WO2007012637A1 - Dispositif microfluidique pour mesure de fluorescence et procede de mesure mettant en œuvre un tel dispositif - Google Patents

Dispositif microfluidique pour mesure de fluorescence et procede de mesure mettant en œuvre un tel dispositif Download PDF

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WO2007012637A1
WO2007012637A1 PCT/EP2006/064612 EP2006064612W WO2007012637A1 WO 2007012637 A1 WO2007012637 A1 WO 2007012637A1 EP 2006064612 W EP2006064612 W EP 2006064612W WO 2007012637 A1 WO2007012637 A1 WO 2007012637A1
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WO
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liquid
filter
excitation
zone
emission
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PCT/EP2006/064612
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English (en)
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Jérôme BOUTET
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Commissariat A L'energie Atomique
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Publication date
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502769—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by multiphase flow arrangements
    • B01L3/502784—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by multiphase flow arrangements specially adapted for droplet or plug flow, e.g. digital microfluidics
    • B01L3/502792—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by multiphase flow arrangements specially adapted for droplet or plug flow, e.g. digital microfluidics for moving individual droplets on a plate, e.g. by locally altering surface tension
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/089—Virtual walls for guiding liquids
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/0415—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces electrical forces, e.g. electrokinetic
    • B01L2400/0427—Electrowetting

Definitions

  • the present invention relates primarily to a microfluidic device for measuring fluorescence using electrowetting, and to a method of implementing such a device, for example to perform genotyping or measurement of antibody antigen reactions.
  • Fluorescence measurement consists in exciting fluorescent markers in a liquid, using a light source of a predetermined wavelength.
  • the signal re-transmitted by the markers is measured at another wavelength (greater than the excitation wavelength) with the aid of a detector.
  • Fluorescence measurement is currently the most widely used technique for genotyping, measurement of antibody antigen reactions (immunodisodetection), ...
  • This measurement consists in labeling the molecules whose concentration we wish to know (called target molecules) with fluorescent molecules (called probes). The volume is then illuminated in a given wavelength and the signal emitted is measured in a longer wavelength. The value of the measured signal makes it possible to determine the concentration by a prior calibration system
  • a fluorescence measuring apparatus generally consists of a light source of an optical system for shaping this light, a filter system for filtering this light, an optical system for collecting light. fluorescence, a second filtering system for blocking the excitation light and pass the fluorescence light and a fluorescence light detector.
  • the design of a fluorescence measuring device requires taking into account the absorption and emission spectrum of the fluorophore that one wishes to measure.
  • the choice of the excitation filter and the emission filter makes it possible to perform efficient filtering.
  • the excitation filter is often centered on the excitation maximum of the fluorophore, as for the emission filter, it is often centered on the maximum emission of the fluorophore. It must then be ensured that there is no overlap between the two filters.
  • the wavelength filtering of the light is commonly carried out by solid filters, of the color filter type or of the interference filter type.
  • Colored filters have the advantage of being little dependent on the angle of incidence of the light, but do not have a high selectivity in wave length. Interferential filters are more selective in wavelength, but on the other hand they are very sensitive to the angle of incidence. In addition, their price is often higher. In some miniature detection systems, the filtering is carried out by solid deposits of optical thin layers, for example at the output of optical fiber.
  • a device for performing fluorescence measurements on a liquid sample wherein one or both filters are formed by a small volume of colored liquid, also movable by electrowetting to put them in place. filtering position, so as to arrange the excitation filter between an optical beam source and the liquid sample, and the emission filter between the sample and the fluorescent light collecting means.
  • the elements involved in the measurement such as filters and the sample can be put in place and removed without the implementation of mechanical device, but only by application of an electrostatic force.
  • the device according to the present invention may also comprise displacement means by electrowetting of the sample to place it between an excitation filter and a transmission filter,
  • the present invention therefore mainly relates to a microfluidic device for the fluorescence measurement of at least a small volume of liquid comprising electrowetting displacement means:
  • the device advantageously comprises electrowetting displacement means for bringing the small volume of liquid into measuring position at the output of the excitation filter zone and in front of the input of the emission filter zone.
  • the emission zone is preferably situated laterally, for example perpendicularly, with respect to the excitation axis, or with respect to a direction of propagation of a beam, which direction can be defined as being on the axis of the beam. excitation.
  • the device according to the present invention comprises storage areas of the different filters.
  • the device according to the invention may comprise an optical beam source intended to illuminate the small volume of liquid to be analyzed and positioned in such a way that the optical beam passes through the excitation filter in measuring position before passing through the small volume of Liquid
  • the optical beam source is, for example, a laser, or at least one light emitting diode, or an organic polymer, or a chemical or semiconductor type.
  • the device according to the invention comprises means for shaping the optical beam, which may comprise an optical system, or at least one mirror or at least one optical fiber.
  • the device may also include means for modulating the shape of the small volume of liquid by electrowetting to modulate the signal obtained after passing through the small volume of liquid by the optical beam.
  • the displacement means may comprise electrowetting electrodes and electrically conductive means forming the counter-electrode for these electrowetting electrodes.
  • the device may also comprise a second substrate facing the hydrophobic surface, forming a cover, which is advantageously transparent for allow direct visual control and fluorescence measurement.
  • the device may then comprise a third transparent substrate provided with electrodes, said third substrate delimiting the emission zone, the liquid emission filters being displaceable by the electrodes of the third substrate.
  • the second substrate comprises the counter-electrode.
  • the counter-elecrode is formed by a suspended conductor wire.
  • an electrowetting electrode of the excitation filter zone and / or an electrowetting electrode of the emission filter zone is of substantially rectangular shape.
  • an electrowetting electrode of the excitation filter zone and / or an electrowetting electrode of the emission filter zone is of parabolic, spherical, concave or convex shape allowing a shape, such as a focus or divergence of the excitation light and / or the emission light respectively.
  • the device according to the invention may also comprise means forming at least two liquid tanks for manufacturing liquid filters.
  • the device according to the present invention advantageously comprises walls insulating the measurement, excitation and emission zones of the external environment, avoiding the presence of stray light and oil leaks
  • the present invention also relates to a fluorescence measurement method comprising the following steps:
  • the emission and excitation filters being chosen to measure at least one determined fluorophore
  • the excitation and emission filters are formed by colored liquids.
  • the method according to the present invention may comprise, before the introduction of the filter (s) for a fluorescence measurement, a step of preparation of the liquid filters. This step may, for example, be carried out by mixing several drops of colored liquid or by diluting a drop of colored liquid.
  • the method according to the invention may also comprise the steps of shaping the optical beam, modulation by electrowetting the shape of the small volume of liquid, and / or changing the emission filter and / or the excitation filter. to measure another fluorophore.
  • the method according to the present invention may also include a step of replacing the liquid measured in the case of photo-destruction thereof by the excitation light.
  • the filters and the small volume to be analyzed may, advantageously, bathe in a liquid immiscible with the liquid forming the filters and that of the small volumes of liquid to be analyzed.
  • a device according to the present invention thus has the advantage of not having mechanical means in motion, in particular for changing the filters, which makes the device very reliable and reduces the cost.
  • a device according to the present invention may also comprise multiple-use electrodes, allowing both the detection and the preparation of the samples, such as dilution, evaporation, mixing, etc.
  • FIGS. 1A-1C represent the principle of displacement of drops, by electrowetting
  • FIG. 2 represents a closed configuration of a device for moving drops
  • FIGS. 3A and 3B show a mixed configuration of a device for moving drops
  • FIGS. 4 and 5A-5B show a device for displacing drops, in which the upper cover is provided with an electrode
  • FIG. 6 is a schematic view from above of a first embodiment of a device according to the present invention in an operating state
  • FIG. 7A is a view from above of the device of FIG. 6 in another operating state
  • FIG. 7B is a schematic view from above of an alternative embodiment of the device of FIG. 7;
  • FIGS. 8A and 8B are side views of the device of FIG. 6 in the measurement situation
  • FIGS. 9A and 9B are schematic side views of an alternative embodiment of the device of FIG. 6;
  • FIGS. 10A and 10B are diagrammatic views from above of a third embodiment of a device according to the present invention in a state of waiting and in a state ready for a measurement;
  • HA - HD represent a well or a liquid reservoir
  • FIGS. 12A and 12B are side views of an alternative embodiment of the device of Figures 9A and 9B.
  • FIG. IA - IC A first embodiment of a device for moving and handling drops, of the open system type, which can be set up in the context of the invention, is illustrated in Figures IA - IC.
  • FIGS. 12A and 12B another embodiment of a displacement device can be seen which can be implemented in the context of the invention.
  • This so-called closed device comprises a cover delimiting with the substrate two zones of displacement of superposed liquid drops.
  • This embodiment implements a device for moving or handling drops of liquid based on the principle of 1 electrowetting on a dielectric.
  • Chip 2 (1) (2002) 96-101.
  • the document FR 2 841 063 describes a device implementing, in addition, a catenary facing the electrodes activated for displacement.
  • a drop 2 rests on a network 4 of electrodes, from which it is isolated by a dielectric layer 6 and a hydrophobic layer 8 (Figure IA).
  • the hydrophobic nature of this layer means that the drop has a contact or wetting angle, on this layer, greater than 90 °.
  • the electrodes 4 are themselves formed on the surface of a substrate 1.
  • the layer dielectric 6 and the hydrophobic layer 8 between this activated electrode and the drop under voltage act as a capacitance.
  • the counter-electrode 10 allows a possible displacement by electrowetting on the surface of the hydrophobic surface; it maintains an electrical contact with the drop during such a displacement.
  • This counter electrode can be either a catenary as in FR - 2 841 063, or a buried wire or a planar electrode in the hood of a confined system (such a confined system is described below).
  • the drop can thus be optionally displaced step by step (FIG. 1C) on the hydrophobic surface 8 by successive activation of the electrodes 4-1, 4-2, etc., along the catenary 10. It is therefore possible to move liquids, but also to mix them (doing approach drops of different liquids), and perform complex protocols.
  • the electrodes can indeed be arranged in a linear manner, but also in two dimensions, thus defining a plan of displacement of the drops.
  • FIG. 2 represents another embodiment of a device for moving or handling drops, of the closed or confined system type, that can be implemented within the scope of the invention.
  • This device further comprises an upper substrate 100, preferably also covered with a hydrophobic layer 108.
  • This set may be optionally transparent, allowing observation from above.
  • FIGS. 3A and 3B in which numerical references identical to those of FIG. 2 denote identical or similar elements, represent a mixed system for moving or handling drops, in which a drop 2 is initially in an open medium (FIG. 3A), the activation of electrodes 4-1, 4-2, 4-3 allowing a flattening of the drop (FIG. 3B), in a closed system, in an area where the system is provided with a hood, as illustrated above in connection with Figure 2.
  • FIG. 4 represents a variant of the closed system, with a conductive cover 100, comprising an electrode or an array of electrodes 112, as well as an insulating layer 106 and a hydrophobic layer 108.
  • the catenary 10 of the preceding figures is replaced, in this embodiment, by the electrode 112.
  • the activation of this electrode 112 and the electrodes 4 makes it possible to move the droplet into the desired position and then to stretch or deform it , to bring it on the path of a light beam 50.
  • FIGS. 5A and 5B on which identical numerical references to those of FIG. 4 denote identical or similar elements, represent a mixed system, in which a drop 2 is initially in an open medium (FIG. 5A), the activation of FIG. 4-1, 4-2, 4-3 electrodes allowing a flattening of the drop (FIG. 5B), in a closed system, in an area where the system is provided with a hood, as illustrated above in connection with the figure 4.
  • a device according to the invention may further comprise means which will make it possible to control or activate the electrodes 4, for example a PC-type computer and a relay system connected to the device or the chip, such as the relays 14 of the FIG. 1A, these relays being controlled by the PC type means.
  • a PC-type computer for example a PC-type computer and a relay system connected to the device or the chip, such as the relays 14 of the FIG. 1A, these relays being controlled by the PC type means.
  • the distance between a possible conductor 10 ( Figures IA - 5B) on the one hand and the hydrophobic surface 8 on the other hand is for example between 1 micron and 100 microns or 500 microns.
  • This conductor 10 may be for example in the form of a wire diameter of between 10 microns and a few hundred microns, for example
  • This wire may be a gold or aluminum wire or tungsten or other conductive materials.
  • two substrates 1, 100 are used (FIGS. 2 - 5B), they are spaced apart by a distance between, for example, 10 ⁇ m and 100 ⁇ m or 500 ⁇ m.
  • a drop of liquid 2 may have a volume between, for example, 1 nanolitre and a few microliters, for example between 1 ni and 5 .mu.l or 10 .mu.l.
  • each of the electrodes 4 will for example have a surface of the order of a few tens of ⁇ m 2 (for example 10 ⁇ m 2 ) up to 1 mm 2 , depending on the size of the drops to be transported, the spacing between adjacent electrodes being for example between 1 .mu.m and 10 .mu.m.
  • the structuring of the electrodes 4 can be obtained by conventional methods of micro ⁇ technologies, for example by photolithography.
  • Conductors, and in particular conductors 112 may be made by depositing a conductive layer and etching of this layer in the appropriate pattern of conductors, before deposition of the hydrophobic layer 108.
  • the electrodes may be made by deposition of a metal layer (for example a metal selected from Au, Al, ITO, Pt, Cr, Cu) by photolithography.
  • the substrate is then covered with a dielectric layer, for example Si 3 N 4 or SiU 2. Finally a deposit of a hydrophobic layer is performed, such as a teflon deposit made by spinning.
  • Such a device for moving drops can implement a two-dimensional array of electrodes that will allow, step by step, to move liquids in or on a plane, to mix them, to achieve complex protocols.
  • a device for the fluorescence analysis comprises an electrowetting device of the type described above, comprising at least a part for analysis I of the small volume to be analyzed or sample drop 2, surrounded by an excitation portion II and an emission portion III.
  • the device according to the present invention may comprise means for putting in place the drop or sample to be analyzed. These means can as shown in FIGS. 6 and 7 by the electrode array 4 extending, in the example shown, in zigzag, but the electrowetting electrodes may have any other desired shape.
  • the displacement means of the samples to be analyzed are formed by channels 300 extending from colored liquid reservoirs (not shown) to the analysis zone, the samples being displaced by means of pumps (not represented).
  • the drops are advantageously immersed in a liquid immiscible with that of drops, for example oil when the drops are formed of an aqueous solution.
  • a liquid immiscible with that of drops for example oil when the drops are formed of an aqueous solution.
  • This makes it possible to avoid the evaporation of the drops and to modify the tension necessary for displacements. Indeed, the presence of the oil modifies the characteristics of the medium.
  • the reflections are limited.
  • the excitation filter and the emission filter are both in the form of a drop of colored liquid.
  • an excitation or emission filter in the form of a droplet and an emission or excitation filter, for example of the solid filter type. According to the device shown in FIGS. 6 and 7, it is possible to use an excitation filter formed by a drop of colored liquid 234.1 or another drop of colored liquid 234.2 having different properties, especially optical properties.
  • the excitation portion II comprises a reception zone of an excitation filter called excitation zone 224, when a measurement is made, and zones 230.1 and 230.2 for storing the excitation filters, respectively 234.1 and 234.2.
  • the storage areas 230.1 and 230.2 are arranged, in the exemplary embodiment, on either side of the excitation zone 224.
  • the displacement of a drop from a storage zone to the excitation zone 224 is carried out inter alia by electrowetting in the manner described above for the sample drop 2 using FIGS. 1A-1C.
  • the excitation portion II comprises third and fourth (not shown) electrically conductive means capable of applying an electrostatic field to the filter drop 234.1, 234.2.
  • the third means are formed by an array of electrodes buried in the substrate 1 and the fourth means are formed, for example by a counterelectrode (not shown) of similar structure to that of the counter electrode 10 (FIGS. 1A-1C). ), vis-à-vis the electrode array.
  • the hydrophobic layer of the dielectric layer is advantageously the same as that of the first displacement means 4.
  • the electrode array extends between the excitation zone 224 and each of the storage zones. 230.1, 230.2.
  • the electrode array comprises an electrode 240.1 in the excitation zone 224, an electrode 240.2 in the storage zone 230.1, an electrode 240.3 in the storage zone 230.2 and intermediate electrodes 240.4, 240.5 arranged. respectively between the excitation zone 224 and the storage zone 230.1 and between the excitation zone 224 and the storage zone 230.2.
  • a greater number of electrodes could be provided, and a longer and more complex path between the storage and excitation zones.
  • Means for switching and controlling the electrode array identical or similar to those of the network 4 are provided.
  • the electrode 240.1 of the excitation zone 224 goes into an active state, the drop 234.1 being in its storage zone 230.1 and the electrode 240.2 being in an inactive state, the drop 234.1 moves from the zone of storage 230.1 to the excitation zone 224.
  • the electrode 240.1 of the excitation zone 224 advantageously has a rectangular shape.
  • the filter drop substantially takes the form of the electrode; thus all the light rays substantially in a direction X substantially perpendicular to a face of the rectangular electrode 240.1, pass through the excitation filter on the same length.
  • the electrodes 240.2 and 240.3 of the storage areas are, in the example shown, of triangular shape to optimize the overall dimensions of the device, but electrodes having another shape, for example rectangular may also be suitable.
  • the emission part III has a structure close to that of the excitation portion II.
  • the transmission part III comprises a reception zone 246 of a transmission filter, called the emission zone, when a measurement is made, and zones 248.1 and 248.2 for storing the emission filters, respectively 244.1, 244.2.
  • the storage areas 248.1 and 248.2 are arranged in the exemplary embodiment on either side of the transmission zone 246.
  • the emission zone 246 preferably extends substantially along an axis Y, orthogonal to the axis X of the excitation light rays, so as to receive the emission light emitted by the droplet 2.
  • the emission part III has fifths 250 and sixths (not shown) means electrically conductive, similar embodiment to those of the excitation portion.
  • the fourth conductive means 250 comprise, in the example shown, an array of five electrodes 252.1, 252.2, 252.3, 252.4, 252.5 for moving a drop 244.1, 244.2.
  • the sixth counterelectrode conductor means is disposed opposite the electrode array 252.1 through 252.5 or in the closed configuration hood (Figs. 9A and 9B).
  • FIG. 8A one can see the device according to FIG. 6 seen according to the arrow 264.
  • the device is in a fluorescence measurement configuration, a drop of excitation 234.1 is in place behind the drop of sample 2 in the direction of movement of the excitation light.
  • the arrows 260,261 respectively schematize the light from a light source and the fluorescence light.
  • Figure 8B one can see the device of Figure 6 seen according to the arrow 266; a drop of emission is positioned in front of the sample drop 244.1 according to the path of the emitted fluorescence light coming out of the sample drop 2.
  • the arrow 268 schematizes the excitation light stopped by the drop. Fluorescence light 261 is then collected by a treatment device (not shown) to determine the amount of fluorophore contained in the sample drop and deduce the concentration of the source liquid.
  • the light rays originate from a light source 242 which is, for example, external to the device, as shown in FIGS. 6 and 7.
  • the light source can also be integrated into the device.
  • the light source 242 is, for example, a halogen incandescent lamp with arc (xenon, mercury) or a discharge lamp also called flashlamp.
  • the light source may also be an external laser or one or more light-emitting diodes (LEDs).
  • An organic polymer
  • OLED organic light source
  • any chemical or semiconductor light source may also be suitable.
  • FIGS. 6 and 7 one can see walls 280 bordering and separating the zones of excitation, emission and measurement.
  • these walls prevent oil leakage and form a support for the hood in the case of a closed device.
  • These walls are for example made of resin.
  • FIGS. 6 and 7 also show a detector 254 of the fluorescence light coming from the emission filter.
  • the detector may be integrated in the chip, for example in the case of a photodiode designed in the stack of technological layers, or in the case of a CMOS sensor glued to the edge of the chip.
  • the detector may also be a photomultiplier, a CCD camera or an avalanche photodiode.
  • the light rays coming from the light source 242 can be guided in the device and shaped directly by lenses arranged outside the chip, or by means of additional means of an optical system 256 or mirrors or alternatively one or more optical fibers or light guides.
  • the emission radius by changing the shape of the drop 2 to be analyzed, by electrowetting.
  • the drop disposed on this electrode in the absence of voltage, is substantially round in shape, whereas in the presence of a voltage, the drop has substantially a rectangular shape.
  • the distance to be traveled in the sample by the emission optical beam can be modified, which can allow synchronous detection.
  • the shaping with the help of the drops of liquid makes it possible to integrate several functions in the device according to the present invention without modifying its compactness.
  • the sample to be measured is displaced, for example by the means 4 to the measurement zone 222.
  • the excitation drop 234.1 is moved from the storage area 230.1 to the excitation zone 224.
  • the emission drop 244.1 is moved from the storage area 248.1 to the transmission area 246.2.
  • An optical beam generated by the light source 242 passes through the excitation drop 234.1 and is filtered therefrom.
  • the light beam emits only in a wavelength determined by the excitation drop 234.1.
  • the filtered light beam passes through the drop 2, which then emits a fluorescent light due to the presence of fluorophores A (FIG. 8A).
  • This fluorescence light then passes through the emission drop 244.1, which filters it so as to absorb the excitation light and let only the fluorescence light pass (FIG. 8B).
  • This fluorescence light is then collected by the detector 254, which by prior calibration, deduces the concentration of fluorophore A.
  • the drops 234.1 and 244.1 are replaced by the excitation and emission drops 234.2 and 234.2 adapted to the detection of the fluorophores B.
  • the drops 234.1 and 244.1 are replaced in their storage zone 230.1. , 248.1 respectively.
  • the detection is carried out in the same way as for the B fluorophores.
  • the detector 254 determines on the basis of the fluorescence light due to fluorophores B, the concentration of fluorophore B.
  • the sample 2 can be replaced by another sample to be analyzed.
  • the device according to the present may comprise more than two excitation and / or emission filters, the number of storage areas will be adapted accordingly.
  • FIGS. 9A and 9B there can be seen an alternative embodiment of the device according to FIG. 6 comprising a cover 100 provided on its inner face with a conductive coating 265 forming the counter-electrode.
  • This cover may, for example be transparent, to control the movement of the drops.
  • FIGS. 12A and 12B we can see an alternative embodiment of the device of FIGS. 9A and 9B, in which the transparent cover 100 also makes it possible to measure the fluorescence.
  • This device comprises a second cover 100.1 disposed at a distance from the first cover 100 above it and delimiting a reception zone of a transmission filter.
  • the cover 100.1 comprises a transparent network of electrodes 4.1 and is provided with a hydrophobic surface on the side of the cover 100. These electrodes can be activated to put in motion the emission filters 244.1, 244.2.
  • the operation of this device is identical to that of the device described above, except that the fluorescence beam 261 coming out of the sample 2 passes through the transparent cover 100, then the emission filter 244.1 and finally the second cover 100.1 before reaching the detector (not shown).
  • excitation filters 234.1 and emission filters 244.1 can be replaced by the filters 234.2, 244.2 to perform detections of different fluorophores (FIG. 12B).
  • This device allows a three-dimensional implementation, which reduces the size of the device.
  • FIGS. 10A and 10B an alternative embodiment of the device of FIG. 6 can be seen, in which the emission and excitation filters have the same storage locations.
  • the device comprises a storage area 270 allowing, in the example shown, the storage of six different filters 271.1 to 271.6.
  • the zone 270 thus comprises six "bins", arranged on one side of the measurement zone. Each bin is defined by an electrowetting electrode 272.1 through 272.6.
  • the device also comprises a displacement zone 274 for enabling the filters of the storage zone to be moved towards the emission part III or excitation II comprising six electrodes 276.1 to 276.6, each connected to one of the six electrodes 272.1 to 272.6 of the storage area respectively, by an intermediate electrode 272.1 'to 272.6'. It could be provided to have directly the electrodes 276.1 to 276.6 adjacent the electrodes 272.1 to 272.6.
  • This device thus makes it possible to distinguish at least three different fluorophores, or even more by combining the different filters.
  • the electrodes 276.1 to 276.6 also form, with an electrode 276.7 adjacent to the electrode 252.2 of the emission zone, a continuous path for the displacement of the liquid filters towards the emission zone III.
  • the device also comprises a displacement zone 278, intermediate between the emission portion III and the excitation portion II and formed in the example shown, by four electrodes 278.1, 278.2, 278.3, 278.4, defining a path between the excitation zone and the emission zone.
  • the excitation filter passes through the emission zone to join the excitation zone by taking the intermediate path 278.
  • provision may be made to pass the drop of excitation through the measurement zone I before the introduction of the drop of sample, or to provide a path specifically dedicated to the displacement of the drop of excitation.
  • the six liquid filters 271.1 to 271.6 are in place in their respective compartments.
  • the electrode 272.2 ' is activated, then 276.2, the filter 271.2 then moves to the electrode 276.2, and the electrodes are then activated. 276.1, 276.7 and the emission electrode 252.3.
  • the electrodes 278.1, 278.2, 278.3, 278.4 and finally the excitation electrode 240.1 are then activated, the filter 271.2 is then in place in the excitation zone 224.
  • the electrodes are activated. 272.4 ', then the electrodes 276.4, 276.3, 276.2, 276.1, 276.7 and the emission electrode 252.3.
  • the transmission filter 276.4 is then in place to filter the emission light.
  • the sample can be put in place before, during or after the installation of the filters. It can also be brought by electrowetting.
  • the fluorescence measurement can then be performed.
  • the excitation filter and / or the emission filter are changed, as previously described.
  • filters 271.1 and 271.3 are used.
  • the number of electrodes for the storage area and for the displacement zones can be adapted to the needs, for example the storage area may comprise more than one electrode per filter.
  • the device also comprises walls 280 for isolating the device from parasitic light and to prevent oil leakage.
  • walls 280 for isolating the device from parasitic light and to prevent oil leakage.
  • a filter generating device comprising, on the one hand, a reservoir of colorless solution, for example aqueous, and on the other at least one concentrated dye reservoir, advantageously several, in order to produce filters having different optical properties.
  • a useful filter is obtained for the measurements.
  • This filter can be stored for later use or evacuated, a new filter will be manufactured. In this case, the device then has no filter storage area, but storage areas of components to make filters.
  • the figures HA - HD represent how can be realized a reservoir such as tanks allowing the manufacture of filters.
  • a liquid 300 to be dispensed is deposited in a well 320 of this device (FIG. This well is for example made in the upper cover 100 of the device.
  • the lower part, shown schematically in Figures HA - HD, is for example similar to the structure of Figures 1A-1C. If you do not use a configuration with a top cover, the open configuration allows the possibility of pouring a liquid such as oil over the entire surface. One can then move a drop by electrowetting. Three electrodes 4-1, 4-2, 4-3, similar to the electrodes 4 for moving liquid drops, are shown in Figures HA-HD.
  • this liquid segment is cut off by deactivating one of the activated electrodes (electrode 4-2 in FIG. HC). A drop 2 is thus obtained, as illustrated in FIG.
  • a series of electrodes 4-1, 4-2, 4-3 are used to stretch liquid from reservoir 320 into a finger 301 (FIGS. HB and HC) and then to cut this finger 301 of liquid (FIG. a drop 2 that can be taken to any measurement site as described above.
  • a measurement method using liquid filters moved by electrowetting comprises the following steps of: a) moving an excitation filter to its measuring position, b) and / or moving a filter of emission to its measurement position, the emission and excitation filters being chosen to measure at least one determined fluorophore, c) moving the small volume of liquid to be measured to its measurement position before, during or after the installation of the filter (s), d) generating an optical beam in the direction of the excitation filter and the small volume of liquid, e) collecting a signal emerging from the emission filter.
  • the sample or the filter (s) are put in place.
  • the drops of liquid used as filters are moved by electrowetting, by alternating activation of the electrodes concerned.
  • the choice of the excitation filter and the emission filter depends on the fluorophore to be detected.
  • a light beam is generated towards the sample. It can be provided to shape the light beam before it enters the excitation filter by the means described above.
  • the method according to the present invention provides for the change of the emission filter and / or the excitation filter and to repeat the measurement by repeating steps a), b), d) and e).
  • the method may also provide a preliminary step of manufacturing the filters by mixing several drops of colored liquid or by diluting a drop of colored liquid, as described above.

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Abstract

La présente invention a principalement pour objet un dispositif microf luidique pour la mesure de fluorescence d'au moins un petit volume de liquide (2) comportant des moyens de déplacement (4) par électromouillage sur une surface hydrophobe pour: - amener un petit volume de liquide en position de mesure en sortie d'une zone de filtre d'excitation (34.1,34.2) et devant l'entrée d'une zone de filtre d'émission, - amener une goutte formant filtre d'émission (44.1,44.2) dans la zone d'excitation, - et/ou pour amener une goutte formant filtre d'émission liquide dans la zone d'émission. La présente invention a également pour objet un procédé de mesure de fluorescence utilisant un filtre d'émission liquide et/ou d'excitation liquide.

Description

DISPOSITIF MICROFLUIDIQUE POUR MESURE DE FLUORESCENCE ET PROCEDE DE MESURE METTANT EN ŒUVRE UN TEL DISPOSITIF
DESCRIPTION
DOMAINE TECHNIQUE ET ART ANTÉRIEUR
La présente invention se rapporte principalement à un dispositif microfluidique pour la mesure de fluorescence utilisant l' électromouillage, et à un procédé de mise en œuvre d'un tel dispositif, par exemple pour réaliser un génotypage ou la mesure de réactions antigènes anticorps.
La mesure en fluorescence consiste à exciter des marqueurs fluorescents dans un liquide, à l'aide d'une source de lumière d'une longueur d'onde prédéterminée.
Le signal réémis par les marqueurs est mesuré à une autre longueur d'onde (supérieure à la longueur d'onde d'excitation) à l'aide d'un détecteur.
La mesure de fluorescence est actuellement la technique la plus répandue pour le génotypage, la mesure de réactions antigènes anticorps (l'immuno- photodétection) , ....
Cette mesure consiste à marquer les molécules dont on souhaite connaître la concentration (appelées molécules cibles) avec des molécules fluorescentes (appelés sondes) . On éclaire alors le volume dans une longueur d' onde déterminée et on mesure le signal émis dans une longueur d'onde supérieure. La valeur du signal mesuré permet de déterminer la concentration par un système de calibration préalable
(mesure de gammes de dilution de concentration connue) .
Un appareil de mesure de fluorescence est généralement constitué d'une source de lumière d'un système optique permettant de mettre en forme cette lumière, d'un système de filtre permettant de filtrer cette lumière, d'un système optique permettant de collecter la lumière de fluorescence, d'un deuxième système de filtrage destiné à bloquer la lumière d'excitation et à laisser passer la lumière de fluorescence et d'un détecteur de lumière de fluorescence .
La conception d'un appareil de mesure de fluorescence, nécessite de prendre en compte le spectre d'absorption et d'émission du fluorophore que l'on souhaite mesurer.
Le choix du filtre d'excitation et du filtre d'émission permet de réaliser un filtrage efficace. Le filtre d'excitation est souvent centré sur le maximum d'excitation du fluorophore, quant au filtre d'émission, celui-ci est souvent centré sur le maximum d'émission du fluorophore. Il faut alors s'assurer qu'il n'y ait pas de recouvrement entre les deux filtres . Le filtrage en longueur d'onde de la lumière est réalisé communément par des filtres solides, du type filtre coloré ou du type filtre interférentiel .
Les filtres colorés présentent l'avantage d'être peu dépendants de l'angle d'incidence de la lumière, mais n'ont pas une sélectivité importante en longueur d'onde. Les filtres interférentiels sont plus sélectifs en longueur d'onde, mais par contre ils sont très sensibles à l'angle d'incidence. De plus, leur prix est souvent plus élevé. Dans certains systèmes de détection miniatures, le filtrage est réalisé par des dépôts solides de couches minces optiques, par exemple en sortie de fibre optique.
Afin de pouvoir mesurer différents fluorophores dans un même échantillon, il est souvent nécessaire de disposer d'un système mécanique (manuel ou motorisé) permettant de changer de filtre, par exemple une roue à filtre ou une tourelle de microscope . II existe également des filtres solides, qui permettent de détecter plusieurs fluorophores
(filtres double ou triple bande) . Cependant, ces filtres ne permettent pas de séparer le signal provenant de chacun des fluorophores. Sont également connus des filtres dits
« accordables » utilisant des cristaux liquides. En faisant varier une tension appliquée au filtre comportant des cristaux liquide, il est possible de modifier le spectre de transmission du filtre. Cependant, ces filtres ont un faible coefficient de transmission dans la bande passante. Cette limitation est intrinsèque aux cristaux liquides. Il est alors nécessaire de passer par au moins deux polariseurs croisés. Le coefficient de transmission maximal théorique de ces filtres est alors de 50%. II existe également des appareils acousto- optiques programmables (AOTF) permettant de sélectionner une longueur d' onde parmi plusieurs longueurs d'onde. Cependant leur coût et leur encombrement les rendent peu adaptés à l'intégration dans des dispositifs miniatures.
C'est par conséquent un but de la présente invention d' offrir un dispositif de petite taille permettant des mesures de fluorescence de petits volumes de liquide.
C'est également un but de la présente invention d' offrir un dispositif simple permettant la détection de plusieurs fluorophores .
C'est également un but de la présente invention d'offrir un dispositif permettant des mesures de fluorescence de petits volumes de liquide sans moyen mécanique .
EXPOSÉ DE L'INVENTION
Les buts précédemment énoncés sont atteints par un dispositif permettant d'effectuer des mesures de fluorescence sur un échantillon de liquide, dans lequel l'un ou les deux filtres sont formés par un petit volume de liquide coloré, déplaçables également par électromouillage pour les mettre en position de filtrage, de manière à disposer le filtre d'excitation entre une source de faisceau optique et l'échantillon de liquide, et le filtre d'émission entre l'échantillon et le moyen de collecte de la lumière fluorescente.
En d'autres termes, les éléments participant à la mesure comme les filtres et l'échantillon peuvent être mis en place et retirés sans la mise en œuvre de dispositif mécanique, mais uniquement par application d'une force électrostatique.
Le dispositif selon la présente invention peut également comporter des moyens de déplacement par électromouillage de l'échantillon pour le placer entre un filtre d'excitation et un filtre d'émission,
La présente invention a alors principalement pour objet un dispositif microfluidique pour la mesure de fluorescence d'au moins un petit volume de liquide comportant des moyens de déplacement par électromouillage :
- pour amener une goutte formant filtre d'excitation dans une zone d'excitation, - et/ou pour amener une goutte formant filtre d'émission liquide dans une zone d'émission, les gouttes formant filtre étant disposées de part et d'autre d'une zone de mesure apte à recevoir le volume de liquide. Le dispositif selon la présente invention, comporte avantageusement des moyens de déplacement par électromouillage pour amener le petit volume de liquide en position de mesure en sortie de la zone de filtre d'excitation et devant l'entrée de la zone de filtre d' émission .
La zone d'émission est située préférentiellement latéralement, par exemple perpendiculairement, par rapport à l'axe d'excitation, ou par rapport à une direction de propagation d'un faisceau, direction qui peut être définie comme étant sur l'axe d'excitation. Dans un exemple de réalisation, le dispositif selon la présente invention comporte des zones de stockage des différents filtres.
Le dispositif selon l'invention peut comporter une source de faisceau optique destinée à éclairer le petit volume de liquide à analyser et positionnée de manière à ce que le faisceau optique traverse le filtre d' excitation en position de mesure avant de traverser le petit volume de liquide La source de faisceau optique est, par exemple, un laser, ou au moins une diode électroluminescente, ou un polymère organique, ou de type chimique ou semi-conducteur.
De manière avantageuse, le dispositif selon l'invention comporte des moyens de mise en forme du faisceau optique, qui peuvent comporter un système optique, ou au moins un miroir ou au moins une fibre optique .
Dans un mode de réalisation, le dispositif peut également comporter des moyens pour moduler la forme du petit volume de liquide par électromouillage afin de moduler le signal obtenu après traversée du petit volume de liquide par le faisceau optique.
Les moyens de déplacement peuvent comporter des électrodes d' électromouillage et des moyens électriquement conducteurs formant la contre-électrode pour ces électrodes d' électromouillage .
Le dispositif peut également comporter un deuxième substrat en regard de la surface hydrophobe, formant capot, qui est avantageusement transparent pour permettre un contrôle visuel direct et la mesure de fluorescence .
Le dispositif peut alors comporter un troisième substrat transparent muni d'électrodes, ledit troisième substrat délimitant la zone d'émission, les filtres d'émission liquide pouvant être déplacés par les électrodes du troisième substrat.
Dans un mode particulier, le deuxième substrat comporte la contre-électrode. Dans un autre mode de réalisation particulier, la contre-élecrode est formée par un fil conducteur suspendu.
Dans un exemple de réalisation, une électrode d' électromouillage de la zone de filtre d'excitation et/ou une électrode d' électromouillage de la zone de filtre d'émission est de forme sensiblement rectangulaire .
Dans un autre exemple de réalisation, une électrode d' électromouillage de la zone de filtre d'excitation et/ou une électrode d' électromouillage de la zone de filtre d'émission est de forme parabolique, sphérique, concave ou convexe permettant une mise en forme, telle qu'une focalisation ou une divergence de la lumière d'excitation et/ou de la lumière d'émission respectivement.
Le dispositif selon l'invention peut également comporter des moyens formant au moins deux réservoirs de liquide pour fabriquer des filtres liquides . Le dispositif, selon la présente invention comporte de manière avantageuse des parois isolant les zones de mesure, d'excitation et d'émission de l'environnement extérieur, évitant la présence de lumière parasite et les fuites d'huile
La présente invention a également pour objet un procédé de mesure de fluorescence comportant les étapes suivantes :
- de déplacement d'un filtre d'excitation jusqu'à sa position de mesure,
- et/ou de déplacement d'un filtre d'émission jusqu'à sa position de mesure, les filtres d'émission et d'excitation étant choisis pour mesurer au moins un fluorophore déterminé,
- de génération d'un faisceau optique en direction du filtre d'excitation et du petit volume de liquide,
- de déplacement du petit volume de liquide à mesurer jusqu'à sa position de mesure avant, pendant ou après la mise en place du ou des filtres.
- de collecte d'un signal sortant du filtre d'émission.
De manière avantageuse, les filtres d'excitation et d'émission sont formés par des liquides colorés .
Le procédé selon la présente invention peut comporter préalablement à la mise en place du ou des filtres pour une mesure de fluorescence, une étape de préparation des filtres liquides. Cette étape peut, par exemple, s'effectuer par mélange de plusieurs gouttes de liquide coloré ou par dilution d'une goutte de liquide coloré. Le procédé selon l'invention peut comporter également les étapes de mise en forme du faisceau optique, de modulation par électromouillage de la forme du petit volume de liquide, et/ou de changement du filtre d'émission et/ou du filtre d'excitation pour mesurer un autre fluorophore.
Le procédé selon la présente invention peut également comporter une étape de remplacement du liquide mesuré en cas de photo-destruction de celui-ci par la lumière d'excitation.
Les filtres et le petit volume à analyser peuvent, de manière avantageuse, baigner dans un liquide non miscible avec le liquide formant les filtres et celui des petits volumes de liquide à analyser.
Un dispositif selon la présente invention présente alors l'avantage de ne pas comporter de moyens mécaniques en mouvement, en particulier pour le changement des filtres, ce qui rend le dispositif très fiable et permet d'en réduire le prix de revient.
De plus, il est possible, avec un dispositif unique, d'accéder à une très grande gamme de filtrages, en changeant simplement la ou les gouttes formant filtre. Ainsi, l'utilisateur peut choisir en fonction des mesures à effectuer, les filtres dont il a besoin en insérant dans le dispositif des gouttes de liquide coloré et en les déplaçant par une simple commande électrique
II est également possible de fabriquer à l'intérieur même du dispositif des filtres sur mesure en changeant la coloration des gouttes, par mélange et/ou dilution des gouttes de liquide colorés.
En outre, l'utilisation de tels filtres permet d'éliminer les problèmes de vieillissement et de salissure par des poussières, puisqu'il suffit simplement de remplacer une goutte en place par une nouvelle goutte. De plus, les filtres utilisés ne risquent plus d'êtres des filtres détruits par la lumière d'excitation ou dégradés, puisqu'ils sont facilement remplaçables .
Un dispositif selon la présente invention peut également comporter des électrodes à usage multiple, permettant à la fois la détection, la préparation des échantillons, tels que la dilution, l' évaporation, le mélange....
BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS
La présente invention sera mieux comprise à l'aide de la description qui va suivre et des dessins en annexe, sur lesquels : - les figures IA-IC représentent le principe de déplacement de gouttes, par électromouillage,
- la figure 2 représente une configuration fermée de dispositif de déplacement de gouttes, - les figures 3A et 3B représentent une configuration mixte de dispositif de déplacement de gouttes,
- les figures 4 et 5A-5B représentent un dispositif de déplacement de gouttes, dans lequel le capot supérieur est muni d'une électrode, - la figure 6 est une vue schématique de dessus d'un premier mode de réalisation d'un dispositif selon la présente invention dans un état de fonctionnement ; - la figure 7A est une vue de dessus du dispositif de la figure 6 dans un autre état de fonctionnement ;
- la figure 7B est une vue schématique de dessus d'une variante de réalisation du dispositif de la figure 7 ;
- les figures 8A et 8B sont des vues de côtés du dispositif de la figure 6 en situation de mesure ;
- les figures 9A et 9B sont des vues schématiques de côté d'une variante de réalisation du dispositif de la figure 6 ;
- les figures 1OA et 10B sont des vues schématiques de dessus d'un troisième mode de réalisation d'un dispositif selon la présente invention dans un état d'attente et dans un état prêt pour une mesure ;
- les figures HA - HD représentent un puits ou un réservoir de liquide ;
- les figures 12A et 12B sont des vues de côté d'une variante de réalisation du dispositif des figures 9A et 9B .
EXPOSÉ DÉTAILLÉ DE MODES DE RÉALISATION PARTICULIERS
Un premier mode de réalisation d'un dispositif de déplacement et de manipulation de gouttes, de type système ouvert et qui peut être mis en œuvre dans le cadre de l'invention, est illustré sur les figures IA - IC.
Sur les figures 12A et 12B, on peut voir un autre mode de réalisation d'un dispositif de déplacement qui peut être mis en œuvre dans le cadre de l'invention. Ce dispositif dit fermé, comporte un capot délimitant avec le substrat deux zones de déplacement de gouttes de liquide superposées
Ce mode de réalisation met en œuvre un dispositif de déplacement ou de manipulation de gouttes de liquide reposant sur le principe de 1' électromouillage sur un diélectrique.
Des exemples de tels dispositifs sont décrits dans l'article de M. G. Pollack, A. D. Shendorov, R. B. Fair, intitulé « Electro-wetting-based actuation of droplets for integrated microfluidics », Lab on
Chip 2 (1) (2002) 96-101.
Les forces utilisées pour le déplacement de gouttes de liquide sont alors des forces électrostatiques.
Le document FR 2 841 063 décrit un dispositif mettant en œuvre, en outre, un caténaire en regard des électrodes activées pour le déplacement.
Le principe de ce type de déplacement est synthétisé sur les figures IA - IC.
Une goutte 2 repose sur un réseau 4 d'électrodes, dont elle est isolée par une couche diélectrique 6 et une couche hydrophobe 8 (figure IA) .
Le caractère hydrophobe de cette couche signifie que la goutte a un angle de contact ou de mouillage, sur cette couche, supérieur à 90°. Les électrodes 4 sont elles-mêmes formées en surface d'un substrat 1.
Lorsque l'électrode 4-1 située à proximité de la goutte 2 est activée, à l'aide de moyens 14 de commutation, dont la fermeture établit un contact entre cette électrode et une source de tension 13 via un conducteur commun 16, la couche diélectrique 6 et la couche hydrophobe 8 entre cette électrode activée et la goutte sous tension agissent comme une capacité. La contre-électrode 10 permet un éventuel déplacement par électromouillage à la surface de la surface hydrophobe; elle maintient un contact électrique avec la goutte pendant un tel déplacement. Cette contre-électrode peut être soit un caténaire comme dans FR - 2 841 063, soit un fil enterré soit une électrode planaire dans le capot d'un système confiné (un tel système confiné est décrit plus loin) .
En système ouvert, s'il n'y a pas de déplacement, il est possible d'étaler la goutte sur la surface hydrophobe, sans contre-électrode. C'est par exemple le cas si la goutte peut être amenée sur la surface hydrophobe par un système de dispense classique, les électrodes 4-1, 4-2 servant uniquement à étaler ou déformer la goutte à l'endroit où elle a été déposée.
La goutte peut ainsi être éventuellement déplacée de proche en proche (figure IC), sur la surface hydrophobe 8, par activation successive des électrodes 4-1, 4-2,... etc, le long du caténaire 10. II est donc possible de déplacer des liquides, mais aussi de les mélanger (en faisant s'approcher des gouttes de liquides différents), et de réaliser des protocoles complexes.
Les documents cités ci-dessus donnent des exemples de mises en œuvre de séries d' électrodes adjacentes pour la manipulation d'une goutte dans un plan, les électrodes pouvant en effet être disposées de manière linéaire, mais aussi en deux dimensions, définissant ainsi un plan de déplacement des gouttes.
La figure 2 représente un autre mode de réalisation d'un dispositif de déplacement ou de manipulation de gouttes, de type système fermé ou confiné, pouvant être mis en oeuvre dans le cadre de 1' invention .
Sur cette figure, des références numériques identiques à celles des figures IA - IC y désignent des mêmes éléments.
Ce dispositif comporte, en outre, un substrat supérieur 100, de préférence également recouvert d'une couche hydrophobe 108. Cet ensemble peut être éventuellement transparent, permettant une observation par le haut.
Les figures 3A et 3B, sur lesquelles des références numériques identiques à celles de la figure 2 y désignent des éléments identiques ou similaires, représentent un système mixte de déplacement ou de manipulation de gouttes, dans lequel une goutte 2 est initialement en milieu ouvert (figure 3A), l'activation d'électrodes 4-1, 4-2, 4-3 permettant un aplatissement de la goutte (figure 3B) , en système fermé, dans une zone où le système est muni d'un capot, comme illustré ci-dessus en liaison avec la figure 2. La figure 4 représente une variante du système fermé, avec un capot conducteur 100, comportant une électrode ou un réseau d'électrodes 112, ainsi qu'une couche isolante 106 et une couche hydrophobe 108.
Le caténaire 10 des figures précédentes est remplacé, dans ce mode de réalisation, par l'électrode 112. L'activation de cette électrode 112 et des électrodes 4 permet de déplacer la goutte dans la position voulue puis de l'étirer ou de la déformer, pour l'amener sur le trajet d'un faisceau lumineux 50.
Les figures 5A et 5B, sur lesquelles des références numériques identiques à celles de la figure 4 y désignent des éléments identiques ou similaires, représentent un système mixte, dans lequel une goutte 2 est initialement en milieu ouvert (figure 5A) , l'activation d'électrodes 4-1, 4-2, 4-3 permettant un aplatissement de la goutte (figure 5B) , en système fermé, dans une zone où le système est muni d'un capot, comme illustré ci-dessus en liaison avec la figure 4.
Un dispositif selon l'invention peut en outre comporter des moyens qui vont permettre de commander ou d'activer les électrodes 4, par exemple un ordinateur type PC et un système de relais connectés au dispositif ou à la puce, tels les relais 14 de la figure IA, ces relais étant pilotés par les moyens de type PC.
Typiquement, la distance entre un éventuel conducteur 10 (figures IA - 5B) d'une part et la surface hydrophobe 8 d'autre part est par exemple comprise entre 1 μm et 100 μm ou 500 μm. Ce conducteur 10 peut se présenter par exemple sous la forme d'un fil de diamètre compris entre 10 μm et quelques centaines de μm, par exemple
200 μm. Ce fil peut être un fil d'or ou d'aluminium ou de tungstène ou d'autres matériaux conducteurs.
Lorsque deux substrats 1, 100 sont utilisés (figures 2 - 5B), ils sont distants d'une distance comprise entre, par exemple, 10 μm et 100 μm ou 500 μm.
Quel que soit le mode de réalisation considéré, une goutte de liquide 2 pourra avoir un volume compris entre, par exemple, 1 nanolitre et quelques microlitres, par exemple entre 1 ni et 5 μl ou 10 μl.
En outre chacune des électrodes 4 aura par exemple une surface de l'ordre de quelques dizaines de μm2 (par exemple 10 μm2) jusqu'à 1 mm2, selon la taille des gouttes à transporter, l'espacement entre électrodes voisines étant par exemple compris entre 1 μm et 10 μm. La structuration des électrodes 4 peut être obtenue par des méthodes classiques des micro¬ technologies, par exemple par photolithographie.
Des procédés de réalisation de puces incorporant un dispositif selon l'invention peuvent être directement dérivés des procédés décrits dans le document FR - 2 841 063.
Des conducteurs, et notamment des conducteurs 112 peuvent être réalisés par dépôt d'une couche conductrice et gravure de cette couche suivant le motif approprié de conducteurs, avant dépôt de la couche hydrophobe 108. Les électrodes peuvent être réalisées par dépôts d'une couche métallique (par exemple en un métal choisi parmi Au, Al, ITO, Pt, Cr, Cu) par photolithographie. Le substrat est ensuite recouvert d'une couche diélectrique, par exemple en Si3N4 ou en SiU2. Enfin un dépôt d'une couche hydrophobe est effectué, comme par exemple un dépôt de téflon réalisé à la tournette.
Un tel dispositif de déplacement de gouttes peut mettre en œuvre un réseau bidimensionnel d'électrodes qui vont permettre, de proche en proche, de déplacer des liquides dans ou sur un plan, de les mélanger, afin de réaliser des protocoles complexes.
Dans le cas du mode de réalisation avec caténaires 10 (figures 1A-3B) , un ensemble bidimensionnel (2D) de ces caténaires peut être réalisé au-dessus de l'ensemble 2D d'électrodes 4. Dans le cas du mode de réalisation avec contre-électrode 112 incorporée dans le capot 100 (figures 4-5B) , cette contre - électrode peut aussi avoir une structure bidimensionnelle .
Comme illustré sur les figures 6 et 7, un dispositif pour l'analyse de fluorescence selon la présente invention comporte un dispositif d' électromouillage du type décrit ci-dessus, comportant au moins une partie pour l'analyse I du petit volume à analyser ou goutte d'échantillon 2, entourée par une partie d'excitation II et une partie d'émission III.
Le dispositif selon la présente invention peut comporter des moyens pour mettre en place la goutte ou échantillon à analyser. Ces moyens peuvent être formés comme représentés sur les figures 6 et 7 par le réseau d'électrodes 4 s' étendant, dans l'exemple représenté, en zigzag, mais les électrodes d' électromouillage peuvent avoir toute autre forme souhaitée.
Sur la figures 7', les moyens de déplacement des échantillons à analyser sont formés par des canaux 300 s' étendant de réservoirs de liquides colorés (non représentés) jusqu'à la zone d'analyse, les échantillons étant déplacés au moyen de pompes (non représentées) .
D'autres moyens de déplacement d'échantillons liquides peuvent convenir.
Les gouttes baignent avantageusement dans un liquide non miscible avec celui des gouttes, par exemple de l'huile lorsque les gouttes sont formées d'une solution aqueuse. Ceci permet d'éviter 1' évaporation des gouttes et de modifier la tension nécessaire aux déplacements. En effet, la présence de l'huile modifie les caractéristiques du milieu. De plus, en choisissant deux liquides d'indice optique proche, les réflexions sont limitées.
Dans l'exemple représenté en figures 6 et 7, le filtre d'excitation et le filtre d'émission sont tous deux sous forme d'une goutte de liquide coloré.
On pourrait prévoir d' avoir un filtre d'excitation ou d'émission sous forme de goutte et un filtre d'émission ou d'excitation, par exemple de type filtre solide. Selon le dispositif représenté en figures 6 et 7, il est possible d'utiliser un filtre d'excitation formé par une goutte de liquide coloré 234.1 ou une autre goutte de liquide coloré 234.2 ayant des propriétés différentes, notamment optiques.
La partie d'excitation II comporte une zone d'accueil d'un filtre d'excitation dite zone d'excitation 224, lorsqu'une mesure est réalisée, et des zones 230.1 et 230.2 pour le stockage des filtres d'excitation, respectivement 234.1 et 234.2.
Les zones de stockage 230.1 et 230.2 sont disposées, dans l'exemple de réalisation, de part et d'autre de la zone d'excitation 224.
Le déplacement d'une goutte d'une zone de stockage à la zone d'excitation 224 s'effectue entre autre par électromouillage de la manière décrite ci-dessus pour la goutte 2 d'échantillon à l'aide des figures 1A-1C.
La partie d'excitation II comporte des troisièmes et quatrièmes (non représentés) moyens électriquement conducteurs aptes à appliquer un champ électrostatique à la goutte filtre 234.1, 234.2.
Les troisièmes moyens sont formés par un réseau d'électrodes enterrées dans le substrat 1 et les quatrièmes moyens sont formés, par exemple par une contre-électrode (non représentée) de structure similaire à celle de la contre-électrode 10 (figures 1A-1C) , en vis-à-vis du réseau d'électrodes.
La couche hydrophobe de la couche diélectrique est avantageusement la même que celle des premiers moyens de déplacement 4. Le réseau d'électrodes s'étend entre la zone d'excitation 224 et chacune des zones de stockage 230.1, 230.2. Dans l'exemple représenté, le réseau d'électrodes comporte une électrode 240.1 dans la zone d'excitation 224, une électrode 240.2 dans la zone de stockage 230.1, une électrode 240.3 dans la zone de stockage 230.2 et des électrodes 240.4, 240.5 intermédiaires disposées respectivement entre la zone d'excitation 224 et la zone de stockage 230.1 et entre la zone d'excitation 224 et la zone de stockage 230.2.
On pourrait prévoir un nombre supérieur d'électrodes, et un chemin plus long et plus complexe entre les zones de stockage et d'excitation.
Des moyens de commutation et de commandes du réseau d'électrodes, identique ou similaire à ceux du réseau 4 sont prévus. Ainsi, lorsque l'électrode 240.1 de la zone d'excitation 224 passe dans un état actif, la goutte 234.1 étant dans sa zone de stockage 230.1 et l'électrode 240.2 étant dans un état inactif, la goutte 234.1 se déplace de la zone de stockage 230.1 vers la zone d'excitation 224.
L'électrode 240.1 de la zone d'excitation 224 a avantageusement une forme rectangulaire. La goutte formant filtre prend sensiblement la forme de l'électrode ; ainsi tous les rayons lumineux suivant sensiblement une direction X sensiblement perpendiculaire à une face de l'électrode 240.1 rectangulaire, traversent le filtre d'excitation sur une même longueur.
On peut également envisager de réaliser une électrode 240.1 de forme parabolique, sphérique, concave ou convexe, permettant alors au filtre d'excitation de remplir également la fonction de lentille afin de participer à la mise en forme du rayon lumineux d'excitation, par exemple pour le focaliser ou le rendre divergent . Les électrodes 240.2 et 240.3 des zones de stockage sont, dans l'exemple représenté, de forme triangulaire permettant d'optimiser l'encombrement de l'ensemble du dispositif, mais des électrodes ayant une autre forme, par exemple rectangulaire peuvent également convenir.
La partie d'émission III est de structure proche de celle de la partie d'excitation II.
Selon le dispositif représenté en figures 6 et 7, il est possible d'utiliser un filtre d'émission formé par une goutte de liquide coloré 244.1 ou une autre goutte de liquide coloré 244.2, ayant des propriétés différentes, notamment optiques.
La partie d'émission III comporte une zone d'accueil 246 d'un filtre d'émission, dite zone d'émission, lorsqu'une mesure est réalisée, et des zones 248.1 et 248.2 pour le stockage des filtres d'émission, respectivement 244.1, 244.2.
Les zones de stockage 248.1 et 248.2 sont disposées dans l'exemple de réalisation de part et d'autre de la zone d'émission 246.
La zone d'émission 246 s'étend de préférence sensiblement selon un axe Y, orthogonal à l'axe X des rayons lumineux d'excitation, de manière à recevoir la lumière d'émission émise par la goutte 2. La partie d'émission III comporte des cinquièmes 250 et sixièmes (non représentés) moyens électriquement conducteurs, de réalisation similaire à ceux de la partie d'excitation.
Les quatrièmes moyens conducteurs 250 comportent, dans l'exemple représenté un réseau de cinq électrodes 252.1, 252.2, 252.3, 252.4, 252.5 pour déplacer un goutte 244.1, 244.2.
Les sixièmes moyens conducteurs formant contre-électrode sont disposés en vis-à-vis du réseau d'électrodes 252.1 à 252.5 ou dans le capot en configuration fermée (figures 9A et 9B) .
La description du fonctionnement des moyens de déplacements de la partie d'excitation II s'applique, ainsi que celle des formes des électrodes.
Sur la figure 8A, on peut voir le dispositif selon la figure 6 vu selon la flèche 264. Le dispositif est dans une configuration de mesure de fluorescence, une goutte d'excitation 234.1 est en place en arrière de la goutte d'échantillon 2 dans le sens de déplacement de la lumière d'excitation. Les flèches 260,261 schématisent respectivement la lumière issue d'une source lumineuse et la lumière de fluorescence .
Sur la figure 8B, on peut voir le dispositif de la figure 6 vu selon la flèche 266 ; une goutte d'émission est positionnée en avant de la goutte d'échantillon 244.1 selon le trajet de la lumière de fluorescence émise sortant de la goutte d' échantillon 2. La flèche 268 schématise la lumière d'excitation arrêtée par la goutte. La lumière de fluorescence 261 est ensuite collectée par un dispositif de traitement (non représenté) pour déterminer la quantité de fluorophore contenue dans la goutte d'échantillon et en déduire la concentration du liquide source.
Les rayons lumineux proviennent d'une source de lumière 242 qui est, par exemple, extérieure au dispositif, tel que cela est représenté en figures 6 et 7. La source de lumière peut également être intégrée au dispositif.
La source de lumière 242 est, par exemple, une lampe à incandescence halogène à arc (xénon, mercure) ou une lampe à décharge appelée également flashlamp. La source de lumière peut également être un laser extérieur ou une ou plusieurs diodes électroluminescentes (LED) . Un polymère organique
(OLED) ou une quelconque source de lumière chimique ou de type semi-conducteur peut également convenir.
Sur les figures 6 et 7, on peut voir des parois 280 bordant et séparant les zones d'excitation, d'émission et de mesure.
Ces parois permettent d'éviter la présence d'une lumière parasite pouvant engendrer, par exemple une lumière d'excitation non filtrée, une réflexion sur les gouttes...
En outre, ces parois évitent les fuites d'huile et forment un support pour le capot dans le cas d'un dispositif fermé.
Ces parois sont par exemple réalisées en résine .
Sur les figures 6 et 7, est également représenté un détecteur 254 de la lumière de fluorescence provenant du filtre d'émission. Dans une variante de réalisation, le détecteur peut être intégré à la puce, par exemple dans le cas d'une photodiode conçue dans l'empilement des couches technologiques, ou bien dans le cas d'un capteur CMOS collé au bord de la puce.
Le détecteur peut également être un photomultiplicateur, une caméra CCD ou encore une photodiode à avalanche.
Les rayons lumineux provenant de la source lumineuse 242 peuvent être guidés dans le dispositif et mis en forme directement par des lentilles disposées en dehors de la puce, ou par l'intermédiaire de moyens supplémentaires d'un système optique 256 ou de miroirs ou encore d'une ou plusieurs fibres optiques ou guides de lumière.
On peut également prévoir de mettre en forme les rayons lumineux en utilisant directement le filtre d'excitation, par exemple en utilisant une électrode 240.1 de forme particulière, tel que cela a été décrit précédemment et/ou un fluide non miscible d'indice particulier.
Il est également possible de moduler le rayon d'émission en modifiant la forme de la goutte 2 à analyser, par électromouillage. Par exemple, dans le cas d'une électrode de forme rectangulaire, en l'absence de tension la goutte disposée sur cette électrode est de forme sensiblement ronde, alors qu'en présence d'une tension, la goutte a sensiblement une forme rectangulaire. Ainsi la distance à parcourir dans l'échantillon par le faisceau optique d'émission peut être modifiée, ce qui peut permettre une détection synchrone .
La mise en forme à l'aide des gouttes de liquide permet d' intégrer plusieurs fonctions dans le dispositif selon la présente invention sans modifier sa compacité .
Nous allons maintenant expliquer le fonctionnement d'un tel dispositif.
Considérons que la goutte d'excitation 234.1 et la goutte d'émission 244.1 permettent une détection d'un fluophore A, tandis que les gouttes d'excitation 234.2 et d'émission 244.2 permettent la détection d'un fluorophore B, les fluorophores A et B dont on veut déterminer la concentration, étant contenus dans l'échantillon de liquide 2.
Dans une première étape, l'échantillon à mesurer est déplacé, par exemple par les moyens 4 jusqu'à la zone de mesure 222.
La goutte d'excitation 234.1 est déplacée de la zone de stockage 230.1 à la zone d'excitation 224.
La goutte d'émission 244.1 est déplacée de la zone de stockage 248.1 à la zone d'émission 246.2.
Tous ces déplacements ont lieu par électromouillage.
Un faisceau optique généré par la source lumineuse 242 traverse la goutte d'excitation 234.1 et est filtré par celle-ci. Le faisceau lumineux n'émet plus que dans une longueur d' onde déterminée par la goutte d'excitation 234.1. Le faisceau lumineux ainsi filtré traverse la goutte 2, qui émet alors une lumière de fluorescence du fait de la présence des fluorophores A (figure 8A) .
Cette lumière de fluorescence traverse ensuite la goutte d'émission 244.1, qui la filtre de manière à absorber la lumière d'excitation et à ne laisser passer que la lumière de fluorescence (figure 8B) .
Cette lumière de fluorescence est ensuite collectée par le détecteur 254, qui grâce à une calibration préalable, en déduit la concentration en fluorophore A.
Ensuite pour déterminer la concentration des fluorophores B, on remplace les gouttes 234.1 et 244.1 par les gouttes d'excitation et d'émission 234.2 et 234.2 adaptées à la détection des fluorophores B. Les gouttes 234.1 et 244.1 sont replacées dans leur zone de stockage 230.1, 248.1 respective.
La détection s'effectue de la même manière que pour les fluorophores B.
Le détecteur 254 détermine sur la base de la lumière de fluorescence due aux fluorophores B, la concentration en fluorophore B.
Lorsque toutes les mesures sur une goutte sont terminées, on peut remplacer l'échantillon 2 par un autre échantillon à analyser.
Le dispositif selon la présente peut comporter plus de deux filtres d'excitation et/ou d'émission, le nombres des zones de stockage sera alors adapté en conséquence. Sur les figures 9A et 9B, on peut voir une variante de réalisation du dispositif selon la figure 6 comportant un capot 100 muni sur sa face intérieure d'un revêtement conducteur 265 formant la contre- électrode. Ce capot peut, par exemple être transparent, pour permettre de contrôler le déplacement des gouttes.
Sur les figures 12A et 12B, on peut voir une variante de réalisation du dispositif des figures 9A et 9B, dans laquelle le capot 100 transparent permet également de réaliser la mesure de fluorescence.
Ce dispositif comporte un deuxième capot 100.1 disposé à distance du premier capot 100 au dessus de celui-ci et délimitant une zone de réception d'un filtre d'émission. Le capot 100.1 comporte un réseau d'électrodes 4.1 transparentes et est muni d'une surface hydrophobe du côté du capot 100. Ces électrodes peuvent être activées pour mettre en mouvement les filtres d'émission 244.1, 244.2. Le fonctionnement de ce dispositif est identique à celui du dispositif décrit précédemment, sauf que le faisceau de fluorescence 261 sortant de l'échantillon 2 traverse la capot transparent 100, puis le filtre d'émission 244.1 et enfin le deuxième capot 100.1 avant d'atteindre le détecteur ( non représenté).
Les filtres d'excitation 234.1 et d'émission 244.1 peuvent être remplacés par les filtres 234.2, 244.2 pour effectuer des détections de fluorophores différents (figure 12B) . Ce dispositif permet une réalisation tridimensionnelle, qui permet de réduire l'encombrement du dispositif.
Sur les figure 1OA et 10B, on peut voir une variante de réalisation du dispositif de la figure 6, dans lequel les filtres d'émission et d'excitation ont les mêmes lieux de stockage.
Le dispositif comporte une zone de stockage 270 permettant, dans l'exemple représenté, le stockage de six filtres 271.1 à 271.6 différents. La zone 270 comporte donc six « casiers », disposés sur un côté de la zone de mesure. Chaque casier est défini par une électrode d' électromouillage 272.1 à 272.6. Le dispositif comporte également une zone de déplacement 274 pour permettre le déplacement des filtres de la zone de stockage vers la partie d'émission III ou d'excitation II comportant six électrodes 276.1 à 276.6 raccordées chacune à une des six électrodes 272.1 à 272.6 de la zone de stockage respectivement, par une électrode intermédiaire 272.1' à 272.6'.On pourrait prévoir d'avoir directement les électrodes 276.1 à 276.6 adjacentes aux électrodes 272.1 à 272.6.
Ce dispositif permet donc de distinguer au moins trois fluorophores différents, voire plus en combinant les différents filtres.
Les électrodes 276.1 à 276.6 forment également avec une électrode 276.7 adjacente à l'électrode 252.2 de la zone d'émission, un chemin continu pour le déplacement des filtres liquides en direction de la zone d'émission III. Dans l'exemple représenté, le dispositif comporte également une zone 278 de déplacement, intermédiaire entre la partie d'émission III et la partie d'excitation II et formée dans l'exemple représenté, par quatre électrodes 278.1, 278.2, 278.3, 278.4, définissant un chemin entre la zone d'excitation et la zone d'émission. En effet, dans l'exemple représenté en figure 1OA et 1OB, le filtre d'excitation passe par la zone d'émission pour rejoindre la zone d'excitation en empruntant le chemin intermédiaire 278.
Selon une variante, on peut prévoir de faire passer la goutte d'excitation par la zone de mesure I avant la mise en place de la goutte d'échantillon, ou encore prévoir un chemin dédié spécifiquement au déplacement de la goutte d' excitation .
Nous allons maintenant expliquer le fonctionnement de ce dispositif.
Sur la figure 1OA, les six filtres liquides 271.1 à 271.6 sont en place dans leur casier respectif.
Si l'on souhaite utiliser le filtre d'excitation 271.2 et le filtre d'émission 271.4, on active l'électrode 272.2', puis 276.2, le filtre 271.2 se déplace alors jusqu'à l'électrode 276.2, puis on active les électrodes 276.1, 276.7 et l'électrode d'émission 252.3. On active ensuite les électrodes 278.1, puis 278.2, 278.3, 278.4 et enfin l'électrode d'excitation 240.1, le filtre 271.2 se trouve alors en place dans la zone d'excitation 224. Pour le filtre d'émission, on active les électrode 272.4', puis les électrodes 276.4, 276.3, 276.2, 276.1, 276.7 et l'électrode d'émission 252.3. Le filtre d'émission 276.4 se trouve alors en place pour filtrer la lumière d'émission.
L'échantillon peut être mis en place avant, pendant ou après la mise en place des filtres . Il peut entre autre être amené lui aussi par électromouillage.
La mesure de fluorescence peut alors être réalisée .
Afin de mesurer un autre fluorophore on change le filtre d'excitation et/ou le filtre d'émission, comme décrit précédemment. Dans la configuration de la figure 10B, on utilise les filtres 271.1 et 271.3.
Le nombre d'électrodes pour la zone de stockage et pour les zones de déplacement peut être adapté aux besoins, par exemple la zone de stockage peut comporter plus d'une électrode par filtre.
Le dispositif comporte également des parois 280 pour isoler le dispositif des lumières parasites et éviter les fuites d'huile. Cependant, à l'inverse du dispositif des figures 6 et 7, il n'y a pas de paroi 280 séparant les zones II et III pour permettre le passage des filtres d'excitation par la zone III d' émission . Si un chemin de déplacement est prévu pour les filtres d'excitation, on peut prévoir une telle paroi de séparation.
On peut envisager de mélanger les filtres entre eux si cela est nécessaire en faisant se rencontrer les gouttes dans une zone de mélange, ou de diluer ceux-ci en mélangeant une goutte de liquide avec une goutte de liquide transparent ou neutre du point de vu optique.
On peut également prévoir un dispositif générateur de filtre, comportant d'une part un réservoir de solution incolore, par exemple aqueuse et de l'autre au moins un réservoir de colorant concentré, avantageusement plusieurs afin de réaliser des filtres ayant des propriétés optiques différentes.
En mélangeant la solution incolore et un colorant, on obtient un filtre utilisable pour les mesures. Ce filtre peut être stocké pour une utilisation ultérieure ou évacué, un nouveau filtre sera fabriqué. Dans ce cas, le dispositif ne comporte alors pas de zone de stockage de filtre, mais des zones de stockage de composants pour fabriquer des filtres.
Les figures HA - HD représentent comment peut être réalisé un réservoir tel que les réservoirs permettant la fabrication de filtres.
Un liquide 300 à dispenser est déposé dans un puits 320 de ce dispositif (figure HA) . Ce puit est par exemple réalisé dans le capot supérieur 100 du dispositif. La partie inférieure, représentée de manière schématique sur les figures HA - HD, est par exemple similaire à la structure des figures 1A-1C. Si on n'utilise pas une configuration avec un capot supérieur, la configuration ouverte laisse la possibilité de verser un liquide tel que de l'huile sur toute la surface. On peut ensuite déplacer une goutte par électromouillage. Trois électrodes 4-1, 4-2, 4-3, similaires aux électrodes 4 de déplacement de gouttes de liquide, sont représentées sur les figures HA - HD.
L' activation de cette série d'électrodes 4-1, 4-2, 4-3 conduit à l'étalement d'une goutte à partir du puits 320, et donc à un segment liquide 301 comme illustré sur la figure HC.
Puis, on coupe ce segment liquide en désactivant une des électrodes activées (électrode 4-2 sur la figure HC) . On obtient ainsi une goutte 2, comme illustré sur la figure HD.
On utilise donc une série d'électrodes 4-1, 4-2, 4-3 pour étirer du liquide du réservoir 320 en un doigt 301 (figures HB et HC) puis pour couper ce doigt 301 de liquide (figure HD) et former une goutte 2 qui va pouvoir être emmenée vers tout site de mesure comme décrit ci-dessus.
Un procédé de mesure utilisant des filtres liquides déplacés par électromouillage, comporte les étapes suivantes de : a) de déplacement d'un filtre d'excitation jusqu'à sa position de mesure, b) et/ou de déplacement d'un filtre d'émission jusqu'à sa position de mesure, les filtres d'émission et d'excitation étant choisi pour mesurer au moins un fluorophore déterminé, c) de déplacement du petit volume de liquide à mesurer jusqu'à sa position de mesure avant, pendant ou après la mise en place du ou des filtres, d) de génération d'un faisceau optique en direction du filtre d'excitation et du petit volume de liquide, e) de collecte d'un signal sortant du filtre d'émission.
Nous allons maintenons décrire le procédé de mesure de manière détaillée.
Dans une première étape, l'échantillon ou le ou les filtres sont mis en place. Les gouttes de liquide servant de filtres, sont déplacées par électromouillage, par activation alternée des électrodes concernées.
Le choix du filtre d'excitation et du filtre d'émission s'effectue en fonction du fluorophore à détecter.
Lorsque toutes les gouttes de liquide sont dans leur position permettant la mesure, un faisceau lumineux est généré en direction de l'échantillon. On peut prévoir de mettre en forme le faisceau lumineux avant qu'il ne pénètre dans le filtre d'excitation par les moyens décrits précédemment.
Simultanément, on peut également prévoir une modifier par électromouillage la forme du petit volume de liquide à analyser pour moduler le rayon d'émission.
Lorsque plusieurs fluorophores sont à mesurer, le procédé selon la présente invention prévoit le changement du filtre d'émission et/ou du filtre d'excitation et de procéder à nouveau à la mesure par répétition des étapes a) , b) , d) et e) . Le procédé peut également prévoir une étape préalable de fabrication des filtres par mélange de plusieurs gouttes de liquide coloré ou par dilution d'une goutte de liquide coloré, tel que cela a été décrit précédemment .

Claims

REVENDICATIONS
1. Dispositif microfluidique pour la mesure de fluorescence d' au moins un volume de liquide (2) comportant des moyens de déplacement (4) par électromouillage sur une surface hydrophobe :
- pour amener une goutte formant filtre d'excitation (234.1, 234.2) dans une zone d'excitation (224), - et/ou pour amener une goutte formant filtre d'émission (244.1, 244.2) liquide dans une zone d'émission (246), les gouttes formant filtre étant disposées de part et d'autre d'une zone de mesure apte à recevoir le volume de liquide.
2. Dispositif selon la revendication précédente, comportant des moyens de déplacement par électromouillage pour amener le volume de liquide (2) dans la zone de mesure en sortie de la zone de filtre d'excitation et devant l'entrée de la zone de filtre d' émission,
3. Dispositif selon la revendication 1 ou 2, comportant des zones de stockage 230.1,230.2,248.1,248.2,270) des différents filtres.
4. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, comportant une source de faisceau optique (242) destinée à éclairer le petit volume de liquide à analyser et positionnée de manière à ce que le faisceau optique traverse le filtre d'excitation en position de mesure avant de traverser le petit volume de liquide (2) .
5. Dispositif selon la revendication précédente, dans lequel la source de faisceau optique (242) est un laser, ou au moins une diode électroluminescente, ou un polymère organique, ou de type chimique ou semi-conducteur.
6. Dispositif selon la revendication 4 ou
5, comportant des moyens de mise en forme du faisceau optique .
7. Dispositif selon la revendication précédente, dans lequel les moyens de mise en forme du faisceau optique comportent un système optique, au moins un miroir ou au moins une fibre optique.
8. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, comportant des moyens pour moduler la forme du petit volume de liquide (2) par électromouillage afin de moduler le signal obtenu après traversée du petit volume de liquide par le faisceau optique .
9. Dispositif selon l'une quelconque es revendications précédentes, dans lequel les moyens de déplacement comportent des électrodes d' électromouillage et des moyens électriquement conducteurs formant contre-électrode pour ces électrodes d' électromouillage .
10. Dispositif selon la revendication précédente, comportant un deuxième substrat (100) en regard de la surface hydrophobe, formant capot (100) .
11. Dispositif selon la revendication précédente, dans lequel ledit deuxième substrat (100) est transparent pour permettre un contrôle visuel direct .
12. Dispositif selon la revendication précédente comportant un troisième substrat (100.1) transparent comportant des électrodes, ledit troisième substrat (100.1) délimitant la zone d'émission, les filtres d'émission liquide pouvant être déplacés par les électrodes du troisième substrat (100.1).
13. Dispositif selon la revendication 10 à 12, dans lequel le deuxième substrat (100) comporte la contre-électrode .
14. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, dans lequel la contre-électrode est formé par un fil conducteur suspendu.
15. Dispositif selon l'une des revendications 9 à 14, dans lequel une électrode d' électromouillage de la zone de filtre d'excitation et/ou une électrode d' électromouillage de la zone de filtre d'émission est de forme sensiblement rectangulaire.
16. Dispositif selon l'une des revendications 12 à 14, dans lequel une électrode d' électromouillage de la zone de filtre d'excitation et/ou une électrode d' électromouillage de la zone de filtre d'émission est de forme parabolique, sphérique, concave ou convexe permettant une mise en forme de la lumière d'excitation.
17. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes comportant des moyens formant au moins deux réservoirs de liquide pour fabriquer des filtres liquides.
18. Dispositif, selon l'une quelconque des revendications précédentes comportant des parois (280) isolant les zones de mesure (I), d'excitation (II) et d'émission (III) de l'environnement extérieur.
19. Procédé de mesure de fluorescence comportant les étapes suivantes :
- de déplacement d'une goutte d'un filtre d'excitation (234.1, 234.2) jusqu'à la zone de filtre d'excitation (224),
- et/ou de déplacement d'une goutte d'un filtre d'émission (244.1 ,244.2) jusqu'à la zone de filtre d'émission (246), les filtres d'émission et d'excitation étant choisis pour mesurer au moins un fluorophore déterminé,
- de déplacement d'un petit volume de liquide (2) à analyser jusqu'à sa position de mesure
(222) en sortie de la zone de filtre d'excitation (224) et devant l'entrée de la zone de filtre d'émission (246), avant, pendant ou après la mise en place du ou des filtres,
- de génération d'un faisceau optique en direction du filtre d'excitation et du petit volume de liquide (2) ,
- de collecte d'un signal sortant du filtre d'émission.
20. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel les filtres d'excitation et d'émission liquides sont formés par des liquides colorés .
21. Procédé selon la revendication 19 ou
20, comportant préalablement à la mise en place du ou des filtres pour une mesure de fluorescence, une étape de préparation des filtres liquides.
22. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel l'étape de préparation des filtres s'effectue par mélange de plusieurs gouttes de liquide coloré ou par dilution d'une goutte de liquide coloré .
23. Procédé selon l'une quelconque des revendications 19 à 22, dans lequel les filtres et le petit volume à analyser baignent dans un liquide non miscible avec les liquides formant les filtres et le petit volume à analyser.
24. Procédé selon l'une quelconque des revendications 19 à 23, comportant également une étape de mise en forme du faisceau optique.
25. Procédé l'une quelconque des revendications 19 à 24, comportant également une étape de modulation par électromouillage de la forme du ou des filtres
26. Procédé l'une quelconque des revendications 19 à 25, comportant également une étape de modulation par électromouillage de la forme du de 1' échantillon .
27. Procédé selon l'une quelconque des revendications 19 à 26, comportant en outre des étapes supplémentaires de changement du filtre d'émission et/ou du filtre d'excitation pour mesurer un autre fluorophore .
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017170075A1 (fr) * 2016-03-30 2017-10-05 シャープ ライフ サイエンス （イーユー）リミテッド Dispositif microfluidique

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040058450A1 (en) * 2002-09-24 2004-03-25 Pamula Vamsee K. Methods and apparatus for manipulating droplets by electrowetting-based techniques

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2872574B1 (fr) * 2004-07-01 2006-11-17 Commissariat Energie Atomique Systeme de detection synchrone de fluorescence en goutte

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040058450A1 (en) * 2002-09-24 2004-03-25 Pamula Vamsee K. Methods and apparatus for manipulating droplets by electrowetting-based techniques

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
POLLACK M G ET AL: "ELECTROWETTING-BASED ACTUATION OF DROPLETS FOR INTEGRATED MICROFLUIDICS", LAB ON A CHIP, ROYAL SOCIETY OF CHEMISTRY, CAMBRIDGE, GB, vol. 2, no. 2, 11 March 2002 (2002-03-11), pages 96 - 101, XP008038786, ISSN: 1473-0197 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017170075A1 (fr) * 2016-03-30 2017-10-05 シャープ ライフ サイエンス （イーユー）リミテッド Dispositif microfluidique
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