WO2010000900A1 - Inmunosupresor basado en la interrupción de la interacción tcr-nck - Google Patents

Inmunosupresor basado en la interrupción de la interacción tcr-nck Download PDF

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Balbino ALARCÓN SÁNCHEZ
Ángel RAMÍREZ ORTIZ
Aldo Borroto Revuelta
Antonio MORREALE DE LEÓN
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Definitions

  • the present invention relates to a compound of structural formula (I)
  • (i) and its derivatives for use as a medicine.
  • an immunosuppressive agent based on the interruption of the TCR-Nck interaction.
  • T lymphocytes play a central role in the rejection of allotransplants and, more or less directly, in the generation of autoimmune diseases. Therefore, current immunosuppressive drugs base their mechanism of action on the inhibition of T lymphocyte activation. These immunosuppressants have high toxicity, because they do not specifically inhibit lymphocyte pathways.
  • T lymphocytes are activated through the antigen receptor (TCR) that recognizes the major histocompatibility complex (MHC) of the transplanted organ as foreign.
  • TCR antigen receptor
  • MHC major histocompatibility complex
  • the TCR consists of 6 subunits, two of which (TCR ⁇ and TCR ⁇ ) are responsible for the recognition of MHC bound to antigenic peptides, while the other four (CD3 ⁇ , CD3 ⁇ , CD3 ⁇ and CD3 ⁇ ) are responsible for Ia Signal transmission to the lymphocyte cytoplasm (reviewed in Alarcon, B., Gil, D., Delgado, P. and Schamel, WW (2003) Immunol Rev, 191, 38-46).
  • the present invention provides a more specific immunosuppressive compound of T lymphocytes and with fewer side effects than currently existing, based on the interruption of the TCR-Nck interaction.
  • the conformational change in the TCR which occurs after the binding of stimulatory antibodies and MHC, was first revealed by a "pull-down" test, where the TCR is induciblely bound to a matrix of the fusion protein GST-Nck.
  • This biochemical test does not allow identifying individually those cells whose TCR is undergoing conformational change.
  • the authors of the present invention demonstrated that the APA1 / 1 antibody also recognizes conformational change (Risue ⁇ o, RM, Gil, D., Fernandez, E., Sánchez-Madrid, F. and Alarcon, B.
  • the antibody can be used in preparations of T lymphocytes in culture and also in immunohistochemical sections. This reagent allows to demonstrate by another procedure other than "pull-down" the existence of the conformational change, in addition to demonstrating that Conformational change occurs in vivo.
  • the antibody recognizes immune synapses formed between T lymphocytes and antigen presenting cells loaded with an agonist peptide, but not synapses formed by a partial agonist / antagonist.
  • the only known consequence of the conformational change in the TCR is the exposure of the PRS in CD3 ⁇ , although it is not ruled out that the conformational change is also transmitted to the cytoplasmic regions of the other CD3 subunits and globally influences the entire process of initiation of signal transmission by the TCR, including the tyrosine phosphorylation of the ITAMs (Minguet, S., Swamy, M., Alarcon, B., Luescher, IF and Schamel, WW (2007) Immunity., 26 , 43-54).
  • this peptide it is possible to specifically inhibit the proliferation of both human CD4 + and CD8 + T cells in response to the stimulation with anti-CD3 antibodies, with an IC50 of approximately 20 ⁇ M, while the proliferation of human T lymphocytes dependent on a Different receptor, IL2R, is practically unaffected by said peptide, even at concentrations 3 times higher.
  • peptide 11 R085 inhibits the activation initiated by the TCR but no activation mediated by another receptor, and therefore, is specific to the molecular target for which it is designed.
  • Peptide 11 R085 also inhibits the production of IL2 and antigen-induced proliferation in primary lymphocytes of transgenic OT-I mice with an IC50 of approximately 5 ⁇ M.
  • the Nck-CD3 ⁇ interaction as a molecular target for the development of immunosuppressants is thus validated.
  • CBM-1 inhibits the proliferation of human T lymphocytes induced by anti-CD3 antibodies but not the IL2-dependent proliferation. Likewise, it inhibits the proliferation of antigen-dependent mouse T lymphocytes and also inhibits the release of IL2.
  • human lymphocytes stimulated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies it inhibits the production of IFN ⁇ , IL-10 and TNF ⁇ , as well as the generation of human IFN ⁇ producing cells in response to anti-CD3 and anti-CD28.
  • a first aspect of the present invention refers to a compound of formula (I):
  • optical isomers or enantiomers caused by the presence of chiral centers (atoms attached to four different substituents) that cause the differentiation between enantiomers with respect to their optical activity (rotation of the polarized light when passing through a solution of the enantiomer),
  • pro-drugs of the compounds of formula (I), any derivative (for example, esters, carbamates, amides etc.), which, when administered to an individual, is capable of providing, directly or indirectly, one or several of the compounds of said formula (I).
  • crystalline forms of the compounds of formula (I) in the free state or as solvates.
  • solvate includes both solvates that can be used in the composition of a medicament, and solvates useful in the preparation of said medicament. Solvates can be obtained by conventional solvation methods well known in the state of the art.
  • salts are understood to mean both those that are pharmaceutically acceptable and those that are not pharmaceutically acceptable but which may also be useful in the preparation of drugs, so that all salts of the compounds of the invention are either Non-pharmaceutically acceptable are included in the scope of the present invention.
  • those compounds of the invention that contain one or more isotopically enriched atoms are included in the definition of "derivatives".
  • the compound of formula (I) is capable of binding to the N3 SH3.1 domain, interrupting the TCR-Nck interaction and therefore, is a T-lymphocyte-specific immunosuppressive compound, which has clear advantages. compared to other immunosuppressants, among others, cause fewer side effects.
  • one aspect of the invention is the use of the compound of structural formula (I) or any of its derivatives to prepare a medicament for the treatment and / or prevention of diseases that occur with the hyperproliferation of T lymphocytes.
  • these diseases are autoimmune diseases, diseases that occur with rejection of allotransplants or xenotransplants of organs or tissues, or lymphomas and / or T leukemias.
  • autoimmune diseases are those where the activation of T lymphocytes plays an important role in the induction phase and / or in the effector phase, and more preferably systemic autoimmune diseases as specific to the organ of the list comprising: multiple sclerosis and varieties, systemic lupus erythematosus, psoriasis, vitiligo, rheumatoid arthritis, asthma, psoriasis, autoimmune hepatitis, type I diabetes, myasthenia gravis, ankylosing spondylitis, Crohn's disease, etc.
  • Another aspect of the invention is directed to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the compound of structural formula (I), or any of its derivatives described above, and a pharmaceutically acceptable excipient.
  • compositions described above can be presented in a pharmaceutical form by oral administration, either in solid form (eg, tablets, dragees, capsules, etc.) or in liquid form (eg, solutions, suspensions, emulsions, etc.) , parenterally (eg, intramuscular, subcutaneous, intravenous, etc.), rectal, or any other form of clinically permitted administration and in a therapeutically effective amount.
  • oral administration either in solid form (eg, tablets, dragees, capsules, etc.) or in liquid form (eg, solutions, suspensions, emulsions, etc.) , parenterally (eg, intramuscular, subcutaneous, intravenous, etc.), rectal, or any other form of clinically permitted administration and in a therapeutically effective amount.
  • compositions are the vehicles usually used in the state of the art.
  • the pharmaceutical composition provided by this invention may be provided by any route of administration, for which said composition will be formulated in the pharmaceutical form suitable to the route of administration chosen.
  • FIG. Model of the SH3.1 domain and virtual screening of compounds with binding potential.
  • FIG 2. Selective effect of the compounds resulting from virtual screening in the proliferation induced by anti-CD3. Proliferation evaluated by flow cytometry according to the loss of green fluorescence (CFSE) within the CD8 + population.
  • the different compounds are represented by the NSI code followed by a number.
  • CBM-1 is the compound NSI-65.
  • FIG. Selective effect of the CBM-1 compound on the proliferation induced by anti-CD3.
  • FIG 4. Inhibition of cytokine release by CBM-1.
  • CBM-1 inhibition of cytokine secretion by human T lymphocytes in response to stimulation with anti-CD3 antibodies Purified peripheral blood mononuclear cells (PBMNC) from healthy donors were stimulated for 72 h on plates coated with the anti-CD3 OKT3 antibody in the presence of different doses of CBM-1.
  • the concentration in the supernatant of the indicated cytokines (IL-10, IFN- ⁇ , and TFN- ⁇ ) was evaluated by multiparameter flow cytometry (BD cytometric bead array).
  • the CBM-1 compound showed no effect on the release of IL5, IL1- ⁇ and IL6, while IL2 and IL4 were not detectable.
  • FIG. Inhibition of intracellular production of IFN ⁇ .
  • Intracellular expression of IFN ⁇ in response to stimulation with a mixture of anti-CD3 and anti-CD28 The expression of Intracellular IFN ⁇ (as a product of the percentage of positive cells and the average fluorescence) as a function of the concentration of the CBM-1 compound.
  • FIG 6. NMR structure of the SH3.1 domain and displacements produced after the binding of the high affinity peptide 11 R085.
  • NMR structure of the SH3.1 domain of Nck ⁇ (A). The five ⁇ sheets are numbered consecutively. N and C indicate the amino- and carboxy-terminal ends, respectively.
  • B Comparison of the residues displaced by the binding of the high affinity peptide 11 R085 to the SH3.1 domain of Nck ⁇ (in black), with the corresponding residues of Nck ⁇ .
  • FIG. Structure by NMR of the SH3.1 domain and displacements produced after the binding of CBM-1.
  • FIG. CBM-1 toxicity.
  • FIG 9 Comparison of the primary sequence of the SH3.1 domain of Nck ⁇ with those of the SH3.1 domain of Nck ⁇ , as well as those of the SH3.2 and SH3.3 domains of Nck ⁇ .
  • purified PBMNC from healthy donors were labeled by fluorescence and incubated for 5 days on plates coated with the anti-CD3 OKT3 antibody in the presence of different doses of said compounds.
  • the proliferation of T lymphocytes was evaluated by flow cytometry according to the loss of green fluorescence (CFSE) within the CD8 + population.
  • CFSE green fluorescence
  • CBM-1 compound of structural formula (I)
  • Figure 2 Figure 2 (FIG 2), where CBM-1 is represented by the compound NSI-65.
  • Purified PBMNC from healthy donors were labeled with CFSE and incubated for 5 days on plates coated with the OKT3 anti-CD3 antibody in the presence of different doses of various indicated compounds, including CBM-1. Proliferation was evaluated by flow cytometry according to the loss of green fluorescence (CFSE) within the CD4 + and CD8 + populations. An IL2-dependent human lymphoblast proliferation experiment was performed in parallel. Purified PBMNC from healthy donors were stimulated with PHA for 48 h and labeled with CFSE. Subsequently, they were cultured for 3 days in the presence of 100 ILJ / ml of recombinant human IL2 in the presence of the concentrations of the compounds used, particularly CBM-1.
  • CFSE green fluorescence
  • the CBM-1 compound inhibited anti-CD3 induced proliferation of CD4 + lymphocytes with an IC50 of 2 ⁇ M and that of CD8 + lymphocytes with an IC50 of 3 ⁇ M (FIG. 3).
  • the inhibitory effect of other compounds was slightly lower.
  • CBM-1 did not significantly inhibit IL2-dependent human lymphoblast proliferation at concentrations of 20 ⁇ M, indicating that its specificity against proliferation dependent on TCR activation but does not prevent IL2R-dependent. This data supports a mechanism of selective action on the TCR.
  • the effect of the CBM-1 compound on the production of cytokines was measured in an assay in which human PBMNC were stimulated with anti-CD3 antibodies. The supernatant of these cells was collected at 72 h and several cytokines were measured simultaneously by a flow cytometry assay. These experiments demonstrated that the compound had a potent inhibitory effect on Th1 cytokines such as IFN ⁇ (IC50 of 0.3 ⁇ M), TNF ⁇ (IC50 of 0.2 ⁇ M) and IL10 (IC50 of 0.2 ⁇ M) and had no effect on Ia IL5 and IL6 production to concentrations of 30 ⁇ M (FIG 4).
  • IFN ⁇ IC50 of 0.3 ⁇ M
  • TNF ⁇ IC50 of 0.2 ⁇ M
  • IL10 IL10
  • the compound joins in a hydrophobic pocket in which Trp41 and Tyr50 / Phe53 residues participate, causing distortion and displacement of the ⁇ 2 sheet and residues in the distal loop (FIG. 7 and FIG. 9).
  • the displacements of residues in the SH3.1 domain validate the prediction about the interaction of the SH3.1 domain with CBM-1 at the molecular level and are consistent with the model.

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Abstract

La presente invención se refiere a un compuesto de fórmula estructural (I) y sus derivados, para su uso como medicamento. Preferiblemente como agente inmunosupresor basado en la interrupción de la interacción TCR-Nck.

Description

INMUNOSUPRESOR BASADO EN LA INTERRUPCIÓN DE LA INTERACCIÓN TCR-Nck
La presente invención se refiere a un compuesto de fórmula estructural (I)
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(i) y sus derivados, para su uso como medicamento. Preferiblemente como agente inmunosupresor basado en Ia interrupción de Ia interacción TCR- Nck.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
Los linfocitos T desempeñan un papel central en el rechazo de alotransplantes y, de forma más o menos directa, en Ia generación de enfermedades autoinmunes. Por ello los fármacos inmunosupresores actuales basan su mecanismo de acción en Ia inhibición de Ia activación de los linfocitos T. Estos inmunosupresores presentan alta toxicidad, debido a que no inhiben vías linfocitarias de modo especifico.
Los linfocitos T son activados a través del receptor para antígeno (TCR) que reconoce al complejo principal de histocompatibilidad (MHC) del órgano transplantado como extraño. El TCR está formado por 6 subunidades, dos de las cuales (TCRα y TCRβ) son responsables del reconocimiento de MHC unido a péptidos antigénicos, mientras que las otras cuatro (CD3γ, CD3δ, CD3ε y CD3ζ) son responsables de Ia transmisión de señales al citoplasma del linfocito (revisado en Alarcon, B., Gil, D., Delgado, P. and Schamel, W.W. (2003) Immunol Rev, 191 , 38-46). Uno de los procesos iniciales que ocurren tras Ia ligación del TCR por parte del MHC es Ia activación de las tirosina quinasas de Ia familia src, Lck y Fyn, que fosforilan las tirosinas de los motivos ITAM de las subunidades de CD3, que a su vez se convierten en sitios de anclaje de las tirosina quinasas de Ia familia Syk (ZAP70 y Syk). Hasta hace poco se pensaba que éste era el esquema lineal de transmisión de señales, y que a partir de las quinasas de Ia familia Syk (ZAP70 sobre todo) se producía Ia divergencia en Ia cascada de activación que resulta en Ia activación de diversos factores de transcripción, incluido NFAT, blanco de los fármacos inmunosupresores ciclosporina A y FK506 (Lin, J. and Weiss, A. (2001 ) J CeII Sci, 114, 243-244). Por su parte, los autores de Ia presente invención descubrieron hace algunos años que, para activarse, el TCR sufre un cambio conformacional que resulta en el reclutamiento del adaptador Nck directamente a una secuencia rica en prolinas (PRS) de Ia subunidad CD3ε (Gil, D., Schamel, W.W., Montoya, M., Sánchez-Madrid, F. and Alarcon, B. (2002) CeII, 109, 901-912;. Esta interacción TCR-Nck se determinó como esencial para Ia activación de TCR mediante experimentos de sobre-expresión del dominio SH3.1 amino-terminal de Nck (el que se une a CD3ε) y mediante Ia introducción en los linfocitos T de el anticuerpo APA1/1 , que se une a PRS y Io bloquea.
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
Un problema importante con los inmunosupresores actuales es su toxicidad, debido a que no inhiben vías linfocitarias de modo especifico.
La presente invención proporciona un compuesto inmunosupresor más específico de linfocitos T y con menos efectos secundarios que los actualmente existentes, basado en Ia interrupción de Ia interacción TCR- Nck.
Para seleccionar el compuesto de Ia presente invención, se ha tenido en cuenta tanto el cambio conformacional del TCR, como el mecanismo de inicio de Ia transmisión de señales, paso fundamental para el reclutamiento de proteínas efectoras.
El cambio conformacional en el TCR, que ocurre tras Ia unión de anticuerpos estimuladores y de MHC, se puso primeramente de manifiesto mediante un ensayo de "pull-down", donde el TCR se une de forma inducible a una matriz de Ia proteína de fusión GST-Nck. Este ensayo bioquímico no permite identificar de forma individual aquellas células cuyo TCR está sufriendo el cambio conformacional. Sin embargo, los autores de Ia presente invención demostraron que el anticuerpo APA1/1 también reconoce el cambio conformacional (Risueño, R. M., Gil, D., Fernandez, E., Sánchez-Madrid, F. and Alarcon, B. (2005J Blood, 106, 601-608). El anticuerpo se puede utilizar en preparaciones de linfocitos T en cultivo y también en cortes inmunohistoquímicos. Este reactivo permite demostrar por otro procedimiento distinto al "pull-down" Ia existencia del cambio conformacional, además de demostrar que el cambio conformacional ocurre in vivo. Es más, el anticuerpo reconoce las sinapsis inmunitarias formadas entre linfocitos T y células presentadoras de antígeno cargadas con un péptido agonista, pero no las sinapsis formadas por un agonista parcial/antagonista. Estos datos sugieren que el cambio conformacional en el TCR podría estar detrás de Ia distinción entre agonistas fuertes y débiles por parte de los linfocitos T y podría activar cascadas de activación específicas durante el reconocimiento de ligandos fuertes. Esta hipótesis parece corroborada por el hecho de que durante el desarrollo tímico el cambio conformacional (visualizado mediante tinción con APA1/1 ) ocurre durante el reconocimiento de ligandos que inducen selección negativa, pero no durante el reconocimiento de ligandos que inducen selección positiva (Risueño, R. M., van Santen, H. M. and Alarcon, B. (2006) Proc Nati Acad Sci U S A., 103, 9625-9630). Por otra parte, Ia única consecuencia conocida del cambio conformacional en el TCR es Ia exposición de Ia PRS en CD3ε, aunque no se descarta que el cambio conformacional se transmita también a las regiones citoplasmáticas de las otras subunidades CD3 e influya globalmente en todo el proceso de iniciación de Ia transmisión de señales por el TCR, incluyendo Ia fosforilación en las tirosinas de los ITAMs (Minguet, S., Swamy, M., Alarcon, B., Luescher, I. F. and Schamel, W.W. (2007) Immunity., 26, 43-54). Sin embargo, el reclutamiento de Nck a Ia PRS de CD3ε constituye un posible mecanismo de Ia transmisión del cambio conformacional a rutas de activación intracelulares (Gil, D., Schamel, W.W., Montoya, M., Sánchez-Madrid, F. and Alarcon, B. (2002) Ce//, 109, 901-912).
Con el fin de demostrar Ia importancia de Ia interacción Nck-CD3ε en Ia activación de linfocitos T y validar esta interacción como blanco de agentes inmunomoduladores, se ha procedido al diseño de péptidos sintéticos que mimetizaran Ia secuencia del PRS y que pudieran bloquear el sitio de unión en Nck a CD3ε. Se ha obtenido así un péptido, denominado 11 R085, que es 300 veces más potente que un péptido con Ia secuencia silvestre en Ia inhibición de Ia interacción de CD3ε con el dominio SH3.1 de Nck. Utilizando este péptido, se consigue inhibir de forma específica Ia proliferación de linfocitos T humanos tanto CD4+ como CD8+ en respuesta a Ia estimulación con anticuerpos anti-CD3, con una IC50 de aproximadamente 20 μM, mientras que Ia proliferación de linfocitos T humanos dependiente de un receptor diferente, el IL2R, no es prácticamente afectada por dicho péptido, incluso a concentraciones 3 veces superiores.
Por tanto, el péptido 11 R085 inhibe Ia activación iniciada por el TCR pero no la activación mediada por otro receptor, y por ello, es específico del blanco molecular para el que está diseñado.
El péptido 11 R085 también inhibe Ia producción de IL2 y Ia proliferación inducida por antígeno en linfocitos primarios de ratones transgénicos OT-I con una IC50 de aproximadamente 5 μM. Queda así validada Ia interacción Nck-CD3ε como blanco molecular para el desarrollo de inmunosupresores.
A partir de esto hecho, y utilizando estrategias bioinformáticas de selección se realizó un cribado virtual de compuestos que se unen al dominio SH3.1 , tal y como se describe en los ejemplos de Ia invención. Tras este cribado, se seleccionaron los diez que teóricamente encajaban mejor en un bolsillo hidrofóbico del SH3.1 , encargado del reconocimiento de Ia secuencia PRS de CD3ε (ver FIG. 1 ). Todos estos compuestos, estrucuturalmente muy diferentes, tuvieron un cierto grado de actividad, pero el que presenta un mayor grado de actividad y menos toxicidad, incluso a dosis altas, (FIG.7), es el compuesto denominado CBM-1 , compuesto de formula estructural (I).
El compuesto CBM-1 presentó buena actividad y capacidad inmunosupresora, CBM-1 inhibe Ia proliferación de linfocitos T humanos inducida por anticuerpos anti-CD3 pero no Ia proliferación dependiente de IL2. Asimismo, inhibe Ia proliferación de linfocitos T de ratón dependiente de antígeno y también inhibe Ia liberación de IL2. En linfocitos humanos estimulados con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 inhibe Ia producción de IFNγ, de IL-10 y de TNFβ, así como Ia generación de células humanas productoras de IFNγ en respuesta a anti-CD3 y anti-CD28. Estos datos verifican que este compuesto tiene una acción inhibidora de Ia activación de linfocitos T, tanto de ratón como humanos, a concentraciones bajas de a partir de 0.1 μM, y preferiblemente en el rango de entre 0,1 y 1 μM. Por tanto, CBM-1 es activo como inmunosupresor.
Por todo ello, un primer aspecto de Ia presente invención, se refiere a un compuesto de fórmula (I):
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o cualquiera de sus derivados, entre los que se incluyen, sus sales, isómeros o mezclas de isómeros, profármacos, formas cristalinas, etc.. para su uso como medicamento, preferiblemente como inmunosupresor.
Entendiéndose por isómeros o mezclas de isómeros en Ia presente invención:
1 ) isómeros en disposición Z o E definidos por Ia posición de los sustituyentes respecto a los enlaces múltiples que presentan los compuestos,
2) isómeros ópticos o enantiómeros, originados por Ia presencia de centros quirales (átomos unidos a cuatro sustituyentes diferentes) que provocan Ia diferenciación entre enantiómeros respecto a su actividad óptica (rotación de Ia luz polarizada al pasar a través de una solución del enantiómero),
3) diastereoisómeros, isómeros con al menos dos centros quirales, estando los sustituyentes de uno de dichos centros dispuestos igual en ambos diastereoisómeros y los sustituyentes de al menos otro de los centros dispuestos de forma distinta entre ambos. Entendiéndose por "pro-fármacos" de los compuestos de fórmula (I), cualquier derivado (por ejemplo, esteres, carbamatos, amidas etc.), que, cuando se administra a un individuo, es capaz de proporcionarle, directa o indirectamente, uno o varios de los compuestos de dicha fórmula (I).
También se incorpora en Ia definición de derivados, "formas cristalinas" de los compuestos de fórmula (I) en estado libre o como solvatos. El término "solvato", tal como aquí se utiliza, incluye tanto solvatos que puedan ser utilizados en Ia composición de un medicamento, como solvatos útiles en Ia preparación de dicho medicamento. Los solvatos pueden obtenerse por métodos convencionales de solvatación bien conocidos en el estado de Ia técnica.
En Ia presente invención, se entiende por "sales", tanto las farmacéuticamente aceptables como las que no sean farmacéuticamente aceptables pero que pueden ser útiles asimismo en Ia preparación de fármacos, por Io que todas las sales de los compuestos de Ia invención, sean o no farmacéuticamente aceptables están incluidas en el ámbito de Ia presente invención.
Por último, se incluye en Ia definición de "derivados", aquellos compuestos de Ia invención que contengan uno o más átomos isotópicamente enriquecidos. Por ejemplo, compuestos con una de las fórmulas de Ia invención en las que uno o varios átomos de hidrogeno han sido sustituidos por átomos de deuterio o de tritio, uno o varios átomos de de carbono han sido sustituidos por átomos de 13C o 14C o uno o varios átomos de nitrógeno han sido sustituidos por 15N.
El compuesto de fórmula (I) es capaz de unirse al dominio SH3.1 de Nck interrumpiendo Ia interacción TCR-Nck y por tanto, es un compuesto inmunosupresor específico de linfocitos T, que presenta ventajas claras frente a otros inmunosupresores, entre otras, originar menos efectos secundarios.
Por todo ello, un aspecto de Ia invención versa en el uso del compuesto de fórmula estructural (I) o cualquiera de sus derivados para preparar un medicamento para el tratamiento y/o prevención de enfermedades que cursen con Ia hiperproliferación de linfocitos T.
Preferiblemente estas enfermedades son enfermedades autoinmunes, enfermedades que cursan con rechazo de alotransplantes ó xenotransplantes de órganos ó tejidos, o linfomas y/o leucemias T.
Más preferiblemente las enfermedades autoinmunes son aquellas donde Ia activación de linfocitos T juegue un papel importante en Ia fase de inducción y/o en Ia fase efectora, y más preferiblemente las enfermedades autoinmunes sistémicas como específicas de órgano de Ia lista que comprende: esclerosis múltiple y variedades, lupus eritematoso sistémico, psoriasis, vitíligo, artritis reumatoide, asma, psoriasis, hepatitis autoinmune, diabetes de tipo I, miastenia gravis, espondilitis anquilosante, enfermedad de Crohn, etc.
Otro aspecto de Ia invención está dirigido a una composición farmacéutica que comprende el compuesto de fórmula estructural (I), o cualquiera de sus derivados anteriormente descritos, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
En cada caso Ia composición se adaptará al tipo de administración utilizada. Por ello, Ia composición descrita anteriormente se puede presentar en una forma farmacéutica de administración por vía oral, bien en forma sólida (e.g., comprimidos, grageas, cápsulas, etc.) o líquida (e.g., soluciones, suspensiones, emulsiones, etc.), por vía parenteral (e.g., intramuscular, subcutánea, intravenosa, etc.), rectal, o cualquier otra forma de administración clínicamente permitida y en una cantidad terapéuticamente eficaz.
Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los vehículos habitualmente utilizados en el estado de Ia técnica. La composición farmacéutica proporcionada por esta invención puede ser facilitada por cualquier vía de administración, para Io cual dicha composición se formulará en Ia forma farmacéutica adecuada a Ia vía de administración elegida.
A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
FIG 1. Modelo del dominio SH3.1 y cribado virtual de compuestos con potencial de unión.
Cribado virtual de compuestos que se unen al dominio SH3.1 de Nck. Modelo teórico de estructura del dominio SH3.1 de Nck (panel A). El panel B muestra cómo encaja uno de esos compuestos en Ia parte superior del modelo virtual.
FIG 2. Efecto selectivo de los compuestos resultantes del cribado virtual en Ia proliferación inducida por anti-CD3. Proliferación evaluada por citometría de flujo de acuerdo con Ia pérdida de fluorescencia verde (CFSE) dentro de Ia población CD8+. Los distintos compuestos se representan mediante el código NSI seguido de un número. CBM-1 es el compuesto NSI-65.
FIG 3. Efecto selectivo del compuesto CBM-1 en Ia proliferación inducida por anti-CD3.
Inhibición por CBM-1 de Ia proliferación de linfocitos T humanos en respuesta a estimulación con anticuerpos anti-CD3. Se comparan estos resultados con los de proliferación de linfoblastos humanos dependientes de IL2.
FIG 4. Inhibición de Ia liberación de citoquinas por CBM-1.
Inhibición por CBM-1 de Ia secreción de citoquinas por linfocitos T humanos en respuesta a estimulación con anticuerpos anti-CD3. Se estimularon células mononucleares de Ia sangre periférica (PBMNC) purificadas de donantes sanos durante 72 h sobre placas recubiertas del anticuerpo anti-CD3 OKT3 en presencia de distintas dosis de CBM-1. La concentración en el sobrenadante de las citoquinas indicadas (IL-10, IFN- γ, y TFN-β) se evaluó mediante citometría de flujo multiparamétrica (cytometric bead array de BD). El compuesto CBM-1 no mostró efecto sobre Ia liberación de IL5, IL1-β e IL6, mientras que IL2 e IL4 no fueron detectables.
FIG 5. Inhibición de Ia producción intracelular de IFNγ.
Expresión intracelular de IFNγ en respuesta a Ia estimulación con una mezca de anti-CD3 y anti-CD28. En Ia gráfica se muestra Ia expresión de IFNγ intracelular (como producto del porcentaje de células positivas y de Ia fluorescencia media) en función de Ia concentración del compuesto CBM- 1.
FIG 6. Estructura por RMN del dominio SH3.1 y desplazamientos producidos tras Ia unión del péptido de alta afinidad 11 R085.
Estructura por RMN del dominio SH3.1 de Nckα (A). Las cinco láminas β están numeradas en forma consecutiva. N y C indican los extremos amino- y carboxi-terminal, respectivamente. (B) Comparación de los residuos desplazados por Ia unión del péptido de alta afinidad 11 R085 al dominio SH3.1 de Nckα (en negro), con los residuos correspondientes de Nckβ.
FIG 7. Estructura por RMN del dominio SH3.1 y desplazamientos producidos tras Ia unión de CBM-1.
Desplazamientos de residuos aminoacídicos en el dominio SH3.1 producidos por Ia interacción con el compuesto CBM-1. Se representan las cadenas laterales de los aminoácidos que cambian su posición tras unirse el compuesto. Los cambios son consecuentes con Ia unión del compuesto CBM-1 al bolsillo prevista en el cribado virtual.
FIG 8. Toxicidad de CBM-1.
La línea celular de linfocitos T humanos Jurkat y Ia línea celular linfoblastoide B humana Raji fueron incubadas con las concentraciones indicadas de CBM-1 durante 48 horas. La toxicidad del compuesto fue estimada mediante exclusión de yoduro de propidio y citometría de flujo. Las dos líneas celulares permanecieron con el 100% de viabilidad tras 48 h, incluso a Ia dosis más alta de compuesto. FIG 9. Comparación de Ia secuencia primaria del dominio SH3.1 de Nckα con las del dominio SH3.1 de Nckβ, así como con las de los dominios SH3.2 y SH3.3 de Nckα.
Las posiciones de las láminas β y los bucles conectores en el dominio SH3.1 de Nckα están indicadas. Las flechas negras indican los residuos fuertemente desplazados tras Ia unión del compuesto CBM-1.
EJEMPLOS
A continuación se ilustrará Ia invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que desarrollan el enfoque llevado a cabo para identificar el compuesto de Ia invención y comprobar su eficacia.
EJEMPLO 1
Efecto de inhibidores peptídicos de Ia interacción Nck-CD3ε en Ia activación de linfocitos T.
Con el fin de demostrar Ia importancia de Ia interacción Nck-CD3ε en Ia activación de linfocitos T y validar esta interacción como blanco de agentes inmunomoduladores, se procedió primero al diseño de péptidos sintéticos que mimetizaran Ia secuencia del PRS y que pudieran bloquear el sitio de unión en Nck a CD3ε. Se consiguió un péptido, denominado 11 R085, que es 300 veces más potente que un péptido con Ia secuencia silvestre en Ia inhibición de Ia interacción de CD3ε con el dominio SH3.1 de Nck. Utilizando este péptido, se consiguió inhibir de forma específica Ia proliferación de linfocitos T humanos tanto CD4+ como CD8+ en respuesta a Ia estimulación con anticuerpos anti-CD3 con una IC50 de 20 μM, mientras que Ia proliferación de linfocitos T humanos dependiente de un receptor diferente, el IL2R, no fue prácticamente afectada por el péptido a concentraciones 3 veces superiores. Esto sugería que el péptido 11 R085 inhibe Ia activación iniciada por el TCR pero no Ia activación mediada por otro receptor, y que por Io tanto era específico del blanco molecular para el que está diseñado. El péptido 11 R085 también inhibió Ia producción de IL2 y Ia proliferación inducida por antígeno en linfocitos primarios de ratones transgénicos OT-I con una IC50 de 5 μM. Quedaba así validada Ia interacción Nck-CD3ε como blanco molecular para el desarrollo de inmunosupresores.
EJEMPLO 2
Selección por cribado in silico de compuestos con potencial de bloqueo de Ia interacción Nck-CD3ε y evaluación de su capacidad inmunosupresora.
Se han utilizado técnicas de modelado molecular (Fiser, A., Feig, M., Brooks, C. L., 3rd and SaIi, A. (2002) Acc Chem Res., 35, 413-421 ) para obtener por homología Ia estructura del dominio SH3.1 de Nckα basándonos en su secuencia y en Ia estructura de unos 50 dominios SH3 conocidos de otras proteínas. De esta forma se ha llegado a un modelo teórico de estructura que puede ajustarse con una muy buena fiabilidad a Ia estructura real del dominio. Partiendo de esta estructura se hizo un cribado virtual con software propio de una colección de más de 300.000 compuestos puestos a disposición por Ia empresa norteamericana Chembridge y se seleccionaron los diez compuestos que teóricamente encajaban mejor en un bolsillo hidrofóbico del SH3.1 , supuestamente encargado del reconocimiento de Ia secuencia PRS de CD3ε (ver FIG. 1 ). Estos compuestos se utilizaron posteriormente para realizar los ensayos de inhibición de Ia proliferación de linfocitos T humanos estimulados con anticuerpos anti-CD3.
EJEMPLO 3
Efecto selectivo de los compuestos resultantes del cribado virtual en Ia proliferación inducida por anti-CD3.
Para Ia siguiente ronda de selección de los compuestos resultantes del cribado virtual con potencial de bloqueo de Ia interacción Nck-CD3ε, se marcaron PBMNC purificadas de donantes sanos mediante fluorescencia y se incubaron durante 5 días sobre placas recubiertas del anticuerpo anti- CD3 OKT3 en presencia de distintas dosis de dichos compuestos. La proliferación de los linfocitos T se evaluó por citometría de flujo de acuerdo con Ia pérdida de fluorescencia verde (CFSE) dentro de Ia población CD8+.
Todos los compuestos ensayados tuvieron un cierto grado de actividad bloqueante de Ia proliferación de los linfocitos, pero el mejor y menos tóxico fue el compuesto denominado CBM-1 (compuesto de formula estructural (I)), como se muestra en Ia figura 2 (FIG. 2), donde CBM-1 está representado por el compuesto NSI-65.
EJEMPLO 4
Efecto selectivo de CBM-1 en Ia proliferación inducida por anti-CD3.
Se marcaron PBMNC purificadas de donantes sanos con CFSE y se incubaron durante 5 días sobre placas recubiertas del anticuerpo anti-CD3 OKT3 en presencia de distintas dosis de varios compuestos indicados, entre ellos CBM-1. La proliferación se evaluó por citometría de flujo de acuerdo con Ia pérdida de fluorescencia verde (CFSE) dentro de las poblaciones CD4+ y CD8+. Se realizó en paralelo un experimento de proliferación de linfoblastos humanos dependiente de IL2. Se estimularon PBMNC purificadas de donantes sanos con PHA durante 48 h y se marcaron con CFSE. Posteriormente se cultivaron por 3 días en presencia de 100 ILJ/ml de IL2 humana recombinante en presencia de las concentraciones de los compuestos utilizados, particularmente de CBM-1.
El compuesto CBM-1 inhibió Ia proliferación inducida por anti-CD3 de linfocitos CD4+ con una IC50 de 2 μM y Ia de linfocitos CD8+ con una IC50 de 3 μM (FIG. 3). El efecto inhibidor de otros de los compuestos fue ligeramente inferior. CBM-1 no inhibió sin embargo significativamente Ia proliferación de linfoblastos humanos dependiente de IL2 a concentraciones de 20 μM, indicando que su especificidad frente a Ia proliferación dependiente de Ia activación de TCR pero no frenta a Ia dependiente de IL2R. Este dato apoya un mecanismo de acción selectivo sobre el TCR.
EJEMPLO 5
Inhibición de Ia secreción de citoquinas por linfocitos T humanos en respuesta a estimulación con anticuerpos anti-CD3.
El efecto del compuesto CBM-1 sobre Ia producción de citoquinas fue medido en un ensayo en que PBMNC humanas fueron estimuladas con anticuerpos anti-CD3. El sobrenadante de estas células fue recogido a las 72 h y se midieron varias citoquinas simultáneamente por un ensayo de citometria de flujo. Estos experimentos demostraron que el compuesto tuvo un potente efecto inhibidor sobre citoquinas Th1 como IFNγ (IC50 de 0,3 μM), TNFβ (IC50 de 0,2 μM) e IL10 (IC50 de 0,2 μM) y no tuvo efecto sobre Ia producción de IL5 e IL6 hasta concentraciones de 30 μM (FIG 4). Los datos indican por Io tanto que CBM-1 inhibe selectivamente Ia producción de algunas citoquinas por linfocitos T, pero no de otras. Es decir, CBM-1 muestra un grado de selectividad en Ia inhibición de rutas intracelulares de transmisión de señales.
EJEMPLO 6
Inhibición de Ia expresión de IFNγ intracelular por células T CD4+ de ratón en respuesta a Ia estimulación con anticuerpos anti-CD3.
Para demostrar si los inhibidores previenen Ia diferenciación de linfocitos ThO a Th1 , se realizaron ensayos de diferenciación in vitro. Se estimularon células de bazo de ratones C57BL/6 con anticuerpos anti-CD3 + anti-CD28 durante 48 h en presencia de las concentraciones de CBM-1 indicadas y se incubaron 6 horas más con brefeldina A, encontrándose que CBM-1 inhibe Ia generación de linfocitos Th1 secretores de IFNγ con una IC50 de 0,8 μM. Las células se tiñeron primero con CD4-PE y después de fijar y permeabilizar se tiñeron con anticuerpo anti-IFNγ. En Ia gráfica (FIG.5) se muestra Ia expresión de IFNγ intracelular (como producto del porcentaje de células positivas y de Ia fluorescencia media) en función de Ia concentración de CBM-1.
EJEMPLO 7
Determinación por RMN de Ia estructura tridimensional del dominio SH3.1 de Nckα
En paralelo, se determinó por RMN (en colaboración con el laboratorio de los Prof. María Angeles Jiménez y Manuel Rico, del Instituto de Química- Física Rocasolano, CSIC, Madrid), Ia estructura tridimensional del dominio SH3.1 de Nckα con y sin el péptido 11 R085 (FIG. 6). Esto permitió validar Ia predicción del modelo de estructura in silico utilizado para el cribado virtual. Además, permitió medir los desplazamientos químicos ocasionados en Ia estructura por el compuesto CBM-1 (FIG. 7).
Los resultados indican que el compuesto CBM-1 interacciona estructuralmente con Ia proteína aproximadamente en Ia forma predicha por los estudios bioinformáticos. El compuesto se une en un bolsillo hidrofóbico en el que participan los residuos Trp41 y Tyr50/Phe53, provocando una distorsión y desplazamiento de Ia lámina β2 y de residuos en el bucle distal (FIG. 7 y FIG. 9). Los desplazamientos de residuos en el dominio SH3.1 validan Ia predicción sobre Ia interacción del dominio SH3.1 con CBM-1 a nivel molecular y son consecuentes con el modelo.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Compuesto de fórmula (I):
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y cualquiera de sus derivados para su uso como medicamento.
2. Uso del compuesto según reivindicación 1 para preparar un medicamento.
3. Uso del compuesto según reivindicación 2 para preparar un medicamento para el tratamiento y/o prevención de enfermedades que cursen con Ia activación de linfocitos T ó con Ia hiperproliferación o proliferación anormal de los mismos.
4. Uso del compuesto según reivindicación 3, donde las enfermedades que cursan con Ia activación de linfocitos T son enfermedades autoinmunes.
5. Uso del compuesto según reivindicación 4 donde las enfermedades autoinmunes se seleccionan de Ia lista que comprende: esclerosis múltiple y sus variedades, lupus eritematoso sistémico, psoriasis, vitíligo, artritis reumatoide, asma, psoriasis, hepatitis autoinmune, diabetes de tipo I, miastenia gravis, espondilitis anquilosante y enfermedad de Crohn.
6. Uso del compuesto según reivindicación 3 donde las enfermedades que cursan con Ia activación de linfocitos T, son enfermedades que cursan con rechazo de alotransplantes ó xenotransplantes de órganos ó tejidos.
7. Uso del compuesto según reivindicación 3 donde las enfermedades que cursan con Ia activación de linfocitos T, son linfomas o leucemias T.
8. Composición farmacéutica que comprende el compuesto según reivindicación 1 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
9. Uso de Ia composición farmacéutica según reivindicación 6 como inmunosupresor.
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