FR2936316A1 - Dispositif de preconcentration selective/detection d'analytes chargees contenues dans un electrolyte et procede associe. - Google Patents

Abstract

L'invention concerne le domaine de la recherche ou de l'analyse des matériaux par l'emploi de moyens électriques et a plus particulièrement pour objet un dispositif de préconconcentration sélective / détection d'analytes chargées contenues dans un électrolyte comportant au moins deux réservoirs séparés par au moins un microcanal sans intersection d'axe longitud nal X et préférablement rectiligne, et comportant au moins une source de tension contrôlable apte à générer une différence de potentiel entre les extrémités dudit microcanal rectiligne, dispositif caractérisé en ce que le dispositif comporte des moyens de génération d'une pression contrôlable associés à au moins l'un des réservoirs et aptes à générer un gradient de pression entre les deux extrémités dudit microcanal et en ce que ce dernier comporte, dans sa partie médiane, des moyens aptes à générer au moins une variation de la charge de surface volumique, le dispositif étant apte à concentrer sélectivement les analytes chargées dans la partie médiane du microcanal, en amont et/ou aval de ces moyens.

Description

L'invention concerne le domaine de la rechercie ou de l'analyse des matériaux par l'emploi de moyens électriques et a plus particulièrement pour objet d'une part un dispositif de préconcentration sélective d'analytes contenus dans un électrolyte et, d'autre part, un procédé de préconcentration sélective des analytes contenus dans un électrolyte. On connaît principalement deux méthodes de séparation d'analytes contenus dans un électrolyte à l'aide de systèmes microfluidiques. La première méthode est l'électrophorèse capillaire. Elle est généralement mise en oeuvre par un réseau microfluidique dans lequel sont injectés un électrolyte et un échantillon renfermant des analytes. Ce réseau peut comporter un certain nombre de réservoirs relié à au moins un long microcanal et/ou à un réseau de microcanaux présentant des intersections agencées particulièrement, et ce, pour permettre l'injection d'une certaine quantité d'analytes dans le microcanal central. L'application d'un champ électrique dans ce même canal dit de séparation après la phase d'injection est responsable de la migration des analytes. En effet, sous un champ électrique, les particules chargées se déplacent dans un milieu liquide avec une vitesse définie à la fois par le champ, par la masse et la charge des particules (électrophorèse). La vitesse des particules dans le liquide est proportionnelle au champ électrique, la constante de proportionnalité étant nommée mobilité électrophorétique. A la paroi solide/liquide, une double couche ionique formée d'une couche d'ions fixe (charge de surface) et d'une couche d'ions mobile (couche diffuse dans le liquide) se forme spontanément. Sous un champ électrique, les ions de la couche mobile migrent, entraînant un mouvement global du liquide par viscosité (électro-osmose). Celui-ci se déplace d'un seul bloc et sa vitesse est aussi proportionnelle au champ électrique. La constante de proportionnalité entre la vitesse du fluide et le champ électrique est appelée mobilité électro-osmotique. L'action concomitante de la migration électrophorétique (vitesse des ions dans le liquide) et du flux de liquide électro-osmotique (vitesse du liquide) générés par la différence de potentiel agit sur les ions contenus dans le fluide, assurant leur transport à travers le canal de séparation. La vitesse :otale d'un ion dans un microcanal soumis à un champ électrique est donc proportionnelle au champ électrique. La constante de proportionnalité est la mobilité totale de l'ion qui est la somme de sa mobilité électrophorétique (propre à chaque ion) et de la mobilité électro-osmotique (identique pour tous les ions et qui dépend des caractéristiques de l'interface solide-liquide). La détection des différents analytes peut se faire successivement dans le temps au niveau de l'extrémité du long microcanal et permet de connaître le nombre d'analytes présents dans la solution à analyser et leur concentration respective. Cette méthode est connue pour sa très bonne résolution à séparer deux analytes, mais présente l'inconvénient de diluer les analytes ce qui rend la détection difficile, voire impossible dans le cas des analytes de très faible concentration. Pour résoudre cet inconvénient, on connaît une seconde méthode connue sous le terme de focalisation électrique par gradient à contre-courant. Elle met aussi en oeuvre un réseau microfluidique comportant au moins cieux réservoirs reliés entre eux par des canaux et par au moins un canal ou une chambre de séparation qui permet de concentrer les analytes à l'intérieur d'un canal de séparation lorsqu'un champ électrique et un gradient de pression approprié sont appliqués. Pour réaliser cette préconcentration, il doit y avoir un gradient de champ électrique dans le canal central alors que le débit de liquide est constant. II existe aujourd'hui plusieurs méthodes pour réaliser un gradient (cf. Shackman et Ross, "Review Counter-flow gradient electrofocusing" Electrophoresis 2007, 28, 556û571) Les figures la et 1b présentent respectivement d'une part la valeur du champ électrique en fonction de l'abscisse à l'intérieur d'un canal cle séparation et selon son axe longitudinal, et d'autre part la valeur de la vitesse des particules chargées en fonction de l'abscisse à l'intérieur de ce même canal de séparation et selon son axe longitudinal. Cette vitesse est la somme de leur vitesse électrophorétique et de la vitesse du liquide. Comme montré sur ces figures, avec cette méthode, la vitesse de chaque analyte varie à l'intérieur du réseau et peut devenir nulle en un point du réseau. Ainsi, chaque analyte contenu dans le réseau migre vers le point où sa vitesse est nulle, lieu de sa préconcentration. Deux analytes présentant des mobilités électrophorétiques différentes peuvent, en théorie, ainsi être préconcentrés en deux zones distinctes du microcanal. Cependant, cette méthode souffre du fait que les zones de préconcentrations sont trop larges pour obtenir une bonne séparation des analytes (les zones de préconcentration se chevauchent). Ainsi, cette technique est davantage utilisée comme outil de préconcentration globale avant une séparation. On parle alors d'électro-capture (cf. Shackman et al. figure 5) et il n'existe pas aujourd'hui de technique permettant de créer un gradient de champ électrique suffisamment fin et suffisamment stable pour permettre d'assurer une séparation convenable de manière concomitante à la préconcentration. On connaît par ailleurs la demande de brevet US2006/018469 de Han et al. qui décrit une méthode, qui couple les avantages des deux méthodes précédemment décrites car permettant une étape d'électro-capture non sélective suivie d'une étape de séparation électrophorétique. Ce dispositif comporte, comme montré sur la figure 2, deux microcanaux 1, 2 en forme de U aux extrémités de chacune desquelles se trouve un réservoir, respectivement 4, 5, 6 et 7. Les bases respectives 8, 9 de ces deux microcanaux sont disposées parallèlement et un nanocanal 10 relie les bases des premier et second microcanaux 1, 2 au niveau de leur partie médiane 11, 12. Des électrodes de platine 13, 14, 15,16 sont disposées dans chacun des réservoirs 4, 5, 6 et 7 et reliées à au moins un générateur de tension, non représenté apte à générer une différence de potentiel entre elles. Ainsi, une différence de potentiel est générée entre l'entrée et la sortie du nanocanal. Avec un tel dispositif, le déplacement des analytes est réalisé électriquement par électrophorèse et électroosmose. La première étape associée au procédé décrit dans ce brevet consiste à réaliser une forte préconcentration non sélective de l'échantillon grâce à une région de charge d'espace utilisée comme barrière. Lorsqu'un faible champ électrique parallèle au nanocanal 10 est généré via le premier générateur, en appliquant une tension de 1V dans les réservoirs 4 et 5 et une tension nulle dans les réservoirs 6 et 7, aucune préconcentration de composé ne se produit. Lorsque l'on augmente ce champ électrique par augmentation de la tension dans les réservoirs 4 et 5, le déplacement des ions contenus dans la solution se produit de façon limitée et une zone 17 pauvre en ions se forme dans le microcanal 1 au droit du nanocanal 10 et dans laquelle il y a autant d'ions négatifs que d'ions positifs. Lorsqu'on applique un fort champ électrique en augmentant encore la tension dans les réservoirs 4 et 5, la neutralité de la somme des ions présents dans ladite zone 17 n'est plus maintenue et il se crée une région de charge d'espace. Si alors, on diminue la tension dans le réservoir 5 de sorte à ce qu'elle soit égale à la moitié de celle présente dans le réservoir 4, un champ électrique secondaire perpendiculaire au nanocanal 10 est généré. Il se produit alors un déplacement du liquide contenu dans ladite première zone 17 par électro-osmose. Les analytes chargés contenu dans le liquide sont ainsi amenés vers la région de charge d'espace dans laquelle ils ne peuvent pas pénétrer. Il en résulte une accumulation de ces analytes chargés dans la zone 18 du microcanal située en amont de la zone 17 et avant l'intersection entre le microcanal 1 et le nanocanal 10.

Après cette étape de préconcentration non sélective, Han montre qu'il est possible de séparer par électrophorèse capillaire les d'analytes préconcentrés présentant des mobilités électrophorétiques différentes. Un dispositif selon cette demande de brevet présente de nombreux inconvénients. Ce dispositif ne permet pas une concentration sélective des analytes au niveau de l'intersection entre le microcanal et le nanocanal (capture globale) et nécessite donc l'utilisation d'une autre technique et un autre dispositif associé, en l'occurrence l'électrophorèse capillaire pour les séparer. Ceci est expliqué par l'utilisation d'un nanocanal qui crée une zone de charge d'espace trop forte. On constate par ailleurs que ce dispositif présente des phénomènes d'électro-osmose secondaires (réf. HAN physical review letters) qui perturbent la zone d'espace de charge responsable de la préconcentration des espèces contenues dans la solution. Ces phénomènes sont notamment observés lors de la création de la zone d'espace de charge. Ils sont aussi causés par la non homogénéité du champ électrique due à la connexion orthogonale entre le microcanal et le nanocanal.

Le but de l'invention est de résoudre ces inconvénients en proposant un procédé et un dispositif de mise en oeuvre de ce procédé permettant de coupler les étapes de préconcentration et de séparation au travers d'une succession de préconcentrations sélectives des différentes espèces ioniques contenues dans un électrolyte.

La solution apporté est un dispositif de préconconcentration sélective / détection d'analytes chargées contenues dans un électrolyte. Il comporte au moins deux réservoirs séparés par au moins un microcanal sans intersection d'axe longitudinal X et préférablement rectiligne. Au moins une source de tension contrôlable apte à générer une différence de potentiel entre les extrémités dudit microcanal rectiligne est associée à ce dispositif. Ce dispositif est caractérisé en ce qu'il comporte des moyens de génération d'une pression contrôlable associés à au moins l'un des réservoirs et aptes à générer un gradient de pression entre les deux extrémités dudit microcanal. L'invention repose sur l'irtroduction, dans la partie médiane dudit microcanal, de moyens aptes à générer au moins une variation de la charge de surface volumique. Un tel dispositif, lorsque un certain champ électrique et un certain débit sont imposés à travers ledit microcanal est apte à concentrer une gamme électrophorétique restreinte d'analytes dans la partie médiane du microcanal, en amont et/ou aval de ces moyens.

Par charge de surface volumique, il faut entendre le rapport de la charge de surface linéique moyenne le long du périmètre d'une section perpendiculaire à l'axe de ce microcanal à l'aire de cette section. Par partie médiane, il faut entendre que ces moyens ne constituent pas l'entrée ou la sortie du microcanal.

Selon une caractéristique particulière, un dispositif selon l'invention comporte au moins l'une des caractéristiques additionnelle suivantes : - les moyens aptes à générer au moins une variation de la charge de surface volumique sont aptes à la générer, selon ledit axe longitudinal, sous forme de marche. - le rapport de la variation de ladite charge de surface volumique sur la concentration ionique totale de l'électrolyte est au moins supérieur à 0.01 %, - les moyens aptes à générer au moins une variation de la charge de surface volumique sont aptes à la générer sur une longueur, selon l'axe X, inférieure à 10 Pm- - le microcanal comporte au moins une face et en ce les moyens aptes à générer au moins une variation de la charge de surface volumique sont constitués soit par : * au moins un revêtement physique ou chimique, une partie seulement de la face de la partie médiane du microcanal étant recouverte par un revêtement différent de celui du reste de la partie (par exemple dépôt de matériaux comme du Si3N4, une résine photosensible, un oxyde, des multicouches de poly-électrolytes chargés, etc...). * une partie seulement de la face de la partie médiane du microcanal comporte une charge de surface volumique différente du reste de la charge, cette différence étant par exemple due à un traitement chimique de cette partie (par exemple, par fonctionnalisation de la surface à l'a de de dérivés silanes) * un rétrécissement de la section du microcanal sur une partie seulement de la partie médiane du microcanal, par exemple de sa hauteur, la plus petite dimension du microcanal ne devant pas permettre la création d'une zone d'espace de charge et pour étant supérieure à 1 CIOnm, * des moyens aptes à générer un changemert de potentiel de surface, par exemple au moyen d'une d'interface métal-isolant-électrolyte apte à modifier la charge de surface effective à l'aide d'un champ radial. En outre, un dispositif selon l'invention peut comporter au moins l'une des caractéristiques suivantes : - il comporte au moins deux microcanaux disposés parallèlement et comportant chacun, dans sa partie médiane, des moyens aptes à générer au moins une variation de la charge de surface volumique et dont au moins une des extrémités de l'un des canaux et relié par un microcanal à l'une des extrémités de l'autre microcanal, - au moins deux canaux présentent des moyens aptes à générer au moins une variation de la charge de surface volumique différente en intensité et/ou en localisation, il comporte un réseau entrecroisé de canaux présentant chacun entre chaque croisement des moyens aptes à générer au moins Lne variation de la charge de surface volumique, préférentiellement différentes en intensité et/ou en localisation entre canaux, - il comporte des moyens de détection des analytes aptes à mesurer leur concentration locale sur l'ensemble du microcanal ou réseau de microcanaux au cours du temps, - . il comporte des moyens de collècte et de traitement des données issues desdits moyens de détection, et permettant de déterminer le nombre et la concentration des analytes contenus dans l'électrolyte. - au moins l'une des extrémités dudit microcanal est connecté à une zone de mélange, pouvant notamment comporter un réservoir interne, ou un serpentin de mélange, la dite zone de mélange étant connectée à au moins deux réservoirs dont les pressions et/ou potentiels électriques peuvent être contrôlés indépendamment et/ou contenant des électrolytes de composition différente.

Ainsi, l'invention repose sur la génération de gradierts ioniques modérés (pas de zone d'espace de charge) stables (pas de phénomènes de perturbations liés à l'électro-osmose secondaires) et autogénérés (pas besoin de membranes perméables au courant ou de gradient de température comme en focalisation électrique à gradient de champ) au sein d'un microcanal rectiligne. Pour ce faire, ledit microcanal présente donc une ou plusieurs variations brutales de la charge de surface volumique en son sein. L'invention concerne aussi un procédé de préconcentration sélective / détection d'au moins un type d'analyte tel par exemple des molécules, des complexes de molécules ou de particules (artificielles ou biologiques ù virus, bactéries, spores,...) ou des cellules contenus dans un électrolyte et mis en oeuvre par un dispositif comme décrit précédemment, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : - remplir au moins en partie un premier réservoir avec un électrolyte comportant les analytes à préconcentrer sélectivement, - remplir au moins un second réservoir, disposé par rapport au premier réservoir de l'autre côté d'au moins un microcanal rectiligne comportant des moyens aptes à générer au moins une variation de la charge de surface volumique, avec une solution tampon contenant ou non les objets de l'analyse, - appliquer, via au moins une source de tension contrôlable, une différence de potentiel entre au moins lesdits premier et second réservoirs - appliquer, via les moyens de génération d'une pression contrôlable, successivement au moins deux gradients de pression, l'un étant apte à préconcentrer, dans la partie médiane du microcanal, en amont ou en aval des moyens aptes à générer au moins une variation de la charge de surface volumique, un type d'analyte et aptes à engendrer la préconcentration dudit premier type d'analyte et le second gradient de pression étant apte à préconcentrer, dans la partie médiane du microcanal, en amont ou en aval des moyens aptes à générer au moins une variation de la charge de surface volumique, le second type d'analyte.

Selon une caractéristique particulière, un procédé selon l'invention comporte en outre les étapes suivantes : - mesurer pour chaque gradient de pression la concentration locale en analytes, - déterminer, à partir de la mesure de concentration locale en analyte pour les différents gradients de concentration le nombre et la concentration des analytes présents dans la solution initiale. 5 Selon une autre caractéristique particulière, un procédé selon l'invention comporte en outre une étape consistant à appliquer un gradient de pression dans au moins l'un des réservoirs variant continument entre deux valeurs extrêmes et éventuellement: une étape de mesure en continu de la concentration locale en 10 analyte et/ou une étape consistant à appliquer, via ladite au moins une source de tension contrôlable, au moins une seconde différence de potentiel entre au moins lesdits premier et second réservoirs et/ou au moins une différence de composition des électrolytes dans les réservoirs du dispositif. Selon une autre caractéristique particulière, un procédé selon l'invention comporte 15 en outre une étape consistant à appliquer, via ladite au moins une source de tension contrôlable, une variation continue de différence de potentiel entre au moins lesdits premier et second réservoirs simultanément ou non à une variation continue de pression dans un moins l'un des réservoirs.

20 - remplir au moins en partie un premier réservoir avec un électrolyte comportant les analytes à préconcentrer sélectivement, - remplir au moins un second réservoir, disposé par rapport au premier réservoir de l'autre côté d'un microcanal rectiligne comportant des moyens aptes à générer au moins une variation de la charge de 25 surface volumique, avec une solution tampcn contenant ou non les objets de l'analyse, - appliquer, via au moins une source de tension contrôlable, une première différence de potentiel entre au moins lesdits premier et second réservoirs 30 - appliquer, via les moyens de génération d'une pression contrôlable, au moins un premier gradient de pression apte à engendrer la préconcentration dudit type d'analyte dans la partie médiane du microcanal, en amont ou en aval des moyens aptes à générer au moins une variation de la charge de surface volumique Pour préconcentrer sélectivement deux analytes ayant des vitesses électrophorétiques différentes, un procédé selon l'invention comporte une étape supplémentaire consistant à appliquer, via les moyens de génération d'une pression contrôlable, au moins un second gradient de pression apte à engendrer la préconcentration dudit second type d'analyte dans la partie médiane du microcanal, en amont ou en aval des moyens aptes à générer au moins une variation de la charge de surface volumique. D'autres avantages et caractéristiques apparaîtront dans la description de modes particuliers de réalisation de l'invention au regard des figures annexées parmi lesquelles : La figure 3-A présente un réseau microfluidique 99 util sé au sein d'un dispositif selon un premier mode de réalisation général d'un dispositif selon l'invention tandis que la figure 3B montre la valeur de la charge de surface volumique d'un tel réseau, - la figure 4A montre le réseau fluidique de la figure 3A auquel ont été ajouté des moyens de génération d'une tension contrôlable tandis que la figure 4B montre le profil de la concentration ionique de l'électronique au sein du réseau fluidique lorsqu'un champ électrique E est appliqué, - la figure 5A présente le réseau fluidique de la figure 3A auquel a été ajouté des moyens de génération d'un gradient de pression apte à générer une surpression au niveau d'un premier réservoir tandis que la figure 5B montre le profil de la concentration ionique de l'électronique au sein du réseau fluidique lorsqu'un champ électrique E et une surpression au sein du premier réservoir sont appliqués, - la figure 6A ne diffère de la figure 5A qu'en ce que la surpression est appliquée dans un second réservoir situé de l'autre côté du micrccanal tandis que la figure 5B montre le profil de la concentration ionique de l'électrolyte au sein du réseau fluidique lorsqu'un champ électrique E et une surpression au sein dudit second réservoir sont appliqués, la figure 7A ne diffère de la figure 5A qu'en ce qu'une zone de préconcentration d'un analyte a été définie tandis que la figure 7B montre la vitesse d'une particule chargée ayant une mobilité électrophorétique donnée pour différentes valeurs de surpression appliquée au niveau du premier réservoir, - la figure 8 montre le taux de préconcentration de trois analytes (présentant des vitesses électrophorétiques différentes) en fonction de la surpression appliquée au niveau dudit premier réservoir, la figure 9A et 9B montre un schéma d'un dispositif selon un second mode de réalisation de l'invention dans lequel la variation de charge de surface volumique est réalisé à l'aide d'une couche de d'oxyde d'aluminium (AI2O3). - les figures 10a et 10b présentent un schéma général d'un dispositif selon un troisième mode de réalisation de l'invention, dans lequel la variation de charge de surface volumique est réalisée à l'aide d'une variation de section. - la figure 11 montre un schéma d'un dispositif selon un quatrième mode de réalisation de l'invention, dans lequel sont détaillés notamment les moyens de contrôle électrique et en pression externes à la puce microfluidique. Les figures 12a, 12b et 12c montrent des exemples de réalisation selon le mode de réalisation décrit en figure 11 ainsi qu'un exemple de suivi de préconcentration sélective par des moyens de fluorescence.

La figure 13 montre un schéma de dispositif selon un 5ème mode de réalisation où le choix du potentiel électrique, de la pression et de la composition de l'électrolyte de par et d'autre du microcanal de préconcentration sélective est réalisée à l'aide de réservoirs dits virtuels ou interne connecté à un certains nombre de réservoirs extérieurs dans lesquels les paramètres mentionnés ci- avant sont contrôlés individuellement. La figure 14 montre, en coupe, un schéma détaillé de réalisation des connexions entre un dispositif selon un sixième mode de réalisation de l'invention et les moyens de moyens de génération d'une pression contrôlable.

La figure 15 montre les taux de préconcentration obtenus dans le cadre d'un dispositif selon le mode de réalisation décrit par la figure I l , - la figure 16A présente un dispositif selon un septième mode de réalisation de l'invention tandis que la figure 16B montre, pour deux surpressions différentes appliquées au niveau du réservoir de ce dispositif, la vitesse d'un analyte chargé comportant une certaine mobilité électrophorétique, la figure 17A présente un dispositif selon un huitième mode de réalisation de l'invention comportant un microcanal possédant cinq moyens successifs aptes à générer une variation de charges de surface volumique et la figure 17B montre un exemple numérique de préconcentration d'un analyte en fonction du temps le long de ce microcanal, la Figure 18 montre un exemple numérique de préconcentration de deux analytes en fonction du temps le long du microcanal selon la figure 17A, ces analytes possédant des vitesses électrophorétiques proches, - la figure 19 A montre à nouveau le dispositif de la figure 5A tandis que la figure 19 B montre un exemple numérique de préconcentration des mêmes deux analytes que dans le cadre de la figure 18, et ce, en fonction du temps le long du microcanal présenté sur la figure 5A. la figure 20 représente le gradient ionique obtenu lors de l'expérience de préconcentration sélective de la figure 18 - la figure 21 montre un dispositif selon un neuvième mode de réalisation de l'invention.

La figure 3-A présente un réseau microfluidique 99 utilisé au sein d'un dispositif selon un premier mode de réalisation d'un dispositif selon l'invention. Ce réseau 99 comportant un microcanal 100 comportant dans sa partie médiane des moyens 101 aptes à générer une variation de charge de surface volumique. Les extrémités 102, 103 du ce microcanal 100 sont chacune connectées à un réservoir, respectivement 104, 105. La figure 3B montre la valeur de la charge de surface volumique le long d'un tel réseau. Les moyens 101 génèrent une variation en forme de marche 98 de la charge de surface volumique. Lorsque, comme montré sur la figure 4A, une différence de potentiel électrique est générée entre les réservoirs 104, 105 par des moyens de génération d'une tension contrôlable 106, cette différence de potentiel génère un champ électrique dirigé selon l'axe longitudinal X du microcanal. Le brutal changement de charge de surface volumique au niveau des moyens 101 provoque, comme montré sur la figure 4B, un gradient de concentration ionique dans une partie du microcanal en amont et en aval desdits moyens 101. Si on applique entre les extrémités 102, 103 du microcanal 100, comme montré sur les figures 5A et 6A, simultanément un champ électrique ainsi qu'un gradient de pression généré par des moyens 107 et apte à créer un débit de liquide dans le microcanal, le gradient de concentration ionique présent au niveau des moyens 101 de génération de la variation de charge se modifie pour prendre le profil d'une marche, soit négative 108 comme montré sur la figure 5B soit positive 109 comme montré sur la figure 6B suivant la direction globale du fluide et donc du côté ou on applique une surpression. On voit ici qu'un dispositif selon l'invention permet de générer un gradient local de concentration ionique très différent des gradients ioniques généralement obtenus en focalisation électrique et montré sur la figure 1. L'amplitude de cette variation de concentration ionique dépend de plusieurs paramètres : - elle est une fonction croissante avec l'amplitude de la variation de charge de surface volumique elle est une fonction décroissante de la concentration ionique de l'électrolyte support - c'est une fonction décroissante avec le débit de liquide à travers le microcanal - c'est une fonction croissante avec la valeur du champ électrique dans le microcanal.

Cette variation locale de la concentration ionique résulte aussi dans une variation locale du champ électrique. Dès lors, comme montré sur la figure 7A qui montre le réseau microfluidique 99 utilisé au sein d'un dispositif selon le premier mode de réalisation d'un dispositif selon l'invention, et sur la figure 7B qui présente la vitesse d'une particule chargée dans le microcanal 100 en fonction de la valeur de la surpression générée au niveau du réservoir 104, cette vitesse subit une variation locale au niveau des moyens 101 aptes à générer une variation de la charge de surface volumique. On peut voir, que suivant la valeur du gradient de pression appliqué, la vitesse du liquide varie ce qui a pour conséquence de translater la courbe de vitesse de la particule. Pour une certaine gamme de pression, et notamment lors de l'application d'une surpression dont la valeur est égale à B, la particule passe par une zone de vitesse nulle ou elle se préconcentre (zone 97 située en amont desdits moyens 101). La principale différence avec les techniques de focalisation habituelles est que le gradient ionique et donc la variation de champ électrique prend la forme d'une marche abrupte de faible hauteur ce qui a pour conséquence de ne permettre la préconcentration que d'une gamme très fine de mobilité électrophorétique, et ce, en un point bien déterminer. Si on fait varier la surpression de manière continue, on pourra successivement préconcentrer des molécules présentant différentes mobilités électro-phorétique avec une précision définie par la hauteur de la barrière ionique comme montré sur la figure 8 qui rapporte le taux de préconcentration dans la zone 97 de la figure 7A. Ainsi, si on fait varier continument de façon croissante le gradient de pression dans le microcanal, par exemple avec la surpression au niveau du réservoir 104, les différents analytes, en l'occurrence les molécules A, B et C se préconcentrent successivement , entre une première et une seconde surpression P1 et P2 pour la molécule A, entre une troisième P3 et une quatrième surpression P4 pour la molécule B et entre une cinquième P5 et une sixième surpression P6 pour la molécule C, avec P1<P2<P3<P4<P5<P6. De plus, dans cette géométrie, le champ électrique reste toujours parallèle à l'axe du microcanal et donc aux parois. Cette particularité permet d'éviter la 25 formation de phénomènes d'électro-osmose secondaire. La figure 9A montre un schéma particulier d'un dispositif selon un second mode de réalisation de l'invention qui est un cas particulier du dispositif présenté en en Figure 3A. Ce dispositif 20 comporte un premier et ui second réservoir 21, 22 relié entre eux par un microcanal central rectiligne 23 d'une longueur de 1cm et 30 d'une section rectangulaire de 100 pm de large et 2 pm de hauteur. Ce microcanal 23 comporte, au niveau de sa partie médiane, 29 et sur sa face supérieure interne 19 un revêtement 24 en AI2O3 sur une longueur de 100 pm. A chacun des réservoirs 21,22 sont associés une source de tension contrôlable, 25, 26 et des moyens 27, 28 de génération d'une pression contrôlable.

Le réservoir 21 est destiné à contenir et un échantillon à analyser comportant des molécules en solution dans un électrolyte, par exemple KCI. Bien évidemment, un seul des réservoirs pourrait comporter une seule source de tension contrôlable et un seul moyen de génération d'une pressior contrôlable pourrait être associés à l'un et/ou l'autre des réservoirs 21, 22. La seule condition est que le second réservoir soit relié à la masse de la dite source de tension associée au premier réservoir afin de permettre le passage du courant depuis le premier réservoir jusqu'au second. La figure 9B détaille les étapes technologiques perrnettant la mise en oeuvre d'un tel dispositif à l'aide d'une technologie dite Verre-PDMS-Verre (cf. articles de Plecis et al sur cette technologie- PDMS = Polydiméthylsiloxane). Deux substrats de verres D263, un pour la partie inférieure, l'autre pour la partie supérieures du microcanal, sont utilisés. Le substrat supérieur 200 es.t percé en deux points définissant les extrémités du microcanal par microsablage au travers d'un masque d'acier 201 (étape 1). Une couche fine 202 d'AI2O3 d'épaisseur 100 nm est ensuite déposée par une technique de déposition connue sous le nom pulvérisation cathodique radiofréquence magnétron sur toute la surface inférieure du substrat 200 (étape 2). Un masque de résine 203 est ensuite créé par une technique de photolithographie à l'aide, par exemple d'une résine AZ-5214 (Dow Corning). Ce masque 203 est utilisé pour protégé la. couche d'AL2O3 lors d'une étape de gravure sèche par plasma qui permet de retirer l'AL2O3 sauf dans la partie médiane du substrat 200 où l'on veut obtenir la variation de charge de surface (étape 3). Sur la face supérieure du substrat inférieur 205 est déposée une fine couche 206 de PDMS (étape 4), sur laquelle est structurée une couche 207 de résine (par exemple SU8 - étape 5). Les régions où il n'y a pas de résine SU8 constitueront le microcanal. Un procédé de gravure plasma est ensuite utilisé pour graver les couches de SU8 et de PDMS (étape 6). La résine 207 est complètement gravée alors qu'une fine couche (2pm) de PDMS 206 reste sur le substrat 205, sauf dans la région définissant le microcanal. Les substrats supérieur et inférieur 200, 205 sont ensuite exposés à un plasma Oxygène afin d'activer les groupes de surface du PDMS et du verre. Après cette étape d'activation, on aligne les substrats inférieur et supérieur 205, 200 et leur mise en contact résulte dans un scellement fort de la structure (étape 7).

Les figures 10a et 10b schématisent un dispositif selon un troisième mode de réalisation de l'invention, la figure 10b étant une coupe du dispositif de la figure 10a selon l'axe longitudinal X (figuré en pointillé). Ce dispositif 30 comporte un microcanal central rectiligne 31 d'axe X comportant un rétrécissement 32 dans sa partie médiane 33 et dont chacune des extrémités 34 est connecté à la partie médiane 35 d'un canal de mélange/injection 36 de section plus importante que celle du microcanal 31. Chacune des extrémités 37 de ce canal de mélange 36 est reliée à un réservoir 38. Le microcanal 31 a une longueur de 1500pm, une largeur de 100pm et une 10 hauteur de 2,5 pm, excepté au niveau du rétrécissement ou sa hauteur n'est que de 0,5 pm. La longueur du rétrécissement est de 100 pm. Le canal de mélange/injection a une longueur de 6 mm et une section de 200 pm de large et 2,5 pm de haut. A chacun des réservoirs 38 sont associés une source de tension contrôlable, 15 39 et des moyens de génération d'une pression contrôlable 27. Pour la réalisation de ce dispositif, une technique de collage anodique a été utilisée. Cette technique est équivalente à celle décrite, notamment par Datta et al dans son article intitulé Nanofluidic channels by anodic bonding of amorphous silicon to glass to study ion accumulation and ion depletion effect Talanta 2006 20 68(3) pp 659-665. Elle consiste à graver les sections microfluidiques dans un substrat de Pyrex à l'aide d'une solution d'acide fluorhydrique et de HCI. Un microcanal central de 2 pm de profondeur est ainsi gravé au centre du dispositif et interrompu sur une longueur de 100 pm. Le rétrécissement fluidique est lui réalisée grâce à l'utilisation d'une couche intermédiaire de Silicium amorphe déposé par des 25 techniques de PECVD (Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition). Cette couche est gravée par gravure plasma (SF6) au niveau des microcanaux préalablement gravés mais aussi dans la région située entre les 2 sections du microcanal. Elle sert ici de couche d'espacement entre le substrat de Pyrex inférieur et supérieur et permet de connecter les deux microcanaux par une section fluidique 30 dont la hauteur est égale à celle de la couche de Silicium amorphe déposé. Elle fait dans notre cas 0,5 pm d'épaisseur et permet donc de créer un microcanal central de 2,5 pm de hauteur (2 pm + 0,5 pm) sauf dans une région centrale faisant 0,5 pm de hauteur. Lorsque les substrats sont ensuite mis en contacte, chauffé à 400°C et qu'un potentiel (typiquement 600 V) est appliqué à travers la structures, un collage permanent (collage anodique) scelle la puce. Les trous d'accès fluidiques sont réalisés par microsablage dans le substrat supérieur préalablement à l'étape de collage anodique. La figure 11 présente un dispositif selon un quatrième mode de réalisation de l'invention basé sur la même technologie que décrite ci avant. La géométrie des canaux latéraux (36 dans la figure 10a) a été seulement modifiée. On y décrit notamment la mise en oeuvre des pressions et des tensions au niveau des différentes entrées. Ce dispositif 40 possède une puce 69 qui comporte un microcanal central rectiligne 41 comportant un rétrécissement 42 dans sa partie médiane 43 et dont chacune des extrémités 44 est connecté à un canal de mélange/injection 46 de section plus importante que celle du microcanal 41. Ce canal de mélange 46 à la forme d'un U dont chacune de ses extrémités 47 est reliée à un réservoir 48 tandis que la partie médiane de sa base 49 est connectée à I une des extrémités 44 du microcanal. Une photographie d'un dispositif réalisé selon le procédé est présenté en Figure 10c A chacun des réservoirs 48 sont associés une source de tension contrôlable, 49 et des moyens 50 de génération d'une pression contrôlable. Chacun de ces moyens 50 de génération d'une pression contrôlable comporte une source 51 d'air comprimé apte à alimenter un récipent hermétique 52 via un tuyau d'alimentation 53 sur lequel est disposé un mancmètre contrôlable 59. Ce récipient hermétique 52 renferme de l'eau distillée 54 et est relié par un tuyau en plastique 55 à l'un des réservoirs 48 du dispositif 40. Ce tuyau en plastique 55 comporte une première extrémité 56 située vers le fond du réservoir hermétique 52 et baignant dans l'eau distillée 54 et une seconde extrémité 57 baignant dans la solution présente dans le réservoir 48 du dispositif 40. Ainsi, La pression est transmise aux réservoirs par l'intermédiaire d'eau distillée (EDI) dont la pression propre est régulée dans des réservoirs de pressions indépendants. Chaque réservoir de pression est relié à une source d'air comprimé au travers d'un manomètre programmable permettant de contrôler dynamiquement la pression dans la chambre, et donc à l'entrée de la puce microfluidique constituée par les réservoirs, les canaux de mélange et le microcanal rectiligne comportant le rétrécissement. La source de tension contrôlable comporte un générateur de tension 60 connecté d'une part à une électrode de platine 61 disposée à l'intérieur dudit tuyau en plastique et d'autre part à une masse 62 commune à toutes les sources de tension. Plusieurs schémas peuvent être appliqués successivement grâce à cette configuration : - si P1=P2 >P3=P4 et que V1=V2 ≠V3=V4, le liquide est amené en quantité équivalente des réservoirs 1 et 2 vers les réservoirs 3 et 4. Le liquide dans le microcanal de préconcentration sélective 41 est donc un mélange des liquides issu des réservoirs 1 et 2. Si les liquides dans ces deux réservoirs sont les même, ce mode de réalisation est équivalent à celui de la figure 5A. Si les liquides dans les réservoirs 1 et 2 sont différents, le liquide présent en 41 sera un mélange de ces deux liquides, présentant des propriétés de force ionique, de pH et de concentration d'analyte intermédiaire à ces deux réservoirs. En modulant P1 et P2 l'un part rapport à l'autre (tout en les conservant ces deux pressions supérieures à P3 et P4), il sera ainsi possible de moduler la composition du liquide dans le microcanal de préconcentration sélective 41. Les potentiels V1, V2, V3 et V4 peuvent aussi être fait varier afin de modifier les composantes électrosmotique du flux EOF dans les canaux latéraux 46 ainsi que la répartition de potentiel dans l'ensemble de la puce. Ce schéma d'intégration permet en réalité de créer deux réservoirs virtuels de part et d'autre du microcanal central dans la zone médiane du canal 46. La composition du liquide, la pression et le potentiel électrique dans ces réservoirs virtuels étant contrôlés par les paramètres de contrôles P1, P2, P3, P4 et V1, V2, V3, V4. - Si P1=P4 > P3=P2 et que V1=V2=V3=V4=0, alors le liquide est mis en mouvement depuis les réservoirs 1 et 4 pour remplacer le liquide dans les canaux latéraux 46. Cette étape peut être utilisée pour changer le liquide plus rapidement dans la puce. De même, on peut jouer à tension nulle sur les pressions relatives de P1, P2, P3 et P4 de manière à remplir la puce à l'aide de l'électrolyte contenu dans l'un des réservoirs. Par exemple si de l'EDI est contenu dans le réservoir 4, en établissant P4 >P1=P2=P3, le dispositif va se remplir d'EDI (nettoyage après une analyse).

Les figures 12a, 12b et 12c représentent les photographies d'exemple de réalisations associées au schéma de la Figure 11 ainsi que les courbes de préconcentration obtenues avec ces dispositifs. La figure 12a représente le microcanal central 41 avec sa restriction centrale 42 et la zone de mélange amont 46. La figure 12b est une photographie de la puce 69. La figure 12c montre une image en fluorescence de la région d'intérêt (ROI en anglais) définie sur la figure 12a à un instant donné de la préconcentration sélective d'une sonde fluorescente. On y voit aussi l'allure de l'intensité le long du microcanal au cours du temps (les courbes plus claires correspondent aux temps les plus longs).

Comme montré sur la figure 13, les canaux de mélange 46 peuvent comporter une partie commune de plus grande dimension constitutive d'un réservoir interne ou d'un réservoir virtuel mis en oeuvre dans le mode de réalisation détaillé dans la Figure 11de plus grande taille que le microcanal 41. La composition de l'électrolyte, le potentiel électrique et la pression dans ces réservoirs internes est fonction des compositions des électrolytes, des potentiels électriques et des pressions appliqués dans les réservoirs réels dont le nombre peut être supérieur à 2. Des moyens de mélange (serpentin ou mélangeur chaotique) peuvent aussi être associés en amont de ces réservoirs virtuels pour améliorer l'homogénéité de l'électrolyte pénétrant dans le microcanal où a lieu la préconcentration. Il est aussi représenté la zone de détection nécessaire au suivi de la. préconcentration sélective. Les moyens de détection doivent donc couvrir une zone de détection correspondant à l'ensemble du microcanal où a lieu la préconcentration. La figure 14 montre, en coupe, un schéma détaillé de réalisation des connexions entre un dispositif selon un sixième mode de réalisation de l'invention et 25 les moyens de génération d'une pression contrôlable. Un dispositif 70 selon ce mode de réalisation comporte un microcanal central rectiligne 71 encastré dans une puce 72 et dont chacune des extrémités est connectée à un réservoir 73 débouchant sur la face supérieure du bloc. Ce bloc 72 est inséré entre une plaque métallique 74 est une membrane d'étanchéité 75 30 comportant des ouvertures dont la position correspond à celle desdits réservoirs 73. La plaque métalliques comporte autant d'alésage 79 que d'ensembles vis écrous 79 nécessaires au maintient de la structure. Elle est de plus percée en son centre afin de permettre l'observation du microcanal central à l'aide d'un objectif de microscope, par exemple, 81.

Une pièce parallélépipédique 76 en plexiglas est disposée au dessus de la membrane d'étanchéité 75. Cette pièce 76 comporte des alésages 77 aptes à prolonger les conduits formés par chacun des réservoirs et de l'ouverture dans la membrane qui lui est associé. Des ensembles vis-écrou 80 assurent le plaquage du bloc 72 contre la membrane via des alésages coaxiaux 78 et 79, pratiqués respectivement dans la pièce parallélépipédique 76 et dans la plaque métallique 74. Deux pipes de raccordement 83 solidaire de la pièce parallélépipédique 76 en plexiglas relient chacune l'un des premiers alésages 77 à un tuyau en plastique 55 raccordé aux moyens 50 de génération d'une pression contrôlable.

Des moyens 81 de détection et de détermination de la concentration en molécule dans le microcanal, en amont et en aval du rétrécissement 82 sont associés au dispositif 70. Dans cet exemple de réalisation, ces moyens de détection sont constitués par un microscope à épifluorescence et par une caméra CCD, ces moyens permettant d'effectuer des mesures de préconcentration de molécules fluorescentes chargées (Fluorescéine). Dans cet exemple de réalisation, le liquide est injecté au fond des réservoirs à l'aide d'une seringue dont l'aiguille est introduite dans les alésages 771e liquide est injecté au fond des réservoirs à l'aide d'une seringue dont l'aiguille est introduite dans les alésages 77 Le fonctionnement des dispositifs précédemment décrits est le suivant :

Un échantillon de molécules à analyser est mélanger, si besoin, à une solution électrolytique, par exemple un tampon phosphate ou KCI, et introduite ensuite dans l'un au moins des réservoirs. Tandis qu'une ou plusieurs solutions identiques ou non à la solution à analyser est introduite dans le ou les autres réservoirs. Ensuite une différence de potentiel est générée, via les sources de tension contrôlables, entre les différents réservoirs. Cette différence de potentiel génère un champ électrique parallèle à l'axe longitudinal X du microcanal. Cette différence de potentiel génère un déplacement des particules à analyser contenues dans la solution à l'intérieur du réseau microfluidique et notamment à l'intérieur du microcanal central rectiligne. Ce déplacement est fonction de la vitesse électrophorétique des molécules à analyser et de la vitesse propre du liquide. Au passage de la zone de variation de charge de surface volumique, la vitesse électrophorétique des particules subit une brutale variation. Si cette variation est suffisante pour annuler la vitesse totale de la particule, cette dernière se préconcentre. Sinon cette particule poursuit sa course. En présence d'un champ électrique, seul le flux électroosmotique est à même de déplacer le liquide. Le débit de liquide ne varie donc pas et seul une gamme électrophorétique de molécules pourra être préconcentrée de cette manière. II est donc indispensable de faire varier le débit de liquide indépendamment du champ électrique. Dans le cadre de l'invention, un gradient de pression est en outre généré, via les moyens de génération d'une pression contrôlable, entre les différents réservoirs. De cette façon, le débit de liquide est modifié dans le microcanal de préconcentration indépendamment du champ électrique et la gamme électrophorétique de particules préconcentrée est modifiée. L'application d'un gradient de pression continu croissant en fonction du temps permet ainsi de préconcentrer successivement les différentes molécules électriquement chargées contenues dans la solution à analyser. On constate donc qu'il est possible de discriminer la préconcentration des molécules présentes dans la solution à analyser en fonction de leur vitesse électrophorétique et ce, en superposant une différence de potentiel et en faisant varier ledit gradient de pression. Ainsi, seule une gamme électrophorétique de molécules se préconcentre dans la partie microfluidique. La préconcentration sélective peut avoir lieu en amont ou en aval de la restriction centrale. Elle est suivie à l'aide d'un système de détection situé sur l'ensemble du microcanal central afin de déterminer les différentes espèces présentes dans l'échantillon et leur taux. Si, par exemple, l'intensité en fluorescence est le paramètre de détection de la concentration locale, cette intensité sera mesurée en fonction d'un nombre de variables d'entrée qui peut être faible (en ne faisant varier la pression seulement dans le réservoir ou se trouve l'échantillon à analyser), ou au contraire important (en faisant varier pression et potentiel électrique dans les différents réservoirs). Dans ce dernier cas, l'analyse multidimensionnelle de l'intensité enregistrée se fera à l'aide d'outils d'analyse numériques plus complexes afin de déterminer le nombre d'espèces présentes et leur taux. Un dispositif selon l'invention permet de définir des zones de préconcentration sous forme de bandes qui peuvent être moyennées dans la largeur et la hauteur du microcanal central. La figure 15 montre les taux de préconcentration obtenus dans le cadre d'un dispositif selon le mode de réalisation décrit par la figure 11. Dans ce cas de figure, les 4 réservoirs sont remplis par une solution de 1mM de KCI contenant les analytes de mobilités électrophorétiques (m.e.) respectivement égales à 0.25, 0.5, 0.75, 1 et 1.25 fois celle de la sonde fluorescente utilisée pour les expériences de préconcentration présentées en Figure 12c. Ici, on rapporte le taux de préconcentration maximal sur l'ensemble du microcanal en fonction du gradient de pression appliqué LP. Dans ces expériences, V1=V2=0 et V3=V4=50V, alors que P1=P2=0 bar et P3=P4=AP. On voit que ces différentes molécules se préconcentrent pour différentes valeurs de OP ce qui permet de coupler les étapes de préconcentration et de séparation. Quand pour un seul analyte (m.e. = 1 relativement à la figure 15), on rapporte le taux de préconcentration en fonction du gradient de pression imposé à travers le même microcanal central et de la concentration en KCI de l'électrolyte, on s'aperçoit que cette molécule possède une signature constituée de trois zones de préconcentrations. Grâce au mode de réalisation détaillé dans la Figure 14 qui permet de faire varier la concentration ionique, le pH, la pression et le potentiel électrique à l'entré du microcanal de préconcentration, il est ainsi possible d'effectuer une analyse multidimensionnel d'un échantillon (chaque molécule aura une signature de préconcentration propre par rapport à ces différents paramètres de contrôles externes). Ainsi, il sera possible d'étendre la signature en préconcentration avec le nombre de paramètres que l'on fera varier dans les réservoirs d'entrée de la puce. Cependant, il est aussi possible, non pas d'étendre la signature d'un analyte à l'aide d'une analyse multidimensionnelle, mais d'affiner cette dernière à l'aide d'une structuration de la charge de surface volumique plus complexe qu'une simple marche. La figure 16A présente un exemple de réalisation dans lequel un même microcanal 108 et connecté à chacune de ses extrémités 117, 118 à un réservoir, respectivement 109, 110 et comporte plusieurs moyens successifs aptes à générer une variation de la charge de surface volumique. Chacun des réservoirs 96, 110 est raccordé à des moyens 120, 121 de génération d'une pression contrôlable. Dans cet exemple de réalisation, ces moyens sont constitués par quatre électrodes 111, 112, 113 et 114 situées sous une couche isolante (SU8 ou SiO2 par exemple). L'application d'un potentiel électrique différent à ces électrodes permet de modifier le potentiel de surface grâce à un effet capacitif (cf. par exemple article de Van der Wouden Field-effect control of electro-osmotic flow in microfluidic networks , Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, Volume 267, Issues 1-3, 5 October 2005, Pages 110-116), donc la charge de surface effective. La puce est réalisée à l'aide de la technique Verre-PDMS-Verre décrite dans la figure 9B et présente a priori des dimensions semblables à celle de la figure 9A. Une différence de potentiel électrique est généré entre les deux extrémités 117, 118 du microcanal via les moyens 119 de génération d'une tension tandis qu'une surpression est générée dans le réservoir 96 via les moyens 120, 121 de génération d'une pression contrôlable. La figure 16B montre, pour deux surpressions différentes appliquées au niveau du réservoir 109, la vitesse d'un analyte chargé comportant une certaine mobilité électrophorétique. On constate que cette vitesse est d'abord constante jusqu'à ladite zone amont 115 puis varie par pallier au niveau de chaque variation de charge de surface volumique, et ce jusqu'à la zone 116 correspondant au quatrième revêtement. La vitesse redevient constante en aval desdits revêtements et sa valeur est égale à celle de cet analyte en amont desdits revêtements. On constate que pour chacune des deux surpressions, la vitesse de l'analyte est, à un certain endroit, égale à zéro, et que cet endroit varie en fonction de la valeur de la surpression. Ces endroits où la vitesse de l'analyte est égale à zéro sont ceux où se produisent sa préconcentration et donc sa séparation des autres analytes. L'utilisation d'une succession de changement de charge de surface volumique permet de créer une succession de gradients ioniques. Dans ce cas, la zone de préconcentration pourra subir une série de décalage lorsque la surpression sera augmentée ou diminuée. La présence dans un même microcanal de plusieurs moyens successifs aptes à générer une variation de charge de surface volumique permet d'accroître la sélectivité du dispositif. La figure 17B représente des résultats de simulation numérique obtenue avec un dispositif comportant les mêmes éléments que ceux de la figure 16A excepté un microcanal 130 de 0,5 pm de hauteur, une charge de surface de -0,1 mC/m2 et possédant cinq moyens successifs 131, 132, 133, 134 et 135 aptes à générer des variations brutales de charge de surface volumique produisant respectivement 5 zones de charges surfaciques successives de -1 mC/m2, -2 mC/m2, -3 mC/m2 , -4 mC/m2 et -5mC/m2 (gauche vers la droite). La longueur totale du microcanal fait 5,4 mm et chaque zone fait 0.2 mm de longueur. La concentration en ions (électrolyte 1:1 KCI) est de 1 mM. La figure rapporte la concentration d'une molécule tierce (valence = -2, coefficient de diffusion = 2,72e-10 m2/s) le long du microcanal en fonction du temps quand un gradient de pression décroissant (de 1 bar à une surpression nulle) est imposé dans le réservoir de gauche. On y voit qu'une préconcentration se crée au niveau de la cinquième zone et la diminution progressive de la pression résulte en un déplacement progressif de cette zone de préconcentration au cours du temps. Lorsqu'une seconde espèce de mobilité très proche est ajoutée, on voit, sur la figure 18 , que l'analyse temporelle de la concentration locale permet de distinguer très clairement les deux molécules. Pour comparaison, la même séparation a été menée dans le cas d'une unique zone de charge de surface -5 mC/m2 comme montré sur la figure 19A. Les résultats de cette séparation sont présentés sur la figure 19B. Il est clair, en comparant les deux figures 18 et 19B que la géométrie de la Figure 18 permet de mieux discriminer deux analytes de mobilité proche. Dans la figure 20 est représenté le gradient ionique obtenu lors de l'expérience de préconcentration sélective de la figure 18. H est donc possible de créer des gradients ioniques stables et de les adapter à la résolution nécessaire en changeant simplement la charge de surface volumique le long du microcanal central par paliers successifs.

Bien évidemment, de nombreuses modifications peuvent être apportées sans sortir du cadre de l'invention. Dans les variantes de réalisation décrites précédemment, l'analyse du lieu et du taux de préconcentration se fait sur une puce ne comportant qu'un seul microcanal de préconcentration. Évidemment, plusieurs microcanaux de préconcentrations, présentant des variations de charge de surfaces volumiques en leur partie médiane différentes pourront être utilisés en parallèles depuis les mêmes réservoirs ou d'autres réservoirs. Il est aussi possible d'envisager de connecter ces microcanaux de préconcentration les uns aux autres, constituant ainsi un réseau 2D de microcanaux de préconcentrations par charge de surface volumique comme montré sur la figure 21. Ce réseau est constitué, dans cet exemple de réalisation par 6 canaux Cl à C6 disposés parallèlement entre eux en lignes. Chacun de ces canaux comporte 5 moyens M1, M2, M3, M4 et M5 aptes à générer dans le microcanal au moins une variation de la charge de surface volumique. En outre, ces canaux sont interconnectés entre eux de sorte à former un second réseau de canaux C7, C8, C9, C10, C11, C12, chacun de ces canaux parallèles entre eux et en colonne. Chacun de ces canaux comporte 5 moyens M6, M7, M8, M9 et M10 aptes à générer dans le microcanal au moins une variation de la charge de surface volumique. Les quatre extrémités d réseau de canaux ainsi formé sont chacune connectées à un réservoir R1, R2, R3 et R4 auquel sont associés des moyens de génération d'une tension contrôlable et des moyens de génération d'une pression contrôlable Les zones où se rejoignent ces microcanaux constituent ainsi autant de réservoirs virtuels tels que définis dans la figure 14, au niveau desquels la composition de l'électrolyte, le potentiel électrique et la pression dépendra de la composition des électrolytes, du potentiel électrique et de la pression appliquée dans chaque réservoir ainsi que de la géométrie du réseau microfluidique. L'analyse de l'intensité de préconcentration au niveau de chaque barrière ionique due à la variation de charge de surface volumique (provoquée par une variation de la section et/ou de la charge de surface) permettra d'observer des signatures de préconcentration propres à chaque mclécule. Enfin, cette figure montre, en pointillés, la zone Z nécessaire au suivi de la préconcentration sélective. Les moyens de détection doivent donc couvrir une zone de détection correspondant à l'ensemble du microcanal où a lieu la préconcentration.

Par ailleurs,. la sélectivité d'une telle invention peut encore être accrue en superposant, à un dispositif selon l'invention, des moyens aptes à générer un gradient de pH à travers une telle structure. Il suffira pour cela d'utiliser des électrolytes supports présentant des pH différents au niveau des réservoirs réels. En outre, un procédé selon l'invention peut par exemple comporter une étape préalable connue de marquage de l'analyte à détecter afin de faciliter sa détection. Par exemple, l'ajout d'anticorps fluorescent à un analyte permettra de déterminer la présence d'antigènes et le nombre de variantes de ces derniers. S'il n'y a pas d'antigène, on ne retrouvera la signature de préconcentration que de l'anticorps fluorescent seul. Si au contraire cet anticorps se complexe à un analyte, sa signature de préconcentration sera modifier et on la retrouvera dans l'analyse des figures de préconcentration, quelles soient uni ou multidimensionne'les. Par ailleurs, le canal de mélange peut être aussi par exemple constitué par un serpentin de mélange ou tout autre géométrie apte à permettre le mélange des liquides provenant des divers réservoirs.

Claims (18)

1. REVENDICATIONS1. Dispositif de préconconcentration sélective / détection d'analytes chargées contenues dans un électrolyte comportant au moins deux réservoirs (21, 22, 53, 48, 104, 96, 110 ,105) séparés par au moins un microcanal (23, 31, 41, 100, 108) sans intersection d'axe longitudinal X et préférablement rectiligne, et comportant au moins une source de tension contrôlable (25, 39, 60, 106) apte à générer une différence de potentiel entre les extrémités dudit microcanal (23, 31, 41, 100) , dispositif caractérisé en ce que le dispositif comporte des moyens (27, 28, 51, 59) de génération d'une pression contrôlable associés à au moins l'un des réservoirs (21, 22, 53, 48, 104, 96, 110 ,105) et aptes à générer un gradient de pression entre les deux extrémités dudit microcanal (23, 31, 41, 100, 108) et en ce que ce dernier comporte, dans sa partie médiane, des moyens (101, 32, 24, 42,111, 112, 113, 114) aptes à générer au moins une variation de la charge de surface volumique, le dispositif étant apte à concentrer sélectivement les analytes chargées dans la partie médiane du microcanal (23, 31, 41, 100, 108), en amont et/ou aval de ces moyens (101, 32, 24, 42,111, 112, 113, 114).
2. 2. Dispositif selon revendications 1, caractérisé en ce que les moyens aptes à générer au moins une variation de la charge de surface volumique sont aptes à générer, selon ledit axe longitudinal X, une variation de la charge de surface en forme de marche.
3. 3. Dispositif selon revendications 1, caractérisé en ce que le rapport de la variation de ladite charge de surface volumique sur la concentration ionique de chacun des analytes est au moins supérieur à 0.01 %.
4. 4. Dispositif selon revendications 1, caractérisé en ce que les moyens (101, 32, 24, 42,111, 112, 113, 114) aptes à générer au moins une variation de la charge de surface volumique sont aptes à la générer sur une longueur, selon l'axe X, inférieure à 10 pm.
5. 5. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le microcanal (23, 31, 41, 100, 108) comporte au moins une face et en ce que les moyens (101, 32, 24, 42,111, 112, 113, 114) aptes à générer au moins une variation de la charge de surface volumique sont constitué par au moins l'un des éléments suivants :- au moins un revêtement (24) , une partie seulement de la surface de la partie médiane du microcanal (23, 31, 41, 100, 108) étant recouverte par un revêtement différent de celui du reste de la partie, - des multicouches de poly-électrolytes chargés, toute substance, par exemple polymère, apte à être déposée sélectivement sur une partie seulement de la surface de la partie médiane du microcanal et présentant une charge de surface différente du reste de la partie, un traitement chimique appliqué à une partie seulement de la surface de la partie médiane du microcanal et lui conférant une charge de surface différente 10 du reste de la partie, un rétrécissement (32, 42) de la section du microcanal sur une partie seulement de la partie médiane du microcanal, la dimension la plus petite de ce dit rétrécissement étant supérieure à une valeur de 0,1 pm, des moyens aptes à générer un changement de potentiel de surface sur une 15 partie seulement de la surface de la partie médiane du microcanal à l'aide par exemple d'un champ radial dans la partie médiane du microcanal et comportant, par exemple, au moins une d'interface métal-isolant-électrolyte.
6. 6. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte au moins deux microcanaux (Cl, C2, C3, C4, C5, C6) disposés parallèlement et 20 comportant chacun, dans sa partie médiane, des moyens (M1, M2, M3, M4, M5) aptes à générer au moins une variation de la charge de surface volumique et dont au moins une des extrémités de l'un des canaux et relié par un microcanal (C7, C8, C9, C10, C11, C12) à l'une des extrémités de l'autre microcanal.
7. 7. Dispositif selon la revendication 6, caractérisé en ce que ces au 25 moins deux microcanaux présentent des moyens (M1, M2, M3, M4, M5) aptes à générer au moins deux variations de la charge de surface volumique différentes en intensité et/ou en localisation.
8. 8. Dispositif selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comporte un réseau entrecroisé de canaux (Cl, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, 30 C12) présentant chacun entre chaque croisement des moyens (M1, M2, M3, M4, M5, M6, M7, M8, M9, M10) aptes à générer au moins une variation de la charge de surface volumique, préférentiellement différentes en intensité et/ou en localisation entre canaux.
9. 9. Dispositif selon revendications 1 et 8 caractérisé en ce qu'il comporte des moyens de détection des analytes aptes à mesurer leur concentration locale sur l'ensemble du microcanal ou réseau de microcanaux au cours du temps.
10. 10. Dispositif selon revendication 9, caractérisé en ce qu'il comporte des moyens de collecte et de traitement des données issues desdits moyens de détection, et permettant de déterminer le nombre et la concentration des analytes contenus dans l'électrolyte.
11. 11. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'au moins l'une des extrémités dudit microcanal est connecté à une zone de mélange (46) , pouvant notamment comporter un réservoir interne, ou un serpentin de mélange, la dite zone de mélange étant connectée à au moins deux réservoirs (48) dont les pressions et/ou potentiels électriques peuvent être contrôlés indépendamment et/ou contenant des électrolytes de composition différente.
12. 12. Procédé de préconcentration sélective / détection d'au moins un type d'analyte tel par exemple des molécules, des complexes de molécules ou de particules, des cellules ou tout objet présentant une mobilité électrophorétique (bactérie, spore, virus, etc...) contenus dans un électrolyte et mis en oeuvre par un dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : - remplir au moins en partie un premier réservoir avec un électrolyte comportant les analytes à préconcentrer sélectivement, - remplir au moins un second réservoir, disposé par rapport au premier réservoir de l'autre côté d'au moins un microcanal rectiligne comportant des moyens aptes à générer au moins une variation de la charge de surface volumique, avec une solution tampon contenant ou non les objets de l'analyse, appliquer, via au moins une source de tension contrôlable, une première différence de potentiel entre au moins lesdits premier et second réservoirs appliquer, via les moyens de génération d'une pression contrôlable, au moins un premier gradient de pression apte à engendrer la préconcentration dudit type d'analyte dans la partie médiane du 30microcanal, en amont ou en aval des moyens aptes à générer au moins une variation de la charge de surface volumique, .
13. 13. Procédé selon la revendication 12 de préconcentration sélective / détection d'au moins un premier et un second types d'analytes, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : remplir au moins en partie un premier réservoir avec un électrolyte comportant les analytes à préconcentrer sélectivement, remplir au moins un second réservoir, disposé par rapport au premier réservoir de l'autre côté d'au moins un microcanal rectiligne comportant des moyens aptes à générer au moins une variation de la charge de surface volumique, avec une solution tampon contenant ou non les objets de l'analyse, appliquer, via au moins une source de tension contrôlable, une différence de potentiel entre au moins lesdits premier et second réservoirs appliquer, via les moyens de génération d'une pression contrôlable, successivement au moins deux gradients de pression, l'un étant apte à préconcentrer, dans la partie médiane du microcanal, en amont ou en aval des moyens aptes à générer au moins une variation de la charge de surface volumique, un type d'analyte et aptes à engendrer la préconcentration dudit premier type d'analyte et le second gradient de pression étant apte à préconcentrer, dans la partie médiane du microcanal, en amont ou en aval des moyens aptes à générer au moins une variation de la charge de surface volumique, le second type d'analyte.
14. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 et 13, caractérisé en ce qu'il comporte en outre les étapes suivantes : 30 - mesurer pour chaque gradient de pression la concentration locale en analytes, - déterminer, à partir de la mesure de concentration locale en analyte pour les différents gradients de concentration le nombre et la concentration des analytes présents dans la solution initiale. 15 20 25
15. 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, caractérisé en ce qu'il comporte une étape consistant à appliquer un gradient de pression dans au moins l'un des réservoirs variant continument entre deux valeurs 5 extrêmes.
16. 16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 15, caractérisé en ce qu'il comporte une étape de mesure en continu de la concentration locale en analyte. 10
17. 17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 16, caractérisé en ce qu'il comporte une étape consistant à appliquer, via ladite au moins une source de tension contrôlable, au moins une seconde différence de potentiel entre au moins lesdits premier et second réservoirs et/ou au moins une différence de composition des électrolytes dans les réservoirs du dispositif. 15
18. 18. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 17, caractérisé en ce qu'il comporte une étape consistant à appliquer, via ladite au moins une source de tension contrôlable, une variation continue de différence de potentiel entre au moins lesdits premier et second réservoirs simultanément ou non à une variation continue de pression dans un moins l'un des réservoirs. 20