FR2953741A1 - Procede de realisation d'un microlaboratoire d'analyse biologique sur puce et procede d'etalonnage de ce laboratoire - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un procédé de réalisation d'un microlaboratoire biologique sur puce, dans lequel on réalise au moins un guide optique (3) dans un substrat. On forme ensuite au moins un canal microfluidique intersectant au moins un guide optique (3) formé précédemment puis on dépose au moins une biopuce (5) au fond du canal microfluidique au niveau de l'intersection de celui-ci avec le guide optique (3) et on ferme le canal microfluidique par dépôt d'une couverture de fermeture. Selon l'invention, la ou les biopuce(s) déposée(s) comporte(nt) chacune n sondes individuelles (7), déposées séparément les unes des autres et de façon ordonnée sur le fond du ou des canaux microfluidiques par microtamponnage ; n étant un nombre supérieur ou égal à 2.

Description

i

La présente invention concerne le domaine technique des microlaboratoires d'analyses biologiques sur puce. De tels laboratoires sont communément dénommés dans le cadre de la communauté scientifique sous le ternie "lab-on-chip" (en anglais).

Ces microlaboratoires permettent de mettre en oeuvre les techniques de microfluidique. Ils disposent en effet de canaux microfluidiques, qui autorisent la manipulation de microvolumes d'échantillons biologiques à analyser à l'aide de composants intégrés dans ces microlaboratoires : micropompes, microvalves, micromélangeurs, microséparateurs, microréservoirs, chambres de réaction, colonnes de séparation (en particulier dans le cadre d'analyses électrophorétiques), etc. L'intérêt de ces microlaboratoires est qu'ils permettent d'automatiser le traitement des échantillons, de limiter la consommation en échantillons biologiques (qui peuvent être précieux) et réactifs, ainsi que d'accélérer les analyses. La présente invention concerne aussi le domaine des « biopuces » (ou biochips en anglais). Traditionnellement, les "biopuces" sont fabriquées sur des substrats plans; elles ne comportent donc pas des canaux comme les microlaboratoires sur puce. Le substrat des biopuces peut être constitué de matériaux divers tels que, par exemple : silicium, polymère, ou encore verre (lame de microscope, par exemple). Elles comportent en général des plots circulaires de 30 à 3000 pm de diamètre séparés de centre à centre d'un pas de 60 à 6000 pm, soit sensiblement le double du diamètre des plots. Sur chaque plot sont greffées des sondes biomoléculaires (ADN, oligopeptides, anticorps, protéines) dont la composition est parfaitement définie. La composition des sondes varie d'un plot à l'autre mais elle est unique pour chaque plot. Chaque plot comporte des sondes biologiques d'une composition donnée. Dans certaines réalisations, on dépose sur une biopuce plusieurs plots de composition identique pour fiabiliser le traitement des données.

Dans la suite de la description de l'invention, on utilisera aussi par extension le terme sonde pour désigner un plot sur le substrat d'une biopuce contenant ladite sonde. Par ailleurs, les biopuces sur support plan sont généralement hybridées dans une chambre fluidique constituée par un couvercle recouvrant en un seul bloc toute la surface de la puce et dont l'aire et le volume sont importants, typiquement de l'ordre de 1 cm2 et 10 pl, respectivement (voire plus). Le nombre de sondes présentes sur une biopuce peut varier selon la problématique biologique que l'on souhaite traiter. En effet, dans certains cas, comme par exemple pour la réalisation d'analyses médicales, les biopuces peuvent ne comporter qu'une dizaine de sondes quand, dans d'autres cas, elles peuvent en comporter jusqu'à 20 000 ou plus (pour l'étude d'un génome entier, par exemple).

Le principe de fonctionnement d'une biopuce repose sur l'interaction des cibles biologiques présentes dans une solution à analyser avec les sondes formées sur les plots de la biopuce. De telles interactions peuvent être par exemple des hybridations ADN/ADN, ou encore anticorps/antigène et de manière générale protéine/protéine. Ces interactions sont détectables par des techniques optiques et notamment par détection d'une émission de fluorescence induite, par exemple, à l'aide d'un laser. Les cibles sont marquées d'un fluorophore avant diffusion à la surface des plots de la puce. Les produits des interactions entre les cibles et les sondes produisent un signal de fluorescence quand ils sont excités par le laser. En l'absence d'interaction entre les cibles et les sondes, il n'y a pas de signal de fluorescence. La présence de fluorescence indique donc la présence des cibles compatibles avec les plots qui existent sur la biopuce. L'excitation et la détection de la fluorescence au niveau de chaque 30 sonde de la puce sont actuellement réalisées par des dispositifs électro- optiques chers, complexes et encombrants.

Lorsque la puce est correctement conçue, les plots répondant avec une grande intensité lumineuse donnent une information «positive» sur la présence de la cible (par exemple : présence d'un code génétique donné) tandis que les plots ne répondant pas avec une grande intensité lumineuse donnent une information «négative» sur la présence de la cible (par exemple : absence d'un code génétique donné). Une combinaison des analyses positives et négatives permet ainsi de déterminer la composition de la solution à analyser.

Dans la pratique, il est souvent nécessaire de dupliquer les plots d'une 10 sonde donnée en plusieurs endroits du laboratoire sur puce et/ou de la biopuce pour fiabiliser la réponse de la biopuce par redondance.

L'exploitation des biopuces se heurte aujourd'hui à trois problèmes principaux.

Tout d'abord, la manipulation des sondes biologiques à analyser se fait

15 le plus souvent manuellement par des opérateurs (par exemple avec des micropipettes, des chambres d'incubation pour agiter les fluides, des étuves pour mettre les couples cibles/sondes à la bonne température d'interaction, etc.), ce qui s'avère fastidieux. Il apparaît donc essentiel d'intégrer tout ou partie de ces opérations dans un seul microdispositif de façon à les

20 automatiser.

De plus, les systèmes existants d'excitation et de détection de fluorescence marqueurs d'une interaction entre sonde et cible sont chers et encombrants. Il est donc nécessaire de miniaturiser la partie du traitement des biopuces.

25 Enfin il n'existe pas de méthode satisfaisante pour miniaturiser une biopuce et l'intégrer dans un microlaboratoire d'analyse sur puce.

Pour des applications thérapeutiques ou de diagnostics, ne nécessitant que quelques sondes par puce, les inconvénients suscités deviennent majeurs et inacceptables. Cela freine considérablement le développement

30 des applications des biopuces, pour les applications médicales de type analyses et diagnostics ambulatoires et à domicile chez les patients, dans le cadre de traitements d'oncologie, par exemple. 2953741 -4- L'invention s'adresse en tout premier lieu à la fabrication de biopuces à faible nombre de sondes pour des analyses biologiques liées à des applications médicales de diagnostics (détection de protéines «marqueurs» cancéreux, reconnaissance génétique et génotypage) mais aussi à d'autres

5 applications comme la biodéfense, l'agroalimentaire...

Différentes techniques ont été récemment proposées dans l'état de la technique pour réduire notamment les coûts de fabrication et d'utilisation de laboratoires d'analyse biologique sur puce lorsqu'un faible nombre d'analyses est nécessaire. Ces techniques proposent notamment, comme décrit dans les publications intitulées "Discussion on optica/ integration in Lab-on-a-chip microsystems for medical diagnostics", Phys.statso/. (c) 3, 998-1012 (2003) et "Towards medical diagnostic chips with monolithically integrated optics in glass substrates', Phys.stat.sol. (c) 4, No.4, 1581-1584 (2007), de réaliser des microlaboratoires sur puce dont les substrats intègrent directement les moyens de guidage de lumière nécessaires à l'excitation et la détection de la fluorescence au niveau des sondes de la puce. Une telle intégration des moyens optiques procure l'avantage d'une meilleure compacité des laboratoires biologiques sur puce ainsi que des coûts de ces laboratoires et de leurs performances.

Par ailleurs, il serait particulièrement avantageux aussi de pouvoir intégrer des biopuces dans les canaux microfluidiques des laboratoires sur puce. Ainsi, il serait possible d'intégrer dans le substrat toutes les fonctions nécessaires à la mise en oeuvre des biopuces en profitant des avantages de techniques microfluidiques. Par exemple, dans le cas d'une analyse de l'ADN d'une cellule, les fonctions suivantes pourront être intégrées extraction de l'ADN, cission et marquage des brins d'ADN avec un fluorophore, hybridation avec les cibles de la biopuce, lavages pour optimiser la réponse de la biopuce. Comme indiqué précédemment, il est possible ainsi d'introduire aussi dans les microlaboratoires sur puces, des composants optiques comme des guides optiques intégrés de façon à exciter la fluorescence des molécules marquées. Aussi un but de l'invention est de proposer un procédé de 2953741 -5- fabrication de microlaboratoires biologiques sur puces qui ne présente pas les inconvénients et limites précédemment évoqués.

Pour cela, la présente invention se rapporte plus particulièrement à un procédé de fabrication de microlaboratoires d'analyse biologique sur puce par

5 microtamponnage de sondes biologiques au fond de canaux microfluidiques, ainsi qu'un procédé d'étalonnage de tels laboratoires. L'objectif est non seulement de miniaturiser et d'intégrer la biopuce dans le microlaboratoire en déposant les sondes par microtamponnage mais aussi de pouvoir procéder à sa calibration.

10 Un but de l'invention est tout particulièrement de fournir un procédé de fabrication de microlaboratoires d'analyse biologique sur puce comportant peu de sondes et qui soit peu encombrant et peu cher pour faciliter leur utilisation à des fins d'analyses médicales et de diagnostics.

Dans cet objectif, la présente invention propose un procédé de 15 réalisation d'un microlaboratoire d'analyse biologique sur puce, dans lequel successivement :

a. On réalise au moins un guide optique lumineux dans un substrat ;

b. On forme au moins un canal microfluidique sur une face du 20 substrat, ledit canal microfluidique intersectant au moins un dit guide optique (formé à l'étape a) ;

c. On dépose au moins une biopuce au fond du canal microfluidique au niveau de l'intersection de celui-ci avec le guide optique ; et

25 d. On ferme au moins ledit canal microfluidique dans lequel une

dite biopuce a été déposée à une intersection avec un guide

optique par dépôt d'une couverture de fermeture, sur la face du

substrat dans laquelle le canal microfluidique a été formé.

En fonction du nombre d'analyses biologiques à réaliser, l'invention

30 prévoit aussi de déposer plusieurs biopuces, côte à côte ou non, à l'intersection de plusieurs canaux microfluidiques avec plusieurs guides optiques. -6- De façon caractéristique du procédé de l'invention, la ou les biopuce(s) biologique(s) déposée(s) à l'étape c) comporte(nt) chacune n sondes individuelles, (n étant un nombre entier supérieur ou égal à 2), déposées séparément les unes des autres et de façon ordonnée sur le fond du ou des canaux microfluidiques par microtamponnage. On entend ici par "ordonné" que le dépôt des sondes est réalisé selon un arrangement déterminé, à pas d'écartement connu entre chaque sonde, et non de façon aléatoire.

Le procédé de l'invention propose ainsi de façon nouvelle de réaliser un laboratoire d'analyse biologique sur puce comportant au moins une biopuce composée de plusieurs sondes individuelles déposées sur des plots formés les uns à côté d'autres par microtamponnage au fond d'un canal microfluidique face à au moins un guide d'onde optique utile à l'excitation des signaux de fluorescence par les sondes.

Un tel procédé de fabrication permet de réduire les coûts de production dans la mesure où la quantité de sondes déposées par microtamponnage est très faible par rapport aux biopuces typiques. Par ailleurs, le microtamponnage est un procédé de fabrication peu coûteux et d'une grande productivité. De plus, la procuration d'éléments d'optique intégrés sous la forme de guides optiques formés dans le substrat du laboratoire permet de n'utiliser qu'une seule source d'excitation lumineuse (laser par exemple), et permet aussi d'utiliser un dispositif de lecture de la puce peu coûteux et de faible encombrement. Cela facilite l'utilisation du microlaboratoire d'analyse biologique en ambulatoire chez des patients. De tels microsystèmes trouveraient aussi de nombreuses applications dans des domaines comme la biodéfense, le diagnostic environnemental, etc.

En particulier, l'utilisation d'éléments microfluidiques et d'optique intégrés dans le substrat du microlaboratoire obtenu selon le procédé de l'invention permet d'automatiser et d'accélérer les différentes étapes de mise en oeuvre du microlaboratoire sur puce, qui peut alors être avantageusement considéré comme un élément jetable après chaque analyse.

Enfin, la miniaturisation de la surface des biopuces permet également d'augmenter très sensiblement la limite de détection de la ou des biopuces 2953741 -7-

déposées. Cette limite de détection est définie comme la quantité minimale de molécules cibles qu'il faut envoyer sur une puce pour obtenir un signal de fluorescence détectable physiquement. Plus la surface de la biopuce est faible plus la biopuce est sensible (limite de détection faible) à condition de 5 pouvoir envoyer les cibles biologiques à la surface de la biopuce. Dans la présente invention, cela est rendu possible et particulièrement avantageux par l'utilisation de techniques microfluidiques. Conformément à une caractéristique de l'invention, dans un plan horizontal parallèle au fond du canal microfluidique, la plus grande dimension 10 des n sondes individuelles est comprise entre 0,5 et 500 micromètres, et de préférence comprise entre 1 et 100 micromètres. Selon une autre caractéristique de l'invention, aux intersections où elles sont déposées, les sondes individuelles sont écartées les unes des autres d'une distance comprise entre 0,5 et 500 micromètres, et de préférence 15 entre 1 et 100 micromètres. Toujours selon le procédé de la présente invention, les n sondes individuelles sont déposées simultanément au fond du canal microfluidique par une seule passe de microtamponnage à l'aide d'un tampon comportant un motif unique. 20 En variante, les n sondes individuelles sont déposées une à une sur le fond du canal microfluidique par n tampons distincts, chaque tampon correspondant à une sonde déterminée et comportant tous les motifs de la sonde. En variante, les n sondes individuelles sont déposées une à une sur le 25 fond du canal microfluidique par un seul tampon dont la position est décalée relativement au substrat pour chaque sonde, le tampon étant décontaminé entre chaque sonde. Dans un mode de réalisation de l'invention, on dépose successivement lesdites sondes individuelles sur plusieurs substrats par microtamponnages 30 successifs desdits substrats repassés les uns après les autres pour déposer lesdites sondes.

En variante, les n sondes individuelles sont regroupées en sous-ensembles ; toutes les sondes d'un sous-ensemble sont déposées simultanément et les sous-ensembles sont déposés séquentiellement. Cette variante est particulièrement avantageuse lorsque l'on regroupe dans un sous-ensemble toutes les sondes correspondant à une biomolécule de composition donnée. De manière explicite, lorsqu'une sonde de composition donnée doit être tamponnée à plusieurs emplacements du substrat, il est avantageux de concevoir un tampon à plusieurs motifs permettant de tamponner tous les emplacements en une seule fois. La consommation en sonde en est réduite drastiquement puisqu'il est nécessaire de ne tamponner qu'une seule fois. Les risques de contamination sont réduits et enfin la vitesse de fabrication est élevée puisque l'on a réduit le nombre d'opérations de tamponnage nécessaires.

On peut également en variante déposer successivement lesdites sondes 15 sur plusieurs substrats selon l'une quelconque des variantes précédentes en ré-encrant si nécessaire le tampon.

Il est bien évident que les combinaisons des variantes précédentes font partie intégrante de l'invention.

Selon des caractéristiques préférées du procédé de l'invention :

20 - le motif unique du tampon présente une base de hauteur H et comporte au moins un plot d'impression formant une saillie de hauteur h par rapport à la base du tampon et de surface s (l'épaisseur totale du tampon est donc H+h), la hauteur h étant supérieure à la profondeur d du canal microfluidique dans lequel les sondes sont déposées ;

25 - la hauteur de la base H du tampon est comprise entre 10 pm et 10 mm, de préférence entre 100 pm et 1 mm et la hauteur h de ladite saillie est comprise entre 0,5 pm et 100 pm ;

- lors du microtamponnage on comprime le tampon, de façon à ce que la nouvelle hauteur h' de la saillie au cours de tamponnage soit supérieure ou 30 égale à la profondeur du canal microfluidique.

- selon une variante, le tampon d'impression comporte un corps de support rigide, notamment en silicium, avec une saillie, et une tête 2953741 -9- d'impression en PDMS, fixée à l'extrémité de ladite saillie, ladite tête étant de préférence sensiblement cubique ; la tête d'impression en PDMS présente une hauteur et une largeur comprises entre 0,5 et 500 micromètres, et de préférence comprise entre 1 et 100 pm ;

5 - le canal microfluidique présente une largeur comprise entre 1 pm et 1 mm et une profondeur comprise entre 1 pm et 1 mm ; et le canal microfluidique présente de préférence une largeur comprise entre 10 et 200 pm et de préférence une profondeur comprise entre 10 et 100 pm.

La présente invention concerne également dans un second objet un

10 procédé d'étalonnage d'un microlaboratoire biologique sur puce obtenu selon le procédé précédemment décrit. Ce procédé consiste essentiellement, au niveau d'au moins une intersection entre un canal microfluidique et un guide optique, à :

a. déposer par microtamponnage au moins un plot de sondes sl dans le fond du canal microfluidique à une intersection avec le guide optique, lesdites sondes si étant marquées par au moins un fluorophore en même quantité et étant inertes aux espèces présentes dans un échantillon biologique à tester par circulation dans le canal microfluidique, et b. déposer par microtamponnage au moins un plot de sondes s2 dans le fond du canal microfluidique du laboratoire à côté des/du plot(s) des sonde(s) si à l'intersection dudit canal avec le guide optique, lesdites sondes s2 étant destinées à réagir avec une molécule F* à identifier marquée d'un fluorophore, présente dans l'échantillon biologique à tester ; ladite molécule F* n'interagissant pas avec les sondes si et

c. déposer par microtamponnage au moins un plot de sondes s3 dans le fond dudit canal microfluidique, à côté des sondes si et s2, à l'intersection avec le guide optique, lesdites sondes s3 étant destinée à réagir avec au moins une molécule connue et de référence F2* marquée par un fluorophore présente ou introduite en quantité connue dans l'échantillon biologique à - 10 - tester, ladite molécule n'interagissant par avec les sondes s1 et s2 ni avec la molécule F* et

d. fermer le dispositif avec un couvercle.

On injecte ensuite dans le canal microfluidique l'échantillon biologique à tester pouvant comporter la molécule à identifier F* et dans lequel a été introduit la molécule de référence F2* et l'on injecte également une lumière excitatrice dans le(s) guide(s) optique. Les phénomènes suivants peuvent alors être observés :

- la détection de l'émission de fluorescence de la sonde si permet de confirmer la présence effective d'un signal lumineux d'excitation à l'emplacement de la biopuce :

- la détection de l'émission de fluorescence de la sonde s2 indique la présence effective de la cible F* dans le fluide biologique ;

- la détection de l'émission de fluorescence de la sonde s3 permet de confirmer l'écoulement de la molécule de référence F2* et donne une indication sur le bon fonctionnement du dispositif microfluidique.

Dans la description qui précède, il a été raisonné implicitement sur un ensemble de sondes s1, s2 et s3 disposées à l'intersection d'un seul canal microfluidique et d'un seul guide d'onde. II est bien entendu que les sondes si, s2 et s3 peuvent être réparties à plusieurs intersections de plusieurs canaux microfluidiques avec plusieurs guides d'onde. La réponse biologique de la puce pourra être avantageusement dérivée des comparaisons des niveaux de fluorescence de plots répartis à plusieurs intersections.

En effet, pour confirmer ou non la présence de la molécule cible F*, il est souvent nécessaire de tester son interaction possible avec un nombre entier w de sondes de type s2(z) de composition différentes avec z = 1 à w et w supérieur ou égal à 2. Pour détecter w interactions biomoléculaires possibles avec la cible, le dispositif peut alors avantageusement comporter : - une sonde si dupliquée w fois (si Z= là W)

- w sondes s2(z) avec z = 1 à w pour détecter w interactions biomoléculaires possibles et w supérieur ou égal à 2 ; -11- - une sonde s3 dupliquée w fois (s3 z= là w) ;

les sondes étant réparties à la surface du microlaboratoire sur puce en w triplets (si z= 1 à w, s2 z= 1 à w, s3 z= 1 à w) et disposées à une et/ou plusieurs intersections canal (aux) microfluidique(s) / guide(s) optique.

La lecture de la biopuce, à savoir la reconnaissance biomoléculaire proprement dite, consiste alors à mesurer la fluorescence émise par l'ensemble des w triplets (si Z= à w, s2 z= 1 à w, s3 z= là w) en comparant 2 à 2 le signal émis par les sondes s2z= 1 à w, Il est alors essentiel que les w sondes s2z= 1 à w soient éclairées par un signal d'excitation lumineux équivalent et qu'elles reçoivent une quantité équivalente de cibles à détecter. Cette double condition d'équivalence n'est pas facilement réalisable dans la pratique :

- en ce qui concerne l'optique intégrée : à cause des inhomogénéités de fabrication des guides d'onde, de répartition de la lumière d'excitation entre les guides, etc. - en ce qui concerne la microfluidique : à cause des inhomogénéités de fabrication des canaux microfluidiques, des différences d'acheminement et/ou de contrôle des fluides, etc.

C'est pourquoi, afin de compenser toutes ces causes d'erreur, dans le cas où w est supérieur ou égal à 2, le procédé d'étalonnage d'un microlaboratoire biologique sur puce selon selon l'invention prévoit également de façon avantageuse :

e. l'introduction du liquide biologique contenant :

- éventuellement la molécule recherchée F*

- au moins une molécule de référence F2* en quantité connue. f. l'injection du faisceau lumineux d'excitation dans le guide optique.

g. la détection et la mesure à l'aide d'un dispositif optique dont la

résolution permet la séparation spatiale d'au moins deux sondes

consécutives de l'intensité du signal de fluorescence émis par chacun des plots de tous les triplets (si Z= i à w, s2 Z=1 à w, s3 z=1 à w)• - 12 - h. la comparaison 2 à 2 de la fluorescence émise par les plots (si z= 1 à w, s2 z= 1 à w, s3 z= 1 à w) et (s1 z= 1, s2 z= 1, s3 z= 1).

De façon avantageuse, le procédé d'étalonnage de la présente invention prévoit également de corriger les différences de variation d'intensité lumineuse incidente en se servant comme référence de la fluorescence émise par les plots sl z= 1 à w, de chaque triplet ; ainsi que les différences de débit microfluidique en se servant comme référence de la fluorescence émise par les plots s3 z= là w de chaque triplet.

D'autres caractéristiques de l'invention ressortiront de la description 10 détaillée qui va suivre, réalisée en référence aux figures annexées parmi lesquelles :

- la Figure 1 représente, grossie 100 fois, une jonction de 2 canaux microfluidiques croisés dans un laboratoire biologique réalisé selon le procédé de l'invention, le laboratoire présentant également une série de

15 guides optiques perpendiculaires au canal microfluidique de séparation ;

- la Figure 2A représente une puce biologique à 9 sondes réalisée à l'intersection d'un canal microfluidique et d'un guide lumineux intégré au substrat d'un laboratoire sur puce obtenu selon le procédé de l'invention ;

- la Figure 2B représente une puce biologique à 9 sondes répartis à 2

20 intersections d'un canal microfluidique avec deux guides d'onde optique.

- les Figures 3A à 3C représentent schématiquement le principe de microtamponnage de sondes biologiques sur un substrat plan ;

- les Figures 4A et 4B représentent schématiquement le

microtamponnage d'une sonde biologique au fond d'un canal microfluidique 25 formé dans un substrat dans le cadre du procédé selon l'invention ;

- les Figures 5A et 5B représente schématiquement le principe de

microtamponnage avec un tampon Si/PDMS à haut facteur de forme pour la

mise en oeuvre du procédé de l'invention ;

- la Figure 6 représente un premier mode de réalisation d'un 30 laboratoire sur puce obtenu conformément au procédé selon l'invention ; -13- - la Figure 7 représente un exemple de mise en oeuvre d'un procédé d'étalonnage d'un laboratoire biologique sur puce du type représenté à la Figure 6. La présente invention propose un nouveau procédé de fabrication de microlaboratoires d'analyse biologique sur puce.

Conformément à ce procédé, on réalise dans une première étape au moins un composant d'optique intégrée, en pratique un canal de guidage lumineux, dans un substrat support dans lequel on souhaite réaliser un laboratoire biologique.

Cette première étape est réalisée de préférence, dans le cadre de l'invention, dans un substrat de verre par une méthode d'échange d'ions dans un bain de sels fondus maintenu à une température élevée. Le choix du verre comme substrat est privilégié dans le cadre de l'invention car il présente l'avantage d'être transparent, isolant, biocompatible et peu cher. La

surface peut être contrôlée chimiquement de manière répétable. Grâce au développement de l'optoélectronique et de la microélectronique, la technologie de fabrication des composants d'optique intégrée et les techniques de micro-intégration sur verre sont aujourd'hui bien maîtrisées.

Néanmoins, il est possible de réaliser des microlaboratoires sur puce

dans d'autres matériaux que le verre avec des guides d'onde et des composants optiques intégrés. Il est possible aussi de mettre en oeuvre des microlaboratoires sur puce constitués de couches de différents matériaux. Par exemple, on peut réaliser de tels dispositifs avec du PDMS (Polydiméthylesiloxane), ou encore du COC (CycloOléfine Copolymère) ou

encore en intégrant des guides d'ondes InGaN (Nitrure de Gallium-Indium) dans du silicium.

Dans ce qui suit, nous allons détailler à titre d'exemple le mode de

fabrication des microlaboratoires en verre avec guide d'ondes optiques

obtenus par échange d'ions. Notons qu'il est possible d'intégrer à de tels 30 dispositifs des microcomposants constitués d'un autre matériau. On peut, par

exemple, introduire des microvannes fluidiques en PDMS dans un dispositif

en verre. - 14 - Selon le mode de réalisation préférentiel, la fabrication des guides optiques dans les substrats de verre relève d'un échange d'ions s'effectuant entre les ions sodium (Na+) présents dans le substrat de verre et ceux présents dans un bain de sels fondus comportant des ions de potassium K+ ou d'argent Ag+ à une température d'environ 380°C. Ce traitement induit un changement local de la composition chimique du substrat de verre qui se traduit par une augmentation de l'indice de réfraction du verre, permettant ainsi de réaliser un guide lumineux tel qu'un guide optique simple, des connections ou une jonction Y.

Après réalisation, les composants optiques réalisés sont soumis à des caractérisations optiques rigoureuses.

On forme ensuite dans une seconde étape au moins un canal

microfluidique sur une face du substrat de verre, ledit canal microfluidique

intersectant au moins le ou les canaux de guidage lumineux formé à l'étape 15 précédente. Pour réaliser ce canal microfluidique, on nettoie dans un premier temps la surface du substrat dans laquelle on souhaite former le canal microfluidique, par exemple à l'aide d'une solution de type "piranha". On dépose ensuite un masque métallique en chrome et une résine photosensible

20 sur la face nettoyée, puis on procède à une étape de photolithographie suivie d'une première étape de gravure de façon à constituer des ouvertures sur la résine, suivie d'une deuxième étape de gravure humide à travers les ouvertures dans la couche de chrome à l'aide d'une solution à base d'acide chlorhydrique, suivie d'une nouvelle étape de gravure humide du verre à

25 l'aide d'une solution d'acide fluorhydrique, puis enfin une étape d'enlèvement de la couche de chrome afin de dégager le verre, par exemple avec de l'eau régale. Pour finir, on perce le cas échéant des trous dans le verre par exemple avec des forets diamantés spéciaux. Ces trous ont notamment pour fonction d'amener les fluides. Selon des variantes connues de l'homme de

30 l'art, on procède non pas à des gravures humides mais pour certaines étapes à des gravures sèches. - 15 - Une fois le canal microfluidique formé, celui-ci intersecte le ou les guides lumineux formés au préalable à la perpendiculaire, comme représenté sur la Figure 1.

Sur cette Figure 1, qui est une image grossie 100 fois d'une portion d'un laboratoire biologique sur puce obtenu selon le procédé de l'invention, on distingue un canal microfluidique principal 1 s'étirant perpendiculairement à un canal microfluidique 2 secondaire ainsi qu'à huit guides lumineux 3. Les canaux microfluidiques 1, 2 et les guides lumineux 3 sont formés tels que précédemment décrits dans la masse d'un substrat 4 de verre. Les canaux microfluidiques 1, 2 présentent une largeur de l'ordre de 20 pm et les guides lumineux 3 une largeur de l'ordre de 2 à 10 pm.

Après avoir formé au moins un guide lumineux 3 et au moins un canal microfluidique 1 intersectant ce guide lumineux, on dépose ensuite dans une troisième étape, comme représenté sur la Figure 2A, au moins une puce biologique 5 au fond du canal microfluidique 1 au niveau d'au moins une intersection 6 de celui-ci avec un canal de guidage lumineux 3. De façon caractéristique du procédé de l'invention et tel que représenté sur la Figure 2A, la puce biologique 5 formée comporte n plots 7 individuels formés distinctement les uns des autres, et de façon ordonnée sur le fond du canal microfluidique 1, n étant un nombre entier. Dans l'exemple représenté sur la Figure 2A, la biopuce, ou puce biologique, 5 comporte donc neuf sondes 7 individuelles.

Dans la Figure 2B, selon une variante, les neufs sondes 7 de la biopuce 5 sont réparties à deux intersections 6. Bien entendu, on peut également envisager de répartir les neuf sondes 7 sur un nombre plus important d'intersections 6 entre le canal microfluidique 1 et les guides d'ondes lumineux 3.

De façon très générale et théorique, il peut y avoir un nombre entier (i,j) de guides d'onde lumineux 3 et de canaux microfluidiques 1 différents sur chaque substrat de verre 4, ainsi qu'un nombre entier nk de sondes 7 à chaque intersection 6 entre un dit guide d'onde lumineux 3 et un dit canal microfluidique 1, avec k=1 à i x j et nk= 1 à n si l'on considère que chaque - 16 -

guide d'onde 3 ne coupe un canal microfluidique 1, 2 qu'une seule fois et qu'il y a au moins une sonde 7 à chaque intersection 6. Les n sondes biologiques 7 sont déposées au fond du canal microfluidique 1 par microtamponnage. Cette technique de dépôt des sondes biologiques 7 s'avère particulièrement originale et même essentielle dans le cadre de l'invention. En effet, dans l'état de la technique, les puces biologiques sont traditionnellement fabriquées sur des substrats plans (silicium, lame de microscope, polymère). Elles sont formées en général de plots ou sondes de 30 à 300 pm de diamètre, séparés d'un pas de 60 à 600 pm. Chaque plot forme une sonde biomoléculaire greffée (ADN, oligopeptides, anticorps, protéines) dont la composition est parfaitement définie. Cette composition des sondes biomoléculaires peut varier d'un plot à l'autre mais elle est unique pour chaque plot.

Les méthodes connues de fabrication de puces biologiques sur substrat plan reposent à ce jour essentiellement sur l'adressage des sondes par voie fluidique, photochimique, par projection, ou encore par microscopie à force atomique. Ces techniques de fabrication de sondes ne sont cependant pas adaptées au dépôt de sondes biologiques au fond de canaux microfluidiques. En effet, la technique de microscopie à force atomique est à exclure en raison du risque important de détérioration de la pointe de détection du dispositif lors du dépôt à l'intérieur d'un canal. Les méthodes de dépôt par projection sont quant à elles limitées à des 25 adressages de réactifs de l'ordre du picolitre soit au mieux d'un diamètre de goutte de 30 pm, donc plus large que la largeur du canal microfluidique 1 et des guides d'ondes lumineux 3 formés dans le substrat 4 de verre suivant le procédé de l'invention. Le dépôt de sondes biologiques au fond d'un canal microfluidique par 30 voie uniquement fluidique, ou combinée avec une activation photochimique locale n'est pas compatible avec la nécessité d'un dépôt précis et ordonné de - 17 - plusieurs sondes les unes à côté des autres, sans contamination entre elles, sur une très faible surface de plot comme proposé par l'invention.

La technique de microtamponnage ne présente de limites techniques au dépôt de sondes microscopiques dans un canal microfluidique ; au contraire le microtamponnage consomme très peu de sondes comparativement aux autres méthodes, sa résolution est très grande (limite connue de l'ordre de 50 nm) et il est facile de tamponner aussi bien un nombre très faible qu'un nombre très important de sondes avec une machine de tamponnage telle que par exemple la machine décrite dans la demande de brevet français FR 2922813 Al, déposée par les inventeurs, le tout de façon très rapide.

La technique de microtamponnage est décrite ci-après en référence aux Figures 3A à 3C, puis plus en détail quant à sa mise en oeuvre concrète dans le cadre de la présente invention en référence aux Figures 4A, 4B et 5.

Les Figures 3A à 3C représentent schématiquement le principe de microtamponnage de sondes biologiques Sb sur un substrat plan P à l'aide d'un tampon T comportant un nombre de motifs M de dépôt égal au nombre de sondes Sb à déposer sur le substrat. Pour effectuer le dépôt des sondes Sb, on encre dans un premier temps le tampon T, et plus particulièrement ses motifs M d'une nano-encre chimique ou biologique destinée à former les sondes Sb sur le substrat plan P, puis on vient apposer lesdits motifs M du tampon T sur une face plane du substrat P avec une pression déterminée suffisante pour effectuer un transfert de l'encre chimique ou biologique enduite sur le tampon T sur la surface supérieure du substrat P. Après retrait du tampon T, les sondes Sb sont déposées les unes à côtés des autres avec un écartement déterminé sur la surface du substrat P, formant ainsi une biopuce biologique.

De façon générale là encore, beaucoup de cas de figures différents

peuvent être envisagés et mis en oeuvre pour ce qui concerne la forme du 30 tampon et/ou son utilisation. En particulier, on peut jouer en fonction du

tampon utilisé sur : -1s- - le nombre de sondes tamponnées en même temps si le tampon comporte plusieurs motifs d'impression,

- la nature des sondes tamponnées en même temps lorsque le tampon comporte plusieurs motifs d'impression.

Il est également possible de déposer une seule sonde par coup de tamponnage ou plusieurs sondes avec un tampon muni de plusieurs motifs de sondes par exemple.

Il est également possible d'envisager la mise en oeuvre de plusieurs tampons pour les différentes sondes déposées ou encore de mettre en oeuvre un seul tampon en le nettoyant entre chaque dépôt de sondes de nature différente. Dans ce cas, la mise en oeuvre de plusieurs tampons est grandement facilitée par l'utilisation d'une machine de microtamponnage comme celle décrite dans la demande FR 2922813 Al (alignement facile des coups de tampon les uns par rapport aux autres). De même la machine est prévue pour tamponner facilement une série de substrats, ce qui autorise une production importante de microlaboratoires.

Il convient également de considérer la possibilité d'effectuer un mouvement relatif du tampon par rapport au substrat entre chaque coup de tampon.

Pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention, les inventeurs ont déterminé qu'il est préférable de prévoir autant de tampons que de sondes 5 de composition différente à tamponner, puis de tamponner une série de substrats 4 en changeant de tampon à chaque fois si l'on ne dispose que d'une machine ou, si l'on dispose d'autant de machines que de sondes 5 à tamponner, tamponner tous les substrats 4 en ligne sur un tapis roulant. L'avantage est que l'on réduit le nombre d'encrage à effectuer sur un tampon, ce qui réduit la consommation en sonde. Il convient de plus de noter que les tampons doivent être nettoyés entre chaque phase d'encrage avec une sonde différente pour éviter toute contamination ; la méthode précédente permet donc de réduire le nombre de lavage d'un tampon.

Le microtamponnage mis en oeuvre dans le cadre du procédé de l'invention relève du principe général décrit ci-avant mais adapté aux - 19 - exigences de dimensionnement réduit des sondes 5 déposées et de leur écartement au fond d'un canal microfluidique 1 de quelques micromètres de largeur et de profondeur.

Les Figures 4A et 4B représentent un mode de microtamponnage de sondes biologiques développé et mis en oeuvre dans le cadre du procédé de l'invention pour par exemple, comme représenté sur la Figure 2A ou encore la Figure 6, réaliser une puce biologique 5 à neuf sondes biologiques 7 individuelles et de compositions différentes.

Trois solutions sont principalement envisageables pour réaliser une telle puce 5 par microtamponnage. La première solution consiste à déposer simultanément les neuf sondes au fond du canal microfluidique 1 en une seule passe de tamponnage à l'aide d'un tampon comportant neuf motifs distincts comme le tampon des Figures 3A et 3B, les neuf motifs étant encrés individuellement avant tamponnage avec une encre adaptée pour réaliser un type de sonde particulier.

La deuxième solution consiste à prévoir 9 tampons et à encrer chaque tampon avec une sonde différente puis à procéder à 9 coups de tamponnage par substrat.

La troisième solution envisagée pour réaliser une puce biologique à l'intersection d'un canal microfluidique 1 et d'un guide d'onde lumineux 3 conformément à l'invention consiste à utiliser un tampon à motif unique pour déposer une seule sonde 7 à la fois et procéder à 9 coups de tamponnage successifs pour chacune des sondes 7 différentes, le tampon étant décalé d'une distance appropriée à chaque coup de tampon. Cette solution est possible lorsque le motif à réaliser est le même pour toutes les sondes. Les difficultés résultent alors principalement de la précision nécessaire à la mécanique de déplacement et d'application du tampon au fond du canal microfluidique pour respecter l'écartement entre chacune des sondes constituant la puce.

Cette solution, est décrite à titre d'exemple plus en détail ci-après en référence aux Figures 4A et 4B. - 20 - Sur les Figures 4A et 4B est représenté schématiquement un dispositif de microtamponnage 8 destiné à déposer des sondes biologiques 7 dans au moins un canal microfluidique 1 d'une largeur d' comprise entre 1 pm et 1 mm, de préférence de l'ordre de 10 à 200 pm, et d'une profondeur d de l'ordre de 1 pm à 1 mm, de préférence comprise entre 10 et 100 pm, formé dans un substrat de verre 4 par l'intermédiaire d'un tampon 9 à motif d'impression 10 unique.

Le dispositif 8 de microtamponnage est stabilisé sur un plan horizontal X, Y et comporte une table 11 de support du substrat et un porte-tampon 12 parallèles entre eux et avec le plan X, Y et mobiles relativement l'un à l'autre selon une direction verticale Z. Le tampon 9 est fixé sur le porte-tampon 12 sans aucun degré de liberté. Il est composé de préférence d'un élastomère tel que du PDMS et comporte un unique motif d'impression 10 s'étendant en saillie sur sa surface d'application 13. La surface s du motif d'impression 10 correspond à la surface d'une sonde 7 de la puce biologique 5 à former au fond du canal microfluidique 1.

Le porte-tampon 12 est constitué d'une plaque 14, par exemple rectangulaire, d'un matériau rigide tel que de l'aluminium ou de l'acier et est monté solidaire d'un mécanisme de translation suivant la direction verticale Z de manière à pouvoir effectuer des mouvements d'application de haut en bas et de retrait de bas en haut du tampon dans le canal microfluidique 1 sur le substrat. Le mécanisme de translation, non représenté sur les Figures 4A, 4B peut notamment comporter un chariot monté coulissant sur des rails verticaux fixés solidement sur un châssis du dispositif 8 de microtamponnage reposant sur le plan horizontal X, Y. Ledit chariot peut être mobilisé le long desdits rails par tout système mécanique ou hydraulique par exemple permettant un déplacement à vitesse et puissance de déplacement contrôlées, et donc de pression d'application du tampon, déterminées.

La table 11 de support du substrat 4 est quant à elle également constituée d'une plaque 15 de matériau rigide tel que de l'aluminium ou l'acier, ou encore une céramique par exemple. Elle est par ailleurs déplaçable en translation dans le plan X, Y par des actionneurs micrométriques (non -21- représentes) afin de pouvoir positionner le substrat 4 sous le motif d'impression 10 du tampon 9 en différentes positions afin de réaliser la puce 5 multisondes souhaitée. De manière avantageuse, lorsque le tampon comporte plus d'un motif, des rotations peuvent être prévues pour aligner plus facilement le tampon avec les canaux microfluidiques du substrat.

La table 11 de support du substrat 4 est également montée réglable en hauteur sur des butées 16 réglables à vis.

Les butées 16 ont une fonction propre de butées d'arrêt du porte-tampon 12 comme cela ressort particulièrement de la Figure 4B. En effet, les butées 16 réglables comportent chacune une tige verticale formée d'une vis micrométrique 17 qui s'étend en saillie selon une direction parallèle à l'axe Z au travers de la table 11 de support du substrat. La partie des vis 17 s'étendant en saillie au dessus de la paroi supérieure de la table 11 de support présente une hauteur D supérieure à l'épaisseur du substrat 4. Cette hauteur D dépend bien entendu de la hauteur de réglage de la table 11 de support du substrat. En pratique, cette hauteur D détermine la hauteur de réglage de la table de support 11. En effet, D est choisie de sorte que le porte-tampon 12 vienne appuyer en butée sur les extrémités 18 des tiges des butées réglables 16 lors de l'application du tampon 9 au fond du canal microfluidique 1 du substrat 4 et donc de la descente du porte-tampon 12. Cet appui du porte-tampon 12 en butée sur l'extrémité supérieure des butées 16 n'intervient avantageusement qu'après un très léger écrasement du motif d'impression 10 du tampon 9 dans le canal microfluidique 1 mais sans contact de la surface d'application du tampon contre la surface supérieure du substrat 4, comme représenté sur la Figure 4B. Grâce à cet arrangement de butées 16, il est possible de régler très précisément la pression d'application du tampon 9 dans le canal microfluidique 1.

Les butées 16 ont donc une double fonction : elles servent de butées d'arrêt du porte-tampon et elles permettent de contrôler la pression appliquée sur le tampon.

Pour un canal microfluidique 1 de profondeur d suffisante pour un bon écoulement de fluides (par exemple un profondeur de l'ordre de 10 pm), il - 22 - faut utiliser un tampon 9 dont le motif d'impression 10 présente une hauteur h supérieure à la profondeur d (soit par exemple h = 15 pm) et comprimer le tampon de façon à ce que la nouvelle hauteur h' de la saillie soit supérieure ou égale à d pour ne déposer la sonde 7 qu'au fond du canal 1 (soit par exemple h' = 12,5 pm). Ainsi, même si toute la surface du tampon est entièrement encrée avec la sonde, un espacement est aménagé entre le tampon et le substrat en dehors du motif d'impression, de sorte que le transfert de l'encre n'est assuré qu'au contact du motif avec le fond du canal.

De façon connue dans le domaine du microtamponnage, il est nécessaire que la largeur s du motif d'impression 10 soit sensiblement égale à sa hauteur h faute de quoi le motif d'impression est écrasé lors du contact. Autrement dit, si le motif d'impression 10 est trop haut, le tampon 9 en élastomère ne conserve pas sa forme lors de l'application et il s'effondre. C'est notamment le cas, si l'on veut une sonde 7 de surface 1 pm2 avec h égal à 15 pm.

Ce réglage est d'autant plus difficile que :

- le canal 1 est profond (h grand), ce qui est nécessaire pour un bon écoulement des fluides, et que

- la surface des sondes 7 de puce est faible, ce qui est utile pour une 20 bonne sensibilité.

Pour vaincre ces contraintes contradictoires, selon une variante avantageuse, les inventeurs proposent dans le cadre du procédé de la présente invention d'utiliser un tampon 9' dur, en silicium par exemple, et comportant, au niveau de l'extrémité du motif d'impression 10 et de hauteur 25 h"1, une tête d'impression 19 de PDMS sensiblement cubique et de hauteur h"2, comme représenté schématiquement sur la Figure 5 A. Ainsi, il est possible de tamponner n'importe quelle sonde biologique 7 au fond d'un canal microfluidique 1 par microtamponnage à l'air sans subir les limites structurelles précédemment évoquées pour les motifs 10 de tampon 30 intégralement en PDMS (Figure 5 B). Un tel tampon 9' de nature "mixte" ne peut pas s'effondrer dans la mesure où seule la tête d'impression 19 du motif du tampon est constituée d'élastomère. La hauteur h"2 de la tête - 23 - d'impression 19 de PDMS peut ainsi être réduite à 1 pm et sa largeur également, même si la hauteur totale h" du motif est elle de 15 pm ou plus. De façon générale, la tête d'impression 19 en PDMS peut présenter une hauteur et une largeur comprises entre 0,5 et 500 pm, et de préférence comprise entre 1 et 100 barn

Il est ainsi possible de déposer des sondes biologiques de 1 à 5 pm de large dans un canal microfluidique d'une largeur de 30 pm environ avec un écartement approprié de 1 à 5 pm entre chaque sonde pour former par exemple une puce biologique à 9 sondes comme représenté sur la Figure 2 ainsi que sur la Figure 6 qui représente un laboratoire biologique sur puce tel qu'obtenu par mise en oeuvre du procédé de l'invention.

Sur la Figure 6, le laboratoire comporte un canal microfluidique 1 qui intersecte trois guides d'ondes lumineux 3 orientés perpendiculairement au canal microfluidique 1. Ces guides lumineux 3 sont parallèles entre eux et se rejoignent tous trois à leur entrée pour former un guide d'introduction 20 d'un faisceau laser d'excitation E.

A l'intersection 6 de chaque guide d'onde lumineux 3 avec le canal microfluidique 1 est formé une biopuce 5 composée de 9 sondes biologiques 7 déposées les unes à côté des autres au fond du canal microfluidique 1 par microtamponnage à l'aide d'un dispositif 8 et d'un tampon 9, 9' tels que décrits aux Figures 4A, 4B et 5. Chaque sonde 7 de chaque biopuce 5 formée présente une largeur comprise entre 1 à 5 pm2, et lesdites sondes sont également séparées entre elles d'une même distance comprise entre 1 et 5 pm.

Une telle configuration de laboratoire biologique à puce présente l'avantage d'être plus sensible que les biopuces à sonde unique. En effet, la limite de détection de chacune des biopuces est plus basse car la surface de la puce est réduite à l'aire de l'intersection canal microfluidique-guide d'onde.

Une fois la ou les sondes 7 constituant la ou les biopuces 5 du laboratoire réalisé déposée(s) par microtamponnage, il convient pour terminer le laboratoire de refermer le canal microfluidique 1 et pour ce faire on dépose une couverture de fermeture sur la face du substrat de verre dans - 24 - laquelle le canal microfluidique a été formé. Une telle couverture de fermeture peut notamment être constituée, par exemple, d'une lame de verre collée sur la surface supérieure du microlaboratoire ou encore une plaque en polymère COC, ou de PDMS.

La présente invention propose également un procédé d'étalonnage optique des biopuces 5 tamponnées à l'intérieur du ou des canaux microfluidiques 1 des laboratoires fabriqués.

La calibration optique consiste principalement à évaluer la réponse en fluorescence des sondes 7 de type s2 des biopuces 5 déposées dans les canaux microfluidiques 1 au regard de sondes étalons de type s1* connues, disposées à coté de sondes sl, pour ensuite pouvoir lors des analyses effectuées corriger les variations d'énergie excitatrice incidente sur les sondes s2.

Cette calibration doit pouvoir notamment prendre en compte les points 15 suivants :

1) La puissance de la lumière excitatrice qui arrive sur une sonde donnée peut varier entre une biopuce et une autre.

2) La puissance de la lumière excitatrice n'est pas identique sur les différentes sondes d'une même biopuce.

20 De plus, même si, sur une sonde donnée, la lumière excitatrice est la même entre une biopuce et une autre, il n'est pas évident que toutes les sondes de la deuxième biopuce reçoivent la même proportion de lumière que dans la première biopuce.

Il faut donc que les différences du signal d'excitation de fluorescence de 25 sondes soient corrigées entre les différentes biopuces, ainsi qu'entre les sondes d'une même biopuce.

Comme cela a précédemment été exposé, les sondes biologiques constituant la ou les biopuces déposées dans un canal microfluidique d'un laboratoire d'analyse biologique sur puce réalisé selon la présente invention

30 sont localisées à au moins une intersection entre un guide d'onde lumineux et le canal microfluidique. - 25 - Les guides optiques sont reliés à leur entrée à une source lumineuse laser destinées à exciter les sondes biologiques. Un dispositif optique, comportant de préférence un capteur optique de type CCD très sensible et de très haute résolution spatiale et dont l'axe optique est perpendiculaire à la surface de la ou des sonde(s) biologiques permet de détecter la fluorescence émise par les sondes pour en établir un signal d'analyse exploitable.

Selon une variante, le capteur CCD du dispositif optique peut être remplacé par des photodiodes (ou autre capteur optique équivalent discret) qui seront disposées en regard des intersections entre les guides optiques et les canaux microfluidiques. Des microlentilles peuvent alors être disposées dans la lame de verre fermant le laboratoire et disposées en regard des photodiodes de façon à collecter avec efficacité la fluorescence émise. Le couvercle et les microlentilles peuvent par exemple être fabriqués de manière très économique dans du polymère COC de façon à former avec le laboratoire un dispositif jetable. Les photodiodes peuvent par exemple être fabriquées dans un substrat silicium, qui peut faire partie ou pas du dispositif jetable. Des filtres optiques de filtration travaillant dans la gamme de longueurs d'onde de fluorescence des fluorophores sont aussi prévus.

Le procédé d'étalonnage et de mesure de la présente invention va être décrit ci-après en référence à la Figure 7, qui représente à titre d'exemple une biopuce comportant 2 triplets de plots déposées au fond d'un canal microfluidique, à deux intersections consécutives dudit canal microfluidique avec deux guides d'onde lumineux, soit (sil, s21, s31) et (six, s2x, s3x).

Les sondes si (si x= 1 à w) sont destinées à la calibration du laboratoire et du dispositif optique de mesure (la Figure 7 correspondant au cas w=2). Ces sondes s1 sont marquées avec une même quantité d'un fluorophore déterminé qui donne toujours une réponse quand il est excité par un faisceau laser transmis par les guides d'onde lumineux. La molécule marquée par un fluorophore, qui est utilisée pour réaliser les sondes si, ne rentre pas en réaction avec les produits chimiques qui sont injectés dans le canal microfluidique. Les signaux de fluorescence émis par les sondes si dépendent donc uniquement de l'intensité locale du signal lumineux - 26 - d'excitation. En mesurant l'intensité du signal de fluorescence émis par les sondes si, (si z= 1 à w) on détermine ainsi quantitativement une valeur d'intensité du signal d'excitation, qui arrive sur tous les plots d'un même voisinage.

Les sondes s2 (s2 z= à w,) comportent par exemple des sondes connues d'ADN sensibles à des cibles d'ADN F* dont on souhaite déterminer la présence. Les cibles en question se trouvent dans une solution de fluide biologique à tester, provenant par exemple d'un sérum sanguin. Le fluide biologique est traité, de préférence, par des microdispositifs fluidiques intégrés au microlaboratoire sur puce, de façon à marquer les cibles F* avec un fluorophore (par exemple le même fluorophore qui a servi à marquer les sondes si).

Lorsque la solution à tester est injectée dans le canal microfluidique, les cibles F* marquées du fluorophore sont piégées par les sondes s2 z= là w. En conséquence, l'une (ou plusieurs) sondes s2 z= i à w émet(ent) un signal de fluorescence, ce qui permet d'identifier la cible. Si les sondes s2 (s2 z= i à w) n'émettent pas de signal de fluorescence, cela signifie que les cibles correspondantes ne sont pas ou plus présentes dans la solution testée.

Les sondes s3, (s3 z= à w), quant à elles sont utilisées, comme les sondes si, (si z= 1 à w), pour étalonner le système de mesure. Elles comportent toutes une molécule, par exemple une sonde d'ADN, différente des sondes si, (si z= 1 à w), et s2, (s2 z= i à w), qui ne correspond pas à un ADN que l'on souhaite identifier dans la solution testée. Au contraire, une cible ADN complémentaire des sondes s3, (s3 z= i à w), est ajoutée dans une concentration bien définie dans la solution testée et injecté avec elle dans le canal microfluidique. Cette cible complémentaire des sondes s3, que l'on peut appeler d'étalonnage, est également marquée avec un fluorophore. Dans le cas d'une biopuce idéale, les sondes s3, (s3 z= 1 à w), devraient donner le même signal de fluorescence aux deux intersections du canal microfluidique avec les guides d'onde lumineux. Il existe cependant de nombreuses raisons pour que cela ne soit pas le cas. - 27 - Les sondes si, (si i= 1 à w), sont sensibles à l'intensité locale de la lumière excitatrice, qui peut varier en raison de fluctuation du laser, d'imperfection d'injection de la lumière laser dans les guides d'onde lumineux, d'imperfections des jonctions Y qui divise les guides d'onde lumineux etc... Les sondes s3, (s3 i= à w), sont, elles, sensibles à des non-uniformités «microfluidiques» dans le canal (uniformité du mélange, variation de concentration locale des antigènes dans la longueur du canal, différences de débits entre deux canaux microfluidiques etc....).

On considère ensuite les valeurs I11, I21 et I31 de fluorescence émise respectivement par les plots si1, s21 et s31 de l'intersection 61, et les valeurs Iii, Ili et I3 de fluorescence émise par les plots s1i, s2i et s3i de l'intersection 6Z. Une comparaison des niveaux d'interaction biomoléculaire de la cible F* avec les sondes s21 et s2i donne une information sur la composition de la sonde. Cette reconnaissance peut néanmoins être faussée par une différence de lumière incidente et/ou de quantité de matière passant sur les plots.

Nous allons ci-dessous décrire la calibration d'un microlaboratoire sur puce qui comporte à titre d'exemple un nombre w de triplets des sondes.

L'étalonnage des triplets comporte logiquement trois étapes.

Dans une première étape, on vérifie l'uniformité de la lumière excitatrice qui arrive sur chacun des w triplets. Des non-uniformités de lumière incidente sur les triplets sont détectées par leur répercussion sur la non uniformité de l'intensité de fluorescence émise par les plots si i= là w, les valeurs I1 i= i à w, qui ne sont pas égales.

En prenant comme référence le premier triplet, on peut calculer, les rapports : I1 i= 1 à w / I11. Différents critères de qualité peuvent être introduits par l'utilisateur, concernant l'uniformité de la lumière excitatrice. On considère dans le cadre de l'invention comme corrigeables les résultats obtenu avec les rapports I1 i= là w / I11 situés dans la gamme de 10 à 0,1, de préférence entre 2 et 0,5. En d'autres termes, si au moins un des rapports I1 i= là w / I11 est supérieur à 10 ou inferieur à 0,1, le microlaboratoire sur puce est considéré comme non-utilisable. Si les rapports I1 i= 1 à w / I11 sont - 28 -

tous dans la gamme de 10 à 0,1, les résultats d'analyse peuvent être corrigés, comme cela sera expliqué ci-dessous. Ensuite, dans une seconde étape, on vérifie l'uniformité « microfluidique » de flux des molécules qui arrivent sur chacun des w triplets. Différents critères de qualité peuvent aussi être introduits par l'utilisateur, concernant l'uniformité « microfluidique » des microlaboratoires sur puce. En prenant comme référence la sonde s3 de la première rangée de plots, c'est-à-dire, la sonde s31 sur la Figure 7, on peut calculer le rapport I3 Z= à w / I31. Ce rapport exprime la non-uniformité « microfluidique ». Les résultats considérés comme corrigeables couvre la gamme des rapports I3 Z= 1 à w / I31 compris entre 10 et 0,1. En d'autres termes, si au moins un rapport I3 z= 1 à w / I31 est supérieur à 10 ou inferieur à 0,1, le microlaboratoire sur puce est considéré comme non utilisable. Si en revanche les rapports I3 Z= à w / I31 sont tous dans la gamme de 10 à 0,1 (de préférence dans la gamme de 2 à 0,5), les résultats d'analyse peuvent être corrigés. Une dernière étape consiste à corriger la valeur du niveau de fluorescence I2 Z=1 à w mesurée.

La calibration a pour objectif de corriger les niveaux de fluorescence I2Z=2àw par rapport à I21. Pour ce faire on définit I2CORZ=1 à w comme étant la valeur du niveau de fluorescence du plot s2Z=1 à w après correction (avec comme cas particulier I2COR1 = I21 ; ce qui revient à étudier la réponse de la puce en prenant comme référence relative le premier triplet). L'objectif de la calibration est de déterminer les w-1 valeurs I2CORZ=2àw à partir des données expérimentales, c'est-à-dire les niveaux de fluorescence des plots de tous les triplets. Le procédé de calibration selon l'invention consiste à prendre comme 30 valeur corrigée du niveau de fluorescence du plot s2Z du triplet (si, s2, s3)Z pour z variant de 2 à w, la valeur suivante : I2CORz=2àw=(Iiz=2àw/Ili)x(I3z=2àw/I31)xI2z=2àw -29- Les exemples qui vont suivre permettent une meilleure compréhension du principe de calibration selon l'invention.

Exemple 1 : le triplet 2 reçoit deux fois plus de lumière excitatrice que le triplet 1. Niveau de fluorescence mesuré sur chaque plot Plot 1 Plot 2 Plot3 Triplet 1 111 =0 ,5 121 = 2 131 = 1 Triplet 2 112= 1 122= 1,5 132= 1 Le niveau de fluorescence corrigé I2COR2 du plot 2 du triplet 2 est donc I2COR2 = (1 /0,5) x (1 / 1) x 1,5 = 3 et non plus 1,5.

Ainsi après correction, le niveau de fluorescence du plot 2 du triplet 2 est supérieur et non pas inférieur au niveau de fluorescence du plot 2 du triplet 1. Cela revient à inverser la réponse de la puce. Exemple 2 : le triplet 2 reçoit deux fois moins de produit biologique que le triplet 1 et la réponse des plots 2 est apparemment la même. Niveau de fluorescence mesuré sur chaque plot Plot 1 Plot 2 Plot3 Triplet 1 I11=1 I21=2 I31=2 Triplet 2 I12=1 I22=2 I32=1 Le niveau de fluorescence corrigé I2COR2 du plot 2 du triplet 2 est donc I2COR2 = (1/1)x(1/2)x2 = 1 et non plus 2. Ainsi le niveau de fluorescence du plot 2 du triplet 2 doit être divisé par 20 deux pour tenir compte de la variation de débit microfluidique. Exemple 3: Niveau de fluorescence mesuré sur chaque plot Plot 1 Plot 2 Plot3 Triplet 1 I11=0,5 I21=0,5 I31=3 Triplet 2 I12=0,25 I22=1 I21=1,5 Le niveau de fluoresence corrigé I2COR2 du plot 2 du triplet 2 est donc I2COR2 = (0,25 /0,5) x (1,5 / 3) x 1 = 0,25 et non plus 1.15 - 30 - Après calibration, la fluorescence du plot 2 du triplet 2 est inférieure d'un facteur 2 à celle du plot 1 du triplet et non pas supérieure d'un facteur 2. La réponse biologique de la puce est donc inversée.

La cible est « plus » reconnue par le plot 2 du triplet 2 que par le plot 2 du triplet 1. On en peut en déduire une information sur la composition chimique de la cible selon des techniques classiques d'analyse de puces à ADN (voir par exemple J.-C. Brès, Y. Mérieux, V. Dugas, J. Broutin, E Vnuk, M. Jaber, D. Rigal, J.R. Martin, E Souteyrand, M. Cabrera, J.P. Cloarec, New method for DNA Microarrays Development: Applied to Human Platelet Antigens Polymorphisms, Biomedical Microde vices 7:2, 137-141, 2005).

Dans ce qui précède, on a considéré pour simplifier que tous les plots des sondes ont la même géométrie (et notamment une même surface), qu'ils ont été tamponnés avec un même nombre de biomolécules, que tous les rendements d'interactions biomoléculaires sont égaux, que toutes les interactions sont indépendantes entre des biomolécules différentes et que tous les rendements de fluorescence sont égaux; l'homme de l'art sachant apporter les corrections nécessaires à ce qui précède si les conditions énoncées ci-dessus ne sont pas totalement remplies dans la pratique, toutes les variantes de la formule 1 et de la formule 2 font donc partie intégrante de l'invention.

Une grande quantité de mesures est indispensable pour aboutir à des relations expérimentales entre les signaux de fluorescence des sondes si, s2 et s3 et les concentrations recherchées de cibles. Un traitement informatique des données peut rendre ensuite la mesure fiable et plus facile.

L'excitation de la fluorescence des sondes si, s2 et s3 peut être réalisée de deux manières : avec une seule source lumineuse d'excitation E telle qu'un laser par exemple comme déjà évoqué ou avec plusieurs sources lumineuses d'excitation pour chaque guide d'onde lumineux 3 particulier intersectant un canal microfluidique 1.

L'utilisation d'une source lumineuse unique n'est envisageable que si l'on dispose d'un capteur optique d'analyse dont la résolution spatiale permet de différentier toutes les sondes formant une biopuce à une intersection - 31 - considérée d'un laboratoire. On peut ainsi utiliser le même fluorophore pour marquer toutes les sondes déposées.

Si la résolution spatiale du capteur optique d'analyse n'est pas suffisante, il faut alors utiliser plusieurs sources lumineuses d'excitation. Dans

l'exemple de la Figure 7, il faut alors utiliser trois fluorophores différents fonctionnant à trois bandes de longueurs d'onde différentes d'excitation et d'émission pour marquer chacune des sondes si, s2, s3. La récolte et l'exploitation des signaux de fluorescence des sondes nécessite alors l'emploi d'un filtre interférentiel disposé entre chacune des puces et le capteur

optique d'analyse pour distinguer l'émission provenant de chaque type de sonde si, s2 ou s3 en allumant/éteignant la source lumineuse correspondante.

Claims (20)

1. REVENDICATIONS1. Procédé de réalisation d'un microlaboratoire biologique sur puce, dans lequel successivement a. On réalise au moins un guide optique (3) dans un substrat (4); b. On forme au moins un canal microfluidique (1) sur une face du substrat (4), ledit canal microfluidique (1) intersectant au moins un guide optique (3) formé à l'étape a) ; c. On dépose au moins une biopuce (5) au fond du canal microfluidique (1) au niveau de l'intersection (6) de celui-ci avec le guide optique (3) ; d. On ferme au moins ledit canal microfluidique dans lequel une dite biopuce (5) a été déposée à une intersection (6) avec le guide optique (3) par dépôt d'une couverture de fermeture sur la face du substrat (4) dans laquelle le canal microfluidique a été formé, caractérisé en ce que la ou les biopuce(s) déposée(s) à l'étape c) comporte(nt) chacune n sondes individuelles (7), déposées séparément les unes des autres et de façon ordonnée sur le fond du ou des canaux microfluidiques (1) par microtamponnage ; n étant un nombre supérieur ou égal à
2. 2. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, dans un plan horizontal parallèle au fond du canal microfluidique (1), la plus grande dimension des n sondes individuelles (7) est comprise entre 0,5 et 500 micromètres, de préférence comprise entre 1 et 100 micromètres.
3. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, aux intersections (6) où elles sont déposées, les sondes individuelles (7) sont écartées les unes des autres d'une distance comprise entre 0,5 et 500 micromètres, et de préférence entre 1 et 100 micromètres.
4. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les n sondes individuelles (7) sont déposées simultanément au fond du canal- 33 - microfluidique (1) par une seule passe de microtamponnage à l'aide d'un tampon (9).
5. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les n sondes individuelles (7) sont déposées une à une sur le fond du canal microfluidique (1) par n tampons (9) distincts, chaque tampon correspondant à une sonde déterminée et comportant tous les motifs de la sonde.
6. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3 et la revendication 5, caractérisé en ce que l'on dépose les n sondes individuelles (7) une à une sur le fond du canal microfluidique (1) par un tampon unique (9) en n coups de tamponnage successifs, et dont la position est décalée relativement au substrat (4) pour chaque sonde, le tampon étant décontaminé entre chaque sonde, de sorte que la biopuce est constitué par n coups de tamponnage décalés.
7. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'on dépose successivement lesdites sondes individuelles (7) sur plusieurs substrats (4) par microtamponnages successifs desdits substrats repassés les uns après les autres pour déposer lesdites sondes.
8. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'on dépose successivement lesdites sondes (7) une à une sur plusieurs substrats (4) par microtamponnages successifs de chaque sonde à l'aide de plusieurs tampons (9) sur chaque substrat passant les uns après les autres sous chaque dit tampon.
9. 9. Procédé selon l'une des revendications 4 à 8, caractérisé en ce que le tampon (9) présente une base de hauteur H et au moins un motif (10) correspondant à un plot d'impression formant une saillie de hauteur h au dessus de la base et de surface s au niveau d'une surface d'impression (13) du tampon de microtamponnage, la hauteur h étant supérieure à la profondeur d du canal microfluidique (1) dans lequel les sondes (7) sont déposées.
10. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la base H du tampon (9) est comprise entre 10 pm et 10 mm, de préférence entre 100 pm- 34 - et 1 mm et en ce que la hauteur h de ladite saillie (10) est comprise entre 0,5 pm et 100 pm.
11. 11. Procédé selon l'une des revendications 4 à 10, caractérisé en ce que lors du microtamponnage on comprime le tampon et que la hauteur h' de la saillie du tampon après compression est supérieure à la profondeur du canal d.
12. 12. Procédé selon l'un des revendications 4 à 11, caractérisé en ce que le tampon (9) d'impression comporte un corps de support rigide, notamment en silicium, et une tête d'impression (19) en PDMS, fixée à l'extrémité d'un motif d'impression rigide en saillie (10) et de hauteur h"1, ladite tête étant de préférence sensiblement cubique et de hauteur h"2.
13. 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que la tête d'impression (19) en PDMS présente une hauteur h"2 et une largeur comprises entre 0,5 et 500 micromètres, et de préférence comprise entre 1 et 100 pm.
14. 14. Procédé selon l'une des revendications 12 à 13, caractérisé en ce que lors du microtamponnage on comprime le tampon (9) et que la hauteur h" après compression de la saillie rigide (10) du tampon et de la tête d'impression (19) en PDMS est supérieure à la profondeur du canal d.
15. 15. Procédé selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que le canal microfluidique (1) présente une largeur D' comprise entre 1 pm et 1 mm, de préférence entre 50 pm et 200 pm, et une profondeur d comprise entre 1 pm et 1 mm, de préférence entre 10 pm et 50 pm.
16. 16. Procédé d'étalonnage et de lecture d'un microlaboratoire sur puce obtenu selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisé en ce que, au niveau d'au moins une intersection entre un canal microfluidique et un guide optique : a) On dépose par microtamponnage au moins un plot de sondes si dans le fond dudit canal microfluidique, lesdites sondes si étant 30 marquées par au moins un fluorophore et étant inertes aux espèces présentes dans un échantillon biologique à tester, et- 35 - b) On dépose par microtamponnage au moins un plot de sondes s2 dans le fond du premier canal microfluidique du laboratoire à côté des/du plot(s) des sonde(s) si, lesdites sondes s2 étant destinées à réagir avec une molécule F* à identifier marquée d'un fluorophore, présente dans un dit échantillon biologique à tester ; ladite molécule F* n'interagissant ni avec les sondes si et c) On dépose par microtamponnage au moins un plot de sondes s3 dans le fond dudit canal microfluidique, à côté des sondes si et s2, à l'intersection avec ledit guide optique, lesdites sondes s3 étant destinée à réagir avec au moins une molécule connue et de référence F2* marquée par un fluorophore présente ou introduite en quantité connue dans dans ledit échantillon biologique à tester, lesdites sondes s3 n'interagissant pas avec la molécule F* et ladite molécule F2* n'interagissant par avec les sondes s1 et s2, constituant ainsi au moins un triplet de sondes (si, s2, s3),=1 et d) On ferme le dispositif avec un couvercle. e) On injecte un fluide biologique à analyser dans le canal microfluidique après avoir au préalable marqué la molécule F* à identifier avec un fluorophore, et introduit en quantité connue dans ledit fluide, une molécule de référence F2* marquée avec un flurophore, et f) On introduit un faisceau lumineux d'exitation (E) dans le guide optique et on détecte et on mesure ensuite à l'aide d'un dispositif optique, dont la résolution permet la séparation spatiale d'au moins deux sondes consécutives, le signal de fluorescence émis par chacune des sondes si, s3 et g) on corrèle ces mesures pour déterminer : i. la présence effective d'un signal lumineux d'excitation par l'émission de fluorescence de la sonde si, ii. la présente effective de la cible F* dans le fluide biologique par l'émission de fluorescence de la sonde s2 ;- 36 - iii. le bon fonctionnement du dispositif microfluidique, lié à l'écoulement de la molécule de référence F2*, par l'émission de fluorescence de la sonde s3.
17. 17. Procédé d'étalonnage et de lecture d'un microlaboratoire d'analyse biologique sur puce selon la revendication 16, selon lequel lorsque ledit microlaboratoire comporte un nombre entier w de triplets de sondes (s1, s2, s3)z=1 à w, le triplet w=1 étant pris comme triplet de référence, et caractérisé en ce que l'on corrige l'intensité de fluorescence des plots s2 z= 2 à w de la formule suivante : I2CORz=2àw = 12z=2àw x (I2z=2àw/ I21 ) x (13 z= 2 à w /131) I1 z= 1 à w étant la mesure de l'intensité de fluorescence des plots si z= 1 à w I2 z= là w étant la mesure de l'intensité de fluorescence des plots s2 z= 1 à w I3 z= 1 à w étant la mesure de l'intensité de fluorescence des plots s3 1 à w
18. 18. Procédé selon l'une des revendications 16 ou 17 caractérisé en ce que l'on introduit un unique faisceau lumineux (E) d'excitation dans un guide optique lumineux (3) et on utilise le même fluorophore pour détecter et mesurer les signaux des sondes si, s2 et s3.
19. 19. Procédé l'une des revendications 16 à 18, caractérisé en ce que l'on introduit plusieurs faisceaux lumineux d'excitation dans le guide optique lumineux (3) et on utilise des fluorophores différents pour détecter et mesurer les signaux des sondes si, s2 et s3, lesdits signaux étant sélectionnés à l'aide d'un filtre interférentiel disposé en sortie dudit canal de guidage face au dispositif optique.
20. 20. Procédé selon l'une des revendications 16 à 19, caractérisé en ce que le dispositif optique comporte au moins un capteur CCD.