WO2009150327A2 - Procede de determination du taux d'hemoglobine, de numeration et de differenciation des globules blancs et milieu adapte - Google Patents

Procede de determination du taux d'hemoglobine, de numeration et de differenciation des globules blancs et milieu adapte Download PDF

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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G01N33/56972—White blood cells

Definitions

  • the invention relates to a method and a reaction medium for both determining, without a toxic product such as cyanide, the hemoglobin level, counting and differentiating white blood cells (GB) on the same dilution of a sample. blood.
  • a toxic product such as cyanide
  • GB white blood cells
  • red blood cells In an aqueous medium, red blood cells (RBCs) are lysed, hemoglobin is oxidized to methemoglobin (also called hemoglobin) by ferricyanide and cyanide ions, which have a strong affinity for the subject; they are methemoglobin theme ligands forming a cyanmethemoglobin complex, whose maximum absorbance is at 540 nm.
  • methemoglobin also called hemoglobin
  • ferricyanide and cyanide ions which have a strong affinity for the subject; they are methemoglobin theme ligands forming a cyanmethemoglobin complex, whose maximum absorbance is at 540 nm.
  • the measurement of hemoglobin is made by spectrophotometry.
  • a quaternary ammonium salt was added in low concentration to the reaction medium.
  • US5468640A discloses a rapid method for determining the level of hemoglobin in a blood sample, wherein said sample is contacted with a reaction medium at a pH of 11.3-13.7 comprising a surfactant ionic, also free of any cyanide ion.
  • a surfactant ionic also free of any cyanide ion.
  • Either the surfactant is also a strong base, such as stearyltrialkylammonium hydroxide, and it imparts the required pH to the medium, or it is not a strong base, for example cetyltrimethylammonium bromide (CTAB), and a strong base must to be added, for example an alkali metal hydroxide.
  • CTAB cetyltrimethylammonium bromide
  • US6740527A discloses a method for determining the hemoglobin level of a blood sample, still devoid of cyanide ion, which further allows to give a count of GB.
  • the sample is first diluted and then contacted with a reaction medium which comprises a lysing agent consisting of 0.1-20% by weight of at least one quaternary ammonium salt and 0.1-15% by weight. % by weight of a hydroxylamine salt.
  • a reaction medium which comprises a lysing agent consisting of 0.1-20% by weight of at least one quaternary ammonium salt and 0.1-15% by weight. % by weight of a hydroxylamine salt.
  • Determining the hemoglobin level, the number of GB and the differentiation of GB with a single lysis agent on an automatic hematology analyzer would reduce the number of reagents used and simplify the fluid organization of the analyzer. These are factors of robustness of the system and reduction of manufacturing and operating costs.
  • the inventors of the present invention have unexpectedly discovered that the mere presence of one or more quaternary ammonium salts is sufficient to lyse GBs and stabilize the measurement of hemoglobin by binding quaternary ammonium groups. on Theme. It is therefore sufficient to determine the hemoglobin level, count the white blood cells and differentiate them, in a blood sample, in the absence of any other lysis agent and other ligand of the subject. hemoglobin.
  • the invention provides a simple method, free of toxic product, allowing, in the same blood sample, both to determine the hemoglobin level, and to count and differentiate the GB. This method involves the reading and measuring techniques conventionally employed in the field of blood formulation and does not involve any toxic chemical entities, such as cyanide ions and hydroxylamine salts, for example.
  • the method of the invention comprises the following steps:
  • the blood sample is placed in an isotonic or hyperosmolar medium, at a pH not exceeding 10, devoid of cyanide ions, and comprising at least one quaternary ammonium salt and at least one preservative agent,
  • the complex formed between hemoglobin and the quaternary ammonium groups is detected by spectrophotometry and
  • GB is counted and is differentiated into at least three sub-populations, said process being carried out in the absence of any other ligand than said quaternary ammonium salt (s).
  • the medium in which the blood sample is typically is prepared in one or two steps; in one step, the constituent ingredients of the diluent and lysis media and the blood sample are mixed in one step; in two stages, the blood sample is placed in the diluent medium, and the medium thus obtained and the lysis medium are mixed.
  • isotonic or hyperosmolar medium is meant a preferably isotonic or slightly hyperosmolar medium, to avoid any excessive contraction of the GB which would hinder their differentiation.
  • the quaternary ammonium salt or salts advantageously correspond to the following characteristics, taken alone or in combination:
  • the quaternary ammonium salt or salts are chosen from the compounds of formula (I) NR1R2R3R4 + X " , in which
  • R1 represents a hydrocarbon chain having from 1 to 18 carbon atoms
  • R2, R3 and R4 each independently represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms
  • X represents a halogen or a group selected from OH, CH 3 SO 4 and PO 4 .
  • R1 may represent a hydrocarbon chain having from 10 to 18 carbon atoms and then the said salt or salts are preferably chosen from the salts of dodecyltrimethylammonium, myristyltrimethylammonium, palmityltrimethylammonium and stearyltrimethylammonium.
  • R1 may also represent a hydrocarbon chain having from 1 to 6 carbon atoms, and said salt or salts are preferably chosen from tetraethyl ammonium salts.
  • said medium may comprise several quaternary ammonium salts, in particular several salts of formula (I), and for example one or more salts of formula (I) in which R1 is a C10-C18 chain. and / or one or more salts of formula (I) in which R1 is a C1-C6 chain.
  • Particularly suitable salts are chosen from myristyltrimethylammonium bromide, dodecyltrimethylammonium chloride and tetraethylammonium hydroxide, used alone or as a mixture.
  • the proportion of the quaternary ammonium salt or salts varies from 2 to 4% by weight.
  • the medium comprises one or more preservatives.
  • This or these agents contribute to an optimization of each of the steps of said process, but particularly to that of the differentiation of GB.
  • This or these agents are in particular bacteriostatic agents preferably chosen from dimethylurea and 2-pyridinethiol-1-sodium oxide.
  • the medium may also contain other ingredients: a stabilizing agent, for example ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA), at least one nonionic surfactant, such as Triton ® .
  • EDTA ethylene diamine tetraacetic acid
  • Triton ® nonionic surfactant
  • the hemoglobin level can be measured by standard spectrophotometric techniques.
  • the enumeration of GB is carried out by a conventional method also based for example on the principle of impedance which, according to the method of the invention, also makes it possible to differentiate GB in at least the following three sub-populations: lymphocytes, monocytic cells (other than lymphocytes) and granulocytes.
  • the medium contains at least one quaternary ammonium salt of formula (I) in which R 1 represents a hydrocarbon chain of 12 carbon atoms and another quaternary ammonium salt of formula (I ) in which R 1 represents a hydrocarbon chain of 14 carbon atoms.
  • R 1 represents a hydrocarbon chain of 12 carbon atoms
  • another quaternary ammonium salt of formula (I ) in which R 1 represents a hydrocarbon chain of 14 carbon atoms under these conditions, and associated with a biparametric method of impedance and laser measurement at large angles, also conventional, we can differentiate at least the following four sub-populations: lymphocytes, monocytes, eosinophilic granulocytes and neutrophilic granulocytes .
  • the medium may also comprise up to three quaternary ammonium salts, or even more.
  • the blood sample is diluted in slightly hyperosmolar medium and buffered at neutral pH.
  • a pH greater than 10 causes partial lysis of GBs preventing their differential counting.
  • the invention also relates to a medium for determining the hemoglobin level and for counting and differentiating white blood cells, said medium being free of cyanide ions, and comprising at least one quaternary ammonium salt and a preservative, said medium being devoid of any other ligand agent than said salt or salts.
  • the medium according to the invention comprises a lysing agent which consists of one or more quaternary ammonium salts, this or these latter constituting the only ligand binding agent (s) to the hemoglobin theme.
  • This salt or these salts are advantageously chosen from the compounds of formula I 1 NR1 R2R3R4 + X " in which
  • R 1 represents a hydrocarbon chain having from 1 to 18 carbon atoms
  • R2, R3 and R4 each independently represents an alkyl group having from 1 to 6 carbon atoms
  • X represents a halogen or a group selected from OH, CH 3 SO 4 and PO 4 ,
  • This medium is advantageously that described above and has the same characteristics, considered alone or in combination.
  • a preferred medium comprises the following quaternary ammonium salts: myristyltrimethylammonium bromide, dodecyltrimethylammonium chloride, tetraethylammonium hydroxide.
  • myristyltrimethylammonium bromide ranges from 20-40 g / l, that of dodecyltrimethylammonium chloride of 1-10 g / l and that of tetraethylammonium hydroxide from 1-5 g / l.
  • It may further comprise at least, as a preservative, a bacteriostatic agent preferably selected from dimethylurea and 2-pyridinethiol-1-sodium oxide.
  • a bacteriostatic agent preferably selected from dimethylurea and 2-pyridinethiol-1-sodium oxide.
  • the proportion of dimethylurea varies from 1 to 10 g / l and that of 2-pyridinethiol-1-sodium oxide from 1-10 g / l.
  • EDTA ethylene diamine tetraacetic acid
  • EXAMPLE 1 Formulation of a Medium
  • the appropriate medium comprises a diluent and a lysing and reaction agent, as follows:
  • a diluent an aqueous solution composed of: an organic phosphate buffer, for example hydrogen phosphate sodium or disodium phosphate anhydrous a membrane stabilizer, for example chloride or sodium sulfate bacteriostatic agents, for example dimethylurea and
  • 2-pyridinethiol-1-sodium oxide a stabilizing agent for example disodium EDTA (EDTA.Na2) and as an agent for lysis, an aqueous solution consisting of: a mixture of bromide myristyltriméthyl ammonium chloride, dodecyltrimethyl ammonium and tetraethylammonium hydroxide, Triton ®, as nonionic surfactant, sodium chloride as a membrane stabilizer, the same or different from the diluent, and deionized water.
  • EDTA.Na2 disodium EDTA
  • Triton ® as nonionic surfactant
  • sodium chloride sodium chloride as a membrane stabilizer, the same or different from the diluent, and deionized water.
  • the diluent has an osmolarity of 320-360 mOsm / Kg at neutral pH and the lysing agent has a pH of 10.5 +/- 0.4.
  • the reaction medium obtained has a pH close to 8.
  • Example 2 Implementation of the process on a "3 populations" analyzer Preparation of the blood sample:
  • a counting sequence is performed as follows:
  • 180 ⁇ l of the first dilution are measured volumetrically to count the GB whereas approximately 100 ⁇ l of the second dilution are measured for RBCs / platelets.
  • the dilution volume of the GB is controlled by two optical barriers in a volumetric tube. During the volumetric count, the data is divided into 4 tables of 2 seconds each for statistical use. GR / Platelet counting starts with GB counting and stops exactly after 8 seconds.
  • the different GB subpopulations are differentiated according to size criteria by controlling the lysis conditions (diluent, lysing agent, time of action). When these conditions are met, the chemical reaction that takes place makes it possible to distinguish three populations of GB: lymphocytes, granulocytes and medium-sized cells (basophils + monocytes + a part of eosinophils + young granulocytes). After the lysis process, the lymphocytes are the smallest cells with their small nucleus and correlate with the cells between 25 and 90 ⁇ 5 fL (parameterizable) on the histogram of distribution of GB (in human mode) not shown.
  • the average cells are in the region between lymphocytes and granulocytes.
  • eosinophils After lysis action, they are correlated with the cells between 90 ⁇ 5 and 140 ⁇ 5 fL (modifiable) on the GB distribution histogram, not shown. Some eosinophils may, however, exceed 220 fL.
  • Neutrophilic granulocytes after the action of lysis, are the largest cells with their polysegmented nuclei retaining part of the cytoplasm. Neutrophils are correlated with cells between 140 ⁇ 10 and 449 fL on the GB distribution histogram, not shown.
  • the light source a green light emitting diode (LED) (555 nm) calculates the absorbance that is proportional to the hemoglobin concentration of the sample.
  • the optical path is determined by two optical paths in the GB chamber.
  • the reference Hb is stored during start-up or when the chamber is filled with thinner.
  • Example 3 Implementation of the process on an analyzer at least 4 populations
  • 150 ⁇ L of blood is taken from the tube where the blood was collected beforehand.
  • the blood column is sucked by the analyzer through a valve ceramic where 25 + 1 ⁇ L are sampled to form a first dilution at about 1/72 with 1800 ⁇ L of low-hypertonic diluent at neutral pH.
  • a second dilution is done in cascade with 25 ⁇ 1 ⁇ l and about 2 ml of diluent for measurement at 1/6000 GR and platelets. 475 ⁇ L of the predilution are taken up with 210 ⁇ L of lysing agent and
  • Hemoglobin is measured at 560 nm directly in the GB preparation tank after 15 seconds. This 1/251 GB / Hb dilution is then transferred to a cytometer where 267 ⁇ L are injected through a 75 ⁇ m micro-orifice and a nearby focused laser beam in a hydrodynamic double-flow architecture.
  • This double device for measuring electrical impedance and laser measurement at large angles makes it possible to count the GB and to determine at least 4 sub-leukocyte populations: lymphocytes, monocytes, erythrocyte granulocytes, neutrophil granulocytes, but also the detection of neutrophil granulocytes. hypogranules, plasmodium vivax, reported platelet agglutinates or nucleated GR.
  • 67 ⁇ L of the 1/6000 dilution are in turn transferred and injected through a 75 ⁇ m micro-orifice into a hydrodynamic double-flow architecture for the counting of GRs and platelets.

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Abstract

L'invention concerne un procédé de détermination, dans un échantillon sanguin, du taux d'hémoglobine, de numération et de différenciation des globules blancs, comprenant les étapes suivantes : On dispose de l'échantillon sanguin dans un milieu isotonique ou hyperosmolaire, à un pH n'excédant pas 10, en l'absence d'ions cyanure et comprenant au moins un sel d'ammonium quaternaire et un agentconservateur, On détecte le complexe formé entre l'hémoglobine et les groupes d'ammonium quaternaire, par spectrophotométrie, et On dénombre les globules blancs et on les différencie en au moins trois sous-populations, ledit procédé étant réalisé en l'absence de tout autre ligand. L'invention concerne aussi un milieu pour mettre en œuvre le procédé.

Description

PROCEDE DE DETERMINATION DU TAUX D'HEMOGLOBINE, DE NUMERATION ET DE DIFFERENCIATION DES GLOBULES BLANCS ET
MILIEU ADAPTE
L'invention concerne un procédé et un milieu de réaction pour, à la fois, déterminer, sans produit toxique tel que le cyanure, le taux d'hémoglobine, dénombrer et différencier les globules blancs (GB) sur une même dilution d'un échantillon sanguin.
Les méthodes traditionnelles de mesure de l'hémoglobine reposaient sur la détection en spectrophotométrie à 540 nm, d'un complexe chromogène formé entre des ions cyanures et l'hémoglobine sous une forme oxydée, la méthémoglobine. L'échantillon sanguin à analyser était exposé à un milieu de réaction aqueux contenant des sels de cyanure (cyanure de potassium) et des sels de ferricyanure (ferricyanure de potassium ou de sodium). En milieu aqueux, les globules rouges (GR) sont lysés, l'hémoglobine est oxydée en méthémoglobine (aussi appelée hémoglobine) par les ions ferricyanure et cyanures, lesquels possèdent une forte affinité vis-à-vis de Thème ; ils sont des ligands de Thème de la méthémoglobine en formant un complexe cyanméthémoglobine, dont le maximum d'absorbance est à 540nm. La mesure de l'hémoglobine est faite par spectrophotométrie. Par la suite, pour accélérer la lyse des GR, un sel d'ammonium quaternaire a été ajouté en faible concentration au milieu réactionnel. On s'est cependant heurté à un problème d'agglutination des complexes formés entre les ions ferrocyanures et les groupes ammonium quaternaire ; ces agglutinats présentent une turbidimétrie qui gêne Ia mesure photométrique de l'hémoglobine. Pour cette raison, les sels de ferricyanure ont été abandonnés, alors que le sel de cyanure est conservé.
Des automates ont été développés pour analyser rapidement l'hémoglobine, le nombre de GR et de GB dans les échantillons sanguins. Les milieux de réaction ont dû aussi évoluer parallèlement ; pour compter les GR et les GB, on est passé d'un diluant aqueux à un diluant isotonique ou faiblement hyperosmolaire. Dans ces conditions, il a été nécessaire d'augmenter la concentration en ammonium quaternaire pour lyser les GR.
Ces techniques présentent l'inconvénient majeur d'impliquer des ions cyanure, toxiques. Des méthodes ne nécessitant plus d'ions cyanure ont été mises au point. I. Oshiro et al. Clin. Biochem. 15(1) 83-88 (1982), proposent un procédé de détermination du taux d'hémoglobine dans un échantillon sanguin, mettant en jeu du lauryl sulfate de sodium (SLS), en l'absence de tout ion cyanure. Le SLS mis au contact de l'échantillon provoque l'hémolyse des GR, entraîne la conversion de l'hémoglobine en méthémoglobine par oxydation de l'atome de fer. Le complexe stable formé est détecté en spectrophotométrie d'absorption. Le SLS, même aux concentrations les plus faibles indiquées, provoque une lyse de l'ensemble des cellules, y compris des GB qui sont réduits à l'état de noyaux. Cette méthode utilise une forte dilution qui ne permet pas le comptage des GB avec une imprécision acceptable pour un temps de comptage limité. En outre le dénombrement différentiel n'est pas accessible.
Le document US5468640A décrit un procédé rapide de détermination du taux d'hémoglobine, dans un échantillon sanguin, selon lequel on met ledit échantillon au contact d'un milieu de réaction, à un pH de 11,3-13,7, comprenant un tensioactif ionique, également exempt de tout ion cyanure. Soit le tensioactif est aussi une base forte, comme l'hydroxyde de stéaryltrialkylammonium, et il confère le pH requis au milieu, soit il n'est pas une base forte, par exemple le bromure de cétyltriméthylammonium (CTAB), et une base forte doit être ajoutée, par exemple un hydroxyde de métal alcalin. Après hémolyse des GR par le tensioactif, l'action de ce dernier et de celle de la base forte entraînent la dénaturation de l'hémoglobine, l'exposition des hèmes de l'hémoglobine à l'oxygène de l'air provoquant l'oxydation de l'atome de fer. Le complexe formé entre les hèmes ferriques et les ions hydroxyde est détecté en spectrophotométrie d'absorption. Comme le procédé précédemment décrit, cette méthode ne permet pas de déterminer la différenciation des GB, car les conditions drastiques provoquent inévitablement leur lyse à l'état de noyaux.
Le document US6740527A divulgue un procédé de détermination du taux d'hémoglobine d'un échantillon sanguin, toujours dépourvu d'ion cyanure, qui permet en outre de donner une numération des GB. L'échantillon est d'abord dilué, puis mis en contact avec un milieu de réaction qui comprend un agent de lyse consistant en 0,1-20% en poids d'au moins un sel d'ammonium quaternaire et 0,1-15% en poids d'un sel d'hydroxylamine. Cette méthode permet de mesurer le taux d'hémoglobine et de dénombrer les GB, mais il ne permet pas de différencier ces derniers. Déterminer le taux d'hémoglobine, le nombre de GB et la différenciation des GB avec un seul agent de lyse sur un analyseur automatique d'hématologie permettrait de réduire le nombre de réactifs utilisés et de simplifier l'organisation fluidique de l'analyseur. Ce sont des facteurs de robustesse du système et de réduction des coûts de fabrication et de fonctionnement.
Les auteurs de la présente invention ont découvert, contre toute attente, que la seule présence d'un ou de plusieurs sels d'ammonium quaternaire était suffisante pour lyser les GB et stabiliser la mesure de l'hémoglobine par fixation des groupes d'ammonium quaternaire sur Thème. ll(s) suffi(sent)t donc pour déterminer le taux d'hémoglobine, dénombrer les globules blancs et différencier ces derniers, dans un échantillon sanguin, en l'absence de tout autre agent de lyse et autre ligand de Thème de l'hémoglobine. Ainsi, l'invention apporte un procédé simple, exempt de produit toxique, permettant, dans le même échantillon sanguin, à la fois de déterminer le taux d'hémoglobine, et de dénombrer et différencier les GB. Ce procédé met en jeu les techniques de lecture et de mesure classiquement employées dans le domaine de la formulation sanguine et n'implique aucune entité chimique toxique, comme les ions cyanures et les sels d'hydroxylamine, par exemple.
Le procédé de l'invention comprend les étapes suivantes :
On dispose de l'échantillon sanguin dans un milieu isotonique ou hyperosmolaire, à un pH n'excédant pas 10, dépourvu d'ions cyanure, et comprenant au moins un sel d'ammonium quaternaire et au moins un agentconservateur,
On détecte le complexe formé entre l'hémoglobine et les groupes d'ammonium quaternaire, par spectrophotométrie, et
On dénombre les GB et on les différencie en au moins trois sous populations, ledit procédé étant réalisé en l'absence de tout autre ligand que ledit ou lesdits sels d'ammonium quaternaire.
Le milieu dans lequel est l'échantillon sanguin est classiquement préparé en une ou deux étapes ; en une étape, les ingrédients constitutifs des milieux diluant et de lyse et l'échantillon sanguin sont mélangés en une étape ; en deux étapes, l'échantillon sanguin est placé dans le milieu diluant, puis le milieu ainsi obtenu et le milieu de lyse sont mélangés. Par milieu isotonique ou hyperosmolaire, on entend un milieu de préférence isotonique ou légèrement hyperosmolaire, pour éviter toute contraction excessive des GB qui gênerait leur différenciation.
Pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention, le ou les sels d'ammonium quaternaire répondent avantageusement aux caractéristiques suivantes, considérées seules ou en combinaison :
Le ou les sels d'ammonium quaternaire sont choisis parmi les composés de formule (I) NR1R2R3R4+ X", dans laquelle
R1 représente une chaîne hydrocarbonée ayant de 1 à 18 atomes de carbone,
R2, R3 et R4 représente chacun, indépendamment, un groupe alkyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone, et
X représente un halogène ou un groupe choisi parmi OH, CH3SO4 et PO4. R1 peut représenter une chaîne hydrocarbonée ayant de 10 à 18 atomes de carbone et alors le ou lesdits sels sont de préférence choisis parmi les sels de dodécyltriméthylammonium, de myristyltriméthyl ammonium, de palmityltriméthyl ammonium et de stéaryltriméthylammonium.
R1 peut aussi représenter une chaîne hydrocarbonée ayant de 1 à 6 atomes de carbone, et le ou lesdits sels sont de préférence choisis parmi les sels de tétraéthyl ammonium.
Bien entendu, selon l'invention, ledit milieu peut comprendre plusieurs sels d'ammonium quaternaire, en particulier plusieurs sels de formule (I), et par exemple un ou des sels de formule (I) où R1 est une chaîne en C10-C18 et/ou un ou des sels de formule (I) où R1 est une chaîne en C1-C6.
Des sels particulièrement adaptés sont choisis parmi le bromure de myristyltriméthyl ammonium, le chlorure de dodécyltriméthyl ammonium et l'hydroxyde de tétraéthylammonium, employés seuls ou en mélange.
Par rapport au poids du milieu, la proportion du ou des sels d'ammonium quaternaire varie de 2 à 4% en poids.
Comme dit précédemment, le milieu comprend un ou des agents conservateurs. Cet ou ces agents contribuent à une optimisation de chacune des étapes dudit procédé, mais tout particulièrement à celle de la différenciation des GB. Cet ou ces agents sont notamment des agents bactériostatiques de préférence choisis parmi le diméthylurée et le 2- pyridinethiol-1 -oxyde de sodium. Le milieu peut en outre contenir d'autres ingrédients : un agent stabilisateur, par exemple l'acide éthylène diamine tétra acétique (EDTA), au moins un tensioactif non ionique, tel que le Triton®. Les ingrédients ci-dessus ne sont pas indispensables à la mise en œuvre du procédé, ils vont en permettre l'optimisation.
Le taux d'hémoglobine peut être mesuré par les techniques classiques de spectrophotométrie. Le dénombrement des GB est effectué par une méthode elle aussi classique basée par exemple sur le principe d'impédance qui, selon le procédé de l'invention, permet aussi de différencier les GB en au moins les trois sous-populations suivantes : les lymphocytes, les cellules monocytaires (autres que les lymphocytes) et les granulocytes.
Selon une variante du procédé de l'invention, le milieu contient au moins un sel d'ammonium quaternaire de formule (I) dans laquelle R1 représente une chaîne hydrocarbonée de 12 atomes de carbone et un autre sel d'ammonium quaternaire de formule (I) dans laquelle R1 représente une chaîne hydrocarbonée de 14 atomes de carbone. Dans ces conditions, et associées à une méthode biparamétrique d'impédance et de mesure laser aux grands angles, elle aussi classique, on peut différencier au moins les quatre sous-populations suivantes : les lymphocytes, les monocytes, les granulocytes éosinophiles et les granulocytes neutrophiles.
Le milieu peut aussi comprendre jusqu'à trois sels d'ammonium quaternaire, voire plus.
Selon une mise en œuvre préférée du procédé, l'échantillon sanguin est dilué en milieu légèrement hyperosmolaire et tamponné à pH neutre. Un pH supérieur à 10 provoque une lyse partielle des GB empêchant leur comptage différentiel.
L'invention concerne aussi un milieu pour la détermination du taux d'hémoglobine et pour le dénombrement et la différentiation des globules blancs, ledit milieu étant exempt d'ions cyanure, et comprenant au moins un sel d'ammonium quaternaire et un agent conservateur, ledit milieu étant dépourvu de tout autre agent ligand que le ou lesdits sels. Ainsi, le milieu selon l'invention comprend un agent de lyse qui consiste en un ou des sels d'ammonium quaternaire, ce ou ces derniers constituant le ou les seuls agents ligands se fixant à Thème de l'hémoglobine. Ce ou ces sels sont avantageusement choisi parmi les composés de formule I1 NR1 R2R3R4+ X" dans laquelle
R1 représente une chaîne hydrocarbonée ayant de 1 à 18 atomes de carbone R2, R3 et R4 représente chacun, indépendamment, un groupe alkyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone, et
X représente un halogène ou un groupe choisi parmi OH, CH3SO4 et PO4,.
Ce milieu est avantageusement celui décrit précédemment et en présente les mêmes caractéristiques, considérées seules ou en combinaison.
Un milieu préféré comprend les sels d'ammonium quaternaire suivants : le bromure de myristyltriméthyl ammonium, le chlorure de dodécyltriméthyl ammonium, l'hydroxyde de tétraéthylammonium. Avantageusement, la proportion du bromure de myristyltriméthyl ammonium varie de 20-40 g/L, celle du chlorure de dodécyltriméthyl ammonium de 1-10 g/L et celle de l'hydroxyde de tétraéthylammonium de 1-5 g/L.
Il peut en outre comprendre au moins, à titre d'agent conservateur, un agent bactériostatique de préférence choisi parmi le diméthylurée et le 2- pyridinethiol-1 -oxyde de sodium. La proportion de diméthylurée y varie de 1- 10 g/L et celle du le 2-pyridinethiol-1 -oxyde de sodium de 1-10 g/L.
Il peut encore comprendre un agent stabilisateur, tel que l'acide éthylène diamine tétra acétique (EDTA), dont la proportion varie de préférence de 1-10 g/L
Les objets de l'invention sont exposés plus en détails et illustrés dans les exemples ci-après.
Exemple 1 : formulation d'un milieu selon l'invention Le milieu approprié comprend un diluant et un agent de lyse et de réaction, comme suit : En tant que diluant, une solution aqueuse composée de : un tampon organique phosphate, par exemple hydrogénophosphate de sodium ou phosphate disodique anhydre un stabilisateur des membranes, par exemple chlorure ou sulfate de sodium des agents bactériostatiques, par exemple diméthylurée et
2-pyridinethiol-1 -oxyde de sodium un agent stabilisant par exemple EDTA disodique (EDTA.Na2) et en tant qu'agent de lyse, une solution aqueuse composée de : un mélange de bromure de myristyltriméthyl ammonium, chlorure de dodécyltriméthyl ammonium et hydroxyde de tétraéthylammonium, Triton®, en tant que tensioactif non ionique, chlorure de sodium en tant que stabilisateur des membranes, identique ou différent de celui du diluant, et l'eau désionisée.
Le diluant a une osmolarité comprise entre 320-360 mOsm/Kg à pH neutre et l'agent de lyse a un pH de 10,5 +/- 0.4. Le milieu réactionnel obtenu a un pH proche de 8.
Exemple 2 : mise en œuyre du procédé sur un analyseur dit « 3 populations » Préparation de l'échantillon sanguin :
Environ 16 μl de sang sont prélevés du tube où l'échantillon a été recueilli. L'aiguille est rincée intérieurement et extérieurement avec du diluant, au-dessus de la cuvette de rinçage. Ensuite, 3,5 ml du diluant décrit à l'exemple 1 sont ajoutés pour obtenir une première dilution (1/219). Une seconde dilution est faite avec 31,2μl de cette première dilution et 4ml du diluant (1/128). Les dilutions sont transférées par vide vers les chambres de comptage. Pendant la dilution des GR, 0,41 ml d'agent de lyse est ajouté à la première dilution dans la chambre de comptage des GB. La dilution finale est d'environ 1/244 pour les GB et de 1/28200 pour les GR/Plaquettes. Une fois les transferts effectués, les cuvettes de dilution sont remplies de diluant pour les rincer.
Comptages :
Une séquence de comptage est effectuée comme suit :
180μl de la première dilution sont mesurés volumétriquement pour dénombrer les GB alors que 100μl environ de la seconde dilution sont mesurés pour les GR/Plaquettes.
Le volume de la dilution des GB est contrôlé par deux barrières optiques dans un tube volumétrique. Pendant le comptage volumétrique, les données sont réparties dans 4 tables de 2 secondes chacune pour une utilisation statistique. Le comptage GR/Plaquettes débute avec le comptage des GB et s'arrête exactement après 8 secondes.
Différenciation en trois populations de GB :
Les différentes sous-populations de GB sont différenciées sur des critères de taille en contrôlant les conditions de lyse (diluant, agent de lyse, temps d'action). Quand ces conditions sont réunies, la réaction chimique qui s'effectue permet de distinguer trois populations de GB : les lymphocytes, les granulocytes et les cellules de taille moyenne (basophiles + monocytes + une partie des éosinophiles + de jeunes granulocytes). Après le processus de lyse, les lymphocytes sont les plus petites cellules avec leur petit noyau et corrèlent avec les cellules comprises entre 25 et 90 ± 5 fL (paramétrable) sur l'histogramme de distribution des GB (en mode humain) non représenté.
Les cellules moyennes se trouvent dans la région située entre les lymphocytes et les granulocytes.
Après action de la lyse, elles sont corrélées avec les cellules entre 90 ± 5 et 140 ± 5 fL (modifiable) sur l'histogramme de distribution des GB, non représenté. Certains éosinophiles peuvent cependant dépasser 220 fL.
Les granulocytes neutrophiles, après action de la lyse, sont les plus grosses cellules avec leurs noyaux polysegmentés retenant une partie du cytoplasme. Les neutrophiles sont corrélés avec les cellules entre 140 ± 10 et 449 fL sur l'histogramme de distribution des GB, non représenté.
Hémoglobine
La source lumineuse, une diode électroluminescente (LED) verte (555 nm), permet de calculer l'absorbance qui est proportionnelle à la concentration en hémoglobine de l'échantillon. Le trajet optique est déterminé par deux conduits optiques dans la chambre des GB. La référence Hb est mémorisée pendant la mise en route ou quand la chambre est remplie de diluant.
Exemple 3 : Mise en œuyre du procédé sur un analyseur au moins 4 populations
Préparation de l'échantillon sanguin :
150μL de sang sont prélevés du tube où le sang a été recueilli au préalable. La colonne de sang est aspirée par l'analyseur à travers une vanne céramique où 25+1 μL sont échantillonnés pour former une première dilution au 1/72 environ avec 1800μL de diluant faiblement hypertonique à pH neutre.
Une seconde dilution est faite en cascade avec 25±1 μL et environ 2ml_ de diluant afin de mesure au 1/6000 GR et Plaquettes. 475μL de la prédilution sont repris avec 210μL d'agent de lyse et
1440μL du diluant environ pour obtenir une dilution finale au 1/251. Mesures :
L'hémoglobine est mesurée à 560nm directement dans la cuve de préparation des GB au bout de 15 secondes. Cette dilution GB/Hb au 1/251 est ensuite transférée dans un cytomètre où 267μL sont injectés au travers d'un micro orifice de 75μm et d'un faisceau laser focalisé à proximité, dans une architecture à double flux hydrodynamique. Ce double dispositif de mesure d'impédance électrique et de mesure laser aux grands angles permet de dénombrer les GB et de déterminer au moins 4 sous populations leucocytaires : lymphocytes, monocytes, granulocytes érythrocytaires, granulocytes neutrophiles, mais également la mise en évidence de granulocytes neutrophiles hypogranulés, du plasmodium vivax, le signalement d'agglutinats plaquettaires ou de GR nucléés.
67 μL de la dilution au 1/6000 sont à leur tour transférés et injectés au travers d'un micro orifice de 75μm dans une architecture à double flux hydrodynamique pour le comptage des GR et des plaquettes.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de détermination, dans un échantillon sanguin, du taux d'hémoglobine, de numération et de différenciation des globules blancs, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : On dispose de l'échantillon sanguin dans un milieu isotonique ou hyperosmolaire, à un pH n'excédant pas 10, en l'absence d'ions cyanure et comprenant au moins un sel d'ammonium quaternaire et un agent conservateur,
On détecte le complexe formé entre l'hémoglobine et les groupes d'ammonium quaternaire, par spectrophotométrie, et
On dénombre les globules blancs et on les différencie en au moins trois sous-populations,
Ledit procédé étant réalisé en l'absence de tout autre ligand.
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que le ou les sels d'ammonium quaternaire sont choisis parmi les composés de formule (I)
NR1 R2R3R4+ X" dans laquelle
R1 représente une chaîne hydrocarbonée ayant de 1 à 18 atomes de carbone,
R2, R3 et R4 représente chacun, indépendamment, un groupe alkyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone, et
X représente un halogène ou un groupe choisi parmi OH, CH3SO4 et PO4.
3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que R1 représente une chaîne hydrocarbonée ayant de 10 à 18 atomes de carbone.
4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le ou les sels d'ammonium sont choisis parmi les sels de dodécyltriméthylammonium, de myristyltriméthyl ammonium, de palmityltriméthyl ammonium et de stéaryltriméthylammonium.
5. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que R1 représente une chaîne hydrocarbonée ayant de 1 à 6 atomes de carbone.
6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le ou les sels d'ammonium sont choisis parmi les sels de tétraéthyl ammonium.
7. Procédé selon la revendication 4 ou 6, caractérisé en ce que le ou les sels d'ammonium sont choisis parmi le bromure de myristyltriméthyl ammonium, le chlorure de dodécyltriméthyl ammonium et l'hydroxyde de tétraéthylammonium.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la proportion du ou des sels d'ammonium quaternaire varie de 2 à 4% en poids par rapport au poids du milieu.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l'agent conservateur est un agent bactériostatique, de préférence le diméthylurée.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que ledit milieu contient en outre un agent stabilisateur.
11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'agent stabilisateur est l'acide éthylène diamine tétra acétique (EDTA).
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que ledit milieu contient en outre au moins un tensioactif non ionique.
13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que le tensioactif non ionique est le Triton®.
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce qu'on dénombre les globules blancs par impédance et on différencie les trois sous-populations suivantes : les lymphocytes, les monocytes autres que les lymphocytes et les granulocytes.
15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 14, caractérisé en ce que le milieu contient au moins un sel d'ammonium quaternaire de formule (I) dans laquelle R1 représente une chaîne hydrocarbonée de 12 atomes de carbone et un autre sel d'ammonium quaternaire de formule (I) dans laquelle R1 représente une chaîne hydrocarbonée de 14 atomes de carbone.
16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'on dénombre les globules blancs par une méthode biparamétrique d'impédance et de mesure laser aux grands angles et on différencie les quatre sous- populations suivantes : les lymphocytes, les monocytes, les éosinophiles et les neutrophiles.
17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, caractérisé en ce que le milieu comprend trois sels d'ammonium quaternaire.
18. Milieu pour la détermination du taux d'hémoglobine et pour le dénombrement et la différenciation des globules blancs, ledit milieu étant exempt d'ions cyanure, et comprenant au moins un sel d'ammonium quaternaire choisi parmi les composés de formule I NR1R2R3R4+ X" dans laquelle
R1 représente une chaîne hydrocarbonée ayant de 1 à 18 atomes de carbone
R2, R3 et R4 représente chacun, indépendamment, un groupe alkyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone, et
X représente un halogène ou un groupe choisi parmi OH, CH3SO4 et PO4, et un agent conservateur, ledit agent étant dépourvu de tout autre agent ligand.
19. Milieu selon la revendication 18, caractérisé en ce que le ou les sels d'ammonium sont choisis parmi le bromure de myristyltriméthyl ammonium, le chlorure de dodécyltriméthyl ammonium, l'hydroxyde de tétraéthylammonium.
20. Milieu selon la revendication 19, caractérisé en ce que la concentration du bromure de myristyltriméthyl ammonium varie de 20-40 g/L, celle du chlorure de dodécyltriméthyl ammonium de 1-10 g/L, et celle de l'hydroxyde de tétraéthylammonium de 1-5 g/L.
21. Milieu selon l'une quelconque des revendications 18 à 20, caractérisé en ce que l'agent conservateur est un agent bactériostatique, de préférence choisi parmi le diméthylurée et le 2-pyridinethiol-1 -oxyde de sodium.
22. Milieu selon la revendication 21 , caractérisé en ce que la concentration de diméthylurée varie de 1-10 g/L, et celle du 2-pyridinethiol-1- oxyde de sodium de 1-10 g/L.
23. Milieu selon l'une quelconque des revendications 18 à 22, caractérisé en ce qu'il contient en outre un agent stabilisateur.
24. Milieu selon la revendication 23, caractérisé en ce que l'agent stabilisateur est l'acide éthylène diamine tétra acétique (EDTA).
25. Milieu selon la revendication 24, caractérisé en ce que la concentration de l'EDTA varie de 1 à 10 g/L.
26. Milieu selon l'une quelconque des revendications 18 à 25, caractérisé en ce qu'il contient un sel d'ammonium quaternaire de formule (I) dans laquelle R1 représente une chaîne hydrocarbonée de 12 atomes de carbone et un autre sel d'ammonium quaternaire de formule (I) dans laquelle
R1 représente une chaîne hydrocarbonée de 14 atomes de carbone.
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