WO2010005078A1 - 細胞分散方法、細胞分散剤及び細胞測定方法 - Google Patents

細胞分散方法、細胞分散剤及び細胞測定方法 Download PDF

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博幸 加畑
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    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label

Definitions

  • the present invention relates to a cell dispersion method, a cell dispersion agent, and a cell measurement method. More specifically, the present invention relates to a cell dispersion method, a cell dispersion agent, and a cell measurement method for dispersing a cell mass generated during cell culture or a cell mass collected from a living body.
  • a plurality of cells aggregate to form a cell mass. Therefore, when the cells are used for microscopic observation (for example, cytodiagnosis) or measured using a flow cytometer, it is necessary to perform a process of dispersing the cell mass as a pretreatment.
  • Patent Document 1 discloses a method of using a proteolytic enzyme such as trypsin as a method of dispersing a cell mass.
  • a proteolytic enzyme such as trypsin
  • the protein contained in the medium is preferentially degraded. For this reason, the cell dispersion effect is insufficient. Further, even when a cell mass stored (immobilized) in an alcohol solution is dispersed using a proteolytic enzyme, the cell dispersion effect is insufficient.
  • the proteolytic enzyme when a cell mass contained in phosphate buffered saline (PBS) is dispersed using a proteolytic enzyme, the proteolytic enzyme can disperse the cell mass. However, when reacted for a long time, the proteolytic enzyme may dissolve the cell membrane. In addition, when a cell mass containing mucus-adherent cells such as cervical cells is dispersed, the proteolytic enzyme preferentially degrades mucus. For this reason, the cell dispersion effect is insufficient.
  • PBS phosphate buffered saline
  • Such cells that are insufficiently dispersed or damaged cells may affect the measurement by microscopic observation (for example, cytodiagnosis) or flow cytometry.
  • the present invention has been made in view of the circumstances as described above, and an object of the present invention is to provide a cell dispersion method, a cell dispersion agent, and a cell dispersion agent capable of dispersing a cell mass while reducing damage to cells. It aims at providing the used cell measuring method.
  • the present invention is a method for separating and dispersing a cell mass in which a plurality of cells are aggregated into individual cells in a liquid medium, characterized in that the cell mass and fluororesin particles are mixed in the liquid medium.
  • a cell dispersion method is provided.
  • this invention provides the cell dispersing agent for disperse
  • the present invention includes a mixing step of mixing a cell mass in which a plurality of cells are aggregated and fluororesin particles in a liquid medium, and a step of measuring the mixture obtained by the mixing step with a flow cytometer.
  • a cell measurement method is provided.
  • the cell dispersion method, cell dispersion agent, and cell measurement method of the present invention it is possible to disperse cell clusters while reducing damage to cells. Therefore, according to the cell dispersion method and the cell dispersion agent of the present invention, a measurement sample suitable for microscopic observation (for example, cytodiagnosis) and flow cytometry can be prepared. Moreover, according to such a cell measurement method, cell measurement can be favorably performed by flow cytometry.
  • Example 1 it is the microscope picture of the cell in the sample obtained by stirring in the presence of a fluororesin particle.
  • the comparative example 1 it is the microscope picture of the cell after performing 1.5-hour incubation with a trypsin.
  • the comparative example 1 it is the microscope picture of the cell after incubating with trypsin for 3 hours.
  • the comparative example 2 it is a microscope picture of the cell in the cell suspension after stirring with a pestle.
  • the comparative example 2 it is a microscope picture of the cell in the cell suspension after stirring with a pestle.
  • Example 3 it is a microscope picture of the cell in the sample obtained by performing stirring in fluororesin particle presence. It is a graph which shows the relationship between the density
  • the cell dispersion method of the present invention is a method in which a cell mass in which a plurality of cells are aggregated is separated and dispersed into individual cells in a liquid medium, and the cell mass and fluororesin particles are dispersed in the liquid medium. It is characterized by mixing.
  • the “cell mass” is an aggregate of a plurality of cells.
  • a cell mass collected by rubbing the mucous membrane of a living body and containing cells aggregated by mucus can be used as the cell mass.
  • Specific examples of the cell mass include those containing cells collected by rubbing the cervix, nasal cavity, and pharynx.
  • what was aggregated by several cells can also be used as a cell clump by preserve
  • a cell culture obtained by culturing cells collected from a living body can be used as a cell mass.
  • “dispersing the cell mass” means separating the cells constituting the cell mass from the cell mass and separating the cells into, for example, a solution.
  • the cell mass to be dispersed in the present invention refers to a huge structure obtained by aggregating single bodies, aggregates, or single bodies and aggregates. The cell mass may affect the measurement by cytodiagnosis or flow cytometry.
  • the state of “dispersed cells” that is the target of dispersion according to the present invention is preferably an aggregated state or a unitary state in which 2 to 6 cells are associated, and more preferably a unitary state. is there.
  • the cell mass is dispersed by the fluororesin particles entering the gap between the cells to which they adhere, that is, the gap between the cells, and lubricating the interface between the cells (the shear stress between the cells is reduced). To occur).
  • the degree of lubrication at the interface between cells increases in proportion to the rate at which the fluororesin particles enter the gaps between cells. That is, it is preferable to increase the rate at which the fluororesin particles enter the gaps between cells. For this reason, the one where the particle diameter of a fluororesin particle is smaller is preferable.
  • the ratio of the fluororesin particles entering the gap between the cells is such that when the cell mass and the fluororesin particles are mixed, the concentration of the fluororesin particles in the mixture containing the cell mass and the fluororesin particles is increased and / or fluorine It becomes larger by promoting the diffusion of resin particles. Therefore, in the cell dispersion method of the present invention, the cell mass can be more efficiently dispersed by adopting such conditions.
  • the step of stirring the mixture containing the cell mass and the fluororesin particles is further performed to promote the diffusion of the fluororesin particles in the mixture, thereby
  • two shear stresses namely an internal shear stress associated with the surface chemical activity inherent to the fluororesin particles and an external shear stress due to hydrodynamic action, act on the gap between the cells.
  • the lump can be quickly and easily dispersed.
  • an aqueous solution a water-soluble organic solvent, and a mixed solvent of an aqueous solution and a water-soluble organic solvent
  • a aqueous solution or a mixed solvent of an aqueous solution and a water-soluble organic solvent Preferred is an aqueous solution or a mixed solvent of an aqueous solution and a water-soluble organic solvent.
  • fluororesin constituting the fluororesin particles examples include polytetrafluoroethylene (PTFE), tetrafluoroethylene / perfluoroalkyl vinyl ether copolymer (PFA), tetrafluoroethylene / hexafluoropropylene copolymer (FEP), Examples thereof include tetrafluoroethylene / ethylene copolymer (ETFE), polyvinylidene fluoride (PVDF), polychlorotrifluoroethylene (PCTFE), and chlorotrifluoroethylene / ethylene copolymer (ECTFE).
  • PTFE polytetrafluoroethylene
  • PFA perfluoroalkyl vinyl ether copolymer
  • FEP tetrafluoroethylene / hexafluoropropylene copolymer
  • ETFE tetrafluoroethylene / ethylene copolymer
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • PCTFE polychloro
  • the concentration of the fluororesin particles in the mixture is preferably 0.003% by mass to 60% by mass, more preferably 0.2% by mass to 3% by mass.
  • the concentration of the fluororesin particles is 0.003% by mass or more, even cells fixed with a cell preservation solution containing alcohol are sufficiently dispersed.
  • the concentration of the fluororesin particles is preferably 0.2% by mass or more.
  • the concentration of the fluororesin particles is 60% by mass or less, the cells dispersed by the cell dispersion method of the present invention can be suitably used for flow cytometry and microscopic observation.
  • the concentration of the fluororesin particles in the test sample is preferably lower.
  • concentration of fluororesin particles in the test sample is low in order to perform observation without suspending the cells to be observed. Is preferred.
  • the concentration of the fluororesin particles is preferably 3% by mass or less from the viewpoint of obtaining cells suitable for flow cytometry and microscopic observation while sufficiently dispersing the cells.
  • the particle diameter of the fluororesin particles can be appropriately selected depending on the size of cells to be dispersed and the use of cells dispersed by the cell dispersion method of the present invention.
  • the fluororesin particles need to enter between cells and lubricate the interface between cells.
  • the particle diameter of the fluororesin particles is preferably smaller than the cell size.
  • the particle diameter of the fluororesin particles is preferably 1/10 or less, more preferably 1/100 or less, with respect to the cell size.
  • the size of plant cells is about 200 ⁇ m
  • the size of animal cells is about 30 ⁇ m.
  • cervical cells may have a size of about 60 ⁇ m.
  • the particle diameter of the fluororesin particles is preferably 200 ⁇ m or less, more preferably 20 ⁇ m or less, and even more preferably 2 ⁇ m or less.
  • the particle diameter of the fluororesin particles is preferably 60 ⁇ m or less, more preferably 6 ⁇ m or less, and even more preferably 0.6 ⁇ m or less.
  • the particle diameter of the fluororesin particles is preferably 0.1 ⁇ m or more.
  • the particle diameter of the fluororesin particles is preferably 1/10 or less, more preferably 1/100 or less, with respect to the cell size.
  • flow cytometry measures scattered light intensity reflecting the size of a measurement substance and fluorescence intensity reflecting internal information of the measurement substance.
  • the cells are stained with a visualization agent to emit fluorescence, but the fluororesin particles are not stained with the visualization agent and do not emit autofluorescence. Therefore, it is possible to determine whether the measurement substance is a cell or a fluororesin particle based on the presence or absence of fluorescence.
  • the particle size of the fluororesin particles is preferably 1/10 or less with respect to the size of the cell to be measured. Preferably it is 1/100 or less.
  • the fluororesin particles having such a particle size it is possible to determine whether it is a cell or a fluororesin particle from the size information obtained from the scattered light intensity. For this reason, the apparatus and program which measure fluorescence intensity can be omitted.
  • the larger the number of particles to be measured the greater the limit of the number of particles measured in the apparatus and the longer the time required for analysis. Therefore, it is preferable that the number of particles to be measured is small. For this reason, if the particle diameter of the fluororesin particles is sufficiently small with respect to the size of the cells, the measurement of the number of cells is not hindered, so that useless counting can be reduced.
  • the average particle diameter of the fluororesin particles is preferably 0.1 ⁇ m or more, more preferably 0.2 ⁇ m or more, from the viewpoint of easy handling, and the fluororesin particles enter between cells, and the interface between cells. From the viewpoint of lubricating oil, it is preferably 200 ⁇ m or less, more preferably 10 ⁇ m or less, and even more preferably 5 ⁇ m or less.
  • the said average particle diameter means the number average diameter measured by the light-scattering method.
  • the cell mass may be a cell mass adhered to a cell culture substrate.
  • a cell dispersion method using a proteolytic enzyme is known.
  • the proteolytic enzyme may dissolve the cell membrane of the cells constituting the cell mass.
  • the fluororesin particles are used in the cell dispersion method of the present invention, the cell mass is detached from the cell culture substrate without damaging the cells constituting the cell mass, and the individual cells are separated. This is advantageous in that it can be dispersed in cells.
  • a cell mass before mixing with the fluororesin particles may be contained in the medium.
  • the medium may be any of a solid medium, a semi-solid medium, and a liquid medium.
  • the cell mass may be a cell mass adhered to the cell culture substrate, or may be a cell mass not adhered to the cell culture substrate.
  • a proteolytic enzyme preferentially degrades the protein contained in a culture medium. Therefore, the intended cell dispersion effect is insufficient.
  • the cell dispersion method of the present invention is advantageous in that the cell mass in the medium can be sufficiently dispersed because the fluororesin particles are used.
  • the cell mass before mixing with the fluororesin particles may be contained in the phosphate buffered physiological saline.
  • the cell mass may be a cell mass adhered to the cell culture substrate or a cell mass not adhered to the cell culture substrate.
  • a cell mass contained in phosphate buffered saline is dispersed using a proteolytic enzyme as in the past, when the proteolytic enzyme and the cell mass are reacted for a long time, the proteolytic enzyme In some cases, the cell membrane of the cells constituting the mass is dissolved.
  • the fluororesin particles are used in the cell dispersion method of the present invention, the cells constituting the cell mass in the phosphate buffered saline are sufficiently damaged without damaging the cells. The mass can be dispersed.
  • the cell mass may contain cervical cells.
  • proteolytic enzymes when used to disperse cell masses containing mucus-adherent cells such as cervical cells, proteolytic enzymes preferentially degrade mucus. Therefore, the intended cell dispersion effect is insufficient.
  • the proteolytic enzyme and the cell mass are reacted for a long time, the proteolytic enzyme may dissolve the cell membrane of the cells constituting the cell mass.
  • the fluororesin particles are used in the cell dispersion method of the present invention, the cell mass can be sufficiently dispersed without damaging cervical cells.
  • the cell mass before mixing with the fluororesin particles may be immobilized.
  • the fixed cell mass include a cell mass collected from the cervix and stored in a methanol solution.
  • the cell mass remains in an aggregated state under the same reaction conditions as those for dispersing the non-immobilized cell mass. The dispersion of is insufficient.
  • the proteolytic enzyme may dissolve the cell membrane of the cells constituting the cell mass.
  • the fluororesin particles are used in the cell dispersion method of the present invention, the cell mass is sufficiently dispersed without damaging the cells constituting the immobilized cell mass. be able to.
  • the cell dispersion method of the present invention includes a step of adding a visualization agent for visualizing cells, that is, a step of bringing a cell mass into contact with a visualization agent for visualizing cells (hereinafter referred to as “visualization step”). Further, it may be included.
  • the visualization step may be performed simultaneously with the mixing of the cell mass and the fluororesin particles, or may be performed after the mixing of the cell mass and the fluororesin particles.
  • a visualization agent may be added to the cell mass or the fluororesin particles before mixing the cell mass and the fluororesin particles.
  • the “visualizing agent” refers to an agent that makes it possible to observe a cell that cannot be observed with a microscope or is difficult to observe, or an agent that makes it possible to detect a cell that cannot be detected with a flow cytometer.
  • the visualization agent include a staining agent that stains the cell membrane, cytoplasm, cell nucleus, or organelle of a cell.
  • examples of the visualization agent include propidium iodide that selectively stains cell nuclei, trypan blue that stains whole cells, and the like. These visualization agents do not stain the fluororesin particles. Therefore, flow cytometry and cytodiagnosis can be performed even when a sample for flow cytometry and cytodiagnosis contains a visualization agent and fluororesin particles.
  • the cell dispersion method of the present invention may further include an accelerating step of increasing the ratio of the fluororesin particles entering the gaps between cells contained in the cell mass in the mixture of the cell mass and fluororesin particles.
  • an accelerating step of increasing the ratio of the fluororesin particles entering the gaps between cells contained in the cell mass in the mixture of the cell mass and fluororesin particles By performing this promotion step, the degree of lubrication at the interface between cells can be increased and the cell mass can be dispersed more efficiently.
  • the accelerating step only needs to increase the rate at which the fluororesin particles enter the gaps between the cells contained in the cell mass to increase the shear stress between the cells.
  • the cell mass and the fluororesin particles And stirring the mixture for a predetermined time referred to as “stirring step”
  • an external force for example, injection input
  • stirring step examples include stirring by applying a rotational force to the mixture (for example, stirring with a pestle or a stirring rod), stirring by vibration, and the like.
  • the agitation time is not particularly limited, and may be performed under the condition that the cells dispersed by the cell dispersion method of the present invention are not damaged by excessive shear stress.
  • the cells dispersed by the cell dispersion method of the present invention are suitable as cell samples for flow cytometry or microscopic observation for measuring the shape of individual cells.
  • examples of the “damage” include that the cell is broken or cleaved, and that the intracellular substance is released to the outside of the cell.
  • the cell-dispersing agent of the present invention contains fluororesin particles.
  • the cell dispersion agent of the present invention can be used in the cell dispersion method. According to the cell dispersant of the present invention, since the fluororesin particles are contained, the cells can be efficiently dispersed while suppressing damage to the cells by lubricating the interface between the cells constituting the cell mass. Can do.
  • the cell dispersant of the present invention may be fluororesin particles themselves or a dispersion in which fluororesin particles are dispersed in a solvent (for example, the liquid medium or the like).
  • Fluorine resin constituting the fluororesin particles used in the cell dispersant of the present invention and the particle diameter of the fluororesin particles are the same as in the cell dispersion method.
  • the cell dispersant of the present invention preferably further contains a visualization agent for visualizing cells.
  • a visualization agent for visualizing cells Cells dispersed using such a cell dispersing agent are visualized so as to be detectable or observable in flow cytometry and microscopic observation, and are therefore suitable as test samples for flow cytometry and microscopic observation.
  • the visualization agent used for the cell dispersion agent of the present invention is the same as in the case of the cell dispersion method.
  • the content of the visualizing agent in the cell dispersing agent should be appropriately set according to the number of cells to be dispersed, the use of the cell dispersing agent, etc. Can do.
  • the cell measurement method of the present invention comprises a mixing step in which a cell mass in which a plurality of cells are aggregated and fluororesin particles are mixed in a liquid medium, and cells in the mixture obtained by the mixing step are flow cytometers.
  • Dispersed cells obtained by the mixing step are suitable as a measurement sample in cell measurement by flow cytometry because the cells are less damaged and are dispersed in individual cells.
  • the mixing step is performed in the same manner as the mixing of the cell mass and the fluororesin particles in the cell dispersion method.
  • a step of adding a visualization agent for visualizing the cells that is, a visualization step of bringing a cell mass into contact with a visualization agent for visualizing the cells May further be included.
  • the visualization step and the stirring step can be performed by the same operations as the visualization step and the stirring step in the cell dispersion method, respectively.
  • FIG. 1 shows the overall configuration of a cell analyzer using a flow cytometry method.
  • the apparatus main body 2 of the cell analyzer 1 includes an optical detection unit 3 for detecting information such as the size of cells and nuclei from a measurement sample, a signal processing circuit (signal processing unit) 4, a measurement control unit 6, and a motor.
  • a drive unit 7 such as an actuator and a valve, and various sensors 8 are provided.
  • the measurement control unit 6 controls the operation of the drive unit 7 while processing the signal of the sensor 8, whereby the measurement sample is sucked and measured.
  • the cell analyzer 1 can be used, for example, when determining whether or not cancer cells are included in cervical cells.
  • the cell mass can be dispersed as follows. Cells collected from the cervix are added to a cell preservation solution containing an alcohol solution (for example, 55% by mass methanol aqueous solution) and fixed to obtain a cell suspension.
  • a cell dispersant containing 60% by mass of fluororesin particles and 1% by mass or less of propidium iodide (PI) as a visualization agent in an aqueous solution is used.
  • PI propidium iodide
  • a cell dispersant is added to the cell suspension so that the concentration of the fluororesin particles is 0.003% by mass to 60% by mass to prepare a mixture.
  • the obtained mixture is stirred to disperse the cell mass and obtain a measurement sample. Since PI is a visualizing agent that selectively stains the nucleus of a cell, fluorescence from the nucleus can be detected in dispersed cells.
  • the obtained measurement sample is accommodated in a test tube, installed at a position below a pipette (not shown) of the apparatus body 2, sucked by the pipette, and supplied to the flow cell.
  • FIG. 2 is a diagram illustrating a configuration of the optical detection unit 3.
  • the lens system (optical system) 52 condenses the laser light emitted from the semiconductor laser 53 that is a light source on the measurement sample that flows through the flow cell 51.
  • the condensing lens 54 condenses the forward scattered light of the cervical cells and the fluororesin particles in the measurement sample on the photodiode 55 which is a scattered light detector.
  • the condensing lens 56 condenses the side scattered light and the side fluorescence of the cell or cell nucleus on the dichroic mirror 57.
  • the dichroic mirror 57 reflects side scattered light to the photomultiplier 58 that is a scattered light detector, and transmits side fluorescence toward the photomultiplier 59 that is a fluorescence detector.
  • the photodiode 55, the photomultiplier 58, and the photomultiplier 59 convert the detected light into an electrical signal, and output a forward scattered light signal, a side scattered light signal, and a side fluorescent signal, respectively. These outputs are amplified by a preamplifier (not shown) and then supplied to the signal processing circuit 4 (see FIG. 1).
  • a value reflecting the cell size is obtained from the signal obtained by detecting the forward scattered light of the cervical cells. Further, a value reflecting the size of the cell nucleus is obtained from the signal obtained by detecting the side fluorescence of the cervical cell.
  • the size of the cervical cell is about 60 ⁇ m, and the size of the nucleus is 5 to 7 ⁇ m. When these cells become cancerous, the frequency of cell division increases abnormally, and the nucleus becomes 10-15 ⁇ m in size. This increases the N / C ratio (nucleus size / cell size) compared to normal cells. Therefore, by detecting the size of the cell and the size of the nucleus, it can be determined whether the cervical cell is a normal cell or a cancer cell.
  • a value reflecting the size of the fluororesin particles can be obtained from the signal obtained by detecting the forward scattered light of the fluororesin particles.
  • the side fluorescence does not substantially occur.
  • the N / C ratio of the fluororesin particles is substantially equal to 0, which is smaller than the N / C ratio of normal cells and cancer cells. That is, fluororesin particles, normal cells, and cancer cells can be distinguished from the N / C ratio. Therefore, even if fluororesin particles are included in the measurement sample, it can be determined whether or not cancer cells are included in the cervical cells.
  • cells dispersed using fluororesin particles can be applied to flow cytometry.
  • Example 1 [Cell dispersion effect by fluororesin particles in cervical cytology specimen]
  • a cell sample obtained by immobilizing cells collected from the cervix with a cell preservation solution containing alcohol (product name: PreservCyt (registered trademark), manufactured by Hologic Inc.) was obtained.
  • the cell sample was subjected to centrifugation at 190 ⁇ g for 5 minutes at room temperature to recover the cells.
  • a cell suspension was obtained by collecting an amount corresponding to 150 ⁇ L from the collected cells with a pipette.
  • PTFE particles polytetrafluoroethylene particles (hereinafter referred to as “PTFE particles”)] (Asahi Glass Co., Ltd., trade name: Fluon (registered trademark) PTFE dispersion AD911L, average of PTFE particles) Particle diameter (measured by light scattering method): 0.25 ⁇ m, PTFE particle content: 60% by mass, liquid specific gravity: 1.52] 3 ⁇ L, 0.5% by mass Trypan Blue staining solution (Nacalai Tesque) as a visualization agent 60 ⁇ L and 87 ⁇ L of water were added to obtain a test sample. Note that trypan blue is a dye that visualizes entire cells (including cell membranes and cell nuclei).
  • the cell dispersion treatment was performed by performing the following operations using the test sample. First, a test sample is added to 150 ⁇ L of the cell suspension so that the concentration of PTFE particles is 0.6% by mass and the concentration of trypan blue, which is a visualization agent, is 0.1% by mass. Obtained. Then, the obtained mixture was stirred for 3 minutes at 4000 rpm using a pestle, and the sample of Example 1 was obtained. As a reference example, a cell suspension before cell dispersion treatment was used.
  • Example 1 The sample of Example 1 and the cell suspension as a control were each observed with a microscope.
  • Example 1 the microscope picture of the cell in the sample obtained by performing stirring in the presence of a fluororesin particle is shown in FIG.
  • FIG. 1 a photomicrograph of the cells in the cell suspension is shown in FIG.
  • the test sample containing the fluororesin particles has an excellent cell dispersion effect, can disperse the cell mass in a state in which the cell morphology is maintained, and has little damage to the cells. It turns out that it has the property. Therefore, it turns out that the test sample containing a fluororesin particle is useful as a cell dispersing agent. It can also be seen that the cell dispersion method using the fluororesin particles can dissociate the cells in the cell suspension and disperse them in individual cells. Moreover, it turns out that the damage given to a cell is small from this result.
  • Comparative Example 1 [Cell dispersion method using proteolytic enzyme (trypsin)] To 150 ⁇ L of the same cell suspension used in Example 1, a trypsin PBS solution was added so that the final concentration of trypsin was 0.01% by mass, and the mixture was maintained at 37 ° C. for a predetermined time (1.5 hours, 3 hours, 3 hours). Incubation was performed for 46 hours). And each cell after incubation was observed with the microscope. In Comparative Example 1, the result of observing the cells after incubation for 1.5 hours with a microscope is shown in FIG. 5, and in Comparative Example 1, the result of observing the cells after 3 hours of incubation with a microscope is shown in FIG. FIG. 7 shows the results obtained by observing the cells after incubation for 46 hours in Comparative Example 1 with a microscope.
  • Comparative Example 2 [Cell dispersion method using physical force] 150 ⁇ L of the cell suspension similar to that used in Example 1 was collected in a plastic tube. Thereafter, the cell suspension was stirred at 4000 rpm for 3 minutes using a pestle. Next, the cells in the stirred cell suspension were observed with a microscope. In addition, propidium iodide solution is added to 150 ⁇ L of the stirred cell suspension so as to have a final concentration of 10 ⁇ g / mL to stain cell nuclei, and the cells in the cell suspension obtained after staining are stained. The cell nuclei were observed with a microscope. In Comparative Example 2, micrographs of cells in the cell suspension after stirring with pestle are shown in FIGS. Further, in Comparative Example 2, a micrograph of a stained image of the cell nucleus of the cell in the cell suspension after stirring with the pestle is shown in FIG.
  • the cell dispersion method of Comparative Example 1 using a proteolytic enzyme and the cell dispersion method of Comparative Example 2 using only physical force have insufficient cell dispersion effects or cell morphology. Can not be held.
  • the cell dispersion method of Example 1 the cells are sufficiently dispersed, and the damage given to the cells is small. Therefore, based on these results, according to a cell dispersant containing fluororesin particles (PTFE particles) and a cell dispersion method using the same, a measurement sample suitable for measurement by cytodiagnosis or flow cytometry is prepared. It is suggested that you can. Further, it can be seen that the cell dispersion method using the cell dispersing agent containing the fluororesin particles is suitable as a pretreatment in cytodiagnosis for observing individual cells and flow cytometry for measuring individual cells.
  • Example 2 [Examination of concentration of fluororesin particles] About 10 ⁇ L of cells were collected from the same cell suspension used in Example 1, and 60 ⁇ L of an aqueous dispersion of fluororesin particles similar to that used in Example 1 was added to prepare a mixture. . In addition, the density
  • Example 2 the sample of Example 2 was observed with a microscope.
  • Example 2 the microscope picture of the cell in the sample obtained by performing stirring in fluororesin particle presence is shown in FIG.
  • Example 3 [Cell dispersion effect in immobilized cultured cells]
  • the cultured cells were suspended in a medium and cultured in a Teflon (registered trademark) dish to form spherical aggregates of cells called spheroids in the medium.
  • the medium containing this spheroid was subjected to centrifugation at 190 ⁇ g for 5 minutes at room temperature to recover the cell group containing the spheroid.
  • a cell preservation solution similar to that used in Example 1 was added to the obtained cell group to immobilize the cells to obtain a cell suspension. Thereafter, trypan blue was added to 150 ⁇ L of the cell suspension containing the immobilized cultured cells so that the final concentration was 0.1% by mass to stain the cells.
  • Example 3 A cell dispersion similar to the cell dispersant in Example 1 was added to the cell suspension after staining so that the final concentration of PTFE particles was 0.6% by mass to obtain a mixture. Thereafter, the obtained mixture was stirred at 4000 rpm for 3 minutes using a pestle. The mixture after stirring was used as the sample of Example 3.
  • Example 3 the sample of Example 3 was observed with a microscope.
  • Example 3 the microscope picture of the cell in the sample obtained by stirring in presence of a cell dispersing agent is shown in FIG.
  • Table 1 summarizes the cell dispersion effect and the damage to cells in each of the cell dispersion methods of Examples 1 to 3 and Comparative Examples 1 and 2 described so far.
  • the cell dispersion method of Comparative Example 1 using a proteolytic enzyme and the cell dispersion method of Comparative Example 2 using only physical force have insufficient cell mass dispersion. It can also be seen that the damage to the cells is also great. Compared with these, in each of the cell dispersion methods of Example 1, Example 2 and Example 3 (cell dispersion method of the present invention), the cell mass is dissociated and dispersed in individual cells, and It can be seen that the damage to the is small.
  • Test Example 1 [Study of influence of concentration of fluororesin particles on cell dispersion effect] Using the same fluororesin particle aqueous dispersion and cell suspension as those used in Example 1, the influence of the concentration of the fluororesin particles on the cell dispersion effect was examined as follows.
  • Example 4 An aqueous dispersion of fluororesin particles is added to the cell suspension so that the final concentration of PTFE particles, which are fluororesin particles, is 0.003% by mass, and the final concentration is 0.1% by mass. Trypan blue was added to obtain a mixture. The resulting mixture was stirred for 3 minutes at 4000 rpm using a stir bar (Example 4). The mixture after stirring was used as the sample of Example 4.
  • the final concentration of PTFE particles is 0.03% by mass (Example 5), 0.06% by mass (Example 6), 0.3% by mass (Example 7), 3% by mass (Example 8) or Samples of Examples 5 to 9 were obtained by performing the same operations as in Example 4 except that the amount was 60% by mass (Example 9).
  • the concentration of PTFE particles was 0.003% by mass, 0.03% by mass, 0.06% by mass, 0.3% by mass, 3% by mass and In any case of 60% by mass, “cell mass in which 2 to 5 cells aggregate” or “in the cell suspension” compared with the cell suspension not added with PTFE particles (Comparative Example 3) or “ It can be seen that the ratio of “cell aggregates of 6 or more cells aggregated” decreases and the ratio of “single cells” increases to over 70%. Therefore, in the cell dispersion methods of Examples 4 to 9 using fluororesin particles, the concentration of the fluororesin particles is in a range from a low concentration of 0.003 mass% to a high concentration of 60 mass%. Is also suggested to show a cell dispersion effect.
  • Test Example 2 Examination of influence of presence or absence of fluororesin particles on cell dispersion effect Using cells derived from the cervix, the influence of the presence or absence of fluororesin particles on the cell dispersion effect was examined.
  • Example 10 In a cell suspension similar to that used in Example 1, an aqueous dispersion of fluororesin particles similar to that used in Example 1 was added so that the final concentration of PTFE particles would be 0.003% by mass. At the same time, trypan blue was added so that the concentration was 5% by mass. The resulting mixture was stirred with a stir bar at 4000 rpm for 3 minutes (Example 10). The mixture after stirring was used as the sample of Example 10. Further, a sample of Example 11 was obtained in the same manner as in Example 10 except that the stirring time was changed to 9 minutes.

Abstract

　細胞に与えるダメージを小さくしつつ、細胞塊を分散させることができる、細胞分散方法、細胞分散剤及び細胞測定方法を提供する。細胞塊の分散に際して、フッ素樹脂粒子を用いる。液体媒体中で、複数の細胞が凝集した細胞塊とフッ素樹脂粒子とを混合して、当該細胞塊を個々の細胞に分離して分散させる。また、分散した細胞を、フローサイトメトリーにて測定することにより細胞測定を行なう。

Description

細胞分散方法、細胞分散剤及び細胞測定方法
　本発明は、細胞分散方法、細胞分散剤及び細胞測定方法に関する。さらに詳しくは、細胞培養中に生じた細胞塊や生体から採取された細胞塊を分散する細胞分散方法、細胞分散剤及び細胞測定方法に関する。
　細胞培養物や子宮頸部から採取された細胞は、複数の細胞が凝集して細胞塊を形成している。したがって、前記細胞を、顕微鏡観察（例えば、細胞診）に用いる場合やフローサイトメーターを用いて測定する場合には、前処理として、細胞塊を分散する処理を行うことが必要になる。
　例えば、特許文献１には、細胞塊を分散させる方法として、トリプシン等のタンパク質分解酵素を使用する方法が開示されている。しかしながら、例えば、タンパク質分解酵素を用いて、培地中に含まれている細胞塊を分散させる場合、培地に含まれるタンパク質を優先的に分解する。このため、細胞分散効果は不十分である。また、タンパク質分解酵素を用いて、アルコール溶液中に保存されている（固定化されている）細胞塊を分散させる場合でも、細胞分散効果は不十分である。
　一方、タンパク質分解酵素を用いて、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に含まれている細胞塊を分散させる場合、タンパク質分解酵素は、細胞塊を分散することができる。しかしながら、長時間反応させると、タンパク質分解酵素は、細胞膜を溶解してしまう場合がある。また、子宮頸部細胞のような粘液付着細胞を含む細胞塊を分散させる場合、タンパク質分解酵素は粘液を優先的に分解する。このため、細胞分散効果は不十分である。
　このように分散が不十分である細胞やダメージを受けた細胞は、顕微鏡観察（例えば、細胞診）やフローサイトメトリーによる測定に影響を与えるおそれがある。
国際公開第２００５／０３８０４４号パンフレット
　本発明は、以上のような事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、細胞に与えるダメージを低減しつつ、細胞塊を分散することが可能な細胞分散方法、細胞分散剤及びそれらを用いた細胞測定方法を提供することを目的とする。
　本発明は、複数の細胞が凝集した細胞塊を液体媒体中で個々の細胞に分離して分散する方法であって、液体媒体中で細胞塊とフッ素樹脂粒子とを混合することを特徴とする細胞分散方法を提供する。また、本発明は、フッ素樹脂粒子を含有している、細胞塊を分散するための細胞分散剤を提供する。また、本発明は、複数の細胞が凝集した細胞塊とフッ素樹脂粒子とを液体媒体中で混合する混合工程と、前記混合工程によって得られた混合物をフローサイトメーターにて測定する工程とを含む、細胞測定方法を提供する。
　本発明の細胞分散方法、細胞分散剤及び細胞測定方法によれば、細胞に与えるダメージを低減しつつ、細胞塊を分散することができる。したがって、本発明の細胞分散方法、及び細胞分散剤によれば、顕微鏡観察（例えば、細胞診）やフローサイトメトリーに好適な測定試料を調製することができる。また、かかる細胞測定方法によれば、フローサイトメトリーにより良好に細胞測定を行なうことができる。
フローサイトメトリー法を用いた細胞分析装置の構成を示すブロック図である。 細胞分析装置内の光学検出部の構成を示す図である。 実施例１において、フッ素樹脂粒子存在下での撹拌を行なうことにより得られた試料中の細胞の顕微鏡写真である。 参考例として、フッ素樹脂粒子非存在下に撹拌した後の細胞懸濁液中の細胞の顕微鏡写真である。 比較例１において、トリプシンとともに１．５時間インキュベーションを行なった後の細胞の顕微鏡写真である。 比較例１において、トリプシンとともに３時間インキュベーションを行なった後の細胞の顕微鏡写真である 比較例１において、トリプシンとともに４６時間インキュベーションを行なった後の細胞の顕微鏡写真である。 比較例２において、ペッスルで撹拌した後の細胞懸濁液中の細胞の顕微鏡写真である 比較例２において、ペッスルで撹拌した後の細胞懸濁液中の細胞の顕微鏡写真である 比較例２において、ペッスルで撹拌した後の細胞懸濁液中の細胞の細胞核の染色像の顕微鏡写真である。 実施例２において、フッ素樹脂粒子存在下での撹拌を行なうことにより得られた試料中の細胞の顕微鏡写真である。 実施例３において、フッ素樹脂粒子存在下での撹拌を行なうことにより得られた試料中の細胞の顕微鏡写真である。 ＰＴＦＥ粒子の濃度と単一細胞及び細胞塊それぞれの比率との関係を示すグラフである。 ＰＴＦＥ粒子の有無と単一細胞及び細胞塊それぞれの比率との関係を示すグラフである。
１．細胞分散方法
　本発明の細胞分散方法は、複数の細胞が凝集した細胞塊を液体媒体中で個々の細胞に分離して分散する方法であって、液体媒体中で細胞塊とフッ素樹脂粒子とを混合することを特徴としている。
　本明細書における「細胞塊」とは、複数の細胞が凝集したものである。本発明においては、例えば、生体の粘膜を擦過して採取された、粘液により凝集している細胞を含むものを細胞塊として用いることができる。具体的な細胞塊としては、例えば、子宮頸部、鼻腔、咽頭を擦過して採取した細胞を含むもの等が挙げられる。また、本発明においては、アルコール溶液中に保存することにより、複数の細胞が凝集したものを細胞塊として用いることもできる。さらに、生体から採取した細胞を培養して得られた細胞培養物を細胞塊として用いることもできる。
　本明細書において、「細胞塊を分散する」とは、細胞塊から、細胞塊を構成する細胞を分離し、かかる細胞を、例えば、溶液中に離散させることをいう。本発明における分散対象となる細胞塊は、単一体同士、会合体同士、又は単一体と会合体とが凝集した巨大な構造体をいう。前記細胞塊は、細胞診やフローサイトメトリーでの測定に影響を及ぼすおそれがある。一方、本発明による分散の目標となる「分散した細胞」の状態は、好ましくは２～６個の細胞が会合した会合体の状態又は単一体の状態であり、さらに好ましくは単一体の状態である。
　本発明の細胞分散方法において、細胞塊の分散は、フッ素樹脂粒子が、接着している細胞の間隙、すなわち、細胞間の間隙に入り込み、細胞間の界面を潤滑する（細胞間にずり応力が生じる）ことにより行なわれる。細胞間の界面における潤滑の程度は、フッ素樹脂粒子が細胞間の間隙に入り込む割合に比例して大きくなる。すなわち、フッ素樹脂粒子が、細胞間の間隙に入り込む割合を大きくすることが好ましい。このため、フッ素樹脂粒子の粒子径が小さいほうが好ましい。また、フッ素樹脂粒子が細胞間の間隙に入り込む割合は、細胞塊とフッ素樹脂粒子との混合に際して、細胞塊とフッ素樹脂粒子とを含む混合物中のフッ素樹脂粒子の濃度を上げること及び／又はフッ素樹脂粒子の拡散を促進することで大きくなる。したがって、本発明の細胞分散方法においては、かかる条件を採用することによって、より効率よく細胞塊を分散させることができる。本発明の細胞分散方法においては、細胞塊とフッ素樹脂粒子とを含む混合物を撹拌する工程（撹拌工程）をさらに行ない、前記混合物中におけるフッ素樹脂粒子の拡散を促進することにより、フッ素樹脂粒子を用いることとの相乗効果として、細胞の間隙には、フッ素樹脂粒子に固有の界面化学活性に伴う内的ずり応力と、流体力学的作用による外的ずり応力の２つのずり応力が働くため、細胞塊を迅速、かつ簡便に分散することができる。
　本明細書において、細胞を分散させるための液体媒体としては、水溶液、水溶性有機溶媒、及び水溶液と水溶性有機溶媒との混合溶媒を用いることができる。好ましくは水溶液、又は水溶液と水溶性有機溶媒との混合溶媒である。
　フッ素樹脂粒子を構成するフッ素樹脂としては、例えば、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、テトラフルオロエチレン・パーフルオロアルキルビニルエーテル共重合体（ＰＦＡ）、テトラフルオロエチレン・ヘキサフルオロプロピレン共重合体（ＦＥＰ）、テトラフルオロエチレン・エチレン共重合体（ＥＴＦＥ）、ポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）、ポリクロロトリフルオロエチレン（ＰＣＴＦＥ）、クロロトリフルオエチレン・エチレン共重合体（ＥＣＴＦＥ）等が挙げられる。
　本発明の細胞分散方法では、前記混合物中のフッ素樹脂粒子の濃度は、好ましくは０．００３質量％以上６０質量％以下、より好ましくは０．２質量％以上３質量％以下である。
　前記フッ素樹脂粒子の濃度が０．００３質量％以上であれば、アルコールを含む細胞保存液で固定化された細胞であっても十分に分散される。また、未洗浄の培地中の細胞塊を分散させる場合には、フッ素樹脂粒子の濃度は、好ましくは０．２質量％以上である。さらに、フッ素樹脂粒子の濃度が６０質量％以下であれば、本発明の細胞分散方法により分散した細胞は、フローサイトメトリーや顕微鏡観察に好適に用いることができる。本発明の細胞分散方法により分散した細胞を含む被験試料（測定試料）をフローサイトメトリーに用いる場合、細胞の測定に与える影響をより小さくし、流路の洗浄をより容易にするためには、前記被験試料中におけるフッ素樹脂粒子の濃度は低い方が好ましい。本発明の細胞分散方法により分散させた細胞を含む被験試料を顕微鏡観察に用いる場合、観察対象である細胞を浮遊させることなく観察を行なうには、前記被験試料中におけるフッ素樹脂粒子の濃度が低い方が好ましい。このため、細胞を十分に分散させつつ、フローサイトメトリーや顕微鏡観察に用いるのに適した細胞を得る観点から、前記フッ素樹脂粒子の濃度は、好ましくは３質量％以下である。
　フッ素樹脂粒子の粒子径は、分散対象の細胞の大きさや本発明の細胞分散方法により分散した細胞の用途によって適宜選択することができる。細胞塊を分散させるには、フッ素樹脂粒子が細胞同士の間に入り込み、細胞間の界面を潤滑させる必要がある。このため、フッ素樹脂粒子の粒子径は、細胞の大きさより小さいほうが好ましい。フッ素樹脂粒子の粒子径は、細胞の大きさに対して、好ましくは１／１０以下、さらに好ましくは１／１００以下である。
　一般的には、植物細胞の大きさは、２００μｍ程度、動物細胞の大きさは、３０μｍ程度である。動物細胞の中でも、子宮頸部細胞は、６０μｍ程度の大きさを有することもある。例えば、２００μｍ程度の大きさである植物細胞を含む細胞塊を分散させる場合、フッ素樹脂粒子の粒子径は、好ましくは２００μｍ以下、より好ましくは２０μｍ以下、さらに好ましくは２μｍ以下である。６０μｍ程度の大きさである子宮頸部細胞を含む細胞塊を分散させる場合、フッ素樹脂粒子の粒子径は、好ましくは６０μｍ以下、より好ましくは６μｍ以下、さらに好ましくは０．６μｍ以下である。一方、フッ素樹脂粒子の飛散等を抑制し、取扱い易くする観点から、フッ素樹脂粒子の粒子径は、好ましくは０．１μｍ以上である。本発明の細胞分散方法では、前記フッ素樹脂粒子として、粒子径が０．１μｍ以上２００μｍ以下の粒子を含む粒子混合物を用いることが好ましい。
　本発明の細胞分散方法により分散した細胞を含む被験試料を顕微鏡観察による細胞診に用いる場合、観察対象である細胞とフッ素樹脂粒子とが同程度の大きさであると、フッ素樹脂粒子は顕微鏡観察の妨げとなるおそれがある。よって、フッ素樹脂粒子の粒子径は、細胞の大きさに対して、好ましくは１／１０以下、より好ましくは１／１００以下であることが望ましい。
　本発明の細胞分散方法により分散した細胞を含む被験試料をフローサイトメトリーに用いる場合、前記被験試料中のフッ素樹脂粒子の粒子径が測定に与える影響は小さい。フローサイトメトリーは、一般的には、測定物質の大きさを反映した散乱光強度と、測定物質の内部情報を反映した蛍光強度とを測定している。細胞は、可視化剤で染色され蛍光を発するが、フッ素樹脂粒子は、可視化剤によって染色されることなく、また自己蛍光も発しない。このため、蛍光の有無により、測定物質が細胞であるかフッ素樹脂粒子であるかを判別することができる。本発明の細胞分散方法により分散した細胞を含む被験試料をフローサイトメトリーに用いる場合、フッ素樹脂粒子の粒子径は、測定対象である細胞の大きさに対して、好ましくは１／１０以下、より好ましくは１／１００以下である。このような粒子径のフッ素樹脂粒子を用いることによって、散乱光強度で得られる大きさ情報から、細胞であるかフッ素樹脂粒子であるかを判別することができる。このため、蛍光強度を測定する装置やプログラムを省略することができる。また、フローサイトメトリーでは、測定対象の粒子数が多いほど、装置での測定粒子数の限界値を超えるおそれや分析に時間を要するおそれがあるため、測定対象の粒子数は少ない方が好ましい。このため、フッ素樹脂粒子の粒子径が細胞の大きさに対して十分に小さい粒子径であれば、細胞数の測定の妨げとならないので、無駄なカウントを減少させることができる。
　かかるフッ素樹脂粒子の平均粒子径は、取り扱いの容易性の観点から、好ましくは０．１μｍ以上、より好ましくは０．２μｍ以上であり、フッ素樹脂粒子が細胞同士の間に入り込み、細胞間の界面を潤滑させる観点から、好ましくは２００μｍ以下、より好ましくは１０μｍ以下、さらに好ましくは５μｍ以下である。なお、前記平均粒子径は、光散乱法により測定された個数平均径を意味する。
　本発明の細胞分散方法では、前記細胞塊は、細胞培養基材に接着した細胞塊であってもよい。細胞培養基材に接着した細胞塊を分散させる従来の方法としては、タンパク質分解酵素を用いた細胞分散方法が知られている。ところが、この方法では、タンパク質分解酵素と細胞塊とを長時間反応させると、タンパク質分解酵素が、当該細胞塊を構成する細胞の細胞膜を溶解させてしまう場合がある。これに対して、本発明の細胞分散方法は、前記フッ素樹脂粒子が用いられているため、細胞塊を構成する細胞にダメージを与えることなく、細胞塊を細胞培養基材から剥離し、個々の細胞に分散させることができるという点で有利である。
　また、本発明の細胞分散方法では、フッ素樹脂粒子との混合前の細胞塊が培地中に含まれていてもよい。本発明において、培地は、固体培地、半固体培地及び液体培地のいずれであってもよい。細胞塊は、細胞培養基材に接着した細胞塊であってもよく、細胞培養基材に接着していない細胞塊であってもよい。ところで、従来のように、タンパク質分解酵素を用いて、培地中に含まれる細胞塊を分散させる場合、タンパク質分解酵素が、培地中に含まれるタンパク質を優先的に分解する。そのため、目的とする細胞分散効果が不十分となる。これに対して、本発明の細胞分散方法は、前記フッ素樹脂粒子が用いられているため、培地中の細胞塊を十分に分散することができるという点で有利である。
　さらに、本発明の細胞分散方法では、フッ素樹脂粒子との混合前の細胞塊がリン酸緩衝化生理食塩水中に含まれていてもよい。この場合、細胞塊は、細胞培養基材に接着した細胞塊であってもよく、細胞培養基材に接着していない細胞塊であってもよい。従来のように、タンパク質分解酵素を用いて、リン酸緩衝化生理食塩水中に含まれる細胞塊を分散させる場合、タンパク質分解酵素と細胞塊とを長時間反応させると、タンパク質分解酵素が、当該細胞塊を構成する細胞の細胞膜を溶解させてしまう場合がある。これに対して、本発明の細胞分散方法は、前記フッ素樹脂粒子が用いられているため、リン酸緩衝化生理食塩水中の細胞塊を構成する細胞に対して、ダメージを与えることなく十分に細胞塊を分散することができる。
　また、本発明の細胞分散方法では、細胞塊が子宮頚部細胞を含んでいてもよい。従来のように、タンパク質分解酵素を用いて、子宮頸部細胞のような粘液付着細胞を含む細胞塊を分散させる場合、タンパク質分解酵素は、粘液を優先的に分解する。そのため、目的とする細胞分散効果が不十分となる。しかも、タンパク質分解酵素と細胞塊とを長時間反応させると、タンパク質分解酵素が、当該細胞塊を構成する細胞の細胞膜を溶解してしまう場合がある。これに対して、本発明の細胞分散方法は、前記フッ素樹脂粒子が用いられているため、子宮頸部細胞に対して、ダメージを与えることなく、十分に細胞塊を分散することができる。
　本発明の細胞分散方法では、フッ素樹脂粒子との混合前の細胞塊は、固定化されていてもよい。固定化された細胞塊の例としては、子宮頚部から採取され、メタノール溶液中に保存された細胞塊等が挙げられる。かかる固定化された細胞塊を、タンパク質分解酵素を用いて分散させる場合、固定化されていない細胞塊を分散させるのと同様の反応条件では、細胞塊が凝集した状態のままであり、細胞塊の分散は不十分である。一方、固定化された細胞塊を分散させるためにタンパク質分解酵素と細胞塊とを長時間反応させると、タンパク質分解酵素が、当該細胞塊を構成する細胞の細胞膜を溶解してしまう場合がある。これに対して、本発明の細胞分散方法は、前記フッ素樹脂粒子が用いられているため、固定化された細胞塊を構成する細胞に対して、ダメージを与えることなく十分に細胞塊を分散することができる。
　本発明の細胞分散方法は、細胞を可視化するための可視化剤を添加する工程、すなわち、細胞塊と、細胞を可視化するための可視化剤とを接触させる工程（以下、「可視化工程」という）をさらに含んでもよい。前記可視化工程は、前記細胞塊とフッ素樹脂粒子との混合と同時に行なってもよく、前記細胞塊とフッ素樹脂粒子との混合の後に行なってもよい。また、本発明においては、前記細胞塊とフッ素樹脂粒子との混合を行なう前の細胞塊又はフッ素樹脂粒子に可視化剤を添加してもよい。
　本明細書において、「可視化剤」とは、顕微鏡で観察できない又は観察しづらい細胞を、観察できる又は観察しやすいようにする薬剤や、フローサイトメーターで検出できない細胞を検出できるようにする薬剤をいう。可視化剤としては、例えば、細胞の細胞膜、細胞質、細胞核又は細胞小器官を染色する染色剤等が挙げられる。具体的には、可視化剤としては、例えば、細胞の核を選択的に染色するヨウ化プロピジウム、細胞全体を染色するトリパンブルー等が挙げられる。これらの可視化剤は、フッ素樹脂粒子を染色しない。したがって、フローサイトメトリーや細胞診を行なう試料中に、可視化剤とフッ素樹脂粒子とが含まれている場合でも、フローサイトメトリーや細胞診を行なうことができる。
　本発明の細胞分散方法は、前記細胞塊とフッ素樹脂粒子との混合物において、フッ素樹脂粒子が、細胞塊に含まれる細胞間の間隙に入り込む割合を大きくする促進工程をさらに含んでもよい。かかる促進工程を行なうことにより、細胞間の界面の潤滑の程度を大きくし、より効率よく細胞塊を分散させることができる。前記促進工程は、フッ素樹脂粒子が細胞塊に含まれる細胞間の間隙に入り込む割合を大きくして、細胞間におけるずり応力を増大させるものであればよく、例えば、前記細胞塊とフッ素樹脂粒子との混合物を所定時間撹拌すること（「撹拌工程」という）、フッ素樹脂粒子を、細胞塊を含む試料に添加する際にこのフッ素樹脂粒子に外力（例えば、注入力等）を加えること等が挙げられる。前記撹拌工程は、混合物に回転力を加えることによる撹拌（例えば、ペッスルや撹拌棒等によりかきまわすこと等）、振動による撹拌等が挙げられる。前記促進工程が撹拌工程である場合、撹拌時間は、特に限定されず、本発明の細胞分散方法により分散した細胞が過度のずり応力によるダメージを受けない条件で行なえばよい。
　従来のように、ミキサー等の撹拌により生じる大きなせん断力を用いて細胞塊を分散させる場合、細胞がダメージを受ける恐れがある。また、細胞にダメージを与えない程度のせん断力を作用させた場合、細胞分散効果が不十分となる。これに対して、本発明の細胞分散方法では、せん断力をほとんど用いることなく細胞塊を分散させることができる。また、本発明の細胞分散方法では、ペッスルの撹拌によりある程度のせん断力を加えた場合であっても、フッ素樹脂粒子の潤滑作用により、細胞に与えるダメージが減少する。このため、本発明の細胞分散方法によれば、個々の細胞の形状を保持した状態で細胞を分散させることができる。よって、本発明の細胞分散方法により分散された細胞は、個々の細胞の形状を測定するフローサイトメトリーや顕微鏡観察の細胞試料として好適である。
　なお、本明細書において、「ダメージ」としては、例えば、細胞が破断したり、開裂したりすること、細胞内の物質が細胞外へ放出されること等が挙げられる。
２．細胞分散剤
　本発明の細胞分散剤は、フッ素樹脂粒子を含有している。本発明の細胞分散剤は、前記細胞分散方法に用いることができる。本発明の細胞分散剤によれば、フッ素樹脂粒子を含有しているため、細胞塊を構成する細胞間の界面を潤滑することにより、細胞にダメージを抑制しつつ、細胞を効率よく分散させることができる。本発明の細胞分散剤は、フッ素樹脂粒子そのものであってもよく、溶媒（例えば、前記液体媒体等）にフッ素樹脂粒子を分散した分散物であってもよい。
　本発明の細胞分散剤に用いられるフッ素樹脂粒子を構成するフッ素樹脂及びフッ素樹脂粒子の粒子径は、前記細胞分散方法の場合と同様である。
　本発明の細胞分散剤は、細胞を可視化するための可視化剤をさらに含有することが好ましい。かかる細胞分散剤を用いて分散した細胞は、フローサイトメトリーや顕微鏡観察において、検出可能又は観察可能なように可視化されるため、フローサイトメトリーや顕微鏡観察の被験試料として好適である。本発明の細胞分散剤に用いられる可視化剤は、前記細胞分散方法の場合と同様である。
　細胞分散剤がフッ素樹脂粒子と可視化剤とを含有する剤である場合、細胞分散剤における可視化剤の含有量は、分散対象の細胞の数、細胞分散剤の用途等に応じて適宜設定することができる。
３．細胞測定方法
　本発明の細胞測定方法は、複数の細胞が凝集した細胞塊とフッ素樹脂粒子とを液体媒体中で混合する混合工程、及び前記混合工程によって得られた混合物中の細胞をフローサイトメーターにて測定する測定工程を含む。前記混合工程により得られる分散した細胞は、細胞のダメージが小さく、個々の細胞に分散されているため、フローサイトメトリーでの細胞測定における測定試料として適している。
　前記混合工程は、前記細胞分散方法における細胞塊とフッ素樹脂粒子との混合と同様に行なわれる。また、本発明の細胞測定方法においては、測定工程に先立って、細胞を可視化するための可視化剤を添加する工程、すなわち、細胞塊と、細胞を可視化するための可視化剤とを接触させる可視化工程をさらに含んでもよい。また、本発明の細胞測定方法においては、前記測定工程に先立って、前記混合工程によって得られた混合物を所定時間撹拌する撹拌工程をさらに含んでもよい。前記可視化工程及び撹拌工程は、それぞれ、前記細胞分散方法における可視化工程及び撹拌工程と同様の操作により行なうことができる。
　以下に、フッ素樹脂粒子を用いて細胞塊を分散させ、分散した細胞を含む被験試料を、フローサイトメトリーを用いた細胞分析装置で測定する場合を示し、説明する。
　図１は、フローサイトメトリー法を用いた細胞分析装置の全体構成である。細胞分析装置１の装置本体２は、測定試料から細胞や核のサイズ等の情報を検出するための光学検出部３と、信号処理回路（信号処理部）４と、測定制御部６と、モータ、アクチュエータ、バルブ等の駆動部７と、各種センサ８とを備えている。測定制御部６が、センサ８の信号を処理しつつ駆動部７の動作を制御することにより、測定試料の吸引や測定が行われる。
　この細胞分析装置１によれば、例えば、子宮頸部細胞に癌細胞が含まれているか否かを判断するときに用いることができる。
　細胞塊の分散は、以下のように行なうことができる。子宮頚部から採取された細胞を、アルコール溶液（たとえば５５質量％メタノール水溶液）を含む細胞保存液に加えて、固定化することにより、細胞懸濁液を得る。また、細胞分散剤として、水溶液中に、フッ素樹脂粒子６０質量％と可視化剤であるヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を１質量％以下とを含有した細胞分散剤を用いる。まず、細胞懸濁液に、フッ素樹脂粒子の濃度が０．００３質量％以上６０質量％以下となるように、細胞分散剤を加えて、混合物を作製する。つぎに、得られた混合物を撹拌し、細胞塊を分散させて、測定試料を得る。ＰＩは、細胞の核を選択的に染色する可視化剤であるため、分散した細胞において、核からの蛍光が検出可能となる。
　得られた測定試料は、試験管に収容され、装置本体２のピペット（図示せず）の下方位置に設置され、当該ピペットにより吸引されてフローセルに供給される。
　図２は、光学検出部３の構成を示す図である。レンズ系（光学系）５２は、光源である半導体レーザ５３から放射されたレーザ光を、フローセル５１を流れる測定試料に集光する。集光レンズ５４は、測定試料中の子宮頸部細胞及びフッ素樹脂粒子の前方散乱光を散乱光検出器であるフォトダイオード５５に集光する。また、集光レンズ５６は、前記細胞又は細胞核の側方散乱光と側方蛍光とをダイクロイックミラー５７に集光する。ダイクロイックミラー５７は、側方散乱光を散乱光検出器であるフォトマルチプライヤ５８へ反射し、側方蛍光を蛍光検出器であるフォトマルチプライヤ５９の方へ透過させる。そしてフォトダイオード５５、フォトマルチプライヤ５８及びフォトマルチプライヤ５９は、検出した光を電気信号に変換し、それぞれ、前方散乱光信号、側方散乱光信号及び側方蛍光信号を出力する。これらの出力は図示しないプリアンプにより増幅された後、前述した信号処理回路４（図１を参照）に供される。
　子宮頚部細胞の前方散乱光を検出した信号から、細胞の大きさを反映した値が得られる。また、子宮頸部細胞の側方蛍光を検出した信号から、細胞の核の大きさを反映した値が得られる。なお、子宮頸部細胞の大きさは、約６０μｍであり、また核の大きさは、５～７μｍである。この細胞が癌化すると、細胞分裂の頻度が異常に多くなり、核は、１０～１５μｍの大きさとなる。これにより、Ｎ／Ｃ比（核の大きさ／細胞の大きさ）が正常な細胞に比べて大きくなる。したがって、細胞の大きさと核の大きさとを検出することによって、子宮頸部細胞が、正常細胞であるか癌細胞であるかを判断することができる。
　一方、フッ素樹脂粒子の前方散乱光を検出した信号から、フッ素樹脂粒子の大きさを反映した値が得られる。しかしながら、フッ素樹脂粒子は、ＰＩ可視化剤で染色されないので、側方蛍光は実質生じない。このため、フッ素樹脂粒子のＮ／Ｃ比はほぼ０に等しく、正常細胞及び癌細胞のＮ／Ｃ比より小さい値となる。つまり、Ｎ／Ｃ比から、フッ素樹脂粒子、正常細胞及び癌細胞を区別することができる。したがって、測定試料中にフッ素樹脂粒子が含まれていても、子宮頸部細胞に癌細胞が含まれているか否かを判断することができる。以上のように、フッ素樹脂粒子を用いて分散した細胞は、フローサイトメトリーに適用できる。
　以下、本発明を、実施例に基づき詳細に説明するが、本発明は、かかる実施例に限定されるものではない。
実施例１：〔子宮頚部細胞診用検体におけるフッ素系樹脂粒子による細胞分散効果〕
　子宮頚部から採取された細胞を、アルコールを含む細胞保存液〔ホロジック（Ｈｏｌｏｇｉｃ　Ｉｎｃ．）製、商品名：ＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（登録商標）〕で固定化した細胞試料を得た。この細胞試料を１９０×ｇで５分間、室温の遠心分離に供して、細胞を回収した。回収した細胞からピペットによって１５０μＬ相当分を採取したものを細胞懸濁液とした。
　一方、フッ素樹脂粒子〔ポリテトラフルオロエチレン粒子（以下、「ＰＴＦＥ粒子」という）〕の水分散液〔旭硝子（株）社製、商品名：Ｆｌｕｏｎ（登録商標）　ＰＴＦＥ　ディスパージョン　ＡＤ９１１Ｌ、ＰＴＦＥ粒子の平均粒子径（光散乱法による測定）：０．２５μｍ、ＰＴＦＥ粒子の含有量：６０質量％、液比重：１．５２〕３μＬに、可視化剤である０．５質量％トリパンブルー染色液（ナカライテスク（株）社製）６０μＬと水８７μＬとを加えて、被験試料を得た。なお、トリパンブルーは、細胞全体（細胞膜と細胞核とを含む）を可視化する染料である。
　前記被験試料を用い、以下のように操作を行なうことにより、細胞分散処理を行なった。まず、前記細胞懸濁液１５０μＬに、ＰＴＦＥ粒子の濃度が０．６質量％となり、かつ可視化剤であるトリパンブルーの濃度が０．１質量％となるように、被験試料を加えて、混合物を得た。その後、得られた混合物を、ペッスルを用いて、４０００ｒｐｍで３分間撹拌し、実施例１の試料を得た。なお、参考例として、細胞分散処理前の細胞懸濁液を用いた。
　実施例１の試料及び対照としての細胞懸濁液それぞれを顕微鏡で観察した。実施例１において、フッ素樹脂粒子存在下での撹拌を行なうことにより得られた試料中の細胞の顕微鏡写真を図３に示す。また、参考例として、細胞懸濁液中の細胞の顕微鏡写真を図４に示す。
　図４に示された結果から、フッ素樹脂粒子を加えていない細胞懸濁液においては、子宮頚部細胞が凝集して細胞塊を形成していることがわかる。これに対して、図３に示された結果から、フッ素樹脂粒子を用いて細胞分散処理を行なった場合、試料中の子宮頚部細胞は、細胞形態が保持された状態で、個々の細胞に分散していることがわかる。
　これらの結果から、フッ素樹脂粒子を含有した被験試料は、細胞分散効果を発現し、しかも、細胞形態が保持された状態で、細胞塊を分散させることができ、細胞に与えるダメージが小さいという優れた性質を有することがわかる。したがって、フッ素樹脂粒子を含有した被験試料は、細胞分散剤として有用であることがわかる。また、フッ素樹脂粒子を用いた細胞分散方法によれば、細胞懸濁液中の細胞を解離させて個々の細胞に分散させることができることがわかる。また、かかる結果から、実施例１の細胞分散方法は、細胞に与えるダメージが小さいことがわかる。
比較例１：〔タンパク質分解酵素（トリプシン）を用いた細胞分散方法〕
　実施例１で用いたものと同様の細胞懸濁液１５０μＬに、トリプシンＰＢＳ溶液を、トリプシンの終濃度が０．０１質量％となるように加え、３７℃で所定時間（１．５時間、３時間、４６時間）、インキュベーションを行なった。そして、インキュベーション後の各細胞を顕微鏡で観察した。比較例１において、１．５時間インキュベーションを行なった後の細胞を顕微鏡で観察した結果を図５に、比較例１において、３時間インキュベーションを行なった後の細胞を顕微鏡で観察した結果を図６に、比較例１において、４６時間インキュベーションを行なった後の細胞を顕微鏡で観察した結果を図７に、それぞれ示す。
　図５、図６及び図７それぞれに示された結果から、トリプシンとともにインキュベーションを行なった場合、実施例１の場合と比較して、細胞塊から解離し、分散した個々の細胞の数が少ないことがわかる。また、図７の細胞１に示されるように、膨潤して水泡状となっている異常な細胞が観察された。かかる結果は、トリプシンとともに細胞が長時間インキュベーションされることにより、細胞膜にダメージが生じ、浸透圧のバランスが乱れたためであると考えられる。
　これらの結果から、トリプシンを用いた比較例１の細胞分散方法は、アルコールを含む細胞保存液によって固定化された子宮頚部細胞を含む細胞懸濁液中の細胞塊を解離させて個々の細胞に分散させるには不十分であることがわかる。また、比較例１の細胞分散方法は、細胞にダメージを与えることがわかる。
比較例２：〔物理的な力を用いた細胞分散方法〕
　実施例１で用いたものと同様の細胞懸濁液１５０μＬをプラスチックチューブに採取した。その後、前記細胞懸濁液を、ペッスルを用いて、４０００ｒｐｍで３分間撹拌した。つぎに、撹拌後の細胞懸濁液中の細胞を顕微鏡で観察した。また、前記撹拌後の細胞懸濁液１５０μＬに、終濃度が１０μｇ／ｍＬとなるようにヨウ化プロピジウム溶液を添加して細胞の細胞核を染色し、染色後に得られた細胞懸濁液中の細胞の細胞核を顕微鏡で観察した。比較例２において、ペッスルで撹拌した後の細胞懸濁液中の細胞の顕微鏡写真を図８及び図９に示す。また、比較例２において、ペッスルで撹拌した後の細胞懸濁液中の細胞の細胞核の染色像の顕微鏡写真を図１０に示す。
　図８～１０それぞれに示された結果から、フッ素樹脂粒子非存在下に、ペッスルでの撹拌による物理的な力のみを用いて細胞塊を分散させる方法では、単に細胞塊が伸張するだけであったり（図８の矢頭を参照）、分散した細胞が破断したり（図９の矢頭を参照）、さらには、細胞核が細胞の膜の外へと飛び出して遊離（脱核）してしまったり（図１０の矢頭を参照）することがわかる。
　これらの結果から、物理的な力のみを用いた比較例２の細胞分散方法は、細胞にダメージを与えることがわかる。このような細胞へのダメージは、細胞診やフローサイトメトリーによる測定に悪影響を与えるおそれがある。これに対して、フッ素樹脂粒子存在下に、撹拌を行なった実施例１の細胞分散方法では、フッ素樹脂粒子の潤滑作用によって、物理的な力による細胞のダメージを低減することができる。
　以上のように、タンパク質分解酵素を用いた比較例１の細胞分散方法や、物理的な力のみを用いた比較例２の細胞分散方法では、細胞分散効果が不十分であったり、細胞の形態を保持できなかったりする。これに対して、実施例１の細胞分散方法では、十分に細胞が分散されており、細胞に与えるダメージも小さい。したがって、これらの結果から、フッ素樹脂粒子（ＰＴＦＥ粒子）を含有した細胞分散剤や、これを用いた細胞分散方法によれば、細胞診やフローサイトメトリーによる測定に好適な測定試料を調製することができることが示唆される。また、フッ素樹脂粒子を含有した細胞分散剤を用いた細胞分散方法は、個々の細胞を観察する細胞診や、個々の細胞を測定するフローサイトメトリーにおける前処理として適していることがわかる。
実施例２：〔フッ素樹脂粒子の濃度の検討〕
　実施例１で用いたものと同様の細胞懸濁液からおよそ１０μＬ相当分の細胞を採取し、実施例１で用いたものと同様のフッ素樹脂粒子の水分散液６０μＬを加えて混合物を作製した。なお、かかる混合物中のフッ素樹脂粒子（ＰＴＦＥ粒子）の濃度は、５４質量％である。得られた混合物を、ペッスルを用いて、４０００ｒｐｍで３分間撹拌した。撹拌後の混合物を実施例２の試料とした。
　つぎに、実施例２の試料を顕微鏡で観察した。実施例２において、フッ素樹脂粒子存在下での撹拌を行なうことにより得られた試料中の細胞の顕微鏡写真を図１１に示す。
　図１１に示される結果から、前記細胞分散剤を用い、ＰＴＦＥ粒子の濃度を上記濃度とした場合であっても、実施例１の場合と同様に、細胞形態が保持された状態で、細胞塊を解離させて個々の細胞に分散させることができ、細胞に与えるダメージも小さいことがわかる。
実施例３：〔固定化された培養細胞での細胞分散効果〕
　培養細胞を培地に懸濁し、テフロン（登録商標）ディッシュ中で培養することにより、培地中にスフェロイドと呼ばれる細胞の球状集合体を形成させた。このスフェロイドを含む培地を１９０×ｇで、５分間、室温の遠心分離に供して前記スフェロイドを含む細胞群を回収した。得られた細胞群に、前記実施例１で用いたものと同様の細胞保存液を添加して、当該細胞を固定化し、細胞懸濁液を得た。その後、固定化された培養細胞を含む細胞懸濁液１５０μＬに、終濃度が０．１質量％となるように、トリパンブルーを加えて、細胞を染色した。染色後の細胞懸濁液に、ＰＴＦＥ粒子の終濃度が０．６質量％となるように、前記実施例１における細胞分散剤と同様の細胞分散剤を加えて、混合物を得た。その後、得られた混合物を、ペッスルを用いて、４０００ｒｐｍで３分間撹拌した。撹拌後の混合物を実施例３の試料とした。
　つぎに、実施例３の試料を顕微鏡で観察した。実施例３において、細胞分散剤存在下に撹拌して得られた試料中の細胞の顕微鏡写真を図１２に示す。
　図１２に示された結果から、固定化された細胞であっても、細胞形態が保持された状態で、細胞塊が解離して個々の細胞に分散されており、細胞に与えるダメージも小さいことがわかる。
　これまでに述べた実施例１～３、比較例１及び２それぞれの細胞分散方法における細胞分散効果と細胞に与えるダメージとについて、表１にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示されるように、タンパク質分解酵素を用いた比較例１の細胞分散方法や、物理的な力のみを用いた比較例２の細胞分散方法では、細胞塊の分散が不十分であるうえに、細胞に与えるダメージも大きいことがわかる。これらと比較して、実施例１、実施例２及び実施例３それぞれの細胞分散方法（本発明の細胞分散方法）では、細胞塊は、解離し個々の細胞に分散しており、しかも、細胞に与えるダメージも小さいことがわかる。
試験例１：〔細胞分散効果におけるフッ素樹脂粒子の濃度の影響の検討〕
　実施例１で用いたものと同様のフッ素樹脂粒子の水分散液及び細胞懸濁液を用い、以下のように、細胞分散効果におけるフッ素樹脂粒子の濃度の影響を検討した。
　細胞懸濁液に、フッ素樹脂粒子であるＰＴＦＥ粒子の終濃度が０．００３質量％となるように、フッ素樹脂粒子の水分散液を加えるとともに、終濃度が０．１質量％となるように、トリパンブルーを加えて混合物を得た。得られた混合物を、撹拌棒を用いて、４０００ｒｐｍで３分間撹拌した（実施例４）。撹拌後の混合物を実施例４の試料とした。
　また、ＰＴＦＥ粒子の終濃度を０．０３質量％（実施例５）、０．０６質量％（実施例６）、０．３質量％（実施例７）、３質量％（実施例８）又は６０質量％（実施例９）としたことを除き、実施例４と同様の操作を行なうことにより、実施例５～９の試料を得た。
　各試料中の細胞を顕微鏡で観察し、各試料中における「単一細胞」、「２～５個の細胞が凝集した細胞塊」及び「６個以上の細胞が凝集した細胞塊」それぞれの比率を調べた。なお、比較のために、ＰＴＦＥ粒子を加えていない細胞懸濁液における単一細胞及び細胞塊の比率を調べた（比較例３）。ＰＴＦＥ粒子の濃度と単一細胞及び細胞塊それぞれの比率との関係を示すグラフを図１３に示す。図１３中、レーン１は、比較例３、レーン２は、実施例４、レーン３は、実施例５、レーン４は、実施例６、レーン５は、実施例７、レーン６は、実施例８、レーン７は、実施例９を示す。
　図１３に示される結果から、実施例４～９のように、ＰＴＦＥ粒子の濃度が０．００３質量％、０．０３質量％、０．０６質量％、０．３質量％、３質量％及び６０質量％のいずれの場合であっても、ＰＴＦＥ粒子を加えていない細胞懸濁液（比較例３）と比較して、試料中における「２～５個の細胞が凝集した細胞塊」や「６個以上の細胞が凝集した細胞塊」の比率が低下し、「単一細胞」の比率が７０％を超えるまでに上昇していることがわかる。したがって、フッ素樹脂粒子を用いた実施例４～９の細胞分散方法においては、フッ素樹脂粒子の濃度を０．００３質量％という低濃度から６０質量％という高濃度までの範囲とした場合であっても、細胞分散効果を示すことが示唆される。
試験例２：細胞分散効果におけるフッ素樹脂粒子の有無の影響の検討
　子宮頸部由来の細胞を用い、細胞分散効果におけるフッ素樹脂粒子の有無の影響を調べた。
　実施例１で用いたものと同様の細胞懸濁液に、ＰＴＦＥ粒子の終濃度が０．００３質量％となるように、実施例１で用いたものと同様のフッ素樹脂粒子の水分散液を加えるとともに、濃度が５質量％となるようにトリパンブルーを加えた。得られた混合物を撹拌棒で４０００ｒｐｍ、３分間撹拌した（実施例１０）。撹拌後の混合物を実施例１０の試料とした。また、撹拌時間を９分間に変えたことを除き、実施例１０と同様に操作を行なって、実施例１１の試料を得た。
　各試料中の細胞を顕微鏡で観察し、細胞懸濁液における「単一細胞」、「２～５個の細胞が凝集した細胞塊」、及び「６個以上の細胞が凝集した細胞塊」の比率を調べた。なお、比較のために、ＰＴＦＥ粒子を加えていない細胞懸濁液（比較例４）、細胞分散剤を加えずに３分間（比較例５）又は９分間（比較例６）、細胞懸濁液を撹拌して得られた比較例５及び６の試料についても、前記と同様にして、単一細胞や細胞塊の比率を調べた。ＰＴＦＥ粒子の有無と単一細胞及び細胞塊それぞれの比率との関係を示すグラフを図１４に示す。図１４中、レーン１は、比較例４、レーン２は、比較例５、レーン３は、比較例６、レーン４は、実施例１０、レーン５は、実施例１１を示す。
　図１４に示された結果から、ＰＴＦＥ粒子を加えずに細胞懸濁液を撹拌した場合（比較例５及び６）、撹拌時間の長さにかかわらず、「単一細胞」の比率は上昇せず、ＰＴＦＥ粒子を加えていない細胞懸濁液（比較例４）における「単一細胞」の比率と同程度であった。一方、ＰＴＦＥ粒子存在下に撹拌を行なった場合（実施例１０及び１１）、細胞分散処理を施していない細胞懸濁液における「単一細胞」の比率と比較して、「２～５個の細胞が凝集した細胞塊」や「６個以上の細胞が凝集した細胞塊」の比率が低下し、「単一細胞」の比率が７０％を超えるまでに上昇していることがわかる。
　このことから、ＰＴＦＥ粒子を用いずに撹拌のみを行なう場合に比べて、ＰＴＦＥ粒子存在下で撹拌を行なう場合には、高い細胞分散効果を示すことがわかる。また、実施例１０における「単一細胞」の比率は、７０％であるのに対して、実施例１１における「単一細胞」の比率が９４％である。これらの結果から、ＰＴＦＥ粒子存在下で撹拌を行なう条件下では、撹拌時間を長くするほど、「２～５個の細胞が凝集した細胞塊」や「６個以上の細胞が凝集した細胞塊」の比率が顕著に低下し、「単一細胞」の比率が上昇することがわかる。したがって、ＰＴＦＥ粒子の濃度が低濃度である場合であっても、撹拌時間を最適な時間に設定することで、高い分散効果が得られることが示唆される。

Claims (16)

  1. 　複数の細胞が凝集した細胞塊を液体媒体中で個々の細胞に分離して分散する方法であって、液体媒体中で細胞塊とフッ素樹脂粒子とを混合することを特徴とする細胞分散方法。
  2. 　前記フッ素樹脂粒子が、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、テトラフルオロエチレン・パーフルオロアルキルビニルエーテル共重合体（ＰＦＡ）、テトラフルオロエチレン・ヘキサフルオロプロピレン共重合体（ＦＥＰ）、テトラフルオロエチレン・エチレン共重合体（ＥＴＦＥ）、ポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）、ポリクロロトリフルオロエチレン（ＰＣＴＦＥ）及びクロロトリフルオエチレン・エチレン共重合体（ＥＣＴＦＥ）からなる群より選択された少なくとも１種からなる粒子である、請求項１に記載の細胞分散方法。
  3. 　フッ素樹脂粒子との混合前の細胞塊が細胞培養基材に接着している、請求項１に記載の細胞分散方法。
  4. 　フッ素樹脂粒子との混合前の細胞塊が培地中に含まれている、請求項１又は３に記載の細胞分散方法。
  5. 　フッ素樹脂粒子との混合前の細胞塊がリン酸緩衝化生理食塩水中に含まれている、請求項１又は３に記載の細胞分散方法。
  6. 　前記細胞塊が、生体中に存在する粘液によって凝集している細胞を含む、請求項１に記載の細胞分散方法。
  7. 　前記細胞塊が子宮頚部細胞を含む、請求項６に記載の細胞分散方法。
  8. 　フッ素樹脂粒子との混合前の細胞塊が固定化されている、請求項１に記載の細胞分散方法。
  9. 　細胞塊と、細胞を可視化するための可視化剤とを接触させる接触工程をさらに含む、請求項１に記載の細胞分散方法。
  10. 　前記細胞塊とフッ素樹脂粒子との混合物において、フッ素樹脂粒子が、細胞塊に含まれる細胞間の間隙に入り込む割合を大きくする促進工程をさらに含む、請求項１に記載の細胞分散方法。
  11. 　前記促進工程が、前記混合物を所定時間撹拌する撹拌工程である、請求項１０に記載の細胞分散方法。
  12. 　前記混合物中のフッ素樹脂粒子の濃度が０．００３質量％以上６０質量％以下である、請求項１に記載の細胞分散方法。
  13. 　前記フッ素樹脂粒子として、粒子径が０．１μｍ以上２００μｍ以下の粒子を含む粒子混合物を用いる、請求項１に記載の細胞分散方法。
  14. 　フッ素樹脂粒子を含有してなる、細胞塊を分散させるための細胞分散剤。
  15. 　細胞を可視化するための可視化剤をさらに含有してなる、請求項１４に記載の細胞分散剤。
  16. 　複数の細胞が凝集した細胞塊とフッ素樹脂粒子とを液体媒体中で混合する混合工程、及び
    　前記混合工程によって得られた混合物をフローサイトメーターにて測定する測定工程
    を含む、細胞測定方法。
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