CN102083809A - 基于阻断TCR-Nck相互作用的免疫抑制物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及结构式(I)的化合物以及其衍生物以用作药物。它们优选为具有基于阻断TCR-Nck相互作用的反应机制的免疫抑制剂。

Description

基于阻断TCR-Nck相互作用的免疫抑制物

技术领域

本发明涉及用作药物的具有结构式(I)的化合物以及它的衍生物。它们优选为具有基于阻断TCR-Nck相互作用的作用机制的免疫抑制剂。

背景技术

T淋巴细胞在同种异体移植排斥中起核心作用，并且或多或少地直接参与自身免疫病的产生。因此，目前免疫抑制药物的作用机制是基于对T淋巴细胞活化的抑制。这些免疫抑制物由于并不以特异方式抑制淋巴细胞途径而具有高毒性。

T淋巴细胞是通过将移植器官的主要组织相容性复合物(MHC)识别为外源物的抗原受体(TCR)而被活化。TCR由6个亚基形成，其中两个(TCRα和TCRβ)负责识别与抗原肽相连的MHC，而其他四个(CD3γ，CD3δ，CD3ε和CD3ζ)负责信号向淋巴细胞胞质的传递(在Alarcon，B.，Gil，D.，Delgado，P.and Schamel，W.W.(2003)Immunol Rev，191，38-46中综述)。在MHC结合TCR后发生的起始过程之一是Src家族的酪氨酸激酶Lck和Fyn的活化，所述酪氨酸激酶使CD3亚基的ITAM的酪氨酸磷酸化，后者接下来转变成Syk家族的酪氨酸激酶(ZAP70和Syk)的结合位点。到目前一直认为这是信号传递的线性模式，并且通过Syk家族的激酶(特别是ZAP70)，发生趋异活化级联反应，造成多种转录因子的活化，包括免疫抑制药物环孢霉素A和FK506的靶标NFAT(Lin，J.and Weiss，A.(2001)J Cell Sci，114，243-244)。多年前，本发明的作者发现了TCR在被激活时，经历构象改变，导致Nck适配体直接在CD3ε亚基的富含脯氨酸的序列(PRS)处募集(Gil，D.，Schamel，W.W.，Montoya，M.，Sanchez-Madrid，F.and Alarcon，B.(2002)Cell，109，901-912)。通过涉及Nck的氨基端SH3.1结构域(其结合CD3ε)的过表达以及通过在T淋巴细胞中引入APA1/1抗体(其结合PRS并阻断它)的实验，显示出这一TCR-Nck相互作用对于TCR活化是至关重要的。

发明内容

目前的免疫抑制剂的一个重要问题在于它们的毒性，这是由于它们并不特异地抑制淋巴细胞途径的事实。

本发明提供一种基于阻断TCR-Nck相互作用，与现有化合物相比对于T淋巴细胞更加特异且具有更少副效应的免疫抑制化合物。

在本发明化合物的部分，TCR构象改变和信号传递的起始机制(募集效应蛋白的基本步骤)都被考虑。

在结合刺激性抗体以及MHC后发生的TCR构象改变首先被“蛋白沉降(pull down)”检测法所证明，在该检测法中，TCR可诱导地结合到GST-Nck融合蛋白基质上。这一生化检测法不能对TCR经历构象改变的那些细胞进行个体鉴定。然而，本发明的作者证明APA1/1抗体也识别构象改变(Risueno，R.M.，Gil，D.，Fernandez，E.，Sanchez-Madrid，F.and Alarcon，B.(2005)Blood，106，601-608)。该抗体可以用于培养物中的T淋巴细胞制品，也可用于免疫组化切片中。除了在体证明构象改变发生外，这一反应剂使得能够通过“蛋白沉降”以外的方法来证明构象改变的存在。此外，该抗体识别在T淋巴细胞和带有肽激动剂的抗原呈递细胞之间形成的免疫突触，而不是由部分激动剂/抗拮剂形成的突触。这些数据表明TCR的构象改变可在T淋巴细胞区分强弱激动剂之后进行，并且会在识别强配体过程中激活特异的活化级联反应。这一假设似乎被下面的事实所确证，在胸腺发育期间，构象改变(通过APA1/1染色可视)发生在诱导负选择的配体识别期间而不是在诱导正选择的配体识别期间(Risueno，R.M.，van Santen，H.M.and Alarcon，B.(2006)Proc Natl Acad Sci USA.，103，9625-9630)。虽然不能忽视构象改变也传递至其他CD3亚基的细胞质区域并且全面地影响由TCR起始的信号传递的整个过程的可能性，此过程包括ITAM的酪氨酸的磷酸化作用(Minguet，S.，Swamy，M.，Alarcon，B.，Luescher，I.F.and Schamel，W.W.(2007)Immunity.，26，43-54)，但是唯一已知的TCR构象改变的结果是在CD3ε上的PRS暴露。然而，Nck向CD3ε的PRS的募集也是将构象改变传递到细胞内活化途径的可能机制(Gil，D.，Schamel，W.W.，Montoya，M.，Sanchez-Madrid，F.and Alarcon，B.(2002)Cell，109，901-912)。

为了证明Nck-CD3ε相互作用对T淋巴细胞活化的重要性以及验证这一相互作用作为免疫调节剂的靶标，设计合成肽来模拟PRS的序列，并且该合成肽可以阻挡Nck到CD3ε结合位点。获得了一条肽，命名为11R085，它在抑制CD3ε与Nck的SH3.1结构域的相互作用上比具有天然野生序列的肽高300倍的潜能。使用该肽特异性抑制了响应于抗CD3抗体的刺激的人T淋巴细胞的增殖，既包括CD4+又包括CD8+，其IC50为约20μM，而依赖于不同受体IL2R的人T淋巴细胞的增殖实际上未受到该肽的影响，即使是在3倍高的浓度下。

因此，肽11R085抑制通过TCR起始的活化但不抑制由其它受体介导的活化，因此它对于设计它时针对的分子靶标是特异的。

肽11R085也以IC50约5μM抑制OT-1转基因小鼠原代淋巴细胞中的IL2产生和由抗原诱导的增殖。因此，证实了Nck-CD3ε相互作用可作为免疫抑制物开发的分子靶标。

使用这一信息和生物信息学选择策略，按本发明实施例所述进行对结合SH3.1结构域的化合物的虚拟筛选。这一筛选后，选择10个最佳地符合SH3.1疏水口袋并且能识别CD3ε的PRS序列的候选物(参见图1)。所有这些结构迥异的化合物都具有一定程度的活性，但是显示最高活性而且即使在高剂量时仍显示最低毒性(图7)的一个是命名为CBM-1的化合物，该化合物具有结构式(I)。

化合物CBM-1显示出良好的活性和免疫抑制能力，抑制由抗-CD3抗体所诱导的人T淋巴细胞的增殖而不抑制IL-2依赖的增殖。它也抑制抗原依赖的小鼠T淋巴细胞的增殖以及IL2的释放。在由抗-CD3和抗-CD28抗体刺激的人淋巴细胞中，响应于抗-CD3和抗-CD28，该化合物抑制IFNγ、IL-10和TNFβ的生产，以及产生IFNγ的人细胞的产生。这些数据证实了在低至0.1μM，优选在0.1和1μm之间的范围的浓度下，该化合物对于鼠和人的T淋巴细胞的活化具有抑制作用。

因此，CBM-1作为免疫抑制剂是有活性的。

如上所述，本发明的第一方面涉及分子式(I)的化合物：

或任何它的衍生物，包括它的盐、异构体或异构体混合物、前药、结晶形式等，以用作药物，优选作为免疫抑制剂。

本发明中的异构体或异构体混合物被理解为意指：

1)以相对于化合物的多个键的取代基位置限定的Z或E异构体，

2)光学异构体或对映异构体，由于手性中心(与四个不同取代基相连的原子)的存在而产生，导致对映异构体之间在它们的光学活性(偏振光通过对映异构体溶液后的旋转)方面的区别，

3)非对映异构体，具有至少两个手性中心的异构体，这些中心之一的取代基在两个非对映异构体中排列相同，而且至少另一个中心的取代基在两非对映异构体中排列不同。

术语分子式(I)的化合物的“前药”应理解为指在给予个体时能够直接或间接提供一种或数种该分子式(I)的化合物的任何衍生物(例如酯、氨基甲酸酯(盐)、酰胺等)。

衍生物的定义也包括游离状态或作为溶剂化物的分子式(I)的化合物的“结晶形式”。在此使用的术语“溶剂化物”包括可以用于药物组合物的溶剂化物以及可用于其制备的溶剂化物。溶剂化物可以通过本领域公知的常规溶剂化方法获得。

本发明中的术语“盐”应理解为药学可接受的盐和可以用于药物制备的药学不可接受的盐。因此本发明化合物的所有盐，无论是否是药学可接受的，都包括在本发明的范围内。

最后，“衍生物”的定义包括那些含有一或多个添加同位素的原子的本发明化合物。例如，具有本发明通式之一的化合物，其中一或数个氢原子被氘或氚原子所替代，一或数个碳原子被¹³C或¹⁴C原子所替代或者一或数个氮原子被¹⁵N所替代。

分子式(I)的化合物能够结合Nck的SH3.1结构域，阻断TCR-Nck相互作用，并因此是T淋巴细胞的特异免疫抑制剂，相比于其它免疫抑制剂，它具有明显的优点，其中之一是它造成更少的副反应。

因此，本发明的一方面是具有结构式(I)的化合物或任何其衍生物在制备治疗和/或预防与T淋巴细胞增殖旺盛相关的疾病的药物中的应用。

这些疾病优选自身免疫疾病、与同种异体移植或者器官或组织异种移植排斥相关的疾病、或者淋巴瘤和/或T白血病。

自身免疫疾病更优选为T淋巴细胞的活化在诱导和/或效应期起重要作用的那些疾病，并且更优选下列全身器官特异性自身免疫疾病，包括：多发性硬化及其变种、全身性红斑狼疮、牛皮癣、白癜风、风湿性关节炎、哮喘、自身免疫性肝炎、I型糖尿病、重症肌无力、强直性脊柱炎、克罗恩氏病等。

本发明的另一方面涉及药物组合物，包括结构式(I)的化合物，或其任何前述的衍生物，以及药学可接受的赋形剂。

在各种情形下，将使该组合物适于所用的给药类型。因此，上述组合物可以以用于口服给药(或者作为固体(例如片剂、丸剂、胶囊等)或者作为液体(例如溶液、悬剂、乳剂等)，用于非经肠道给药(例如，肌肉内、皮下、静脉内等)、直肠给药等的药物形式存在，或者任何其它临床上允许的给药形式，并且以治疗有效量给药。

可以用于这些组合物的药学可接受的佐剂和赋形剂是本领域通常使用的赋形剂。本发明提供的药物组合物可以通过任何给药途径给予，因此这一组合物将被配制成用于所选给药途径的适合的药物形式。

在整个说明书和权利要求书中，措词“包括”及其变体并不旨在排除其它技术特征、添加物、组分或步骤。对于本领域技术人员，本发明的其它目的、优点和特征将部分通过说明书而部分通过本发明的实践变得显而易见。下面的附图和实例仅以说明的方式提供，而并不旨在限制本发明。

附图说明

图1、SH3.1结构域的模型以及具有结合潜能的化合物的虚拟筛选。

结合Nck的SH3.1结构域的化合物的虚拟筛选。Nck的SH3.1结构域的理论结构模型(A图)。B图示出这些化合物之一如何适配虚拟模型的上部。

图2、由虚拟筛选所产生的化合物对于抗-CD3诱导的增殖的选择效应。

通过流式细胞仪，按照CD8+群内绿色荧光(CFSE)的损失来评估增殖。不同的化合物由带数字的NSI代码表示。CBM-1是化合物NSI-65。

图3、化合物CBM-1对于抗-CD3诱导的增殖的选择效应。

响应于抗-CD3抗体的刺激，由CBM-1对人T淋巴细胞增殖的抑制。将这些结果与人IL2-依赖的淋巴母细胞增殖的结果相比较。

图4、CBM-1对细胞因子释放的抑制。

响应于抗-CD3抗体的刺激，由CBM-1对人T淋巴细胞的细胞因子分泌的抑制。在各种剂量的CBM-1存在下，于包被有抗-CD3 OKT3抗体的板上对从健康供体纯化的外周血单核细胞(PBMNC)刺激72小时。通过多指标流式细胞仪(BD细胞计数珠阵列，BD cytometric bead array)来评估上清中的所示细胞因子(IL-10，IFN-γ和TFN-β)的浓度。化合物CBM-1没有显示出对于IL5、IL1-β和IL6释放的任何影响，而检测不到IL2和IL4。

图5、IFNγ的细胞内生产的抑制。

响应于抗-CD3和抗-CD28混合物的刺激的IFNγ的细胞内表达。图中示出作为CBM-1浓度函数的细胞内IFNγ(作为阳性细胞百分数和平均荧光的乘积)表达。

图6、SH3.1结构域的NMR结构以及在结合11R085高亲和肽后造成的移位。

Nckα的SH3.1结构域的NMR结构(A)。5个β-片层连续编号。N和C分别表示氨基和羧基末端。(B)通过将11R085高亲和肽与Nckα的SH3.1结构域(黑色)相结合而移位的残基与Nckβ的相应残基的比较。

图7、SH3.1结构域的NMR结构以及在结合CBM-1后造成的移位。

由于与化合物CBM-1的相互作用而造成的SH3.1结构域中氨基酸残基的移位。在结合化合物后位置改变的氨基酸残基的侧链被表示出来。该改变是化合物CBM-1与在虚拟筛选中看到的口袋结合的结果。

图8、CBM-1的毒性，

用所示浓度的CBM-1孵育人Jurkat T淋巴细胞系和人Raji成淋巴细胞B细胞系48小时。通过碘化丙啶排除和流式细胞仪来评估化合物毒性。两种细胞系在48小时后仍保持100％存活，即使以最高剂量的化合物也如此。

图9、Nckα的SH3.1结构域的一级序列与Nckβ的SH3.1结构域的一级序列的比较以及Nckα的SH3.2和SH3.3结构域的一级序列的比较。

在Nckα的SH3.1结构域中的β-片层和连接环的位置被表示出来。黑色箭头指示在结合CBM-1后被强烈移位的残基。

具体实施方式

实施例

下面用发明人进行的一些实验说明本发明，这些实验解释了一些为鉴定本发明化合物以及证明其效力所进行的工作。

实施例1

抑制Nck-CD3ε相互作用的肽对T淋巴细胞活化的影响

为了证明Nck-CD3ε相互作用对于T淋巴细胞活化的重要性以及验证这一相互作用作为免疫调节剂的靶标，设计模拟PRS的序列并且可以阻断Nck与CD3ε结合位点的合成肽。获得了一条肽，命名为11R085，它在抑制CD3ε与Nck的SH3.1结构域的相互作用上比具有天然野生序列的肽高300倍的潜能。使用该肽特异性抑制了响应于抗CD3抗体的刺激的人T淋巴细胞的增殖，既包括CD4+又包括CD8+，其C50为约20μM，而依赖于不同受体IL2R的人T淋巴细胞的增殖实际上未受到该肽的影响，即使是在3倍高的浓度下。这表明肽11R085抑制由TCR起始的活化作用但不抑制由另一受体介导的活化作用，并且因此它对于设计它时针对的分子靶标是特异的。肽11R085也以IC50为5μM抑制OT-I转基因鼠原初淋巴细胞的IL2生产以及抗原诱导的增殖。因此，证实了Nck-CD3ε相互作用作为免疫抑制物开发的分子靶标。

实施例2

通过对具有阻断Nck-CD3ε相互作用潜能的化合物的虚拟筛选进行的选择以及它们免疫抑制物能力的评估。

基于Nckα的SH3.1结构域的序列以及其他蛋白质的50个已知的SH3结构域的结构，通过同源性，使用分子建模技术(Fiser，A.，Feig，M.，Brooks，C.L.，3rd and Sali，A.(2002)Acc.Chem.Res.，35，413-421)获得Nckα的SH3.1结构域的结构。以这种方式，获得可以被认为与该结构域的实际结构非常相似的理论结构模型。从这一结构开始，在由North American公司Chembridge提供的多于300,000种化合物的集合上，用发明人自己的软件进行虚拟筛选并且选择10种理论上最适合SH3.1的疏水口袋的化合物，该口袋被认为是负责识别CD3ε的PRS序列(参见图1)。这些化合物随后被用于进行由抗-CD3抗体所刺激的人T淋巴细胞增殖抑制的检测。

实施例3

虚拟筛选产生的化合物对于抗-CD3诱导的增殖的选择效应。

对于虚拟筛选所产生的具有阻断Nck-CD3ε相互作用潜能的化合物的下一轮选择，将自健康供体纯化的PBMNC用荧光标记并在不同剂量的这些化合物存在下，在覆有抗-CD3 OKT3抗体的板上孵育5天。根据CD8+群中的绿色荧光(CFSE)的损失，通过流式细胞仪评估T淋巴细胞的增殖。

所有检测的化合物对于淋巴细胞的增殖具有一定程度的阻断活性，但是最佳的且毒性最小的是命名为CBM-1的化合物(结构式(I)的化合物)，如图2所示，其中CBM-1由化合物NSI-65所表示。

实施例4

CBM-1对抗-CD3诱导的增殖的选择效应。

将自健康供体纯化的PBMNC用CFSE标记并在各种剂量的所示化合物(包括CBM-1)存在下，在包被有抗-CD3 OKT3抗体的板上孵育5天。根据CD4+和CD8+群中的绿色荧光(CFSE)的损失，通过流式细胞仪评估增殖。对人IL2-依赖的淋巴母细胞的增殖进行平行实验。将来自健康供体的纯化PBMNC用PHA刺激48小时并用CFSE标记。随后在各种浓度的所用化合物(尤其是CBM-1)存在下，在100IU/ml人重组IL2存在下，培养3天。

化合物CBM-1以IC50为2μM抑制由抗-CD3诱导的CD4+淋巴细胞的增殖并且以IC50为3μM抑制由抗-CD3诱导的CD8+淋巴细胞的增殖(图3)。其他化合物的抑制效应稍少。然而，CBM-1在20μM浓度下不显著抑制人IL2-依赖的淋巴母细胞的增殖，表明它对于依赖TCR活化而非依赖IL2R的增殖的特异性。这一数据支持对于TCR的选择作用机制。

实施例5

响应抗-CD3抗体的刺激，对人T淋巴细胞的细胞因子分泌的抑制。

在用抗-CD3抗体刺激的人PBMNC的检测中，测量CBM-1对细胞因子的生产的影响。在72小时收集这些细胞的上清液并且通过流式细胞仪检测来同时测量若干细胞因子。这些实验证明该化合物对细胞因子Th1和IFNγ(IC50为0.3μM)、TNFβ(IC50为0.2μM)和IL10(IC50为0.2μM)具有潜在的抑制效应并且在浓度高达30μM时也对IL5和IL6的生产没有影响(图4)。因此该数据表明CBM-1选择性地抑制T淋巴细胞的一些细胞因子的生产，而对其他的没有影响。也就是说，CBM-1显示出对于抑制细胞内信号传递途径的一定程度的选择性。

实施例6

响应抗-CD3抗体的刺激，对鼠CD4+T细胞的细胞内IFNγ表达的抑制。

为了证明抑制物是否可以阻止Th0分化成Th1淋巴细胞，在体外进行分化检测。在指示浓度的CBM-1存在下，用抗-CD3+抗-CD28抗体刺激C57BL/6小鼠脾细胞48小时并用布雷菲德菌素A进一步孵育6小时。发现CBM-1以IC50为0.8μM抑制分泌IFNγ的Th1淋巴细胞。细胞首先用CD4-PE染色然后固定并漂洗，用抗-IFNγ抗体染色。图中(图5)示出作为CBM-1浓度的函数的细胞内IFNγ的表达(作为阳性细胞百分数和平均荧光的乘积)。

实施例7、Nckα的SH3.1结构域的三维结构的NMR测定

在肽11R085存在和不存在下，平行测定Nckα的SH3.1结构域的三维结构(Instituto de Química-Física Rocasolano，CSIC，Madrid的Professors María Angeles Jiménez和Manuel Rico实验室协作)(图6)。这能够验证用于虚拟筛选的结构计算机模型的预测。此外，其允许对化合物CBM-1给该结构造成的化学移位的测量(图7)。

结果表明，大体上如由生物信息学研究所预测的那样，CBM-1与该蛋白质在结构上相互作用。该化合物通过残基Trp41和Tyr50/Phe53的参与而结合疏水口袋，造成β2-片层和远端环中的残基的扭曲和移位(图7和图9)。SH3.1结构域中残基的移位验证了SH3.1结构域与CBM-1在分子水平相互作用的预测并且与模型一致。

Claims (9)

1.分子式(I)的化合物：

以及所述化合物的任何衍生物，所述化合物和衍生物用作药物。

2.如权利要求1所述的化合物在制备药物中的应用。

3.如权利要求2所述的化合物在制备药物中的应用，所述药物用于治疗和/或预防与T淋巴细胞的活化或者它们的旺盛增殖或异常增殖相关的疾病。

4.如权利要求3所述的化合物的应用，其中所述与T淋巴细胞活化相关的疾病是自身免疫疾病。

5.如权利要求4所述的化合物的应用，其中所述自身免疫疾病选自包括：多发性硬化及其变种、全身性红斑狼疮、牛皮癣、白癜风、风湿性关节炎、哮喘、自身免疫性肝炎、I型糖尿病、重症肌无力、强直性脊柱炎、克罗恩氏病的列表。

6.如权利要求3所述的化合物的应用，其中所述与T淋巴细胞活化相关的疾病是与器官或组织的同种异体移植或异种移植排斥相关的疾病。

7.如权利要求3所述的化合物的应用，其中所述与T淋巴细胞活化相关的疾病是淋巴瘤或T细胞白血病。

8.包括如权利要求1所述的化合物以及药学上可接受的赋形剂的药物组合物。

9.如权利要求6所述的药物组合物作为免疫抑制剂的应用。

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