WO2024003470A1 - Dispositif d'amplification d'un signal en imagerie de phase quantitative autoreferencee - Google Patents

Dispositif d'amplification d'un signal en imagerie de phase quantitative autoreferencee Download PDF

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WO2024003470A1
WO2024003470A1 PCT/FR2022/051312 FR2022051312W WO2024003470A1 WO 2024003470 A1 WO2024003470 A1 WO 2024003470A1 FR 2022051312 W FR2022051312 W FR 2022051312W WO 2024003470 A1 WO2024003470 A1 WO 2024003470A1
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light radiation
zone
optical
phase
attenuation
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Application number
PCT/FR2022/051312
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English (en)
Inventor
Pascal BERTO
Clémence GENTNER
Pierre Bon
Gilles Tessier
Benoit ROGEZ
Original Assignee
Sorbonne Universite (Su)
Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm)
Universite Paris Cite
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    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/06—Means for illuminating specimens
    • G02B21/08—Condensers
    • G02B21/14—Condensers affording illumination for phase-contrast observation

Definitions

  • the present invention relates to a quantitative phase imaging device, in particular for the characterization of nano-objects.
  • Prior technique When a transparent or semi-transparent object is observed in conventional transmission microscopy, that is to say in a bright field, the contrast observed in the image is generally low. This complicates the study of the object, particularly when the size of the object is less than a micrometer.
  • Phase contrast microscopy developed by Frederik Zernike is an imaging method consisting of exploiting the phase changes of a light wave passing through an object to be imaged.
  • a disadvantage of the phase contrast microscope is the halo it introduces into the image around the objects observed.
  • Phase contrast microscopy is based on measuring the intensity of the light wave, and on the hypothesis that part of the phase information is transmitted in the intensity by interference phenomena. Thus, it has the major disadvantage of not quantifying the phase of the wave, and does not make it possible to isolate the intensity contribution from the phase contribution. However, as described below, the precise measurement of the phase is particularly important in numerous applications, in particular for the study of microorganisms or the characterization of nanoparticles.
  • Quantitative phase microscopy is another imaging method based on the analysis of the wavefront of light that illuminates and interacts with the object to be imaged. It measures the optical phase, or a proportional quantity of this wave. In most cases, it simultaneously measures light intensity.
  • Quantitative phase microscopy generates contrasts superior to those obtained in conventional microscopy for transparent or semi-transparent objects, and thus makes it possible to study smaller objects in detail than with conventional microscopy.
  • the quantitative measurement of the phase makes it possible in particular to access the measurement of density or mass of an observed object.
  • phase microscopy techniques based on the measurement of interference between a reference wave and a wave having interacted with the object to be imaged, such as holography
  • self-referenced techniques can be implemented using a wavefront analyzer imaging the object.
  • the wavefront analyzer can be based on the use of an optical mask, for example a matrix of holes of the Hartmann type, a matrix of microlenses of the Shack-Hartmann type, a grating, a mask of Modified Hartmann, a diffuser, or meta-surface, upstream of a camera.
  • Quantitative phase microscopy has many applications, particularly in biology to image weakly diffusing subcellular components while obtaining characteristic biophysical values. But observation at the molecular scale is complex, if not impossible, due to the weak light-matter interaction of semi-transparent nano-objects. Quantitative phase microscopy also makes it possible to detect and characterize nanoparticles or to monitor chemical reactions. The detection limit of objects or material flows depends directly on the phase sensitivity of the method used. Quantitative phase microscopy also makes it possible to map variations in the refractive index resulting from thermal disturbance. It thus makes it possible to map a temperature distribution with micrometric spatial precision.
  • phase sensitivity would then make it possible to increase the temperature sensitivity. This would also make it possible to map with greater sensitivity changes in the refractive index resulting from electrical, acoustic or magnetic disturbance.
  • quantitative phase microscopy makes it possible to measure the profile of a surface, with variations in thickness inducing a local variation in the measured phase shift. Good phase sensitivity is crucial for quantifying sub-nanometric thickness variations.
  • a defect common to known quantitative phase microscopy techniques is the fact that the amplitude of the field scattered by the object(s) to be imaged is very low compared to the amplitude of the incident field.
  • the invention proposes a quantitative phase imaging device comprising: - an optical imaging system for imaging an object in an image plane, - a light source for emitting light radiation on at least part of the plane of Fourier of the imaging optical system, - an optical spatial filter extending in the Fourier plane of the imaging optical system and comprising a zone of less attenuation of the light radiation and a zone of greater attenuation of the light radiation, - a front sensor wave for measuring, in the image plane, the intensity and phase of the electromagnetic field associated with the light radiation emitted by the light source and which has passed through the imaging optical system and the optical spatial filter, and of which at least part has interacted with the object, in order to quantify the phase induced by the object, the light source, the optical imaging system and the optical spatial filter being arranged so that in the absence of the object to be imaged, the light radiation is focused on the zone of greatest attenuation.
  • the “Fourier plane” of the imaging optical system is the plane in which the Fraunhofer diffraction pattern, that is to say the Fourier transform of the object studied, can be observed.
  • the user of the device can visualize, in the Fourier plane, the spatial frequencies of the object studied.
  • the imaging optical system is telecentric, that is to say that its entrance pupil or its exit pupil is at infinity, and the Fourier plane is coincident with a pupil plane of the imaging optical system.
  • a “pupillary plane” of the imaging optical system is a plane in which the pupil of the optical system, or an image of it by a part of the optical system, is observed.
  • the incident light radiation coming from the light source and not diffracted and/or not scattered by the object is focused on the zone of greatest attenuation of the spatial filter, while the light radiation diffracted and/or scattered by the object is localized at least in part on the zone of least attenuation.
  • the optical spatial filter specifically attenuates the intensity of the incident light radiation not diffracted and/or scattered by the object, while keeping the intensity of the radiation diffracted and/or scattered by the object virtually unchanged outside the zone. greater attenuation.
  • the invention makes it possible to attenuate the contribution of the incident electromagnetic field associated with the incident light radiation emitted by the light source and not diffracted and/or scattered by the object to the electromagnetic field detected by the wavefront sensor, which amplifies the phase signal. From the measurement of the phase and the intensity, and taking into account the complex transmittance of the zones of greatest and least attenuation, an analytical model or numerical processing makes it possible to determine the quantified value of the phase which would be measured in the absence of the optical spatial filter, with an increased signal-to-noise ratio. It is thus possible to calculate relevant quantitative quantities, such as the dry mass of the object, the index value of the object, or the thickness of the object, from this quantified value of the phase.
  • Wavefront sensor measures at least one variation, in particular a gradient, of the phase of the light radiation having passed through the object, the imaging optical system and the optical spatial filter, or a characteristic quantity of said phase such as the difference in optical path traveled by two light rays.
  • the phase induced by the object can be determined from the characteristic quantity, by integration of the measured gradient.
  • the wavefront sensor further measures the intensity of said radiation.
  • the wavefront sensor preferably comprises a detector of light radiation, for example a camera, and in particular comprises a two-dimensional sensor making it possible to sample the intensity.
  • the wavefront sensor comprises a wavefront analysis mask placed in front of the detector along the optical path of the light radiation, in order to determine the spatial distribution of the gradient of the phase of the light radiation or a signal proportional to said phase.
  • the wavefront analysis mask can in particular simultaneously measure the phase and the intensity of the detected light radiation.
  • the wavefront analysis mask preferably comprises a diffractive, periodic or aperiodic optical element, and/or a refractive optical element.
  • the wavefront analysis mask can be placed close to the detector or close to a plane conjugate to the plane in which the detector extends.
  • the wavefront analysis mask can be chosen in particular from a mask comprising an array of microlenses, for example a Shack-Hartmann mask, a modified Hartmann mask, for example as described by P. Bon et al. In “Quadriwave lateral shearing interferometry for quantitative phase microscopy of living cells”, Opt. Express, 17, 13080-13094 (2009), and a thin diffuser, for example as described by P. Berto, H. Rigneault and M. Guillon in “Wavefront sensing with a thin diffuser”, Opt. Lett. 42, 5117-5120 (2017).
  • the light radiation detector preferably comprises a digital camera for acquiring the light radiation which, preferably, has interacted with the wavefront analysis mask.
  • the digital camera may include a light sensor, for example CMOS or CCD, to acquire the light radiation and which measures the intensity of said light radiation.
  • a light sensor for example CMOS or CCD
  • Optical spatial filter The zone of greatest attenuation and, optionally, the zone of least attenuation, are adapted to attenuate the intensity of the light radiation. Preferably, the zone of least attenuation does not attenuate the intensity of the light radiation, in order to maintain maximum light intensity for the measurement.
  • the zone of greatest attenuation induces a greater attenuation of the intensity of the light radiation than the zone of less attenuation.
  • the zone of greater attenuation and/or the zone of less attenuation can induce a phase shift between the light radiation which is incident on said zones respectively and the light radiation attenuated by said zones so as to amplify the signal-to-noise ratio of the phase signals and intensity measured
  • the optical spatial filter is adapted to reflect the light radiation, the zone of greatest attenuation being semi-reflective.
  • the area of least attenuation may be semi-reflective or, preferably, reflective.
  • the zones of less attenuation and greater attenuation can have different thicknesses, in order to induce different phase shifts in the light radiation that they attenuate.
  • the spatial filter is adapted to transmit the light radiation, the zone of greatest attenuation being semi-transparent.
  • the area of least attenuation may be semi-transparent or, preferably, transparent.
  • the optical spatial filter may comprise a transparent support and a semi-opaque coating partially covering the support, the area of greatest attenuation being defined by the superposition of the support and the semi-opaque coating.
  • the transparent support may be made of glass.
  • the semi-opaque coating may have the shape of at least one disk of radius r fs , preferably less than 0.1*r p , r p being the maximum radius of the disk within which the collected spatial frequencies are distributed in the Fourier plane. For example, rfs ⁇ 100 ⁇ m.
  • the Fourier plane is confused with a pupil plane.
  • r p then represents the radius of the image of the aperture pupil of the imaging optical system in the Fourier plane.
  • the semi-opaque coating is shaped like a ring. It can present any shape corresponding to the angular spectrum of illumination.
  • the semi-opaque coating may be centered on the optical axis of the optical spatial filter.
  • the semi-opaque coating may have a thickness of less than 100 nm.
  • the semi-opaque coating may comprise a semi-opaque layer of a metal chosen from gold, silver, aluminum, chrome, titanium, and their alloys, for example gold.
  • the semi-opaque coating may include an adhesion layer sandwiched between and in contact with the support and the semi-opaque layer, for example made of chrome and/or titanium.
  • the zone of greatest attenuation may present a variable complex transmittance, in particular as a function of the polarization of the light radiation and/or the temperature of said zone, and/or modifiable by the user.
  • the zone of greatest attenuation may include a thermochromic material, the transmission of which may vary as a function of the temperature, and/or a polarizing material, the transmission of which may vary as a function of the polarization of the light radiation.
  • the thermochromic material can be chosen from thermochromic liquid crystals, thermochromic leuco-dyes, thermochromic oxides, optionally doped, and their mixtures, for example being chosen from the group formed by VO 2 , BiVO 4 , NbO 2 and their mixtures.
  • the zone of greatest attenuation and/or the zone of least attenuation may comprise at least one layer of a material capable of inducing a phase shift between the radiation incident on said zones respectively, and the radiation attenuated by said zones.
  • they include a layer comprising a polymer, a glass, or titanium dioxide. They may include a stack of layers made of at least two different materials, for example a stack of a layer of titanium dioxide, a layer of silicon dioxide and another layer of titanium dioxide, or a layer of titanium dioxide. metasurface.
  • the zone of greatest attenuation and/or the zone of least attenuation may comprise a layer of a birefringent material which induces a phase shift between the radiation incident on said zones respectively and the radiation attenuated by said zones, adjustable by rotation of the direction of polarization of the light source.
  • the zone of greatest attenuation and/or the zone of least attenuation may comprise a layer of a material having a non-zero thermo-optical coefficient, which induces a phase shift varying as a function of the temperature, in particular a liquid, for example glycerol , or a polymer, for example polydimethylsiloxane.
  • the device may include a thermal regulation module to modify the temperature of the zone of greatest attenuation and/or of the zone of least attenuation in order to modify the transmission of said zones and/or the phase shift induced by said zones.
  • the thermal regulation module may include an optical, electric or magnetic heating member, for example by the Joule effect.
  • the optical heating of said layer modifies the refractive index of the layer, which results in a variation in the optical phase shift induced by the zone of greater attenuation between the radiation incident on said zone and the radiation attenuated by said zone.
  • the heating can be induced electrically by a resistive wire, in particular an indium tin oxide (ITO) wire.
  • ITO indium tin oxide
  • the optical spatial filter may include a spatial light modulator, known by the abbreviation SLM (Space Light Modulator), or a phased optical network, in particular in order to modulate the complex transmittance.
  • the spatial light modulator may optionally be coupled to an opaque mask in order to attenuate some of the radiation diffracted and/scattered by the object.
  • the spatial filter may include several zones of greater attenuation of light radiation which are separated from each other.
  • the device may include several optical spatial filters.
  • the optical spatial filters can be arranged one after the other along the propagation path of the light radiation.
  • the optical spatial filters may be removable, the addition or removal of at least one of the optical spatial filters modifying the equivalent complex transmittance of all of said spatial filters.
  • the optical imaging system can combine an object plane with the image plane, the object being for example located outside the object plane but close to it.
  • the device makes it possible to digitally refocus an object located outside the object plane.
  • the optical system may include a lens.
  • the optical system preferably comprises one or even several additional lenses, in particular converging lenses, and/or one or even several mirrors.
  • the optical system is preferably stigmatic or substantially stigmatic.
  • the optical system is preferably aplanatic.
  • the object NAobject numerical aperture of the optical system is preferably between 0.12 and 1.7 to maximize the light radiation diffracted and/or scattered by the object which will be detected by the wavefront sensor.
  • Light source preferably comprises a light generator for generating the light radiation, for example chosen from a lamp, in particular a halogen lamp, and an intense laser, in particular a super-continuum laser.
  • the light radiation emitted by the light source has an angular spectrum which can be shaped by an additional optical system upstream of the object to be imaged in order to distribute the energy of the incident light radiation over the area of greatest attenuation.
  • the zone of greatest attenuation has the shape of a disk centered on the optical axis and the light source may include an additional optical system to generate Köhler illumination.
  • the additional optical system can be arranged between the light generator and the object, in the direction of propagation of the light radiation, in particular in order to collimate the light radiation incident on the object.
  • the light source can be configured to emit monochromatic or polychromatic radiation.
  • ⁇ nominal HW ⁇ correspond to the phase shift and the phase shift variation induced by the optical spatial filter for ⁇ ⁇ and on the spectral range ⁇ respectively.
  • the spectral extent of the light radiation is preferably fixed by the way of generating the phase shift induced by the optical spatial filter. For a phase shift induced by the optical spatial filter generated by refractive effect, 1 ⁇ ⁇ 50%.
  • the radiation can be visible, X-ray or infrared radiation.
  • the light radiation emitted by the light source can be polarized.
  • the light source may include a filter for selecting at least one wavelength of the light radiation emitted by the light generator and/or a filter for polarizing said light radiation.
  • the selection filter and/or the polarization filter can be arranged, along the path of the light radiation, between the light generator and the object to be imaged.
  • the device may include an additional digital camera, in particular for measuring the intensity of the light radiation in the Fourier plane of the optical imaging system.
  • the additional digital camera makes it possible in particular to image the Fourier plane in order to precisely position the optical spatial filter in this plane.
  • the device may include a microscope having an objective, the optical spatial filter being distant or not from the microscope.
  • the microscope may include the light source, in particular the microscope may itself emit Köhler illumination.
  • the microscope may include a sample holder.
  • the microscope may include other elements of the optical system, including one or more lenses and/or one or more mirrors.
  • the device may comprise one or more additional optical elements, for example chosen from a lens, in particular a converging lens, a reflecting mirror, a semi-reflecting mirror, a dichroic mirror, and wavelength filters.
  • a lens in particular a converging lens, a reflecting mirror, a semi-reflecting mirror, a dichroic mirror, and wavelength filters.
  • the invention also relates to a method of acquiring at least one digital image of a sample comprising an object by means of the device according to the invention, the method comprising: a) the emission with the light source of incident light radiation directed onto the object, b) detection by the wavefront sensor of the total light radiation having interacted with the object, transmitted by the imaging optical system and the optical spatial filter, and c) processing the signal detected in step b) to quantify a quantity chosen from the phase of the radiation and/or a variation of the phase of the radiation, and optionally to generate a digital image of said quantity.
  • the processing in step c) further comprises the quantification of the intensity of the light radiation and preferably the generation of a digital image of the intensity of the light radiation.
  • the processing in step c) is quantitative, ie it includes the correction of the signal detected in step b) by taking into account the effect of the phase shift and attenuation induced by the optical filter on the value of the quantity .
  • the sample may include one or even several objects whose size is less than the resolution of the optical imaging system.
  • the resolution of the imaging optical system is defined by R, where ⁇ is the wavelength of the radiation luminous and ⁇ ⁇ is the object numerical aperture of the imaging optical system.
  • the object can be transparent or semi-transparent to light radiation. Alternatively, the object may be opaque to said radiation.
  • the sample can be chosen from a biological material comprising a microorganism, a powder, a biological culture solution, a group of cells or micro-tissues, an inert material comprising a nanoparticle or a solution of mixture of particles.
  • the microorganism can be a bacteria, a vesicle or a virus.
  • the light radiation may have a wavelength spectrum as described above.
  • the invention finally relates to the use of the device for the study of one or more nanoparticles, or for the analysis of a chemical reaction or an electrochemical reaction, or of a photografting or photopolymerization reaction, or for the mapping of a temperature distribution or the specific detection of molecules via their absorption in a pump-probe regime.
  • Figure 1A represents, schematically and partially, an example of a device according to the invention
  • Figure 1B represents, schematically and partially, an example of a wavefront sensor
  • Figures 2A and 2B illustrate in a schematic manner schematically the spatial distributions of the incident and diffused fields in the Fourier plane, for the device according to the invention, respectively without and with the presence of the spatial filter
  • the figures 2C, 2D and 2E show the complex representations of the incident, diffused and total fields, in the case of Figure 2A for Figure 2C and in the case of Figure 2B for Figures 2D and 2E
  • - Figures 3A, 3B and 3C represent results of digital simulations of phase images
  • Figures 3D, 3E and 3F represent digital simulations of intensity images of a spherical object, respectively without filtering (3A and 3D), with filtering
  • FIG. 1A illustrates an example of a quantitative phase imaging device 1 according to the invention.
  • the device comprises a light source 2, a telecentric imaging optical system 3, an optical spatial filter 4 and a wavefront sensor 5.
  • Part of the optical system 3 is housed in a microscope 9.
  • This part of the optical system 3 comprises an objective 31, a mirror 32 and a tube lens 33.
  • the microscope 9 also includes a sample holder 10 arranged in the object focal plane A of the optical system 3.
  • the user of the device 1 places a sample 14 comprising the object on the sample holder 10.
  • the light source 2 comprises a light generator 21 and can include, between the light generator 21 and the object focal plane A, an optical system 22 making it possible to create illumination of the type Köhler at the level of the object focal plane A, and therefore at the level of sample 14 if necessary.
  • the incident radiation I, coming from the source 2 is thus collimated and at normal incidence in the object focal plane A, on the sample holder 10. A part D of this radiation is then scattered by the sample 14.
  • the image focal plane B of the objective 31, corresponding to the Fourier plane of the optical system is inaccessible because located inside the microscope 9.
  • the spatial filter 4 can be arranged in a plane conjugated C to the plane of Fourier B, transferred after the tube lens 33 by a converging lens 34 of the imaging optical system 3.
  • the conjugate plane C thus corresponds to the Fourier plane of the optical system 3.
  • the front sensor of wave 5 may include a digital camera 51 and a wavefront analysis mask 53, for example of the Shack-Hartman type, arranged upstream of the camera 51. Radiation R characterized by its front wave F arrives on the wavefront analysis mask 53 before being detected by the camera 51.
  • the wavefront analysis mask 53 can modify the path of the light radiation and the variation of The complex amplitude generated makes it possible to simultaneously measure the phase and intensity of the light radiation.
  • the wavefront sensor illustrated in Figure 1B measures the intensity and phase of the total light radiation that it receives.
  • the wavefront sensor 5 is preceded, in the example illustrated in Figure 1A, in the direction of propagation of the light radiation, by a converging lens 35 forming part of the optical imaging system 3 and making it possible to image the sample 14 on the digital camera 51.
  • the device 1 also includes an additional camera 15 for imaging the Fourier plane C using a pivoting or semi-transparent mirror 16 and an optical system 17 with two lenses.
  • the spatial filter 4 can thus be positioned precisely in the Fourier plane C, centered on the optical axis, for example using a translation stage, not shown.
  • the optical spatial filter 4 has a zone of greater attenuation 41 and a zone of lower attenuation 42.
  • the spatial filter comprises a support 43 having the shape of a transparent plate, for example made of glass, and square shape, covered with a metallic coating 44 having the shape of a disk of radius r fs placed in the center of the plate.
  • the zone of least attenuation 42 can be delimited by the portion of the support 43 not covered by the coating 44 and the zone of greatest attenuation is delimited by the superposition of the support 43 and the coating 44.
  • Figure 2A schematically illustrates the spatial distributions in the Fourier plane of the incident and scattered electromagnetic fields obtained by the device 1 according to the invention, without the presence of the spatial filter 4.
  • the incident electromagnetic field corresponding to the incident radiation I not impacted by the sample is denoted ⁇ ⁇ and the scattered electromagnetic field corresponding to the scattered radiation D is denoted ⁇ ⁇ .
  • ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ represent the spatial Fourier transforms of the scattered fields ⁇ ⁇ and ⁇ ⁇ respectively.
  • the incident radiation I being collimated at the level of the sample 14, it presents a point distribution at the center of the Fourier plane C, corresponding to the image of the pupil of the optical system 3.
  • the sample 14 is smaller than the or the wavelengths of the incident radiation, for example of dimension less than 100 nm, the radiation D is diffused in an almost isotropic manner. It thus presents a homogeneous distribution on the image of the pupil of the optical system 3 in the Fourier plane C.
  • the fields ⁇ ⁇ and ⁇ ⁇ can be observed in the Fourier plane C as illustrated schematically in Figure 2A, thanks to the additional camera 15 which images the Fourier plane C.
  • the field ⁇ ⁇ fills the Fourier plane C while the field ⁇ ⁇ is here concentrated at a point in the center of the Fourier plane C. More generally, the field ⁇ ⁇ is distributed according to the angular distribution of the light radiation I emitted by the light source 2.
  • of the scattered field is small compared to the module of the incident field
  • the phase shift ⁇ is low, notably less than 0.05 rad, so that we can use the Taylor expansion in ⁇ , hence the relation (4 ): ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ (1 ⁇ ⁇ ) (4)
  • the diffused field ⁇ ⁇ can be written, according to relation (5), as the incident field ⁇ ⁇ ⁇ attenuated by ⁇ , and out of phase by approximately ⁇ :
  • Figure 2C shows the complex representation of the incident ⁇ , scattered ⁇ and total ⁇ fields obtained with device 1 without spatial filter.
  • the radius ⁇ ⁇ of the zone of lower transmittance is preferably at least 5 times lower than the radius ⁇ ⁇ of the image of the pupil of the optical system 3 in the Fourier plane.
  • the amplitude t0 of the transmittance is chosen such that
  • the total transmitted field ⁇ ⁇ ⁇ carries a new phase shift ⁇ ⁇ > ⁇ with respect to the field ⁇ .
  • the phase shift ⁇ induced by the sample 14 can be quantified from the measurement of the intensity and phase of the field ⁇ ⁇ ⁇ .
  • relation (10) ⁇ ⁇ and ⁇ are the relative intensities respectively of the total fields ⁇ in the case of a device 1 without spatial filter 4 and after filtering ⁇ ⁇ ⁇ in the case of a device 1 with spatial filter 4.
  • the relationships ( 11) and (12) can be formulated: as well as relation (13) from relation (10):
  • the wavefront sensor 5 measures a relative intensity, that is to say the ratio between a reference image without sample and an image in the presence of the sample 14.
  • Relation (16) can then be formulated from relation (13):
  • the sample 14 studied is a polystyrene ball with an optical index equal to 1.62, immersed in water with an optical index equal to 1.33.
  • Sample 14 was illuminated by monochromatic light radiation of ORQJXHXU ⁇ G ⁇ RQGH ⁇ ⁇ QP ⁇ / ⁇ REMHFWLI ⁇ 31 used had a numerical aperture 1.4.
  • Spatial filtering was simulated on the field ⁇ ⁇ , spatial Fourier transform of the total field ⁇ ⁇ .
  • the simulated electromagnetic field included in a disk of radius ⁇ ⁇ , radius of the zone of greatest attenuation 41 of the spatial filter 4 was then multiplied by the complex transmittance ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ of the spatial filter 4 to simulate the interaction with said spatial filter 4.
  • the field ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ was thus simulated, according to the relation (17): with k the image vectors in the pupil, and ⁇ being the numerical aperture of the optical system 3 and ⁇ the wavelength of the light radiation.
  • Figure 3B the obtaining of an amplification of the measured phase ⁇ ⁇ , the value of which is up to more than ten times higher than the value of the phase shift ⁇ calculated in the absence of the spatial filter and represented on Figure 3A.
  • Figure 3E As for the intensity map in Figure 3E, it corresponds to a partially dark field image, where the light scattered by the object, in the center of the figure, is preponderant compared to the incident light.
  • Figure 4A represents the phase amplifications
  • the amplification of the phase is all the stronger as the transmission T is weak. This reflects that device 1 operates optimally when the ratio ⁇ ⁇ ⁇ is balanced.
  • FIG. 5 modifying the complex transmission of spatial filter 4 leads to relative errors less than 10 ⁇ for phase ( Figure 5A) and 10 ⁇ for intensity (Figure 5B).
  • Figure 6 illustrates the effect of the ratio ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ of the radius of the spatial filter 4 on the radius of the image of the pupil of the optical system 3 in the Fourier plane C, on the relative phase and intensity errors.
  • ⁇ ⁇ 10%
  • the errors in phase are less than 1% (figure 6A) and those in intensity less than 10 % (figure 6B).
  • this value of the ratio as a limit below which we consider reasonable the hypothesis according to which the presence of the spatial filter 4 does not modify the scattered field ⁇ ⁇ .
  • Example 1 The microscope 9 used was a commercial Olympus IX71 microscope, equipped with a microscope objective of x60 magnification and 0.9 numerical aperture (Olympus UPlanFLN). The illumination of sample 14 was ensured using the native Köhler illumination of the microscope 9 (halogen lamp), filtered in wavelength.
  • Wavefront sensor 5 was an ID4L analyzer (Quadrilateral Shift Interferometer) composed of an Andor Zyla 5.5 camera and a 2D diffraction grating with a periodicity of 10 ⁇ m, optimized for the wavelength 650 nm . This network was re-imaged on the camera via a x2 magnification telescope, composed of 2 achromatic lenses.
  • the phase shift ⁇ 0.5 ⁇ was measured by interferometry.
  • FIG 7A an image of the Fourier plane of the experimental device acquired by the additional camera 15.
  • the white disk corresponds to the radiation scattered D by a sample formed from a superposition of sheets of paper, over the entire image of the pupil of the optical system 3 in the Fourier plane C, and the black disk in the middle corresponds to the spatial filter 4.
  • the comparison of Figures 7B and 7C highlights the effect of the spatial filter 4 on the intensity of the incident radiation I .
  • the results obtained in the case without spatial filter 4 and with spatial filter 4, as well as with the quantitative reconstruction, using equation 16 from the filtered images, are presented in Figure 8.
  • Figure 8A shows the results obtained without spatial filter 4
  • Figure 8B shows the results obtained with spatial filter 4
  • Figure 8 C shows the results obtained with spatial filter 4 and following quantitative processing from the measurements.
  • the angular spectrum of the incident light radiation I is a disk centered in the Fourier plane C, as can be observed in Figure 10A, the white zone corresponding to the incident light radiation I.
  • the zone of greatest attenuation 41 is a disk at the center of the optical spatial filter 4, as shown in Figure 10D, the gray zone corresponding to the zone of greatest attenuation 41.
  • the angular spectrum of the incident light radiation I is represented in the plane of Fourier C by several spaced disks, as observable in Figure 10B, the white zones corresponding to the incident light radiation I.
  • the zone of greatest attenuation 41 is composed of several disks distributed over the optical spatial filter 4 in the same way as the radiation incident light I in the Fourier plane C, as shown in Figure 10E, the gray zones corresponding to the zone of greatest attenuation 41.
  • the angular spectrum of the incident light radiation I is a ring in the plane of Fourier C, as can be observed in Figure 10A, the white zone corresponding to the incident light radiation I.
  • the zone of greatest attenuation 41 is a corresponding ring on the optical spatial filter 4, as shown in Figure 10D, the gray zone corresponding to the zone of greatest attenuation 41.
  • Example 2 The same sample 14 and the same device as for example 1 have been used, with the exception of the optical spatial filter 4.
  • Chamber 48 made it possible, thanks to a focused laser heating system 47, to vary the phase shift induced by the optical spatial filter 4 on the incident field Ei.
  • the total phase shift ⁇ total induced by the optical spatial filter 4 on the incident field E i was then the sum of a variable component ⁇ variable and a fixed component ⁇ fixed , as can be observed in Figure 11B, where ⁇ ⁇ , ⁇ ⁇ and ⁇ ⁇ ⁇ are respectively the complex representations of the incident after filtering, diffuse after filtering and total after filtering fields.
  • the variable phase shift made it possible to optimize the values of the phase shift ⁇ ⁇ and the intensity

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Abstract

Dispositif d'imagerie de phase quantitative (1) comportant : - un système optique imageur (3) pour imager un objet (14) dans un plan image, - une source lumineuse (2) pour émettre un rayonnement lumineux (I) sur le plan de Fourier (C) du système optique imageur, - un filtre spatial optique (4) dans le plan de Fourier comportant une zone de moindre atténuation (41) et une zone de plus grande atténuation (42), - un capteur de front d'onde (5) pour mesurer dans le plan image, l'intensité et la phase du rayonnement lumineux qui a traversé le système optique imageur et le filtre spatial optique, et dont au moins une partie a interagi avec l'objet, pour quantifier la phase induite par l'objet, la source lumineuse, le système optique imageur et le filtre spatial optique étant tels qu'en l'absence de l'objet, le rayonnement lumineux (I) soit focalisé sur la zone de plus grande atténuation.

Description

DISPOSITIF D’AMPLIFICATION D’UN SIGNAL EN IMAGERIE DE PHASE QUANTITATIVE AUTOREFERENCEE Domaine Technique La présente invention concerne un dispositif d’imagerie de phase quantitative, en particulier pour la caractérisation de nano-objets. Technique antérieure Lorsqu’un objet transparent ou semi-transparent est observé en microscopie classique en transmission, c’est-à-dire en champ clair, le contraste observé sur l’image est généralement faible. Cela complexifie l’étude de l’objet, en particulier lorsque la taille de l’objet est inférieure au micromètre. La microscopie à contraste de phase développée par Frederik Zernike est une méthode d’imagerie consistant à exploiter les changements de phase d’une onde lumineuse traversant un objet à imager. Un inconvénient du microscope à contraste de phase est le halo qu’il introduit sur l’image autour des objets observés. La microscopie à contraste de phase repose sur une mesure de l’intensité de l’onde lumineuse, et sur l’hypothèse qu’une partie de l’information de phase se transmet dans l’intensité par phénomène d’interférences. Ainsi, elle présente l’inconvénient majeur de ne pas quantifier la phase de l’onde, et ne permet pas d’isoler la contribution d’intensité de la contribution de phase. Or comme cela est décrit ci- après, la mesure précise de la phase est particulièrement importante dans de nombreuses applications, notamment pour l’étude de micro-organismes ou la caractérisation de nanoparticules. La microscopie de phase quantitative est une autre méthode d’imagerie basée sur l’analyse du front d’onde de la lumière qui illumine et interagit avec l’objet à imager. Elle mesure la phase optique, ou une grandeur proportionnelle de cette onde. Dans la plupart des cas, elle mesure simultanément l’intensité lumineuse. Elle met en œuvre une mesure, par une caméra numérique adjointe d’éléments optiques diffractifs, réfractifs ou réfléchissants, d’un champ total résultant de la somme d’un champ incident et d’un champ diffusé par l’objet, par exemple semi-transparent, non absorbant et faiblement diffusant. La microscopie de phase quantitative génère des contrastes supérieurs à ceux obtenus en microscopie classique pour des objets transparents ou semi-transparents, et permet ainsi d’étudier en détail des objets de plus petite taille qu’en microscopie classique. La mesure quantitative de la phase permet notamment d’accéder à la mesure de densité ou de masse d’un objet observé. Parmi les techniques de microscopie de phase quantitative, on distingue : - les techniques dites à « bras de référence », basées sur la mesure des interférences entre une onde de référence et une onde ayant interagi avec l’objet à imager, comme l’holographie, et - les techniques autoréférencées reposant sur une mesure de gradient de phase. En particulier, les techniques autoréférencées peuvent être mise en œuvre à l’aide d’un analyseur de front d’onde imageant l’objet. En particulier, l’analyseur de front d’onde peut être basé sur l’utilisation d’un masque optique, par exemple une matrice de trous de type Hartmann, une matrice de microlentilles de type Shack-Hartmann, un réseau, un masque de Hartmann modifié, un diffuseur, ou une méta-surface, en amont d’une caméra. Contrairement aux techniques à bras de référence, qui nécessitent des montages optiques complexes et sensibles aux vibrations, les techniques d’imagerie de phase quantitative autoréférencées sont simples à mettre en œuvre et permettent d’obtenir une bonne sensibilité de phase. La microscopie de phase quantitative a de nombreuses applications, notamment en biologie pour imager des composants subcellulaires faiblement diffusants tout en obtenant des valeurs biophysiques caractéristiques. Mais l’observation à l’échelle moléculaire est complexe, voire impossible, du fait de la faible interaction lumière-matière des nano-objets semi-transparents. La microscopie de phase quantitative permet aussi de détecter et caractériser des nanoparticules ou de suivre des réactions chimiques. La limite de détection des objets ou des flux de matière dépend directement de la sensibilité de phase de la méthode employée. La microscopie de phase quantitative permet également de cartographier des variations de l’indice de réfraction résultant d’une perturbation thermique. Elle permet ainsi de cartographier une distribution de température avec une précision spatiale micrométrique. Augmenter la sensibilité de phase permettrait alors d’augmenter la sensibilité en température. Cela permettrait également de cartographier avec une plus grande sensibilité des modifications de l’indice de réfraction résultant d’une perturbation électrique, acoustique ou magnétique. En métrologie optique, en particulier pour du contrôle qualité en lithographie ou en nano-impression, la microscopie de phase quantitative permet de mesurer le profil d’une surface, les variations d’épaisseur induisant une variation locale du déphasage mesuré. Une bonne sensibilité de phase est cruciale pour quantifier des variations sub-nanométriques d’épaisseur. Cependant, un défaut commun aux techniques connues de microscopie de phase quantitative, est le fait que l’amplitude du champ diffusé par le ou les objets à imager est très faible par rapport à l’amplitude du champ incident. Il en résulte alors un faible signal de phase, qui rend difficile la caractérisation de nano-objets, encore plus quand ces derniers sont en mouvement. Des modifications des techniques à bras de référence ont été proposées pour tenter de surmonter cet inconvénient, mais elles restent complexes à implémenter et sont caractérisées par une sensibilité limitée par les vibrations du bras de référence du montage optique. Il existe donc un besoin pour améliorer la détectabilité des techniques d’imagerie de phase quantitative autoréférencées, c’est-à-dire de disposer d’une technique d’imagerie de phase quantitative autoréférencée apte à détecter au moins un objet, notamment semi- transparent et/ou d’une taille inférieure à 100 nanomètres, notamment un tel objet en mouvement, avec un contraste élevé. Résumé de l’invention L’invention propose un dispositif d’imagerie de phase quantitative comportant : - un système optique imageur pour imager un objet dans un plan image, - une source lumineuse pour émettre un rayonnement lumineux sur au moins une partie du plan de Fourier du système optique imageur, - un filtre spatial optique s’étendant dans le plan de Fourier du système optique imageur et comportant une zone de moindre atténuation du rayonnement lumineux et une zone de plus grande atténuation du rayonnement lumineux, - un capteur de front d’onde pour mesurer, dans le plan image, l’intensité et la phase du champ électromagnétique associé au rayonnement lumineux émis par la source lumineuse et qui a traversé le système optique imageur et le filtre spatial optique, et dont au moins une partie a interagi avec l’objet, afin de quantifier la phase induite par l’objet, la source lumineuse, le système optique imageur et le filtre spatial optique étant agencés pour qu’en l’absence de l’objet à imager, le rayonnement lumineux soit focalisé sur la zone de plus grande atténuation. Le « plan de Fourier » du système optique imageur est le plan dans lequel la figure de diffraction de Fraunhofer, c’est-à-dire la transformée de Fourier de l’objet étudié, peut être observée. Ainsi, l’utilisateur du dispositif peut visualiser, dans le plan de Fourier, les fréquences spatiales de l’objet étudié. Dans une variante, le système optique imageur est télécentrique, c’est-à-dire que sa pupille d’entrée ou sa pupille de sortie est à l’infini, et le plan de Fourier est confondu avec un plan pupillaire du système optique imageur. Un « plan pupillaire » du système optique imageur est un plan dans lequel on observe la pupille du système optique, ou une image d’elle par une partie du système optique. En présence d’un objet à imager par le système optique imageur, le rayonnement lumineux incident issu de la source lumineuse et non diffracté et/ou non diffusé par l’objet est focalisé sur la zone de plus grande atténuation du filtre spatial, alors que le rayonnement lumineux diffracté et/ou diffusé par l’objet est localisé au moins en partie sur la zone de moindre atténuation. Ainsi, le filtre spatial optique atténue spécifiquement l’intensité du rayonnement lumineux incident non diffracté et/ou diffusé par l’objet, tout en conservant quasi-inchangée l’intensité du rayonnement diffracté et/ou diffusé par l’objet hors de la zone de plus grande atténuation. L’invention permet d’atténuer la contribution du champ électromagnétique incident associé au rayonnement lumineux incident émis par la source lumineuse et non diffracté et/ou diffusé par l’objet au champ électromagnétique détecté par le capteur de front d’onde, ce qui amplifie le signal de phase. A partir de la mesure de la phase et de l’intensité, et en tenant compte de la transmittance complexe des zones de plus grande et de moindre atténuation, un modèle analytique ou un traitement numérique permet de déterminer la valeur quantifiée de la phase qui serait mesurée en l’absence du filtre spatial optique, avec un rapport signal sur bruit augmenté. Il est ainsi possible de calculer des grandeurs quantitatives pertinentes, telles que la masse sèche de l’objet, la valeur d’indice de l’objet, ou l’épaisseur de l’objet, à partir de cette valeur quantifiée de la phase. Les zones de plus grande et de moindre atténuation affectent, de préférence, la phase de l’onde de manière différente. La « zone de plus grande atténuation » induit une atténuation à la ou les longueurs d’onde qui composent le rayonnement lumineux émis par la source lumineuse, plus faible en norme que la « zone de moindre atténuation ». Capteur de front d’onde Le capteur de front d’onde mesure au moins une variation, notamment un gradient, de la phase du rayonnement lumineux ayant traversé l’objet, le système optique imageur et le filtre spatial optique, ou une grandeur caractéristique de ladite phase telle que la différence de chemin optique parcourue par deux rayons lumineux. La phase induite par l’objet peut être déterminée à partir de la grandeur caractéristique, par intégration du gradient mesuré. Le capteur de front d’onde mesure en outre l’intensité dudit rayonnement. Le capteur de front d’onde comporte de préférence un détecteur du rayonnement lumineux, par exemple une caméra, et en particulier comporter un capteur bidimensionnel permettant d’échantillonner l’intensité. Optionnellement, le capteur de front d'onde comporte un masque d’analyse de front d’onde disposé devant le détecteur le long du trajet optique du rayonnement lumineux, afin de déterminer la distribution spatiale du gradient de la phase du rayonnement lumineux ou d’un signal proportionnel à ladite phase. La masque d’analyse de front d’onde peut notamment mesurer simultanément la phase et l’intensité du rayonnement lumineux détecté. Le masque d’analyse de front d’onde comporte de préférence un élément optique diffractif, périodique ou apériodique, et/ou un élément optique réfractif. Le masque d’analyse de front d’onde peut être placé proche du détecteur ou proche d’un plan conjugué au plan dans lequel s’étend le détecteur. Le masque d’analyse de front d’onde peut être choisi notamment parmi un masque comportant un réseau de microlentilles, par exemple un masque de Shack-Hartmann, un masque de Hartmann modifié, par exemple tel que décrit par P. Bon et al. Dans « Quadriwave lateral shearing interferometry for quantitative phase microscopy of living cells », Opt. Express, 17, 13080-13094 (2009), et un diffuseur mince, par exemple tel que décrit par P. Berto, H. Rigneault and M. Guillon dans « Wavefront sensing with a thin diffuser », Opt. Lett. 42, 5117-5120 (2017). Le détecteur du rayonnement lumineux comporte de préférence une caméra numérique pour acquérir le rayonnement lumineux qui, de préférence, a interagi avec le masque d’analyse de front d’onde. La caméra numérique peut comporter un capteur lumineux, par exemple CMOS ou CCD, pour acquérir le rayonnement lumineux et qui mesure l’intensité dudit rayonnement lumineux. Filtre spatial optique La zone de plus grande atténuation et, optionnellement, la zone de moindre atténuation, sont adaptées à atténuer l’intensité du rayonnement lumineux. De préférence, la zone de moindre atténuation n’atténue pas l’intensité du rayonnement lumineux, afin de conserver une intensité lumineuse maximale pour la mesure. La zone de plus grande atténuation induit une atténuation de l’intensité du rayonnement lumineux plus grande que la zone de moindre atténuation. La zone de plus grande atténuation et/ou la zone de moindre atténuation peuvent induire un déphasage entre le rayonnement lumineux qui est incident sur lesdites zones respectivement et le rayonnement lumineux atténué par lesdites zones de manière à amplifier le rapport signal sur bruit des signaux de phase et d’intensité mesurés Selon une variante, le filtre spatial optique est adapté à réfléchir le rayonnement lumineux, la zone de plus grande atténuation étant semi-réfléchissante. La zone de moindre atténuation peut être semi-réfléchissante ou, de préférence, réfléchissante. Les zones de moindre atténuation et de plus grande atténuation peuvent présenter des épaisseurs différentes, afin d’induire des déphasages différents aux rayonnements lumineux qu’elles atténuent. Selon une autre variante, le filtre spatial est adapté à transmettre le rayonnement lumineux, la zone de plus grande atténuation étant semi-transparente. La zone de moindre atténuation peut être semi-transparente ou, de préférence, transparente. Plus l’atténuation de l’intensité est élevée, plus la transmission est faible. La zone de plus grande atténuation peut présenter une transmittance complexe t définie par la relation t=t0*e-Lȕ avec 0 < t0 ^^^^7, l’amplitude t0 étant mesurée sur au moins une partie du spectre de longueur(s) d’onde(s) du rayonnement lumineux émis par la source lumineuse, et optionnellement le déphasage ȕ^est tel que -1 rad [S] ^^ȕ^^^1 rad [S], notamment afin d’amplifier le signal sur la phase en valeur absolue. L’amplitude t0 de la transmittance complexe peut être mesurée en focalisant un faisceau lumineux sur la zone de plus grande atténuation et en mesurant l’atténuation de l’intensité du faisceau lumineux ce qui donne accès à la transmission T= t0². Le GpSKDVDJH^ȕ peut être mesuré par interférométrie. 'H^ SUpIpUHQFH^^ 7^ ^^ ^^15, par exemple T = 0,1. Le GpSKDVDJH^ȕ^SHXW^rWUH^pJDO^j^^^ Le filtre spatial optique peut comporter un support transparent et un revêtement semi-opaque recouvrant partiellement le support, la zone de plus grande atténuation étant définie par la superposition du support et du revêtement semi-opaque. Le support transparent peut être en verre. Le revêtement semi-opaque peut avoir la forme d’au moins un disque de rayon rfs, de préférence inférieur à 0,1*rp, rp étant le rayon maximal du disque à l’intérieur duquel se répartissent les fréquences spatiales collectées dans le plan de Fourier. Par exemple, rfs ^^ 100 µm. Selon la variante où le système optique imageur est télécentrique, le plan de Fourier est confondu avec un plan pupillaire. rp représente alors le rayon de l’image de la pupille d’ouverture du système optique imageur dans le plan de Fourier. En variante, le revêtement semi-opaque a la forme d’un anneau. Il peut présenter toute forme correspondant au spectre angulaire de l’illumination. Le revêtement semi-opaque peut être centré sur l’axe optique du filtre spatial optique. Le revêtement semi-opaque peut présenter une épaisseur inférieure à 100 nm. Le revêtement semi-opaque peut comporter une couche semi opaque en un métal choisi parmi l’or, l’argent, l’aluminium, le chrome, le titane, et leurs alliages, par exemple en or. Le revêtement semi-opaque peut comporter une couche d’accroche prise en sandwich entre et au contact du support et de la couche semi-opaque, par exemple faite de chrome et/ou de titane. La zone de plus grande atténuation peut présenter une transmittance complexe variable, notamment en fonction de la polarisation du rayonnement lumineux et/ou de la température de ladite zone, et/ou modifiable par l’utilisateur. La zone de plus grande atténuation peut comporter un matériau thermochrome, dont la transmission peut varier en fonction de la température, et/ou polarisant, dont la transmission peut varier en fonction de la polarisation du rayonnement lumineux. Le matériau thermochrome peut être choisi parmi les cristaux liquides thermochromes, les leuco-colorants thermochromes, les oxydes thermochromes, optionnellement dopés, et leurs mélanges, par exemple étant choisi dans le groupe formé par VO2, BiVO4, NbO2 et leurs mélanges. La zone de plus grande atténuation et/ou la zone de moindre atténuation peuvent comporter au moins une couche en un matériau apte à induire un déphasage entre le rayonnement incident sur lesdites zones respectivement, et le rayonnement atténué par lesdites zones. Par exemple, elles comportent une couche comportant un polymère, un verre, ou du dioxyde de titane. Elles peuvent comporter un empilement de couches faites d’au moins deux matériaux différentes, par exemple un empilement d’une couche de dioxyde de titane, d’une couche de dioxyde de silicium et d’une autre couche de dioxyde de titane, ou une métasurface. La zone de plus grande atténuation et/ou la zone de moindre atténuation peuvent comporter une couche d’un matériau biréfringent qui induit un déphasage entre le rayonnement incident sur lesdites zones respectivement et le rayonnement atténué par lesdites zones, modulable par rotation de la direction de polarisation de la source lumineuse. La zone de plus grande atténuation et/ou la zone de moindre atténuation peuvent comporter une couche d’un matériau présentant un coefficient thermo-optique non nul, qui induit un déphasage variant en fonction de la température, notamment un liquide, par exemple du glycerol, ou un polymère, par exemple du polydiméthylsiloxane. Le dispositif peut comporter un module de régulation thermique pour modifier la température de la zone de plus grande atténuation et/ou de la zone de moindre atténuation afin de modifier la transmission desdites zones et/ou le déphasage induit par lesdites zones. Le module de régulation thermique peut comporter un organe de chauffage optique, électrique ou magnétique, par exemple par effet Joule. Par exemple, dans une variante où la zone de moindre transmittance comporte une couche en or, le chauffage optique de ladite couche modifie l’indice de réfraction de la couche, ce qui résulte en une variation du déphasage optique induit par la zone de plus grande atténuation entre le rayonnement incident sur ladite zone et le rayonnement atténué par ladite zone. En variante, le chauffage peut être induit électriquement par un fil résistif, en particulier un fil en oxyde d’indium- étain (ITO). L’utilisation d'un module de régulation thermique permet notamment de faire varier le déphasage induit par le filtre spatial optique en temps réel, de manière à optimiser le rapport signal sur bruit à la fois sur le signal d’intensité et sur le signal de phase. Le filtre spatial optique peut comporter un modulateur spatial de lumière, connu sous l’abréviation SLM (Space Light Modulator), ou un réseau optique à commande de phase, notamment afin de moduler la transmittance complexe Le modulateur spatial de lumière peut être éventuellement couplé à un masque opaque afin d’atténuer une partir du rayonnement diffracté et/ diffusé par l’objet. Le filtre spatial peut comporter plusieurs zones de plus grande atténuation du rayonnement lumineux qui sont séparées les unes des autres. Le dispositif peut comporter plusieurs filtres spatiaux optiques. Les filtres spatiaux optiques peuvent être disposés les uns à la suite des autres le long du trajet de propagation du rayonnement lumineux. Les filtres spatiaux optiques peuvent être amovibles, l’ajout ou le retrait d’au moins un des filtres spatiaux optiques modifiant la transmittance complexe équivalente de l’ensemble desdits filtres spatiaux. Système optique imageur Le système optique imageur peut conjuguer un plan objet avec le plan image, l’objet étant par exemple situé hors du plan objet mais proche de celui-ci. Le dispositif permet de refocaliser numériquement un objet situé hors du plan objet. Le système optique peut comporter un objectif. En variante, le système optique comporte de préférence une, voire plusieurs lentilles supplémentaires, notamment convergente, et/ou un, voire plusieurs miroirs. Le système optique est de préférence stigmatique ou sensiblement stigmatique. Le système optique est de préférence aplanétique. L’ouverture numérique objet NAobjet du système optique est comprise de préférence entre 0,12 et 1,7 pour maximiser le rayonnement lumineux diffracté et/ou diffusé par l’objet qui sera détecté par le capteur de front d’onde. Le grandissement du système optique imageur, qui est lié à l’ouverture numérique image par la relation NAimage = NAobjet / grandissement, est de préférence choisi pour échantillonner en phase la réponse percussionnelle image (PSFimage) du système optique imageur en répondant au critère de Nyquist (>2 points de mesures / PSFimage). Source lumineuse La source lumineuse comporte de préférence un générateur de lumière pour générer le rayonnement lumineux, par exemple choisi parmi une lampe, notamment à halogène, et un laser intense, notamment un laser super-continuum. Le rayonnement lumineux émis par la source lumineuse présente un spectre angulaire qui peut être mis en forme par un système optique supplémentaire en amont de l’objet à imager afin de répartir l’énergie du rayonnement lumineux incident sur la zone de plus grande atténuation. Dans un exemple de réalisation, la zone de plus grande atténuation a une forme d’un disque centré sur l’axe optique et la source lumineuse peut comporter un système optique supplémentaire pour générer une illumination de Köhler. Le système optique supplémentaire peut être disposé entre le générateur de lumière et l’objet, dans le sens de propagation du rayonnement lumineux, notamment afin de collimater le rayonnement lumineux incident sur l’objet. La source lumineuse peut être configurée pour émettre un rayonnement monochromatique ou polychromatique. Lorsque le déphasage induit par le filtre spatial optique entre le rayonnement qui lui est incident et le rayonnement filtré est non-nul, le rayonnement lumineux de longueur d’onde nominale ^^^^^^^^^ présente une étendue spectrale ο^ satisfaisant de préférence la condition ǻȕ^ȕnominale < 50 %. ȕnominale HW^ǻȕ correspondent au déphasage et la variation de déphasage induits par le filtre spatial optique pour ^^^^^^^^^ et sur l’étendue spectrale ǻȕ respectivement. L’étendue spectrale du rayonnement lumineux est de préférence fixée par la manière de générer le déphasage induit par le filtre spatial optique. Pour un déphasage induit par le filtre spatial optique généré par effet réfractif,
Figure imgf000012_0001
1^ < 50%. Le rayonnement peut être un rayonnement visible, X ou infrarouge. Le rayonnement lumineux émis par la source lumineuse peut être polarisé. La source lumineuse peut comporter un filtre de sélection d’au moins une longueur d’onde du rayonnement lumineux émis par le générateur de lumière et/ou un filtre de polarisation dudit rayonnement lumineux. Le filtre de sélection et/ou le filtre de polarisation peuvent être disposés, le long du trajet du rayonnement lumineux, entre le générateur de lumière et l’objet à imager. Autres organes du dispositif Le dispositif peut comporter une caméra numérique supplémentaire, notamment pour mesurer l’intensité du rayonnement lumineux dans le plan de Fourier du système optique imageur. La caméra numérique supplémentaire permet notamment d’imager le plan de Fourier afin de positionner précisément le filtre spatial optique dans ce plan. Le dispositif peut comporter un microscope disposant d’un objectif, le filtre spatial optique étant distant ou non du microscope. Le microscope peut comporter la source lumineuse, en particulier le microscope peut émettre lui-même une illumination de Köhler. Le microscope peut comporter un porte -échantillon. Le microscope peut comporter d’autres éléments du système optique, notamment un ou plusieurs lentilles et/ou un ou plusieurs miroirs. Le dispositif peut comporter un ou plusieurs éléments optiques supplémentaires, par exemple choisi parmi une lentille, notamment convergente, un miroir réfléchissant, un miroir semi-réfléchissant, un miroir dichroïque, et des filtres en longueur d’onde. Procédé Par ailleurs, l’invention a encore pour objet un procédé d’acquisition d’au moins une image numérique d’un échantillon comportant un objet au moyen du dispositif selon l’invention, le procédé comportant : a) l’émission avec la source lumineuse d’un rayonnement lumineux incident dirigé sur l’objet, b) la détection par le capteur de front d’onde du rayonnement lumineux total ayant interagi avec l’objet, transmis par le système optique imageur et le filtre spatial optique, et c) le traitement du signal détecté à l’étape b) pour quantifier une grandeur choisie parmi la phase du rayonnement et/ou une variation de la phase du rayonnement, et optionnellement pour générer une image numérique de ladite grandeur. De préférence, le traitement à l’étape c) comporte en outre la quantification de l’intensité du rayonnement lumineux et de préférence la génération d’une image numérique de l’intensité du rayonnement lumineux. Le traitement à l’étape c) est quantitatif, i.e. il comporte la correction du signal détecté à l’étape b) en prenant en compte l’effet du déphasage et de l’atténuation induits par le filtre optique sur la valeur de la grandeur. L’échantillon peut comporter un, voire plusieurs objets dont la taille est inférieure à la résolution du système optique imageur. La résolution du système optique imageur est définie par R , où ^ est la longueur d’onde du rayonnement
Figure imgf000014_0001
lumineux et ^^^^^^௧ est l’ouverture numérique objet du système optique imageur. L’objet peut être transparent ou semi-transparent au rayonnement lumineux. En variante, l’objet peut être opaque audit rayonnement. L’échantillon peut être choisi parmi une matière biologique comportant un micro-organisme, une poudre, une solution de culture biologique, un groupe de cellules ou micro-tissus, une matière inerte comportant une nanoparticule ou une solution de mélange de particules. Le micro-organisme peut être une bactérie, une vésicule ou un virus. Le rayonnement lumineux peut présenter un spectre de longueur d’onde tel que décrit ci-dessus. L’invention concerne enfin l’utilisation du dispositif pour l’étude d’une ou plusieurs nanoparticules, ou pour l’analyse d’une réaction chimique ou d’une réaction électrochimique, ou d’une réaction de photogreffage ou de photopolymérisation, ou pour la cartographie d’une distribution de températures ou la détection spécifique de molécules via leur absorption dans un régime pompe sonde. Brève description des dessins L’invention pourra être mieux comprise à la lecture de la description détaillée qui va suivre, d’exemples de mise en œuvre non limitatifs de celle-ci, et à l’examen du dessin annexé, sur lequel : - la figure 1A représente, de manière schématique et partielle, un exemple de dispositif selon l’invention, - la figure 1B représente, de manière schématique et partielle, un exemple de capteur de front d’onde, - les figures 2A et 2B illustrent de manière schématique les distributions spatiales des champs incidents et diffusé dans le plan de Fourier, pour le dispositif selon l’invention, respectivement sans et avec la présence du filtre spatial, et les figures 2C, 2D et 2E montrent les représentations complexes des champs incident, diffusé et total, dans le cas de la figure 2A pour la figure 2C et dans le cas de la figure 2B pour les figures 2D et 2E, - les figures 3A, 3B et 3C représentent des résultats de simulations numériques des images de phase et les figures 3D, 3E et 3F des simulations numériques des images d’intensité, d’un objet sphérique, respectivement sans filtrage (3A et 3D), avec filtrage (3B et 3E), et avec filtrage et traitement quantitatif (3C et 3F), - les figures 4A et 4B représentent respectivement des cartes des valeurs de gain en phase et en contraste d’intensité simulées en fonction du coefficient de transmission et du déphasage du filtre spatial, - les figures 5A et 5B représentent des cartes des erreurs relatives en phase et en intensité simulées en fonction du coefficient de transmission et du déphasage du filtre spatial, - les figures 6A et 6B représentent les erreurs relatives en phase et en intensité simulées en fonction du ratio entre le rayon du filtre spatial et le rayon de la pupille de sortie du système optique, - la figure 7A est une image expérimentale du plan de Fourier, les figures 7B et 7C sont chacune l’image et le profil du rayonnement incident dans le plan de Fourier, respectivement avec et sans filtre, - les figures 8A, 8B et 8C sont chacune des images d’intensité et de phase ainsi que des profils d’intensité et de phase selon les segments représentés sur les images d’intensité et de phase, - les figures 9A et 9B montrent des agrandissements des images de phase des figures 8A et 8C, - les figures 10A, 10B et 10C montrent trois spectres angulaires différents du rayonnement lumineux dans le plan de Fourier et les figures 10D, 10E et 10F montrent les filtrent spatiaux optiques correspondants, - la figure 11A représente de manière schématique et partielle une variante de réalisation du filtre spatial optique et la figure 11B montre les représentations complexes des champs incident, diffusé et total après filtrage par le filtre spatial optique de la figure 11A, - les figures 12A et 12B sont des images expérimentales d’intensité et de phase respectivement, d’un même objet en l’absence du filtre spatial optique de la figure 11A (groupe 1 de gauche) et en présence du filtre spatial optique de la figure 11A (groupe 2 de droite) pour différentes valeurs de déphasage variable appliqué, et - les figures 13A et 13B représentent l’évolution du contraste d’intensité et du gain de phase respectivement, correspondants aux figures 12A et 12B. Description détaillée On a illustré à la figure 1A un exemple de dispositif d’imagerie de phase quantitative 1 selon l’invention. Le dispositif comporte une source lumineuse 2, un système optique imageur 3 télécentrique, un filtre spatial optique 4 et un capteur de front d’onde 5. Une partie du système optique 3 est logée dans un microscope 9. Cette partie du système optique 3 comporte un objectif 31, un miroir 32 et une lentille de tube 33. Le microscope 9 comporte également un porte-échantillon 10 disposé dans le plan focal objet A du système optique 3. Pour imager un objet, l’utilisateur du dispositif 1 place un échantillon 14 comportant l’objet sur le porte-échantillon 10. La source lumineuse 2 comporte un générateur de lumière 21 et peut comporter, entre le générateur de lumière 21 et le plan focal objet A, un système optique 22 permettant de créer une illumination de type Köhler au niveau du plan focal objet A, et donc au niveau de l’échantillon 14 le cas échéant. Le rayonnement incident I, issu de la source 2, est ainsi collimaté et en incidence normale dans le plan focal objet A, sur le porte-échantillon 10. Une partie D de ce rayonnement est alors diffusée par l’échantillon 14. Dans l’exemple illustré, le plan focal image B de l'objectif 31, correspondant au plan de Fourier du système optique, est inaccessible car situé à l'intérieur du microscope 9. Avantageusement le filtre spatial 4 peut être disposé dans un plan conjugué C au plan de Fourier B, reporté après la lentille de tube 33 par une lentille convergente 34 du système optique imageur 3. Le plan conjugué C correspond ainsi au plan de Fourrier du système optique 3. Comme illustré sur la figure 1B, le capteur de front d’onde 5 peut comporter une caméra numérique 51 et un masque d’analyse de front d’onde 53, par exemple de type Shack- Hartman, disposé en amont de la caméra 51. Un rayonnement R caractérisé par son front d’onde F arrive sur le masque d’analyse de front d’onde 53 avant d’être détecté par la caméra 51. Le masque d’analyse de front d’onde 53 peut modifier le trajet du rayonnement lumineux et la variation d’amplitude complexe engendrée permet de mesurer simultanément la phase et l’intensité du rayonnement lumineux. Ainsi, le capteur de front d’onde illustré sur la figure 1B mesure l’intensité et la phase du rayonnement lumineux total qu’il reçoit. Le capteur de front d’onde 5 est précédé, dans l’exemple illustré sur la figure 1A, dans le sens de propagation du rayonnement lumineux, d’une lentille convergente 35 faisant partie du système optique imageur 3 et permettant d’imager l’échantillon 14 sur la caméra numérique 51. Le dispositif 1 comporte également une caméra supplémentaire 15 pour imager le plan de Fourier C grâce à un miroir pivotant ou semi-transparent 16 et un système optique 17 à deux lentilles. Le filtre spatial 4 peut ainsi être positionné précisément dans le plan de Fourier C, centré sur l’axe optique, par exemple à l’aide d’une platine de translation, non représentée. Le filtre spatial optique 4 présente une zone de plus grande atténuation 41 et une zone de moindre atténuation 42. Dans l’exemple illustré, le filtre spatial comporte un support 43 présentant la forme d’une plaque transparente, par exemple en verre, et de forme carrée, recouverte d’un revêtement 44 métallique ayant la forme d’un disque de rayon rfs disposé au centre de la plaque. La zone de moindre atténuation 42 peut être délimitée par la portion du support 43 non recouverte par le revêtement 44 et la zone de plus grande atténuation est délimitée par la superposition du support 43 et du revêtement 44. La figure 2A illustre schématiquement les distributions spatiales dans le plan de Fourier des champs électromagnétiques incident et diffusé obtenus par le dispositif 1 selon l’invention, sans la présence du filtre spatial 4. Lorsqu’un échantillon 14 est disposé dans le plan focal objet A sur le porte-échantillon 10 du dispositif sans filtre spatial 4, le champ électromagnétique incident correspondant au rayonnement incident I non impacté par l’échantillon est noté ^^ et le champ électromagnétique diffusé correspondant au rayonnement diffusé D est noté ^ௗ. ^^ ௗ ^^ ^^ ^ représentent respectivement les transformées de Fourier spatiale des champs diffusés ^ௗ et ^^. Dans le cas où l’échantillon 14 est un objet semi transparent, non absorbant et faiblement diffusant, le champ électromagnétique total ^௧ est exprimé par la relation (1) : ^௧ = ^^ + ^ௗ (1) Dans cet exemple, le rayonnement incident I étant collimaté au niveau de l’échantillon 14, il présente une distribution ponctuelle au centre du plan de Fourier C, correspondant à l’image de la pupille du système optique 3. Lorsque l’échantillon 14 est plus petit que la ou les longueurs d’onde du rayonnement incident, par exemple de dimension inférieure à 100 nm, le rayonnement D est diffusé de manière quasi isotrope. Il présente ainsi une distribution homogène sur l’image de la pupille du système optique 3 dans le plan de Fourier C. Les champs ^^ et ^ௗ peuvent être observés dans le plan de Fourier C comme illustré schématiquement sur la figure 2A, grâce à la caméra supplémentaire 15 qui image le plan de Fourier C. Le champ ^ௗ remplit le plan de Fourier C alors que le champ ^^ est ici concentré en un point au centre du plan de Fourier C. Plus généralement, le champ ^^ est réparti selon la répartition angulaire du rayonnement lumineux I émis par la source lumineuse 2. Dans le cas d’un objet faiblement diffusant, et comme illustré sur la figure 2C, le module |^ௗ| du champ diffusé est petit par rapport au module du champ incident |^^|. Il est par exemple plus de 1000 fois inférieur au module du champ incident |^^|. Il peut alors être considéré que le champ total ^௧ est égal au champ incident ^^ déphasé d’un déphasage ^, d’où la relation (2) : ^௧ = ^^^ି^ఝ (2) Pour des objets biologiques, tels que des vésicules ou des virus, ou encore des nanoparticules, le déphasage ^ est faible, notamment inférieur à 0,05 rad, de sorte que l’on peut utiliser le développement de Taylor en ^, d’où la relation (4) : ^௧ ^ ^^(1 െ ^^) (4) Par identification entre les relations (1) et (4), le champ diffusé ^ௗ peut être écrit, selon la relation (5), comme le champ incident ^ గ ^ atténué de ^, et déphasé d’environ ଶ :
Figure imgf000018_0001
La figure 2C montre la représentation complexe des champs incident ^^, diffusé ^ௗ et total ^௧ obtenu avec le dispositif 1 sans filtre spatial. On observe sur cette figure le déphasage proche de గ ଶ du champ diffusé ^ௗ par rapport au champ incident ^^. Dans le cas du dispositif selon l’invention avec la présence du filtre spatial optique 4 dans le plan de Fourier C, ^^^ est la contribution du champ électromagnétique incident, correspondant au rayonnement incident I après transmission par le filtre spatial 4, et ^ௗ^la contribution du champ électromagnétique diffusé, correspondant au rayonnement diffusé D après transmission par le filtre spatial 4, au champ électromagnétique total ^௧^ atteignant le capteur de front d’onde 5. Dans le cas où l’échantillon 14 est un objet semi transparent, non absorbant et faiblement diffusant, la relation (6) suivante peut être définie : ^௧^ = ^^^ + ^ௗ^ (6) La transmittance complexe t de la zone de moindre transmittance est définie comme ^ = ^^^ି^ఉ. Le rayon ^
Figure imgf000019_0001
^ de la zone de moindre transmittance est de préférence au moins 5 fois inférieur au rayon ^^ de l’image de la pupille du système optique 3 dans le plan de Fourier. Ainsi, la zone de plus grande atténuation n’affecte donc que le champ incident et pas le champ diffusé, comme cela peut être observé sur la figure 2B. Les relations (7) à (9) suivantes peuvent ainsi être écrites :
Figure imgf000019_0002
On observe sur les figures 2D et 2E la représentation complexe des champs incident après filtrage ^^ ᇱ, diffusé après filtrage ^ௗ et total après filtrage ^௧^, respectivement GDQV^OH^FDV^R^^ȕ^HVW^QXO^HW^GDQV^OH^FDV^R^^ȕ^HVW^QRQ^QXO. On observe en particulier la diminution de l’amplitude du champ incident après filtrage ^^ ᇱ, par rapport à l’amplitude du champ incident ^^ non filtré illustré sur la figure 2C. L’amplitude t0 de la transmittance est choisie telle que |^^^| = |^^^| ^ |^ௗ| afin d'atteindre le meilleur compromis entre atténuation de ^^ et niveau de signal nécessaire à une bonne reconstruction de phase. De préférence, 0 < t0 < 0,7. La zone de plus grande atténuation est semi-transparente. L'annulation complète du champ incident ^^^ = 0 par une zone de plus grande atténuation opaque produirait une illumination en champ sombre mais empêcherait de définir la phase du front d’onde sur l’ensemble du champ de vue. Le champ total transmis ^௧^ porte un nouveau déphasage ^ᇱ > ^ par rapport au champ ^^^. Le déphasage ^ induit par l’échantillon 14 peut être quantifié à partir de la mesure de l’intensité et de la phase du champ ^௧^. En combinant les relations (1) et (8), on obtient la relation (10) :
Figure imgf000020_0001
^௧ et ^௧^ sont les intensités relatives respectivement des champs totaux ^௧ dans le cas d’un dispositif 1 sans filtre spatial 4 et après filtrage ^௧^ dans le cas d’un dispositif 1 avec filtre spatial 4. Les relations (11) et (12) peuvent être formulées :
Figure imgf000020_0002
ainsi que la relation (13) à partir de la relation (10) :
Figure imgf000020_0003
Le capteur de front d’onde 5 mesure une intensité relative, c’est-à-dire le rapport entre une image de référence sans échantillon et une image en présence de l’échantillon 14. Les rapports d'intensité ^^ et ^^^ définis par les relations (14) et (15) peuvent ainsi être mesurés :
Figure imgf000020_0004
La relation (16) peut alors être formulée à partir de la relation (13) :
Figure imgf000020_0005
En connaissant la transmission complexe du filtre spatial 4 et à partir des grandeurs mesurées ^^ ᇱ ^^ et ^ en présence du filtre spatial 4, le déphasage ^ et l'absorption ^^ induits par l’objet diffusant de l’échantillon 14 peuvent être quantifiés. Des simulations numériques de la mise en œuvre du dispositif 1 ont été réalisées, afin d’en déterminer les conditions d’utilisation optimale. Elles ont été mises en œuvre en suivant la méthode définie dans l’article P. Bon, B. Wattellier, and S. Monneret, “Modeling quantitative phase image formation under tilted illuminations,” Opt. Lett. 37, 1718 (2012). L’échantillon 14 étudié est une bille de polystyrène d’indice optique égal à 1,62, immergées dans de l’eau d’indice optique égal à 1,33. L’échantillon 14 a été illuminé par un rayonnement lumineux monochromatique de ORQJXHXU^G¶RQGH^^^ ^^^^^QP^^/¶REMHFWLI^31 utilisé avait une ouverture numérique 1,4. Le filtrage spatial a été simulé sur le champ ^^ ௧, transformée de Fourier spatiale du champ total ^௧. Le champ électromagnétique simulé compris dans un disque de rayon ^^^, rayon de la zone de plus grande atténuation 41 du filtre spatial 4, a été ensuite multiplié par la transmittance complexe ^^^ି^ఉ du filtre spatial 4 pour simuler l’interaction avec ledit filtre spatial 4. La zone du champ située en dehors d’un disque de rayon ^^, rayon de l’image de la pupille du système optique 3 dans le plan de Fourier C, a été mise à 0 pour simuler l’ouverture numérique finie du système optique 3. Le champ ^^ ௧^ a ainsi été simulé, selon la relation (17) :
Figure imgf000021_0001
avec k les vecteurs images dans la pupille, et ^^ étant l’ouverture numérique du système optique 3 et ^ la longueur d’onde du rayonnement lumineux. La valeur du champ total après filtrage ^௧^, mesurable sur le capteur de front d’onde 5, a été calculée en effectuant une transformée de Fourier spatiale inverse de ce champ ^^ ௧^.ᇲ మ L'intensité ^^ ᇱ et la phase ^ᇱ, calculées respectivement par หா^ห ௧మ బ et arg(^௧ ᇱ), sont représentées sur les images d’intensité et de phase des figures 3E et 3B respectivement. Elles ont été calculées en considérant ^ ^ ^ = 0.1 , ^ = 0 et ^ೞ ^^ = 7%. On vérifie sur la figure 3B l'obtention d'une amplification de la phase mesurée ^ᇱ, dont la valeur est jusqu’à plus de dix fois plus élevée que la valeur du déphasage ^ calculé en l’absence du filtre spatial et représentée sur la figure 3A. Quant à la carte d'intensité de la figure 3E, elle correspond à une image en champ partiellement sombre, où la lumière diffusée par l'objet, au centre de la figure, est prépondérante par rapport à la lumière incidente. La figure 4A représente les amplifications en phase et la figure 4B les amplifications en contraste d’intensité simulées en fonction de la transmission T et du sage ^ du filtre spatial 4, pour ^
Figure imgf000022_0001
dépha ^ೞ ^^ = 7%. Pour un déphasage ^ induit par le filtre spatial 4 proche de 0 [2^], l'amplification de la phase est d'autant plus forte que la transmission T est faible. Cela traduit que le dispositif 1 fonctionne de manière optimale lorsque que le ratio ^ா^ ா^ ^ est équilibré. Un traitement permettant de remonter aux grandeurs quantitatives a été appliqué à l'intensité ^ᇱ ᇱ ^ et à la phase ^ calculées, selon la relation (18) :
Figure imgf000022_0002
En comparant les valeurs de phase et d’intensité réelles (^, ^^), et celles retrouvées après filtrage et traitement quantitatif (^^ , ^^,^), l’erreur relative induite par le filtre spatial 4 a été estimée et est particulièrement faible. On peut observer, en comparant la figure 3C avec la figure 3A, ainsi que la figure 3F et avec la figure 3D, que les valeurs de phases et d’intensité retrouvées (^^ , ^^,^) sont quasiment identiques aux valeurs de phase et d’intensité réelle (^, ^^). Cette comparaison traduit le bon fonctionnement du traitement quantitatif permettant de revenir aux valeurs en l’absence de filtre. Comme illustré sur la figure 5, modifier la transmission complexe du filtre spatial 4 conduit à des erreurs relatives inférieures à 10ିଶ pour la phase (figure 5A) et à 10ିସ pour l'intensité (figure 5B). La figure 6 illustre l’effet du rapport ^
Figure imgf000022_0003
^ ^^ du rayon du filtre spatial 4 sur le rayon de l’image de la pupille du système optique 3 dans le plan de Fourier C, sur les erreurs relatives de phases et d’intensité. On constate qu'au-dessous de
Figure imgf000022_0004
^^ = 10%, les erreurs en phase sont inférieures à 1% (figure 6A) et celles en intensité inférieures à 10ିଷ% (figure 6B). On établit alors cette valeur du ratio comme limite au-dessous de laquelle on considère raisonnable l'hypothèse selon laquelle la présence du filtre spatial 4 ne modifie pas le champ diffusé ^ௗ. Exemple 1 Le microscope 9 utilisé était un microscope commercial Olympus IX71, équipé d’un objectif de microscope de grossissement x60, et d’ouverture numérique 0,9 (Olympus UPlanFLN). L’illumination de l’échantillon 14 a été assurée grâce à l’illumination Köhler native du microscope 9 (lampe halogène), filtrée en longueur d’onde. Le capteur de front d’onde 5 était un analyseur ID4L (Interféromètre à Décalage Quadri-Latéral) composé d’une caméra Andor Zyla 5.5 et d’un réseau de diffraction 2D de périodicité 10 µm, optimisé pour la longueur d’onde 650 nm. Ce réseau a été réimagé sur la caméra via un télescope de grossissement x2, composé de 2 lentilles achromatiques. La distance effective entre le réseau de diffraction et la caméra était ^ = 1.2 ^^. La zone de plus grande atténuation 41 du filtre spatial 4 était un disque de 80 nm d’or sur 5 nm de chrome, et de rayon
Figure imgf000023_0001
= 100 µm, déposé via évaporation par bombardement électronique sur une lame de verre. La transmission du filtre spatial optique a été mesurée expérimentalement à T = 7 % j^^^ ^^^^^HW^^^^^QP^^HQ^PHVXUDQW^ en l’absence d’échantillon, le signal d’intensité I1 sans filtre et le signal d’intensité I2 avec filtre, pour en déduire T=I2/I1. Le déphasage ^ = 0.5 ^^^ a été mesuré par interférométrie. On observe sur la figure 7A, une image du plan de Fourier du dispositif expérimental acquise par la caméra supplémentaire 15. Le disque blanc correspond au rayonnement diffusé D par un échantillon formé d’une superposition de feuilles de papier, sur toute l’image de la pupille du système optique 3 dans le plan de Fourier C, et le disque noir au milieu correspond au filtre spatial 4. La comparaison des figures 7B et 7C met en évidence l’effet du filtre spatial 4 sur l’intensité du rayonnement incident I. L’échantillon 14 étudié était un ensemble de billes de polystyrène d’indice optique ^^^^௬ = 1.62 et de diamètre ^ = 100 ^^ immergées dans de l’eau d’indice optique
Figure imgf000023_0002
Les résultats obtenus dans le cas sans filtre spatial 4 et avec filtre spatial 4, ainsi qu’avec la reconstruction quantitative, en utilisant l’équation 16 à partir des images filtrées, sont présentées en figure 8. La figure 8A montre les résultats obtenus sans filtre spatial 4, la figure 8B montre les résultats obtenus avec filtre spatial 4 et la figure 8 C montre les résultats obtenus avec filtre spatial 4 et suite au traitement quantitatif à partir des mesures. Expérimentalement, on mesure un gain d’un facteur environ 3 du signal de phase passant de ^ = 3.5 ^^ sans filtre spatial, à ^ᇱ = 11^^ avec filtre spatial, proche de la valeur théorique simulée par le modèle et illustrée sur la figure 4A. Les valeurs de phase sont exprimées en nm car elles font référence à la différence de chemin optique ^ parcourue, quantité qui peut être reliée à la phase en radian par la relation : ^ = 2^ ఋ ఒ, où ^ est la longueur d’onde du rayonnement. Le module du champ diffusé par les billes étant très faible devant celui du champ incident, les billes n’apparaissent pas sur l’image d’intensité sans filtrage de la figure 8A. On voit sur l’image 8B que la présence du filtre spatial 4 produit une configuration en champ partiellement sombre et permet de faire ressortir les billes avec un contraste de 0,2, lui aussi proche de la valeur théorique attendue que l’on trouve sur la figure 4B. Après reconstruction quantitative, les valeurs d’intensité et de phase reconstruites, visibles sur la figure 8C, sont identiques aux valeurs d’intensité et de phase brutes, mais avec un net gain dans le rapport signal sur bruit. La figure 9A représente un agrandissement de l’image de phase de la figure 8B et la figure 9B montre un agrandissement de l’image de phase de la figure 8C. Le bruit est calculé sur les zones délimitées en pointillés sur les figures 9A et 9B. On observe un bruit de phase RMS de ^
Figure imgf000024_0001
= 0.42 ^^ pour les mesures sans filtre spatial de la figure 9A, et de ^ఝ = 0.29 ^^ pour les mesures filtrées puis reconstruites de la figure 9B. Dans une variante, le spectre angulaire du rayonnement lumineux incident I est un disque centré dans le plan de Fourier C, comme on peut l’observer sur la figure 10A, la zone blanche correspondant au rayonnement lumineux incident I. La zone de plus grande atténuation 41 est un disque au centre du filtre spatial optique 4, comme représenté sur la figure 10D, la zone grise correspondant à la zone de plus grande atténuation 41. Dans une variante, le spectre angulaire du rayonnement lumineux incident I est représenté dans le plan de Fourier C par plusieurs disques espacés, comme observable sur la figure 10B, les zones blanches correspondant au rayonnement lumineux incident I. La zone de plus grande atténuation 41 est composée de plusieurs disques répartis sur le filtre spatial optique 4 de la même manière que le rayonnement lumineux incident I dans le plan de Fourier C, comme représenté sur la figure 10E, les zones grises correspondant à la zone de plus grande atténuation 41. Dans une autre variante, le spectre angulaire du rayonnement lumineux incident I est un anneau dans le plan de Fourier C, comme on peut l’observer sur la figure 10A, la zone blanche correspondant au rayonnement lumineux incident I. La zone de plus grande atténuation 41 est un anneau correspondant sur le filtre spatial optique 4, comme représenté sur la figure 10D, la zone grise correspondant à la zone de plus grande atténuation 41. Exemple 2 Le même échantillon 14 et le même dispositif que pour l’exemple 1 ont été utilisés, à l’exception du filtre spatial optique 4. Ce dernier, observable sur la figure 11A, présentait ici une zone de plus grande atténuation 41 comportant une chambre 48 contenant un milieu présentant un coefficient thermo-optique dn/dT élevé, tel que du glycérol pour lequel dn/dT=-2,7.10-4, au contact du disque d’or 46 de 80 nm d’épaisseur décrit précédemment, la chambre 48 et le disque 46 étant entre deux plaques de verre 45 du filtre spatial optique 4. La chambre 48 permettait, grâce à un système de chauffage 47 par laser focalisé, de faire varier le déphasage induit par le filtre spatial optique 4 sur le champ incident Ei. Le déphasage total ȕtotal induit par le filtre spatial optique 4 sur le champ incident Ei était alors la somme d’une composante variable ȕvariable et d’une composante fixe ȕfixe, comme on peut l’observer sur la figure 11B, où ^^ ᇱ, ^ௗ et ^௧^ sont respectivement les représentations complexes des champs incident après filtrage, diffusé après filtrage et total après filtrage. Le déphasage ȕvariable permettait d’optimiser les valeurs du déphasage ^ᇱ et de l’intensité |^^௧|ଶ. On observe sur les figures 12A et 12B les images expérimentales d’intensité et de phase respectivement, en l’absence de filtre (groupe 1 de gauche) et en présence du filtre VSDWLDO^RSWLTXH^^^SRXU^GLIIpUHQWHV^YDOHXUV^GH^ȕvariable obtenues en faisant chauffer la chambre thermosensible (groupe 2 de droite). Les courbes des figures 13A et 13B représentent respectivement la variation des contrastes en intensité et en phase, en fonction du déphasage induit par le filtre spatial optique 4. On remarque que l’on retrouve expérimentalement les résultats des simulations présentées en figure 4A et 4B, pour une transmission T égale à 7%. L’utilisation de la chambre 48 et du système de chauffage 47 permet de faire varier le déphasage induit par le filtre spatial optique 4 en temps réel, de manière à optimiser le rapport signal sur bruit à la fois sur le signal d’intensité et sur le signal de phase.

Claims

Revendications 1. Dispositif d’imagerie de phase quantitative (1) comportant : - un système optique imageur (3) pour imager un objet (14) dans un plan image, - une source lumineuse
(2) pour émettre un rayonnement lumineux (I) sur au moins une partie du plan de Fourier (C) du système optique imageur
(3), - un filtre spatial optique
(4) s’étendant dans le plan de Fourier (C) du système optique imageur (3) et comportant une zone de moindre atténuation (41) du rayonnement lumineux (D) et une zone de plus grande atténuation (42) du rayonnement lumineux (I), - un capteur de front d’onde
(5) pour mesurer dans le plan image, l’intensité et la phase du champ électromagnétique associé au rayonnement lumineux (I ; D) émis par la source lumineuse (2) et qui a traversé le système optique imageur (3) et le filtre spatial optique (4), et dont au moins une partie a interagi avec l’objet (14), afin de quantifier la phase induite par l’objet, la source lumineuse (2), le système optique imageur (3) et le filtre spatial optique (4) étant agencés pour qu’en l’absence de l’objet (14) à imager, le rayonnement lumineux (I) soit focalisé sur la zone de plus grande atténuation (41). 2. Dispositif selon la revendication 1, la zone de plus grande atténuation (41) présentant une transmittance complexe t définie par la relation t=t0*e-Lȕ avec 0 < t0 ^^0,7, l’amplitude t0 étant mesurée sur au moins une partie du spectre de longueur(s) d’onde(s) du rayonnement lumineux (I) émis par la source lumineuse (2), et optionnellement le déphasage ȕ étant tel que -1 rad [S] ^^ȕ^^^1 rad [S], notamment afin d’amplifier le signal sur la phase en valeur absolue. 3. Dispositif selon l’une quelconque des revendications 1 et 2, le filtre spatial optique (4) comportant un support transparent (43) et un revêtement semi-opaque (44) recouvrant partiellement le support (43), la zone de plus grande atténuation (41) étant définie par la superposition du support (43) et du revêtement semi-opaque (44). 4. Dispositif selon la revendication 3, le revêtement semi-opaque (44) ayant la forme d’au moins un disque de rayon rfs, de préférence inférieur à 0,1*rp, rp étant le rayon maximal du disque à l’intérieur duquel se répartissent les fréquences spatiales collectées dans le plan de Fourier (C), par exemple rfs ^^^^^^^P^ 5. Dispositif selon la revendication 3, le revêtement semi-opaque (44) ayant la forme d’un anneau.
6. Dispositif selon l’une quelconque des revendications 3 à 5, le revêtement semi-opaque (44) étant centré sur l’axe optique du filtre spatial optique (4).
7. Dispositif selon l’une quelconque des revendications 3 à 6, le revêtement semi-opaque (44) comportant une couche semi opaque en un métal choisi parmi l’or, l’argent, l’aluminium, le chrome, le titane, et leurs alliages, par exemple en or.
8. Dispositif selon la revendication précédente, le revêtement semi-opaque (44) comportant une couche d’accroche prise en sandwich entre et au contact du support (43) et de la couche semi-opaque, par exemple faite de chrome et/ou de titane.
9. Dispositif selon l’une quelconque des revendications précédentes, le capteur de front d’onde (5) comportant un détecteur du rayonnement lumineux et, optionnellement, un masque d’analyse de front d’onde (53) disposé devant le détecteur le long du trajet optique du rayonnement lumineux, afin de déterminer la distribution spatiale du gradient de la phase du rayonnement lumineux (I ; D ; R) ou d’un signal proportionnel à ladite phase.
10. Dispositif selon la revendication précédente, le masque d’analyse de front d’onde (53) étant choisi parmi un masque comportant un réseau de microlentilles, par exemple un masque de Shack-Hartmann, un masque de Hartmann modifié et un diffuseur mince.
11. Dispositif selon l’une quelconque des revendications 9 et 10, le détecteur du rayonnement lumineux (I ; D ; R) comportant une caméra numérique (51) pour acquérir le rayonnement lumineux (I ; D ; R) qui, de préférence, a interagi avec le masque d’analyse de front d’onde (53).
12. Dispositif selon la revendication précédente, la caméra numérique (51) comportant un capteur lumineux, par exemple CMOS ou CCD, pour acquérir le rayonnement lumineux (I ; D ; R) et qui mesure l’intensité dudit rayonnement lumineux (I ; D ; R).
13. Dispositif selon l’une quelconque des revendications précédentes, comportant une caméra numérique supplémentaire (15), notamment pour mesurer l’intensité du rayonnement lumineux (I ; D) dans le plan de Fourier (C) du système optique imageur (3).
14. Dispositif selon l’une quelconque des revendications précédentes, comportant un microscope (9) disposant d’un objectif (31), et optionnellement le microscope comportant un porte-échantillon (10) et/ou la source lumineuse (2), le filtre spatial optique (4) étant distant du microscope (9).
15. Dispositif selon l’une quelconque des revendications précédentes, la zone de plus grande atténuation (41) présentant une transmittance complexe variable, notamment en fonction de la polarisation du rayonnement lumineux (I) et/ ou de la température de ladite zone (41), et/ou modifiable par l’utilisateur.
16. Dispositif selon la revendication précédente, la zone de plus grande atténuation (41) comportant un matériau thermochrome et/ou polarisant.
17. Dispositif selon la revendication précédente, le matériau thermochrome étant choisi parmi les cristaux liquides thermochromes, les leuco-colorants thermochromes, les oxydes thermochromes, optionnellement dopés, et leurs mélanges, par exemple étant choisi dans le groupe formé par VO2, BiVO4, NbO2 et leurs mélanges.
18. Dispositif selon l’une quelconque des revendications précédentes, la zone de plus grande atténuation (41) et/ou la zone de moindre atténuation (42) comportant au moins une couche en un matériau apte à induire un déphasage entre le rayonnement incident (I ; D) sur lesdites zones respectivement, et le rayonnement (I ; D) atténué par lesdites zones, par exemple une couche comportant un polymère, un verre, ou du dioxyde de titane, un empilement de couches, ou une métasurface.
19. Dispositif selon la revendication précédente, la zone de plus grande atténuation (41) et/ou la zone de moindre atténuation (42) comportant une couche d’un matériau biréfringent.
20. Dispositif selon l’une des revendication 18 et 19, la zone de plus grande atténuation et/ou la zone de moindre atténuation comportant une couche d’un matériau présentant un coefficient thermo-optique non nul, notamment un liquide, par exemple du glycerol, ou un polymère, par exemple du polydiméthylsiloxane.
21. Dispositif selon l’une quelconque des revendications précédentes, comportant un module de régulation thermique pour modifier la température de la zone de plus grande atténuation (41) et/ou de la zone de moindre atténuation (42) afin de modifier la transmission desdites zones (41 ; 42) et/ou le déphasage induit par lesdites zones (41 ; 42).
22. Dispositif selon l’une quelconque des revendications précédentes, comportant plusieurs filtres spatiaux optiques (4).
23. Dispositif selon l’une quelconque des revendications précédentes, la source lumineuse (2) comportant un générateur de lumière (21) pour générer le rayonnement lumineux (I), par exemple choisi parmi une lampe, notamment à halogène, et un laser intense, notamment un laser super-continuum.
24. Dispositif selon la revendication précédente, la zone de plus grande atténuation ayant une forme d’un disque centré sur l’axe optique et la source lumineuse (2) comportant un système optique supplémentaire (22) pour générer une illumination de Köhler, le système optique supplémentaire (22) étant disposé entre le générateur de lumière (21) et l’objet (14), dans le sens de propagation du rayonnement lumineux (I), notamment afin de collimater le rayonnement lumineux incident (I) sur l’objet (14).
25. Procédé d’acquisition d’au moins une image numérique d’un échantillon comportant un objet (14) au moyen du dispositif (1) selon l’une quelconque des revendications précédentes, le procédé comportant : a) l’émission avec la source lumineuse (2) d’un rayonnement lumineux incident (I) dirigé sur l’objet (14), b) la détection par le capteur de front d’onde (5) du rayonnement lumineux total (I ; D ; R) ayant interagi avec l’objet (14), transmis par le système optique imageur (3) et le filtre spatial optique (4), et c) le traitement du signal détecté à l’étape b) pour quantifier une grandeur choisie parmi la phase du rayonnement lumineux (I ; D ; R) et/ou une variation de la phase du rayonnement lumineux (I ; D ; R), et optionnellement pour générer une image numérique de ladite grandeur.
26. Procédé selon la revendication précédente, le traitement à l’étape c) comportant en outre la quantification de l’intensité du rayonnement lumineux (I ; D ; R) et de préférence la génération d’une image numérique de l’intensité du rayonnement lumineux (I ; D ; R).
27. Procédé selon l’une quelconque des revendications 25 et 26, l’échantillon (14) comportant un, voire plusieurs objets (14) dont la taille est inférieure à la résolution du système optique imageur (3).
28. Procédé selon l’une quelconque des revendications 25 à 27, l’échantillon étant choisi parmi une matière biologique comportant un micro-organisme, une poudre, une solution de culture biologique, un groupe de cellules ou micro-tissus, une matière inerte comportant une nanoparticule ou une solution de mélange de particules.
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