WO2010092302A2 - Microscope de plasmon de surface a haute resolution comportant un interferometre heterodyne fibre - Google Patents

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WO2010092302A2
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Françoise Argoul
Lofti Berguiga
Audrey Fahys
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Ecole Normale Superieure De Lyon
Centre National De La Recherche Scientifique
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    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/55—Specular reflectivity
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    • G—PHYSICS
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    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/18—Arrangements with more than one light path, e.g. for comparing two specimens

Definitions

  • the present invention relates to a high-resolution surface plasmon microscope comprising a fiber heterodyne interferometer, that is to say substantially consisting of optical fibers.
  • the technical field of the invention is that of the design of imaging systems and methods allowing the detection of small variations of refractive index in an observation medium and / or dielectric objects of the order of a few nanometers do not necessarily have remarkable optical properties (fluorescence, luminescence, localized plasmon resonance or Raman resonance) and located near a surface and immersed in any dielectric medium and in particular in air or in an aqueous medium.
  • a surface plasmon is a surface electromagnetic wave that propagates at an interface between a metal and an observation dielectric medium.
  • the surface plasmon excitation requires a polarized incident light and a coupling medium at the metal / dielectric medium interface at a particular angle which is generally referred to as plasmon resonance angle ⁇ p .
  • the angle ⁇ p (in other words the coupling condition) is very sensitive to the slightest changes in the optical properties at the metal / dielectric medium interface.
  • This sensitivity makes exploitable the surface plasmon for the production of images of objects of very small sizes located at the interface metal / dielectric medium, said objects modifying the optical properties of the surface plasmon at this interface, this which allows to obtain a contrast between the object and its environment.
  • the surface plasmon being an evanescent wave, it makes it possible to overcome the effects of volume within the observation medium.
  • OCT Optical Coherence Tomography
  • US 2004/100636 can not fill the gaps or be combined with current surface plasmon technologies insofar as the nature of the light beams observed is different, including the distribution in amplitude and in phase, not homogeneous in the case of surface plasmon, and which can not then be observed by OCT microscopy which focuses on the observation of light beams whose variations are uniform in amplitude and in phase .
  • the object of the invention is in particular to provide a high-resolution surface plasmon microscope that enables the detection and visualization of objects of very small size, of the order of a nanometer, such as biological molecules for example, without having recourse to chemical, optical or radioactive markers of these objects.
  • Another object of the invention is finally to provide a surface plasmon microscope that is compact and simple to use, and also suitable for a biological or medical laboratory environment.
  • a high-resolution surface plasmon microscope comprising essentially: a) a coherent light source for emitting an excitation light beam, and b) a medium of optical coupling and confinement of a surface plasmon having a large numerical aperture lens, an immersion oil and a glass slide coated on one side which is not in contact with the immersion oil of a metal layer, and c) a heterodyne interferometer dividing the excitation light beam emitted by the light source into at least one reference beam and at least one measurement beam directed to the optical coupling medium to generate a surface plasmon, the interferometer being positioned between the light source and the objective of the optical coupling medium to form an interferometric beam between the reference beam and the measuring beam after reflection of each of them respectively by reflective element and by the metal layer, and d) scanning means of the metal layer with the aid of the measuring light beam, and e) means for detecting the interferometric beam coming from the interferometer, and f
  • the heterodyne interferometer of the microscope consists essentially of at least four optical guide fibers, respectively, of the excitation beam, the measuring beam, the reference beam, and the interferometric beam and optically connected at a first of their ends to an optical coupler and each also connected optically at their second end respectively to the light source, to the optical coupling medium, to the reflecting element of the reference beam, and to the interferometric beam detection means.
  • the microscope of the invention allows the detection of dielectric and metal objects with a diameter of less than 10 nm, without marking said objects. It has the advantage, compared to known surface plasmon microscopes, to provide a significant reduction in the size of the microscope and the optical settings thereof, since it allows the removal of any mechanical support of the optical elements of the microscope. 'interferometer.
  • the microscope of the invention provides a significant and significant improvement in the stability of the interferometer and the quality of the optical beams involved, both the measurement and reference beams and the interferometric beam, which allows a much better quality and sensitivity of the images obtained.
  • the optical fibers of the heterodyne interferometer may be monomode or multimode fibers.
  • the choice of fibers is made according to the criteria of stability and sensitivity defined by the user.
  • the optical fibers are polarization-maintaining fibers at the wavelength of the excitation light beam emitted by the source.
  • the optical fiber connection coupler of the interferometer is adapted to the properties of the optical fibers used.
  • the optical fibers whose second end is respectively connected to the reflecting element of the reference beam and to the coupling and confinement medium of the surface plasmon each cooperate with at least one acousto-optic modulator.
  • the optical fiber for guiding the excitation light beam is connected in its second end to the light source through at least one collimating lens.
  • the microscope of the invention also advantageously includes an optical isolator and a half-wave plate disposed between the light source and the collimating lens.
  • the microscope of the invention also advantageously comprises a polarization converter positioned between the half wave plate and the collimating lens.
  • This polarization converter makes it possible to vary at will, if necessary periodically, the polarization of the excitation light beam linearly, circular, radial, or azimuth for example.
  • the polarization conversion provided by the polarization converter makes it particularly advantageous to perform a differential mode imaging, which makes it possible to further improve the contrast and the dynamics of the images obtained. It is indeed possible to polarize alternately with the aid of the polarization converter the excitation beam in pure mode p (radial polarization) and in pure mode s (azimuthal polarization) and to scan linearly alternatively and synchronously the alternating polarization of the excitation beam the metal layer by the measuring beam polarized alternately in pure mode p and in pure mode s.
  • the guide fiber of the measuring beam is connected at its second end to the optical coupling medium by means of a collimating lens which collimates the measuring beam on the objective of the coupling medium.
  • the reflecting element of the reference beam is a mirror.
  • this mirror is advantageously constituted by a metal coating deposited on the end of the guide fiber of the reference beam.
  • the reflecting element of the reference beam is constituted by the glass plate of an optical coupling medium identical to the coupling medium connected to the guide fiber of the measuring beam, said plate being coated. on one side not in contact with the oil immersing a metal layer of the same quality as that which covers the glass plate of the optical coupling medium connected to the guide fiber of the measuring beam.
  • This particular embodiment of the microscope of the invention advantageously makes it possible to perform surface plasmon interference imaging between the reflected beam generated by the measurement beam and the reflected beam generated by the reference beam.
  • the objective of the optical coupling medium to which the guide fiber of the measurement beam is connected is replaced by a solid immersion lens and the collimation lens of the measuring beam is integrated. on the second end of the guide fiber of the measuring beam, by assembly or in the form of a lenticular fiber.
  • the collimating lens connecting the guide fiber of the measuring beam to the optical coupling medium and the objective of the optical coupling medium are both replaced by an axicon formed directly at the second end of said fiber. guidance of the reference beam.
  • the microscope of the invention comprises a scanning system of the metal surface of the optical coupling medium using the measuring beam.
  • the microscope of the invention may also, in one embodiment, include a polarizer between the interferometric beam detection means and the second end of the guide fiber of said interferometric beam, in particular to increase the contrast of the images in the interferometer beam. configuration in linear polarization.
  • FIG. 1 represents a first preferred embodiment of a surface plasmon microscope according to the present invention
  • FIG. 2 represents a response diagram V (z) of the microscope of the invention in the configuration of FIG. 1;
  • FIG. 3 represents an alternative embodiment of the optical coupling medium of the microscope, comprising a doublet of lenses; fixed on an optical fiber,
  • FIG. 4 is a schematic representation of a first embodiment of the microscope of the invention
  • FIG. 5 represents a second variant of the microscope of the invention adapted to perform a plasmon interference microscopy.
  • the present invention provides a novel high resolution surface plasmon microscope configuration for observing nanoparticles or molecules without fluorescent markers in air and in an aqueous medium.
  • the microscope comprises a heterodyne interferometer composed essentially of optical fibers.
  • the microscope of the present invention firstly comprises a coherent light source 1, chosen in the particular example presented as a single-mode, polarized and stabilized helium-neon laser source. amplitude. This light source is however not limiting and one can consider the use of other types of coherent light sources.
  • the light source 1 emits a laser excitation laser of a surface plasmon which is injected and directed by a heterodyne interferometer 6 to an optical coupling medium 7 comprising, in the example of FIG. conventional for a surface plasmon microscope, a high numerical aperture objective 8, an immersion oil 9 and a glass plate 10 covered with a thin layer of metal 11, preferably a thin layer of gold, at which a surface plasmon is generated by the excitation laser beam.
  • the heterodyne interferometer 6 of the microscope of the invention is essentially composed, as represented in FIG. 1, of at least four optical fibers 12, 13, 14, 15 optically connected to each other at a first of their ends 12a. , 13a, 14a, 15a by an optical coupler 16.
  • These optical fibers 12, 13, 14, 15 are preferably monomode polarization-maintaining fibers.
  • polarization-maintaining optical fiber means that the optical fibers 12, 13, 14, 15 of the interferometer are single-mode at the wavelength of the excitation laser beam of the source 1, that is, the propagation of light in these optical fibers is effected in a single guided mode.
  • a first optical fiber 12 forms a guide fiber of the excitation beam.
  • This beam is injected into the guide fiber 12 by the second end 12b of the fiber by means of a collimating lens 5.
  • the excitation beam emitted by said source through an optical isolator 2, a half-wave plate 3 and a polarization converter 4.
  • the optical isolator 2 has the function of eliminating the beam return associated with the interferometer 6 which behaves like a mirror and which destabilizes the laser.
  • the half-wave plate 3 for its part makes it possible to control the orientation of the polarization of the excitation beam, the polarization converter 4 being intended for generating a selected polarization of the excitation beam before it enters the guide fiber. 12, this polarization being linear, circular, radial, or azimuth for example.
  • the guide fiber 12 is welded at its first end 12a to the optical coupler 16.
  • This coupler 16 is of the polarization maintaining type. It divides the excitation beam guided by the fiber 12 from the light source 1 into two identical beams of measurement and reference respectively, the measurement beam being transmitted and guided in a second optical guide fiber 13 to the middle of the optical coupling of the microscope, the beam of reference being transmitted and guided by a third optical fiber 14 to a reflecting element 17, this element being in this embodiment a mirror 18.
  • the optical fibers 13, 14 respectively form the measurement arms 19 and 20 of the heterodyne interferometer 6. These two arms, and therefore the two fibers 13, 14 are each connected to an acousto-optical modulator
  • the acousto-optical modulator 22 of the reference arm 20 is connected to a polarization-holding optical fiber 23 whose end 24 is covered with a metallic deposit acting as a mirror 18.
  • the light transmitted in this arm 20, whose frequency has been shifted by ⁇ ref is reflected by this mirror 18, and passes through the acousto-optical modulator 22, the optical fiber 14, the coupler 16 and is then coupled in a fourth arm 25 of the interferometer 6 formed by a fourth fiber optical 15. It undergoes a shift in total frequency of 2 ⁇ ref.
  • the optical fiber 13 is connected to an acousto-optical modulator 21 which shifts the optical frequency of the transmitted light with a frequency ⁇ test.
  • the acousto-optical modulator 21 is connected to a polarization-maintaining optical fiber 26, at the output of which the light, which is in fact the excitation beam, is collimated by a collimating lens 28 on the high-aperture lens.
  • digital microscope optical coupling medium to illuminate the glass slide on which a sample E is placed to be observed.
  • the light of the excitation beam transmitted by the objective 8 is reflected by the optical system 10, 11, E, passes through the objective 8 and returns to the lens 27 which focuses the light at the end of the fiber optical 26 to allow its reinjection.
  • the light is again shifted in frequency at the output of the acoustic modulator 21 of ⁇ test.
  • the reflected light After passing through the optical fiber 13 and the coupler 16, the reflected light is transmitted in the fourth arm 25 of the heterodyne interferometer 6 with the reflected beam from the reference arm. It undergoes an overall frequency shift of 2 ⁇ test. So the A bright field propagating in the fourth arm of the interferometer is the superposition of the reflected beams from the reference arm and the measuring arm.
  • a polarizer 29 may also be added in the case of a linear polarization of the starting excitation beam.
  • the microscope of the invention as shown in Figure 1 and described above, provides a number of advantages over known surface plasmon microscopes.
  • the microscope of the invention provides a miniaturization of the microscope (partial or total) related to reducing the size of the interferometer 6 enabled by the use of optical fibers.
  • the integration of a fiber interferometer 6 greatly reduces the volume of the system since the replacement of the optical components by optical fibers eliminates the need to use mechanical supports and thus decreases the volume occupied by the arms of the interferometer.
  • the use of optical fibers also allows as will be described later and is shown in FIGS. 3 and 4 to replace the optical stage allowing the magnification of the beam and the microscope objective by an all-fiber system or a system. fiber / lens that excites the surface plasmon and confine it. This part of the assembly is therefore less bulky and can be fixed at the end of the optical fiber. It is thus possible to produce a version of this totally fiberized microscope.
  • optical fibers to make the interferometer 6 of the microscope also provides a drastic reduction in the number of optical adjustments, an improvement in the stability of the interferometer, and an improvement in the quality of the optical beams of excitation, measurement, reference and the interferometric beam.
  • a free-field interferometer as used in the microscopes known in the state of the art, it is necessary to superimpose the beams from each arm of the interferometer.
  • Ir e f and I t are t the luminous intensities coming from the reference and test arms respectively, ⁇ is the phase of the interference signal,
  • M (t) is a factor varying between 0 and 1, reflecting the superposition of the two beams at the detector.
  • M (t) depends in this case on the quality of the overlap of the two beams and is therefore a functional of time t.
  • This retrofit can be achieved for example by a motorization of both the mirror of the reference arm and a reflection mirror upstream of the beam separation. The positions of these mirrors are readjusted by a retrofit loop positioning the beam based either on the beam position detection or on the control of the optical signal itself (optimization).
  • This time M does not depend on time.
  • the interference process is obtained directly by coupling within the optical fibers and therefore does not require any post-adjustment or catch-up of beam superimposition.
  • V (z) M ⁇ /c / /, ft , cos ⁇ 2 r £, / - ->)
  • optical signal S (x, y) of each pixel of an image produced by the surface plasmon microscope being directly proportional to the modulus of the third term of equation (2) above, ie:
  • Figure 2 shows the relevance and performance of a heterodyne fiber 6 interferometer surface plasmon microscope as proposed by the invention.
  • This Figure 2 shows the module of the optical response of a surface plasmon microscope as a function of the defocus z of the microscope objective with respect to the interface of the gold metal layer 11 covering the glass slide 10 the optical coupling medium 7 with the viewing medium (here air), the metal layer 11 having in this example a thickness of 45 nm.
  • the propagation of the electromagnetic fields in the core of the optical fibers used ensures a total superposition of the fields, eliminating the fluctuations of the interferometric signal related to the fluctuations of the respective positions of the measurement and reference beams. as it can be with free-field microscopes.
  • This stability greatly improves the signal-to-noise ratio of the phase signal ⁇ of the interferometer and makes easier fine measurements from the phase signal (by shortening the integration time of the measurement).
  • free field surface plasmon microscopes it is therefore possible to use the microscope of the invention, which uses an optical fiber interferometer 6, the phase signal and to obtain images of the phase the response signal V (z) of the microscope.
  • phase of the signal V (z) makes it particularly advantageous to distinguish the nature of a sample observed with the aid of the microscope and thus, for example, when an aqueous medium containing different particles or molecules is studied. to know which type of particle one observes at a moment t.
  • a last singular advantage of the fiber interferometer microscope of the present invention is to allow an improvement in the quality of the optical beams involved, whether it be the excitation beam, the measurement and reference beams or the beam interferometer.
  • the light field that propagates in the heart of the fiber possesses a profile based on the radial distance r to the center of the fiber which can be approximated by a Gaussian ⁇ r) TM ⁇ ffi ⁇ (r ⁇ i w J.
  • the beam incident on the microscope objective has a Gaussian profile much more regular than that which can be obtained in free field.
  • the light reflected by the sample E in the measuring arm 19 of the interferometer returns to the optical fiber 26 being spatially filtered during its reinjection into the fiber due to its passage through a heart of a few micrometers in diameter, thereby performing a cleaning of the beam.
  • a first variant of the microscope of the invention is entirely fibered, from the light source to the optical coupling medium of the microscope.
  • the collimation lens 27 and the high numerical aperture objective 8 of the microscope of FIG. 1 are replaced by a lens doublet (block B2 in FIG. 4).
  • the first lens of this doublet not shown in FIG.
  • the optical fiber 26 is integrated on the end of the optical fiber 26, either in the form of a lenticular fiber, that is to say that the end of the fiber 26 is itself machined and constitutes a diopter, either as shown in Figure 3 in the form of an optical block 30 fixed to the end of the fiber 26 and having a first lens 31 and a second lens 32 which is a lens SIL (for "solid immersion lens” in English), a flat face 33 acts as a glass slide and is covered with a thin layer of gold 11 which is in contact with the observation medium in which is located for example a sample E to observe.
  • This second lens 32 makes it possible to focus the measuring beam coming from the first lens 31 at the level of the gold layer / observation medium interface in order to generate the surface plasmon.
  • This arrangement has several advantages, in particular to be much more compact than a commercial immersion objective as used in the microscope of Figure 1.
  • the use of a lens doublet allows a direct attachment on the end of the optical fiber 26 transmitting the measuring beam, while providing numerical openings greater than the commercial objectives and consequently to allow the observation of higher-index media (dense polymers, liquid crystals, non-aqueous solvents ...) -
  • the numerical aperture is increased.
  • An alternative embodiment not shown is also to replace the objective 8 of the microscope of Figure 1 by a fiber whose end has an axicon.
  • the axicon is machined directly from the end of the optical fiber to give a conical shape to the heart of the optical fiber.
  • Such an axicon makes it possible to generate a ring of convergent light whose high angle of incidence makes it possible to excite the surface plasmon.
  • the portions of the microscope of the invention that may or may not be fibered are represented in the form of Bl, B2 blocks.
  • a block B2 such as, for example, the block 30 of FIG. 3, to replace the light source and the conditioning of the excitation light beam.
  • an all-fiber system B1 such as for example a polarized fiber laser.
  • the microscope of the invention comprises not one but two optical coupling mediums 7, T 1 each placed at the end of the measuring arm 19 and the reference arm 20 of the microscope.
  • the sensitivity of the microscope is considerably increased because it is possible to discriminate, in the interferometric signal and the response V (z) of the microscope, the noise related to the gold layer and to the surface plasmon of that bound to the microscope. the observed sample.
  • V (z) the response of the microscope
  • the polarization converter is advantageous to use to perform, using the measuring beam, sweeps of the gold layer of the optical coupling medium in alternating lines. polarized in pure mode p (radial polarization) and in pure mode s (azimuthal polarization).
  • the polarization converter is electronically piloted so as to switch at a selected frequency from an azimuth polarization to a radial polarization of the excitation light beam emitted by the laser source 1 synchronously with mechanical components. displacement along the three axes Z of the lens and X, Y; optical coupling medium.
  • the displacement relates to the end of the optical fiber 26 supporting the doublet.
  • This mode of alternating illumination of the gold layer of the optical coupling medium advantageously makes it possible to perform a differential imaging of surface plasmon. This gives better contrasting images, a gain in dynamic images, and a catch-up of the decrease of the response V (z) of the microscope when the defocus z increases relative to the sample.
  • optical signal obtained from the pure mode polarized beams can also be made for the purpose of servocontrolling the vertical position of the objective 8 at the end of the measuring arm with respect to the sample E to be observed.
  • the analysis of the signals established from the mode-polarized measuring beam and reflected by the gold layer of the optical coupling medium makes it possible to determine the absolute value of the position of the objective 8, and from from this position, it is then possible to correct all the mechanical and thermal drifts inherent to a high resolution microscopy.
  • Such a technique of correcting the position of the objective of the microscope is not in itself totally new in microscopy, however, with the microscope of the invention, the peculiarity lies in the fact that it is the imaging system itself that allows the correction and not a system reported in parallel to the imaging system.
  • the microscope is neither complicated nor significantly increased its adjustment cost, all without disturbing the optical measurement of plasmon.
  • this ability to control the position of the objective 8 with respect to the observed sample makes it possible to have a greater accuracy in the measurements of the function V (z), both in amplitude and in phase.
  • Another advantage of the microscope of the present invention is to allow the construction of three-dimensional images of the measured function V (z).
  • the construction of such three-dimensional "maps" of the function V (z) makes it possible to find the optical plane of section where the contrast of the image will be the best. To do this, we perform a post-processing of these 3D images and then by interpolation we determine the Z plane where the contrast is optimum.

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Abstract

La présente invention concerne un microscope à plasmon de surface à haute résolution comportant un interféromètre hétérodyne (6) divisant un faisceau lumineux d'excitation en au moins un faisceau de référence et au moins un faisceau de mesure dirigé vers un milieu de couplage optique (7) pour générer un plasmon de surface, ledit interféromètre hétérodyne étant constitué essentiellement de fibres optiques de guidage (12, 13, 14, 15) reliées optiquement au niveau d'une première de leurs extrémités à un coupleur optique (16) et chacune également reliées optiquement en leur seconde extrémité respectivement à une source lumineuse (1), un milieu de couplage optique (7), un élément réfléchissant (17) du faisceau de référence, et des moyens de détection (28) d'un faisceau interférométrique.

Description

MICROSCOPE DE PLASMON DE SURFACE A HAUTE RESOLUTION COMPORTANT UN INTERFEROMETRE HETERODYNE FIBRE
Domaine technique de l'invention
La présente invention concerne un microscope à plasmon de surface à haute résolution comportant un interféromètre hétérodyne fibre, c'est-à-dire essentiellement constitué de fibres optiques.
Le domaine technique de l'invention est celui de la conception de systèmes et procédés d'imagerie permettant la détection de faibles variations d'indice de réfraction dans un milieu d'observation et/ou d'objets diélectriques de l'ordre de quelques nanomètres ne présentant pas nécessairement des propriétés optiques remarquables (fluorescence, luminescence, résonance plasmonique localisée ou encore résonance Raman) et localisés près d'une surface et immergés dans tout milieu diélectrique et notamment dans l'air ou dans un milieu aqueux.
Etat de la technique
Un plasmon de surface est une onde électromagnétique de surface qui se propage au niveau d'une interface entre un métal et un milieu diélectrique d'observation.
L'excitation du plasmon de surface nécessite une lumière incidente polarisée et un milieu de couplage à l'interface métal/milieu diélectrique sous un angle particulier qu'on appelle généralement angle de résonance plasmon θp.
De par les propriétés de résonance des plasmons de surface, l'angle θp (en d'autres termes la condition de couplage) est très sensible aux moindres modifications des propriétés optiques au niveau de l'interface métal/milieu diélectrique. Cette sensibilité rend exploitable le plasmon de surface pour la réalisation d'images d'objets de très petites tailles situés au niveau de l'interface métal/milieu diélectrique, lesdits objets modifiant les propriétés optiques du plasmon de surface au niveau de cette interface, ce qui permet d'obtenir un contraste entre l'objet et son milieu. En outre le plasmon de surface étant une onde évanescente, il permet de s'affranchir des effets de volume au sein du milieu d'observation.
Différentes configurations de microscopie de plasmon de surface ont déjà été proposées dans l'état de la technique. Un grand nombre d'entre elles reposent sur le principe d'excitation du plasmon dans la configuration dite de Kretschmann- Raether. Cependant, la résolution de ces systèmes, limitée par la propagation latérale du plasmon, est relativement faible, de l'ordre de quelques dizaines de microns seulement dans les longueurs d'onde visibles.
Plus récemment, de nouvelles générations de microscopes à plasmon de surface dont la résolution n'est plus limitée par la propagation latérale du plasmon, mais simplement par la diffraction, ont été proposées.
Ces différents microscopes ont tous pour idée commune de focaliser un faisceau laser avec un objectif à forte ouverture numérique et à fort grossissement au niveau d'une surface qui présente une couche métallique (or, argent, cuivre, aluminium, etc.) de quelques dizaines de nanomètres d'épaisseur. Ceci permet à la fois d'exciter et de confiner le plasmon de surface.
On peut cependant différencier ces techniques d'une part par le profil d'illumination à l'entrée de l'objectif et d'autre part par le mode de détection du signal. En effet quand un faisceau arrive à l'entrée de l'objectif du microscope, seul un anneau très fin de lumière contribue à l'excitation du plasmon de surface. La partie du faisceau réfléchi qui contient l'information liée au plasmon de surface est très fine et se retrouve noyée dans le reste du faisceau lumineux. Sans traitement particulier du faisceau, l'imagerie est quasiment impossible. Dans certaines publications, notamment dans la demande de brevet japonais JP 2003083886, l'illumination et la détection reposent sur un filtrage spatial, à l'entrée de l'objectif, des rayons lumineux qui contribuent à l'excitation plasmon et sur l'élimination de ceux qui n'y contribuent pas.
Dans certaines autres publications telles que les brevets américains US 6,970,249 et US 2004/0100636 ou encore dans l'article de M. G, Somekh, S. G
Liu, T. S Velinov and C. W See, « Optical V(z) for high-resolution plasmon microscopy », Optics Letters 25, 823 (2000) et, « High-resolution scanning surface-plasmon microscopy », Applied Optics 39, 6279 (2000), il a été proposé l'utilisation d'un interféromètre. Bien que plus lourde à mettre en œuvre cette méthode apporte une meilleure sensibilité. Cependant dans la configuration optique décrite, il n'y a qu'une fraction de l'énergie lumineuse incidente qui participe à l'excitation du plasmon de surface. Par ailleurs, la sensibilité et la stabilité des images obtenues selon ces techniques sont limitées et globalement insatisfaisantes pour pouvoir visualiser des objets de très petite taille, de l'ordre de quelques dizaines de nanomètres notamment, comme cela peut être le cas en biologie. Par ailleurs, les autres techniques de microscopie comme la microscopie
OCT (pour «Optical Cohérence Tomography» en anglais) décrite dans le document US 2004/100636 ne peuvent combler les insuffisances ni être combinées aux technologies de plasmon de surface actuelles dans la mesure où la nature des faisceaux lumineux observés est différente, notamment la distribution en amplitude et en phase, non homogène dans le cas du plasmon de surface, et qui ne peut alors être observé en microscopie de type OCT qui s'attache à l'observation de faisceaux de lumière dont les variations sont uniformes en amplitude et en phase.
Un but de la présente invention est de procurer un microscope à plasmon de surface à haute résolution qui présente une résolution et une sensibilité accrue par rapport aux microscopes à plasmon de surface existants.
Un autre but de l'invention est de fournir un microscope à plasmon de surface qui procure une meilleure stabilité d'observation et une amélioration du faisceau lumineux d'excitation et d'observation du plasmon de surface. Un autre but de l'invention est de fournir un microscope à plasmon de surface qui permette l'observation de molécules et particules dans des milieux diélectriques aqueux, et notamment dans des liquides biologiques.
L'invention vise notamment à procurer un microscope à plasmon de surface à haute résolution qui permette la détection et la visualisation d'objets de très faibles tailles, de l'ordre du nanomètre, tels que des molécules biologiques par exemple, sans avoir recours à des marqueurs chimiques, optiques ou radioactifs de ces objets. Un autre but de l'invention est enfin de fournir un microscope à plasmon de surface qui soit compact et simple à utiliser, et également adapté à un environnement de laboratoire biologique ou médical.
Exposé de l'invention
Les différents objectifs assignés précédemment sont atteints conformément à la présente invention grâce à un microscope à plasmon de surface à haute résolution comportant essentiellement : a) une source de lumière cohérente d'émission d'un faisceau lumineux d'excitation, et b) un milieu de couplage optique et de confinement d'un plasmon de surface comportant un objectif à grande ouverture numérique, une huile à immersion et une lamelle de verre recouverte sur une face qui n'est pas en contact avec l'huile d'immersion d'une couche métallique, et c) un interféromètre hétérodyne divisant le faisceau lumineux d'excitation émis par la source de lumière en au moins un faisceau de référence et au moins un faisceau de mesure dirigé vers le milieu de couplage optique pour générer un plasmon de surface, l'interféromètre étant positionné entre la source lumineuse et l'objectif du milieu de couplage optique pour former un faisceau interférométrique entre le faisceau de référence et le faisceau de mesure après réflexion de chacun d'eux respectivement par élément réfléchissant et par la couche métallique, et d) des moyens de balayage de la couche métallique à l'aide du faisceau lumineux de mesure, et e) des moyens de détection du faisceau interférométrique issu de l'interféromètre, et f) des moyens de traitement et de formation d'une image à partir du faisceau interférométrique.
Conformément à l'invention, l'interféromètre hétérodyne du microscope est constitué essentiellement d'au moins quatre fibres optiques de guidage, respectivement, du faisceau d'excitation, du faisceau de mesure, du faisceau de référence, et du faisceau interférométrique et reliés optiquement au niveau d'une première de leurs extrémités à un coupleur optique et chacune également reliées optiquement en leur seconde extrémité respectivement à la source lumineuse, au milieu de couplage optique, à l'élément réfléchissant du faisceau de référence, et aux moyens de détection du faisceau interférométrique.
On entend ici par première extrémité des fibres optiques de l'interféromètre l'extrémité de chacune des fibres reliée au coupleur optique, et par seconde extrémité l'extrémité de chacune des fibres reliée à un autre élément du microscope distinct du coupleur optique.
Le microscope de l'invention permet la détection d'objets diélectriques et métalliques d'un diamètre inférieur à 10 nm, sans marquage desdits objets. II présente l'avantage, par rapport aux microscopes à plasmon de surface connus, de procurer une réduction importante de l'encombrement du microscope et des réglages optiques de celui-ci, car il permet la suppression de tout support mécanique des éléments optiques de l'interféromètre.
De plus, le microscope de l'invention procure une amélioration importante et significative de la stabilité de l'interféromètre et de la qualité des faisceaux optiques mis en jeu, aussi bien les faisceaux de mesure et de référence que le faisceau interférométrique, ce qui permet une bien meilleure qualité et sensibilité des images obtenues.
Selon l'invention, les fibres optiques de l'interféromètre hétérodyne peuvent être des fibres monomode ou multimodes. En pratique, le choix des fibres se fait selon les critères de stabilité et de sensibilité définis par l'utilisateur. Selon un mode préféré de réalisation du microscope de l'invention, les fibres optiques sont des fibres à maintien de polarisation à la longueur d'onde du faisceau lumineux d'excitation émis par la source. Toujours selon l'invention, le coupleur de liaison des fibres optiques de l'interféromètre est adapté aux propriétés des fibres optiques utilisées.
Toujours selon l'invention, les fibres optiques dont la seconde extrémité est reliée respectivement à l'élément réfléchissant du faisceau de référence et au milieu de couplage et confinement du plasmon de surface coopèrent chacune avec au moins un modulateur acousto-optique.
Selon un mode préféré de réalisation du microscope de l'invention, la fibre optique de guidage du faisceau lumineux d'excitation est reliée en sa seconde extrémité à la source lumineuse par l'intermédiaire au moins d'une lentille de collimation.
Dans ce mode de réalisation préféré, le microscope de l'invention comporte également de façon avantageuse un isolateur optique et une lame demi-onde disposés entre la source de lumière et la lentille de collimation.
Toujours dans ce mode de réalisation préféré, le microscope de l'invention comporte également avantageusement un convertisseur de polarisation positionné entre la lame demi-onde et la lentille de collimation. Ce convertisseur de polarisation permet de faire varier à volonté, le cas échéant de façon périodique, la polarisation du faisceau lumineux d'excitation de façon linéaire, circulaire, radiale, ou azimutale par exemple.
La conversion de polarisation procurée par le convertisseur de polarisation permet de façon particulièrement avantageuse de réaliser une imagerie en mode différentiel, qui permet d'améliorer encore le contraste et la dynamique des images obtenues. Il est en effet ainsi possible de polariser alternativement à l'aide du convertisseur de polarisation le faisceau d'excitation en mode pur p (polarisation radiale) et en mode pur s (polarisation azimutale) et de balayer linéairement de façon alternative et synchrone de la polarisation alternative du faisceau d'excitation la couche métallique par le faisceau de mesure polarisé alternativement en mode pur p et en mode pur s.
De façon avantageuse, la fibre de guidage du faisceau de mesure est reliée en sa seconde extrémité au milieu de couplage optique par l'intermédiaire d'une lentille de collimation qui collimate le faisceau de mesure sur l'objectif du milieu de couplage. Dans un mode particulier de réalisation du microscope de l'invention, l'élément réfléchissant du faisceau de référence est un miroir. De préférence, ce miroir est avantageusement constitué par un revêtement métallique déposé sur l'extrémité de la fibre de guidage du faisceau de référence.
Dans un autre mode particulier de réalisation, l'élément réfléchissant du faisceau de référence est constitué par la lamelle de verre d'un milieu de couplage optique identique au milieu de couplage relié à la fibre de guidage du faisceau de mesure, ladite lamelle étant revêtue sur une face non en contact avec l'huile d'immersion d'une couche métallique de même qualité que celle qui revêt la lamelle de verre du milieu de couplage optique relié à la fibre de guidage du faisceau de mesure.
Ce mode particulier de réalisation du microscope de l'invention permet avantageusement de réaliser une imagerie par interférence de plasmon de surface entre le faisceau réfléchi généré par le faisceau de mesure et le faisceau réfléchi généré par le faisceau de référence.
Dans une variante de réalisation du microscope de l'invention, l'objectif du milieu de couplage optique auquel est reliée la fibre de guidage du faisceau de mesure est remplacé par une lentille solide à immersion et la lentille de collimation du faisceau de mesure est intégrée sur la seconde extrémité de la fibre de guidage du faisceau de mesure, par assemblage ou sous la forme d'une fibre lentillée.
Dans une autre variante de réalisation, la lentille de collimation reliant la fibre de guidage du faisceau de mesure au milieu de couplage optique et l'objectif du milieu de couplage optique sont tous deux remplacés par un axicon formé directement à la seconde extrémité de ladite fibre de guidage du faisceau de référence.
Conformément à une autre caractéristique avantageuse du microscope de l'invention, celui-ci comporte un système de balayage de la surface métallique du milieu de couplage optique à l'aide du faisceau de mesure.
Enfin, le microscope de l'invention peut également, dans un mode de réalisation, comporter un polariseur entre les moyens de détection du faisceau interférométrique et la seconde extrémité de la fibre de guidage dudit faisceau interférométrique, notamment pour augmenter le contraste des images dans la configuration en polarisation linéaire.
Description des dessins
D'autres caractéristiques et avantages du microscope de l'invention ressortiront mieux à la lecture de la description détaillée qui va suivre, faite en référence aux figures annexées parmi lesquelles : - la Figure 1 représente un premier mode de réalisation préféré d'un microscope à plasmon de surface conforme à la présente invention,
- la Figure 2 représente un diagramme de réponse V(z) du microscope de l'invention dans la configuration de la Figure 1, - la Figure 3 représente un mode de réalisation alternatif du milieu de couplage optique du microscope, comportant un doublet de lentilles fixé sur une fibre optique,
- la Figure 4 représente schématiquement une première variante de réalisation du microscope de l'invention, - la Figure 5 représente une seconde variante du microscope de l'invention adaptée à la réalisation d'une microscopie par interférence de plasmon.
Description détaillée de modes de réalisation de l'invention La présente invention propose une nouvelle configuration de microscope à plasmon de surface à haute résolution pour l'observation de nanoparticules ou molécules sans marqueurs fluorescents dans l'air et en milieu aqueux. Dans cette configuration, de façon originale, le microscope comporte un interféromètre hétérodyne composé essentiellement de fibres optiques. En référence tout d'abord à la Figure 1, le microscope de la présente invention comporte tout d'abord une source de lumière cohérente 1, choisie dans l'exemple particulier présenté comme étant une source laser Hélium-Néon monomode, polarisé et stabilisé en amplitude. Cette source de lumière n'est cependant pas limitative et l'on peut envisager l'utilisation d'autres types de sources lumineuses cohérentes.
La source de lumière 1 émet un faisceau laser d'excitation d'un plasmon de surface qui est injecté et dirigé par un interféromètre hétérodyne 6 jusqu'à un milieu de couplage optique 7 comportant, dans l'exemple de la Figure 1 et de manière classique pour un microscope à plasmon de surface, un objectif à forte ouverture numérique 8, une huile à immersion 9 et une lamelle de verre 10 recouverte d'une fine couche de métal 11, de préférence d'une fine couche d'or, au niveau de laquelle un plasmon de surface est généré par le faisceau laser d'excitation.
L'interféromètre hétérodyne 6 du microscope de l'invention est composé essentiellement, comme représenté sur la Figure 1, d'au moins quatre fibres optiques 12, 13, 14, 15 reliées optiquement entre elles au niveau d'une première de leurs extrémités 12a, 13a, 14a, 15a par un coupleur optique 16. Ces fibres optiques 12, 13, 14, 15 sont de façon préférée des fibres monomode à maintien de polarisation.
Au sens de l'invention, on entend par fibre optique à maintien de polarisation que les fibres optiques 12, 13, 14, 15 de l'interféromètre sont monomodes à la longueur d'onde du faisceau laser d'excitation de la source 1, c'est-à-dire que la propagation de la lumière dans ces fibres optiques s'effectue sur un seul mode guidé.
Une première fibre optique 12 forme une fibre de guidage du faisceau d'excitation. Ce faisceau est injecté dans la fibre de guidage 12 par la seconde extrémité 12b de la fibre au moyen d'une lentille de collimation 5. Entre cette lentille de collimation 5 et la source de lumière 1, le faisceau d'excitation émis par ladite source traverse un isolateur optique 2, une lame demi-onde 3 et un convertisseur de polarisation 4. L'isolateur optique 2 a pour fonction d'éliminer le retour de faisceau lié à l'interféromètre 6 qui se comporte comme un miroir et qui déstabilise le laser. La lame demi-onde 3 quant à elle permet de contrôler l'orientation de la polarisation du faisceau d'excitation, le convertisseur de polarisation 4 étant lui destiné à générer une polarisation choisie du faisceau d'excitation avant son entrée dans la fibre de guidage 12, cette polarisation pouvant être linéaire, circulaire, radiale, ou azimutale par exemple.
La fibre de guidage 12 est soudée en sa première extrémité 12a au coupleur optique 16. Ce coupleur 16 est du type à maintien de polarisation. Il divise le faisceau d'excitation guidé par la fibre 12 depuis la source de lumière 1 en deux faisceaux identiques dits de mesure et de référence respectivement, le faisceau de mesure étant transmis et guidé dans une seconde fibre optique de guidage 13 vers le milieu de couplage optique du microscope, le faisceau de référence étant lui transmis et guidé par une troisième fibre optique 14 jusqu'à un élément réfléchissant 17, cet élément étant dans cet exemple de réalisation un miroir 18.
Les fibres optiques 13, 14 forment respectivement les bras de mesure 19 et de référence 20 de l'interféromètre hétérodyne 6. Ces deux bras, et donc les deux fibres 13, 14 sont connectées chacune à un modulateur acousto-optique
21, 22 qui décale la fréquence optique du faisceau de lumière transmis par chaque fibre 13, 14 d'une fréquence Ωref et Ωtest.
Le modulateur acousto-optique 22 du bras de référence 20 est connecté à une fibre optique 23 à maintien de polarisation dont l'extrémité 24 est recouverte d'un dépôt métallique faisant office de miroir 18. La lumière transmise dans ce bras 20, dont la fréquence a été décalée de Ωref est réfléchie par ce miroir 18, et repasse par le modulateur acousto-optique 22, la fibre optique 14, le coupleur 16 et est ensuite couplée dans un quatrième bras 25 de l'interféromètre 6 formé par une quatrième fibre optique 15. Elle subit un décalage en fréquence totale de 2Ωref.
Dans le bras de mesure 19, la fibre optique 13 est connectée à un modulateur acousto-optique 21 qui décale la fréquence optique de la lumière transmise d'une fréquence Ωtest. Le modulateur acousto-optique 21 est connecté à une fibre optique à maintien de polarisation 26, en sortie de laquelle la lumière, qui est en fait le faisceau d'excitation, est collimatée par une lentille de collimation 28 sur l'objectif à forte ouverture numérique du milieu de couplage optique du microscope, pour illuminer la lame de verre sur lequel un échantillon E est placé pour être observé. La lumière du faisceau d'excitation transmise par l'objectif 8 est réfléchie par le système optique 10, 11, E, repasse par l'objectif 8 et retourne vers la lentille 27 qui focalise la lumière au niveau de l'extrémité de la fibre optique 26 pour y permettre sa réinjection. La lumière est à nouveau décalée en fréquence à la sortie du modulateur acoustique 21 de Ωtest. Après passage dans la fibre optique 13 et le coupleur 16, la lumière réfléchie est transmise dans le quatrième bras 25 de l'interféromètre hétérodyne 6 avec le faisceau réfléchi provenant du bras de référence. Elle subit un décalage global en fréquence de 2Ωtest. Ainsi le champ lumineux qui se propage dans le quatrième bras 25 de l'interféromètre est la superposition des faisceaux réfléchis provenant du bras de référence et du bras de mesure.
A l'extrémité 15b de la fibre 15 formant le quatrième bras 25 se trouve un détecteur 28 photosensible, la puissance lumineuse présente une composante continue et une composante modulée dans le temps à la fréquence fm = 2(Ωtest
— Ωref) = 2 ΔΩ.
A l'entrée du détecteur 28 un polariseur 29 peut être également rajouté dans le cas d'une polarisation linéaire du faisceau d'excitation de départ. Le microscope de l'invention, tel que représenté sur la Figure 1 et décrit ci- dessus procure un grand nombre d'avantages par rapport aux microscopes à plasmon de surface connus.
En particulier, le microscope de l'invention procure une miniaturisation du microscope (partielle ou totale) liée à la réduction de l'encombrement de l'interféromètre 6 permise par l'utilisation de fibres optiques. L'intégration d'un interféromètre 6 fibre réduit fortement le volume du système car le remplacement des composants optiques par des fibres optiques élimine la nécessité d'utiliser des supports mécaniques et diminue ainsi le volume occupé par les bras de rinterféromètre. L'utilisation de fibres optiques permet également comme il va être décrit par la suite et est représenté aux Figures 3 et 4 de remplacer l'étage optique permettant l'agrandissement du faisceau et l'objectif de microscope par un système tout fibre ou un système fibre/lentille qui permet d'exciter le plasmon de surface et de le confiner. Cette partie du montage est donc moins volumineuse et peut être fixée en extrémité de la fibre optique. On peut ainsi réaliser une version de ce microscope totalement fibrée.
L'utilisation de fibres optiques pour réaliser rinterféromètre 6 du microscope procure également une diminution drastique du nombre de réglages optiques, une amélioration de la stabilité de l'interféromètre, et une amélioration de la qualité des faisceaux optiques d'excitation, de mesure, de référence et du faisceau interférométrique. Dans un interféromètre en champ libre tel qu'utilisé dans les microscopes connus dans l'état de la technique, il faut superposer les faisceaux issus de chaque bras de l'interféromètre. Pour former le faisceau interférométrique que l'on va détecter pour former les images il faut donc aligner les deux faisceaux de référence et de mesure (ou plus exactement leurs faisceaux réfléchis) et maintenir dans le temps l'optimum de superposition de ces deux faisceaux.
L'expression de l'intensité du signal interférométrique recueilli par le détecteur de l'interféromètre en champ libre s'écrit : ï ≈ Iref + /,„„ -r 2 M(I)
Figure imgf000014_0001
+ φ) où
Iref et Itest sont les intensités lumineuses issues des bras de référence et de test respectivement, φ est la phase du signal d'interférence,
M(t) est un facteur variant entre 0 et 1, traduisant la superposition des deux faisceaux au niveau du détecteur.
M(t) dépend dans ce cas de la qualité du recouvrement des deux faisceaux et par conséquent est une fonctionnelle du temps t.
Dans un système en champ libre un rattrapage doit donc être fait en permanence pour compenser les dérives mécaniques des composants. Dans la pratique ceci implique un réalignement assez régulier de l'appareil
(dépendant fortement des conditions de stabilité thermique de l'interféromètre) qui peut être entrepris soit par l'utilisateur, soit automatiquement si un système de rattrapage automatisé est introduit dans l'interféromètre. Ce rattrapage peut être réalisé par exemple par une motorisation à la fois du miroir du bras de référence et d'un miroir de renvoi en amont de la séparation des faisceaux. Les positions de ces miroirs sont réajustées par une boucle de rattrapage de positionnement du faisceau basée soit sur la détection de position du faisceau, soit sur le contrôle du signal optique lui même (optimisation).
Dans une configuration fibrée comme proposée par l'invention, l'intensité du signal tiré du faisceau interférométrique s'écrit :
Figure imgf000015_0001
Cette fois ci M ne dépend pas du temps. En effet dans un interféromètre par fibre optique l'obtention du processus d'interférence se fait directement par couplage au sein des fibres optiques et ne nécessite par conséquent aucun postréglage ou rattrapage de superposition des faisceaux.
La réponse optique du microscope V(z) où z est la défocalisation de l'échantillon par rapport au foyer de l'objectif du microscope est donnée par la relation suivante :
V(z) = M ^Λ c//,ft, cos{2îr £,,/- - «>)
Le signal optique S(x, y) de chaque pixel d'une image produite par le microscope à plasmon de surface étant directement proportionnel au module du troisième terme de l'équation (2) ci-dessus, c'est à dire :
S{x, y)
Figure imgf000015_0002
M y lrf f(x. ytftrJx. y)
La Figure 2 témoigne de la pertinence et de la performance d'un microscope à plasmon de surface à interféromètre hétérodyne fibre 6 tel que proposé par l'invention.
Cette Figure 2 présente le module de la réponse optique d'un microscope à plasmon de surface en fonction de la défocalisation z de l'objectif du microscope par rapport à l'interface de la couche métallique 11 d'or recouvrant la lame de verre 10 du milieu de couplage optique 7 avec le milieu d'observation (ici l'air), la couche métallique 11 présentant dans cet exemple une épaisseur de 45 nm.
Comme on peut le remarquer sur ce diagramme, dans le domaine des z positifs il existe un phénomène d'oscillation dont la période Δz est reliée aux propriétés du plasmon de surface. On peut également constater par comparaison de la courbe de réponse du microscope fibre avec celle d'un microscope en champ libre connu de l'art antérieur, que la réponse du microscope conforme à l'invention est sensiblement identique à celle du microscope en champ libre, donc que l'intensité du signal de réponse V(z) du microscope fibre est similaire à celle des microscopes en champ libre. Cette comparaison valide donc la configuration fibrée de ce microscope. En outre, le système fibre est performant avec un nombre de photons bien inférieur à celui d'un système en champ libre. Dans le mode de réalisation préféré, un gain de sensibilité au niveau de la détection a été mesuré (facteur > 10), toute chose étant égale par ailleurs (laser, détecteur). Par ailleurs, le choix d'un microscope à interféromètre fibre permet naturellement une isolation supérieure du système qui le rend moins sensible aux fluctuations externes de température, vibrations acoustique et mécanique, ou de fluctuations de l'air.
En outre, pour les mêmes raisons qu'indiquées précédemment, la propagation des champs électromagnétiques dans le cœur des fibres optiques utilisées assure une superposition totale des champs, éliminant les fluctuations du signal interférométrique liées aux fluctuations des positions respectives des faisceaux de mesure et de référence, telle qu'on peut l'avoir avec les microscopes en champ libre. Cette stabilité améliore fortement le rapport signal sur bruit du signal de phase φ de l'interféromètre et rend plus aisées des mesures fines à partir du signal de phase (en raccourcissant le temps d'intégration de la mesure). A la différence des microscopes à plasmon de surface en champ libre, il est donc possible d'exploiter avec le microscope de l'invention, qui utilise un interféromètre 6 à fibres optiques, le signal de phase et d'obtenir des images de la phase du signal de réponse V(z) du microscope. L'utilisation de la phase du signal V(z) permet notamment de façon avantageuse de distinguer la nature d'un échantillon observé à l'aide du microscope et donc, lorsque par exemple on étudie un milieu aqueux contenant différentes particules ou molécules, de savoir quel type de particule on observe à un instant t.
Enfin, un dernier avantage singulier du microscope à interféromètre fibre de la présente invention est de permettre une amélioration de la qualité des faisceaux optiques mis en jeu, que ce soit le faisceau d'excitation, les faisceaux de mesure et de référence ou encore le faisceau interférométrique. En effet, la propagation de la lumière se faisant dans des fibres optiques monomode, le champ lumineux qui se propage dans le cœur de la fibre possède un profil en fonction de la distance radiale r au centre de la fibre qui peut s'approximer par une gaussienne ^r) ™~ ffiφ(~r iw J. Le faisceau qui arrive sur l'objectif de microscope présente un profil gaussien bien plus régulier que celui que l'on peut obtenir en champ libre. En outre la lumière réfléchie par l'échantillon E dans le bras de mesure 19 de l'interféromètre retourne dans la fibre optique 26 en étant filtrée spatialement lors de sa réinjection dans la fibre du fait de son passage par un cœur de quelques micromètres de diamètre, réalisant ainsi un nettoyage du faisceau.
Comme cela a été évoqué précédemment, des variantes de réalisation particulièrement avantageuses du microscope à interféromètre fibre de la présente invention sont proposées conformément à l'invention et décrites ci-après en relation avec les Figures 3 et 4.
Une première variante du microscope de l'invention est entièrement fibrée, depuis la source lumineuse jusqu'au milieu de couplage optique du microscope. Dans cette réalisation, la lentille de collimation 27 et l'objectif à grande ouverture numérique 8 du microscope de la Figure 1 sont remplacés par un doublet de lentilles (block B2 dans la Figure 4). La première lentille de ce doublet, non représenté sur la Figure 4, est intégrée sur l'extrémité de la fibre optique 26, soit sous la forme d'une fibre lentillée, c'est-à-dire que l'extrémité de la fibre 26 est elle même usinée et constitue un dioptre, soit comme représenté à la Figure 3 sous la forme d'un bloc optique 30 fixé à l'extrémité de la fibre 26 et comportant une première lentille 31 ainsi qu'une seconde lentille 32 qui est une lentille SIL (pour "solid immersion lens" en anglais), dont une face plane 33 fait office de lame de verre et est recouverte d'une fine couche d'or 11 qui est au contact du milieu d'observation dans lequel se trouve par exemple un échantillon E à observer. Cette seconde lentille 32 permet la focalisation du faisceau de mesure issu de la première lentille 31 au niveau de l'interface couche d'or/milieu d'observation pour générer le plasmon de surface.
Ce montage présente plusieurs avantages, en particulier d'être beaucoup plus compact qu'un objectif à immersion commercial tel qu'utilisé dans le microscope de la Figure 1. De plus, l'utilisation d'un doublet de lentille permet une fixation directe sur l'extrémité de la fibre optique 26 de transmission du faisceau de mesure, tout en proposant des ouvertures numériques supérieures aux objectifs commerciaux et en conséquence de permettre l'observation de milieux à plus forts indices (polymères denses, cristaux liquides, solvants non aqueux...)- En effet en choisissant des lentilles SIL avec des indices de réfraction élevés (supérieurs à 2 voire plus) on augmente l'ouverture numérique.
Une variante de réalisation non représentée consiste également à remplacer l'objectif 8 du microscope de la Figure 1 par une fibre dont l'extrémité présente un axicon. L'axicon est directement usiné à partir de l'extrémité de la fibre optique pour donner une forme conique au cœur de la fibre optique. Un tel axicon permet de générer un anneau de lumière convergeant dont l'angle d'incidence élevé permet d'exciter le plasmon de surface.
Sur la Figure 4, les parties du microscope de l'invention qui peuvent être au choix fibrées ou non sont représentées sous forme de blocs Bl, B2. Ainsi on peut constater qu'il est également possible, outre le milieu de couplage optique du microscope par un bloc B2 tel que par exemple le bloc 30 de la Figure 3, de remplacer la source de lumière et le conditionnement du faisceau lumineux d'excitation émis par cette source par un système tout fibre Bl, tel que par exemple un laser fibre polarisé. Dans une autre variante représentée à la Figure 5, le microscope de l'invention comporte non pas un mais deux milieux de couplage optique 7, T1 placés chacun à l'extrémité du bras de mesure 19 et du bras de référence 20 du microscope et tous deux identiques dans leur constitution, notamment comportant un objectif 8', une huile à immersion 91 et un lame de verre 10" recouverte d'une couche d'or 111 de même qualité et épaisseur que celle du milieu de couplage optique 7 du bras de mesure 19. Dans cette configuration, l'élément réfléchissant 17 du microscope de la Figure 1 est remplacé par une lentille de focalisation 34 fixée à l'extrémité de la fibre optique 23 afin de collimater le faisceau de référence sur l'objectif 8' du second milieu de couplage optique 7". Cette configuration particulière de microscope à plasmon de surface, jamais encore dévoilée, permet de réaliser une imagerie de plasmon de surface différentielle entre le signal extrait du faisceau de mesure et le signal extrait du faisceau de référence, qui tous deux comportent alors une information liée au plasmon de surface. Ainsi, il est possible de corriger le plasmon de surface formé au niveau du milieu de couplage du bras de mesure, au contact d'un échantillon observé, par un autre plasmon de surface de référence, obtenu sur une même couche mince d'or mais cette fois vierge de tout contact avec un échantillon.
Ainsi, on augmente de façon considérable la sensibilité du microscope car il est possible de discriminer, dans le signal interférométrique et la réponse V(z) du microscope, le bruit lié à la couche d'or et au plasmon de surface de celui lié à l'échantillon observé. Bien entendu, dans cette configuration il est possible de remplacer les deux milieux de couplage optique 7, T par deux doublets de lentilles tel que décrit précédemment et représenté à la Figure 3.
Dans toutes les variantes du microscope de l'invention présentées précédemment, il est possible d'agir par le biais du convertisseur de polarisation adjoint à la source lumineuse pour faire varier à façon la polarisation du faisceau lumineux d'excitation, et par voie de conséquence celle des faisceaux de mesure, de référence et interférométrique dans chacun des bras de l'interféromètre hétérodyne à fibres optiques 6.
Selon un mode d'utilisation particulier du microscope de l'invention, il est intéressant d'utiliser le convertisseur de polarisation pour réaliser à l'aide du faisceau de mesure des balayages de la couche d'or du milieu de couplage optique en lignes alternativement polarisées en mode pur p (polarisation radiale) et en mode pur s (polarisation azimutale). Ainsi dans ce mode de fonctionnement, on pilote électroniquement le convertisseur de polarisation de façon à basculer selon une fréquence choisie d'une polarisation azimutale à une polarisation radiale du faisceau lumineux d'excitation émis par la source laser 1 de façon synchrone avec des composants mécaniques de déplacement selon les trois axes Z de l'objectif et X, Y; du milieu de couplage optique. Dans le cas où cet objectif est substitué par un doublet de lentilles comme décrit précédemment en relation avec les Figures 3 et 4, le déplacement concerne l'extrémité de la fibre optique 26 supportant le doublet. Ce mode d'illumination alterné de la couche d'or du milieu de couplage optique permet avantageusement de réaliser une imagerie différentielle de plasmon de surface. On obtient ainsi des images mieux contrastées, un gain en dynamique des images, ainsi qu'un rattrapage de la décroissance de la réponse V(z) du microscope lorsque la défocalisation z augmente par rapport à l'échantillon.
Une autre utilisation du signal optique obtenu des faisceaux polarisés en mode pur s peut également être faite aux fins d'asservissement de la position verticale de l'objectif 8 au bout du bras de mesure par rapport à l'échantillon E à observer. En effet, l'analyse des signaux établis à partir du faisceau de mesure polarisé en mode s et réfléchi par la couche d'or du milieu de couplage optique permet de déterminer la valeur absolue de la position de l'objectif 8, et à partir de cette position, il est ensuite possible de corriger tous les drifts mécaniques et thermiques inhérents à une microscopie de haute résolution. Une telle technique de correction de la position de l'objectif du microscope n'est pas en soi totalement nouvelle en microscopie, cependant, avec le microscope de l'invention, la particularité réside dans le fait que c'est le système d'imagerie lui-même qui permet de faire la correction et non un système rapporté en parallèle au système d'imagerie. De ce fait, on ne complexifie point le microscope ni n'augmente de façon importante son coût d'ajustement, le tout sans perturber la mesure optique de plasmon. De plus, une telle faculté d'asservissement de la position de l'objectif 8 par rapport à l'échantillon observé permet d'avoir une plus grande précision dans les mesures de la fonction V(z), aussi bien en amplitude qu'en phase. Un autre avantage du microscope de la présente invention est de permettre la construction d'images en trois dimensions de la fonction V(z) mesurée. La construction de telles "cartes" tridimensionnelles de la fonction V(z) permet de trouver le plan optique de coupe où le contraste de l'image sera le meilleur. Pour ce faire, on réalise un post-traitement de ces images 3D puis par interpolation on détermine le plan Z où le contraste est optimum.

Claims

REVENDICATIONS
1. Microscope à plasmon de surface à haute résolution comportant essentiellement : a) une source (1) de lumière cohérente d'émission d'un faisceau lumineux d'excitation, et b) un milieu de couplage optique (7) et de confinement d'un plasmon de surface comportant un objectif (8) à grande ouverture numérique, une huile à immersion (9) et une lamelle de verre (10) recouverte sur une face qui n'est pas en contact avec l'huile d'immersion d'une couche métallique (11), et c) un interféromètre hétérodyne (6) divisant le faisceau lumineux d'excitation émis par la source de lumière en au moins un faisceau de référence et au moins un faisceau de mesure dirigé vers le milieu de couplage pour générer un plasmon de surface, l'interféromètre étant positionné entre la source lumineuse et l'objectif du milieu de couplage pour former un faisceau interférométrique entre le faisceau de référence et le faisceau de mesure après réflexion de chacun d'eux respectivement par élément réfléchissant (17) et par la couche métallique (10), et d) des moyens de balayage de la couche métallique à l'aide du faisceau lumineux de mesure, et e) des moyens de détection (28) du faisceau interférométrique issu de l'interféromètre, et f) des moyens de traitement et de formation d'une image à partir du faisceau interférométrique, et caractérisé en ce que l'interféromètre hétérodyne (6) est constitué essentiellement d'au moins quatre fibres optiques (12, 13, 14, 15) de guidage, respectivement, du faisceau d'excitation, du faisceau de mesure, du faisceau de référence, et du faisceau interférométrique et reliés optiquement au niveau d'une première de leurs extrémités (12a, 13a, 14a, 15a) à un coupleur optique (16) et chacune également reliées optiquement en leur seconde extrémité (12b, 13b, 14b, 15b) respectivement à la source lumineuse (1), au milieu de couplage optique (7), à l'élément réfléchissant (17) du faisceau de référence, et aux moyens de détection (28) du faisceau interférométrique.
2. Microscope selon la revendication 1, caractérisé en ce que les fibres optiques de l'interféromètre hétérodyne sont des fibres monomode ou multimodes.
3. Microscope selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que les fibres optiques de l'interféromètre hétérodyne sont des fibres à maintien de polarisation.
4. Microscope selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les fibres optiques (13, 14) dont la seconde extrémité (13b, 14b) est reliée respectivement à l'élément réfléchissant du faisceau de référence et au milieu de couplage et confinement du plasmon de surface coopèrent chacune avec au moins un modulateur acousto-optique (21, 22).
5. Microscope selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la fibre optique (12) de guidage du faisceau lumineux d'excitation est reliée en sa seconde extrémité (12b) à la source lumineuse (1) par l'intermédiaire au moins d'une lentille de collimation (5).
6. Microscope selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il comporte un isolateur optique (2) et une lame demi-onde (3) disposés entre la source de lumière (1) et la lentille de collimation (5).
7. Microscope selon la revendication 5 ou 6, caractérisé en ce qu'il comporte un convertisseur de polarisation (4) positionné entre la lame demi-onde
(3) et la lentille de collimation (5).
8. Microscope selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la fibre (13) de guidage du faisceau de mesure est reliée au milieu de couplage par l'intermédiaire d'une fibre optique (26) et d'une lentille de collimation (27).
9. Microscope selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l'élément réfléchissant (17) du faisceau de référence est un miroir (18).
10. Microscope selon la revendication 9, caractérisé en ce que le miroir (18) est constitué par un revêtement métallique déposé sur l'extrémité d'une fibre (23) reliée à l'extrémité (14b) de la fibre (14) de guidage du faisceau de référence.
11. Microscope selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l'élément réfléchissant (17) du faisceau de référence est constitué par la lamelle de verre (101) d'un milieu de couplage optique (71) identique au milieu de couplage optique (7) relié à la fibre (13, 26) de guidage du faisceau de mesure, ladite lamelle (101) étant revêtue sur une face dépourvue de contact avec l'huile d'immersion (91) d'une couche métallique (111) de même qualité que celle qui revêt la lamelle de verre (10) du milieu de couplage optique relié à la fibre de guidage du faisceau de mesure.
12. Microscope selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que l'objectif du milieu de couplage optique auquel est reliée la fibre de guidage du faisceau de mesure est formé par une lentille solide à immersion (32) et la lentille de collimation (31) du faisceau de mesure est intégrée sur l'extrémité de la fibre de guidage du faisceau de mesure, par assemblage ou sous la forme d'une fibre lentillée.
13. Microscope selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce qu'il comporte un axicon formé directement à l'extrémité de ladite fibre de guidage du faisceau de référence.
14. Microscope selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce qu'il comporte un système de balayage de la surface métallique du milieu de couplage optique à l'aide du faisceau de mesure.
15. Microscope selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé en ce qu'il comporte un polariseur (29) positionné entre les moyens de détection (28) du faisceau interférométrique et la seconde extrémité (15b) de la fibre de guidage (15) dudit faisceau interférométrique.
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