcla que contenía Ortophenilen-diamine (OPD) y el sustrato peróxido de ; 0 hidrógeno en buffer citrato. Los títulos de anticuerpos fueron calculados como Ia máxima dilución a Ia cual Ia absorbancia de las muestras fueron 2 veces superiores al valor de corte del ensayo.
1.2.5. Determinación de niveles de Testosterona: Los niveles de Testosterona fueron determinados utilizando el kit TESTO CT2 (CisBio, International, France). 5 Para este proceder, se tomaron 25 μl de suero de cada muestra y se dispensaron directamente en tubos pre-recubiertos. Las muestras fueron incubadas por duplicado. Finalmente los tubos fueron lavados con agua destilada y leídos en un contador gamma. Los resultados fueron expresados en nmol/L.
1.2.6. Sacrificio de los animales y análisis estadístico: Los animales fueron 0 anestesiados y luego sacrificados, de acuerdo a las normas de buenas prácticas de laboratorio, un mes posterior a Ia quinta inmunización (100 días). Para Ia evaluación de las diferencias estadísticas del tamaño de los testículos y Ia próstata se utilizó el Test de Duncan del Stat -Graphic. De forma similar los niveles de Testosterona fueron analizados utilizando este mismo paquete estadístico (SAS Institute Inc ,
SAS/STAT™ User's Guidθ, Reléase 6.03 Edition. Cary, NC: SAS Institute Inc., 1988. 1028 pp). 5 1.3. Resultados experimentales
1.3.1. Análisis de Ia Seroconversiόn:
La molécula GnRH, como se ha explicado, al compartir el 100% de homología en todos los mamíferos y en un elevado nivel en los vertebrados superiores, y ser de muy pequeño tamaño (solo diez aminoácidos), confiere a este péptido muy poco
I O poder inmunogénico y en contraste una alta capacidad tolerogénica, debido a su naturaleza endógena.
En el ejemplo que describimos, el grupo inmunizado con Ia variante amino terminal con el péptido (TT-GnRHmI ), tuvo un 100% de seroconversiόn después de Ia primera inmunización, mientras que el grupo inmunizado con Ia variante carboxilo
15 terminal representado por el péptido (GnRHmI-TT), mostró entre un 80-90% de seroconversión, solo después de Ia 3ra inmunización. La combinación (50/50) de las variantes carboxilo y amino terminal mezcladas, tuvieron un 100% de seroconversión después de Ia segunda inmunización y finalmente, Ia combinación de las variantes carboxilo y amino terminal en Ia proporción (70/30), y el esquema 0 de inmunización alterno, desarrollaron un 100% de seroconversión, después de Ia tercera inmunización (Fig.2).
1.3.2. Evaluación de los títulos de anticuerpos anti-GnRH:
La figura 3 relaciona los títulos de anticuerpos anti GnRH de los sueros de cada uno de los grupos experimentales. En este gráfico se observa que el 5 grupo TT-GnRHmI fue el que mostró mayor velocidad en Ia aparición de los títulos anti GnRH, los cuales oscilaron entre 1/6000 y 1/12 000, entre los 75 y 100 días de comenzado el experimento. De las variantes combinadas, Ia vahante (50/50) y (70/30), mostraron similares títulos de anticuerpos anti GnRH. Sin embargo, Ia variante (50/50), fue Ia que mostró mayor velocidad 0 de aparición de los títulos. El esquema de inmunización alterno con las variantes GnRHmI -TT y TT-GnRHmI , aunque mostró similar velocidad en Ia aparición en los títulos que Ia variante (70/30), no logró mantener sin embargo, títulos a niveles tan altos como Ia primera. En el grupo inmunizado con Ia variante GnRHmI-TT, los títulos aparecieron más tarde que el resto de los grupos experimentales (después de Ia tercera inmunización) y no alcanzaron niveles superiores a 1/1 OQO en los mejores casos.
1.3.3. Correlación de Ia respuesta humoral despertada contra diferentes zonas 5 de Ia hormona GnRH y su efecto sobre órganos diana.
Se realizó un análisis de correlación entre los títulos de anticuerpo y el efecto sobre los órganos diana (próstata y testículos). Como puede observarse en Ia fig 3, mientras Ia inmunización con Ia variante amino terminal TT-GnRHmI mostró una alta inmunogenicidad, Ia variante carboxilo terminal (GnRHmI -TT), mostró una
I O seroconversión mucho más lenta y títulos de anticuerpos significativamente inferiores contra Ia GnRH. Estos' diferentes resultados en Ia seroconversión, no resultaron sin embargo ' en diferencias evidentes sobre los órganos diana al momento del sacrificio. Así, títulos tan altos como 1 :12000 del grupo inmunizado con Ia variante- amino terminal (TT-GnRHmI ), produjo efectos similares sobre los
15 órganos diana (próstata y testículos) que el grupo inmunizado con Ia variante carboxilo terminal (GnRHmI-TT) (Fig. 4 y 5).
Sin embargo, las variantes carboxilo y amino terminal mezcladas en diferentes proporciones en un mismo esquema de inmunización, logran por una parte una respuesta inmunológica significativamente superior a Ia obtenida con el péptido 0 carboxilo terminal individual, y aunque inferior a los títulos obtenidos con el uso de Ia variante aminotermínal, el efecto biológico resulta significativamente superior a las 2 variantes administradas de forma individual. Resultados similares se observaron cuando ambos péptidos fueron inoculados en un mismo esquema de inmunización de forma alterna. (Fig 4, 5, 6). 5
Ejemplo 2. Inmunogenicidad de las variantes carboxilo y amino-terminal de GnRHmI utilizando el péptido P48-P64K como molécula portadora. 2.1. Grupos Experimentales 1 - Placebo
30 2-Carboxilo terminal (GnRHmI -P48-P64K) 750 ug de péptido total. 3- Amino terminal (P48-P64K-GnRHm1 ) 750ug de péptido total 4-Comb¡nación 50/50 (w/w) en una misma emulsión del carboxilo terminal (GnRHmI -P48-P64K) + el amino terminal (P48-P64K-GnRHm1 ). Se usaron 375ug de cada uno a sumar 750 ug totales
5- Combinación 70/30 (p/p) en una misma emulsión de las variantes carboxilo (GnRHm1-P48-P64K) y amino terminal (P48-P.64K-GnRHm1 ). Se utilizaron: • (525ug del GnRHmI -P48-P64K y 225ug del P48-P64K-GnRHm1 ) para un total de
750 ug.
6- Inmunización alterna con 2 y 3, es decir se inmunizó con 750ug de Ia variante carboxilo terminal (GnRHmI -P48-P64K) a los tiempos 0, 30 y 60 días y luego con 750ug de amino terminal (P48-P64K-GnRHm1 ) en los tiempos 15 y 45 días.
Se realizaron 5 inmunizaciones subcutáneas totales para cada variante usando el adyuvante Montanide .
2.2. Desarrollo experimental
La preparación de los inmunógenos, inmunización de los animales, chequeo de los resultados, y procesamiento estadístico, se realizó de forma similar a Io descrito desde 1.2.1 hasta 1.3.3.
2.3. Resultados experimentales
2.3.1. Análisis de Ia Seroconversión:
En este experimento, el grupo inmunizado con Ia variante amino terminal con el péptido (P48-P64K-GnRHm1 ), tuvo un 100% de serocoriversión después de Ia primera inmunización, mientras que el grupo inmunizado con Ia variante carboxilo terminal representado por el péptido (GnRHmI -P48-P64K), mostró entre un 70- 80% de seroconversión, solo después de Ia 3ra inmunización. Sin embargo, Ia combinación (50/50) de las variantes carboxilo y amino terminal mezcladas, tuvieron un 100% de seroconversión después de Ia segunda inmunización. La combinación de las variantes carboxilo y amino terminal en Ia proporción (70/30), y el esquema de inmunización alterno, desarrollaron un 100% de seroconversión, después de Ia tercera inmunización (Fig. 7).
2.3.2. Evaluación de los títulos de anticuerpos anti-GnRH: La figura 8 relaciona los títulos de anticuerpos anti GnRH de los sueros de cada uno de los grupos experimentales. En este gráfico se observa que el grupo P48-P64K-GnRHm1 fue el que mostró mayor velocidad en Ia aparición de los títulos anti GnRH, los cuales oscilaron entre 1 /5000 y 1/8 000, al final del experimento. De las variantes combinadas, Ia variante (50/50) y (70/30), mostraron similares títulos de anticuerpos anti GnRH. Sin embargo, Ia variante (50/50), fue Ia que mostró mayor velocidad de aparición de los títulos. Por su parte, el esquema de inmunización alterno con las variantes GnRHm1-P48-P64K y P48-P64K-GnRHm1 , mostraron niveles de 5 inmunogenicidad similares a los despertados cuando se utilizó Ia variante (70/30), aunque no se logró mantener los títulos a niveles tan altos como Ia primera. En el grupo inmunizado con Ia variante GnRHm1-P48-P64K, los títulos aparecieron más tarde que el resto de los grupos experimentales, y no alcanzaron niveles superiores a 1/1000 en los mejores casos.
I O 2.3.3. Correlación de Ia respuesta humoral despertada contra diferentes zonas de Ia hormona GnRH y su efecto sobre órganos diana.
Como puede observarse en las fig. 7 y 8, mientras Ia inmunización con Ia vanante amino terminal P48-P64K-GnRHm1 mostró una alta inmunogenicidad, Ia variante carboxilo terminal (GnRHmI -P48-P64K), mostró una seroconversión mucho más
15 lenta y títulos de anticuerpos significativamente inferiores contra Ia GnRH. Estas diferencias en Ia seroconversión, no resultaron sin embargo, en diferencias evidentes sobre los órganos diana al momento del sacrificio. Así, títulos tan altos como 1 :8000 del grupo inmunizado con Ia variante amino terminal (P48-P64K- GnRHmI ), produjo efectos similares sobre los órganos diana (testículos y próstata) 0 que el grupo inmunizado con Ia variante carboxilo terminal (GnRHmI -P48-P64K) (Fig. 9 y 10).
Por su parte, las variantes carboxilo y amino terminal mezcladas en diferentes proporciones en un mismo esquema de inmunización, logran una respuesta inmunológica significativamente superior a Ia obtenida con el péptido carboxilo 5 terminal individual, y aunque inferior a los títulos obtenidos con el uso de Ia variante aminoterminal, el efecto biológico resulta significativamente superior a las 2 variantes administradas de forma individual. Resultados similares se observaron cuando ambos péptidos fueron inoculados en un mismo esquema de inmunización de forma alterna (Fig. 8, 9 y 10). 0 Ejemplo 3. Correlación de Ia respuesta humoral despertada contra diferentes zonas de Ia hormona GnRH y su efecto sobre órganos diana. La combinación de estos efectos. Una vez analizados los títulos de anticuerpos, se realizó un análisis de correlación entre estos y el efecto sobre los órganos diana (próstata y testículos). Como puede observarse en las figuras 3 y 8, en los grupos experimentales 2 y 3, correspondiente a las variantes carboxilo terminal y amino terminal, se observó un comportamiento 5 totalmente diferente respecto a su capacidad inmunogénica, es decir, mientras el amino terminal, representado por los péptidos TT-GnRHmI y P48-P64K-GnRHm1 , mostraron una alta velocidad de producción de anticuerpos contra Ia GnRH en los modelos utilizados y elevados títulos contra esta hormona, Ia variante carboxilo terminal (GnRHmI-TT y GnRHm1-P48-P64K), mostraron una seroconversión
I O mucho más lenta y títulos de anticuerpos significativamente inferiores contra Ia GnRH. Estos diferentes resultados en Ia seroconversión y en Ia titulación de los sueros, arrojaron sin embargo similares resultados en su acción sobre los órganos diana cuando los animales fueron evaluados al sacrificio. Así, se pudo observar que títulos de anticuerpos tan altos como 1 :12000 en los grupos inmunizados con las
15 variantes amino terminal, produjeron efectos similares sobre los órganos diana (testículos y próstata ) que los grupos inmunizados con las variantes carboxilo terminal (Fig. 4, 5 y 9,10). Sin embargo, si las variantes carboxilo y amino terminal se mezclan en diferentes proporciones en un mismo esquema de inmunización, se logra por una parte, una respuesta inmunológica significativamente superior a Ja 0 obtenida con el péptido carboxilo terminal individual, Ia cual aunque no llega a alcanzar valores de titulación tan elevados como con el uso de Ia variante aminoterminal, produce sin embargo, un efecto biológico significativamente superior a las 2 variantes administradas de forma individual. Resultados similares se observaron cuando ambos péptidos fueron inoculados en un mismo esquema de 5 inmunización de forma alterna (Fig 4, 5, 9 y 10).
Los resultados descritos aquí, hablan a favor de que Ia presencia del grupo carboxilo libre en Ia GnRH estimula de forma muy potente Ia respuesta inmunológica contra esta hormona, cuando esta es unida a una molécula portadora por su extremo amino-terminal y probablemente a otra zona alejada del carboxilo. Lo 0 contrario sucede con Ia variante carboxilo terminal, Ia cual al unirse con Ia molécula portadora por su extremo carboxilo, parece estar comprometiendo Ia exposición al sistema inmunológico de esta zona y solo exponiendo su extremo amino, el cual no presenta Ia alta capacidad inmunoestimulante que el primero, pero que sin embargo, es capaz de generar una respuesta que aunque es 10 veces menor, es simílarmente neutralizante de Ia hormona, cuando esta es administrada en iguales dosis que Ia variante aminoterminal.
Estos hallazgos permiten afirmar que para Ia GnRH, similar a Io que ocurre con otras proteínas y péptidos, se cumple que las zonas más inmunogénicas, no son necesariamente las más inmuno-neutralizantes.
Estos resultados permiten concluir que el uso simultáneo en un mismo esquema de inmunización de una mezcla de 2 variantes de GnRH o sus miméticos unidos a una molécula portadora en un caso por su amino y en el otro por su carboxilo terminal, producen un sinergismo en Ia respuesta inmunológica de anticuerpos contra Ia GnRH del individuo, Io cual resulta superior a Ia simple sumatoria de los efectos esperados en cada caso.
Los resultados de Ia inmunización con Ia mezcla de los péptidos y su uso como inmunógenos se hizo más marcado en las vahantes de combinación (50/50) y (70/30), en ese orden donde se observa un franco efecto sinérgico en Ia reducción del tamaño de los testículos y Ia próstata. También aunque en menor proporción, se observa un efecto combinado con el uso del esquema de inmunización secuencial o alterno, los cuales se vieron materializados fundamentalmente en el potente efecto atrofiante sobre los testículos y Ia próstata. En Ia realización de los cálculos, el Efecto del tratamiento (ETratamiento) se consideró como Ia unidad menos Ia relación de Ia media del peso de los órganos (próstata y testículos) en los animales tratados (PTratamiento) y Ia media del peso de los órganos diana en los animales placebos (PPIacebo). ETratamiento = 1 - (PTratamiento/ PPIacebo) (1 ) Como se puede apreciar en las Tablas No. 1 a y 1 b, para Ia combinación carboxilo + amino terminal (50/50), el efecto experimental sobre Ia próstata y los testículos, resultó superior al efecto teórico o esperado, quedando demostrado el efecto sinérgico de esta combinación en Ia reducción del tamaño de estos órganos utilizando cualquiera de las moléculas portadoras descritas en Ia figura 1. Para el caso de Ia combinación de las 2 variantes peptídicas en Ia relación (70/30), se obtuvieron resultados muy similares a los observados con Ia combinación carboxilo + amino terminal (50/50). En el esquema alterno, aunque como se ha mostrado resultaron ser significativamente superiores a las variantes individuales de inmunización, referidos a su efecto biológico sobre los órganos blanco descritos (próstata y testículos), solo se observó el resultado de Ia sumatoria de dichos efectos.
El resultado global del efecto sinérgico que tuvo Ia inmunización combinada comparada con las variantes individuales de cada uno de los péptidos cuando estos fueron utilizados por separado en Ia inmunización de animales adultos sanos, se presentan en Ia Tabla 1 a y b.
Tabla 1. Resumen de los valores teóricos y experimentales utilizando las variantes carboxilo y amino-terminal de Ia GnRHmI con 2 moléculas transportadoras diferentes. A) Efecto obtenido con las moléculas GnRHmI-TT y TT-GnRHmL B)
Efecto generado con Ia utilización de Ia variante GnRHmI -P48-P64K y P48-P64K-
GnRHmL
Λ)
Figure imgf000022_0001
B)
Figure imgf000023_0001
Ejemplo 4. Experimentos de terapia usando las variantes GnRHmI-TT y TT- GnRHmI individuales y sus combinaciones (GnRHmI-TT +TT-GnRHmI ) en ratas adultas Copenhagen implantadas con Ia linea celular Dunning R3327-H.
4.1. Animales, modelo tumoral: Fragmentos de tumor de (2 x 2 x 2 mm) del modelo tumoral murino Dunning R3327-H, fueron transplantados subcutáneamente (s.c). en Ia zona distal de Ia extremidad posterior derecha de ratas Copenhagen adultas con un peso de entre 150 y 200 g. (CENPALAB, Cuba). Esta es una línea tumoral altamente diferenciada, hormono-dependiente, con un tiempo de replicación, (VDT) del inglés, (volume doublimng time) de 17 días. Para Ia determinación de Ia tasa de crecimiento tumoral, los tumores fueron medidos rutinariamente una vez por semana. El volumen tumoral fue calculado usando Ia fórmula 4/3 π r3 donde r, es Ia media del radio. Los animales fueron mantenidos con dieta comercial y agua fresca at libitum.
4.2. Diseño experimental:
El experimento contó con los siguientes grupos:
1. Animales placebos (inmunizados con PBS en Montanide ISA 51 ).
2. Animales castrados quirúrgicamente.
3. Animales inmunizados con el péptido GnRHmI -I 4. Animales inmunizados con una mezcla (50/50) de los péptidos GnRHmI -TT + TT-GnRHmL
5. Animales inmunizados con el péptido GnRHmI -P48-P64K
6. Animales inmunizados con una mezcla (50/50) de los péptidos GnRHmI -P48- 5 P64K + P48-P64K-GnRHm1.
4.3. Tratamiento de los animales: El tratamiento de los animales se realizó utilizando un modelo terapéutico, en el cual se inocularon fragmentos de Ia línea tumoral Dunning R3327-H, tal y como se describe en el acápite 3.1.1. La intervención terapéutica (inmunizaciones), se comenzaron cuando los tumores
I O alcanzaron un diámetro de aproximadamente 10 mm. Las inmunizaciones se realizaron con un intervalo quincenal.
Las dosis utilizadas en el experimento para los grupos del 3 al 6, fueron las mismas que las descritas en el acápite 1.1.
4.4. Resultados experimentales:
15 Evaluación de Ia velocidad de crecimiento tumoral de las ratas Copenhagen implantadas con Ia línea tumoral Dunning R3327-H.
Como puede apreciarse en Ia figura 11 , mientras en el grupo placebo se observó un crecimiento abrupto del tumor, en los grupos castrados e inmunizados con se observa una marcada inhibición del crecimiento tumoral. No obstante Ia mayor 0 inhibición del crecimiento tumoral se observó en los animales castrados y en los grupos de animales inmunizados con las variantes combinadas GnRHmI -TT+TT- GnRHmI (50/50) y GnRHmI -P48-P64K + P48-P64K-GnRHm1 (50/50). La inhibición para estas 3 variantes experimentales fue muy similar y resultó significativa en comparación con el placebo y los restantes tratamientos 5

Claims

REIVINDICACIONES
1- Composición farmacéutica caracterizada porque contiene una mezcla de 2 variantes de GnRH natural y/o modificada, donde una de las variantes contiene Ia
5 molécula portadora unida por su extremo carboxilo-terminal y Ia otra vanante unida al mismo portador u otro diferente por su extremo-amino terminal.
2- Composición farmacéutica de acuerdo a Ia reivindicación 1 caracterizada porque Ia molécula de GnRH puede estar en forma natural o variantes modificadas de esta, y Ia molécula portadora de Ia GnRH puede ser el toxoide tetánico entre otras.
I O 3- Composición de acuerdo a Ia reivindicación 2 caracterizada porque Ia molécula portadora además del toxoide tetánico y/o sus epítopes, puede estar constituido por Ia proteína p64K de Ia Neisseria meningitides, el antígeno de Ia envoltura de Ia hepatitis B, KLH, Ovoalbúmina, BSA u otras proteínas y péptidos derivados de gérmenes que producen infecciones en el hombre y los animales.
15 4- Composición de acuerdo con las reivindicaciones 2 y 3 donde las moléculas portadoras son básicamente el péptido 830-844 del toxoide tetánico y el péptido P48-P64K de Ia proteína P64K de Neisseria Meningitides u otros fragmentos de Ia proteína p64K de Ia Neisseria meningitides, el antígeno de Ia envoltura de Ia hepatitis B, KLH, Ovoalbúmina, BSA u otras proteínas y péptidos derivados de 0 gérmenes que producen infecciones en el hombre y los animales.
5- Composición farmacéutica de acuerdo con Ia reivindicación 1 caracterizada porque Ia mezcla de las variantes carboxilo y amino-terminales de Ia GnRH o sus miméticos, son obtenidas a través de Ia unión química por síntesis, Ia conjugación o el clonaje. 5 6- Composición farmacéutica según Ia reivindicación 1 caracterizada porque Ia GnRH o sus miméticos están sintetizados químicamente a partir de D aminoácidos, y Ia unión al portador puede realizarse por conjugación química o unirse en el mismo proceso de síntesis a Ia molécula portadora.
7- Composición farmacéutica según Ia reivindicación 1 , donde Ia mejor combinación 0 incluye aquellas donde Ia variante carboxilo terminal representa entre un 50 y un
70% de Ia mezcla peptídica y Ia variante amino-terminal constituye entre el 30 y el 50% de Ia mezcla total.
8- Composición farmacéutica según las reivindicaciones de Ia 1 a Ia 7 para el control de Ia conducta y el manejo de animales de importancia económica como los bovinos, búfalos, caballos, u otros, el control de Ia fertilidad en humanos, como herramienta terapéutica para el control de enfermedades benignas y malignas, especialmente de cáncer dependientes de hormonas como cáncer de próstata, mama, ovario, endometrio, cáncer de testículo y cáncer de Ia glándula submaxilar, 5 cáncer hepático.
9- Una composición farmacéutica que contenga una mezcla de anticuerpos monoclonales, policlonales y/o, anticuerpos quiméricos, humanizados, y fragmentos de anticuerpos dirigidos contra Ia GnRH, obtenidos según se describe en las reivindicaciones del 1 al 8.
I O 10- Uso de Ia mezcla de las variantes de GnRH de acuerdo con las reivindicaciones 1 , 2, 3, 4 y 5, 6, 7, 8 y 9 como inmunógenos en mamíferos para Ia esterilización de animales domésticos tales como perros, gatos, u otros, para el control de Ia fertilidad de especies de roedores, para Ia inmunocastración de animales como bovinos, cerdos, caprinos en los animales enteros, aprovechándose Ia inmunocastración en
15 el sentido de evitar el desagradable olor que producen en las carnes y grasas de animales adultos machos, las concentraciones fisiológicas de androstenona y Skatole en los animales enteros.
11 - Uso de Ia mezcla de las variantes de GnRH de acuerdo con las reivindicaciones 1 , 2, 3, 4 y 5, 6, 7, 8, 9 y 10 como una herramienta terapéutica para el control de 0 enfermedades benignas y malignas, especialmente algunos tipos de cáncer dependientes de hormonas como son el cáncer de próstata, mama, ovario, endometrio, cáncer de testículo y cáncer de Ia glándula submaxilar, entre otros.
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