FR2933713A1 - Procede et dispositif de manipulation et d'observation de gouttes de liquide - Google Patents

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Abstract

L'invention concerne un dispositif et un procédé de manipulation et d'observation de particules en suspension dans un liquide. Le dispositif comporte : - un premier substrat (12) comportant au moins un premier orifice (21) formant site d'entrée dudit liquide, - un site d'observation (100) pour observer les particules en suspension, et - des moyens de déplacement du liquide dudit site d'entrée (21) audit site d'observation (100). Selon l'invention, le premier substrat (12) comportant une première couche hydrophobe (52), le liquide étant électriquement conducteur, lesdits moyens de déplacement du liquide sont adaptés à déplacer ledit liquide sous forme de goutte (F1) par électromouillage, ladite goutte (F1) étant en contact avec ladite couche hydrophobe (52).

Description

SP 33141 DJB 1 PROCEDE ET DISPOSITIF DE MANIPULATION ET D'OBSERVATION DE GOUTTES DE LIQUIDE
DESCRIPTION DOMAINE TECHNIQUE La présente invention se rapporte au domaine général de la microfluidique et concerne un procédé et un dispositif de manipulation et d'observation en parallèle de particules en suspension contenues dans des gouttes de liquide pour les analyser. ETAT DE LA TECHNIQUE ANTERIEURE Dans le domaine pharmacologique, il est nécessaire d'analyser l'effet d'un nombre très important de composés chimiques et biologiques sur des cibles biologiques. Par exemple, il peut s'agir d'étudier l'action de différentes drogues ou toxines sur un type de cellule. La technique d'analyse par criblage à haut débit est habituellement utilisée puisqu'elle permet de conduire quelques milliers voire millions de tests en un temps relativement court dans le but de sélectionner les réactifs produisant les effets recherchés. Pour cela, il est courant d'utiliser des plaques à puits, comportant par exemple 96, 384 ou 1536 puits. Ces plaques permettent de mettre en contact dans chaque puits, par exemple, un réactif différent avec un type de cellule déterminée.
SP 33141 DJB 2 L'observation peut ensuite être réalisée par microscopie confocale qui permet d'observer par fluorescence la réponse des cellules au stimulus provoqué par le réactif testé.
Cependant, le temps de balayage du microscope pour repérer les cellules à observer est directement lié au volume des puits et peut être, selon la concentration des cellules, relativement long, ce qui est contraire à l'exigence de rapidité du criblage à haut débit.
De plus, le volume des puits conduit à utiliser une quantité importante de réactif par plaque. Par exemple, une plaque comportant 1536 puits dont le volume est de l'ordre de quelques microlitres conduit à utiliser quelques millilitres de réactif. Le coût engendré est alors particulièrement important du fait du grand nombre de tests à effectuer. Récemment, des améliorations ont été entreprises pour manipuler et observer des faibles volumes de réactifs.
Ainsi, le document US-A1-2007/0243523 décrit un dispositif de manipulation et d'observation de particules en suspension dans le but de les analyser. Les figures 1A et 1B représentent schématiquement le dispositif selon l'art antérieur suivant une coupe longitudinale (figure 1A) et en vue de dessus (figure 1B). Comme le montre la figure 1A, le dispositif microfluidique comprend un substrat A10 dans lequel est formé un microcanal A15.
Une plaque à puits A90 repose sur une face externe du substrat A10, et comprend au moins un puits d'entrée SP 33141 DJB 3 A91 et un puits de sortie A94, chacun présentant une ouverture A95 au fond du puits. Les puits d'entrée A91 et de sortie A94 sont reliés l'un à l'autre par le microcanal A15 du substrat A10.
Le puits d'entrée A91 forme un réservoir A91 pouvant contenir des particules en suspension, par exemple des cellules en solution dans une toxine liquide. Le puits de sortie A94 peut être un réservoir d'évacuation.
Un capot amovible A130 de mise en pression est disposé sur les puits d'entrée A91 et de sortie A94 pour contrôler le débit de l'écoulement dans le microcanal A15. Pour cela, une pression positive ou négative est appliquée à l'interface liquide/air dans les puits d'entrée A91 et de sortie A94. Un gradient de pression est alors créé à l'intérieur du microcanal A15 qui provoque la mise en mouvement du liquide, et ainsi des particules en suspension. Le capot A130 est relié par des flexibles A131 à une source de pression (non représentée). La source de pression est commandée par ordinateur pour contrôler la valeur du gradient de pression généré et donc l'intensité du débit dans le microcanal A15. Le liquide peut alors être mis en mouvement, arrêté, ou déplacé selon un débit déterminé. Enfin, une partie du microcanal A15 forme un site d'observation A100 au travers duquel passent les particules à observer. Un dispositif d'observation (non représenté) disposé en regard du site d'observation A100 permet de réaliser une séquence d'images. Ce dispositif d'observation peut être un microscope SP 33141 DJB 4 optique, à fluorescence, à contraste de phase ou encore confocal. Le fonctionnement du dispositif selon l'art antérieur est le suivant.
Par l'application d'un gradient de pression dans le microcanal A15, un écoulement est généré qui fait circuler les particules en suspension du puits d'entrée A91 vers le puits de sortie A95. Lorsque les particules sont présentes dans le site d'observation A100, l'écoulement est arrêté pour permettre la réalisation d'une séquence d'images par le dispositif d'observation. Puis l'écoulement est repris et d'autres particules en suspension sont introduites dans le site d'observation A100 pour réaliser la séquence d'images suivante. La géométrie et la taille du microcanal A15 et donc du site d'observation A100 permettent de réduire le temps de balayage du microscope utilisé. Le dispositif microfluidique selon l'art antérieur présente cependant un certain nombre d'inconvénients liés au mode de déplacement du liquide contenant les particules en suspension. D'une part, le volume de liquide mis en mouvement reste élevé. Il est de l'ordre de la contenance du puits d'entrée A91, soit quelques microlitres. En effet, la création du gradient de pression dans le microcanal A15 provoque le déplacement de l'ensemble du liquide contenu dans le puits d'entrée A91. En outre, il n'est pas possible de mettre en 30 mouvement une quantité déterminée de liquide, SP 33141 DJB 5 inférieure au volume initial du liquide dans le puits d'entrée A91. D'autre part, le fait que les particules en suspension soient déplacées dans un microcanal A15 ne permet pas de contrôler le déplacement de manière localisée des particules en suspension. En effet, par conservation du débit, le déplacement du liquide en aval influe nécessairement sur le liquide situé en amont, ainsi que sur le liquide situé dans des canaux affluents. En outre, il n'est pas possible de réaliser un réseau fluidique complexe de microcanaux, c'est-à-dire comportant un grand nombre de microcanaux principaux et d'affluents. La gestion des gradients de pression appliqués est particulièrement compliquée. Aussi, le dispositif selon l'art antérieur est limité à un microcanal principal sans affluent, voire avec peu d'affluents. Par ailleurs, le microcanal A15 peut comporter des zones de recirculation A16 dans lesquelles les particules peuvent être piégées. Il s'agit notamment des zones où les parois du microcanal forment une arête concave. Les particules peuvent s'y accumuler et ainsi perturber l'écoulement.
EXPOSÉ DE L'INVENTION L'invention concerne d'abord un procédé de manipulation et d'observation de particules en suspension dans un liquide.
Selon l'invention, le procédé comporte les étapes suivantes .
SP 33141 DJB 6 - la mise en contact d'un premier liquide avec une surface hydrophobe, - la formation d'une première goutte à partir du premier liquide puis le déplacement de ladite goutte par électromouillage afin de l'amener sur un site d'observation, ladite première goutte étant en contact avec ladite surface hydrophobe, - l'observation des particules contenues dans ladite première goutte.
Le procédé peut comporter en outre, avant ladite étape d'observation des particules, une étape de mélange de ladite première goutte avec une seconde goutte d'un second liquide. La goutte est, de préférence, confinée lors de son déplacement entre ladite surface hydrophobe et un substrat disposé en regard de la surface hydrophobe. Avantageusement, la goutte est formée à partir d'un orifice traversant ladite surface hydrophobe ou ledit substrat, ledit orifice communiquant avec un puits d'une plaque à puits. Le volume de la goutte peut être compris entre 0, lnl et 10111. Ladite première goutte de liquide comprend, de préférence, des cellules de types différents, ou au moins un type de cellules et un type de toxine. La concentration en particules de ladite première goutte peut être comprise entre 50 et 5000 particules par microlitre. L'invention concerne également un dispositif de 30 manipulation et d'observation de particules en suspension dans un liquide comportant : SP 33141 DJB 7 - un premier substrat comportant au moins un premier orifice formant site d'entrée dudit liquide, - un site d'observation pour observer les particules en suspension, et - des moyens de déplacement du liquide dudit site d'entrée audit site d'observation. Selon l'invention, le premier substrat comportant une première couche hydrophobe, le liquide étant électriquement conducteur, lesdits moyens de déplacement du liquide sont adaptés à déplacer ledit liquide sous forme de goutte par électromouillage, ladite goutte étant en contact avec ladite première couche hydrophobe. De préférence, le premier orifice traverse ledit 15 premier substrat de manière sensiblement orthogonal. Selon un mode de réalisation, les moyens pour déplacer ladite goutte, par électromouillage, comportent : - une pluralité d'électrodes entre ladite première 20 couche hydrophobe et ledit premier substrat, - une couche diélectrique entre ladite première couche hydrophobe et ladite pluralité d'électrodes, - au moins une contre-électrode en contact 25 électrique avec la goutte de liquide, et - un générateur de tension pour appliquer une différence de potentiel entre les électrodes et ladite contre-électrode. De préférence, le dispositif comprend un second 30 substrat disposé en regard du premier substrat.
SP 33141 DJB 8 Le second substrat peut être recouvert d'une seconde couche hydrophobe en regard de ladite première couche hydrophobe, ladite contre-électrode étant située entre ladite seconde couche hydrophobe et ledit second substrat. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le dispositif comprend un second substrat disposé en regard du premier substrat et recouvert d'une seconde couche hydrophobe en regard de ladite première couche hydrophobe. Les moyens pour déplacer ladite goutte, par électromouillage, comportent avantageusement : - une pluralité d'électrodes entre ladite seconde couche hydrophobe et ledit second substrat, - une couche diélectrique entre ladite seconde couche hydrophobe et ladite pluralité d'électrodes, - au moins une contre-électrode en contact électrique avec la goutte de liquide, - un générateur de tension pour appliquer une différence de potentiel entre les électrodes et ladite contre-électrode. Ladite contre-électrode est, de préférence, située entre ladite première couche hydrophobe et ledit premier substrat. Avantageusement, ledit premier orifice communique avec un premier puits disposé sur une face externe dudit premier substrat opposée à ladite première couche hydrophobe.
Avantageusement, ledit premier substrat comporte au moins un second orifice formant site d'entrée ou de SP 33141 DJB 9 sortie de liquide, ledit second orifice communiquant avec un second puits disposé sur une face externe dudit premier substrat opposée à ladite première couche hydrophobe.
De préférence, ledit puits est un puits d'une plaque à puits. De préférence, les moyens de déplacement par électromouillage comprennent des moyens pour former une goutte de liquide à partir dudit réservoir.
Avantageusement, le premier substrat et/ou le second substrat sont réalisés dans un matériau transparent. Avantageusement, les électrodes sont réalisées dans un matériau transparent.
De préférence, le dispositif comprend un dispositif d'observation pour observer les particules en suspension contenues dans ladite goutte située dans le site d'observation. Ledit dispositif d'observation peut comprendre un microscope confocal. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront dans la description détaillée non limitative ci-dessous.
BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS On décrira à présent, à titre d'exemples non limitatifs, des modes de réalisation de l'invention, en se référant aux dessins annexés, dans lesquels : Les figures 1A et 1B sont des représentations schématiques en coupe longitudinale (figure 1A) ou en vue de dessus (figure 1B) d'un dispositif de SP 33141 DJB 10 manipulation et d'observation de particules en suspension dans un liquide selon l'art antérieur ; Les figures 2A à 2C représentent le principe de fonctionnement de déplacement de gouttes par électromouillage, dans une configuration ouverte ; La figure 3 représente le principe de fonctionnement de déplacement de liquide par électromouillage, dans un dispositif de type fermé ou confiné pouvant être mis en oeuvre dans le cadre de l'invention ; La figure 4 est une représentation schématique en coupe longitudinale d'un dispositif selon le mode de réalisation préféré de l'invention ; La figure 5 est une vue de dessus du dispositif représenté dans la figure 4 ; Les figures 6A à 6C représentent le principe de formation d'une goutte à partir de liquide contenu dans le site d'entrée du dispositif selon l'invention ; Les figures 7 et 8 sont des représentations schématiques en vue de dessus de variante de réalisation de l'invention ; La figure 9 est une vue en coupe du dispositif selon la variante de réalisation représentée dans la figure 8 muni d'un dispositif d'observation des particules en suspension. EXPOSÉ DÉTAILLÉ D'UN MODE DE RÉALISATION PREFERE Un dispositif selon l'invention met en oeuvre un dispositif de déplacement de liquide, par électromouillage, ou plus précisément par électromouillage sur diélectrique.
SP 33141 DJB 11 Dans la description qui va suivre, les verbes recouvrir , être situé sur et être disposé sur n'impliquent pas ici nécessairement de contact direct. Ainsi, un matériau ou un liquide peut être disposé sur une paroi sans qu'il y ait de contact direct entre intermédiaire direct est directement le matériau et la paroi. Un matériau peut réalisé ainsi être présent. Le contact lorsque le qualificatif est utilisé avec les verbes précédemment cités. Le principe de l'électromouillage sur diélectrique mis en oeuvre dans le cadre de l'invention peut être illustré à l'aide des figures 2A - 2C, dans le cadre d'un dispositif de type ouvert.
Une goutte d'un liquide électriquement conducteur F1 repose sur un réseau d'électrodes 30, dont elle est isolée par une couche diélectrique 40 et une couche hydrophobe 50 (figure 2A). On a donc un empilement hydrophobe et isolant.
Le caractère hydrophobe de cette couche signifie que la goutte a un angle de contact, sur cette couche, supérieur à 90°. Elle est entourée d'un fluide diélectrique FD, et forme avec ce fluide une interface I.
Les électrodes 30 sont elles-mêmes formées en surface d'un substrat 11. Une contre-électrode 60, ici sous forme d'un fil caténaire, permet de maintenir un contact électrique avec la goutte F. Cette contre-électrode peut également être un fil enterré ou une électrode planaire dans le capot d'un système confiné.
SP 33141 DJB 12 Les électrodes 30 et la contre-électrode 60 sont connectées à une source de tension 70 permettant d'appliquer une tension U entre les électrodes.
Lorsque l'électrode 30(1) située à proximité de la goutte F1 est activée, à l'aide de moyens 81 de commutation dont la fermeture établit un contact entre cette électrode et la source de tension 80 via un conducteur commun 82, l'ensemble goutte sous tension FI, couche diélectrique 40 et électrode activée 30(1) agit comme une capacité.
Comme le décrit l'article de Berge intitulé Electrocapillarité et mouillage de films isolants par l'eau , C.R. Acad. Sci., 317, série 2, 1993, 157-163, l'angle de contact de l'interface de la goutte F1 en regard de l'électrode activée 30(1) diminue alors suivant la relation : coseI(U)=cose~°>+ 1 er U2 2e6
où e est l'épaisseur de la couche diélectrique 40, Er la permittivité de cette couche et 6 la tension de surface de l'interface de la goutte.
Dans le cas d'une tension alternative, la valeur de la fréquence est choisie de manière à excéder le temps de réponse hydrodynamique de la goutte F. La réponse de la goutte F1 dépend alors de la valeur efficace de la tension, puisque l'angle de contact dépend de la tension en U2.
Selon l'article de Bavière et al. intitulé
Dynamics of droplet transport induced by electrowetting actuation , Microfluid Nanofluid, 4, 2008, 287-294, il apparaît une pression électrostatique agissant sur l'interface I1r à proximité de la ligne de SP 33141 DJB 13 contact. Si cette pression électrostatique est appliquée de manière asymétrique, la goutte F1 peut alors être déplacée. Dans la figure 2A, l'activation de l'électrode 30(1) met la goutte en mouvement suivant la direction X. La goutte peut ainsi être éventuellement déplacée de proche en proche (figures 2B et 2C), sur la surface hydrophobe 50, par activation successive des électrodes 30(1), 30(2), etc., le long de la caténaire 60.
Il est donc possible de déplacer des liquides, mais aussi de les mélanger (en faisant s'approcher des gouttes de liquides différents), et de réaliser des protocoles complexes. Bien entendu, le raisonnement est identique pour assurer le déplacement de la goutte dans la direction (-X). La manipulation de la goutte se situe dans un plan, les électrodes pouvant en effet être disposées de manière linéaire, mais aussi en deux dimensions, définissant ainsi un plan de déplacement pour la goutte. La figure 3 illustre le phénomène de déplacement d'un liquide par électromouillage dans un dispositif de type fermé ou confiné pouvant être mis en oeuvre dans le cadre de l'invention. Des exemples de dispositifs mettant en oeuvre ce principe sont décrits dans l'article de Pollack et al. intitulé Electro-wetting-based actuation of droplets for integrated microfluidics , Lab Chip, 2002, 2, 96- 101.
SP 33141 DJB 14 Sur cette figure, les références numériques identiques à celles des figures 2A - 2C désignent les mêmes éléments. Une goutte de liquide conducteur F1 est confinée entre un substrat inférieur 11 contenant la pluralité d'électrodes 30 de contrôle, et un substrat supérieur 12 disposé en regard du substrat inférieur 11. La goutte F1 comporte une interface amont I1,R et une interface aval I1,A.
Une couche hydrophobe 52 recouvre de préférence le substrat supérieur 12. La contre-électrode 60 est ici une électrode planaire disposée entre la couche hydrophobe 52 et le substrat supérieur 12. Elle peut être un fil caténaire comme dans les figures 2A à 2C, ou un fil enterré. Le principe de fonctionnement dans ce type de dispositif est similaire à ce qui a été décrit précédemment. La ligne triple des interfaces amont I1,R et aval I1,A est mise en mouvement par l'activation successive des électrodes de contrôle 30, provoquant un mouvement d'ensemble de la goutte dans la direction X, ou (-X). Il est à noter que le fluide FD ne subit pas de mouvement d'ensemble dans le sens de déplacement de la goutte. En d'autres termes, le fluide FD n'est pas poussé par la goutte FI, comme ce serait le cas dans un microcanal, mais contourne la goutte qui se déplace. Il est à noter également que les électrodes 30 et la couche diélectrique 40 peuvent, de manière alternative, être situées entre la couche hydrophobe 52 SP 33141 DJB 15 et le substrat supérieur 12, la contre-électrode 60 étant alors située sous la couche hydrophobe 51 du substrat inférieur 11.
Le mode de réalisation préféré de l'invention est représenté sur les figures 4 et 5 qui montrent, en coupe longitudinale (figure 4) et en vue de dessus (figure 5), un dispositif microfluidique de manipulation et d'observation de particules en suspension dans une goutte de liquide. La coupe de la figure 4 est effectuée suivant le plan A-A représenté sur la figure 5. Sur ces figures, les références numériques identiques à celles de la figure 3 désignent les mêmes éléments. En référence à la figure 4, le dispositif comporte un substrat inférieur 11 et un substrat supérieur 12, disposés en regard l'un de l'autre. Les deux substrats 11 et 12 sont montés l'un à l'autre par l'intermédiaire d'une cale d'espacement 13 qui permet de maintenir constant l'écartement entre les substrats 11, 12. La cale 13 s'étend le long de la périphérie de chaque substrat 11, 12. Le substrat supérieur 12 comporte avantageusement une pluralité d'orifices 21, 22, 23 et 24 (figure 5) formant sites d'entrée ou de sortie de liquide, traversant le substrat 12 de manière sensiblement perpendiculaire (figure 4). Par exemple, le substrat 12 comporte au moins un orifice 21 formant site d'entrée et de stockage de liquide contenant des particules à observer, au moins SP 33141 DJB 16 un orifice 22 formant site d'entrée d'agent actif. On utilise le terme agent actif pour désigner par exemple une toxine ou une drogue. Le substrat 12 peut comporter également au moins un orifice 23 formant site d'entrée de liquide tampon pour contrôler la concentration de particules dans les gouttes, et par exemple un orifice 24 formant site de sortie ou d'évacuation. Les orifices 21, 22, 23 et 24 peuvent communiquer avec des puits qui contiennent les liquides correspondants, respectivement 91, 92, 93 et 94 (figure 5), situés contre la face externe du substrat supérieur 12 opposée à la couche hydrophobe 52. La communication fluidique est assurée par l'intermédiaire d'une ouverture 95 disposée au fond du puits. Les orifices 21, 22, 23, 24 peuvent former ainsi des réservoirs. Les puits 91, 92, 93 et 94 sont avantageusement des puits d'une plaque à puits (8, 96, 384, 1586 puits) et peuvent être intégrés au dispositif selon l'invention.
Les substrats 11 et 12 peuvent être fixés au niveau de leur périphérie au mur périphérique 120 de la plaque à puits qui s'étend de manière perpendiculaire au plan des substrats, pour assurer un montage solidaire entre les orifices et les puits.
Avantageusement, un même puits peut communiquer avec plusieurs orifices. Dans ce cas, le puits présente alors un volume et une géométrie adaptée. Il comporte une pluralité d'ouvertures 95, chacune étant disposée en regard de l'orifice correspondant.
Dans ce mode de réalisation, la pluralité d'électrodes de contrôle 30 et la couche diélectrique SP 33141 DJB 17 40 sont situées entre la couche hydrophobe 52 et le substrat supérieur 12. Plus précisément, la pluralité d'électrodes 30 est en contact avec le substrat supérieur 12 et la couche diélectrique 40 recouvre ces électrodes. Comme le montre la figure 5, les électrodes 30 sont disposées de manière à former un réseau bidimensionnel. Ce réseau d'électrodes 30 permet de déplacer des gouttes de liquide, de proche en proche, sur un plan, de les mélanger, et de les amener sur un site d'observation 100 pour observer les particules qu'elles contiennent. La figure 4 montre la contre-électrode 60 incorporée sous la couche hydrophobe 51 du substrat inférieur 11. Elle peut avoir une structure bidimensionnelle de manière à assurer un contact électrique avec les gouttes en déplacement. Elle peut également être formée par un ensemble bidimensionnel de fils caténaires.
La source de tension 70, de préférence alternative, est connectée aux électrodes 30 et à la contre-électrode 60. La fréquence est avantageusement comprise entre 100Hz et 10kHz, de préférence de l'ordre de 1kHz, de manière à excéder le temps de réponse hydrodynamique des gouttes de liquide. Les ions éventuellement contenus dans le liquide n'ont alors pas le temps de migrer et de s'accumuler, selon leur charge, à proximité de l'électrode 30 activée. Ainsi, la réponse des gouttes dépend de la moyenne temporelle de la tension appliquée, ou plus précisément de la valeur efficace de celle-ci puisque l'angle de SP 33141 DJB 18 contact dépend de la tension en U2, selon la relation donnée précédemment. La valeur efficace peut varier entre OV et quelques centaines de volt, par exemple 200V. De préférence, elle est de l'ordre de quelques dizaines de volt. Des moyens permettent de commander ou d'activer les électrodes 30, par exemple un ordinateur type PC et un système de relais connectés au dispositif ou à la puce, tels les relais 81 de la figure 1A, ces relais étant pilotés par les moyens de type PC. Selon une variante de réalisation, la couche diélectrique 40 et les électrodes 30 peuvent être disposées sous la couche hydrophobe 51 du substrat inférieur 11, comme expliqué précédemment, la contre- électrode 60 pouvant alors être située entre la couche hydrophobe 52 et le substrat supérieur 12. Dans toute la description, on dira que la goutte formée peut être déplacée sur le plan de déplacement formé par le réseau d'électrodes 30, que les électrodes soient situées au niveau du substrat inférieur 11 ou supérieur 12. La figure 4 montre une goutte de liquide F1 contenant des particules à observer à proximité d'un orifice 21 et une deuxième goutte de liquide F2 à proximité d'un second orifice 22. La deuxième goutte contient alors un agent actif. Les particules à observer sont de préférence des cellules biologiques. La concentration en particules peut être comprise entre 50 et 5000 particules par microlitre, et est de préférence de 500 particules par microlitre environ.
SP 33141 DJB 19 Les gouttes sont entourées d'un fluide FD diélectrique, non miscible avec les liquides des gouttes F1 et F2. Le fluide FD peut être de l'air, une huile minérale ou silicone, un solvant perfluoré, comme du FC-40 ou du FC-70, ou encore un alcane comme de 1'undécane. Chaque goutte peut avoir un volume compris entre 0.1 et 100 nanolitres, et est de préférence de 0.2, 2, 8 ou 64n1.
Les gouttes peuvent donc être déplacées sur le réseau bidimensionnel d'électrodes 30 jusqu'à un site d'observation 100. Une pluralité de sites d'observation 100 peut être prévue dans le réseau d'électrodes 30. Le site d'observation 100 est une zone du dispositif selon l'invention par lequel il est possible d'observer le contenu de la goutte qui y est située. L'observation peut être effectuée au travers du substrat inférieur 11. Pour cela, les matériaux du substrat inférieur 11, de la couche hydrophobe 51 et de la contre-électrode 60 sont de préférence transparents. Elle peut alternativement être effectuée au travers du substrat supérieur 12. Pour cela, les matériaux du substrat supérieur 12, de la couche hydrophobe 52 et de l'électrode 30 située dans le site d'observation sont de préférence transparents. Il est avantageux que les matériaux de l'ensemble des composants qui viennent d'être cités soient transparents, pour permettre une observation au travers du substrat supérieur 12 ou inférieur 11, selon le choix de l'utilisateur ou les contraintes de l'environnement.
SP 33141 DJB 20 Le dispositif d'observation peut comprendre un microscope optique du type à lumière directe, à contraste de phase ou à fluorescence, ou encore à champ proche. Il peut également être un microscope confocal ou à tomographie numérique, ou un dispositif de microscopie holographique digitale. Il peut comprendre également une unité de gestion des prises de vues et de stockage de données, du type PC, pour ensuite post-traiter et analyser les séquences d'images réalisées. Comme il vient d'être dit, les substrats 11 et 12 sont réalisés de préférence en matériau transparent, par exemple en verre ou en polycarbonate. La cale d'espacement 13 peut préférentiellement être réalisée en film sec photo-imageable de type Ordyl, ce qui permet de contrôler précisément l'écartement entre les substrats inférieur 11 et supérieur 12. L'espacement entre le substrat inférieur 11 et le substrat supérieur 12 est typiquement compris entre 10pm et 500pm, et de préférence entre 50pm et 100pm. Les orifices 21, 22, 23 et 24 présentent un diamètre de quelques micromètres, compris par exemple entre 50pm et quelques millimètres. Ces orifices sont par exemple réalisés par lithographie et gravure sélective. En fonction des diamètres et des profondeurs à graver, on pourra utiliser la gravure sèche (attaque par gaz, par exemple SF6, dans un plasma). La gravure peut être également humide. Pour le verre (majoritairement SiO2) ou des nitrures de silicium, on peut utiliser les gravures à l'acide fluorhydrique ou SP 33141 DJB 21 phosphorique (ces gravures sont sélectives mais isotropes). La gravure peut être effectuée par ablation laser ou encore par ultrasons. Le micro-usinage peut également être utilisé, en particulier pour du polycarbonate. Ces orifices peuvent être en communication fluidique avec les puits de la plaque à puits, dont la contenance de chaque puits peut être comprise entre 1pl et 1ml.
Les électrodes 30 et contre-électrode 60 sont réalisées par dépôt d'un matériau transparent, par exemple de l'ITO, sur le substrat. Cette couche conductrice peut être pulvérisée ou réalisée en procédé sol-gel. Elle est ensuite gravée suivant un motif approprié, par exemple par gravure humide. L'épaisseur des électrodes est comprise entre 10nm et lpm, de préférence 300nm. Les électrodes 30 sont de préférence carrées avec un côté dont la longueur est comprise entre quelques micromètres à quelques millimètres, de préférence entre 50pm et Imm. La surface des électrodes 30 dépend de la taille des gouttes à transporter. L'espacement entre électrodes voisines peut être compris entre lpm et 10pm. La couche diélectrique 40 est réalisée par dépôt d'une couche de nitrure de silicium Si3N4, d'épaisseur, de manière générale comprise entre 100nm et lpm, de préférence de 300nm. Un procédé de dépôt chimique en phase vapeur assisté par plasma (PECVD) est préféré au procédé de dépôt en phase vapeur à basse pression (LPCVD) pour des raisons thermiques. En effet, la température du substrat n'est portée qu'entre 150°C et SP 33141 DJB 22 350°C (selon les propriétés recherchées) contre 750°C environ pour le dépôt LPCVD. Les couches hydrophobes 51 et 52 sont obtenues par dépôt par évaporation sous vide d'une couche de Téflon ou de SiOC, ou de parylène, sur les substrats inférieur 11 et supérieur 12. Cette couche permet notamment de diminuer voire d'éviter les effets d'hystérésis de l'angle de mouillage. Son épaisseur, d'une manière générale comprise entre 100nm et 5pm, est de préférence de 1pm. Les figures 6A à 6C représentent comment peut être formée une goutte à partir d'un puits 91, 92, 93 ou 94, ici à partir du puits 91. Le dispositif selon l'invention est représenté ici de manière très schématique. Certains composants n'apparaissent pas, de manière à simplifier les figures. Un liquide à dispenser est introduit dans l'orifice 21 formant site d'entrée à partir du puits 91 (figure 6A). Chaque orifice forme alors un réservoir. Les substrats inférieur et supérieur, représentés de manière schématique sur les figures 6A à 6C, sont par exemple similaires à la structure de la figure 4. Trois électrodes 31(1), 31(2), 31(3), similaires aux électrodes 30 de déplacement de gouttes de liquide, sont représentées sur les figures 6A à 6C. L'activation simultanée de cette série d'électrodes 31(1), 31(2), 31(3) conduit à l'étalement du liquide à partir du site d'entrée 21, et donc à un segment liquide L1 comme illustré sur la figure 6B.
SP 33141 DJB 23 Puis, on coupe ce segment liquide en désactivant l'électrode 31(2). On obtient ainsi une goutte FI, comme illustré sur la figure 6C. On utilise donc une série d'électrodes 31(1), 31(2), 31(3) pour étirer du liquide du puits 91 au travers du site d'entrée 21 en un segment liquide L1 (figures 6A et 6B) puis pour couper ce segment liquide L1 (figure 6C) et former une goutte F1 qui va pouvoir être déplacée sur le plan de déplacement, comme décrit ci-dessus.
Le fonctionnement du dispositif selon l'invention est le suivant, en référence aux figures 4 et 5. Une goutte F1 contenant des particules en suspension est formée à partir du puits 91. Par activation successive des électrodes 30, elle est déplacée sur le réseau bidimensionnel d'électrodes 30. Une ou plusieurs gouttes F2 contenant un agent actif peuvent être formées et déplacées jusqu'à la goutte FI, dans un site de mélange, de manière à mettre en contact les particules en suspension avec l'agent actif voulu. Les gouttes F2 peuvent également contenir du liquide tampon, pour contrôler la concentration en particules de la goutte F. La goutte F1 est ensuite déplacée jusqu'au site d'observation 100 pour effectuer des séquences d'images des particules. On peut ainsi observer la réponse des particules au stimulus provoqué par l'agent actif.
Puis la goutte F1 est déplacée jusqu'au site de sortie 24 et évacuée dans le puits d'évacuation 94.
SP 33141 DJB 24 Il est à noter que plusieurs gouttes F1 peuvent être formées à partir d'un unique puits 91 débouchant sur plusieurs orifices et déplacées simultanément sur le réseau bidimensionnel sans que le déplacement de l'une influe le déplacement des autres. Il est alors avantageux qu'une pluralité de sites d'observation 100 soit prévue pour permettre l'observation des différentes gouttes FI, comme le montre la figure 5. Le dispositif d'observation est alors mobile dans le référentiel lié aux substrats de manière à venir en regard de chaque site d'observation 100 lorsqu'une goutte F1 y est située. La figure 7 montre une variante de réalisation dans laquelle est prévu un site unique d'observation. Le réseau d'électrodes 30 est alors conçu pour que les gouttes FI, une fois observées, puissent continuer leur déplacement dans la même direction. Un train de gouttes F1 peut alors être formé et déplacé sur un même trajet. Le dispositif d'observation est alors fixé au dispositif, en regard du site d'observation. Selon une autre variante de réalisation de l'invention représentée dans les figures 8 et 9, une pluralité de dispositifs selon l'invention peut être montée sur une unique plaque à puits. Chaque dispositif selon l'invention est indépendant des dispositifs voisins (figure 8). Le dispositif d'observation 130 se déplace alors pour se placer en regard des différents sites d'observation 100 des différents dispositifs selon l'invention (figure 9).
L'invention offre de multiples avantages.
SP 33141 DJB 25 Elle permet d'abord l'utilisation de volumes de gouttes de liquide extrêmement réduits, de l'ordre du nanolitre (par exemple entre 0,lnl et 100nl, de préférence 2n1, 8nl ou 64n1), sans volume mort, et permet le contrôle des concentrations. L'invention permet une dispense unique, à partir d'un réservoir, des drogues et des cellules, ou de tout agent actif, au lieu d'une dispense puits par puits comme dans le dispositif de l'art antérieur précédemment décrit. Le coût lié à l'utilisation des cellules et des réactifs est alors particulièrement réduit par rapport à celui du dispositif selon l'art antérieur. De plus, le temps de balayage par le microscope pour repérer les particules contenues dans la goutte est également réduit de manière importante. Le dispositif selon l'invention répond aux exigences de rapidité du criblage à haut débit. En outre il n'y a pas d'évaporation qui risquerait d'influencer la viabilité des cellules. La concentration peut être contrôlée par dilutions successives à partir d'un réservoir de concentration connue. Il est alors possible d'étudier les actions combinées des mélanges de toxines, afin de vérifier si leurs actions sont, ou pas, compatibles et/ou synergiques. Il est possible également de contrôler localement le déplacement des gouttes, indépendamment des gouttes situées en amont et en aval. Un réseau complexe de SP 33141 DJB 26 chemin de parcours de goutte est donc facilement réalisable. Il n'y a aucune zone de recirculation qui peut piéger les particules en suspension. En effet, celles-5 ci restent contenues dans la goutte en déplacement.

Claims (13)

  1. REVENDICATIONS1. Procédé de manipulation et d'observation de 5 particules en suspension dans un liquide, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : - la mise en contact d'un premier liquide avec une surface hydrophobe (52), - la formation d'une première goutte (FI) à partir 10 du premier liquide puis le déplacement de ladite goutte (F1) par électromouillage afin de l'amener sur un site d'observation (100), ladite première goutte étant en contact avec ladite surface hydrophobe (52), - l'observation des particules contenues dans 15 ladite première goutte (F1).
  2. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte en outre, avant ladite étape d'observation des particules, une étape de mélange de 20 ladite première goutte (F1) avec une seconde goutte (F2) d'un second liquide.
  3. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la goutte (F1,F2) est confinée 25 lors de son déplacement entre ladite surface hydrophobe et un substrat (11) disposé en regard de la surface hydrophobe (52).
  4. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en 30 ce que la goutte (F1,F2) est formée à partir d'un orifice (21) traversant ladite surface hydrophobe {52)SP 33141 DJB 28 ou ledit substrat (11), ledit orifice communiquant avec un puits {91, 92, 93) d'une plaque à puits.
  5. 5. Procédé selon l'une quelconque des 5 revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la goutte (F1,F2) a un volume compris entre 0,1nl et 10pl.
  6. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ladite 10 première goutte (F1) de liquide comprend des cellules de types différents, ou au moins un type de cellule et un type de toxine.
  7. 7. Procédé selon l'une quelconque des 15 revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la concentration en particules est comprise entre 50 et 5000 particules par microlitre.
  8. 8. Dispositif de manipulation et d'observation de 20 particules en suspension dans un liquide comportant : - un premier substrat (12) comportant au moins un premier orifice (21) formant site d'entrée dudit liquide, - un site d'observation {100) pour observer les 25 particules en suspension, et - des moyens de déplacement du liquide dudit site d'entrée audit site d'observation, caractérisé en ce que, le premier substrat (12) comportant une première couche hydrophobe (52), le 30 liquide étant électriquement conducteur, lesdits moyens de déplacement du liquide sont adaptés à déplacer leditSP 33141 DJB 29 liquide sous forme de goutte (F1) par électromouillage, ladite goutte (F1) étant en contact avec ladite première couche hydrophobe (52).
  9. 9. Dispositif selon la revendication 8, caractérisé en ce que les moyens pour déplacer ladite goutte, par électromouillage, comportent : - une pluralité d'électrodes {30) entre ladite première couche hydrophobe (52) et ledit premier substrat (12), - une couche diélectrique (40) entre ladite première couche hydrophobe (52) et ladite pluralité d'électrodes (30), - au moins une contre-électrode (60) en contact électrique avec la goutte de liquide (F1), et - un générateur de tension (70) pour appliquer une différence de potentiel entre les électrodes (30) et ladite contre-électrode (30).
  10. 10. Dispositif selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un second substrat (11) disposé en regard du premier substrat (12).
  11. 11. Dispositif selon la revendication 10, caractérisé en ce que le second substrat {11) est recouvert d'une seconde couche hydrophobe (51) en regard de ladite première couche hydrophobe (52), ladite contre-électrode (60) étant située entre ladite seconde couche hydrophobe (51) et ledit second substrat (Il).SP 33141 DJB 30
  12. 12. Dispositif selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un second substrat (11) disposé en regard du premier substrat {12) et recouvert d'une seconde couche hydrophobe {51) en regard de ladite première couche hydrophobe (52).
  13. 13. Dispositif selon la revendication 12, caractérisé en ce que les moyens pour déplacer ladite 10 goutte, par électromouillage, comportent : - une pluralité d'électrodes entre ladite seconde couche hydrophobe (51) et ledit second substrat (Il), - une couche diélectrique (40) entre ladite seconde 15 couche hydrophobe (51) et ladite pluralité d'électrodes (30), - au moins une contre-électrode (60) en contact électrique avec la goutte de liquide (F1), et - un générateur de tension (70) pour appliquer une 20 différence de potentiel entre les électrodes {30) et ladite contre-électrode (60). 18. Dispositif selon la revendication 13, caractérisé en ce que ladite contre-électrode (60) est 25 située entre ladite première couche hydrophobe {52) et ledit premier substrat (12). 19. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 10 à 14, caractérisé en ce que ledit 30 premier orifice (21) communique avec un premier puits (91) disposé sur une face externe dudit premierSP 33141 DJB 31 substrat (12) opposée à ladite première couche hydrophobe (52). 16. Dispositif selon la revendication 15, caractérisé en ce que ledit premier substrat (12) comporte au moins un second orifice (22, 23, 24) formant site d'entrée ou de sortie de liquide, ledit second orifice {22, 23, 24) communiquant avec un second puits {92, 93, 94) disposé sur une face externe dudit premier substrat (12) opposée à ladite première couche hydrophobe (52). 17. Dispositif selon la revendication 15 ou 16, caractérisé en ce que ledit puits (91, 92, 93, 94) est 15 un puits d'une plaque à puits. 18. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 15 à 17, caractérisé en ce que les moyens de déplacement par électromouillage comprennent 20 des moyens (31(1), 31(2), 31(3)) pour former une goutte de liquide à partir dudit orifice (21, 22, 23, 24). 19. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 10 à 18, caractérisé en ce que le 25 premier substrat (12) et/ou le second substrat (11) sont réalisés dans un matériau transparent. 20. Dispositif selon la revendication 19, caractérisé en ce que les électrodes {30) sont 30 réalisées dans un matériau transparent.SP 33141 DJB 32 21. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 8 à 20, caractérisé en ce qu'il comprend un dispositif d'observation (130) pour observer les particules en suspension contenues dans ladite goutte (FI) située dans le site d'observation (100). 22. Dispositif selon la revendication 21, caractérisé en ce que le dispositif d'observation (130) comprend un microscope confocal.10
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