WO2010106289A1 - Dispositif de microscopie de fluorescence et methode d'observation associee - Google Patents

Dispositif de microscopie de fluorescence et methode d'observation associee Download PDF

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WO2010106289A1
WO2010106289A1 PCT/FR2010/050482 FR2010050482W WO2010106289A1 WO 2010106289 A1 WO2010106289 A1 WO 2010106289A1 FR 2010050482 W FR2010050482 W FR 2010050482W WO 2010106289 A1 WO2010106289 A1 WO 2010106289A1
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fluorescence microscopy
cache
fluorescence
sample
equal
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PCT/FR2010/050482
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Inventor
Emmanuel Fort
Sandrine Leveque Fort
Julie Delahaye
Karla Balaa
Original Assignee
Université Paris Diderot - Paris 7
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    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/16—Microscopes adapted for ultraviolet illumination ; Fluorescence microscopes
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/33—Immersion oils, or microscope systems or objectives for use with immersion fluids

Definitions

  • the present invention relates to a fluorescence microscopy device and an associated observation method.
  • Fluorescence microscopy is an optical microscopy technique that takes advantage of the fluorescence phenomenon to observe various compounds. Fluorescence is the property that some bodies have to emit fluorescent light by themselves.
  • the fluorescence of a compound to be observed may be primary if this compound is fluorescent by itself (for example: chlorophyll, oil) or secondary when the compound to be observed is marked with a fluorescent substance, called fluorochrome or fluorescent marker.
  • a fluorescence microscopy device usually comprises a light source for excitation, means for separating the excitation photons from the emission photons, a lens system for collecting the photons and generally imaging means. Fluorescence techniques can be used with different types of microscope including: a conventional optical microscope where excitation light can pass through the sample or through the lens. In the latter case, we then speak of epifluorescence microscopy; a confocal microscope, for example a scanning laser which makes it possible, in particular, to produce three-dimensional images of the sample;
  • TIRF total internal fluorescence fluorescence microscope
  • TIRF total internai reflection fluorescence
  • the illumination is performed by an incident beam of a laser at a supercritical angle to create an evanescent wave (exponentially decreasing orthogonally at the interface).
  • TIRF microscopy although currently in full swing and allowing accurate observations, nevertheless has certain disadvantages. Indeed the use of a suitable laser source is expensive and the excitation field thus generated may not be homogeneous (due to interference from the coherence of the beam).
  • the aim of the present invention is to propose a fluorescence microscopy device that makes it possible to obtain high quality fluorescence images with an inexpensive device or to improve the quality of the images obtained by TIRF microscopy.
  • a "full-field” objective is an objective for forming a full-field image.
  • such an objective is a commercial objective of standard use in fluorescence microscopy.
  • the device according to the invention it is possible to obtain fluorescence microscopy images of very high quality, allowing for example to obtain valuable information for the study of biological materials.
  • the device according to the invention makes it possible to obtain full-field fluorescence images with great sensitivity, in particular from areas located at the interface of the refractive index support n s and the liquid medium of refractive index. n L. It is thus possible to visualize events occurring near this interface, at a depth of about one sixth of the wavelength of the excitation light.
  • the depth on which the observation takes place is of the order of 50 nm to 100 nm for wavelengths in the visible range.
  • the supports commonly used in fluorescence microscopy are made of glass and it is advantageous to choose standard glasses with a refractive index less than or equal to 1.55, the cost of which is low.
  • the addition of the cache in the rear focal plane of the objective or in a conjugate plane can be done in a simple manner and in particular be implemented with commercial fluorescence microscopes. The result is an improved device whose cost of improvement is very modest.
  • the function of the cache consists in concealing the fluorescence emission components of the sample in the angular directions where the angle ⁇ is less than or equal to the critical angle ⁇ c .
  • Figures 5a and 5b appended hereto recall the principles of fluorescence emission.
  • a fluorochrome behaves like an antenna capable of emitting a signal. This transmitter has in its immediate environment (a few dozen nanometers) electromagnetic components that are evanescent when placed in a homogeneous medium. These components can become propagative when the fluorochrome is placed near an interface. They then propagate at angles greater than the critical angle in the middle of the highest refractive index.
  • FIG. 5a represents the fluorescence emission components of a transmitter 12 located at the interface between a support 20 and a liquid medium 11.
  • the fluorescence emission of the emitter 12 comprises a component 14 emitted for ⁇ between 0 and ⁇ c and a component emitted for ⁇ greater than ⁇ c , called “forbidden light” or “supercritical light” and corresponds to the evanescent components in the liquid medium 11 that has become propagative in the transparent support 20.
  • the light emitted comprises the same component 14, emitted for ⁇ between 0 and ⁇ c, but no longer includes a component emitted at an angle greater than ⁇ c , corresponding to supercritical light.
  • the arrangement of the device cover according to the invention makes it possible to select only the supercritical light and thus to produce images giving information on the events taking place in about 100 nm depth with respect to the liquid medium / support interface.
  • near field image will be used to designate an image made with the cache of the device according to the invention, and "image of epifluorescence” an image made without said cache.
  • the device according to the invention can comprise one or the following characteristics which can be combined with each other: the cache is removable; it is thus possible to successively perform images with and without cache; we can thus make images of epifluorescence and near field; the cache is composed of an opaque disk and optionally opaque concentric rings;
  • the cache is chosen from the list of occultable devices consisting of a liquid crystal device, a microfluidic device, a mechanical device;
  • the numerical angular aperture, ON, of the immersion objective is greater than or equal to 1.45 and less than or equal to 1.50;
  • a polychromatic or monochromatic light source is arranged to illuminate the sample through the support on which it is arranged;
  • the fluorescence microscopy device further comprises a pinhole disposed in an image plane located in the optical path beyond the cache so as to allow observations of confocal microscopy; the fluorescence microscopy device further comprises a laser illumination source so as to allow observations of TIRF microscopy ("total internai reflection fluorescence", for “total internal reflection fluorescence”); it is also possible to implement the TIRF microscope using a conventional source that is focused;
  • the cache is removable and further comprises means for actuating this removable cache so as to allow a succession of observations of the sample with and without cache; the device further comprises means for acquiring the image of the sample and means for interfacing said acquisition means to enable alternating acquisition of images with and without cache.
  • the present invention also relates to a method of observation by fluorescence microscopy using the fluorescence microscopy device according to the invention and mentioned above, where the sample to be observed is illuminated through the support on which it is arranged. .
  • the sample to be observed is a biological sample comprising cells in the liquid medium of refractive index n L ;
  • the cache of the fluorescence microscopy device is removable and the method comprises an observation step without the cache and an observation step with the cache followed by a step of comparing the two images thus obtained;
  • the comparison step may comprise a computation step by combining the image obtained without the cache and the image obtained with the cache; the images are acquired by means of video acquisition and the succession of the observation steps with and without the cache is synchronized with the video rate of said video acquisition means;
  • FIG. 1 illustrates a schematic view of a fluorescence microscopy device according to the invention
  • FIG. 2 illustrates a variant according to the invention of the device according to FIG. 1, adapted to confocal microscopy
  • FIG. 3 illustrates a variant according to the invention of the device according to FIG. 1, adapted to TIRF microscopy;
  • FIG. 4 illustrates an exemplary cache used in the device according to the invention
  • Figures 5a and 5b illustrate the fluorescence emission components in different configurations and have been discussed above;
  • FIG. 6 illustrates the fluorescence profiles of fluorescent reference beads with and without a mask
  • FIGS. 7a and 7b illustrate fluorescence observations of the same cell respectively without and with the device according to the invention.
  • FIG. 1 shows a schematic view of a fluorescence microscopy device 100 according to the invention.
  • This includes an immersion objective 110 whose ON is greater than or equal to 1.33.
  • a glass support 20 is disposed above this immersion objective 110. Oil is disposed between the immersion objective 110 and the glass support 20.
  • a sample 10 to be observed is placed on the glass support 20.
  • This sample 10 comprises, for example, fluorescent components dispersed in water.
  • Excitation light is produced by a beam 200 coming from a light source which passes through an excitation filter 210 and is reflected by a dichroic mirror 120 to illuminate the light. Sample 10 after passing through the transparent support 20. An example of a path of the incident excitation light is shown by the arrows pointing upwards in the figure. The incident excitation light may be partially reflected and is then filtered by a transmission filter 130 so that the image formed in an image plane comprises only the fluorescence light emitted by the sample 10.
  • the fluorescence light emitted by the sample 10 passes through the transparent support 20, the dichroic mirror 120 and the emission filter 130.
  • this light is reflected on a mirror 140 and the rest of the device operates with the reflected light.
  • the fluorescence light is not reflected and the rest of the device operates with the transmitted light.
  • a lens 150 makes it possible to focus the light on an intermediate image plane 410.
  • the light is then parallelized by means of a lens 160 and then focused by a lens 180 on the image plane 430 where the image is acquired by a suitable device, in particular a camera 300.
  • the planes 430 and 410 are conjugate image planes of the observation plane.
  • the lenses 160 and 180 are arranged so that a conjugate plane 420 of the rear focal plane of the immersion objective 110 is located between these lenses 160 and 180.
  • a cover 170 is disposed in this rear focal plane of the immersion objective, so as to mask the fluorescence emission components of the sample 10 in the angular directions where the angle ⁇ is less than or equal to the angle critical ⁇ c .
  • the light rays emitted at a certain angle by the fluorescent emitters of the sample 10 located in the observation plane intercept the rear focal plane 400 of the objective (or any conjugate plane 420 of this plane 400) at a certain distance r ( ⁇ ) of the center (defined by the optical axis) of this plane.
  • r ( ⁇ ) is an increasing function of ⁇ .
  • r ( ⁇ ) is substantially proportional to sin ( ⁇ ).
  • r ( ⁇ ) n ⁇ xf 0 ⁇ sin ( ⁇ ), where f 0 is the focal length of the immersion objective 110 (generally of the order of a few millimeters) and n x is the index of the immersion medium used for the objective (in general of the oil).
  • f 0 the focal length of the immersion objective 110 (generally of the order of a few millimeters)
  • n x is the index of the immersion medium used for the objective (in general of the oil).
  • the cover 170 When the cover 170 is disposed in the conjugate plane of the rear focal plane, it is necessary to take into account the magnification factor related to the optical system.
  • the emission following the subcritical angles ⁇ ⁇ c intercepts the rear focal plane following a centered disc of radius r ( ⁇ c ).
  • the rays associated with the supercritical emission collected by the objective that is to say whose emission verifies ⁇ c ⁇ ⁇ ma ⁇ , form a ring in the rear focal plane r ( ⁇ c ) ⁇ r ( ⁇ ) ⁇ r ( ⁇ ma ⁇ ) • It is thus possible to mask selectively using a directory cache the rays emitted by the fluorescent emitters of the sample 10 at a given angle ⁇ .
  • ⁇ c The introduction of a disc of radius r ( ⁇ c ) makes it possible to select the supercritical rays and thus to selectively detect the fluorescent emitters of the sample 10 located near the water / glass interface of the support 20. eliminating the emission of the fluorescent emitters of the sample 10 located at a greater distance.
  • non-coherent light source for example a standard white light, in particular obtained with a mercury lamp.
  • a standard white light in particular obtained with a mercury lamp.
  • the function r ( ⁇ ) varies according to the objectives used which one may wish to change according to the observations. It may be advantageous to provide a variable radius cache system or to provide various easily retractable covers.
  • the cache may have a diameter greater than r ( ⁇ c ). It is thus possible to obtain a higher confinement of the detection of the fluorescent emitters of the sample 10. In fact, the most inclined components emitted by the fluorescent emitters of the sample 10 are associated with the fluorescent emitters which are the closest the water / glass interface. However, this results in a lower proportion of fluorescence detected. This proportion decreases when the diameter of the cache is widened.
  • the actuating means operate at the video rate (typically of the order of a few tens of Hertz) in order to go from the position without cache to the position with alternating cache at the speed of acquisition of images. It is thus possible to have volume and surface information simultaneously.
  • This imaging system is particularly suitable for imaging biological systems, in particular for the study of biological processes in living cells, such as cell adhesion phenomena, endocytosis / exocytosis, etc.
  • FIG. 2 is a schematic view of a variant according to the invention of the device of FIG. 1 in which the components present before the image plane 430 are identical in the two embodiments.
  • a pinhole type cache 190 having a hole 195 is disposed in the image plane.
  • a monodetector 350 allows point-by-point acquisition of the light passing through the hole 195. It is thus possible to obtain a configuration for performing confocal microscopy.
  • Figure 3 shows a schematic view of a variant, according to the invention, of the device of Figure 1 wherein the components of the microscope device are similar, but where the light source differs.
  • the light 250 is from a laser and the illumination of the sample is produced by total internal reflection. It is thus possible to obtain an improved TIRF type device.
  • a Nikon Ti-type fluorescence inverted microscope comprising a module (ref TI-T-BPH, MEB55810) which makes it possible to image the rear focal plane and to position an annular cover to enable the phase contrast (external) with the objectives of large numerical aperture. It is possible to put a cache 170 of the device according to the invention in this type of module.
  • the centering system and the adjustment of the position of the plane are quite suitable for a cache filtering sub-critical angles.
  • the system includes several positions for the different lenses as well as a position without a cover.
  • FIG 4 shows a schematic view of a cover 170 to be disposed on the rear focal plane 400 of the immersion objective 110 or in a conjugate plane 420 of said focal plane.
  • the cache 170 is composed of a central zone 171 in the form of a disc and two annular zones 172, 173, concentric with the central zone 171. Fine intermediate zones 174, 175 respectively separate the central zone 171 from the first annular zone 172. and the two annular zones 172, 173 between them.
  • the central areas 171 and annular 172, 173 are areas whose transmission can be varied, in particular between an occultation configuration and a light-transmitting configuration.
  • the cover may comprise more than two concentric annular zones and according to the example shown, only two concentric annular zones and the central zone have been obscured.
  • the cache 170 is a microfluidic system and channels 177, 178, 179 supply opaque fluid to the central zones 171 and annular 172, 173 and the intermediate zones 174, 175 are partition walls.
  • the cache 170 is a liquid crystal system and each annular central area 171, 172, 173 can be addressed by electrodes 177, 178, 179 so as to vary the transmission of the liquid crystals.
  • the liquid crystal system can be flexible in transmission type
  • SLM spatial light modulator
  • the cover 170 is a reflection device capable of reflecting light in an area of selected diameter.
  • a cache can for example be obtained with reflection-modulated pixel devices, also called “Digital Mirror Device”. It can also be of the SLM type in reflection.
  • the caches exemplified above make it possible to obtain very short transmission / shutter cycles, for example capable of following the rate of acquisition of the images with a camera.
  • a filter cube usually denotes "TRITC A” with a 543 nm excitation filter, a 593 nm emission filter and a 499/555 nm reference dichroic plate.
  • the light source used is a "Nikon Intensilight” commercial reference fibroid source with a 130 W Hg lamp and a "C-HGFI” ® generator.
  • the camera used is a Hamamatsu Camera, reference EMCCD C9100-13, cooled to substantially -65 °.
  • the cache 170 used was made by painting a circular counter-blade of thickness between 0.13 and 0.16 mm and diameter 16 mm.
  • the disk forming the cover is made by rotating the strip around its central axis.
  • the slat is placed horizontally on a spinning wheel equipped with a va ⁇ ateur.
  • a brush is fixed perpendicularly to the lamella on a support equipped with 2 micrometric translation plates in two orthogonal directions in order to finely adjust the brush / blade distance and the radial position of the brush (that is to say distance from the center of rotation).
  • the paint used is an opaque black paint for glass.
  • the cover is then positioned in the Nikon MEB55810 ("TI-T-BPH") module in place of the phase ring.
  • the position of the cover is adjusted using the Bertrand lens of the microscope and the movements of the module by means of centering and axial position screws).
  • the procedure followed is identical to that of the phase ring setting provided by the manufacturer with this module. Lateral resolution measurements were performed with fluorescent Fluosphere® beads
  • FIG. 6 illustrates the fluorescence intensity profile of these beads (normalized signal intensity on the y-axis as a function of the lateral displacement on the abscissa, expressed in ⁇ m).

Abstract

Dispositif de microscopie de fluorescence (100) pour observer d'un échantillon (10) dans un milieu liquide d'indice de réfraction nL disposé sur un support transparent (20) d'indice de réfraction ns supérieur à nL, et inférieur ou égal à 1,55, ledit dispositif comprenant un objectif plein champ à immersion (110) dont l'ouverture angulaire numérique est supérieure ou égale à 1,33 et inférieure ou égale à ns, un ensemble de lentilles (150, 160, 180), un cache (170) disposé dans le plan focal arrière (400) de l'objectif à immersion (110) ou dans un plan conjugué (420) dudit plan focal arrière de manière à occulter les composantes d'émission de fluorescence de l'échantillon (10) dans les directions angulaires où l'angle θ est inférieur ou égal à un angle critique θc, avec θc = arcsin (nL/ns). Méthode d'observation associée.

Description

DISPOSITIF DE MICROSCOPIE DE FLUORESCENCE ET METHODE D'OBSERVATION ASSOCIEE
La présente invention concerne un dispositif de microscopie de fluorescence et une méthode d'observation associée .
La microscopie de fluorescence est une technique de microscopie optique qui tire profit du phénomène de fluorescence pour observer divers composés. La fluorescence est la propriété que possèdent certains corps d'émettre de la lumière fluorescente par eux-mêmes.
La fluorescence d'un composé à observer peut être primaire si ce composé est fluorescent par lui-même (par exemple : chlorophylle, huile) ou secondaire quand on marque le composé à observer avec une substance fluorescente, dite fluorochrome ou marqueur fluorescent.
En biologie cellulaire, un grand nombre d'événements moléculaires intervenant à la surface des cellules sont étudiés en microscopie de fluorescence comme par exemple l'adhésion cellulaire, la fixation d'hormones sur des récepteurs de la membrane plasmique, la sécrétion de neurotransmetteurs ainsi que la dynamique membranaire (endocytose, exocytose) .
Un dispositif de microscopie de fluorescence comprend usuellement une source de lumière pour l'excitation, des moyens pour séparer les photons d'excitation des photons d'émission, un système de lentilles pour collecter les photons et en général des moyens d'imagerie. Les techniques de fluorescence peuvent être utilisées avec différents types de microscope notamment : un microscope optique classique où la lumière d'excitation peut passer par l'échantillon ou par l'objectif. Dans ce dernier cas, on parle alors de microscopie à épifluorescence ; - un microscope confocal, par exemple à balayage laser qui permet notamment de réaliser des images en trois dimensions de l'échantillon ;
- un microscope de fluorescence par réflexion totale interne (en anglais : « total internai reflection fluorescence » usuellement appelée TIRF) qui utilise une onde évanescente pour n'exciter la fluorescence que sur une très faible profondeur, immédiatement adjacente à l'interface du support de l'échantillon (en général en verre) et du milieu liquide (en général de l'eau) dans lequel est disposé l'échantillon. L'éclairage est réalisé par un faisceau incident d'un laser suivant un angle surcritique pour créer une onde évanescente (exponentiellement décroissante orthogonalement à l' interface) . La microscopie TIRF, bien qu'actuellement en plein essor et permettant des observations précises, présente néanmoins certains inconvénients. En effet l'utilisation d'une source laser adaptée se révèle onéreuse et le champ d'excitation ainsi généré peut ne pas être homogène (suite aux interférences provenant de la cohérence du faisceau) . En outre on constate qu'un éclairage par l'objectif ne permet pas une excitation homogène et que la profondeur de pénétration résultante n'est pas constante sur l'ensemble du champ à observer. De plus, il existe des pertes de confinement du champ excitateur liées à la diffusion intrinsèque de la lumière par les cellules. Le but de la présente invention est de proposer un dispositif de microscopie de fluorescence permettant d'obtenir des images de fluorescence de grande qualité avec un dispositif peu onéreux ou d'améliorer la qualité des images obtenues en microscopie TIRF.
L'invention propose ainsi un dispositif de microscopie de fluorescence pour observer l'émission de fluorescence d'un échantillon comprenant des composants fluorescents dans un milieu liquide d' indice de réfraction nL disposé sur un support transparent d' indice de réfraction ns supérieur à nL et inférieur ou égal à 1,55, ledit dispositif comprenant un objectif plein champ à immersion dont l'ouverture angulaire numérique, ON, est supérieure ou égale à 1,33 et inférieure ou égale à ns et un ensemble de lentilles pour former une image dans au moins un plan image et qui comprend en outre un cache disposé dans le plan focal arrière de l'objectif à immersion ou dans un plan conjugué dudit plan focal arrière de manière à occulter les composantes d'émission de fluorescence de l'échantillon dans les directions angulaires où l'angle θ est inférieur ou égal à un angle critique θc, avec θc = arcsin (nL/ns) et l'angle θ défini comme l'angle d'une direction angulaire d'émission de fluorescence par rapport à la direction perpendiculaire de la surface du support sur laquelle est disposé l'échantillon à observer.
On entend par objectif « plein champ », un objectif permettant de former une image plein champ. De manière avantageuse, un tel objectif est un objectif commercial d'usage standard en microscopie de fluorescence.
Grâce au dispositif selon l'invention, il est possible d'obtenir des images de microscopie de fluorescence de très grande qualité, permettant par exemple d'obtenir des informations précieuses pour l'étude de matériaux biologiques.
En effet, le dispositif selon l'invention permet d'obtenir des images de fluorescence plein champ avec une grande sensibilité, notamment de zones localisées à l'interface du support d'indice de réfraction ns et du milieu liquide d'indice de réfraction nL. On peut ainsi visualiser des événements se produisant près de cet interface, sur une profondeur d'environ du sixième de la longueur d'onde de la lumière d'excitation. A titre d'exemple, la profondeur sur laquelle s'effectue l'observation est de l'ordre de 50 nm à 100 nm pour des longueurs d'onde dans le visible.
Les supports communément utilisés en microscopie de fluorescence sont en verre et il est avantageux de choisir des verres standard, d' indice de réfraction inférieur ou égal à 1,55, dont le coût est faible.
L'adjonction du cache dans le plan focal arrière de l'objectif ou dans un plan conjugué peut se faire de manière simple et notamment être mise en œuvre avec des microscopes de fluorescence commerciaux. Il en résulte un dispositif amélioré dont le coût de l'amélioration est très modeste .
La fonction du cache consiste à occulter les composantes d'émission de fluorescence de l'échantillon dans les directions angulaires où l'angle θ est inférieur ou égal à l'angle critique θc. Les figures 5a et 5b ci-annexées rappellent les principes d'émission de fluorescence . Un fluorochrome se comporte comme une antenne susceptible d'émettre un signal. Cet émetteur possède dans son environnement immédiat (quelques dizaines de nanomètres) des composantes électromagnétiques qui sont évanescentes lorsqu'il est placé dans un milieu homogène. Ces composantes peuvent devenir propagatives lorsque le fluorochrome est placé à proximité d'une interface. Elles se propagent alors dans des angles supérieurs à l'angle critique dans le milieu d' indice de réfraction le plus élevé .
La figure 5a représente les composantes d'émission de fluorescence d'un émetteur 12 situé à l'interface entre un support 20 et un milieu liquide 11.
L'émission de fluorescence de l'émetteur 12 comprend une composante 14 émise pour θ compris entre 0 et θc et une composante 15 émise pour θ supérieur à θc, dite « lumière interdite » ou « lumière supercritique » et correspond aux composantes évanescentes dans le milieu liquide 11 devenue propagative dans le support transparent 20.
On constate que près de l'interface la lumière supercritique peut représenter jusqu'à environ un tiers de la lumière totale émise. La valeur de l'angle critique est donnée par les lois de la réfraction de Snell-Descartes où θc = arcsin (nL/ns) . Dans le cas où le liquide est de l'eau (nL = 1,33) et le support est en verre standard (ns = 1,52) , θc vaut 61°. La figure 5b représente les composantes d'émission de fluorescence d'un émetteur 12 situé à une distance supérieure à environ 100 nm.
On constate que la lumière émise comprend la même composante 14, émise pour θ compris entre 0 et θc mais ne comprend plus de composante émise à un angle supérieur à θc, correspondant à de la lumière supercritique. La disposition du cache du dispositif selon l'invention permet de sélectionner seulement la lumière supercritique et ainsi de produire des images donnant des informations sur les événements se déroulant dans environ les 100 nm de profondeur par rapport à l'interface milieu liquide / support.
Ces informations sont particulièrement précieuses pour les biologistes.
Dans la suite de la présente description, on appellera « image de champ proche » une image effectuée avec le cache du dispositif selon l'invention, et « image d' épifluorescence » une image effectuée sans ledit cache.
L'ouverture numérique, ON, d'un objectif est définie par ON = n.sin(αmax) où n est l'indice du milieu de fonctionnement de l'objectif et αmax est l'angle maximum de collection de l'objectif.
Des objectifs commerciaux actuels de grande ouverture numérique à immersion à huile (n=l,51) ont été développés. Ils possèdent des ON par exemple de 1,45 et de 1,49. Les angles maximums collectés sont supérieurs à l'angle critique θc. Ainsi, ces objectifs permettent de collecter la majeure partie de la lumière supercritique. De préférence, ces objectifs sont corrigés des aberrations chromatiques et sphériques et permettent ainsi d'obtenir une image plein champ d'excellente qualité.
Le dispositif selon l'invention peut comprendre l'une ou les caractéristiques suivantes qui peuvent être combinées entre elles : le cache est amovible ; il est ainsi possible d'effectuer successivement des images avec et sans cache ; on peut ainsi faire des images d' épifluorescence et de champ proche ; le cache est composé d'un disque opaque et optionnellement d'anneaux concentriques opaques ;
- le cache est choisi parmi la liste des dispositifs occultables constituée d'un dispositif à cristaux liquides, un dispositif microfluidique, un dispositif mécanique ;
- l'ouverture angulaire numérique, ON, de l'objectif à immersion est supérieure ou égale à 1,45 et inférieure ou égale à 1,50 ;
- une source d'éclairage polychromatique ou monochromatique est disposée de manière à éclairer l'échantillon à travers le support sur lequel il est disposé ;
- le dispositif de microscopie par fluorescence comprend en outre un sténopé disposé dans un plan image situé dans le trajet optique au-delà du cache de manière à permettre des observations de microscopie confocale ; le dispositif de microscopie par fluorescence comprend en outre une source d' éclairage laser de manière à permettre des observations de microscopie TIRF (« total internai reflection fluorescence », pour « fluorescence par réflexion totale interne ») ; il est également possible de mettre en œuvre le microscope TIRF en utilisant une source classique qui est focalisée ;
- le cache est amovible et comprend en outre des moyens pour actionner ce cache amovible de manière à permettre une succession d'observations de l'échantillon avec et sans cache ; le dispositif comprend en outre des moyens d'acquisition de l'image de l'échantillon et des moyens d' interfaçage desdits moyens d'acquisition pour permettre l'acquisition en alternance d'images avec et sans cache. La présente invention vise également une méthode d'observation par microscopie de fluorescence mettant en œuvre le dispositif de microscopie par fluorescence selon l'invention et mentionné ci-dessus, où l'échantillon à observer est éclairé à travers le support sur lequel il est disposé .
Selon différents modes de réalisation qui peuvent être combinés entre eux :
- l'échantillon à observer est un échantillon biologique comprenant des cellules dans le milieu liquide d' indice de réfraction nL ;
- le cache du dispositif de microscopie de fluorescence est amovible et la méthode comprend une étape d'observation sans le cache et une étape d'observation avec le cache suivies d'une étape de comparaison des deux images ainsi obtenues ; selon ce mode de réalisation, l'étape de comparaison peut comprendre une étape de calcul par combinaison de l'image obtenue sans le cache et de l'image obtenue avec le cache ; - les images sont acquises par des moyens d' acquisition vidéo et la succession des étapes d'observation avec et sans le cache est synchronisée à la cadence vidéo desdits moyens d'acquisition vidéo ;
- on dispose un composant semi-réfléchissant dans le faisceau émis et les images sont acquises avec deux moyens d'acquisition vidéo afin d'acquérir simultanément les images avec et sans cache ; le composant semi-réfléchissant est notamment une lame séparatrice ou un cube semi- réfléchissant . L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui va suivre, donnée uniquement à titre d'exemple et faite en se référant aux dessins annexés dans lesquels : la figure 1 illustre une vue schématique d'un dispositif de microscopie de fluorescence selon l'invention ; la figure 2 illustre une variante selon l'invention du dispositif selon la figure 1, adapté à la microscopie confocale ; la figure 3 illustre une variante selon l'invention du dispositif selon la figure 1, adapté à la microscopie TIRF ;
- la figure 4 illustre un exemple de cache utilisé dans le dispositif selon l'invention ; les figures 5a et 5b illustrent les composantes d'émission de fluorescence selon différentes configurations et ont été commentées ci-dessus ;
- la figure 6 illustre les profils de fluorescences de billes fluorescentes de référence avec et sans cache ;
- les figures 7a et 7b illustrent des observations de fluorescences d'une même cellule respectivement sans et avec le dispositif selon l'invention.
Pour des raisons de clarté, les différents éléments représentés sur les figures ne sont pas nécessairement à l'échelle. Sur ces figures, des références identiques correspondent à des éléments identiques .
La figure 1 présente une vue schématique d'un dispositif de microscopie de fluorescence 100 selon l'invention. Celui-ci comprend un objectif à immersion 110 dont l'0N est supérieur ou égal à 1.33. Un support en verre 20 est disposé au-dessus de cet objectif à immersion 110. De l'huile est disposée entre l'objectif à immersion 110 et le support en verre 20.
Un échantillon 10 à observer est disposé sur le support en verre 20. Cet échantillon 10 comprend par exemple des composants fluorescents dispersés dans de l'eau.
Le plan focal arrière de l'objectif est référencé 400. De la lumière d'excitation est produite par un faisceau 200 issu d'une source lumineuse qui traverse un filtre d'excitation 210 et est réfléchie par un miroir dichroïque 120 pour aller illuminer l'échantillon 10 après avoir traversé le support transparent 20. Un exemple de trajet de la lumière d'excitation incidente est figuré par les flèches dirigées vers le haut de la figure. La lumière d'excitation incidente peut être en partie réfléchie et est alors filtrée par un filtre d'émission 130 de manière à ce que l'image formée dans un plan image ne comprenne que de la lumière de fluorescence émise par l'échantillon 10.
La lumière de fluorescence émise par l'échantillon 10 traverse le support transparent 20, le miroir dichroïque 120, le filtre d'émission 130.
Selon le mode de réalisation représenté en figure 1, cette lumière est réfléchie sur un miroir 140 et la suite du dispositif fonctionne avec la lumière réfléchie. Selon un autre mode de réalisation (non représenté) , la lumière de fluorescence n' est pas réfléchie et la suite du dispositif fonctionne avec la lumière transmise.
Une lentille 150, dite lentille de tube, permet de focaliser la lumière sur un plan image intermédiaire 410. La lumière est ensuite parallélisée grâce à une lentille 160 et focalisée ensuite par une lentille 180 sur le plan image 430 où l'image est acquise par un dispositif adapté, notamment une caméra 300. Les plans 430 et 410 sont des plans images conjugués du plan d'observation.
Les lentilles 160 et 180 sont disposées de manière à ce qu'un plan conjugué 420 du plan focal arrière de l'objectif à immersion 110 soit situé entre ces lentilles 160 et 180.
Un cache 170 est disposé dans ce plan focal arrière de l'objectif à immersion, de manière à occulter les composantes d'émission de fluorescence de l'échantillon 10 dans les directions angulaires où l'angle θ est inférieur ou égal à l'angle critique θc.
Les rayons lumineux émis suivants un certain angle par les émetteurs fluorescents de l'échantillon 10 situés dans le plan d'observation interceptent le plan focal arrière 400 de l'objectif (ou tout plan conjugué 420 de ce plan 400) à une certaine distance r(θ) du centre (défini par l'axe optique) de ce plan. r(θ) est une fonction croissante de θ. Pour des objectifs dits aplanatiques par exemple, r(θ) est sensiblement proportionnel à sin(θ) . Ainsi, l'ensemble des rayons émis suivant l'angle θ (formant un cône) décrit un cercle de rayon r(θ) dans le plan focal arrière .
Quand le cache 170 est disposé dans le plan focal arrière 400 de l'objectif 110, la relation entre r(θ) et sin(θ) s'exprime : r(θ) = nx x f0 x sin(θ), où f0 est la distance focale de l'objectif à immersion 110 (en général de l'ordre de quelques millimètres) et nx est l'indice du milieu d'immersion utilisé pour l'objectif (en général de l'huile) . Selon un exemple de réalisation, on a un objectif à immersion de grossissement G = 100 et la distance focale de la lentille de tube 150 vaut ft = 200 mm.
On a alors fo = ft/G = 2 mm. On obtient dans cette configuration : r(θc)= 2,66 mm.
Quand le cache 170 est disposé dans le plan conjugué du plan focal arrière, il convient de tenir compte du facteur de grandissement lié au système optique. A titre d'exemple le cache 170 est disposé dans le plan 420 et il convient d' introduire un facteur multiplicatif G' = fi6θ/fi5θ/ où fi5o est la distance focale de la lentille de tube 150 et fiβo est la distance focale de la lentille 160.
L'émission suivant les angles sous-critiques θ < θc intercepte le plan focal arrière suivant un disque centré de rayon r(θc) . Les rayons associés a l'émission supercritique collectés par l'objectif, c'est-à-dire dont l'émission vérifie θc < θ < θmaχ, forment un anneau dans le plan focal arrière r(θc) < r(θ) < r(θmaχ) • II est ainsi possible de masquer sélectivement à l'aide d'un cache annuaire les rayons émis par les émetteurs fluorescents de l'échantillon 10 suivant un angle donné θ. La mise en place d'un disque de rayon r(θc) permet de sélectionner les rayons super-critiques et ainsi de détecter sélectivement les émetteurs fluorescents de l'échantillon 10 situés à proximité de l'interface eau/verre du support 20 en éliminant l'émission des émetteurs fluorescents de l'échantillon 10 situés à une distance plus importante.
La sélection se fait ainsi à l'émission. Il en résulte que le système d'éclairage n'a pas besoin d'être changé par rapport à celui d'un dispositif d'observation d' épifluorescence standard. On peut ainsi éclairer avec une i j
source de lumière non-cohérente, par exemple une lumière blanche standard, notamment obtenue avec une lampe au mercure. Il en résulte plusieurs avantages, comme l'absence de surcoût significatif (à comparer à la technique de microscopie TIRFM, où un éclairage par laser est requis) ainsi que la possibilité d'obtenir un champ homogène (autorisant éventuellement des mesures quantitatives) .
La fonction r(θ) varie suivant les objectifs utilisés que l'on peut souhaiter changer en fonction des observations. Il peut être avantageux de réaliser un système de cache de rayon variable ou de prévoir différents caches facilement escamotables.
Selon un mode de réalisation, le cache peut être de diamètre supérieur à r(θc) . Il est ainsi possible d'obtenir un confinement supérieur de la détection des émetteurs fluorescents de l'échantillon 10. En effet, les composantes les plus inclinées émises par les émetteurs fluorescents de l'échantillon 10 sont associées aux émetteurs fluorescents qui sont le plus près de l'interface eau / verre. Il en résulte cependant une moindre proportion de fluorescence détectée. Cette proportion diminue quand on élargit le diamètre du cache.
Selon un mode de réalisation, on peut passer facilement d'une position avec cache à une position sans cache pour obtenir une image d' épifluorescence standard et une image de lumière supercritique d'un même échantillon, grâce à des moyens d' actionnement du cache 170.
Selon un mode de réalisation, les moyens d' actionnement fonctionnent à la cadence vidéo (typiquement de l'ordre de quelques dizaines de Hertz) afin de passer de la position sans cache à la position avec cache en alternance à la vitesse d'acquisition des images. Il est ainsi possible d'avoir l'information de volume et en surface simultanément.
Ce système d' imagerie est particulièrement adapté à l'imagerie de systèmes biologiques, en particulier pour l'étude de processus biologiques dans les cellules vivantes, tels que phénomènes d'adhésion cellulaire, d' endocytoses / exocytoses, ....
La figure 2 présente une vue schématique d'une variante, selon l'invention, du dispositif de la figure 1 où les composants présents avant le plan image 430 sont identiques dans les deux modes de réalisation. Dans le dispositif de la figure 2, un cache de type sténopé 190 comprenant un trou 195 est disposé dans le plan image. Un monodétecteur 350 permet une acquisition point par point de la lumière passant à travers le trou 195. Il est ainsi possible d' obtenir une configuration permettant d' effectuer de la microscopie confocale.
La figure 3 présente une vue schématique d'une variante, selon l'invention, du dispositif de la figure 1 où les composants du dispositif de microscopie sont similaires, mais où la source de lumière diffère.
Dans le dispositif de la figure 3, la lumière 250 provient d'un laser et l'éclairage de l'échantillon est produit par réflexion totale interne. Il est ainsi possible d'obtenir un dispositif de type TIRF amélioré.
On remarque que le plan focal arrière des objectifs commerciaux est situé en général à l'intérieur de l'objectif et donc difficilement accessible. Il est donc souvent recommandé de réaliser un système permettant d' imager ce plan focal arrière pour pouvoir insérer le système de cache 170 entre le détecteur et l'objectif. U
Selon un exemple de réalisation, on utilise un microscope inversé de fluorescence de type Ti de Nikon comprenant un module (réf. TI-T-BPH, MEB55810) qui permet d' imager le plan focal arrière et de positionner un cache annulaire pour permettre le contraste de phase (externe) avec les objectifs de grandes ouverture numérique. Il est possible de mettre un cache 170 du dispositif selon l'invention dans ce type de module. Le système de centrage et du réglage de la position du plan sont tout à fait adaptés pour un cache filtrant les angles sous-critiques. Le système comprend plusieurs positions pour les différents objectifs ainsi qu'une position sans cache.
La figure 4 présente une vue schématique d'un cache 170 destiné à être disposé sur le plan focal arrière 400 de l'objectif à immersion 110 ou dans un plan conjugué 420 dudit plan focal. Le cache 170 est composé d'une zone centrale 171 sous forme de disque et de deux zones annulaires 172, 173, concentriques à la zone centrale 171. De fines zones intermédiaires 174, 175 séparent respectivement la zone centrale 171 de la première zone annulaire 172 et les deux zones annulaires 172, 173 entre elles. Les zones centrales 171 et annulaires 172, 173 sont des zones dont la transmission peut être variée, notamment entre une configuration d'occultation et une configuration laissant passer la lumière.
Le cache peut comprendre plus de deux zones annulaires concentriques et selon l'exemple représenté, seules deux zones annulaires concentriques et la zone centrale ont été occultées . Selon un premier mode de réalisation, le cache 170 est un système microfluidique et des canaux 177, 178, 179 alimentent en fluide opaque les zones centrales 171 et annulaires 172, 173 et les zones intermédiaires 174, 175 sont des parois de séparation.
Selon un autre mode de réalisation, le cache 170 est un système à cristaux liquides et chaque zone, centrale 171, annulaires 172, 173 peut être adressée par des électrodes 177, 178, 179 de manière à faire varier la transmission des cristaux liquides. Le système à cristaux liquides peut être modulable en transmission de type
« SLM » pour « spatial light modulator » (modulateur spatial de lumière) .
Grâce au cache selon la figure 4, il est possible de faire varier aisément le rayon d'occultation désiré. On peut ainsi activer une pluralité de zones annulaires dans le cache 170 de manière à occulter la lumière passant dans le plan focal arrière ou dans un plan configuré selon un rayon r(θc) désiré.
Le cache illustré en figure 4 permet aisément de faire varier le rayon d'occultation, notamment quand des observations sont menées avec une pluralité d'objectifs. Selon un autre mode de réalisation, le cache 170 est un dispositif de réflexion susceptible de réfléchir la lumière dans une zone de diamètre choisi. Un tel cache peut par exemple être obtenu avec des dispositifs de pixels modulables en réflexion, également dénommés « Digital Mirror Device ». Il peut également être du type SLM en réflexion .
Les caches exemplifiés ci-dessus permettent d'obtenir des cycles transmission / obturation très courts, susceptibles par exemple de suivre le rythme d'acquisition des images avec une caméra.
Selon un exemple de réalisation, on utilise un microscope de fluorescence inversé Nikon type «Ti-U»® avec I /
une base de tube binoculaire de phase «TI-T-BPH»®, un objectif a immersion a huile xlOO d'ouverture numérique 1,49. On utilise un cube de filtres dénomme usuellement «TRITC A» avec filtre excitation a 543 nm, un filtre d'émission à 593 nm et une lame dichroique de référence 499/555 nm. La source lumineuse utilisée est une source fibree de référence commerciale «Nikon Intensilight»® avec une lampe Hg de 130 W et un générateur «C-HGFI»®. La caméra utilisée est une Caméra Hamamatsu, de référence EMCCD C9100-13, refroidie à sensiblement -65°.
Le cache 170 utilisé a été réalisé par peinture d'une contre-lamelle circulaire d'épaisseur comprise entre 0,13 et 0,16 mm et de diamètre 16 mm. Le disque formant cache est réalisé par rotation de la lamelle autour de son axe central. La lamelle est placée horizontalement sur une tournette équipée d'un vaπateur. Un pinceau est fixé perpendiculairement à la lamelle sur un support équipé de 2 platines de translation micrométriques dans deux directions orthogonales afin d'ajuster finement la distance pinceau / lamelle et la position radiale du pinceau (c'est-à-dire distance par rapport au centre de rotation) . La peinture utilisée est une peinture noire opaque pour verre.
Le cache est ensuite positionné dans le module Nikon MEB55810 («TI-T-BPH») à la place de l'anneau de phase. La position du cache est réglée à l'aide de la lentille de Bertrand du microscope et des déplacements du module grâce à des vis de centrage et de position axiale) . La procédure suivie est identique à celle du réglage de l'anneau de phase fourni par le constructeur avec ce module. Des mesures de la résolution latérale ont ete effectuées avec des billes fluorescentes Fluosphere®
(commercialisées par Invitrogen) excitation/émission :
580/605 nm déposées à la tournette (« spm-coating ») sur une contre-lamelle de verre standard (épaisseur 0.13- 0.16 mm), puis immergées dans de l'eau distillée.
La figure 6 illustre le profil d'intensité de fluorescence de ces billes (intensité de signal normalisé en ordonnée en fonction du déplacement latéral en abscisse, exprimé en μm) .
On constate que le profil obtenu sans cache (601) et celui avec cache (602) sont similaires. On obtient une largeur à mi-hauteur des profils de l'ordre de 450 nm. Il n'y a donc pas de perte de résolution avec et sans cache.
Des observations ont été effectuées sur des cellules d'embryon de rein humain marquées à la Cholératoxine (qui se lie à des glycolipides sur la membrane et les constituants des radeaux lipidiques) couplée à Alexa 488 et excitées par la lampe Nikon Intensilight Hg 130 W (lampe classique) . Le cube de filtres utilisé est composé d'un filtre d'excitation à bande passante de 450 à 490 nm, d'un miroir dichroïque à 500 nm et d'un filtre d'émission à bande passante de 510 à 550 nm. Les figures 7a et b montrent deux images obtenues sans cache, 7a, et avec cache, 7b. Le temps de pause est T=150 ms et le gain G=255 pour l'image obtenue avec cache (Figure 7b) et T=IOO ms et G=105 pour l'image obtenue en épifluorescence standard (Figure 7a) . On constate une différence de forme entre les deux images et on observe avantageusement des variations d'intensité que l'on associe à des phénomènes membranaires sur l'image 7b, obtenue avec cache, que l'on ne peut observer distinctement sur l'image obtenue sans cache 7a. On note que ces observations ont été avantageusement réalisées avec une lampe « classique » et qu'il n'a pas été nécessaire de mettre en œuvre un laser pour les obtenir. iy
L' invention ne se limite pas à ces types de réalisation et doit être interprétée de façon non limitative, et englobant tous les modes de réalisation équivalents .

Claims

REVENDICATIONS
1. Dispositif de microscopie de fluorescence (100) pour observer l'émission de fluorescence d'un échantillon (10) comprenant des composants fluorescents dans un milieu liquide d' indice de réfraction nL disposé sur un support transparent (20) d'indice de réfraction ns supérieur à nL, et inférieur ou égal à 1,55, ledit dispositif comprenant un objectif plein champ à immersion (110) dont l'ouverture angulaire numérique, ON, est supérieure ou égale à 1,33 et inférieure ou égale à ns, et un ensemble de lentilles (150, 160, 180) pour former une image dans au moins un plan image (410, 430) caractérisé en ce que ledit dispositif comprend en outre un cache (170) disposé dans le plan focal arrière (400) de l'objectif à immersion (110) ou dans un plan conjugué (420) dudit plan focal arrière de manière à occulter les composantes d'émission de fluorescence de l'échantillon (10) dans les directions angulaires où l'angle θ est inférieur ou égal à un angle critique θc, avec θc = arcsin (nL/ns) et l'angle θ défini comme l'angle d'une direction angulaire d'émission de fluorescence par rapport à la direction perpendiculaire de la surface du support (20) sur laquelle est disposé l'échantillon (10) à observer.
2. Dispositif de microscopie de fluorescence selon la revendication précédente caractérisé en ce que le cache (170) est amovible.
3. Dispositif de microscopie de fluorescence selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que le cache (170) est composé d'un disque opaque et optionnellement d'anneaux concentriques opaques.
4. Dispositif de microscopie de fluorescence selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que le cache (170) est choisi parmi la liste des dispositifs occultables constituée d' un dispositif à cristaux liquides, un dispositif microfluidique, un dispositif mécanique.
5. Dispositif de microscopie de fluorescence selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que l'ouverture angulaire numérique, ON, de l'objectif à immersion (110) est supérieure ou égale à 1,45 et inférieure ou égale à 1,50.
6. Dispositif de microscopie de fluorescence selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que le dispositif de microscopie par fluorescence comprend en outre une source d'éclairage polychromatique ou monochromatique (200) disposée de manière à éclairer l'échantillon (10) à travers le support (20) sur lequel il est disposé.
7. Dispositif de microscopie de fluorescence selon la revendication précédente caractérisé en ce que le dispositif de microscopie par fluorescence comprend en outre un sténopé (190) disposé dans un plan image (430) situé dans le trajet optique au-delà du cache (170) de manière à permettre des observations de microscopie confocale.
8. Dispositif de microscopie de fluorescence selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que le dispositif de microscopie par fluorescence comprend en outre une source d'éclairage laser (250) de manière à permettre des observations de microscopie TIRF (« total internai reflection fluorescence », pour fluorescence par réflexion totale interne) .
9. Dispositif de microscopie de fluorescence selon l'une quelconque des revendications 2 à 8 où le cache (170) est amovible, caractérisé en ce qu'il comprend en outre des moyens pour actionner le cache (170) amovible de manière à permettre une succession d'observations de l'échantillon (10) avec et sans cache.
10. Dispositif de microscopie de fluorescence selon la revendication précédente caractérisé en ce qu' il comprend en outre des moyens d'acquisition (300, 350) de l'image de l'échantillon (10) et des moyens d' interfaçage desdits moyens d'acquisition (300, 350) pour permettre l'acquisition en alternance d'images avec et sans cache.
11. Méthode d'observation par microscopie de fluorescence mettant en œuvre le dispositif de microscopie par fluorescence (100) selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 où l'échantillon (10) à observer est éclairé à travers le support (20) sur lequel il est disposé .
12. Méthode d'observation par microscopie à fluorescence selon la revendication précédente caractérisée en ce que l'échantillon (10) à observer est un échantillon biologique comprenant des cellules dans le milieu liquide d'indice de réfraction nL.
13. Méthode d'observation par microscopie à fluorescence selon l'une quelconque des revendications 11 ou 12 et où le cache (170) du dispositif de microscopie de fluorescence est amovible comprenant une étape d'observation sans le cache (170) et une étape d'observation avec le cache (170) suivies d'une étape de comparaison des deux images ainsi obtenues.
14. Méthode d'observation par microscopie à fluorescence selon la revendication précédente caractérisée en ce que l'étape de comparaison comprend une étape de calcul par combinaison de l'image obtenue sans le cache (170) et de l'image obtenue avec le cache (170) .
15. Méthode d'observation par microscopie à fluorescence selon l'une des revendications 13 ou 14 caractérisée en ce que les images sont acquises par des moyens d'acquisition vidéo (300) et que la succession des étapes d'observation avec et sans le cache (170) est synchronisée à la cadence vidéo desdits moyens d'acquisition vidéo (300).
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013542466A (ja) * 2010-10-28 2013-11-21 ユニベルシテ パリ ディデロ−パリ ７ 動的光学顕微鏡法により試料からの発光を観察する方法
WO2014031723A2 (fr) * 2012-08-21 2014-02-27 Insurance Services Office, Inc. Appareil et procédé d'analyse de données de performances de conduite

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020097489A1 (en) * 2001-01-25 2002-07-25 Olympus Optical Co., Ltd. Total internal reflection fluorescence microscope having a conventional white-light source
US20070058262A1 (en) * 2005-07-22 2007-03-15 Carl Zeiss Microimaging Gmbh Microscope objective system

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020097489A1 (en) * 2001-01-25 2002-07-25 Olympus Optical Co., Ltd. Total internal reflection fluorescence microscope having a conventional white-light source
US20070058262A1 (en) * 2005-07-22 2007-03-15 Carl Zeiss Microimaging Gmbh Microscope objective system

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CONIBEAR P B ET AL: "A comparison of optical geometries for combined flash photolysis and total reflection fluorescence microscopy", JOURNAL OF MICROSCOPY, vol. 200, no. PART 3, 1 December 2000 (2000-12-01), WILEY-BLACKWELL PUBLISHING LTD, GB, pages 218 - 229, XP003014065, ISSN: 0022-2720 *
QUIRKE A M ET AL: "Scanning total internal reflection fluorescence imaging", PROCEEDINGS OF THE SPIE - THE INTERNATIONAL SOCIETY FOR OPTICAL ENGINEERING, vol. 6089, no. 1, 9 February 2006 (2006-02-09), USA, pages 608907-1 - 608907-12, XP002541631, ISSN: 0277-786X *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013542466A (ja) * 2010-10-28 2013-11-21 ユニベルシテ パリ ディデロ−パリ ７ 動的光学顕微鏡法により試料からの発光を観察する方法
WO2014031723A2 (fr) * 2012-08-21 2014-02-27 Insurance Services Office, Inc. Appareil et procédé d'analyse de données de performances de conduite
WO2014031723A3 (fr) * 2012-08-21 2014-04-17 Insurance Services Office, Inc. Appareil et procédé d'analyse de données de performances de conduite

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