WO2010034908A1 - Dispositif de preconconcentration selective/detection d'analytes chargees contenues dans un electrolyte et procede associe - Google Patents

Dispositif de preconconcentration selective/detection d'analytes chargees contenues dans un electrolyte et procede associe Download PDF

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WO2010034908A1
WO2010034908A1 PCT/FR2009/001135 FR2009001135W WO2010034908A1 WO 2010034908 A1 WO2010034908 A1 WO 2010034908A1 FR 2009001135 W FR2009001135 W FR 2009001135W WO 2010034908 A1 WO2010034908 A1 WO 2010034908A1
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PCT/FR2009/001135
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Inventor
Adrien Plecis
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Etat Français représenté par le Délégué Général pour L'Armement
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/24—Extraction; Separation; Purification by electrochemical means

Definitions

  • the invention relates to the field of the research or the analysis of materials by the use of electrical means and more particularly to the object on the one hand a device for selective preconcentration of analytes contained in an electrolyte and, on the other hand, on the other hand, a selective preconcentration process of the analytes contained in an electrolyte.
  • the first method is capillary electrophoresis. It is generally implemented by a microfluidic network in which an electrolyte and a sample containing analytes are injected. This.
  • the network may comprise a number of reservoirs connected to at least one long microchannel and / or a microchannel network having intersections arranged particularly, and this to allow the injection of a certain amount of analytes into the central microchannel.
  • the application of an electric field in the same channel called separation after the injection phase is responsible for the migration of the analytes.
  • the charged particles move in a liquid medium with a speed defined by both the field, the mass and the charge of the particles (electrophoresis).
  • the velocity of the particles in the liquid is proportional to the electric field, the proportionality constant being called electrophoretic mobility.
  • electrophoretic mobility At the solid / liquid wall, a double ion layer formed of a fixed ion layer (surface charge) and a mobile ion layer (diffuse layer in the liquid) is formed spontaneously.
  • the ions of the mobile layer migrate, causing a global movement of the liquid by viscosity (electro-osmosis). It moves in a single block and its speed is also proportional to the electric field.
  • the proportionality constant between the fluid velocity and the electric field is called electroosmotic mobility.
  • the concomitant action of the electrophoretic migration (ion velocity in the liquid) and the electro-osmotic liquid flow (velocity of the liquid) generated by the potential difference acts on the ions contained in the fluid, ensuring their transport through the separation channel.
  • the total rate of an ion in a microchannel subjected to an electric field is therefore proportional to the electric field.
  • the constant of proportionality is the total mobility of the ion which is the sum of its electrophoretic mobility (specific to each ion) and the electro-osmotic mobility (identical for all the ions and which depends on the characteristics of the solid-liquid interface).
  • the detection of the different analytes can be done successively in time at the end of the long microchannel and allows to know the number of analytes present in the solution to be analyzed and their respective concentration.
  • This method is known for its very good resolution to separate two analytes, but has the disadvantage of diluting the analytes which makes the detection difficult or impossible in the case of analytes of very low concentration.
  • a second method known under the term of electrical focusing by gradient against the current is known. It also implements a microfluidic network comprising at least two reservoirs interconnected by channels and by at least one channel or a separation chamber which makes it possible to concentrate the analytes inside a separation channel when a field Electrical and a suitable pressure gradient are applied.
  • FIGS. 1a and 1b respectively show, on the one hand, the value of the electric field as a function of the abscissa inside a separation channel and along its longitudinal axis, and on the other hand the value of the particle velocity loaded according to the abscissa inside the same separation channel and along its longitudinal axis.
  • This velocity is the sum of their electrophoretic velocity and the velocity of the liquid.
  • the speed of each analyte varies within the network and can become zero at one point in the network.
  • each analyte contained in the network migrates to the point where its speed is zero, the place of its preconcentration.
  • This device comprises, as shown in FIG. 2, two microchannels 1, 2 in the form of a U at the ends of each of which there is a reservoir, respectively 4, 5, 6 and 7.
  • the respective bases 8, 9 of these two microchannels are arranged parallel and a nanochannel 10 connects the bases of the first and second microchannels 1, 2 at their middle portion 11, 12.
  • Platinum electrodes 13, 14, 15, 16 are arranged in each of the reservoirs 4, 5, 6 and 7 and connected to at least one voltage generator, not shown capable of generating a potential difference between them.
  • a potential difference is generated between the input and the output of the nanochannel.
  • the displacement of the analytes is performed electrically by electrophoresis and electro-osmosis.
  • This patent application further provides the use of mechanical means capable of generating a pressure difference between said tanks 4, 5, 6 and 7, these means may for example be constituted by one or more micro pumps and ensure the displacement of the solution in the device. It also provides for the alternating use of the electrical means for moving the solution and the mechanical means for moving the solution.
  • the first step associated with the method described in this patent is to perform a strong non-selective preconcentration of the sample through a space charge region used as a barrier.
  • a small electric field parallel to the nanochannel 10 is generated via the first generator, by applying a voltage of 1V in the reservoirs 4 and 5 and a zero voltage in the reservoirs 6 and 7, no preconcentration of compound occurs.
  • this electric field is increased by increasing the voltage in the reservoirs 4 and 5, the displacement of the ions contained in the solution occurs in a limited way and an ion-poor zone 17 is formed in the microchannel 1 at the nanochannel 10 and in which there are as many negative ions as positive ions.
  • Han shows that it is possible to separate capillary electrophoresis from preconcentrated analytes exhibiting different electrophoretic mobilities.
  • a device has many disadvantages. This device does not allow a selective concentration of the analytes at the intersection between the microchannel and the nanochannel (global capture) and therefore requires the use of another technique and another associated device, in this case electrophoresis capillary to separate them. This is explained by the use of a nanochannel that creates a space charge zone that is too strong. It is also noted that this device exhibits secondary electro-osmosis phenomena (ref HAN physical review letters) which disturb the charge space zone responsible for the preconcentration of the species contained in the solution.
  • the object of the invention is to solve these drawbacks by proposing a method and a device for implementing this method for coupling the preconcentration and separation steps through a succession of selective preconcentrations of the different ionic species contained in an electrolyte.
  • the solution provided is a device for selective preconconcentration / detection of charged analytes contained in an electrolyte comprising at least two tanks separated by at least one microchannel without intersection of longitudinal axis X and preferably rectilinear, and comprising at least one controllable voltage source.
  • the device comprises means for generating a controllable pressure associated with at least one of the reservoirs and able to generate a pressure gradient between the two ends of said microchannel and in that the latter comprises in its median part, at least a first part having a constant surface area load followed by a second part comprising means capable of generating at least one variation of the surface area load with respect to that of the first part, the device being able to selectively concentrate the analytes loaded in the microchannel, upstream and / or downstream of these means by volume surface charge, is meant the ratio of the average linear surface load along the perimeter of a section perpendicular to the axis of this microchannel to the area of this section. It is therefore equal to the product of the surface charge perimeter of the microchannel divided by the microchannel section.
  • a device comprises at least one of the following additional features:
  • the means capable of generating at least one variation of the surface-volume load are capable of generating it, along said longitudinal axis, in the form of a step.
  • the means capable of generating at least one variation in the surface area load are capable of generating, for a 1 mM pH 7 PBS buffer electrolyte used as the reference electrolyte, a change in surface area charge of greater than or equal to 10,000 C / m 3 .
  • the means capable of generating at least one variation of the surface area load are capable of generating it: over a length, along the X axis, less than 10 ⁇ m.
  • the microchannel comprises at least one face and in this the means able to generate at least one variation of the surface-space charge consist either of: at least one physical or chemical coating, only a part of the face of the middle part the microchannel being covered by a coating different from that of the remainder of the part (for example deposition of materials such as Si3N4, a photoresist, an oxide, charged poly-electrolyte multilayers, etc.).
  • a device may comprise at least one of the following features: it comprises at least two microchannels arranged in parallel and each having, in its middle part, means capable of generating at least one variation of the volume surface charge and at least one of the ends of one of the channels and connected by a microchannel to one end of the other microchannel, at least two channels have means capable of generating at least one variation of the volume surface charge different in intensity and / or location, it comprises an intersecting network of channels each having between each crossing means capable of generating at least one variation of the surface area charge, preferably different in intensity and / or localization between channels, it comprises means for detecting analytes able to measure their local concentration on the whole of the microchannel or resonant.
  • microchannel water over time it comprises means for collecting and processing data from said detection means, and for determining the number and concentration of analytes contained in the electrolyte,
  • the invention relies on the generation of moderate ionic gradients (no load space area) stable (no interference phenomena associated with the secondary electro-osmosis) and internally generated (no need to permeable membranes, running or temperature gradient as in field gradient electric focusing) within a rectilinear microchannel. To do this, said microchannel thus has one or more sudden variations in the volume surface charge within it.
  • the invention also relates to a method of selective preconcentration / detection of at least one type of analyte, for example molecules, complexes of molecules or particles (artificial or biological - viruses, bacteria, spores, etc.) or cells contained in an electrolyte and implemented by a device comprising at least two tanks connected by at least said microchannel without intersection and a controllable voltage source capable of generating a potential difference between the ends of said microchannel and means for generating a controllable pressure associated with at least one of the reservoirs and capable of generating a pressure gradient between the two ends of said microchannel, characterized in that it comprises the following steps: filling at least partly a first reservoir with an electrolyte comprising the analytes to preconcentrate selectively, filling at least a second reservoir, arranged with respect to the first reservoir on the other side of at least one rectilinear microchannel having means capable of generating at least one variation of the surface area charge, with a buffer solution containing or not the objects of the analysis,
  • a method according to the invention comprises an additional step of applying, via the means for generating a controllable pressure, at least one second pressure gradient capable of generating the preconcentration of said type. analyte in the middle part of the microchannel, upstream or downstream means capable of generating at least one variation of the surface area load.
  • FIG. 3-A shows a microfluidic network 99 used within a device according to a first general embodiment of a device according to the invention, whereas FIG. 3B shows the value of the surface charge of such a device. network,
  • FIG. 4A shows the fluidic network of FIG. 3A to which means for generating a controllable voltage have been added whereas FIG. 4B shows the profile of the ionic concentration of the electronics within the fluidic network when an electric field E is applied ,
  • FIG. 5A shows the fluidic network of FIG. 3A to which has been added means for generating a pressure gradient capable of generating an overpressure at a first reservoir while FIG. 5B shows the profile of the ionic concentration of the electronics within the fluidic network when an electric field E and an overpressure within the first reservoir are applied,
  • FIG. 6A differs from FIG. 5A only in that the overpressure is applied in a second reservoir situated on the other side of the microchannel whereas FIG. 5B shows the profile of the ionic concentration of the electrolyte within the network.
  • FIG. 7A differs from FIG. 5A only in that an preconcentration zone of an analyte has been defined while FIG. 7B shows the velocity of a charged particle having a given electrophoretic mobility for different values of applied overpressure. at the level of the first reservoir,
  • FIG. 8 shows the preconcentration rate of three analytes (having different electrophoretic speeds) as a function of the pressure applied at said first reservoir
  • FIGS. 9A and 9B show a diagram of a device according to a second embodiment of the invention in which the variation of the surface area load is carried out using a layer of aluminum oxide (Al 2 O 3 ).
  • FIGS. 10a and 10b show a general diagram of a device according to a third embodiment of the invention, in which the variation of the surface area load is carried out using a variation of section.
  • FIG. 11 shows a diagram of a device according to a fourth embodiment of the invention, in which the electrical and external control means external to the microfluidic chip are in particular detailed.
  • FIGS. 12a, 12b and 12c show exemplary embodiments according to the embodiment described in FIG. 11 and an example of selective preconcentration monitoring by fluorescence means.
  • FIG. 13 shows a device diagram according to a fifth embodiment in which the choice of the electric potential, of the pressure and of the composition of the electrolyte on either side of the selective preconcentration microchannel is carried out at using so-called “virtual" or internal tanks connected to a certain number of external tanks in which the parameters mentioned above are individually controlled.
  • FIGS. 15A and 15B show two examples of selective preconcentration respectively one-dimensional and multidimensional as a function of the electrophoretic mobility of the molecules.
  • FIG. 16A shows a device according to a sixth embodiment of the invention while FIG. 16B shows, for two different overpressures applied at the reservoir of this device, the speed of a charged analyte having a certain electrophoretic mobility
  • FIG. 17A shows a device according to a seventh embodiment of the invention comprising a microchannel having five successive means capable of generating a variation of surface area charges and FIG. 17B shows a numerical example of preconcentration of an analyte as a function of the time along this microchannel,
  • FIG. 19A again shows the device of FIG. 5A while FIG. 19B shows a numerical example of preconcentration of the same two analytes as in the context of FIG. 18, and this, as a function of time, along the presented microchannel. in Figure 5A.
  • FIG. 20 represents the ion gradient obtained during the selective preconcentration experiment of FIG.
  • Figure 21 shows a device according to an eighth embodiment of the invention.
  • FIG. 3-A shows a microfluidic network 99 used within a device according to a first embodiment of a device according to the invention.
  • This network 99 comprising a microchannel 100 having a first portion 110 having a constant volume surface charge and ending in the middle portion of the microchannel and followed by means 101 capable of generating a change in surface area load.
  • the ends 102, 103 of this microchannel 100 are each connected to a tank, respectively 104, 105.
  • FIG. 3B shows the value of the surface area load along such a network.
  • the means 101 generate a step-shaped variation 98 of the surface area load.
  • an electric potential difference is generated between the tanks 104, 105 by means of generating a controllable voltage 106, this potential difference generates an electric field directed along the longitudinal axis X of the microchannel.
  • the abrupt change in surface area charge at the level of the means 101 causes, as shown in FIG. 4B, an ion concentration gradient in a part of the microchannel upstream and downstream of said means 101.
  • the ion concentration gradient present at the level of means 101 for generating the charge variation is modified to take the profile of a step, that is negative 108 as shown in FIG. 5B, or positive 109 as shown in FIG. 6B according to the overall direction of the fluid and therefore on the side where applies an overpressure.
  • a device according to the invention makes it possible to generate a local gradient of ion concentration very different from the ionic gradients generally obtained in electrical focusing and shown in FIG. 1. The amplitude of this ionic concentration variation depends on several parameters.
  • FIG. 7A which shows the fluidic microfluidic network 99 used in a device according to the first embodiment of a device according to the invention
  • FIG. 7B which presents the speed of a charged particle in the microchannel 100 according to the value of the overpressure generated at the reservoir 104
  • this speed undergoes a local variation at the means 101 capable of generating a variation of the surface area load. It can be seen that, depending on the value of the pressure gradient applied, the speed of the liquid varies, which has the consequence of translating the velocity curve of the particle.
  • the particle passes through a zone of zero velocity where it preconcentrates (zone 97 located upstream of said means 101).
  • zone 97 located upstream of said means 101.
  • the ion gradient and thus the electric field variation take the form of a steep, low-height step, which has the consequence of allowing the preconcentration only of a very fine range of electro-osmotic mobility, and this, at a point well determined.
  • the overpressure is varied continuously, it will be possible successively preconcentrate molecules having different electrophoretic mobilities with a precision defined by the height of the ionic barrier as shown in Figure 8 which reports the preconcentration rate in the zone 97 of FIG. 7A.
  • the different analytes in this case the molecules A, B and C preconcentrate successively in the first part of the microchannel, upstream of the means 101 for generating a change in surface area charge, and between a first and a second pressure P1 and P2 for the molecule A, between a third P3 and a fourth pressure P4 for the molecule B and between a fifth P5 and a sixth P6 overpressure for the C molecule, with P1 ⁇ P2 ⁇ P3 ⁇ P4 ⁇ P5 ⁇ P6.
  • the electric field always remains uniform according to the height of the section of the microchannel. This feature avoids the formation of hydrodynamic vortices and / or secondary electro-osmosis phenomena.
  • FIG. 9A shows a particular diagram of a device according to a second embodiment of the invention which is a particular case of the device presented in FIG. 3A.
  • This device 20 comprises a first and a second reservoir 21, 22 interconnected by a central microchannel rectilinear 23 with a length of 1 cm and a rectangular section of 100 microns wide and 2 microns in height.
  • This microchannel 23 has, at its middle portion, 29 and on its inner upper face 19 a coating 24 of Al2O3 over a length of 100 microns.
  • Each reservoir 21, 22 is associated with a controllable voltage source, 25, 26 and means 27, 28 for generating a controllable pressure.
  • the reservoir 21 is intended to contain a sample to be analyzed comprising molecules dissolved in an electrolyte, for example KCl.
  • an electrolyte for example KCl.
  • only one of the reservoirs could comprise a single source of controllable voltage and only one means for generating a controllable pressure could be associated with one and / or the other of the reservoirs 21, 22.
  • Two D263 lens substrates one for the lower part, the other for the upper part of the microchannel, are used.
  • the upper substrate 200 is pierced at two points defining the ends of the microchannel by microsablage through a steel mask 201 (step 1).
  • a thin layer 202 of Al 2 O 3 with a thickness of 100 nm is then deposited by a deposition technique known as radio-frequency magnetron sputtering over the entire lower surface of the substrate 200 (step 2).
  • a resin mask 203 is then created by a photolithography technique using, for example, an AZ-5214 resin (Dow Corning).
  • This mask 203 is used to protect the AL 2 ⁇ 3 layer during a plasma dry etching step which makes it possible to remove TAL 2 O 3 except in the middle part of the substrate 200 where it is desired to obtain the variation of surface charge (step 3).
  • a thin layer 206 of PDMS step 4
  • a layer 207 of resin eg SU8 - step 5
  • Regions where there is no SU8 resin will be the microchannel.
  • a plasma etching process is then used to etch the SU8 and PDMS layers (step 6).
  • the resin 207 is completely etched while a thin layer (2 ⁇ m) of PDMS 206 remains on the substrate 205, except in the region defining the microchannel.
  • FIGS. 10a and 10b schematize a device according to a third embodiment of the invention, Figure 10b being a section of the device of Figure 10a along the longitudinal axis X (shown dashed).
  • This device 30 comprises a rectilinear central microchannel 31 of axis X having a constriction 32 in its median part 33 and each of the ends 34 is connected to the median part 35 of a mixing / injection channel 36 of larger section than that of the microchannel 31.
  • Each of the ends 37 of this mixing channel 36 is connected to a reservoir 38.
  • the microchannel 31 has a length of 1500 ⁇ m, a width of 100 ⁇ m and a height of 2.5 ⁇ m, except at the level of the narrowing or its height is only 0.5 ⁇ m.
  • the length of the narrowing is 50 ⁇ m.
  • the mixing / injection channel has a length of 6 mm and a section of 200 ⁇ m wide and 2.5 ⁇ m high.
  • Each of the reservoirs 38 is associated with a controllable voltage source 39 and means for generating a controllable pressure 27.
  • an anodic bonding technique has been used. This technique has been previously described, in particular by Datta et al in its article entitled “Nanofluidic channels by anodic bonding of amorphous silicon to glass to study ion accumulation and depletion effect" Talanta 2006 68 (3) pp 659-665 and consists in engraving microfluidic sections in a Pyrex substrate using a solution of hydrofluoric acid and HCl. The nanofluidic section is made by using an amorphous silicon intermediate layer deposited by PECVD (Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition) techniques.
  • PECVD Pullasma Enhanced Chemical Vapor Deposition
  • This layer is etched by plasma etching (SF6) between the 2 microchannels and serves as a spacer layer between the lower and upper Pyrex substrate.
  • SF6 plasma etching
  • a potential typically 600 VJ is applied through the structures, a permanent bonding (anodic bonding) seals the chip.
  • the fluidic access holes are made by microsablage in the upper substrate prior to the anodic bonding step.
  • a surface charge of about 25mC / m 3 is obtained.
  • the volume charge in the first part of the microchannel is equal to the product of the surface charge by the interperimeter of the channel divided by its section is 20500C / m 3 while it is 100500 C / m 3 at the narrowing.
  • the variation in the surface area load is in this case 80000 C / m 3 .
  • Figure 11 shows a device according to a fourth embodiment of the invention based on the same technology as described above.
  • the geometry of the side channels (36 in Fig. 10a) has only been changed. It describes in particular the implementation of pressures and voltages at the different inputs.
  • This device 40 has a chip 69 which comprises a rectilinear central microchannel 41 having a constriction 42 in its central portion 43 and each of the ends 44 is connected to a mixing / injection channel 46 of larger section than that of the microchannel 41.
  • This U-shaped mixing channel 46 each of whose ends 47 is connected to a reservoir 48 while the middle portion of its base 49 is connected to one end 44 of the microchannel.
  • Each of the reservoirs 48 is associated with a controllable voltage source 49 and means 50 for generating a controllable pressure.
  • Each of these means 50 for generating a controllable pressure comprises a source 51 of compressed air adapted to supply a sealed container 52 via a supply pipe 53 on which is disposed a controllable pressure gauge 59.
  • This hermetic container 52 contains distilled water 54 and is connected by a plastic pipe 55 to one of the tanks 48 of the device 40.
  • This plastic pipe 55 has a first end 56 located towards the bottom of the hermetic tank 52 and bathed in distilled water 54 and a second end 57 immersed in the solution present in the tank 48 of the device 40.
  • EDI distilled water
  • Each pressure tank is connected to a source of compressed air through a programmable pressure gauge for dynamically controlling the pressure in the chamber, and therefore at the inlet of the microfluidic chip constituted by the tanks, the mixing channels and the rectilinear microchannel comprising the narrowing.
  • the controllable voltage source comprises a voltage generator 60 connected to a first electrode 61 disposed inside said plastic pipe and a second electrode 62 constituting a reference electrode and being preferably common to each of the voltage generators 60.
  • FIGS. 12a, 12b and 12c represent the exemplary photographs of embodiments associated with the diagram of FIG. 11 as well as the curves of FIG. preconcentration obtained with these devices.
  • Figure 12a shows the central microchannel 41 with its central restriction 42 and the upstream mixing zone 46.
  • Figure 12b is a photograph of the chip 69.
  • Figure 12c shows a fluorescence image of the region of interest (ROI). ) defined in Figure 12a at a given instant of the selective preconcentration of a fluorescent probe. It also shows the pace of intensity along the microchannel over time (the brighter curves correspond to the longer times).
  • ROI region of interest
  • the mixing channels 46 may comprise a common portion of larger size constituting an internal reservoir or a virtual reservoir implemented in the embodiments detailed in FIG. 11, which is larger than the microchannel 41.
  • the composition of the electrolyte, the electric potential and the pressure in these internal reservoirs is a function of the compositions of the electrolytes, the electric potentials and the pressures applied in the actual reservoirs, the number of which may be greater than 2. It is also represented the zone of detection necessary for the follow-up of the selective preconcentration. The detection means must therefore cover a detection zone corresponding to the entire microchannel where the preconcentration takes place.
  • Figure 14 shows, in section, a detailed diagram of the connections between a device according to a fifth embodiment of the invention and the means for generating a controllable pressure.
  • a device 70 comprises a rectilinear central microchannel 71 embedded in a chip 72 and each of whose ends is connected to a reservoir 73 opening on the upper face of the block.
  • This block 72 is inserted between a metal plate 74 is a sealing membrane 75 having openings whose position corresponds to that of said tanks 73.
  • the metal plate has as much bore 79 as nut screw assemblies 79 necessary for the maintenance of the structure. It is also pierced in its center to allow the observation of the central microchannel using a microscope objective, for example, 81.
  • a parallelepipedal piece 76 in plexiglass is disposed above the sealing membrane 75
  • This piece 76 has bores 77 able to extend the ducts formed by each of the reservoirs and the opening in the membrane associated therewith.
  • Screw-nut assemblies 80 ensure the block 72 is pressed against the membrane via coaxial bores 78 and 79, which are used respectively in the parallelepipedal part 76 and in the metal plate 74.
  • Two connecting pipes 83 integral with the parallelepipedal piece 76 in plexiglass each connect one of the first bores 77 to a plastic pipe 55 connected to the means 50 for generating a controllable pressure.
  • Means 81 for detecting and determining the concentration of molecules in the microchannel, upstream and downstream of the constriction 82, are associated with the device 70.
  • these detection means are constituted by an epifluorescence microscope and by a CCD camera, these means for performing preconcentration measurements of charged fluorescent molecules (Fluorescein).
  • a sample of molecules to be analyzed is mixed with an electrolytic solution, for example a phosphate buffer, and then introduced into at least one of the reservoirs. While one or more solutions identical or not to the solution to be analyzed is introduced into the other tank or tanks.
  • an electrolytic solution for example a phosphate buffer
  • This difference in potential generates a displacement of the particles to be analyzed contained in the solution inside the microfluidic network and in particular inside the rectilinear central microchannel.
  • This displacement is a function of the electrophoretic speed of the molecules to be analyzed and the speed of the liquid itself.
  • the electrophoretic speed of the particles undergoes a sudden change. If this variation is sufficient to cancel the total velocity of the particle, the latter preconcentrates. Otherwise this particle continues its course.
  • an electric field only the electroosmotic flow is able to move the liquid.
  • the liquid flow rate does not vary and only an electrophoretic range of molecules can be preconcentrated in this way. It is therefore essential to vary the flow of liquid independently of the electric field.
  • a pressure gradient is further generated, via the means for generating a controllable pressure, between the different tanks.
  • the liquid flow rate is changed in the preconcentration channel independently of the electric field and the electrophoretic range of preconcentrated particles is changed.
  • Selective preconcentration can take place upstream or downstream of the central restriction. It is followed by a detection system located on the entire central channel to determine the different species present in the sample and their rate. If, for example, the fluorescence intensity is the detection parameter of the local concentration, this intensity will be measured as a function of a number of input variables which may be low (by varying the pressure only in the reservoir where is the sample to be analyzed), or on the contrary important (by varying pressure and electrical potential in the different tanks). In the latter case, the multidimensional analysis of recorded intensity will be done using more complex numerical analysis tools to determine the number of species present and their rate.
  • FIG. 15 shows the preconcentration rates obtained in the context of a device according to the embodiment described in FIG. 11.
  • the 4 reservoirs are filled with a 1mM solution of KCl containing the electrophoretic mobility analytes (FIG. me) respectively equal to 0.25, 0.5, 0.75, 1 and 1.25 times that of the fluorescent probe used for the preconcentration experiments presented in Figure 12c.
  • the maximum preconcentration rate is reported for the entire microchannel as a function of the applied pressure gradient ⁇ P.
  • the preconcentration rate is reported as a function of the pressure gradient imposed through the same central microchannel and the KCl concentration of the electrolyte.
  • this molecule has a signature consisting of three zones of preconcentrations.
  • FIG. 16A shows an exemplary embodiment in which the same microchannel 108 and connected at each of its ends 117, 118 to a tank, respectively 109, 110 and comprises several successive means able to generate a variation of the surface area load.
  • Each of the reservoirs 96, 110 is connected to means 120, 121 for generating a controllable pressure.
  • these means consist of four electrodes 111, 112, 113 and 114 located under an insulating layer (SU8 or SiO2 for example). The application of a different electrical potential to these electrodes makes it possible to modify the surface potential thanks to a capacitive effect (see article by Van der Wouden), thus the effective surface charge.
  • the chip is made using the Glass-PDMS-Glass technique described in Figure 9B and has a priori dimensions similar to that of Figure 9A.
  • An electric potential difference is generated between the two ends 117, 118 of the microchannel via the means 119 for generating a voltage while an overpressure is generated in the reservoir 96 via the means 120, 121 for generating a controllable pressure.
  • FIG. 16B shows, for two different overpressures applied at the level of reservoir 109, the speed of a charged analyte having a certain electrophoretic mobility. It can be seen that this velocity is firstly constant up to said upstream zone 115 and then varies in step with each variation of surface area charge, up to zone 1 16 corresponding to the fourth coating.
  • the use of a succession of changes in surface area charge makes it possible to create a succession of ionic gradients. In this case, the preconcentration zone may undergo a series of shifts when the overpressure is increased or decreased.
  • the presence in the same microchannel of several successive means capable of generating a change in surface area load makes it possible to increase the selectivity of the device.
  • FIG. 17B represents numerical simulation results obtained with a device comprising the same elements as those of FIG. 16A except for a microchannel 130 of 0.5 ⁇ m in height, a surface charge of -0.1 mC / m 2 and having five successive means 131, 132, 133, 134 and 135 capable of generating abrupt variations in surface area load respectively producing 5 zones of successive surface loads of -1 mC / m 2 , -2 mC / m 2 , -3 mC / m 2 , -4 mC / m 2 and -5mC / m 2 (left glass right).
  • the total length of the microchannel is 5.4 mm and each zone is 0.2 mm in length.
  • the ion concentration (1: 1 KCl electrolyte) is 1 mM.
  • the determination of said potential difference and of said gradient to be applied is made beforehand experimentally for each analyte that can be searched for.
  • the analysis of the location and rate of preconcentration is done on a chip having only one microchannel preconcentration.
  • several microchannels of preconcentrations, having load variations of different surface areas in their median part may be used in parallel from the same tanks or other tanks.
  • This network is constituted, in this exemplary embodiment by 6 channels C1 to C6 arranged parallel to each other in lines.
  • Each of these channels comprises means M1, M2, M3, M4 and M5 capable of generating in the microchannel at least one variation of the surface area load.
  • these channels are interconnected with each other so as to form a second network of channels C7, C8, C9, C10, C11, C12, each of these channels parallel to each other and in column.
  • Each of these channels comprises means M6, M7, M8, M9 and M10 capable of generating in the microchannel at least one variation of the surface area load.
  • the four ends of the channel network thus formed are each connected to a tank R1, R2, R3 and R4 which are associated means for generating a controllable voltage and means for generating a controllable pressure
  • the areas where these microchannels meet are thus as many "virtual reservoirs" as defined in FIG. 14, at which the composition of the The electrolyte, electrical potential and pressure will depend on the composition of the electrolytes, the electric potential and the pressure applied in each reservoir as well as the geometry of the microfluidic network.
  • the analysis of the preconcentration intensity at the level of each ionic barrier due to the change in surface area load (caused by a variation of the section and / or the surface charge) will make it possible to observe specific preconcentration signatures. to each molecule.
  • this figure shows, in dashed lines, the zone Z necessary for monitoring selective preconcentration.
  • the detection means must therefore cover a detection zone corresponding to the entire microchannel where the preconcentration takes place.
  • the selectivity of such an invention can be further increased by superimposing, on a device according to the invention, means able to generate a pH gradient through such a structure. It will be sufficient for this purpose to use support electrolytes with different pH levels at the actual reservoirs.
  • a method according to the invention may for example comprise a prior known step of labeling the analyte to be detected in order to facilitate its detection.
  • the addition of fluorescent antibodies to an analyte will determine the presence of antigens and the number of antigens thereof. If there is no antigen, the preconcentration signature will be found only with the fluorescent antibody alone. If, on the contrary, this antibody becomes complex to an analyte, its preconcentration signature will be modified and will be found in the analysis of the preconcentration figures, whether they are uni or multidimensional.
  • the mixing channel may also be for example constituted by a mixing coil or any other geometry adapted to allow the mixing of liquids from the various tanks.

Abstract

L'invention concerne le domaine de la recherche ou de l'analyse des matériaux par l'emploi de moyens électriques et a plus particulièrement pour objet un dispositif de préconconcentration sélective / détection d'analytes chargées contenues dans un électrolyte comportant au moins deux réservoirs séparés par au moins un microcanal sans intersection d'axe longitudinal X et préférablement rectiligne, et comportant au moins une source de tension contrôlable apte à générer une différence de potentiel entre les extrémités dudit canal rectiligne, dispositif caractérisé en ce que le dispositif comporte des moyens de génération d'une pression contrôlable associés à au moins l'un des réservoirs et aptes à générer un gradient de pression entre les deux extrémités dudit microcanal et en ce que ce dernier comporte, dans sa partie médiane, des moyens aptes à générer au moins une variation de la charge de surface volumique, le dispositif étant apte à concentrer sélectivement les analytes chargées dans la partie médiane du canal, en amont et/ou aval de ces moyens.

Description

Dispositif de préconconceπtration sélective / détection d'analytes chargées contenues dans un électrolyte et procédé associé
L'invention concerne le domaine de la recherche ou de l'analyse des matériaux par l'emploi de moyens électriques et a plus particulièrement pour objet d'une part un dispositif de préconcentration sélective d'analytes contenus dans un électrolyte et, d'autre part, un procédé de préconcentration sélective des analytes contenus dans un électrolyte.
On connaît principalement deux méthodes de séparation d'analytes contenus dans un électrolyte à l'aide de systèmes microfluidiques. La première méthode est l'électrophorèse capillaire. Elle est généralement mise en œuvre par un réseau microfluidique dans lequel sont injectés un électrolyte et un échantillon renfermant des analytes. Ce. réseau peut comporter un certain nombre de réservoirs relié à au moins un long microcanal et/ou à un réseau de microcanaux présentant des intersections agencées particulièrement, et ce, pour permettre l'injection d'une certaine quantité d'analytes dans le microcanal central. L'application d'un champ électrique dans ce même canal dit de séparation après la phase d'injection est responsable de la migration des analytes. En effet, sous un champ électrique, les particules chargées se déplacent dans un milieu liquide avec une vitesse définie à la fois par le champ, par la masse et la charge des particules (électrophorèse). La vitesse des particules dans le liquide est proportionnelle au champ électrique, la constante de proportionnalité étant nommée mobilité électrophorétique. A la paroi solide/liquide, une double couche ionique formée d'une couche d'ions fixe (charge de surface) et d'une couche d'ions mobile (couche diffuse dans le liquide) se forme spontanément. Sous un champ électrique, les ions de la couche mobile migrent, entraînant un mouvement global du liquide par viscosité (électro-osmose). Celui-ci se déplace d'un seul bloc et sa vitesse est aussi proportionnelle au champ électrique. La constante de proportionnalité entre la vitesse du fluide et le champ électrique est appelée mobilité électro-osmotique. L'action concomitante de la migration électrophorétique (vitesse des ions dans le liquide) et du flux de liquide électro-osmotique (vitesse du liquide) générés par la différence de potentiel agit sur les ions contenus dans le fluide, assurant leur transport à travers le canal de séparation. La vitesse totale d'un ion dans un microcanal soumis à un champ électrique est donc proportionnelle au champ électrique. La constante de proportionnalité est la mobilité totale de l'ion qui est la somme de sa mobilité électrophorétique (propre à chaque ion) et de la mobilité électro-osmotique (identique pour tous les ions et qui dépend des caractéristiques de l'interface solide-liquide).
La détection des différents analytes peut se faire successivement dans le temps au niveau de l'extrémité du long microcanal et permet de connaître le nombre d'analytes présents dans la solution à analyser et leur concentration respective. Cette méthode est connue pour sa très bonne résolution à séparer deux analytes, mais présente l'inconvénient de diluer les analytes ce qui rend la détection difficile, voire impossible dans le cas des analytes de très faible concentration. Pour résoudre cet inconvénient, on connaît une seconde méthode connue sous le terme de focalisation électrique par gradient à contre-courant. Elle met aussi en œuvre un réseau microfluidique comportant au moins deux réservoirs reliés entre eux par des canaux et par au moins un canal ou une chambre de séparation qui permet de concentrer les analytes à l'intérieur d'un canal de séparation lorsqu'un champ électrique et un gradient de pression approprié sont appliqués. Pour réaliser cette préconcentration, il doit y avoir un gradient de champ électrique dans le canal central alors que le débit de liquide est constant. Il existe aujourd'hui plusieurs méthodes pour réaliser un gradient (cf Shackman et Ross "Review Counter-flow gradient electrofocusing" Electrophoresis 2007, 28, 556-571) ).
Les figures 1a et 1b présentent respectivement d'une part la valeur du champ électrique en fonction de l'abscisse à l'intérieur d'un canal de séparation et selon son axe longitudinal, et d'autre part la valeur de la vitesse des particules chargées en fonction de l'abscisse à l'intérieur de ce même canal de séparation et selon son axe longitudinal. Cette vitesse est la somme de leur vitesse électrophorétique et de la vitesse du liquide. Comme montré sur ces figures, avec cette méthode, la vitesse de chaque analyte varie à l'intérieur du réseau et peut devenir nulle en un point du réseau. Ainsi, chaque analyte contenu dans le réseau migre vers le point où sa vitesse est nulle, lieu de sa préconcentration. Deux analytes présentant des mobilités électrophorétiques différentes peuvent, en théorie, ainsi être préconcentrés en deux zones distinctes du microcanal. Cependant, cette méthode souffre du fait que les zones de préconcentrations sont trop larges pour obtenir une bonne séparation des analytes (les zones de préconcentration se chevauchent). Ainsi, cette technique est davantage utilisée comme outil de préconcentration globale avant une séparation. On parle alors d'électro-capture (Shackman et al. figure 5) et il n'existe pas aujourd'hui de technique permettant de créer un gradient de champ électrique suffisamment fin et suffisamment stable pour permettre d'assurer une séparation convenable de manière concomitante à la préconcentration. On connaît par ailleurs la demande de brevet US2006/018469 de Han et al. qui décrit une méthode, qui couple les avantages des deux méthodes précédemment décrites car permettant une étape de préconcentration non sélective suivie d'une étape de séparation électrophorétique. Ce dispositif comporte, comme montré sur la figure 2, deux microcanaux 1 , 2 en forme de U aux extrémités de chacune desquelles se trouve un réservoir, respectivement 4, 5, 6 et 7. Les bases respectives 8, 9 de ces deux microcanaux sont disposées parallèlement et un nanocanal 10 relie les bases des premier et second microcanaux 1 , 2 au niveau de leur partie médiane 11 , 12.
Des électrodes de platine 13, 14, 15,16 sont disposées dans chacun des réservoirs 4, 5, 6 et 7 et reliées à au moins un générateur de tension, non représenté apte à générer une différence de potentiel entre elles. Ainsi, une différence de potentielle est générée entre l'entrée et la sortie du nanocanal. Avec un tel dispositif, le déplacement des analytes est réalisée électriquement par électrophorèse et électro-osmose. Cette demande de brevet prévoit en outre l'utilisation de moyens mécaniques aptes à générer une différence de pression entre lesdits réservoirs 4, 5, 6 et 7, ces moyens pouvant par exemple être constitués par une ou plusieurs micro pompes et assurer le déplacement de la solution dans le dispositif. Elle prévoit aussi l'utilisation alternée des moyens électriques de déplacement de la solution et des moyens mécaniques de déplacement de la solution.
La première étape associée au procédé décrit dans ce brevet consiste à réaliser une forte préconcentration non sélective de l'échantillon grâce à une région de charge d'espace utilisée comme barrière. Lorsqu'un faible champ électrique parallèle au nanocanal 10 est généré via le premier générateur, en appliquant une tension de 1V dans les réservoirs 4 et 5 et une tension nulle dans les réservoirs 6 et 7, aucune préconcentration de composé ne se produit. Lorsque l'on augmente ce champ électrique par augmentation de la tension dans les réservoirs 4 et 5, le déplacement des ions contenus dans la solution se produit de façon limitée et une zone 17 pauvre en ions se forme dans le microcanal 1 au droit du nanocanal 10 et dans laquelle il y a autant d'ions négatifs que d'ions positifs. Lorsqu'on applique un fort champ électrique en augmentant encore la tension dans les réservoirs 4 et 5, la neutralité de la somme des ions présents dans ladite zone 17 n'est plus maintenue et il se crée une région de charge d'espace. Si alors, on diminue la tension dans le réservoir 5 de sorte à ce qu'elle soit égale à la moitié de celle présente dans le réservoir 4, un champ électrique secondaire perpendiculaire au nanocanal 10 est généré. Il se produit alors un déplacement du liquide contenu dans ladite première zone 17 par électro-osmose. Les analytes chargés contenu dans le liquide sont ainsi amenés vers la région de charge d'espace dans laquelle ils ne peuvent pas pénétrer. Il en résulte une accumulation de ces analytes chargés dans la zone 18 du microcanal située en amont de la zone 17 et avant l'intersection entre le microcanal 1 et le nanocanal 10.
Après cette étape de préconcentration non sélective, Han montre qu'il est possible de séparer par électrophorèse ^ capillaire les d'analytes préconcentrés présentant des mobilités électrophorétiques différentes.
Un dispositif selon cette demande de brevet présente de nombreux inconvénients. Ce dispositif ne permet pas une concentration sélective des analytes au niveau de l'intersection entre le microcanal et le nanocanal (capture globale) et nécessite donc l'utilisation d'une autre technique et un autre dispositif associé, en l'occurrence l'électrophorèse capillaire pour les séparer. Ceci est expliqué par l'utilisation d'un nanocanal qui crée une zone de charge d'espace trop forte. On constate par ailleurs que ce dispositif présente des phénomènes d'électro-osmose secondaires (ref HAN physical review letters) qui perturbent la zone d'espace de charge responsable de la préconcentration des espèces contenues dans la solution. Le but de l'invention est de résoudre ces inconvénients en proposant un procédé et un dispositif de mise en oeuvre de ce procédé permettant de coupler les étapes de préconcentration et de séparation au travers d'une succession de préconcentrations sélectives des différentes espèces ioniques contenues dans un électrolyte. La solution apporté est un dispositif de préconconcentration sélective / détection d'analytes chargées contenues dans un électrolyte comportant au moins deux réservoirs séparés par au moins un microcanal sans intersection d'axe longitudinal X et préférablement rectiligne, et comportant au moins une source de tension contrôlable apte à générer une différence de potentiel entre les extrémités dudit microcanal, dispositif caractérisé en ce que le dispositif comporte des moyens de génération d'une pression contrôlable associés à au moins l'un des réservoirs et aptes à générer un gradient de pression entre les deux extrémités dudit microcanal et en ce que ce dernier comporte, dans sa partie médiane, au moins une première partie présentant une charge de surface volumique constante suivie par une seconde partie comportant des moyens aptes à générer au moins une variation de la charge de surface volumique par rapport à celle de la première partie, le dispositif étant apte à concentrer sélectivement les analytes chargées dans le microcanal, en amont et/ou aval de ces moyens Par charge de surface volumique, il faut entendre le rapport de la charge de surface linéique moyenne le long du périmètre d'une section perpendiculaire à l'axe de ce microcanal à l'aire de cette section. Elles est donc égale au produit de la charge de surface par le périmètre du microcanal divisé par la section du microcanal.
Par partie médiane, il faut entendre que ces moyens ne constituent pas l'entrée ou la sortie du microcanal.
Selon une caractéristique particulière, un dispositif selon l'invention comporte au moins l'une des caractéristiques additionnelle suivantes :
- les moyens aptes à générer au moins une variation de la charge de surface volumique sont aptes à la générer, selon ledit axe longitudinal, sous forme de marche.
- les moyens aptes à générer au moins une variation de la charge de surface volumique sont aptes à générer, pour un électrolyte tampon PBS 1 mM à pH7 utilisé comme électrolyte de référence, une variation de charge de surface volumique supérieure ou égale à 10 000 C/m3. - les moyens aptes à générer au moins une variation de la charge de surface volumique sont aptes à la générer: sur une longueur, selon l'axe X, inférieure à 10 : μm.
- le microcanal comporte au moins une face et en ce les moyens aptes à générer au moins une variation de la charge de surface volumique sont constitués soit par : * au moins un revêtement physique ou chimique, une partie seulement de la face de la partie médiane du microcanal étant recouverte par un revêtement différent de celui du reste de la partie (par exemple dépôt de matériaux comme du Si3N4, une résine photosensible, un oxyde, des multicouches de poly-électrolytes chargés, etc.). * une partie seulement de la face de la partie médiane du microcanal comporte une charge de surface volumique différente du reste de la charge, cette différence étant par exemple due à un traitement chimique de cette partie (par exemple, par fonctionnalisation de la surface à l'aide de dérivés silanes) * un rétrécissement de la section du microcanal sur une partie seulement de la partie médiane du microcanal, par exemple se sa hauteur à une valeur au moins égale à 100nm,
* des moyens aptes à générer un changement de potentiel de surface, par exemple au moyen d'une d'interface métal-isolant-électrolyte apte à modifier la charge de surface effective à l'aide d'un champ radial.
En outre, un dispositif selon l'invention peut comporter au moins l'une des caractéristiques suivantes: il comporte au moins deux microcanaux disposés parallèlement et comportant - chacun, -dans sa partie médiane, des moyens aptes à générer au moins une variation de la charge de surface volumique et dont au moins une des extrémités de l'un des canaux et relié par un microcanal à l'une des extrémités de l'autre microcanal, au moins deux canaux présentent des moyens aptes à générer au moins une variation de la charge de surface volumique différente en intensité et/ou en localisation, il comporte un réseau entrecroisé de canaux présentant chacun entre chaque croisement des moyens aptes à générer au moins une variation de la charge de surface volumique, préférentiellement différentes en intensité et/ou en localisation entre canaux, - il comporte des moyens de détection des analytes aptes à mesurer leur concentration locale sur l'ensemble du microcanal ou réseau de microcanaux au cours du temps, il comporte des moyens de collecte et de traitement des données issues desdits moyens de détection, et permettant de déterminer le nombre et la concentration des analytes contenus dans l'électrolyte,
.au moins l'une des extrémités dudit microcanal est connecté à une zone de mélange, pouvant notamment comporter un réservoir interne, ou un serpentin de mélange, la dite zone de mélange étant connectée à au moins deux réservoirs dont les pressions et/ou potentiels électriques peuvent être contrôlés indépendamment et/ou contenant des électrolytes de composition différente. Ainsi, l'invention repose sur la génération de gradients ioniques modérés (pas de zone d'espace de charge) stables (pas de phénomènes de perturbations liés à l'électro-osmose secondaires) et autogénérés (pas besoin de membranes perméables au, courant ou de gradient de température comme en focalisation électrique à gradient de champ) au sein d'un microcanal rectiligne. Pour ce faire, ledit microcanal présente donc une ou plusieurs variations brutales de la charge de surface volumique en son sein.
L'invention concerne aussi un procédé de préconcentration sélective / détection d'au moins un type d'analyte tel par exemple des molécules, des complexes de molécules ou de particules (artificielles ou biologiques - virus, bactéries, spores,...) ou des cellules contenus dans un électrolyte et mis en œuvre par un dispositif comportant au moins deux réservoirs relies par au moins ledit microcanal sans intersection et une source de tension contrôlable apte à générer une différence de potentiel entre les extrémités dudit microcanal et des moyens de génération d'une pression contrôlable associés à au moins l'un des réservoirs et aptes à générer un gradient de pression entre les deux extrémités dudit microcanal, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : remplir au moins en partie un premier réservoir avec un électrolyte comportant les analytes à préconcentrer sélectivement, remplir au moins un second réservoir, disposé par rapport au premier réservoir de l'autre côté d'au moins un microcanal rectiligne comportant des moyens aptes à générer au moins une variation de la charge de surface volumique, avec une solution tampon contenant ou non les objets de l'analyse, générer une variation de charge de surface volumique dans la partie médiane du microcanal avec des moyens de génération d'une variation de charge de surface volumique, ainsi qu' une différence de potentiel entre les extrémités dudit microcanal par la source de tension contrôlable et qu' un premier gradient de pression entre les extrémités dudit microcanal par les moyens de génération d'une pression contrôlable, cette différence de potentiel et cette pression étant apte à concentrer cet analyte à l'intérieur dudit microcanal, en et en amont ou en aval de ladite variation de charge volumique, la variation de charge de surface volumique étant, pour un électrolyte tampon PBS 1mM à pH7, préférentiellement d'au moins 10000C/m3.
Pour préconcentrer sélectivement deux analytes ayant des vitesses électrophorétiques différentes, un procédé selon l'invention comporte une étape supplémentaire consistant à appliquer, via les moyens de génération d'une pression contrôlable, au moins un second gradient de pression apte à engendrer la préconcentration dudit type d'analyte dans la partie médiane du microcanal, en amont ou en aval des moyens aptes à générer au moins une variation de la charge de surface volumique.
D'autres avantages et caractéristiques apparaîtront dans la description de modes particuliers de réalisation de l'invention au regard des figures annexées parmi lesquelles :
La figure 3-A présente un réseau microfluidique 99 utilisé au sein d'un dispositif selon un premier mode de réalisation général d'un dispositif selon l'invention tandis que la figure 3B montre la valeur de la charge de surface volumique d'un tel réseau,
la figure 4A montre le réseau fluidique de la figure 3A auquel a été ajouté des moyens de génération d'une tension contrôlable tandis que la figure 4B montre le profil de la concentration ionique de l'électronique au sein du réseau fluidique lorsqu'un champ électrique E est appliqué,,
la figure 5A présente le réseau fluidique de la figure 3A auquel a été ajouté des moyens de génération d'un gradient de pression apte à générer une surpression au niveau d'un premier réservoir tandis que la figure 5B montre le profil de la concentration ionique de l'électronique au sein du réseau fluidique lorsqu'un champ électrique E et une surpression au sein du premier réservoir sont appliqués,
la figure 6A ne diffère de la figure 5A qu'en ce que la surpression est appliquée dans un second réservoir situé de l'autre côté du microcanal tandis que la figure 5B montre le profil de la concentration ionique de l'électrolyte au sein du réseau fluidique lorsqu'un champ électrique E et une surpression au sein dudit second réservoir sont appliqués, la figure 7A ne diffère de la figure 5A qu'en ce qu'une zone de préconcentration d'un analyte a été définie tandis que la figure 7B montre la vitesse d'une particule chargée ayant une mobilité électrophorétique donnée pour différentes valeurs de surpression appliquée au niveau du premier réservoir,
- la figure 8 montre le taux de préconcentration de trois analytes (présentant des vitesses électrophorétiques différentes) en fonction de la surpression appliquée au niveau dudit premier réservoir,
la figure 9A et 9B montre un schéma d'un dispositif selon un second mode de réalisation de l'invention dans lequel la variation de charge de surface volumique est réalisé à l'aide d'une couche de d'oxyde d'aluminium (AI2O3).
- les figures 10a et 10b présentent un schéma général d'un dispositif selon un troisième mode de réalisation de l'invention, dans lequel la variation de charge de surface volumique est réalisée à l'aide d'une variation de section.
la figure 11 montre un schéma d'un dispositif selon un quatrième mode de réalisation de l'invention, dans lequel sont détaillés notamment les moyens de contrôle électrique et en pression externes à la puce microfluidique.
Les figures 12a, 12b et 12c montrent des exemples de réalisation selon le mode de réalisation décrit en figure 1 1 ainsi qu'un exemple de suivi de préconcentration sélective par des moyens de fluorescence.
- La figure 13 montre un schéma de dispositif selon un 5eme mode de réalisation où le choix du potentiel électrique, de la pression et de la composition de l'électrolyte de par et d'autre du microcanal de préconcentration sélective est réalisée à l'aide de réservoirs dits « virtuels » ou interne connecté à un certains nombre de réservoirs extérieurs dans lesquels les paramètres mentionnés ci- avant sont contrôlés individuellement.
La figure 14 montre, en coupe, un schéma détaillé de réalisation des connexions entre un dispositif selon un cinquième mode de réalisation de l'invention et les moyens de moyens de génération d'une pression contrôlable. Les figures 15A et 15B montre deux exemples de préconcentration sélective respectivement unidimensionnelle et multidimensionnelle en fonction de la mobilité électrophorétique des molécules.
la figure 16A présente un dispositif selon un sixième mode de réalisation de l'invention tandis que la figure 16B montre, pour deux surpressions différentes appliquées au niveau du réservoir de ce dispositif, la vitesse d'un analyte chargé comportant une certain mobilité électrophorétique,
la figure 17A présente un dispositif selon un septième mode de réalisation de l'invention comportant un microcanal possédant cinq moyens successifs aptes à générer une variation de charges de surface volumique et la figure 17B montre un exemple numérique de préconcentration d'un analyte en fonction du temps le long de ce microcanal,
la 18 montre un exemple numérique de préconcentration de deux analytes en fonction du temps le long du microcanal selon la figure 17A, ces analytes possédant des vitesses électrophorétiques proches,
la figure 19 A montre à nouveau le dispositif de la figure 5A tandis que la figure 19 B montre un exemple numérique de préconcentration des mêmes deux analytes que dans le cadre de la figure 18, et ce, en fonction du temps le long du microcanal présenté sur la figure 5A.
- la figure 20 représente le gradient ionique obtenu lors de l'expérience de préconcentration sélective de la figure 18
la figure 21 montre un dispositif selon un huitième mode de réalisation de l'invention.
La figure 3-A présente un réseau microfluidique 99 utilisé au sein d'un dispositif selon un premier mode de réalisation d'un dispositif selon l'invention. Ce réseau 99 comportant un microcanal 100 comportant une première partie 110 comportant une charge de surface volumique constante et se terminant dans la partie médiane du microcanal et suivie par des moyens 101 aptes à générer une variation de charge de surface volumique. Les extrémités 102, 103 de ce microcanal 100 sont chacune connectées à un réservoir, respectivement 104, 105. La figure 3B montre la valeur de la charge de surface volumique le long d'un tel réseau. Les moyens 101 génèrent une variation en forme de marche 98 de la charge de surface volumique. Lorsque, comme montré sur la figure 4A, une différence de potentiel électrique est générée entre les réservoirs 104, 105 par des moyens de génération d'une tension contrôlable 106, cette différence de potentiel génère un champ électrique dirigé selon l'axe longitudinal X du microcanal. Le brutal changement de charge de surface volumique au niveau des moyens 101 provoque, comme montré sur la figure 4B, un gradient de concentration ionique dans une partie du microcanal en amont et en aval desdits moyens 101. Si on applique entre les extrémités 102, 103 du microcanal 100, comme montré sur les figures 5A et 6A, simultanément un champ électrique ainsi qu'un gradient de pression généré par des moyens 107 et apte à créer un débit de liquide dans le microcanal, le gradient de concentration ionique présent au niveau des moyens 101 de génération de la variation de charge se modifie pour prendre le profil d'une marche, soit négative 108 comme montré sur la figure 5B soit positive 109 comme montré sur la figure 6B suivant la direction globale du fluide et donc du côté ou on applique une surpression. On voit ici qu'un dispositif selon l'invention permet de générer un gradient local de concentration ionique très différent des gradients ioniques généralement obtenus en focalisation électrique et montré sur la figure 1. L'amplitude de cette variation de concentration ionique dépend de plusieurs paramètres : - , elle est une fonction croissante avec l'amplitude de la variation de charge de surface volumique elle est une fonction décroissante de la concentration ionique de l'électrolyte support c'est une fonction décroissante avec le débit de liquide à travers le microcanal c'est une fonction croissante avec la valeur du champ électrique dans le microcanal.
Cette variation locale de la concentration ionique résulte aussi dans une variation locale du champ électrique. Dès lors, comme montré sur la figure 7A qui montre le réseau microfluidique 99 fluidique utilisé au sein d'un dispositif selon le premier mode de réalisation d'un dispositif selon l'invention, et sur la figure 7B qui présente la vitesse d'une particule chargée dans le microcanal 100 en fonction de la valeur de la surpression générée au niveau du réservoir 104, cette vitesse subit une variation locale au niveau des moyens 101 aptes à générer une variation de la charge de surface volumique. On peut voir, que suivant la valeur du gradient de pression appliqué, la vitesse du liquide varie ce qui a pour conséquence de translater la courbe de vitesse de la particule. Pour une certaine gamme de pression, et notamment lors de l'application d'une surpression dont la valeur est égale à B1 la particule passe par une zone de vitesse nulle où elle se préconcentre ( zone 97 située en amont desdits moyens 101). La principale différence avec les techniques de focalisation habituelles est que le gradient ionique et donc la variation de champ électrique prend la forme d'une marche abrupte de faible hauteur ce qui a pour conséquence de ne permettre la préconcentration que d'une gamme très fine de mobilité électro-osmotique, et ce, en un point bien déterminer. Si on fait varier la surpression de manière continue, on pourra successivement préconcentrer des molécules présentant différentes mobilités électrophorétique avec une précision définie par la hauteur de la barrière ionique comme montré sur la figure 8 qui rapporte le taux de préconcentration dans la zone 97 de la figure 7A. Ainsi, si on fait varier continûment de façon croissante le gradient de pression dans le microcanal, par exemple avec la surpression au niveau du réservoir 104, les différents analytes, en l'occurrence les molécules A, B et C se préconcentrent successivement dans la première partie du microcanal, en amont des moyens 101 de génération d'une variation de charge de surface volumique, et entre une première et une seconde surpression P1 et P2 pour la molécule A, entre une troisième P3 et une quatrième surpression P4 pour la molécule B et entre une cinquième P5 et une sixième surpression P6 pour la molécule C, avec P1<P2<P3<P4<P5<P6. De plus, dans cette géométrie, le champ électrique reste toujours uniforme selon la hauteur de la section du microcanal. Cette particularité permet d'éviter la formation de tourbillons hydrodynamiques et/ou de phénomènes d'électro-osmose secondaire.
La figure 9A montre un schéma particulier d'un dispositif selon un second mode de réalisation de l'invention qui est un cas particulier du dispositif présenté en en Figure 3A. Ce dispositif 20 comporte un premier et un second réservoir 21 , 22 relié entre eux par un microcanal central rectiligne 23 d'une longueur de 1cm et d'une section rectangulaire de 100 μm de large et 2 μm de hauteur. Ce microcanal 23 comporte, au niveau de sa partie médiane, 29 et sur sa face supérieure interne 19 un revêtement 24 en AI2O3 sur une longueur de 100 μm.
A chacun des réservoirs 21 ,22 sont associés une source de tension contrôlable, 25, 26 et des moyens 27, 28 de génération d'une pression contrôlable. Le réservoir 21 est destiné à contenir un échantillon à analyser comportant des molécules en solution dans un électrolyte, par exemple KCI. Bien évidemment, un seul des réservoirs pourrait comporter une seule source de tension contrôlable et un seul moyen de génération d'une pression contrôlable pourrait être associés à l'un et/ou l'autre des réservoirs 21 , 22. La figure 9B détaille les étapes technologiques permettant la mise en œuvre d'un tel dispositif à l'aide d'une technologie dite Verre-PDMS-Verre (cf. articles de Plecis et al sur cette technlogie- PDMS = Polydiméthylsiloxane). Deux substrats de verres D263, un pour la partie inférieure, l'autre pour la partie supérieures du microcanal, sont utilisés. Le substrat supérieur 200 est percé en deux points définissant les extrémités du microcanal par microsablage au travers d'un masque d'acier 201 (étape 1). Une couche fine 202 d'AI2O3 d'épaisseur 100 nm est ensuite déposée par une technique de déposition connue sous le nom pulvérisation cathodique radio-fréquence magnétron sur toute la surface inférieure du substrat 200 (étape 2). Un masque de résine 203 est ensuite créé par une technique de photolithographie à l'aide, par exemple d'une résine AZ-5214 (Dow Corning). Ce masque 203 est utilisé pour protégé la couche d'AL2θ3 lors d'une étape de gravure sèche par plasma qui permet de retirer TAL2O3 sauf dans la partie médiane du substrat 200 où l'on veut obtenir la variation de charge de surface (étape 3). Sur la face supérieure du substrat inférieur 205 est déposée une fine couche 206 de PDMS (étape 4), sur laquelle est structurée une couche 207 de résine (par exemple SU8 - étape 5). Les régions où il n'y a pas de résine SU8 constitueront le microcanal. Un procédé de gravure plasma est ensuite utilisé pour graver les couches de SU8 et de PDMS (étape 6). La résine 207 est complètement gravée alors qu'une fine couche (2μm) de PDMS 206 reste sur le substrat 205, sauf dans la région définissant le microcanal. Les substrats supérieur et inférieur 200, 205 sont ensuite exposés à un plasma Oxygène afin d'activer les groupes de surface du PDMS et du verre. Après cette étape d'activation, on aligne les substrats inférieur et supérieur 205, 200 et leur mise en contact résulte dans un scellement fort de la structure (étape 7). Les figures 10a et 10b schématisent un dispositif selon un troisième mode de réalisation de l'invention, la figure 10b étant une coupe du dispositif de la figure 10a selon l'axe longitudinal X (figuré en pointillé). Ce dispositif 30 comporte un microcanal central rectiligne 31 d'axe X comportant un rétrécissement 32 dans sa partie médiane 33 et dont chacune des extrémités 34 est connecté à la partie médiane 35 d'un canal de mélange/injection 36 de section plus importante que celle du microcanal 31. Chacune des extrémités 37 de ce canal de mélange 36 est reliée à un réservoir 38.
Le microcanal 31 a une longueur de 1500μm, une largeur de 100μm et une hauteur de 2,5 μm, excepté au niveau du rétrécissement ou sa hauteur n'est que de 0,5 μm. La longueur du rétrécissement est de 50 μm.
Le canal de mélange/injection a une longueur de 6 mm et une section de 200 μm de large et 2,5 μm de haut.
A chacun des réservoirs 38 sont associés une source de tension contrôlable, 39 et des moyens de génération d'une pression contrôlable 27.
Pour la réalisation de ce dispositif, une technique de collage anodique a été utilisée. Cette technique a été précédemment décrite, notamment par Datta et al dans son article intitulé « Nanofluidic channels by anodic bonding of amorphous silicon to glass to study ion accumulation and ion depletion effect » Talanta 2006 68(3) pp 659-665 et consiste à graver les sections microfluidiques dans un substrat de Pyrex à l'aide d'une solution d'acide fluorhydrique et de HCI. La section nanofluidique est elle réalisée grâce à l'utilisation d'une couche intermédiaire de Silicium amorphe déposé par des techniques de PECVD (Plasma Enhanced Chemical Vapor Déposition). Cette couche est gravée par gravure plasma (SF6) entre les 2 microcanaux et sert de couche d'espacement entre le substrat de Pyrex inférieur et supérieur. Lorsque les substrats sont ensuite mis en contact, chauffé à 4000C et qu'un potentiel (typiquement 600 VJ est appliqué à travers la structures, un collage permanent (collage anodique) scelle la puce. Les trous d'accès fluidiques sont réalisés par microsablage dans le substrat supérieur préalablement à l'étape de collage anodique.
Avec un tel microcanal 31 et en utilisant un électrolyte tampon PBS 1mM à pH7, on obtient une charge de surface d'environ 25mC/m3. La charge volumique dans la première partie du microcanal est égale au produit de la charge surfacique par le .périmètre du canal divisé par sa section soit 20500C/m3 alors qu'elle est de 100500 C/m3 au niveau du rétrécissement. La variation de charge de surface volumique est donc dans ce cas de 80000 C/m3 .
La figure 11 présente un dispositif selon un quatrième mode de réalisation de l'invention basé sur la même technologie que décrite ci avant. La géométrie des canaux latéraux (36 dans la figure 10a) a été seulement modifiée. On y décrit notamment la mise en œuvre des pressions et des tensions au niveau des différentes entrées.
Ce dispositif 40 possède une puce 69 qui comporte un microcanal central rectiligne 41 comportant un rétrécissement 42 dans sa partie médiane 43 et dont chacune des extrémités 44 est connecté à un canal de mélange/injection 46 de section plus importante que celle du microcanal 41. Ce canal de mélange 46 à la forme d'un U dont chacune de ses extrémités 47 est reliée à un réservoir 48 tandis que la partie médiane de sa base 49 est connectée à l'une des extrémités 44 du microcanal. Une photographie d'un dispositif réalisé selon le procédé est présenté en Figure 10c
A chacun des réservoirs 48 sont associés une source de tension contrôlable, 49 et des moyens 50 de génération d'une pression contrôlable.
Chacun de ces moyens 50 de génération d'une pression contrôlable comporte une source 51 d'air comprimé apte à alimenter un récipient hermétique 52 via un tuyau d'alimentation 53 sur lequel est disposé un manomètre contrôlable 59. Ce récipient hermétique 52 renferme de l'eau distillée 54 et est relié par un tuyau en plastique 55 à l'un des réservoirs 48 du dispositif 40. Ce tuyau en plastique 55 comporte une première extrémité 56 située vers le fond du réservoir hermétique 52 et baignant dans l'eau distillée 54 et une seconde extrémité 57 baignant dans la solution présente dans le réservoir 48 du dispositif 40. Ainsi, La pression est transmise aux réservoirs par l'intermédiaire d'eau distillée (EDI) dont la pression propre est régulée dans des réservoirs de pressions indépendants. Chaque réservoir de pression est relié à une source d'air comprimé au travers d'un manomètre programmable permettant de contrôler dynamiquement la pression dans la chambre, et donc à l'entrée de la puce microfluidique constituée par les réservoirs, les canaux de mélange et le microcanal rectiligne comportant le rétrécissement.
La source de tension contrôlable comporte un générateur de tension 60 connecté à une première électrode 61 disposée à l'intérieur dudit tuyau en plastique et une seconde électrode 62 constituant une électrode de référence et étant, préférentiellement commune à chacun des générateurs de tension 60.
Plusieurs schémas peuvent être appliqués successivement grâce à cette configuration : - si P1=P2 >P3=P4 et que V1=V2 ≠V3=V4, le liquide est amené en quantité équivalente des réservoirs 1 et 2 vers les réservoirs 3 et 4. Le liquide dans le microcanal de préconcentration sélective 41 est donc un mélange des liquides issu des réservoirs 1 et 2. Si les liquides dans ces deux réservoirs sont les même, ce mode de réalisation est équivalent à celui de la figure 5A. Si les liquides dans les réservoirs 1 et 2 sont différents, le liquide présent en 41 sera un mélange de ces deux liquides, présentant des propriétés de force ionique, de pH et de concentration d'analyte intermédiaire à ces deux réservoirs. En modulant P1 et P2 l'un part rapport à l'autre (tout en les conservant ces deux pressions supérieures à P3 et P4), il sera ainsi possible de moduler la composition du liquide dans le canal de préconcentration sélective 41. Les potentiels V1 ,V2,V3 et V4 peuvent aussi être fait varier afin de modifier les composantes électrosmotiques du flux EOF dans les canaux latéraux 46 ainsi que la répartition de potentiel dans l'ensemble de la puce. Ce schéma d'intégration permet en réalité de créer deux « réservoirs virtuels » de part et d'autre du microcanal central dans la zone médiane du canal 46. La composition du liquide, la pression et le potentiel électrique dans ces « réservoirs virtuels » étant contrôlés par les paramètres de contrôles P1 ,P2,P3,P4 et V1 ,V2,V3,V4. Il est possible - Si P1=P4 > P3=P2 et que V1=V2=V3=V4=0, alors le liquide est mis en
: mouvement depuis les réservoirs 1 et 4 pour remplacer le liquide dans les canaux latéraux 46. Cette étape peut être utilisé pour changer le liquide plus rapidement dans la puce. De même, on peut jouer à tension nulle sur les pressions relatives de P1 , P2, P3 et P4 de manière à remplir la puce à l'aide de l'électrolyte contenu dans l'un des réservoirs. Par exemple si de l'EDI est contenu dans le réservoir 4, en établissant P4 >P1=P2=P3, le dispositif va se remplir d'EDI (nettoyage après une analyse).
Les figures 12a, 12b et 12c représentent les photographies d'exemple de réalisations associées au schéma de la Figure 1 1 ainsi que les courbes de préconcentration obtenues avec ces dispositifs. La figure 12a représente le microcanal central 41 avec sa restriction centrale 42 et la zone de mélange amont 46. La figure 12b est une photographie de la puce 69. La figure 12c montre une image en fluorescence de la région d'intérêt (ROI en anglais) définie sur la figure 12a à un instant donné de la préconcentration sélective d'une sonde fluorescente. On y voit aussi l'allure de l'intensité le long du microcanal au cours du temps (les courbes plus claires correspondent aux temps les plus longs).
Comme montré sur la figure 13, les canaux de mélange 46 peuvent comporter une partie commune de plus grande dimension constitutive d'un réservoir interne ou d'un réservoir virtuel mis en œuvre dans les modes de réalisations détaillés dans la Figure 11de plus grande taille que le microcanal 41. La composition de l'électrolyte, le potentiel électrique et la pression dans ces réservoirs internes est fonction des compositions des électrolytes, des potentiels électriques et des pressions appliqués dans les réservoirs réels dont le nombre peut être supérieur à 2. Il est aussi représenté la zone de détection nécessaire au suivi de la préconcentration sélective. Les moyens de détection doivent donc couvrir une zone de détection correspondant à l'ensemble du microcanal où a lieu la préconcentration.
La figure 14 montre, en coupe, un schéma détaillé de réalisation des connexions entre un dispositif selon un cinquième mode de réalisation de l'invention et les moyens de génération d'une pression contrôlable.
Un dispositif 70 selon ce mode de réalisation comporte un microcanal central rectiligne 71 encastré dans une puce 72 et dont chacune des extrémités est connectée à un réservoir 73 débouchant sur la face supérieure du bloc. Ce bloc 72 est inséré entre une plaque métallique 74 est une membrane d'étanchéité 75 comportant des ouvertures dont la position correspond à celle desdits réservoirs 73. La plaque métalliques comporte autant d'alésage 79 que d'ensembles vis écrous 79 nécessaires au maintient de la structure. Elle est de plus percée en son centre afin de permettre l'observation du microcanal central à l'aide d'un objectif de microscope, par exemple, 81. Une pièce parallélépipédique 76 en plexiglas est disposée au dessus de la membrane d'étanchéité 75. Cette pièce 76 comporte des alésages 77 aptes à prolonger les conduits formés par chacun des réservoirs et de l'ouverture dans la membrane qui lui est associé. Des ensembles vis-écrou 80 assurent le plaquage du bloc 72 contre la membrane via des alésages coaxiaux 78 et 79, pratiqués respectivement dans la pièce parallélépipédique 76 et dans la plaque métallique 74. Deux pipes de raccordement 83 solidaire de la pièce parallélépipédique 76 en plexiglas relient chacune l'un des premiers alésages 77 à un tuyau en plastique 55 raccordé aux moyens 50 de génération d'une pression contrôlable. Des moyens 81 de détection et de détermination de la concentration en molécule dans le microcanal, en amont et en aval du rétrécissement 82 sont associés au dispositif 70. Dans cet exemple de réalisation, ces moyens de détection sont constitués par un microscope à épifluoresceπce et par une caméra CCD, ces moyens permettant d'effectuer des mesures de préconcentration de molécules fluorescentes chargées (Fluorescéine).
Le fonctionnement des dispositifs précédemment décrits est le suivant :
Un échantillon de molécules à analyser est mélanger à une solution électrolytique, par exemple un tampon phosphate, et introduite ensuite dans l'un au moins des réservoirs. Tandis qu'une ou plusieurs solutions identiques ou non à la solution à analyser est introduite dans le ou les autres réservoirs.
Ensuite une différence de potentiel est générée, via les sources de tension contrôlables, entre les différents réservoirs. Cette différence de potentiel génère un champ électrique parallèle à l'axe longitudinal X du microcanal.
Cette différence de potentiel génère un déplacement des particules à analyser contenues dans la solution à l'intérieur du réseau microfluidique et notamment à l'intérieur du microcanal central rectiligne. Ce déplacement est fonction de la vitesse électrophorétique des molécules à analyser et de la vitesse propre du liquide. Au passage de la zone de variation de charge de surface volumique, la vitesse électrophorétique des particules subit une brutale variation. Si cette variation est suffisante pour annuler la vitesse totale de la particule, cette dernière se préconcentre. Sinon cette particule poursuit sa course. En présence d'un champ électrique, seul le flux électroosmotique est à même de déplacer le liquide. Le débit de liquide ne varie donc pas et seul une gamme électrophorétique de molécules pourront être préconcentrées de cette manière. Il est donc indispensable de faire varier le débit de liquide indépendamment du champ électrique.
Dans le cadre de l'invention, un gradient de pression est en outre généré, via les moyens de génération d'une pression contrôlable, entre les différents réservoirs. De cette façon, le débit de liquide est modifié dans le canal de préconcentration indépendamment du champ électrique et la gamme électrophorétique de particules préconcentrées est modifiée. L'application d'un gradient de pression continu croissant en fonction du temps permet ainsi de préconcentrer successivement les différentes molécules électriquement chargées contenues dans la solution à analyser.
On constate donc qu'il est possible de discriminer la préconcentration des molécules présentes dans la solution à analyser en fonction de leur vitesse électrophorétique et ce, en superposant une différence de potentiel et en faisant varier ledit gradient de pression. Ainsi, seule une gamme électrophorétique de molécules se préconcentre dans la partie microfluidique.
La préconcentration sélective peut avoir lieu en amont ou en aval de la restriction centrale. Elle est suivie à l'aide d'un système de détection situé sur l'ensemble du canal central afin de déterminer les différentes espèces présentes dans l'échantillon et leur taux. Si, par exemple, l'intensité en fluorescence est le paramètre de détection de la concentration locale, cette intensité sera mesurée en fonction d'un nombre de variables d'entrée qui peut être faible (en ne faisant varier la pression seulement dans le réservoir ou se trouve l'échantillon à analyser), ou au contraire important (en faisant varier pression et potentiel électrique dans les différents réservoirs). Dans ce dernier cas, l'analyse multidimensionnelle de l'intensité enregistrée se fera à l'aide d'outils d'analyse numériques plus complexes afin de déterminer le nombre d'espèces présentes et leur taux.
Un dispositif selon l'invention permet de définir des zones de préconcentration sous forme de bandes qui peuvent être moyennées dans la largeur et la hauteur du microcanal central. La figure 15 montre les taux de préconcentration obtenus dans le cadre dîun dispositif selon le mode de réalisation décrit par la figure 11. Dans ce cas de figure, les 4 réservoirs sont remplis par une solution de 1mM de KCI contenant les analytes de mobilités électrophorétiques (m.e.) respectivement égales à 0.25, 0.5, 0.75, 1 et 1.25 fois celle de la sonde fluorescente utilisée pour les expériences de préconcentration présentées en Figure 12c. Ici, on rapporte le taux de préconcentration maximal sur l'ensemble du microcanal en fonction du gradient de pression appliqué ΔP. Dans ces expériences, V1=V2=0 et V3=V4=50V, alors que P1=P2=0 bar et P3=P4=ΔP. On voit que ces différentes molécules se préconcentrent pour différentes valeurs de ΔP ce qui permet de coupler les étapes de préconcentration et de séparation.
Dans la figure 15B, on rapporte le taux de préconcentration en fonction du gradient de pression imposé à travers le même microcanal central et de la concentration en KCI de l'électrolyte. Dans ce cas, seul un analyte (m.e. = 1 relativement à la figure 15A) est étudié. On s'aperçoit ici que cette molécule possède une signature constituée de trois zones de préconcentrations. Grâce au mode de réalisation détaillé dans la Figure 14 qui permet de faire varier la concentration ionique, le pH, la pression et le potentiel électrique à l'entré du microcanal de préconcentration, il est ainsi possible d'effectuer une analyse multidimensionnel d'un échantillon (chaque molécule aura une signature de préconcentration propre par rapport à ces différents paramètres de contrôles externes). Ainsi, il sera possible « d'étendre » la signature en préconcentration avec le nombre de paramètres que l'on fera varier dans les réservoirs d'entrée de la puce. Cependant, il est aussi possible, non pas « d'étendre » la signature d'un analyte à l'aide d'une analyse multidimensionnelle, mais d'affiner cette dernière à l'aide d'une structuration de la charge de surface volumique plus complexe qu'une simple marche.
La figure 16A présente un exemple de réalisation dans lequel un même microcanal 108 et connecté à chacune de ses extrémités 117, 118 à un réservoir, respectivement 109, 110 et comporte plusieurs moyens successifs aptes à générer une variation de la charge de surface volumique. Chacun des réservoirs 96, 110 est raccordé à des moyens 120, 121 de génération d'une pression contrôlable. Dans cet exemple de réalisation, ces moyens sont constitués par quatre électrodes 111 , 112, 113 et 114 situées sous une couche isolante (SU8 ou SiO2 par exemple). L'application d'un potentiel électrique différent à ces électrodes permet de modifier le potentiel de surface grâce à un effet capacitif (cf. article de Van der Wouden), donc la charge de surface effective. La puce est réalisée à l'aide de la technique Verre- PDMS-Verre décrite dans la figure 9B et présente a priori des dimensions semblables à celle de la figure 9A. Une différence de potentiel électrique est généré entre les deux extrémités 117, 118 du microcanal via les moyens 119 de génération d'une tension tandis qu'une surpression est générée dans le réservoir 96 via les moyens 120, 121 de génération d'une pression contrôlable. La figure 16B montre, pour deux surpressions différentes appliquées au niveau du réservoir 109, la vitesse d'un analyte chargé comportant une certain mobilité électrophorétique. On constate que cette vitesse est d'abord constante jusqu'à ladite zone amont 115 puis varie par pallier au niveau de chaque variation de charge de surface volumique, et ce jusqu'à la zone 1 16 correspondant au quatrième revêtement. La vitesse redevient constante en aval desdits revêtements et sa valeur est égale à celle de cet analyte en amont desdits revêtements. On constate que pour chacune des deux surpressions, la vitesse de l'analyte est, à un certain endroit, égale à zéro, et que cet endroit varie en fonction de la valeur de la surpression. Ces endroits où la vitesse de l'analyte est égale à zéro sont ceux où se produit sa préconcentration et donc sa séparation des autres analytes. L'utilisation d'une succession de changement de charge de surface volumique permet de créer une succession de gradients ioniques. Dans ce cas, la zone de préconcentration pourra subir une série de décalage lorsque la surpression sera augmentée ou diminuée. La présence dans un même microcanal de plusieurs moyens successifs aptes à générer une variation de charge de surface volumique permet d'accroître la sélectivité du dispositif.
La figure 17B représente des résultats de simulation numérique obtenue avec un dispositif comportant les mêmes éléments que ceux de la figure 16A excepté un microcanal 130 de 0,5 μm de hauteur, une charge de surface de -0,1 mC/m2 et possédant cinq moyens successifs 131 , 132, 133, 134 et 135 aptes à générer des variations brutales de charge de surface volumique produisant respectivement 5 zones de charges surfaciques successives de -1 mC/m2, -2 mC/m2, -3 mC/m2 , -4 mC/m2 et -5mC/m2 (gauche verre la droite). La longueur totale du microcanal fait 5,4 mm et chaque zone fait 0.2 mm de longueur. La concentration en ions (électrolyte 1 :1 KCI) est de 1 mM. La figure rapporte la concentration d'une molécule tierce (valence = -2, coefficient de diffusion = 2,72e-10 m2/s) le long du microcanal en fonction du temps quand un gradient de pression décroissant (de 1 bar à une surpression nulle) est imposé dans le réservoir de gauche. On y voit qu'une préconcentration se crée au niveau de la cinquième zone et la diminution progressive de la concentration résulte en un déplacement progressif de cette zone de préconcentration.
Lorsqu'une seconde espèce de mobilité très proche est ajoutée, on voit, sur la figure 18 B, que l'analyse temporelle de la concentration locale permet de distinguer très clairement les deux molécules. Pour comparaison, la même séparation a été menée dans le cas d'une unique zone de charge de surface -5 mC/m2 comme montré sur la figure 19A. Les résultats de cette séparation sont présentés sur la figure 19B. Il est clair, en comparant les deux figures 18B et 19B que la géométrie de la Figure 18B permet de mieux discriminer deux analytes de mobilité proche. Dans la figure 20 est représenté le gradient ionique obtenu lors de l'expérience de préconcentration sélective de la figure 18B. Il est donc possible de créer des gradients ioniques stables et de les adapter à la résolution nécessaire en changeant simplement la charge de surface volumique le long du microcanal central par paliers successifs.
Dans tous les cas, et pour une géométrie et un matériau des réservoirs et du ou des microcanaux donnée et pour des moyens donnés de variation de la charge volumique, la détermination de ladite différence de potentielle et dudit gradient à appliquer est faite au préalable expérimentalement pour chaque analyte susceptible d'être recherché.
Bien évidemment, de nombreuses modifications peuvent être apportées sans sortir du cadre de l'invention. Dans les variantes de réalisation décrites précédemment, l'analyse du lieu et du taux de préconcentration se fait sur une puce ne comportant qu'un seul microcanal de préconcentration. Evidemment, plusieurs microcanaux de préconcentrations, présentant des variations de charge de surfaces volumiques en leur partie médiane différentes pourront être utilisés en parallèles depuis les mêmes réservoirs ou d'autres réservoirs. Il est aussi possible d'envisager de connecter ces microcanaux de préconcentration les uns aux autres, constituant ainsi un réseau 2D de microcanaux de préconcentrations par charge de surface volumique comme montré sur la figure 21. Ce réseau est constitué, dans cet exemple de réalisation par 6 canaux C1 à C6 disposés parallèlement entre eux en lignes. Chacun de ces canaux comporte 5 moyens M1 , M2, M3, M4 et M5 aptes à générer dans le microcanal au moins une variation de la charge de surface volumique. En outre, ces canaux sont interconnectés entre eux de sorte à former un second réseau de canaux C7, C8, C9, C10, C11 , C12, chacun de ces canaux parallèles entre eux et en colonne. Chacun de ces canaux comporte 5 moyens M6, M7, M8, M9 et M 10 aptes à générer dans le microcanal au moins une variation de la charge de surface volumique. Les quatre extrémités du réseau de canaux ainsi formé sont chacune connectées à un réservoir R1 , R2, R3 et R4 auquel sont associés des moyens de génération d'une tension contrôlable et des moyens de génération d'une pression contrôlable Les zones où se rejoignent ces microcanaux constituent ainsi autant de « réservoirs virtuels » tels que définis dans la figure 14, au niveau desquels la composition de l'électrolyte, le potentiel électrique et la pression dépendra de la composition des électrolytes, du potentiel électrique et de la pression appliquée dans chaque réservoir ainsi que de la géométrie du réseau microfluidique. L'analyse de l'intensité de préconcentration au niveau de chaque barrière ionique due à la variation de charge de surface volumique (provoquée par une variation de la section et/ou de la charge de surface) permettra d'observer des signatures de préconcentration propres à chaque molécule. Enfin, cette figure montre, en pointillés, la zone Z nécessaire au suivi de la préconcentration sélective. Les moyens de détection doivent donc couvrir une zone de détection correspondant à l'ensemble du microcanal où a lieu la préconcentration.
Par ailleurs, la sélectivité d'une telle invention peut encore être accrue en superposant, à un dispositif selon l'invention, des moyens aptes à générer un gradient de pH à travers une telle structure. Il suffira pour cela d'utiliser des électrolytes supports présentant des pH différents au niveau des réservoirs réels.
En outre, un procédé selon l'invention peut par exemple comporter une étape préalable connue de marquage de l'analyte à détecter afin de faciliter sa détection. Par exemple, l'ajout d'anticorps fluorescent à un analyte permettra de déterminer la présence d'antigènes et le nombre de variantes de ce dernier. S'il n'y a pas d'antigène, on ne retrouvera la signature de préconcentration que de l'anti-corps fluorescent seul. Si au contraire cet anticorps se complexe à un analyte, sa signature de préconcentration sera modifier et on la retrouvera dans l'analyse des figures de préconcentration, quelles soient uni ou multidimensionnelles.
Par ailleurs, le canal de mélange peut être aussi par exemple constitué par un serpentin de mélange ou tout autre géométrie apte à permettre le mélange des liquides provenant des divers réservoirs.

Claims

REVENDICATIONS
1. Dispositif de préconconcentration sélective / détection d'analytes chargées contenues dans un électrolyte comportant au moins deux réservoirs (21 , 22, 53, 48, 104, 96, 110 ,105) séparés par au moins un microcanal (23, 31 , 41 , 100, 108) sans intersection d'axe longitudinal X et préférablement rectiligne, et comportant au moins une source de tension contrôlable (25, 39, 60, 106) apte à générer une différence de potentiel entre les extrémités dudit microcanal (23, 31 , 41 , 100) , dispositif caractérisé en ce que le dispositif comporte des moyens (27, 28, 51 , 59) de génération d'une pression contrôlable associés à au moins l'un des réservoirs (21 , 22, 53, 48, 104, 96, 110 ,105) et aptes à générer un gradient de pression entre les deux extrémités dudit microcanal (23, 31 , 41 , 100, 108) et en ce que ce dernier comporte, dans sa partie médiane, au moins une première partie présentant une charge de surface volumique constante suivie par une seconde partie comportant des moyens (101 , 32, 24, 42,111, 112, 113, 114) aptes à générer au moins une variation de la charge de surface volumique par rapport à celle de la première partie, le dispositif étant apte à concentrer sélectivement les analytes chargées dans le microcanal (23, 31 , 41 , 100, 108), en amont et/ou aval de ces moyens (101 , 32, 24, 42,111 , 112, 1 13, 114).
2. Dispositif selon revendications 1 , caractérisé en ce que les moyens aptes à générer au moins une variation de la charge de surface volumique sont aptes à générer selon ledit axe longitudinal X, une variation de la charge de surface en forme de marche.
3. Dispositif selon revendications 1 , caractérisé en ce que les moyens aptes à générer au moins une variation de la charge de surface volumique sont aptes à générer, pour un électrolyte tampon PBS 1mM à pH7, une variation de charge de surface volumique supérieure ou égale à 10 000 C/m3.
4. Dispositif selon revendications 1 , caractérisé en ce que les moyens (101 , 32, 24, 42,111 , 112, 1 13, 114) aptes à générer au moins une variation de la charge de surface volumique sont aptes à la générer sur une longueur, selon l'axe X, inférieure à 10 μm.
5. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le microcanal (23, 31 , 41 , 100, 108) comporte au moins une face et en ce les moyens (101 , 32, 24, 42,111 , 112, 113, 114) aptes à générer au moins une variation de la charge de surface volumique sont constitué par :
- Au moins un revêtement (24) , une partie seulement de la surface de la partie médiane du microcanal (23, 31 , 41 , 100, 108) étant recouverte par un revêtement différent de celui du reste de la partie, et/ou
- des multicouches de poly-électrolytes chargés, et/ou
- toute forme de polymère ou substance que l'on puisse déposer sélectivement sur une partie seulement de la surface de la partie médiane du microcanal et présentant une charge de surface différente du reste de la partie, et/ou - un traitement chimique appliqué à une partie seulement de la surface de la partie médiane du microcanal et lui conférant une charge de surface différente du reste de la partie et/ou un rétrécissement (32, 42) de la section du microcanal sur une partie seulement de la partie médiane du microcanal, et/ou - des moyens aptes à générer un changement de potentiel de surface sur une partie seulement de la surface de la partie médiane du microcanal à l'aide par exemple d'un champ radial dans la partie médiane du microcanal et comportant, par exemple, au moins une d'interface métal-isolant-électrolyte.
6. Dispositif selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu'il comporte au moins deux microcanaux (C1, C2, C3, C4, C5, C6) disposés parallèlement et comportant chacun, dans sa partie médiane, des moyens (M1 , M2, M3, M4, M5) aptes à générer au moins une variation de la charge de surface volumique et dont au moins une des extrémités de l'un des canaux et relié par un microcanal (C7, C8, C9, C10, C11 , C12) à l'une des extrémités de l'autre microcanal.
7. Dispositif selon la revendication 6, caractérisé en ce que ces au moins deux microcanaux présentent des moyens (M1 , M2, M3, M4,- M5) aptes à générer au moins deux variations de la charge de surface volumique différentes en intensité et/ou en localisation.
8. Dispositif selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comporte un réseau entrecroisé de canaux (C1 , C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11 , C12) présentant chacun entre chaque croisement des moyens (M1 , M2, M3, M4, M5, M6, M7, M8, M9, M10) aptes à générer au moins une variation de la charge de surface volumique, préférentiellement différentes en intensité et/ou en localisation entre canaux.
9. Dispositif selon revendications 1 et 8 caractérisé en ce qu'il comporte des moyens de détection des analytes aptes à mesurer leur concentration locale sur l'ensemble du microcanal ou réseau de microcanaux au cours du temps.
10. Dispositif selon revendication 9, caractérisé en ce qu'il comporte des moyens de collecte et de traitement des données issues desdits moyens de détection, et permettant de déterminer le nombre et la concentration des analytes contenus dans l'électrolyte.
11. Dispositif selon l'une quelconque des revendication 1 à 10, caractérisé en ce qu'au moins l'une des extrémités dudit microcanal (23, 31 , 41 , 100, 108) est connecté à un canal de mélange, pouvant notamment comporter un réservoir interne (46), ou un serpentin de mélange.
12. Procédé de préconcentration sélective / détection à l'intérieur d'un microcanal sans intersection d'au moins un type d'analyte tel par exemple des molécules, des complexes de molécules ou de particules, des cellules ou tout objet présentant une mobilité électrophorétique (bactérie, spore, virus, etc..) contenus dans un électrolyte et mis en œuvre par un dispositif comportant au moins deux réservoirs reliés par au moins ledit microcanal sans intersection et une source de tension contrôlable (25, 39, 60, 106) apte à générer une différence de potentiel entre les extrémités dudit microcanal (23, 31 , 41 , 100) et des moyens (27, 28, 51 , 59) de génération d'une pression contrôlable associés à au moins l'un des réservoirs (21 , 22, 53, 48, 104, 96, 110 ,105) et aptes à générer un gradient de pression entre les deux extrémités dudit microcanal, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : remplir au moins en partie un premier réservoir avec un électrolyte comportant les analytes à préconcentrer sélectivement, remplir au moins un second réservoir, disposé par rapport : au premier réservoir de l'autre côté d'au moins un microcanal rectiligne comportant des moyens aptes à générer au moins une variation de la charge de surface volumique, avec une solution tampon contenant ou non les objets de l'analyse, générer une variation de charge de surface volumique dans la partie médiane du microcanal avec des moyens de génération d'une variation de charge de surface volumique, ainsi qu' une différence de potentiel entre les extrémités dudit microcanal par la source de tension contrôlable et qu' un premier gradient de pression entre les extrémités dudit microcanal par les moyens de génération d'une pression contrôlable, cette différence de potentiel et cette pression étant apte à concentrer cet analyte à l'intérieur dudit microcanal, en et en amont ou en aval de la variation de charge volumique.
13. Procédé selon la revendication 12 de préconcentration sélective / détection d'au moins un premier et un second types d'analytes, caractérisé en ce qu'il comporte une génération d'une variation de charge de surface volumique d'au moins 10OOOC/m3.
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 de préconcentration sélective / détection d'au moins un premier et un second types d'analytes, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes :
- remplir au moins en partie un premier réservoir avec un électrolyte comportant les analytes à préconcentrer sélectivement, - remplir au moins un second réservoir, disposé par rapport au premier réservoir de l'autre côté d'au moins un microcanal rectiligne comportant des moyens aptes à générer au moins une variation de la charge de surface volumique, avec une solution tampon contenant ou non les objets de l'analyse,
- générer une variation de charge de surface volumique dans la partie médiane du microcanal avec des moyens de génération d'une variation de charge de surface volumique, ainsi qu' une différence de potentiel entre les extrémités dudit microcanal par la source de tension contrôlable et qu' un premier gradient de pression entre les extrémités dudit microcanal par les moyens de génération d'une pression contrôlable, cette différence de potentiel et cette pression étant apte à concentrer le premier analyte à l'intérieur dudit microcanal, en et en amont ou en aval de la variation de charge volumique, :
- générer une variation de charge de surface volumique dans la partie médiane du microcanal avec des moyens de génération d'une variation de charge de surface volumique, ainsi qu' une différence de potentiel entre les extrémités dudit microcanal par la source de tension contrôlable et qu' un premier gradient de pression entre les extrémités dudit microcanal par les moyens de génération d'une pression contrôlable, cette différence de potentiel et cette pression étant apte à concentrer le second analyte à l'intérieur dudit microcanal, en et en amont ou en aval de la variation de charge volumique.
15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, caractérisé en ce qu'il comporte en outre les étapes suivantes : mesurer pour chaque gradient de pression la concentration locale en analytes, déterminer, à partir de la mesure de concentration locale en analyte pour les différents gradients de concentration le nombre et la concentration des analytes présents dans la solution initiale.
16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 15, caractérisé en ce qu'il comporte une étape consistant à appliquer un gradient de pression variant continûment entre deux valeurs extrêmes.
17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 16, caractérisé en ce qu'il comporte une étape de mesure en continu de la concentration locale en analyte.
18. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 17, caractérisé en ce qu'il comporte une étape consistant à appliquer, via ladite au moins une source de tension contrôlable, au moins une seconde différence de potentiel entre au moins lesdits premier et second réservoirs et/ou au moins une différence de composition des électrolytes dans les réservoirs du dispositif
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