FR2889081A1 - Dispositif microfluidique pour mesure de fluorescence et procede de mesure mettant en oeuvre un tel dispositif - Google Patents

Abstract

La présente invention a principalement pour objet un dispositif microfluidique pour la mesure de fluorescence d'au moins un petit volume de liquide (2) comportant des moyens de déplacement (4) par électromouillage sur une surface hydrophobe pour :- amener un petit volume de liquide en position de mesure en sortie d'une zone de filtre d'excitation (34.1,34.2) et devant l'entrée d'une zone de filtre d'émission,- amener une goutte formant filtre d'émission (44.1,44.2) dans la zone d'excitation,- et/ou pour amener une goutte formant filtre d'émission liquide dans la zone d'émission.La présente invention a également pour objet un procédé de mesure de fluorescence utilisant un filtre d'émission liquide et/ou d'excitation liquide.

Description

DISPOSITIF MICROFLUIDIQUE POUR MESURE DE FLUORESCENCE

ET PROCEDE DE MESURE METTANT EN UVRE UN TEL DISPOSITIF

DESCRIPTION

DOMAINE TECHNIQUE ET ART ANTÉRIEUR La présente invention se rapporte principalement à un dispositif microfluidique pour la mesure de fluorescence utilisant l'électromouillage, et à un procédé de mise en oeuvre d'un tel dispositif, par exemple pour réaliser un génotypage ou la mesure de réactions antigènes anticorps.

La mesure en fluorescence consiste à exciter des marqueurs fluorescents dans un liquide, à l'aide d'une source de lumière d'une longueur d'onde prédéterminée.

Le signal réémis par les marqueurs est mesuré à une autre longueur d'onde (supérieure à la longueur d'onde d'excitation) à l'aide d'un détecteur.

La mesure de fluorescence est actuellement la technique la plus répandue pour le génotypage, la mesure de réactions antigènes anticorps (l'immunophotodetection) ....

Cette mesure consiste à marquer les molécules dont on souhaite connaître la concentration (appelées molécules cibles) avec des molécules fluorescentes (appelés sondes). On éclaire alors le volume dans une longueur d'onde déterminée et on mesure le signal émis dans une longueur d'onde supérieure. La valeur du signal mesuré permet de déterminer la concentration par un système de calibration préalable (mesure de gammes de dilution de concentration connue).

Un appareil de mesure de fluorescence est généralement constitué d'une source de lumière d'un système optique permettant de mettre en forme cette lumière, d'un système de filtre permettant de filtrer cette lumière, d'un système optique permettant de collecter la lumière de fluorescence, d'un deuxième système de filtrage destiné à bloquer la lumière d'excitation et à laisser passer la lumière de fluorescence et d'un détecteur de lumière de fluorescence.

La conception d'un appareil de mesure de fluorescence, nécessite de prendre en compte le spectre d'absorption et d'émission du fluorophore que l'on souhaite mesurer.

Le choix du filtre d'excitation et du filtre d'émission permet de réaliser un filtrage efficace. Le filtre d'excitation est souvent centré sur le maximum d'excitation du fluorophore, quant au filtre d'émission, celui-ci est souvent centré sur le maximum d'émission du fluorophore. Il faut s'assurer qu'il n'y ait pas de recouvrement entre les deux filtres.

Le filtrage en longueur d'onde de la lumière est réalisé communément par des filtres solides, du type filtre coloré ou du type filtre interférentiel.

Les filtres colorés présentent l'avantage d'être peu dépendants de l'angle d'incidence de la lumière, mais n'ont pas une sélectivité importante en longueur d'onde. Les filtres interférentiels sont plus sélectifs en longueur d'onde, mais par contre ils sont très sensibles à l'angle d'incidence. De plus, leur prix est souvent plus élevé.

Dans certains systèmes de détection miniatures, le filtrage est réalisé par des dépôts solides de couches minces optiques, par exemple en sortie de fibre optique.

Afin de pouvoir mesurer différents fluorophores dans un même échantillon, il est souvent nécessaire de disposer d'un système mécanique (manuel ou motorisé) permettant de changer de filtre, par exemple une roue à filtre ou une tourelle de microscope.

Il existe également des filtres solides, qui permettent de détecter plusieurs fluorophores (filtres double ou triple bande). Cependant, ces filtres ne permettent pas de séparer le signal provenant de chacun des fluorophores.

Sont également connus des filtres dits accordables utilisant des cristaux liquides. En faisant varier une tension appliquée au filtre comportant des cristaux liquide, il est possible de modifier le spectre de transmission du filtre. Cependant, ces filtres ont un faible coefficient de transmission dans la bande passante. Cette limitation est intrinsèque aux cristaux liquides. Il est alors nécessaire de passer par au moins deux polariseurs croisés. Le coefficient de transmission maximal théorique de ces filtres est alors de 50%.

Il existe également des appareils acousto- optiques programmables (AOTF) permettant de sélectionner une longueur d'onde parmi plusieurs longueurs d'onde. Cependant leur coût et leur encombrement les rendent peu adaptés à l'intégration dans des dispositifs miniatures.

C'est par conséquent un but de la présente invention d'offrir un dispositif de petite taille permettant des mesures de fluorescence de petits volumes de liquide.

C'est également un but de la présente invention d'offrir un dispositif simple permettant la détection de plusieurs fluorophores.

C'est également un but de la présente invention d'offrir un dispositif permettant des mesures de fluorescence de petits volumes de liquide sans moyen mécanique.

EXPOSÉ DE L'INVENTION Les buts précédemment énoncés sont atteints par un dispositif permettant d'effectuer des mesures de fluorescence sur un échantillon de liquide, dans lequel l'un ou les deux filtres sont formés par un petit volume de liquide coloré, déplaçables également par électromouillage pour les mettre en position de filtrage, de manière à disposer le filtre d'excitation entre une source de faisceau optique et l'échantillon de liquide, et le filtre d'émission entre l'échantillon et le moyen de collecte de la lumière fluorescente.

En d'autres termes, les éléments participant à la mesure comme les filtres et l'échantillon peuvent être mis en place et retirés sans la mise en oeuvre de dispositif mécanique, mais uniquement par application d'une force électrostatique.

Le dispositif selon la présente invention peut également comporter des moyens de déplacement par électromouillage de l'échantillon pour le placer entre un filtre d'excitation et un filtre d'émission, La présente invention a alors principalement pour objet un dispositif microfluidique pour la mesure de fluorescence d'au moins un petit volume de liquide comportant des moyens de déplacement par électromouillage: - pour amener une goutte formant filtre d'excitation dans une zone d'excitation, - et/ou pour amener une goutte formant filtre d'émission liquide dans une zone d'émission, les gouttes formant filtre étant disposées de part et d'autre d'une zone de mesure apte à recevoir le volume de liquide.

Le dispositif selon la présente invention, comporte avantageusement des moyens de déplacement par électromouillage pour amener le petit volume de liquide en position de mesure en sortie de la zone de filtre d'excitation et devant l'entrée de la zone de filtre d'émission.

La zone d'émission est située préférentiellement latéralement, par exemple perpendiculairement, par rapport à l'axe d'excitation, ou par rapport à une direction de propagation d'un faisceau, direction qui peut être définie comme étant sur l'axe d'excitation.

Dans un exemple de réalisation, le dispositif selon la présente invention comporte des zones de stockage des différents filtres.

Le dispositif selon l'invention peut comporter une source de faisceau optique destinée à éclairer le petit volume de liquide à analyser et positionnée de manière à ce que le faisceau optique traverse le filtre d'excitation en position de mesure avant de traverser le petit volume de liquide La source de faisceau optique est, par exemple, un laser, ou au moins une diode électroluminescente, ou un polymère organique, ou de type chimique ou semi-conducteur.

De manière avantageuse, le dispositif selon l'invention comporte des moyens de mise en forme du faisceau optique, qui peuvent comporter un système optique, ou au moins un miroir ou au moins une fibre optique.

Dans un mode de réalisation, le dispositif peut également comporter des moyens pour moduler la forme du petit volume de liquide par électromouillage afin de moduler le signal obtenu après traversée du petit volume de liquide par le faisceau optique.

Les moyens de déplacement peuvent comporter des électrodes d'électromouillage et des moyens électriquement conducteurs formant la contre-électrode pour ces électrodes d'électromouillage.

Le dispositif peut également comporter un deuxième substrat en regard de la surface hydrophobe, formant capot, qui est avantageusement transparent pour permettre un contrôle visuel direct et la mesure de fluorescence.

Le dispositif peut alors comporter un troisième substrat transparent muni d'électrodes, ledit troisième substrat délimitant la zone d'émission, les filtres d'émission liquide pouvant être déplacés par les électrodes du troisième substrat.

Dans un mode particulier, le deuxième substrat comporte la contreélectrode.

Dans un autre mode de réalisation particulier, la contre-élecrode est formée par un fil conducteur suspendu.

Dans un exemple de réalisation, une électrode d'électromouillage de la zone de filtre d'excitation et/ou une électrode d'électromouillage de la zone de filtre d'émission est de forme sensiblement rectangulaire.

Dans un autre exemple de réalisation, une électrode d'électromouillage de la zone de filtre d'excitation et/ou une électrode d'électromouillage de la zone de filtre d'émission est de forme parabolique, sphérique, concave ou convexe permettant une mise en forme, telle qu'une focalisation ou une divergence de la lumière d'excitation et/ou de la lumière d'émission respectivement.

Le dispositif selon l'invention peut également comporter des moyens formant au moins deux réservoirs de liquide pour fabriquer des filtres liquides.

Le dispositif, selon la présente invention comporte de manière avantageuse des parois isolant les zones de mesure, d'excitation et d'émission de l'environnement extérieur, évitant la présence de lumière parasite et les fuites d'huile La présente invention a également pour 5 objet un procédé de mesure de fluorescence comportant les étapes suivantes.

- de déplacement d'un filtre d'excitation jusqu'à sa position de mesure, et/ou de déplacement d'un filtre d'émission jusqu'à sa position de mesure, les filtres d'émission et d'excitation étant choisi pour mesurer au moins un fluorophore déterminé, - de génération d'un faisceau optique en direction du filtre d'excitation et du petit volume de 15 liquide, - de déplacement du petit volume de liquide à mesurer jusqu'à sa position de mesure avant, pendant ou après la mise en place du ou des filtres.

- de collecte d'un signal sortant du filtre d'émission.

De manière avantageuse, les filtres d'excitation et d'émission sont formés par des liquides colorés.

Le procédé selon la présente invention peut comporter préalablement à la mise en place du ou des filtres pour une mesure de fluorescence, une étape de préparation des filtres liquides. Cette étape peut, par exemple, s'effectuer par mélange de plusieurs gouttes de liquide coloré ou par dilution d'une goutte de liquide coloré.

Le procédé selon l'invention peut comporter également les étapes de mise en forme du faisceau optique, de modulation par électromouillage de la forme du petit volume de liquide, et/ou de changement du filtre d'émission et/ou du filtre d'excitation pour mesurer un autre fluorophore.

Le procédé selon la présente invention peut également comporte un étape de remplacement du liquide mesuré en cas de photo-destruction de celui-ci par la lumière d'excitation.

Les filtres et le petit volume à analyser peuvent, de manière avantageuse, baigner dans un liquide non miscible avec le liquide formant les filtres et celui des petits volumes de liquide à analyser.

Un dispositif selon la présente invention présente alors l'avantage de ne pas comporter de moyens mécaniques en mouvement, en particulier pour le changement des filtres, ce qui rend le dispositif très fiable et permet d'en réduire le prix de revient.

De plus, il est possible, avec un dispositif unique, d'accéder à une très grande gamme de filtrages, en changeant simplement la ou les gouttes formant filtre. Ainsi, l'utilisateur peut choisir en fonction des mesures à effectuer, les filtres dont il a besoin en insérant dans le dispositif des gouttes de liquide coloré et en les déplaçant par une simple commande électrique Il est également possible de fabriquer à l'intérieur même du dispositif des filtres sur mesure en changeant la coloration des gouttes, par mélange et/ou dilution des gouttes de liquide colorés.

En outre, l'utilisation de tels filtres permet d'éliminer les problèmes de vieillissement et de salissure par des poussières, puisqu'il suffit simplement de remplacer une goutte en place par une nouvelle goutte. De plus, les filtres utilisés ne risquent plus d'êtres des filtres détruits par la lumière d'excitation ou dégradés, puisqu'ils sont facilement remplaçables.

Un dispositif selon la présente invention peut également comporter des électrodes à usage multiple, permettant à la fois la détection, la préparation des échantillons, tels que la dilution, l'évaporation, le mélange....

BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS

La présente invention sera mieux comprise à l'aide de la description qui va suivre et des dessins en annexe, sur lesquels: - les figures 1A-1C représentent le principe de déplacement de gouttes, par électromouillage, - la figure 2 représente une configuration fermée de dispositif de déplacement de gouttes, - les figures 3A et 3B représentent une configuration mixte de dispositif de déplacement de gouttes, - les figures 4 et 5A-5B représentent un dispositif de déplacement de gouttes, dans lequel le capot supérieur est muni d'une électrode, 25 - la figure 6 est une vue schématique de dessus d'un premier mode de réalisation d'un dispositif selon la présente invention dans un état de fonctionnement la figure 7 est une vue de dessus du dispositif de la figure 6 dans un autre état de fonctionnement la figure 7' est une vue schématique de dessus d'une variante de réalisation du dispositif de la figure 7; - les figures 8A et 8B sont des vues de côtés du dispositif de la figure 6 en situation de mesure; - les figures 9A et 9B sont des vues schématiques de côté d'une variante de réalisation du dispositif de la figure 6; les figures 10A et 10B sont des vues schématiques de dessus d'un troisième mode de réalisation d'un dispositif selon la présente invention dans un état d'attente et dans un état prêt pour une mesure; - les figures 11A - 11D représentent un puits ou un réservoir de liquide; les figures 12A et 12B sont des vues de côté d'une variante de réalisation du dispositif des figures 9A et 9B.

EXPOSÉ DÉTAILLÉ DE MODES DE RÉALISATION PARTICULIERS Un premier mode de réalisation d'un dispositif de déplacement et de manipulation de gouttes, de type système ouvert et qui peut être mis en oeuvre dans le cadre de l'invention, est illustré sur les figures 1A - 1C.

Sur les figures 12A et 12B, on peut voir un autre mode de réalisation d'un dispositif de déplacement qui peut être mis en oeuvre dans le cadre de l'invention. Ce dispositif dit fermé, comporte un capot délimitant avec le substrat deux zones de déplacement de gouttes de liquide superposées Ce mode de réalisation met en oeuvre un dispositif de déplacement ou de manipulation de gouttes de liquide reposant sur le principe de l'électromouillage sur un diélectrique.

Des exemples de tels dispositifs sont décrits dans l'article de M.G. Pollack, A.D. Shendorov, R.B. Fair, intitulé Electro-wetting-based actuation of droplets for integrated microfluidics , Lab on Chip 2 (1) (2002) 96-101.

Les forces utilisées pour le déplacement de gouttes de liquide sont alors des forces électrostatiques.

Le document FR 2 841 063 décrit un dispositif mettant en oeuvre, en outre, un caténaire en regard des électrodes activées pour le déplacement.

Le principe de ce type de déplacement est synthétisé sur les figures 1A 1C.

Une goutte 2 repose sur un réseau 4 d'électrodes, dont elle est isolée par une couche diélectrique 6 et une couche hydrophobe 8 (figure 1A).

Le caractère hydrophobe de cette couche signifie que la goutte a un angle de contact ou de mouillage, sur cette couche, supérieur à 90 .

Les électrodes 4 sont elles-mêmes formées en surface d'un substrat 1.

Lorsque l'électrode 4-1 située à proximité de la goutte 2 est activée, à l'aide de moyens 14 de commutation, dont la fermeture établit un contact entre cette électrode et une source de tension 13 via un conducteur commun 16, la couche diélectrique 6 et la couche hydrophobe 8 entre cette électrode activée et la goutte sous tension agissent comme une capacité.

La contre-électrode 10 permet un éventuel déplacement par électromouillage à la surface de la surface hydrophobe; elle maintient un contact électrique avec la goutte pendant un tel déplacement. Cette contre-électrode peut être soit un caténaire comme dans FR - 2 841 063, soit un fil enterré soit une électrode planaire dans le capot d'un système confiné (un tel système confiné est décrit plus loin).

En système ouvert, s'il n'y a pas de déplacement, il est possible d'étaler la goutte sur la surface hydrophobe, sans contre-électrode. C'est par exemple le cas si la goutte peut être amenée sur la surface hydrophobe par un système de dispense classique, les électrodes 4-1, 4-2 servant uniquement à étaler ou déformer la goutte à l'endroit où elle a été déposée.

La goutte peut ainsi être éventuellement déplacée de proche en proche (figure 1C), sur la surface hydrophobe 8, par activation successive des électrodes 4-1, 4-2,... etc, le long du caténaire 10.

Il est donc possible de déplacer des liquides, mais aussi de les mélanger (en faisant s'approcher des gouttes de liquides différents), et de réaliser des protocoles complexes.

Les documents cités ci-dessus donnent des exemples de mises en oeuvre de séries d'électrodes adjacentes pour la manipulation d'une goutte dans un plan, les électrodes pouvant en effet être disposées de manière linéaire, mais aussi en deux dimensions, définissant ainsi un plan de déplacement des gouttes.

La figure 2 représente un autre mode de réalisation d'un dispositif de déplacement ou de manipulation de gouttes, de type système fermé ou confiné, pouvant être mis en oeuvre dans le cadre de l'invention.

Sur cette figure, des références numériques identiques à celles des figures 1A - 1C y désignent des mêmes éléments.

Ce dispositif comporte, en outre, un substrat supérieur 100, de préférence également recouvert d'une couche hydrophobe 108. Cet ensemble peut être éventuellement transparent, permettant une observation par le haut.

Les figures 3A et 3B, sur lesquelles des références numériques identiques à celles de la figure 2 y désignent des éléments identiques ou similaires, représentent un système mixte de déplacement ou de manipulation de gouttes, dans lequel une goutte 2 est initialement en milieu ouvert (figure 3A), l'activation d'électrodes 4-1, 4-2, 4-3 permettant un aplatissement de la goutte (figure 3B), en système fermé, dans une zone où le système est muni d'un capot, comme illustré ci-dessus en liaison avec la figure 2.

La figure 4 représente une variante du système fermé, avec un capot conducteur 100, comportant une électrode ou un réseau d'électrodes 112, ainsi qu'une couche isolante 106 et une couche hydrophobe 108.

Le caténaire 10 des figures précédentes est remplacé, dans ce mode de réalisation, par l'électrode 112. L'activation de cette électrode 112 et des électrodes 4 permet de déplacer la goutte dans la position voulue puis de l'étirer ou de la déformer, pour l'amener sur le trajet d'un faisceau lumineux 50.

Les figures 5A et 5B, sur lesquelles des références numériques identiques à celles de la figure 4 y désignent des éléments identiques ou similaires, représentent un système mixte, dans lequel une goutte 2 est initialement en milieu ouvert (figure 5A), l'activation d'électrodes 4-1, 4-2, 4-3 permettant un aplatissement de la goutte (figure 5B), en système fermé, dans une zone où le système est muni d'un capot, comme illustré ci-dessus en liaison avec la figure 4.

Un dispositif selon l'invention peut en outre comporter des moyens qui vont permettre de commander ou d'activer les électrodes 4, par exemple un ordinateur type PC et un système de relais connectés au dispositif ou à la puce, tels les relais 14 de la figure 1A, ces relais étant pilotés par les moyens de type PC.

Typiquement, la distance entre un éventuel conducteur 10 (figures 1A - 5B) d'une part et la surface hydrophobe 8 d'autre part est par exemple comprise entre 1 pm et 100 pm ou 500 pm.

Ce conducteur 10 peut se présenter par exemple sous la forme d'un fil de diamètre compris entre 10 pm et quelques centaines de pm, par exemple 200 pm. Ce fil peut être un fil d'or ou d'aluminium ou de tungstène ou d'autres matériaux conducteurs.

Lorsque deux substrats 1, 100 sont utilisés (figures 2 - 5B), ils sont distants d'une distance comprise entre, par exemple, 10 pm et 100 pm ou 500 pm.

Quel que soit le mode de réalisation considéré, une goutte de liquide 2 pourra avoir un volume compris entre, par exemple, 1 nanolitre et quelques microlitres, par exemple entre 1 nl et 5 pl ou 10 pl.

En outre chacune des électrodes 4 aura par exemple une surface de l'ordre de quelques dizaines de pm' (par exemple 10 pm') jusqu'à 1 mm', selon la taille des gouttes à transporter, l'espacement entre électrodes voisines étant par exemple compris entre 1 pm et 10 pm.

La structuration des électrodes 4 peut être obtenue par des méthodes classiques des micro-technologies, par exemple par photolithographie.

Des procédés de réalisation de puces incorporant un dispositif selon l'invention peuvent être directement dérivés des procédés décrits dans le document FR - 2 841 063.

Des conducteurs, et notamment des conducteurs 112 peuvent être réalisés par dépôt d'une couche conductrice et gravure de cette couche suivant le motif approprié de conducteurs, avant dépôt de la couche hydrophobe 108.

Les électrodes peuvent être réalisées par dépôts d'une couche métallique (par exemple en un métal choisi parmi Au, Al, ITO, Pt, Cr, Cu) par photolithographie. Le substrat est ensuite recouvert d'une couche diélectrique, par exemple en Si3N4 ou en SiO2. Enfin un dépôt d'une couche hydrophobe est effectué, comme par exemple un dépôt de téflon réalisé à la tournette.

Un tel dispositif de déplacement de gouttes peut mettre en oeuvre un réseau bidimensionnel d'électrodes qui vont permettre, de proche en proche, de déplacer des liquides dans ou sur un plan, de les mélanger, afin de réaliser des protocoles complexes.

Dans le cas du mode de réalisation avec caténaires 10 (figures 1A-3B), un ensemble bidimensionnel (2D) de ces caténaires peut être réalisé audessus de l'ensemble 2D d'électrodes 4. Dans le cas du mode de réalisation avec contre-électrode 112 incorporée dans le capot 100 (figures 4-5B), cette contre - électrode peut aussi avoir une structure bidimensionnelle.

Comme illustré sur les figures 6 et 7, un dispositif pour l'analyse de fluorescence selon la présente invention comporte un dispositif d'électromouillage du type décrit ci-dessus, comportant au moins une partie pour l'analyse I du petit volume à analyser ou goutte d'échantillon 2, entourée par une partie d'excitation II et une partie d'émission III.

Le dispositif selon la présente invention peut comporter des moyens pour mettre en place la goutte ou échantillon à analyser. Ces moyens peuvent être formés comme représentés sur les figures 6 et 7 par le réseau d'électrodes 4 s'étendant, dans l'exemple représenté, en zigzag, mais les électrodes d'électromouillage peuvent avoir toute autre forme souhaitée.

Sur la figures 7', les moyens de déplacement des échantillons à analyser sont formés par des canaux 300 s'étendant de réservoirs de liquides colorés (non représentés) jusqu'à la zone d'analyse, les échantillons étant déplacés au moyen de pompes (non représentées).

D'autres moyens de déplacement d'échantillons liquides peuvent convenir.

Les gouttes baignent avantageusement dans un liquide non miscible avec celui des gouttes, par exemple de l'huile lorsque les gouttes sont formées d'une solution aqueuse. Ceci permet d'éviter l'évaporation des gouttes et de modifier la tension nécessaire aux déplacements. En effet, la présence de l'huile modifie les caractéristiques du milieu. De plus, en choisissant deux liquides d'indice optique proche, les réflexions sont limitées.

Dans l'exemple représenté en figures 6 et 7, le filtre d'excitation et le filtre d'émission sont tous deux sous forme d'une goutte de liquide coloré.

On pourrait prévoir d'avoir un filtre d'excitation ou d'émission sous forme de goutte et un filtre d'émission ou d'excitation par exemple de type filtre solide.

Selon le dispositif représenté en figures 6 et 7, il est possible d'utiliser un filtre d'excitation formé par une goutte de liquide coloré 234.1 ou une autre goutte de liquide coloré 234.2 ayant des propriétés différentes, notamment optiques.

La partie d'excitation II comporte une zone d'accueil d'un filtre d'excitation dite zone d'excitation 224, lorsqu'une mesure est réalisée, et des zones 230.1 et 230.2 pour le stockage des filtres d'excitation, respectivement 234.1 et 234.2.

Les zones de stockage 230.1 et 230.2 sont disposées, dans l'exemple de réalisation, de part et d'autre de la zone d'excitation 224.

Le déplacement d'une goutte d'une zone de stockage à la zone d'excitation 224 s'effectue entre autre par électromouillage de la manière décrite cidessus pour la goutte 2 d'échantillon à l'aide des figures 1A-1C.

La partie d'excitation II comporte des troisièmes et quatrièmes (non représentés) moyens électriquement conducteurs aptes à appliquer un champ électrostatique à la goutte filtre 234.1, 234.2.

Les troisièmes moyens sont formés par un réseau d'électrodes enterrées dans le substrat 1 et les quatrièmes moyens sont formés, par exemple par une contre-électrode (non représentée) de structure similaire à celle de la contre-électrode 10 (figures 1A-1C), en vis-à-vis du réseau d'électrodes.

La couche hydrophobe de la couche diélectrique est avantageusement la même que celle des premiers moyens de déplacement 4.

Le réseau d'électrodes s'étend entre la zone d'excitation 224 et chacune des zones de stockage 230.1, 230.2. Dans l'exemple représenté, le réseau d'électrodes comporte une électrode 240.1 dans la zone d'excitation 224, une électrode 240.2 dans la zone de stockage 230.1, une électrode 240.3 dans la zone de stockage 230.2 et des électrodes 240.4, 240.5 intermédiaires disposées respectivement entre la zone d'excitation 224 et la zone de stockage 230.1 et entre la zone d'excitation 224 et la zone de stockage 230.2.

On pourrait prévoir un nombre supérieur d'électrodes, et un chemin plus long et plus complexe entre les zones de stockage et d'excitation.

Des moyens de commutation et de commandes du réseau d'électrodes, identique ou similaire à ceux du réseau 4 sont prévus.

Ainsi, lorsque l'électrode 240.1 de la zone d'excitation 224 passe dans un état actif, la goutte 234.1 étant dans sa zone de stockage 230.1 et l'électrode 240.2 étant dans un état inactif, la goutte 234.1 se déplace de la zone de stockage 230.1 vers la zone d'excitation 224.

L'électrode 240.1 de la zone d'excitation 224 a avantageusement une forme rectangulaire. La goutte formant filtre prend sensiblement la forme de l'électrode; ainsi tous les rayons lumineux suivant sensiblement unedirection X sensiblement perpendiculaire à une face de l'électrode 240.1 rectangulaire, traversent le filtre d'excitation sur une même longueur.

On peut également envisager de réaliser une électrode 240.1 de forme parabolique, sphérique, concave ou convexe, permettant alors au filtre d'excitation de remplir également la fonction de lentille afin de participer à la mise en forme du rayon lumineux d'excitation, par exemple pour le focaliser ou le rendre divergent.

Les électrodes 240.2 et 240.3 des zones de stockage sont, dans l'exemple représenté, de forme triangulaire permettant d'optimiser l'encombrement de l'ensemble du dispositif, mais des électrodes ayant une autre forme, par exemple rectangulaire peuvent également convenir.

La partie d'émission III est de structure proche de celle de la partie d'excitation II.

Selon le dispositif représenté en figures 6 et 7, il est possible d'utiliser un filtre d'émission formé par une goutte de liquide coloré 244.1 ou une autre goutte de liquide coloré 244.2, ayant des propriétés différentes, notamment optiques.

La partie d'émission III comporte une zone d'accueil 246 d'un filtre d'émission, dite zone d'émission, lorsqu'une mesure est réalisée, et des zones 248.1 et 248.2 pour le stockage des filtres d'émission, respectivement 244.1, 244.2.

Les zones de stockage 248.1 et 248.2 sont disposées dans l'exemple de réalisation de part et d'autre de la zone d'émission 246.

La zone d'émission 246 s'étend de préférence sensiblement selon un axe Y, orthogonal à l'axe X des rayons lumineux d'excitation, de manière à recevoir la lumière d'émission émise par la goutte 2.

La partie d'émission III comporte des cinquièmes 250 et sixièmes (non représentés) moyens électriquement conducteurs, de réalisation similaire à ceux de la partie d'excitation.

Les quatrièmes moyens conducteurs 250 comportent, dans l'exemple représenté un réseau de cinq électrodes 252.1, 252.2, 252.3, 252.4, 252.5 pour déplacer un goutte 244.1, 244.2.

Les sixièmes moyens conducteurs formant contre-électrode sont disposés en vis-à-vis du réseau d'électrodes 252.1 à 252.5 ou dans le capot en configuration fermée (figures 9A et 9B).

La description du fonctionnement des moyens de déplacements de la partie d'excitation II s'applique, ainsi que celle des formes des électrodes.

Sur la figure 8A, on peut voir le dispositif selon la figure 6 vu selon la flèche 264. Le dispositif est dans une configuration de mesure de fluorescence, une goutte d'excitation 234.1 est en place en arrière de la goutte d'échantillon 2 dans le sens de déplacement de la lumière d'excitation. Les flèches 260,261 schématisent respectivement la lumière issue d'une source lumineuse et la lumière de fluorescence.

Sur la figure 8B, on peut voir le dispositif de la figure 6 vu selon la flèche 266; une goutte d'émission est positionnée en avant de la goutte d'échantillon 244.1 selon le trajet de la lumière de fluorescence émise sortant de la goutte d'échantillon 2. La flèche 268 schématise la lumière d'excitation arrêtée par la goutte. La lumière de fluorescence 261 est ensuite collectée par un dispositif de traitement (non représenté) pour déterminer la quantité de fluorophore contenue dans la goutte d'échantillon et en déduire la concentration du liquide source.

Les rayons lumineux proviennent d'une source de lumière 242 qui est, par exemple, extérieure au dispositif, tel que cela est représenté en figures 6 et 7. La source de lumière peut également être intégrée au dispositif.

La source de lumière 242 est, par exemple, une lampe à incandescence halogène à arc (xénon, mercure) ou une lampe à décharge appelée également flashlamp. La source de lumière peut également être un laser extérieur ou une ou plusieurs diodes électroluminescentes (LED). Un polymère organique (OLED) ou une quelconque source de lumière chimique ou de type semiconducteur peut également convenir.

Sur les figures 6 et 7, on peut voir des parois 280 bordant et séparant les zones d'excitation, d'émission et de mesure.

Ces parois permettent d'éviter la présence d'une lumière parasite pouvant engendrer, par exemple une lumière d'excitation non filtrée, une réflexion sur les gouttes...

En outre, ces parois évitent les fuites d'huile et forment un support pour le capot dans le cas d'un dispositif fermé.

Ces parois sont par exemple réalisées en résine.

Sur les figures 6 et 7, est également représenté un détecteur 254 de la lumière de fluorescence provenant du filtre d'émission.

Dans une variante de réalisation, le détecteur peut être intégré à la puce, par exemple dans le cas d'une photodiode conçue dans l'empilement des couches technologiques, ou bien dans le cas d'un capteur CMOS collé au bord de la puce.

Le détecteur peut également être un photomultiplicateur, une caméra CCD ou encore une photodiode à avalanche.

Les rayons lumineux provenant de la source lumineuse 242 peuvent être guidés dans le dispositif et mis en forme directement par des lentilles disposées en dehors de la puce, ou par l'intermédiaire de moyens supplémentaires d'un système optique 256 ou de miroirs ou encore d'une ou plusieurs fibres optiques ou guides de lumière.

On peut également prévoir de mettre en forme les rayons lumineux en utilisant directement le filtre d'excitation, par exemple en utilisant une électrode 240.1 de forme particulière, tel que cela a été décrit précédemment et/ou un fluide non miscible d'indice particulier.

Il est également possible de moduler le rayon d'émission en modifiant la forme de la goutte 2 à analyser, par électromouillage. Par exemple, dans le cas d'une électrode de forme rectangulaire; en l'absence de tension la goutte disposée sur cette électrode est de forme sensiblement ronde, alors qu'en présence d'une tension, la goutte a sensiblement une forme rectangulaire. Ainsi la distance à parcourir dans l'échantillon par le faisceau optique d'émission peut être modifiée, ce qui peut permettre une détection synchrone.

La mise en forme à l'aide des gouttes de liquide permet d'intégrer plusieurs fonctions dans le dispositif selon la présente invention sans modifier sa compacité.

Nous allons maintenant expliquer le fonctionnement d'un tel dispositif.

Considérons que la goutte d'excitation 234.1 et la goutte d'émission 244. 1 permettent une détection d'un fluophore A, tandis que les gouttes d'excitation 234.2 et d'émission 244.2 permettent la détection d'un fluorophore B, les fluorophores A et B dont on veut déterminer la concentration, étant contenus dans l'échantillon de liquide 2.

Dans une première étape, l'échantillon à mesurer est déplacé, par exemple par les moyens 4 jusqu'à la zone de mesure 222.

La goutte d'excitation 234.1 est déplacée de la zone de stockage 230.1 à la zone d'excitation 224.

La goutte d'émission 244.1 est déplacée de la zone de stockage 248.1 à la zone d'émission 246.2.

Tous ces déplacements ont lieu par électromouillage.

Un faisceau optique généré par la source lumineuse 242 traverse la goutte d'excitation 234.1 et est filtré par celle-ci. Le faisceau lumineux n'émet plus que dans une longueur d'onde déterminée par la goutte d'excitation 234.1.

Le faisceau lumineux ainsi filtré traverse la goutte 2, qui émet alors une lumière de fluorescence du fait de la présence des fluorophores A (figure 8A).

Cette lumière de fluorescence traverse ensuite la goutte d'émission 244.1, qui la filtre de manière à absorber la lumière d'excitation et à ne laisser passer que la lumière de fluorescence (figure 8B).

Cette lumière de fluorescence est ensuite collectée par le détecteur 254, qui grâce à une calibration préalable, en déduit la concentration en fluorophore A. Ensuite pour déterminer la concentration des fluorophores B, on remplace les gouttes 234.1 et 244.1 par les gouttes d'excitation et d'émission 234.2 et 234.2 adaptées à la détection des fluorophores B. Les gouttes 234.1 et 244.1 sont replacées dans leur zone de stockage 230.1, 248.1 respective.

La détection s'effectue de la même manière que pour les fluorophores B. Le détecteur 254 détermine sur la base de la lumière de fluorescence due aux fluorophores B, la concentration en fluorophore B. Lorsque toutes les mesures sur une goutte sont terminées, on peut remplacer l'échantillon 2 par un autre échantillon à analyser.

Le dispositif selon la présente peut comporter plus de deux filtres d'excitation et/ou d'émission, le nombres des zones de stockage sera alors adapté en conséquence.

Sur les figures 9A et 9B, on peut voir une variante de réalisation du dispositif selon la figure 6 comportant un capot 100 muni sur sa face intérieure d'un revêtement conducteur 265 formant la contre- électrode. Ce capot peut, par exemple être transparent, pour permettre de contrôler le déplacement des gouttes.

Sur les figures 12A et 12B, on peut voir une variante de réalisation du dispositif des figures 9A et 9B, dans laquelle le capot 100 transparent permet également de réaliser la mesure de fluorescence.

Ce dispositif comporte un deuxième capot 100.1 disposé à distance du premier capot 100 au dessus de celui-ci et délimitant une zone de réception d'un filtre d'émission.

Le capot 100.1 comporte un réseau d'électrodes 4.1 transparentes et est muni d'une surface hydrophobe du côté du capot 100. Ces électrodes peuvent être activées pour mettre en mouvement les filtres d'émission 244. 1, 244.2.

Le fonctionnement de ce dispositif est identique à celui du dispositif décrit précédemment, sauf que le faisceau de fluorescence 261 sortant de l'échantillon 2 traverse la capot transparent 100, puis le filtre d'émission 244.1 et enfin le deuxième capot 100.1 avant d'atteindre le détecteur( non représenté).

Les filtres d'excitation 234.1 et d'émission 244.1 peuvent être remplacés par les filtres 234.2, 244.2 pour effectuer des détections de fluorophores différents (figure 12B). 20

Ce dispositif permet une réalisation tridimensionnelle, qui permet de réduire l'encombrement du dispositif.

Sur les figure 10A et 10B, on peut voir une variante de réalisation du dispositif de la figure 6, dans lequel les filtres d'émission et d'excitation ont les mêmes lieux de stockage.

Le dispositif comporte une zone de stockage 270 permettant, dans l'exemple représenté, le stockage de six filtres 271.1 à 271.6 différents. La zone 270 comporte donc six casiers , disposés sur un côté de la zone de mesure. Chaque casier est défini par une électrode d'électromouillage 272.1 à 272.6. Le dispositif comporte également une zone de déplacement 274 pour permettre le déplacement des filtres de la zone de stockage vers la partie d'émission III ou d'excitation II comportant six électrodes 276.1 à 276.6 raccordées chacune à une des six électrodes 272.1 à 272.6 de la zone de stockage respectivement, par une électrode intermédiaire 272.1' à 272.6'.On pourrait prévoir d'avoir directement les électrodes 276.1 à 276.6 adjacentes aux électrodes 272.1 à 272.6.

Ce dispositif permet donc de distinguer au moins trois fluorophores différents, voire plus en combinant les différents filtres.

Les électrodes 276.1 à 276.6 forment également avec une électrode 276.7 adjacente à l'électrode 252.2 de la zone d'émission, un chemin continu pour le déplacement des filtres liquides en direction de la zone d'émission III.

Dans l'exemple représenté, le dispositif comporte également une zone 278 de déplacement, intermédiaire entre la partie d'émission III et la partie d'excitation II et formée dans l'exemple représenté, par quatre électrodes 278.1, 278.2, 278.3, 278.4, définissant un chemin entre la zone d'excitation et la zone d'émission. En effet, dans l'exemple représenté en figure 10A et 10B, le filtre d'excitation passe par la zone d'émission pour rejoindre la zone d'excitation en empruntant le chemin intermédiaire 278.

Selon une variante, on peut prévoir de faire passer la goutte d'excitation par la zone de mesure I avant la mise en place de la goutte d'échantillon, ou encore prévoir un chemin dédié spécifiquement au déplacement de la goutte d'excitation.

Nous allons maintenant expliquer le fonctionnement de ce dispositif.

Sur la figure 10A, les six filtres liquides 271.1 à 271.6 sont en place dans leur casier respectif.

Si l'on souhaite utiliser le filtre d'excitation 271.2 et le filtre d'émission 271.4, on active l'électrode 272.2', puis 276.2, le filtre 271. 2 se déplace alors jusqu'à l'électrode 276.2, puis on active les électrodes 276.1, 276.7 et l'électrode d'émission 252.3. On active ensuite les électrodes 278.1, puis 278.2, 278.3, 278.4 et enfin l'électrode d'excitation 240.1, le filtre 271.2 se trouve alors en place dans la zone d'excitation 224.

Pour le filtre d'émission, on active les électrode 272.4', puis les électrodes 276.4, 276.3, 276.2, 276.1, 276.7 et l'électrode d'émission 252.3. Le filtre d'émission 276.4 se trouve alors en place pour filtrer la lumière d'émission.

L'échantillon peut être mis en place avant, pendant ou après la mise en place des filtres. Il peut entre autre être amené lui aussi par électromouillage.

La mesure de fluorescence peut alors être réalisée.

Afin de mesurer un autre fluorophore on change le filtre d'excitation et/ou le filtre d'émission, comme décrit précédemment. Dans la configuration de la figure 10B, on utilise les filtres 271.1 et 271.3.

Le nombre d'électrodes pour la zone de stockage et pour les zones de déplacement peut être adapté aux besoins, par exemple la zone de stockage peut comporter plus d'une électrode par filtre.

Le dispositif comporte également des parois 280 pour isoler le dispositif des lumières parasites et éviter les fuites d'huile. Cependant, à l'inverse du dispositif des figures 6 et 7, il n'y a pas de paroi 280 séparant les zones II et III pour permettre le passage des filtres d'excitation par la zone III d'émission.

Si un chemin de déplacement est prévu pour les filtres d'excitation, on peut prévoir une telle paroi de séparation.

On peut envisager de mélanger les filtres entre eux si cela est nécessaire en faisant se rencontrer les gouttes dans une zone de mélange, ou de diluer ceux-ci en mélangeant une goutte de liquide avec une goutte de liquide transparent ou neutre du point de vu optique.

On peut également prévoir un dispositif générateur de filtre, comportant d'une part un réservoir de solution incolore, par exemple aqueuse et de l'autre au moins un réservoir de colorant concentré, avantageusement plusieurs afin de réaliser des filtres ayant des propriétés optiques différentes.

En mélangeant la solution incolore et un colorant, on obtient un filtre utilisable pour les mesures. Ce filtre peut être stocké pour une utilisation ultérieure ou évacué, un nouveau filtre sera fabriqué. Dans ce cas, le dispositif ne comporte alors pas de zone de stockage de filtre, mais des zones de stockage de composants pour fabriquer des filtres.

Les figures 11A - 11D représentent comment peut être réalisé un réservoir tel que les réservoirs permettant la fabrication de filtres.

Un liquide 300 à dispenser est déposé dans un puits 320 de ce dispositif (figure 11A). Ce puit est par exemple réalisé dans le capot supérieur 100 du dispositif. La partie inférieure, représentée de manière schématique sur les figures 11A - 11D, est par exemple similaire à la structure des figures 1A-1C. Si on n'utilise pas une configuration avec un capot supérieur, la configuration ouverte laisse la possibilité de verser un liquide tel que de l'huile sur toute la surface. On peut ensuite déplacer une goutte par électromouillage.

Trois électrodes 4-1, 4-2, 4-3, similaires aux électrodes 4 de déplacement de gouttes de liquide, sont représentées sur les figures 11A - 11D.

L'activation de cette série d'électrodes 4-1, 4-2, 4-3 conduit à l'étalement d'une goutte à partir du puits 320, et donc à un segment liquide 301 comme illustré sur la figure 11C.

Puis, on coupe ce segment liquide en désactivant une des électrodes activées (électrode 4-2 sur la figure 11C). On obtient ainsi une goutte 2, comme illustré sur la figure 11D.

On utilise donc une série d'électrodes 4-1, 4-2, 4-3 pour étirer du liquide du réservoir 320 en un doigt 301 (figures 11B et 11C) puis pour couper ce doigt 301 de liquide (figure 11D) et former une goutte 2 qui va pouvoir être emmenée vers tout site de mesure comme décrit ci-dessus.

Un procédé de mesure utilisant des filtres liquides déplacés par électromouillage, comporte les étapes suivantes de: a) de déplacement d'un filtre d'excitation jusqu'à sa position de mesure, b) et/ou de déplacement d'un filtre d'émission jusqu'à sa position de mesure, les filtres d'émission et d'excitation étant choisi pour mesurer au moins un fluorophore déterminé, c) de déplacement du petit volume de liquide à mesurer jusqu'à sa position de mesure avant, pendant ou après la mise en place du ou des filtres, d) de génération d'un faisceau optique en direction du filtre d'excitation et du petit volume de liquide, e) de collecte d'un signal sortant du filtre d'émission.

Nous allons maintenons décrire le procédé de mesure de manière détaillée.

Dans une première étape, l'échantillon ou le ou les filtres sont mis en place.

Les gouttes de liquide servant de filtres, sont déplacées par électromouillage, par activation alternée des électrodes concernées.

Le choix du filtre d'excitation et du filtre d'émission s'effectue en fonction du fluorophore à détecter.

Lorsque toutes les gouttes de liquide sont dans leur position permettant la mesure, un faisceau lumineux est généré en direction de l'échantillon. On peut prévoir de mettre en forme le faisceau lumineux avant qu'il ne pénètre dans le filtre d'excitation par les moyens décrits précédemment.

Simultanément, on peut également prévoir une modifier par électromouillage la forme du petit volume de liquide à analyser pour moduler le rayon d'émission.

Lorsque plusieurs fluorophores sont à mesurer, le procédé selon la présente invention prévoit le changement du filtre d'émission et/ou du filtre d'excitation et de procéder à nouveau à la mesure par répétition des étapes a), b), d) et e).

Le procédé peut également prévoir une étape préalable de fabrication des filtres par mélange de plusieurs gouttes de liquide coloré ou par dilution d'une goutte de liquide coloré, tel que cela a été décrit précédemment

Claims (27)

REVENDICATIONS

1. Dispositif microfluidique pour la mesure de fluorescence d'au moins un volume de liquide (2) comportant des moyens de déplacement (4) par électromouillage sur une surface hydrophobe: - pour amener une goutte formant filtre d'excitation (234.1, 234.2) dans une zone d'excitation (224), et/ou pour amener une goutte formant filtre d'émission (244.1, 244. 2) liquide dans une zone d'émission (246), les gouttes formant filtre étant disposées de part et d'autre d'une zone de mesure apte à recevoir le volume de liquide.

2. Dispositif selon la revendication précédente, comportant des moyens de déplacement par électromouillage pour amener le volume de liquide (2) dans la zone de mesure en sortie de la zone de filtre d'excitation et devant l'entrée de la zone de filtre d'émission,

3. Dispositif selon la revendication 1 ou 2, comportant des zones de stockage 230.1,230.2,248.1, 248.2,270) des différents filtres.

4. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, comportant une source de faisceau optique (242) destinée à éclairer le petit volume de liquide à analyser et positionnée de manière à ce que le faisceau optique traverse le filtre d'excitation en position de mesure avant de traverser le petit volume de liquide (2).

5. Dispositif selon la revendication précédente, dans lequel la source de faisceau optique (242) est un laser, ou au moins une diode électroluminescente, ou un polymère organique, ou de type chimique ou semi-conducteur.

6. Dispositif selon la revendication 4 ou 5, comportant des moyens de mise en forme du faisceau optique.

7. Dispositif selon la revendication précédente, dans lequel les moyens de mise en forme du faisceau optique comportent un système optique, au moins un miroir ou au moins une fibre optique.

8. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, comportant des moyens pour moduler la forme du petit volume de liquide (2) par électromouillage afin de moduler le signal obtenu après traversée du petit volume de liquide par le faisceau optique.

9. Dispositif selon l'une quelconque es revendications précédentes, dans lequel les moyens de déplacement comportent des électrodes d'électromouillage et des moyens électriquement conducteurs formant contre-électrode pour ces électrodes d'électromouillage.

10. Dispositif selon la revendication précédente, comportant un deuxième substrat (100) en regard de la surface hydrophobe, formant capot (100).

11. Dispositif selon la revendication précédente, dans lequel ledit deuxième substrat (100) est transparent pour permettre un contrôle visuel direct.

12. Dispositif selon la revendication précédente comportant un troisième substrat (100.1) transparent comportant des électrodes, ledit troisième substrat (100.1) délimitant la zone d'émission, les filtres d'émission liquide pouvant être déplacés par les électrodes du troisième substrat (100.1).

13. Dispositif selon la revendication 10 à 12, dans lequel le deuxième substrat (100) comporte la contre-électrode.

14. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, dans lequel la contre-électrode est formé par un fil conducteur suspendu.

15. Dispositif selon l'une des revendications 9 à 14, dans lequel une électrode d'électromouillage de la zone de filtre d'excitation et/ou une électrode d'électromouillage de la zone de filtre d'émission est de forme sensiblement rectangulaire.

16. Dispositif selon l'une des revendications 12 à 14, dans lequel une électrode d'électromouillage de la zone de filtre d'excitation et/ou une électrode d'électromouillage de la zone de filtre d'émission est de forme parabolique, sphérique, concave ou convexe permettant une mise en forme de la lumière d'excitation.

17. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes comportant des moyens formant au moins deux réservoirs de liquide pour fabriquer des filtres liquides.

18. Dispositif, selon l'une quelconque des revendications précédentes comportant des parois (280) isolant les zones de mesure (I), d'excitation (II) et d'émission (III) de l'environnement extérieur.

19. Procédé de mesure de fluorescence comportant les étapes suivantes: de déplacement d'une goutte d'un filtre d'excitation (234.1, 234.2) jusqu'à la zone de filtre d'excitation (224), - et/ou de déplacement d'une goutte d'un filtre d'émission (244.1,244.2) jusqu'à la zone de filtre d'émission (246), les filtres d'émission et d'excitation étant choisi pour mesurer au moins un fluorophore déterminé, - de déplacement d'un petit volume de liquide (2) à analyser jusqu'à sa position de mesure (222) en sortie de la zone de filtre d'excitation (224) et devant l'entrée de la zone de filtre d'émission (246), avant, pendant ou après la mise en place du ou des filtres, - de génération d'un faisceau optique en direction du filtre d'excitation et du petit volume de liquide (2), - de collecte d'un signal sortant du filtre d'émission.

20. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel les filtres d'excitation et d'émission liquides sont formés par des liquides colorés.

21. Procédé selon la revendication 19 ou 20, comportant préalablement à la mise en place du ou des filtres pour une mesure de fluorescence, une étape de préparation des filtres liquides.

22. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel l'étape de préparation des filtres s'effectue par mélange de plusieurs gouttes de liquide coloré ou par dilution d'une goutte de liquide coloré.

23. Procédé selon l'une quelconque des revendications 19 à 22, dans lequel les filtres et le petit volume à analyser baignent dans un liquide non miscible avec les liquides formant les filtres et le petit volume à analyser.

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24. Procédé selon l'une quelconque des revendications 19 à 23, comportant également une étape de mise en forme du faisceau optique.

25. Procédé l'une quelconque des revendications 19 à 24, comportant également une étape de modulation par électromouillage de la forme du ou des filtres

26. Procédé l'une quelconque des revendications 19 à 25, comportant également une étape de modulation par électromouillage de la forme du petit volume de liquide.

27. Procédé selon l'une quelconque des revendications 19 à 26, comportant en outre des étapes supplémentaires de changement du filtre d'émission et/ou du filtre d'excitation pour mesurer un autre fluorophore.