WO2009150022A2 - Enzymatische synthese von sphingolipiden - Google Patents

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WO2009150022A2
WO2009150022A2 PCT/EP2009/056206 EP2009056206W WO2009150022A2 WO 2009150022 A2 WO2009150022 A2 WO 2009150022A2 EP 2009056206 W EP2009056206 W EP 2009056206W WO 2009150022 A2 WO2009150022 A2 WO 2009150022A2
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WO
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reaction
lysosphingolipid
acid
biocatalyst
phytosphingosine
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PCT/EP2009/056206
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Frank Hollmann
Oliver Thum
Christoph TÖLLE
Angelo Provinzano
Cornelis Gerrit Nijs Korevaar
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Evonik Goldschmidt Gmbh
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/68—Sphingolipids, e.g. ceramides, cerebrosides, gangliosides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals

Definitions

  • the invention relates to the enzymatic synthesis of sphingolipids and compositions containing sphingolipids from lysosphingolipids and carboxylic acid esters, as well as cosmetic, dermatological or pharmaceutical formulations containing these sphingolipids or compositions.
  • the invention relates to a process for the biocatalytic production of sphingolipids of the general formula I.
  • R 1 , R 2 , R 3 and X are as defined below.
  • the sphingolipids are used as cosmetically and / or dermatologically active components.
  • ceramides for example: Farwick, M. et al., Int. J. Cosm. Sci., 2007, 29 (4), 319-329 or Klee, SK et al. Basic Clinic, Dermatol., 2007, 40, 155-165).
  • the phytosphingosine is of fermentative origin.
  • the activated carboxylic acid is typically the carboxylic acid chloride, either used as such or prepared in situ from the carboxylic acid.
  • US6420604 (Cosmoferm, NL) describes the synthesis of some ceramides by reaction of the sphingosine base with corresponding carboxylic acid halides.
  • the disadvantage of this method is the necessity of using toxic organochlorine compounds and the high salt load in the final product.
  • the object of the present invention was therefore to provide an alternative, gentle and industrially applicable access to ceramides in which at least one of the disadvantages of the prior art can be overcome.
  • Amidation reactions are also biocatalytically, ie using an enzyme as a catalyst, accessible.
  • Preferred biocatalysts for the synthesis of carboxylic acid derivatives are hydrolases (EC 3.1.xx), in particular lipases (triacylglycerol ester hydrolases, EC 3.1.1.3) and esterases (EC 3.1.1.1).
  • lipases preferentially catalyze hydrolytic cleavage of esters. But also the condential formation of esters is often described in literature.
  • amines as nucleophiles in lipase-catalyzed condensation reactions also includes literature examples.
  • Xia et al., J MoI Catal B, 2004, 31, 11-11, 115 describes the synthesis of N-lauroyl-.beta.-aminoproprio- nitrile by amidation of methyl laurate with a reactive, primary amine catalyzed by a lipase from Candida antarctica (CALB).
  • a disadvantage of the described method in addition to the restriction to dilute substrate solutions (less than 50 mM), is the comparatively low conversion of only up to 94.3% conversion. In addition, no regio- or chemo-selectivity is necessary in the reaction shown.
  • selectivities may be absolutely necessary in the reaction according to the invention, since several reactive functionalities may be present in a starting-material molecule such as, for example, phytosphingosine.
  • a starting-material molecule such as, for example, phytosphingosine.
  • the problem of this selectivity is shown for example in P. Tufvesson et al. : Biotechnol. Bioeng. , 2007, 97 (3), 447-453: In the CALB-catalyzed reaction of ethanolamine with carboxylic acids, no simple selective amidation was possible, bypassing enzyme-catalyzed esterification. Only with repeated metered addition of a starting material and distillative removal of the water of reaction was it possible to enrich the desired amide.
  • WO94 / 26919 (Gis t-Brocades, NL) describes the enzymatic N-acylation of phytosphingosine by means of carboxylic acid esters and using bacterial lipases or mammalian polypeptides.
  • bacterial lipases and mammalian lipases are preferably used; in particular a lipase from Pseudomonas alcaligenes.
  • the disadvantage of this process is, in particular, the need for high amounts of biocatalyst (30-95% w / w) to achieve only modest conversions (up to 78%).
  • significant amounts of undesired N, O-diacylation products (up to 17%) were found.
  • the object of the present invention was therefore to provide a method which does not have one or more disadvantages of the prior art methods.
  • a method should be developed with which readily available lysosphingolipids can be used as starting materials and, moreover, in high concentrations.
  • the process according to the invention or the biocatalyst used according to the invention has the advantage that amidation reactions can be carried out economically meaningfully, since either relatively low enzyme concentrations must be used, for example less than 10% by weight, based on the educts used, and / or Biocatalyst multiple times, for example, at least 10 times, can be used again.
  • a further advantage of the process according to the invention is that products of high purity, for example having an active content of> 90% and a proportion of N, O-diacetylation products of less than 5%, can be prepared without complicated work-up reactions, such as chromatography or fractionated crystallization ,
  • a particular advantage of the process according to the invention is that carboxylic acid components which are readily available are carboxylic acid alkyl esters, for example methyl esters, which do not cause any undesirable side reactions.
  • the present invention therefore provides a process for the biocatalytic production of sphingolipids of the general formula I.
  • R 3 represents a branched or unbranched alkyl radical having 1 to 12 C atoms, which may be substituted by at least one radical -OR 4 ,
  • R 4 independently of one another are identical or different radicals selected from the group comprising
  • biocatalyst which comprises at least one carboxyl ester hydrolase of the enzyme class E.C.1.1.1 selected from the group
  • Carboxyl ester hydrolases of the enzyme class EC 3.1.1 which can be isolated from an organism of the kingdom of fungi and carboxyl ester hydrolases of the enzyme class EC 3.1.1, which at the amino acid level at least 60%, preferably at least 80%, preferably at least 90%, particularly preferred at least 95%, 98% or 99% homologous to those isolating themselves from an organism of the kingdom of fungi,
  • amino acid identity which can be determined by known methods.
  • special computer programs are used with algorithms taking into account special requirements. Preferred methods for determining identity initially produce the greatest match between the sequences to be compared.
  • Computer identity determination programs include, but are not limited to, the GCG program package, including
  • GAP Garnier, J. et al., Nucleic Acid Research 12 (1984), page 387, Genetics Computer Group University of Wisconsin, Medicine (Wi), and - BLASTP, BLASTN and FASTA (Altschul, S. et al., Journal of Molecular Biology 215 (1990), pages 403-410
  • the BLAST program can be obtained from the National Center For Biotechnology Information (NCBI) and from other sources (BLAST Handbook, Altschul S. et al., NCBI NLM NIH Bethesda ND 22894; Altschul S. et al., Supra).
  • the percent identity between two amino acid sequences can be determined, for example, by the Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)) algorithm, which is available in the GAP program in the GCG software package (available via http://www.gcg.com), using either a Blossom 62 matrix or a PAM250 matrix, a gap weight of 16, 14, 12, 10, 8, 6, or 4 and a length weight of 1, 2, 3, 4, 5, or 6.
  • Blossom 62 matrix is used using the default settings (gap weight: 12, length weight: 1).
  • a 60% identity according to the above algorithm means 60% homology in the context of the present invention. The same applies to higher identities.
  • the ester of a carboxylic acid having a radical -R 3 of the alcohol R 3 OH in which the carboxylic acid is selected from the group of the naturally occurring fatty acid based on natural vegetable or animal oils, is particularly preferred 6-30 carbon atoms, especially with 8-22 carbon atoms.
  • Natural fatty acids are unbranched and consist of an even number of carbon atoms. Any double bonds have a cis configuration.
  • Examples are: caproic, caprylic, capric, lauric, myristic, palmitic, palmitoleic, isostearic, stearic, 12-hydroxystearic, dihydroxy, oleic, linoleic Linolenic acid, eicosapentaenoic acid, docosahexaenoic acid, arachidonic acid, whose ester products are very particularly preferred.
  • the carboxylic ester of the general formula III is preferably the ester of a carboxylic acid with a radical -R 3 of the alcohol R 3 OH, in which the carboxylic acid is selected from the group of hydroxylated derivatives of a polyunsaturated fatty acid.
  • fatty acids are, for example, 9- or 13-hydroxyoctadecadienoic acid, 15-hydroxyeicosatetraenoic acid and the series of the so-called alpha-hydroxy acids.
  • the carboxylic acid is particularly preferably a polycondensation product of hydroxy-functionalized acids, for example poly-12-hydroxystearic acid or polyricinoleic acid.
  • the carboxylic acid is most preferably a synthetic or naturally occurring carboxylic acid containing aromatic substituents, e.g. Benzoic acid, palmitic acid, ferulic acid, protocatechuric acid, gallic acid, vanillic acid, syringic acid, isoferulaic acid, sinapinic acid, caffeic acid, genitic acid, salicylic acid, salicyluric acid or nicotinic acid.
  • aromatic substituents e.g. Benzoic acid, palmitic acid, ferulic acid, protocatechuric acid, gallic acid, vanillic acid, syringic acid, isoferulaic acid, sinapinic acid, caffeic acid, genitic acid, salicylic acid, salicyluric acid or nicotinic acid.
  • R 3 is preferably an unsubstituted alkyl radical having 1 to 4 C atoms, R 3 is preferably selected from the group comprising methyl,
  • the carboxylic acid ester of general formula III represents a full or partial ester of polyols having at least one acid R 1 COOH.
  • Preferred as full or partial esters of polyols are glycol, glyceryl, 1,2-pentanediyl - 1, 3-pentanediyl, 1, 2-butadiyl, 1, 3-butadi- diyl, 1, 4-butadiyl esters, and their isomers and unsaturated analogs used.
  • the abovementioned educts which determine the radical R 3 by the esterification of R 1 COOH can be in the form of a pure substance or in a mixture, so that, if appropriate, a mixture can be described by the structure of the general formula III.
  • mixtures of sphingolipids of the general formula I can be produced biocatalytically by using mixtures of the general formula III with different R 1 .
  • mixtures of carboxylic acid esters of the general formula III with different R 3 can be used in the process according to the invention.
  • the acid addition products, also called acid addition salts, of the lysosphingolipids can be used, as obtained, for example, in the case of the abovementioned phytosphingosine in the established fermentative processes, as described, for example, in P. Lersch, U. Schick, Spec. Chem. Mag., 2003, 23 (6), 30-31.
  • the acid addition product of the lysosphingolipid is preferably the carboxylic acid carboxylate, sulfate, phosphate, nitrate, carbonate, hydroxide or halide, particularly preferably the chloride and sulfate of the lysosphingolipid.
  • the lysosphingolipid is prepared by deprotonation of the acid addition product of the lysosphingolipid prior to the enzymatic reaction.
  • the lysosphingolipid thus obtained is also referred to below as lysosphingolipid base.
  • the deprotonating treatment may take place in solutions or suspensions of the acid addition product of the lysosphingolipid in common organic solvents.
  • suitable solvents are: paraffinic, monohydric or polyhydric alcohols (for example: methanol, ethanol, isopropanol, propanol, butanol, pentanol, hexanol, cyclohexanol, methylcyclohexanol, 2-butyl-1-octanol and also their isomers, Ethylene glycol, glycerol, diacetone alcohol, isobutanol, etc.), ethers (diethyl ether, tert-butylmethyl ether, tetrahydrofuran, dioxane, polyethoylates, polypropoxylates and mixed polymers, etc.), ketones (acetone, methyl isobutyl ketone, methyl ethyl ketone, etc.
  • paraffinic, monohydric or polyhydric alcohols for example: methanol, ethanol, isopropanol, propanol, butanol
  • Esters triethyl citrate, tributyl citrate, isobutyl isobutyrate, isobutyl acetate, isononyl isononanoate, (2-ethylhexyl) acetate, cyclohexyl acetate, 4-tert-butylcyclohexyl acetate).
  • Preference is given to toxicologically harmless solvents such as methyl isobutyl ketone or 2-methyl-2-butanol.
  • the deprotonation step can be carried out at reaction temperatures where the solvent is in the liquid state. Preferably at reaction temperatures between -8O 0 C and + 15O 0 C, more preferably between 0 0 C and 12O 0 C, most preferably between +25 0 C and 100 0 C.
  • the solution of lysosphingolipid base thus obtained can be used as such for the enzymatic reaction or be filtered beforehand.
  • the solvent of the deprotonation step can be prepared by a method familiar to the person skilled in the art (for example distillative removal or precipitation / crystallization of the lysosphingo).
  • lipid base followed by filtration are removed.
  • the lysosphingolipid base may be isolated prior to enzymatic reaction by, for example, precipitation or crystallization or by distillative removal of the solvent. It is preferred that between the deprotonation of the acid addition product of the lysosphingolipid and biocatalytic preparation, a filtration step takes place in which the salts resulting from the deprotonating treatment are removed.
  • the lysosphingolipid base can be prepared by deprotonation of the acid addition product of the lysosphingolipid during biocatalysis.
  • the activation associated with deprotonation can be carried out by using a base, preferably by means of an organic or inorganic base.
  • Preferred inorganic bases are inorganic hydroxides, carbonates, metal hydrides (such as, for example, lithium aluminum hydride, calcium hydride, sodium hydride and the like), ion exchange materials (such as cationic or anion exchangers), and organic bases such as organometallics (such as butyllithium), alkoxides, amines and their metal salts such as lithium diisopropylamine used.
  • water-binding preferably water-binding inorganic salts, such as Na2SO4 for binding of resulting reaction water when using alkali and / or alkaline earth metal hydroxides as the base.
  • Preference is given to using Na 2 SO 4 .
  • the molar ratio between the acid addition product of the lysosphingolipid and base is in the range between 10: 1 and 0.05: 1, preferably between 3: 1 and 0.2: 1, more preferably between 1.4: 1 and 0, 6 to 1 and most preferably the molar ratio between acid addition product of the lysosphingolipid and base is equimolar.
  • any water present is removed from the deprotonation reaction to produce the lysosphingolipid base.
  • this water removal methods such as physical methods (eg distillation, membrane processes, extraction or adsorption (for example, molecular sieve)) or chemical methods (eg: Reaction with metal hydrides and oxides or other reactants such as anhydrides, esters) are used.
  • physical methods eg distillation, membrane processes, extraction or adsorption (for example, molecular sieve)
  • chemical methods eg: Reaction with metal hydrides and oxides or other reactants such as anhydrides, esters
  • Carboxyl ester hydrolases of the enzyme class EC 3.1.1 which can be isolated from an organism of the fungus kingdom and / or at least 60%, preferably at least 80%, preferably at least 90%, are particularly preferred as biocatalysts in the process according to the invention at least 95%, 98% or 99% homologous to those isolated from an organism of the kingdom of fungi, in which the organism is selected from the genera Aspergillus, Bipolaris, Candida, Fusarium, Geotrichum, Humicola, Microsporum, Mucor, Pichia, Thermomyces, Penicilium, Pichia, Rhizopus, Rhizomucor, Microsporum, Mucor, Nocardia, Saccharomyces, Streptomyces, Thermomyces, Trichosporon, Zygosaccharomyces.
  • Exemplary representatives are, for example: Aspergillus caesiellus, A. candidus, A. carbonarius, A. carneus, A. chevalieri, A. clavatus, A. costaricaensis, A. cretensis, A. deflectus, A. flaviceps, A. flavus, A. flocculatosus, A. fumigatus, A. glaucus, A. ibericus, A. lacticoffeatus, A. lentulus, A. neobridgeri, A. nidulans, A. niger, A. niveus, A. ochracene, A. oryzae, A. parasiticus, A.
  • penicilloides A. piperis, A. pseudoelegans, A. pseudofisheri, A. restrictus, A. roseoglobulus, A. sclerotioniger, A. sojae, A. steynii, A. sydowi, A. terreus, A. udagawae, A. ustus, A. versicolor,
  • Picifera Candida antarctica, C. cylindracea, C. lipolytic tica, C. rugosa, C. utilis, C. robusta, C. kefyr, C. albicans, C. glabrata, C. krusei, C. lusitaniae, C. parapsilosis, C. tropicalis, Fusarium chlamydosporum, F. coeruleum F. dimerum, F. incarnatum, F. moniliforme F. oxysporum, F. proliferatum, F. sacchari, F. semitectum, F. solani, F. sporotrichoides, F. subglutinans, F. tabacinum, F.
  • anomala P. antillensis, P. barkeri, P. besseyi, P. bimundalis, P. bispora, P. bovis, P. cactophila, P. canadensis, P. capsulata, P. caribaea, P. castillae, P. chambardii, P. delftensis, P. deserticola, P. dryadoides, P. euphorbiae, P. euphorbiiphila, P. fabianii, P. faecalis, P. farinosa, P. fermentans, P. finlandica, P. fluxuum, P. galaeiformis, P.
  • carboxyl ester hydrolases used in the process according to the invention are enzymes selected from the group of the lipase from Thermomyces lanuginosus (accession number 059952), lipases A and B (accessionnumber P41365) from Candida antarctica and, the lipase from Mucor miehei (accessionnumber P19515) , the Rhizomucor javanicus lipase (accessionnumber S32492), the Rhizopus lipase oryzae (accessionnumber P61872), the lipases from Candida rugosa (accessionnumber P20261, P32946, P32947, P3294 and P32949), the Rhizopus niveus lipase (accessionnumber P61871), the penicillium camberti faccessionnum ber [2 ⁇ J2V.] lipase, the Lipases from Aspergillus niger (ABG73
  • carboxyl ester hydrolases in the process according to the invention are the commercial products Lipozyme TL IM, Novozym 435, lipozyme IM 20, lipase SP382, lipase SP525, lipase SP523 (all commercial products from Novozymes A / S, Bagsvaerd , Denmark), Chirazyme L2, Chirazyme L5, Chirazyme L8, Chirazme L9 (all commercial products from Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany), and Lipase M “Amano”, lipase F-AP 15 "Amano", lipase AY “Amano”, Lipase N “Amano”, Lipase R “Amano”, Lipase A “Amano”, Lipase D “Amano”, Lipase G “Amano” (all commercial products of the company Amano, Japan).
  • the biocatalyst is preferably used in anhydrous or partially hydrated form. It can be immobilized or used as a lyophilisate.
  • carriers for immobilization inert organic or inorganic carriers can be used.
  • Such inert carriers are preferably used as inert carriers or are present in the enzyme immobilizate which have a particle size distribution in which at least 90% of the particles have a particle size distribution Particle size of 10 to 5000 .mu.m, preferably from 50 .mu.m to 2000 .mu.m.
  • Particularly suitable organic carriers are those which comprise or consist of polyacrylate, polymethacrylate, polyvinylstyrene, styrene-divinylbenzene copolymers, polypropylene, polyethylene, polyethyleneperephthalate, PTFE and / or other polymers.
  • acidic or basic ion exchange resins may be used as support material, for example Duolite A568, Duolite XAD 761, Duolite XAD 1180, Duolite XAD 7HP, Amberlite IR 120, Amberlite IR 400, Amberlite CG 50, Amberlyst 15 (all products from Rohm and Haas) or Lewatit CNP 105 and Lewatit VP OC 1600 (products from Lanxess, Leverkusen, Germany).
  • oxide and / or ceramic supports can be used as inorganic supports.
  • inorganic supports for example, celites, zeolites, silica, controlled pore glass (CPG) or other carriers, as described, for example, in L. Cao, "Carrier-Bound Immobilized Enzymes: Principles, Application and Design", Wiley-VCH: 2005, Weinheim, Germany.
  • the inert carriers present in the enzyme immobilizate or the inert carriers used for the preparation of the enzyme immobilizates consist of polyvinyl styrene, polymethacrylate or polyacrylate.
  • the immobilization on the particles can according to the invention be covalent or noncovalent, preferably noncovalent.
  • the carrier z. B. with an aqueous enzyme solution optionally further ingredients such.
  • inorganic salts or detergents may be incubated or impregnated.
  • This incubation / impregnation can z.
  • At tempera- Tures between 0 0 C and 50 0 C, preferably between 0 0 C and 40 ° C are performed.
  • the incubation / impregnation is carried out over a period of a few minutes to a few hours. The progress of the incubation can be made by determining the concentration of the enzyme in the solution by the common methods for protein determination.
  • the support may preferably be washed with water and, if desired, dried.
  • the biocatalyst can be used in a proportion of the substrates used from 0.01% (w / w) to 300% (w / w).
  • the preferred mass ratio follows from the specific activity of the biocatalyst under the respective reaction conditions (in particular depending on the substrates, their concentration, the solvent and the reaction temperature). Depending on these parameters, preference is given to a biocatalyst amount which allows a full conversion of the reactants within a period of 1 to 96 hours, preferably 8 to 24 hours.
  • the amount of biocatalyst is preferably based on the total mass of starting materials in a range between 1% (w / w) and 100% (w / w) and very particularly preferably between 1% (w / w) and 50% (w / w) in particular between 1% (w / w) and 20% (w / w).
  • the biocatalyst is recovered.
  • the reactants can be present at the beginning of the enzymatic reaction in a molar ratio of lysosphingolipid to carboxylic ester of from 1:10 to 10: 1.
  • molar ratio here refers to the molar ratio of lysosphingolipid amines to acyl donor carboxylate groups. Preference is given to using ratios of between 1: 3 and 3: 1. Particular preference is given to using ratios of between 1: 1.4 and 1.4: 1 , in particular equimolar proportions.
  • the reactants may either be in the molten state without further solubilizers or dissolved or suspended in an organic solvent.
  • the reaction is carried out in the organic solvent.
  • Particularly suitable solvents are those which are capable of dissolving the reactants in high concentrations at temperatures in the range from 2O 0 C to 13O 0 C.
  • ketones such as, for example, methyl isobutyl ketone or cyclohexanone, sterically hindered secondary alcohols such as 2-butyl-1-octanol, methylcyclohexanols, 1-methoxy-2-propanol, 2 have proven to be particularly suitable.
  • the reaction is preferably carried out under anhydrous conditions, defined as the water content of not more than 0.100 M, preferably not more than 0.010 M and particularly preferably not more than 0.005 M, determined according to Karl Fischer.
  • High substrate concentrations are particularly advantageous for the reaction rate.
  • High conversions result in high product concentrations which, surprisingly, do not have a negative effect on the enzyme activity at high conversions. This is surprising for the person skilled in that product inhibition is usually observed in enzymatic reactions.
  • the removal of one of the reaction products (ceramide or alcohol) from the reaction mixture is not necessarily necessary to achieve very high to quantitative conversions. According to the Le Chatelier principle, which is familiar to the person skilled in the art, this would have been expected in the present equilibrium reaction.
  • the prior art reaction conversions (WO94 / 26919, Gist-Brocades) of only 67% to 78% expected this to be necessary.
  • even low substrate concentrations can be efficiently implemented.
  • a reactant concentration at the beginning of the reaction in the range between 0.01 M and 3 M, in particular in the range between 0.2 M and 2 M, is preferred and more preferably in the range between 0.5 M and 1.5 M per reactant.
  • reaction temperature it has been found that, in particular, those temperatures are suitable in which the substrates are homogeneously soluble in the solvent.
  • Advantageously reaction temperatures proved to be in the range of 2O 0 C and 13O 0 C. In particular at high temperatures, take care to careful degassing of the reaction mixture due to color changes.
  • Edinburghaschender- as has been found, however, that arrangements of such at reaction temperatures of 100 0 C and below are not necessary. Therefore reaction temperatures ranging from 40 0 C to 9O 0 C and most preferably are preferred is the range between 70 0 C and 85 0 C.
  • the reaction is preferably carried out under a pressure of less than 1 bar, preferably less than 0.5 bar and more preferably less than 0.05 bar.
  • the reaction can be carried out continuously or semi-continuously in the batch process (stirred tank) or in the fixed bed reactor. Particularly in the batch process, a high inactivation rate of the biocatalyst was to be assumed.
  • a high inactivation rate of the biocatalyst was to be assumed.
  • Such effects are known in the art and adequate remedies are known from the literature. For example, in the case of mechanical wear of the biocatalyst occurring in the stirring process, this can be avoided by using a fixed bed become.
  • Other types of reactors known to those skilled in the art are also useful in preventing mechanical enzyme inactivation.
  • an object of the present invention is a process with the particularly pure N-Acylphytosphingosine already obtained as crude products from the enzymatic reaction.
  • the conversion in relation to the target compound of the formula I is more than 80%, particularly preferably more than 85% and very particularly preferably more than 90 %% of the theoretically expected conversion.
  • the process according to the invention is furthermore suitable for the preparation of a composition containing formula I and from 0.001 to 19% by mass, preferably from 0.005 to 19% by mass, more preferably from 0.01 to 5% by mass, of the corresponding N, O diacetylation product.
  • the sphingolipid prepared by the method according to the invention is likewise part of the invention.
  • Another object of the present invention is a method for isolating the sphingolipid from the reaction mixture. Due to its advantageous physical properties, the sphingolipid can be easily removed by crystallization / precipitation from the reaction solution and thus the already high purity of the crude product can be further increased in a simple manner.
  • Sphingolipids and compositions according to the invention are particularly suitable for the preparation of cosmetic and pharmaceutical formulations. Therefore, cosmetic or pharmaceutical formulations containing at least one inventive sphingolipid and / or a composition according to the invention are also part of the invention.
  • Figure 1 Reaction course of an enzymatic conversion of Phytosphingosi with a 3.4-fold excess of acyl donor.
  • Figure 2 Comparison of the reaction sequences of the enzymatic conversion of phytosphingosine with methylsureate. Triangles: with additional N-stearoylphytosphingosine, squares: without additional N-stearoylphytosphingosine.
  • Figure 3 Recycling of the biocatalyst: the initial activities of the respective cycles are shown in black and the yields are hatched after 24 h.
  • Figure 4 Time-turnover curves of the enzymatic conversion of phytosphingosine with methyl stearate in various solvents.
  • Figure 5 Course of an enzymatic ceramide II synthesis using tristearin as acyl donor.
  • phytosphingosine sulphate (Cosmoferm, Delft, NL) are suspended in 600 g of methanol at 55 0 C, treated with 46 g of sodium methoxide and stirred for 150 minutes at 55 0 C. Then the suspension is filtered hot and the filtrate is concentrated. The light beige solid (78g) is used for further experiments.
  • Table 1 Examination of various yeast or fungal lipases for their suitability as N-acylation catalyst for phytosphingosine.
  • lipase B from Candida antarctica was used.
  • the kinetic parameters of the enzymatic N-acylation were determined as follows: Maintaining the concentration of one reactant, the concentration of the other was varied. The reactions were carried out in dioxane at 8O 0 C, respectively, using the same amount of enzyme. Samples were taken periodically and analyzed by gas chromatography; The respective initial rates were determined from these and analyzed according to Lineweaver-Burk. As a result, a K M value of 400 mM was determined for phytosphingosine and a K M value of 196 mM for methyl stearate.
  • Example 12 Enzymatic conversion of phytosphingosine with various fatty acid esters
  • Table 3 Results of the enzymatic conversion of various acid esters with phytosphingosine.
  • Methyl stearate (734mM) and phytosphingosine (146 mM) were dissolved in 2-methyl-2-butanol at 8O 0 C, treated with 5% w / w of Novozym 435 and stirred at 8O 0 C 20h.
  • the enzyme was then filtered off while hot and the clear starting solution was heated at 45 ° C. overnight.
  • the precipitated solid was filtered off, filtrate and filter residue were analyzed by gas chromatography. As can be seen from Table 4, fractional precipitation allows selective enrichment of the desired product even in the presence of high substrate excesses.
  • Enzymatic reactions were carried out using triglyceride (tristearin) as the acyl donor.
  • tristearin triglyceride
  • Example 15 One-pot synthesis of N-stearoyl phytosphingosine from phytosphingosine sulfate
  • N-stearoyl phytosphingosine purity> 97%) filtered off.
  • 207.8 g of phytosphingosine sulfate are suspended together with 108.04 g of NaOCH 3 -Lsg (25% in methanol) in 500 ml of MIBK at 55 0 C and then hot through a filter press in transferred a fixed bed reactor and mixed with 149.3 g of methyl stea- rat.
  • the fixed bed contains 17.8 g of Novozyme 435.
  • the entire reactor is thermostated at 8O 0 C.
  • the fixed bed is flushed with the reaction mixture at a pumping rate of about 25 ml min -1 , a negative pressure of 0.8 bar is applied to remove excess methanol After 24 h, the reactor is vented with nitrogen, emptied and the reaction solution is transferred over The precipitated solid is filtered off (287.1 g of N-stearoyl phytosphingosine, purity

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Abstract

Gegenstand der Erfindung ist die enzymatische Synthese von Sphingolipiden und Zusammensetzungen enthaltend Sphingolipide aus Lysosphingolipiden und Carbonsäureestern, sowie kosmetische, dermatologische oder pharmazeutische Formulierungen, die diese Sphingolipide oder Zusammensetzungen enthalten.

Description

Enzymatische Synthese von Sphingolipiden
Gebiet der Erfindung
Gegenstand der Erfindung ist die enzymatische Synthese von Sphingolipiden und Zusammensetzungen enthaltend Sphingoli- pide aus Lysosphingolipiden und Carbonsäureestern, sowie kosmetische, dermatologische oder pharmazeutische Formulierungen, die diese Sphingolipide oder Zusammensetzungen enthalten .
Stand der Technik
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biokatalytischen Herstellung von Sphingolipiden der allgemeinen Formel I
Figure imgf000002_0001
Formel I
durch Umsetzung eines Lysosphingolipids der allgemeinen Formel II
Figure imgf000002_0002
Formel II
mit einem Carbonsäureester der allgemeinen Formel III, RV ^O
Y
R3 Formel I I I
wobei R1, R2, R3 und X wie unten definiert.
Die Sphingolipide finden Anwendung als kosmetisch und/oder dermatologisch aktive Komponenten.
Sphingolipide der allgemeinen Formel I mit R2 = H werden Ceramide genannt und sind natürlich in der Haut (Stratum corneum) vorkommende polare Lipide. In den äußeren Hornzel- len (Corneocyten) stellen Ceramide einen Hauptbestandteil
(40-65% des Lipidanteils) der Zellmembranen dar und spielen somit eine zentrale Rolle in deren Schutzfunktion indem sie beispielsweise die Wasserpermeabilität regulieren. Mit zu- nehmendem Alter büßen die Keratinozyten einen Großteil ihrer Ceramidsynthese-aktivität ein wodurch die Haut einen Teil ihrer Schutzwirkung verliert und beispielsweise den epidermalen Wasserverlust nicht mehr vollständig unterbinden kann. Dies kann durch topische Applikation von Cerami- den wenigstens teilweise kompensiert werden (z.B.: Farwick, M. et al., Int. J. Cosm. Sei., 2007, 29(4), 319-329 oder Klee, S. K. et al . Basic Clinic. Dermatol. , 2007, 40, 155- 165) .
Darüber hinaus wurden positive Effekte von Ceramiden bei der Behandlung atopischer Dermatitis berichtet (Kerscher, M. et al., Eur. J. Dermatol., 1991, 1, 39-43; Imokawa, G. et al., J. Soc. Cosmet. Chem. 1989, 40, 500-507) .
In Anbetracht der demographischen Entwicklung in vielen Industrieländern, insbesondere in Deutschland, ist mit einem weiter wachsenden Bedarf an Ceramiden zu rechnen. Nach dem Stand der Technik werden Ceramide durch Schotten-Baumann-analoge N-Acylierung von Lysosphingolipiden der allgemeinen Formel II mit R2 = H wie z.B. Phytosphingosin (allgemeine Formel II mit R2 = H und X = CH2-HCOH) mittels aktivierter Carbonsäurederivate hergestellt.
Typischerweise ist das Phytosphingosin fermentativen Ursprungs .
Bei der aktivierten Carbonsäure handelt es sich typischerweise um das Carbonsäurechlorid welches entweder als solches eingesetzt wird oder in situ aus der Carbonsäure hergestellt wird. In US6420604 (Cosmoferm, NL) wird die Synthese einiger Ceramide durch Reaktion der Sphingosinbase mit entsprechenden Carbonsäurehalogeniden beschrieben. Besonders nachteilig bei dieser Methode ist einerseits die Notwendigkeit des Einsatzes von toxischen Organochlorver- bindungen sowie das Anfallen einer hohen Salzfracht im Endprodukt. Außerdem ist dem Fachmann offensichtlich, dass bei der Verwendung hochreaktiver Carbonsäurehalogenide mit der Bildung signifikante Mengen unerwünschter Nebenprodukte zu rechnen ist.
Alternative Syntheserouten verlaufen über Anhydride. So lehrt beispielsweise WO93/20038 (Gist-Brocades, NL) die basenkatalysierte Synthese gemischter Anhydride aus Carbonsäure und Alkyl-phenylsulfonylchlorid um reaktive Carbonsäurederivate für die N-Acylierung von Phytosphingosin zu erhalten .
Allen diesen Routen ist gemein, dass sie auf der Verwendung reaktiver Carbonsäurederivate beruhen. Nachteilig ist hierbei sowohl die hohe Korrosivität dieser Substanzen als auch ihre Gesundheitsschädlichkeit was spezielle Reaktorsysteme und Vorkehrungen notwendig macht und somit den präparativen Aufwand erhöht. Darüber hinaus muss für die topische Anwendbarkeit der Produkte sichergestellt sein dass sie von den reaktiven und toxischen Edukten und Nebenprodukten befreit sind. Des Weiteren ist mit hohen Salzfrachten zu rechnen sowie mit dem damit verbundenen zusätzlichen Aufwand bei der Produktaufreinigung und Entsorgung. Ein weiterer Nachteil der Verfahren des Standes der Technik ist, dass nur geringe Edukt- und Produktkonzentrationen erhalten werden; so sind in WO93/20038 (Gist-Brocades, NL) maximal 15% (w/v) -Eduktlösungen im toxischen Lösungsmittel Methylenchlorid bei gleichzeitiger Verwendung von reaktiven und toxischen Coreagentien p-Toluolsulfonsäurechlorid und Triethylamin beschrieben. Darüber hinaus ist sind entweder Reinheit der Produkte oder Ausbeuten (jeweils im Bereich um 80%) nicht zufriedenstellend.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war deshalb die Bereit- Stellung eines alternativen, schonenden und industriell anwendbaren Zugangs zu Ceramiden bei dem wenigstens einer der Nachteile des Standes der Technik überwunden werden kann.
Amidierungsreaktionen sind auch biokatalytisch, d.h. unter Verwendung eines Enzyms als Katalysator, zugänglich. Übersichten über industrielle Anwendungen von Enzymen finden sich beispielsweise bei Liese et al (Industrial Biotransformations; Second, Completely Revised Edition, Wiley-VCH, Weinheim, 2006) . Bevorzugte Biokatalysatoren für die Syn- these von Carbonsäurederivaten sind Hydrolasen (E. C. 3.1.x.x) insbesondere Lipasen (Triacylglyceridesterhydrola- sen, E. C. 3.1.1.3) und Esterasen (E. C. 3.1.1.1) . Entsprechend ihrer natürlichen Funktion im Metabolismus einer Zelle katalysieren Lipasen bevorzugt hydrolytische Spaltung von Estern. Aber auch die kondesative Bildung von Estern ist vielfach literaturbeschrieben. Repräsentative Beispiele hierfür finden sich bei Drauz und Waldmann (Enzyme Catalysis in Organic Synthesis, A Comprehensive Handbook; Second, Completely Revised and Enlaged Edition, Vol. II, Wiley-VCH, Weinheim, 2002), bei Aehle (Enzymes in In- dustry, Production and Applications; Second, Completely Re- vised Edition, Wiley-VCH, Weinheim, 2004) oder bei Bornscheuer (Enzymes in Lipid Modification, Wiley-VCH, Weinheim, 2000) .
Auch für die Verwendung von Aminen als Nucleophile in Li- pase-katalysierten Kondensationsreaktionen finden sich Literaturbeispiele .
Y. -M. Xia et al, J MoI Catal B, 2004, 31,111-115 beschreibt beispielsweise die Synthese von N-Lauroyl-ß-aminoproprio- nitril durch Amidierung von Laurinsäuremethylester mit einem reaktiven, primären Amin katalysiert durch eine Lipase aus Candida antarctica (CALB) . Nachteilig bei dem beschriebenen Verfahren ist neben der Beschränkung auf verdünnte Substratlösungen (unter 50 mM) der vergleichweise geringe Umsatz von lediglich bis zu 94,3% Umsatz. Darüber hinaus ist bei der gezeigten Reaktion keinerlei Regio- oder Chemo- selektivität notwendig.
Solche Selektivitäten können allerdings bei der erfindungs- gemäßen Umsetzung zwingend notwendig, da sich in einem Eduktmolekül wie beispielsweise dem Phytosphingosin mehrere reaktive Funktionalitäten befinden können. Die Problematik dieser Selektivität zeigt sich beispielsweise bei P. Tufvesson et al . : Biotechnol .Bioeng. , 2007, 97(3), 447-453: Bei der CALB-katalysierten Umsetzung von Ethanolamin mit Carbonsäuren war keine einfache selektive Amidierung unter Umgehung der enzymkatalysierten Veresterung möglich. Ledig- lieh unter mehrfachem Zudosieren eines Eduktes und destil- lativer Entfernung des Reaktionswassers konnte eine Anreicherung des gewünschten Amids erreicht werden.
In einem weiteren Beispiel für die enzymatische Amidierung beschreiben M. Nechab et al . : JOC, 2007, 72, 6918-6923 die stereoselektive Umsetzung von (R) -konfigurierten sekundären Aminen mittels CALB. Die hohe optische Reinheit (>99% ee) der beobachteten Produkte legt eine starke Präferenz der CALB für (R) -konfigurierte Amine nahe, wodurch die Umset- zung von beispielsweise Phytosphingosin aufgrund seiner S- Konfiguration am Amin-Kohlenstoffatom mit diesem Katalysator fraglich ist. Des Weiteren wurden wiederum stark verdünnte Subs t rat lösungen (100 mM) bei gleichzeitig hohen Biokatalysatorkonzentrationen (27% w (CALB) /w (Substrate) ) eingesetzt was die industrielle Attraktivität des beschriebenen Verfahrens signifikant einschränkt.
In WO94/26919 (Gis t-Brocades, NL) ist die enzymatische N-Acylierung von Phytosphingosin mittels Carbonsäureestern und unter Verwendung bakterieller Lipasen oder Säugetierli- pasen beschrieben. In dem beschriebenen Verfahren werden bevorzugt bakterielle Lipasen und Säugetierlipasen eingesetzt; insbesondere eine Lipase aus Pseudomonas alcalige- nes . Nachteilig bei diesem Verfahren ist insbesondere die Notwendigkeit hoher Biokatalysatormengen (30—95% w/w) zur Erreichung von nur mäßigen Umsätzen (bis zu 78%) . Darüber hinaus wurden signifikante Mengen an unerwünschten N,O-Di- acylierungsprodukten (bis zu 17%) gefunden. Zusätzlich wur- den lediglich verdünnte Lösungen der Substrate eingesetzt (59 bis 93 mM) was geringe Raum-Zeit-Ausbeuten zur Folge hatte. Ein weiterer Nachteil ist die Beschränkung auf Phy- tosphingosin-Base als Substrat was im Vergleich zur Verwen- düng von Säureadditionsprodukten des Phythosphingosins , beispielsweise Phytosphingosin-Sulfat , eine drastische Erhöhung der Substratkosten mit sich bringt. Ausdrücklich wird außerdem darauf hingewiesen, dass Lipasen aus Hefen und Pilzen als Katalysatoren nicht geeignet sind. Somit scheidet das in WO94/26919 beschriebene Verfahren als ökonomisch sinnvolle Alternative zu den bestehenden chemischen Verfahren aus .
Es besteht daher weiterhin Bedarf an Methoden der enzymati- sehen Amidierung von Lysosphingolipiden welche die Nachteile des Standes der Technik überwinden, um bisher nicht realisierbare biokatalytische Spingolipidsynthese ausgehend von Carbonsäurealkylestern zu ermöglichen.
Beschreibung der Erfindung
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war daher die Bereitstellung eines Verfahrens, das einen oder mehrere Nachteile der Verfahren des Standes der Technik nicht aufweist. Insbesondere sollte ein Verfahren entwickelt werden, mit dem gut verfügbare Lysosphingolipide als Edukte und darüber hinaus in hohen Konzentrationen eingesetzt werden können.
Weitere nicht explizit genannte Aufgaben ergeben sich aus dem Kontext der nachfolgenden Beschreibung, der Beispiele sowie der Ansprüche. Überaschenderweise wurde gefunden, dass entgegen dem Stand der Technik mittels Pilzlipasen die selektive Umsetzung von Carbonsäureestern mit Lysosphingolipiden zu Sphingolipiden hoher Reinheit möglich ist. Darüber hinaus wurde gefunden, dass diese Umsetzung ökonomisch sinnvoll durchführbar ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren bzw. der erfindungsgemäß verwendete Biokatalysator hat den Vorteil, dass Amidie- rungsreaktion ökonomisch sinnvoll durchgeführt werden kön- nen, da entweder relativ niedrige Enzymkonzentrationen eingesetzt werden müssen, beispielsweise unter 10 Gewichts-% bezogen auf die eingesetzten Edukte, und/oder der Biokatalysator mehrfach, zum Beispiel mindestens 10-fach, wieder verwendet werden kann. Ein weiterer Vorteil des erfindungs- gemäßen Verfahrens besteht darin, dass ohne aufwändige Aufarbeitungsreaktionen, wie Chromatographie oder fraltio- nierte Kristallisation Produkte hoher Reinheit, beispielsweise mit einem Aktivgehalt von > 90% und einem Anteil von N, O-Diacetylierungsprodukten von unter 5% darstellbar sind. Ein besondere Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, dass als Carbonsäurekomponenten einfach zugängliche Carbonsäurealkyles ter , beispielsweise Methylester, eingesetzt werden, die keine unerwünschten Nebenreaktionen verursachen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur biokatalytischen Herstellung von Sphingolipiden der allgemeinen Formel I
Figure imgf000009_0001
Formel I durch Umsetzung eines Lysosphingolipids der allgemeinen Formel II
Figure imgf000010_0001
Forme l I I
mit einem Carbonsäureester der allgemeinen Formel III,
Figure imgf000010_0002
Formel III
wobei R1 eine lineare oder verzweigte, gegebenenfalls eine oder mehrere Mehrfachbindungen und/oder aromatische oder heteroaromatische Ringe enthaltende, gegebenenfalls durch Sauerstoffatome oder Ester- oder Amidfunktionalitäten un- terbrochene, gegebenenfalls durch mindestens eine weitere Gruppe ausgewählt aus Alkyl- Hydroxy-, Keto- oder Amingrup- pen substituierte Alkylkette mit 2 bis 55 Kohlenstoffatomen, bevorzugt -CH2-Y-CH3 mit Y = eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung oder eine lineare oder verzweigte, gegebenen- falls eine oder mehrere Mehrfachbindungen und/oder aromatische oder heteroaromatische Ringe enthaltende, gegebenenfalls durch Sauerstoffatome oder Ester- oder Amidfunktiona- litäten unterbrochene, gegebenenfalls durch mindestens eine weitere Gruppe ausgewählt aus Alkyl- Hydroxy-, Keto- oder Amingruppen substituierte Alkylenkette mit 1 bis 53 Kohlenstoffatomen, darstellt,
R2 H, Phosphocholin, Serin, Ethanolamin oder einen Zucker bevorzugt Zucker oder H , besonders bevorzugt H darstellt, X CH=CH, CH2-CH2 oder CH2-HCOH , bevorzugt CH2-HCOH darstellt,
R3 einen verzweigten oder unverzweigten Alkylrest mit 1 bis 12 C-Atomen, der mit mindestens einem Rest -OR4 substituiert sein kann, darstellt,
wobei R4 unabhängig voneinander gleiche oder ungleiche Reste ausgewählt aus der Gruppe umfassend
H und ein Rest -C (O)R1
ist,
dadurch gekennzeichnet, dass ein Biokatalysator eingesetzt wird, der mindestens eine Carboxylester-Hydrolase der Enzymklasse E. C. 3.1.1 ausgewählt aus der Gruppe umfassend
Carboxylester-Hydrolasen der Enzymklasse E. C. 3.1.1, die sich aus einem Organismus des Reiches der Pilze isolieren lassen und Carboxylester-Hydrolasen der Enzymklasse E. C. 3.1.1, die auf Aminosäureebene mindestens 60 %, vorzugsweise mindestens 80 % bevorzugt mindestens 90 %, besonders bevorzugt mindestens 95%, 98% bzw. 99 % homolog zu den sich aus einem Organismus des Reiches der Pilze isolieren lassenden sind,
aufweist . Mit „Homologie auf Aminosäureebene" im Sinne der vorliegenden Erfindung ist nun und sei auch im Folgenden die „Aminosäure-Identität" verstanden, welche mit Hilfe bekannter Verfahren bestimmt werden kann. Generell werden besondere Computerprogramme mit Algorithmen unter Berücksichtigung spezieller Erfordernisse verwendet. Bevorzugte Verfahren zur Bestimmung der Identität erzeugen zunächst die größte Übereinstimmung zwischen den zu vergleichenden Sequenzen. Computer-Programme zur Bestimmung der Identität umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, das GCG- Programmpaket, einschließlich
GAP (Deveroy, J. et al . , Nucleic Acid Research 12 (1984), Seite 387, Genetics Computer Group University of Wisconsin, Medicine (Wi), und - BLASTP, BLASTN und FASTA (Altschul, S. et al . , Journal of Molecular Biology 215 (1990), Seiten 403-410. Das BLAST- Programm kann erhalten werden vom National Center For Bio- technology Information (NCBI) und aus weiteren Quellen (BLAST Handbuch, Altschul S. et al . , NCBI NLM NIH Bethesda ND 22894; Altschul S. et al . , vorstehend) .
Der Fachmann ist sich bewusst, dass verschiedene Computerprogramme für die Kalkulation der Ähnlichkeit bzw. Identität zwischen zwei Nukleotid- oder Aminosäure-Sequenzen zur Verfügung stehen. So kann die prozentuale Identität zwischen zwei Aminosäure-Sequenzen z.B. durch den Needleman und Wunsch (J. Mol. Biol. (48) : 444-453 (1970)) Algorithmus bestimmt werden, der in das GAP Programm im GCG Software- Paket (erhältlich über http://www.gcg.com) integriert wurde, berechnet werden und zwar entweder unter Verwendung einer Blossom 62-Matrix oder einer PAM250-Matrix, einer gap weight von 16, 14, 12, 10, 8, 6, oder 4 und einer length weight von 1, 2, 3, 4, 5, oder 6. Der Fachmann wird aner- kennen, dass die Verwendung unterschiedlicher Parameter zu leicht unterschiedlichen Ergebnissen führen wird, dass aber die prozentuale Identität zwischen zwei Aminosäure-Sequenzen insgesamt nicht signifikant unterschiedlich sein wird. Üblicherweise wird die Blossom 62-Matrix unter Anwendung der Voreinstellungen (gap weight: 12, length weight: 1) genutzt .
Eine Identität von 60 % gemäß dem vorstehenden Algorithmus bedeutet im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung 60 % Homologie. Das gleiche gilt für höhere Identitäten.
Besonders bevorzugt ist in dem erfindungsgemäßen Verfahren der Carbonsäureester der allgemeinen Formel III der Ester einer Carbonsäure mit einem Rest -R3 des Alkohols R3OH, bei dem die Carbonsäure ausgewählt ist aus der Gruppe der natürlich vorkommenden Fettsäure auf Basis natürlicher pflanzlicher oder tierischer Öle mit 6-30 Kohlenstoffato- men, insbesondere mit 8-22 Kohlenstoffatomen . Natürliche Fettsäuren sind unverzweigt und bestehen aus einer geraden Anzahl Kohlenstoffatomen . Eventuelle Doppelbindungen besitzen cis-Konfiguration . Beispiele sind: Capronsäure, Capryl- säure, Caprinsäure, Laurinsäure, Myristinsäure, Palmitin- säure, Palmitoleinsäure, Isostearinsäure, Stearinsäure, 12-Hydroxystearinsäure, Dihydroxys tearinsäure, Ölsäure, Linolsäure, Linolensäure, Petrolesinsäure, Elaidinsäure, Arachinsäure, Behensäure, Erucasäure, Gadoleinsäure, Linolensäure, Eicosapentaensäure, Docosahexaensäure, Arachidon- säure, dessen Esterprodukte ganz besonders bevorzugt sind.
Des Weiteren ist in dem erfindungsgemäßen Verfahren der Carbonsäureester der allgemeinen Formel III bevorzugt der Ester einer Carbonsäure mit einem Rest -R3 des Alkohols R3OH, bei dem die Carbonsäure ausgewählt ist aus der Gruppe der hydroxylierten Derivaten einer mehrfach ungesättigten Fettsäure. Solche Fettsäure sind beispielsweise 9- oder 13- Hydroxyoctadecadiensäure, 15-Hydroxyeicosatetraensäure und die Reihe der sogenannten alpha-Hydroxysäuren . Ebenfalls ist in diesem Zusammenhang die Carbonsäure besonders bevorzugt ein Polykondensationsprodukt von hydroxyfunktionali- sierten Säuren, beispielsweise Poly-12-hydroxystearinsäure oder Polyricinolsäure .
Ebenfalls ist in diesem Zusammenhang die Carbonsäure besonders bevorzugt eine synthetische oder natürlich vorkommende Carbonsäure, die aromatische Substituenten enthält, wie z.B. Benzoesäure, Zimmtsäure, Ferulasäure, Protocatechur- säure, Gallussäure, Vanillinsäure, Syringasäure, Isoferula- säure, Sinapinsäure, Kaffesäure, Genitinsäure, Salicyl- säure, Salicylursäure oder Nikotinsäure.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren ist R3 bevorzugt ein un- substituierter Alkylrest mit 1 bis 4 C-Atomen, bevorzugt ist R3 ausgewählt aus der Gruppe enthaltend Methyl-,
Ethyl-, Vinyl-, Propyl-, Isopropyl-, n-Butyl, sek-Butyl- und tert-Butyl-Reste .
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens stellt der Carbonsäureester der allgemeinen Formel III einen Voll- oder Partialestern von Polyolen mit mindestens einer Säure R1COOH dar. Bevorzugt werden als Voll- oder Partialester von Polyolen Glycol-, Glyceryl-, 1, 2-pentandiyl- 1, 3-pentandiyl-, 1 , 2-Butadiyl-, 1 , 3-Buta- diyl-, 1 , 4-Butadiylester, sowie deren Isomere und ungesättigte Analoga eingesetzt. Die durch die Veresterung von R1COOH den Rest R3 bestimmenden oben genannten Edukte können als Reinsubstanz oder im Gemisch vorliegen, so dass folglich durch die Struktur der allgemeinen Formel III gegebenenfalls ein Gemisch beschrie- ben werden kann.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren können Mischungen von Sphingolipiden der allgemeinen Formel I biokatalytisch hergestellt werden, indem Mischungen der allgemeinen Formel III mit unterschiedlichem R1 eingesetzt werden.
Ebenso können in dem erfindungsgemäßen Verfahren Mischungen von Carbonsäureestern der allgemeinen Formel III mit unterschiedlichem R3 eingesetzt werden.
Erfindungsgemäß können auch die Säureadditionsprodukte, auch Säureadditionsalze genannt, der Lysosphingolipide eingesetzt werden, wie sie beispielsweise im Falle des bereits genannten Phytosphingosins bei den etablierten fermentati- ven Verfahren anfallen, wie beispielsweise beschrieben bei P. Lersch, U. Schick, Spec . Chem. Mag., 2003, 23(6), 30-31. Als Säureadditionsprodukt des Lysosphingolipids wird bevorzugt das Carbonsäurecarboxylat , Sulfat, Phosphat, Nitrat, Carbonat, Hydroxid oder Halogenid, besonderd bevorzugt das Chlorid und Sulfat des Lysosphingolipids eingesetzt.
Bei Verwendung des Säureadditionsproduktes des Lysosphingolipids in erfindungsgemäßem Verfahren ist es bevorzugt, dass das Lysosphingolipid durch Deprotonierung des Säureadditionsprodukts des Lysosphingolipids vor der enzymatischen Umsetzung hergestellt wird.
Das so erhaltene Lysosphingolipid wird im Folgenden auch als Lysosphingolipid-Base bezeichnet. Die deprotonierende Behandlung kann in Lösungen oder Suspensionen des Säureadditionsproduktes des Lysosphingolipids in üblichen organischen Lösungsmitteln stattfinden. Als Lösungsmittel können beispielsweise eingesetzt werden: Paraf- fine, ein- oder mehrwertige Alkohole (z.B.: Methanol, Etha- nol, Isopropanol, Propanol, Butanol, Pentanol, Hexanol, Cyclohexanol, Methylcyclohexanol, 2-Butyl-l-octanol sowie deren Isomere, Ethylenglycol, Glycerol, Diacetonalkohol, Isobutanol, etc.), Ether (Diethylether, tert . -Butylmethyl- ether, Tetrahydrofuran, Dioxan, Polyethoylate, Polypropoxy- late sowie Mischpolymere etc.), Ketone (Azeton, Methyliso- butylketon, Methylethylketon, etc.), Ester (Triethylcitrat, Tributylcitrat . Isobutylisobutyrat , Isobutylacetat . Isono- nylisononanoat, (2-Ethylhexyl ) Acetat , Cyclohexylacetat , 4- tert . -Butylcyclohexylacetat) . Bevorzugt sind toxikologisch unbedenkliche Lösungsmittel wie Methylisobutylketon oder 2- Methyl-2-butanol .
Der Deprotonierungsschritt kann bei Reaktionstemperaturen durchgeführt werden, bei denen das Lösungsmittel sich im flüssigen Zustand befindet. Vorzugsweise bei Reaktionstemperaturen zwischen -8O0C und +15O0C, besonders bevorzugt zwischen O0C und 12O0C, ganz besonders bevorzugt zwischen +250C und 1000C.
Die so erhaltene Lösung von Lysosphingolipid-Base kann als solche für die enzymatische Umsetzung eingesetzt werden oder vorher filtriert werden.
In einer weiteren Ausführung der vorliegenden Erfindung kann das Lösungsmittel des Deprotonierungsschritts nach einer dem Fachmann geläufigen Methode (z.B. destillative Entfernung oder Präzipitation/Kristallisation der Lysosphingo- lipid-Base mit anschließender Filtration) entfernt werden. Optional kann die Lysosphingolipid-Base vor der enzymati- schen Umsetzung beispielsweise durch Präzipitation oder Kristallisation oder durch destillative Entfernung des Lo- sungsmittels isoliert werden. Bevorzugt ist, dass zwischen der Depro tonierung des Säureadditionsprodukts des Ly- sosphingolipids und biokatalytischer Herstellung ein Filtrationsschritt erfolgt, in dem die bei der deprotonierenden Behandlung anfallenden Salze entfernt werden.
Alternativ kann die Lysosphingolipid-Base durch Deprotonie- rung des Säureadditionsprodukts des Lysosphingolipids während der Biokatalyse hergestellt werden.
Die mit einer Aktivierung einhergehende Deprotonierung kann durch Einsatz einer Base erfolgen, bevorzugt mittels einer organischen oder anorganischen Base. Bevorzugt werden als anorganische Basen anorganische Hydroxide, Carbonate, Metallhydride (wie z.B. : Lithiumaluminiumhydrid, Calzium- hydrid, Natriumhydrid und ähnliche), Ionenaustauschermaterialien (wie z.B. KationeN- oder Anionentauscher) sowie als organische Basen Metallorganyle (wie beispielsweise Butyl- lithium) Alkoholate, Amine sowie deren Metallsalze wie beispielsweise Lithiumdiisopropylamin eingesetzt.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass insbesondere solche Basen, bei deren Reaktion mit den Säureadditionssalzen formal kein Wasser entsteht, qualitative besonders hochwertige Lysoshingolipid-Base liefen, welche sich in der enzy- matischen Reaktion besonders leicht umsetzen lässt. Besonders bevorzugt sind daher solche Basen, bei denen kein Reaktionswasser frei wird. Dies sind solche, die nach Proto- nierung kein Wasser frei setzen. Bevorzugt eingesetzt wird als Base ein Alkalimetallalkoholat . Dieses kann beispielsweise in alkoholische Lösung vorliegen. Besonders bevorzugt sind Natrium- und Kaliummethanolat . Diese können ebenfalls als Lösungen in organischen Lösungsmitteln eingesetzt wer- den .
Eine weitere Alternative, Reaktionswasser zu vermeiden, und somit ebenso bevorzugt in erfindungsgemäßem Verfahren ist der Einsatz von wasserbindenden, bevorzugt wasserbindenden anorganische Salzen, wie beispielsweise Na2SO4 zur Bindung von entstehendem Reaktionswasser bei Einsatz von Alkali- und/oder Erdalkalihydroxiden als Base. Bevorzugt wird Na2SO4 eingesetzt.
Erfindungsgemäß liegt in dem Verfahren das molare Verhältnis zwischen Säureadditionsprodukts des Lysosphingolipids und Base im Bereich zwischen 10 zu 1 bis 0,05 zu 1, bevorzugt zwischen 3 zu 1 bis 0,2 zu 1, besonders bevorzugt zwischen 1,4 zu 1 und 0,6 zu 1 und ganz besonders bevorzugt ist das molare Verhältnis zwischen Säureadditionsprodukt des Lysosphingolipids und Base äquimolar.
In einer besonderen Ausführung der vorliegenden Erfindung wird eventuell vorhandenes Wasser aus dem Deprotonierung- sansatz zur Herstellung der Lysosphingolipid-Base entfernt. Beispielsweise werden hierzu Wasserentfernungsverfahren wie physikalischer Methoden (z.B. Destillation, Membranverfahren, Extraktion oder Adsorption (beispielweise an Molekularsieb) ) oder auch chemische Methoden (z.B.: Reaktion mit Metallhydriden und -Oxiden oder anderen Reaktanden wie Anhydriden, Estern) eingesetzt. Wie bereits eingangs erwähnt, ist es vor dem Stand der Technik, wie er in WO94/26919 (Gist-Brocades) beschrieben ist, völlig überraschend, dass Pilzlipasen in erfindungsgemäßem Verfahren als effizienter Biokatalysator eingesetzt werden können.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren werden als Biokatalysator insbesondere Carboxylester-Hydrolasen der Enzymklasse E. C. 3.1.1, die sich aus einem Organismus des Reiches der Pilze isolieren lassen und/oder die auf Aminosäureebene mindestens 60 %, vorzugsweise mindestens 80 % bevorzugt mindestens 90 %, besonders bevorzugt mindestens 95%, 98% bzw. 99 % homolog zu den sich aus einem Organismus des Reiches der Pilze isolieren lassenden sind, bei denen der Or- ganismus ausgewählt ist aus der Gruppe der Gattungen Aspergillus, Bipolaris , Candida, Fusarium, Geotrichum, Humicola , Microsporum, Mucor, Pichia, Thermomyces , Penicilium, Pi- chia, Rhizopus , Rhizomucor, Microsporum, Mucor, Nocardia , Saccharomyces , Streptomyces , Thermomyces, Trichosporon, Zy- gosaccharomyces .
Beispielhafte Vertreter sind z.B.: Aspergillus caesiellus, A. candidus , A. carbonarius , A. carneus , A. chevalieri , A. clavatus , A. costaricaensis , A. cretensis , A. deflectus , A. flaviceps , A. flavus, A. flocculatosus , A. fumigatus , A. glaucus, A. ibericus , A. lacticoffeatus, A. lentulus , A. neobridgeri, A. nidulans , A. niger, A. niveus, A. ochra- ceus , A. oryzae, A. parasiticus , A. penicilloides , A. pipe- ris, A. pseudoelegans , A. pseudofisheri , A. restrictus , A. roseoglobulus , A. sclerotioniger, A. sojae, A. steynii, A. sydowi, A. terreus, A. udagawae, A. ustus , A. versicolor,
A. westerdijkiae, Bipolaris australiensis , B .hawaiiensis ,
B. picifera, Candida antarctica, C. cylindracea, C. lipoly- tica, C. rugosa, C. utilis , C. robusta, C. kefyr, C. albicans, C. glabrata, C. krusei , C. lusitaniae, C. parapsilo- sis, C. tropicalis , Fusarium chlamydosporum, F. coeruleum, F. dimerum, F. incarnatum, F. moniliforme F. oxysporum, F. proliferatum, F. sacchari , F. semitectum, F. solani, F. sporotrichoides , F. sub glutinans , F. tabacinum, F. verti- cillioides , Geotrichum candidum, G.klebahnii , Humicola fus- coatra var . Fuscoatra, H.a grisea var. Grisea, H. grisea var . Thermoidea , H. insolens , Microsporum amazonicum, M. audouinii , M. audouinii var. Langeronii , M. audouinii var. Rivalierii , M. boullardii , M. canis , M. canis var. distor- tum, M. cookei, M. equinum, M. ferrugineum, M. fulvum, M. gallinae, M. gypseum, M. nanum, M. persicolor, M. praecox, M. racemosum, M. vanbreuseghemii Mucor javanicus , M. pusil- lus , M. plumbeus , M. racemosus , M. hiemalis , Nocardia aste- roides, N. brasiliensis , N. otitidiscaviarum, Penicillium aurantiogriseum, P. brevicompactum, P. chrysogenum, P. ca- memberti , P. digitatum, P. citrinum, P. commune, P. cory- lophilum, P. crustosum, P. cyclopium, P. expansum, P. funi- culosum, P. glabrum, P. glaucum, P. griseofulvum, P. itali- cum, P. marneffei, P. nalgiovense, P. nordicum, P. notatum, P. palitans , P. purpurrescens , P. purpurogenum, P. olsonii, P. oryzae, P. roqueforti , P. variabile, P. viridicatum, P. verrucosum, Pichia acaciae, P. amylophilia, P. ciferrii, P. pastoris , P. alni, P. americana , P. amethionina , P. an- gophorae, P. angusta, P. anomala, P. antillensis , P. bar- keri , P. besseyi, P. bimundalis , P. bispora, P. bovis , P. cactophila, P. canadensis , P. capsulata, P. caribaea, P. castillae, P. chambardii , P. delftensis, P. deserticola, P. dryadoides , P. euphorbiae, P. euphorbiiphila , P. fabianii , P. faecalis , P. farinosa , P. fermentans , P. finlandica , P. fluxuum, P. galaeiformis , P. glucozyma, P. guilliermondii , P. hampshirensis , P. haplophila , P. heedii, P. heimii, P. henricii , P. holstii, P. inositovora, P. jadinii, P. japo- nica, P. kluyveri , P. kodamae, P. lynferdii , P. maganishii , P. media, P. membranifaciens , P. methanolica , P. methylivo- ria, P. mexicana , P. meyerae, P. minuta , P. mississippien- sis, P. nakasei, P. nakazawae, P. norvegensis , P. oezlemii , P. ofunaensis , P. ohmeri, P. onychis , P. opuntiae, P. pe- tersonii , P. philodendri , P. philogaea , P. pijperi , P. pini, P. populi, P. pseudocactophila , P. quercuum, P. ra- baulensis , P. rhodanensis , P. salicaria , P. scolyti, P. se- gobiensis , P. silvicola, P. spartinae, P. stipitis , P. strasburgensis , P. subpelliculosa , P. sydowiorum, P. tanni- cola, P. thermotolerans , P. toletana, P. trehalophila, P. triangularis , P. veronae, P. wickerhamii , P. xylosa, Ther- momyces lanuginosa , Rhizopus arrhizus , R. delemar, R. ni- veus , R. oryzae, R. azygosporus , R. microsporus , R. schip- perae, R. stolonifer, Rhizomucor miehei, Saccharomyces barnettii , S. bayanus , S. castellii , S. cerevisiae, S. daire- nensis, S. exiguus , S. paradoxus , S. pastorianus , S. rosi- nii, S. servazii , S. spencoerorum, S. transvaalensis , S. unisporus , S. bailii, Streptomyces spp . , Trichosporon asa- hii, T. asteroides , T. beigelii , T. coremiiforme, T. cuta- neum, T. faecale, T. gracile, T. inkin, T. mucoides , T. ovoides, T. pullulans , Zygosaccharomyces bisporus , Z. cidri, Z. fermantati , Z. florentinus , Z. mellis, Z. micro- ellipsoides , Z. mrakii, Z. rouxii.
Besonders bevorzugt eingesetzte Carboxylester-Hydrolasen in erfindungsgemäßem Verfahren sind Enzyme ausgewählt aus der Gruppe der Lipase aus Thermomyces lanuginosus (accession- number 059952), die Lipasen A und B (accessionnumber P41365) aus Candida antarctica und, die Lipase aus Mucor miehei (accessionnumber P19515) , die Lipase aus Rhizomucor javanicus (accessionnumber S32492), die Lipase aus Rhizopus oryzae (accessionnumber P61872), die Lipasen aus Candida rugosa (accessionnumber P20261, P32946, P32947, P3294 und P32949), die Lipase aus Rhizopus niveus (accessionnumber P61871), die Lipase aus Penicillium camberti faccessionnum- ber ?2ΓJ2V.) , die Lipasen aus Aspergillus niger (ABG73613, ABG73614 und ABG37906) und die Lipase aus Penicillium cyc- lopium (accessionnumber P61869), so wie jeweils deren auf Ammosaureebene mindestens 60 %, vorzugsweise mindestens 80 % bevorzugt mindestens 90 %, besonders bevorzugt mindestens 95%, 98% bzw. 99 % homologen. Bezüglich Homologie sei auf oben genannte Definition verwiesen.
Kommerzielle Beispiele und ebenfalls bevorzugt eingesetzte Carboxylester-Hydrolasen in er f mdungsgemaßem Verfahren sind die Handelsprodukte Lipozyme TL IM, Novozym 435, Lipo- zyme IM 20, Lipase SP382, Lipase SP525, Lipase SP523, (alles Handelsprodukte der Firma Novozymes A/S, Bagsvaerd, Danemark), Chirazyme L2, Chirazyme L5, Chirazyme L8, Chira- zyme L9 (alles Handelprodukte der Firma Roche Molecular Bi- ochemicals, Mannheim, Deutschland), sowie Lipase M „Amano", Lipase F-AP 15 „Amano", Lipase AY „Amano" , Lipase N „Amano", Lipase R „Amano", Lipase A „Amano", Lipase D „Amano", Lipase G „Amano" (alles Handelsprodukte der Firma Amano, Japan) .
Der Biokatalysator wird vorzugsweise in wasserfreier, bzw. teilhydratisierter Form eingesetzt. Er kann immobilisiert oder als Lyophilisat eingesetzt werden. Als Trager zur Immobilisierung können inerte organische oder anorganische Trager verwendet werden. Vorzugsweise werden als inerte Trager solche partikularen Trager verwendet bzw. sind im Enzymimmobilisat vorhanden, die eine Teilchengroßenvertei- lung aufweisen, bei der mindestens 90% der Teilchen eine Teilchengröße von 10 bis 5000 μm, bevorzugt von 50 μm bis 2000 μm aufweisen. Als organische Träger können insbesondere solche eingesetzt werden, die Polyacrylat, Polymeth- acrylat, Polyvinylstyrol, Styrol-Divinylbenzolcopolymeren, Polypropylen, Polyethylen, Polyethylenperepthalat, PTFE und/oder andere Polymere aufweisen oder aus diesen bestehen. Als Trägermaterial können, in Abhängigkeit von dem zu immobilisierenden Enzym, insbesondere saure oder basische Ionenaustauscherharze eingesetzt werden, beispielsweise Du- olite A568, Duolite XAD 761, Duolite XAD 1180, Duolite XAD 7HP, Amberlite IR 120, Amberlite IR 400, Amberlite CG 50, Amberlyst 15 (alles Produkte der Fa. Rohm und Haas) oder Lewatit CNP 105 und Lewatit VP OC 1600 (Produkte der Fa. Lanxess, Leverkusen, Deutschland) . Als anorganische Träger können aus dem Stand der Technik bekannte, oxidische und/oder keramische Träger eingesetzt werden. Insbesondere können als anorganische Träger beispielsweise Celite, Zeo- liten, Silica, Controlled-Pore Glas (CPG) oder andere Träger, wie sie zum Beispiel in L. Cao, „Carrier-bound Immobi- lized Enzymes: Principles, Application and Design", Wiley- VCH: 2005, Weinheim, Deutschland, beschrieben sind, eingesetzt werden. Besonders bevorzugt bestehen die im Enzymim- mobilisat vorhandenen inerten Träger bzw. die zur Herstellung der Enzymimmobilisate verwendeten inerten Träger aus Polyvinylstyrol, Polymethacrylat oder Polyacrylat.
Die Immobilisierung auf den Partikeln kann erfindungsgemäß kovalent oder nichtkovalent, bevorzugt nichtkovalent erfolgen. Für die nichtkovalente Immobilisierung kann der Träger z. B. mit einer wässrigen Enzymlösung, die gegebenenfalls weitere Bestandteile, wie z. B. anorganische Salze oder De- tergenzien, enthalten kann, inkubiert bzw. imprägniert werden. Diese Inkubation/Imprägnierung kann z. B. bei Tempera- turen zwischen 0 0C und 50 0C, bevorzugt zwischen 0 0C und 40 °C durchgeführt werden. Vorzugsweise erfolgt die Inkubation/Imprägnierung über einen Zeitraum von wenigen Minuten bis zu einigen Stunden. Der Fortschritt der Inkubation kann durch Bestimmung der Konzentration des Enzyms in der Lösung mit den gängigen Verfahren zur Proteinbestimmung erfolgen. Nach Erreichen des gewünschten Immobilisierungsgrads kann der Träger vorzugsweise mit Wasser gewaschen und, wenn gewünscht, getrocknet werden.
Möglich ist auch die Verwendung ganzer Zellen, die einen geeigneten Biokatalysator enthalten, entweder als resting cells oder in getrockneter Form, vorzugsweise nach einer Methode des Standes der Technik permeabilisiert .
Erfindungsgemäß kann der Biokatalysator in einem Mengenverhältnis zu den eingesetzten Substraten von 0,01% (w/w) bis 300% (w/w) verwendet werden. Das bevorzugte Massenverhältnis folgt aus der spezifischen Aktivität des Biokatalysators unter den jeweiligen Reaktionsbedingungen (insbesondere in Abhängigkeit der Substrate, deren Konzentration, des Lösungsmittels und der Reaktionstemperatur) . In Abhängigkeit dieser Parameter wird eine Biokatalysatormenge bevorzugt, die einen Vollumsatz der Reaktanden innerhalb eines Zeit- raumes von 1 bis 96 Stunden, vorzugsweise von 8 bis 24 Stunden ermöglicht. Bevorzugt wird die Biokatalysatormenge bezogen auf die Gesamtmasse an Edukten in einem Bereich zwischen 1% (w/w) und 100% (w/w) und ganz besonders bevorzugt zwischen 1% (w/w) und 50% (w/w) insbesondere zwischen 1% (w/w) und 20% (w/w) eingesetzt.
In einer besonderen Ausführungsform wird der Biokatalysator zurückgewonnen . Erfindungsgemäß können die Reaktanden zu Beginn der enzyma- tischen Umsetzung in einem molaren Verhältnis von Ly- sosphingolipid zu Carbonsäureester von 1:10 bis 10:1 vorliegen. Der Term „molare Verhältnis" bezieht sich hierbei auf das molare Verhältnis von Lysosphingolipid-Aminen zu Acyldonorcarboxylatgruppen . Bevorzugt werden Mengenverhältnisse zwischen 1:3 und 3:1 eingesetzt. Besonders bevorzugt werden Mengenverhältnisse zwischen 1:1,4 und 1,4:1 eingesetzt, insbesondere äquimolare Mengenverhältnisse.
Die Reaktanden können entweder im geschmolzenen Zustand ohne weitere Lösungsvermittler vorliegen oder in einem organischen Lösungsmittel gelöst oder suspendiert sein. Bevorzugt wird die Reaktion im organischen Lösungsmittel durchgeführt. Als Lösungsmittel eignen sich besonders diese die die Reaktanden bei Temperaturen im Bereich 2O0C bis 13O0C in hohen Konzentrationen zu lösen vermögen. Als besonders geeignet erwiesen sich beispielsweise, ohne eine Beschränkung auf diese Lösungsmittel, Ketone wie beispiels- weise Methylisobutylketon oder Cylclohexanon, sterisch gehinderte sekundäre Alkohole wie 2-Butyl-l-Oktanol, Methyl- cyclohexanole, l-Methoxy-2-propanol, 2 , 3-Butandiol 2-Okta- nol, Diacetonalkohol, 2-Methyl-2-butanol, sterisch gehinderte Ester wie 4-tert-Butylcyclohexylacetat, (2-Ethylhe- xyl) acetat, Cyclohexylace tat und Ether wie 1,4-Dioxan, Tetrahydrofuran und Varonic APM (Evonik Goldschmidt GmbH, Essen, Deutschland) . Als ungeeignet erwiesen sich solche Lösungsmittel, insbesondere Ester, die mit signifikanter Aktivität vom Biokatalysator umgesetzt werden. Bei der Re- aktion mit Phytosphingosin als Edukt und Verwendung von Buttersäureethylester konnten beispielsweise neben dem gewünschten Produkt signifikante Mengen an N-Butyrolyphytosphingosin und Umesterungsprodukt mit dem eingesetzten Acyldonor (z.B. Methylstearat ) nachgewiesen werden. Dasselbe gilt für die Verwendung von Essigsäurebu- tylester (Bildung von N-Acetylphytosphingosin und Acyldo- norbutylester) .
Bevorzugt wird die Reaktion unter wasserfreien Bedingungen, definiert als Wassergehalt von maximal 0,100 M, bevorzugt maximal 0,010 M und besonders bevorzugt unter maximal 0,005 M, nachgewiesen nach Karl Fischer, durchgeführt.
Hohe Substratkonzentrationen sind besonders vorteilhaft für die Reaktionsgeschwindigkeit. Bei hohen Umsätzen resultieren daraus hohe Produktkonzentrationen die sich überraschenderweise aber nicht negativ auf die Enzymaktivität bei hohen Umsätzen auswirken. Dies ist für den Fachmann insofern überraschend als dass Produktinhibition bei enzymati- schen Reaktionen üblicherweise beobachtet wird. Darüber hinaus wurde überraschenderweise gefunden, dass die Entfernung eines der Reaktionsprodukte (Ceramid oder Alkohol) aus der Reaktionsmischung nicht zwingend zur Erreichung sehr hoher bis quantitativer Umsätze notwendig ist. Nach dem, dem Fachmann geläufigen, Prinzip von Le Chatelier wäre dies bei der vorliegenden Gleichgewichtsreaktion zu erwarten gewesen. Darüber ließen die Reaktionsumsätze des Standes der Technik (WO94/26919, Gist-Brocades ) von lediglich 67% bis 78% diese Notwendigkeit erwarten. Erfindungsgemäß können allerdings auch niedrige Substratkonzentrationen effizient umgesetzt werden.
Bevorzugt im Sinne der Erfindung ist eine Reaktandenkon- zentration zu Beginn der Reaktion im Bereich zwischen 0,01 M und 3 M, insbesondere im Bereich zwischen 0,2 M und 2 M und besonders bevorzugt im Bereich zwischen 0,5 M und 1,5 M je Reaktand liegt.
Bezüglich der Reaktionstemperatur wurde gefunden, dass ins- besondere solche Temperaturen geeignet sind bei denen die Substrate homogen im Lösungsmittel löslich sind. Vorteilhaft erwiesen sich dabei Reaktionstemperaturen im Bereich zwischen 2O0C und 13O0C. Insbesondere bei hohen Temperaturen ist aufgrund von Farbveränderungen auf eine sorgfältige Entgasung der Reaktionsmischung zu achten. Überaschender- weise wurde allerdings gefunden, dass Vorkehrungen solcherart bei Reaktionstemperaturen von 1000C und darunter nicht notwendig sind. Bevorzugt sind daher Reaktionstemperaturen im Bereich von 40 0C bis 9O0C und ganz besonders bevorzugt der Bereich zwischen 70 0C und 85 0C.
Die Reaktion wird bevorzugt unter einem Druck von kleiner 1 bar, bevorzugt kleiner 0,5 bar und besonders bevorzugt kleiner 0,05 bar durchgeführt.
Die Reaktionsführung kann im batch-Verfahren (Rührkessel) oder im Festbettreaktor kontinuierlich oder semi-kontinu- ierlich durchgeführt werden. Insbesondere beim batch-Ver- fahren war von einer hohen Inaktivierungsrate des Biokata- lysators auszugehen. Zu Nennen ist hier die mechanische Zerstörung des Biokatalysators aufgrund des auftretenden mechanischen Stresses durch Rühren, sowie thermische Inak- tivierung des Biokatalysators gepaart mit inaktivierenden Effekten hervorgerufen durch Reaktanden und Lösungsmittel. Solche Effekte sind dem Fachmann bekannt und adäquate Abhilfen sind literaturbekannt. So kann beispielsweise bei auftretender mechanischer Abnutzung des Biokatalysators im Rührverfahren diese durch Einsatz eines Festbetts umgangen werden. Weitere Reaktortypen wie sie dem Fachmann bekannt sind eignen sich ebenfalls zur Verhinderung von mechanischer Enzyminaktivierung.
Weiterhin ist bei der Verwendung von Säureestern als Acyl- donoren mit chemischer Inaktivierung des Biokatalysators durch die freiwerdenden Alkohole zu rechnen (z.B.: Y. Yoshida et al . , J. Biosci. Bioeng., 2006, 102(1), 66-68) . Methoden zur Umgehung solcher Inaktivierungen sind dem Fachmann bekannt und umfassen beispielsweise die destilla- tive Abtrennung des Alkohols aus dem Reaktionsgemisch oder die Anwendung von Membranverfahren. Überraschenderweise wurde allerdings gefunden, dass auch ohne Anwendung der oben beschriebenen Verfahren der Biokatalysator mehrfach und ohne signifikanten Aktivitätsverlust wiederverwendet werden kann.
Allen im Stand der Technik beschriebenen Verfahren ist gemein, dass die erhaltenen Produkte Zusammensetzungen aus Sphingolipid und hohen Anteilen (bis zu 19% des Gesamtproduktes) des korrespondierenden N, O-Diacylierungsproduktes sind. Diese Zusammensetzungen sind allesamt in beispielsweise kosmetischen Komposititionen nicht einsetzbar, da der Anteil an N, O-Diacylierungsprodukt nicht kleiner 5 % ist. Überaschenderweise wurde weiterhin gefunden, dass in dem erfindungsgemäßen Verfahren die Amidierung der sekundären Aminfunktion gegenüber der Veresterung einer der Alkoholfunktionen deutlich bevorzugt ist. Ein gegenteiliges Verhalten insbesondere eine Bevorzugung der primären, also sterisch leicht zugänglichen Alkoholfunktion wäre zu erwarten gewesen. Ähnliches ist im Stand der Technik (WO94/26919, Gist-Brocades ) beschrieben; die dort erhaltenen Reaktionsprodukte enthielten bei Verwendung einer bak- teriellen Lipase und bereits bei einem molaren Überschuss von 60% des Acyldonors über Phytosphingosin, signifikante Anteile an N, O-Diacylierungsprodukt (Mono- zu Diacylie- rungsprodukt > 1:5) .
In dem erfindungsgemäßen Verfahren konnte hingegen gezeigt werden, dass sogar bei einem 3, 6-fachen Überschuss an Acyl- donor über Lysosphingolipid keine signifikante Diacylierung eintritt solange noch Lysosphingolipid im Reaktionsansatz vorhanden ist. Erst ab vollständigem Umsatz von Lysosphingolipid zum Sphingolipid konnte langsame Veresterungsaktivität nachgewiesen werden. Bei stöchiometrischer Verwendung von Lysosphingolipid und Acyldonor wurde die oben beschriebene unerwünschte Nebenreaktion kaum beobachtet.
Somit ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren mit dem besonders reine N-Acylphytosphingosine bereits als Rohprodukte aus der enzymatischen Umsetzung erhalten werden. Vorzugsweise liegt der Umsatz in Bezug auf die Zielverbindung gemäß Formel I bei über 80 %, besonders bevorzugt bei über 85% und ganz besonders bevorzugt bei mehr als 90%% des theoretisch zu erwartenden Umsatzes.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich weiterhin zur Herstellung einer Zusammensetzung enthaltend Formel I und von 0,001 bis 19 Massen-%, bevorzugt 0,005 bis 19 Massen-% besonders bevorzugt 0,01 bis 5 Massen-% des korrespondierenden N, O-Diacetlyierungsproduktes .
Somit sind Zusammensetzungen enthaltend Formel I und von 0,001 bis 19 Massen-%, bevorzugt 0,005 bis 19 Massen-% besonders bevorzugt 0,01 bis 5 Massen-% des korrespondierenden N, O-Diacetlyierungsproduktes, hergestellt mit erfin- dungsgemäßem Verfahren, ebenfalls Bestandteil der Erfindung.
Das Sphingolipid, hergestellt mit dem erfindungsgemäßen Verfahren, ist ebenfalls Bestandteil der Erfindung.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Methode zur Isolierung des Sphingolipids aus der Reaktionsmischung. Aufgrund seiner vorteilhaften physikalischen Ei- genschaften kann das Sphingolipid leicht durch Kristallisation / Präzipitation aus der Reaktionslösung entfernt werden und somit die bereits hohe Reinheit des Rohproduktes auf einfache Weise noch gesteigert werden.
Erfindungsgemäße Sphingolipide und Zusammensetzungen sind besonders geeignet für die Herstellung von kosmetischen und pharmazeutischen Formulierungen. Daher sind kosmetische oder pharmazeutische Formulierungen enthaltend mindestens ein erfindungsgemäßes Sphingolipid und/oder eine erfin- dungsgemäße Zusammensetzung ebenfalls Bestandteil der Erfindung.
In den nachfolgend aufgeführten Beispielen wird die vorliegende Erfindung beispielhaft beschrieben, ohne dass die Er- findung, deren Anwendungsbreite sich aus der gesamten Beschreibung und den Ansprüchen ergibt, auf die in den Beispielen genannten Ausführungsformen beschränkt sein soll.
Folgende Abbildungen sind Bestandteil der Beispiele:
Abbildung 1: Reaktionsverlauf einer enzymatischen Umsetzung von Phytosphingosi mit einem 3,4-fachen Überschuss an Acyl- donor . Abbildung 2: Vergleich der Reaktionsverläufe der enzymati- schen Umsetzung von Phytosphingosine mit Methyls tearat . Dreiecke: mit zusätzlichem N-Stearoylphytosphingosin, Quadrate: ohne zusätzliches N-Stearoylphytosphingosin.
Abbildung 3: Recycling des Biokatakysators : widergegeben sind in schwarz die Anfangsaktivitäten der betreffenden Cyclen und in schraffiert die Ausbeuten nach 24h.
Abbildung 4: Zeit-Umsatz-Kurven der enzymatischen Umsetzung von Phytosphingosin mit Methylstearat in verschiedenen Lösungsmitteln .
Abbildung 5: Verlauf einer enzymatischen Ceramidl II-Syn- these unter Verwendung von Tristearin als Acyldonor.
Beispiele :
Beispiel 1: Deprotonierung von PS-Sulfat
100 g Phytosphingosin-Sulfat (Cosmoferm, Delft, NL) werden in 600 g Methanol bei 550C suspendiert, mit 46 g Natrium- methanolat versetzt und 150 Minuten bei 550C gerührt. Anschließend wird die Suspension heiß filtriert und das FiI- trat eingeengt. Der hell-beige Feststoff (78g) wird für weitere Versuche eingesetzt.
Beispiel 2: Screening kommerzieller Lipasen auf Amidie- rungsreaktivität
In einer äquimolaren Lösung von Phytosphingosin (aus Beispiel 1) und Methylstearat (jeweils IM) in Dioxan (11 mL) werden je 0,35 g (5% w/w) der in Tabelle 1 aufgeführten Pilzlipasen suspendiert und 72h bei 8O0C Lipase geschüttelt. Anschließend wird der Biokatalysator heiß abfiltriert und das Filtrat gaschromatographisch analysiert.
Tabelle 1: Untersuchung verschiedener Hefe- oder Pilzlipasen bezüglich ihrer Eignung als N-Acylierungskatalysator für Phytosphingosin .
Lipase aus % Ceramid % Phytosphingosin % Methylstearat
Rhizomucor
15, 0 10, 9 6, 8 miehei
Thermomyces
7,1 17,3 12, 9 lanuginosa
Candida
3, 6 16, 8 17,7 rugosa
Candida
3,2 14, 6 15,7 cylindracea
Candida antarctica 2,9 20,2 15, 6
(Lipase A)
Candida antarctica 23, 1 5,3 4,4
(Lipase B)
Für weitere Versuche wurde die Lipase B aus Candida antarctica verwendet.
Beispiel 4: Negativkontrolle
Um eine mögliche unkatalysierte Umsetzung von Phytosphingosin mit dem Acyldonor auszuschließen wurde Phytosphingosin 0,2 M in Methylstearat bei 8O0C gelöst und 4 Stunden inku- biert . Die anschließende gaschromatographische Analyse zeigte keinen signifikanten (quantifizierbaren) Umsatz.
Beispiel 5: Reaktionen mit Phytosphingosin-Sulf at
Zur Demonstration der Notwendigkeit der Deprotonierung von Phytosphingosin-Sulf at wurde folgendes Vergleichsexperiment durchgeführt: 8, 18g Phytosphingosin-Sulf at und 6, 72g Me- thylstearat wurden in 15 mL Dioxan bei 8O0C suspendiert und mit 0, 16g Novozym 435 versetzt. Nach 4 Stunden Inkubation unter Rühren wurde die Reaktionsmischung gaschromatogra- phi s ch anal ys iert . Es wurden ledigl ich 31, 7 mM N-Stearoylphytosphingosin gefunden. In einem Vergleichsexperiment unter identischen Bedingungen aber nach Zugabe von 2, 4 g N a t r i u m c a r b o n a t wurden 368 mM N-Stearoyl¬ phytosphingosin gefunden.
Beispiel 6: Regioselektivität der enzymatischen Acylierung
Um einen hohen Überschuss von Acyldonor zu Phytosphingosi zu erreichen, wurden 4,43g Phytosphingosin in 15,09g Me- thylstearat bei 12O0C gelöst. Zu dieser Lösung wurden 0,98g Novozym 435 (5% w/w) zugegeben und unter Normaldruck gerührt. Periodisch wurden Proben entnommen und gaschromato- graphisch analysiert.
Wie aus dem Reaktionsverlauf (Abbildung 1) erkennbar ist, erfolgt eine signifikante Akkumulation des unerwünschten N, O-Distaerylphytosphingosins erst bei vollständigem Umsatz der eingesetzten Phytosphingosin. So ist nach einer Stunde, bei einer Rest-Phytosphingosinkonzentration von 19 mM (Umsatz > 99,5%) noch kein N, O-Diacylierungsprodukt nachweisbar; erst unterhalb einer Phytosphinigosinkonzentration von ca. 5 mM wird Bildung des N, O-Diacylierungsprodukts beobachtet. Darüber hinaus liegt die Reaktionsgeschwindigkeit der Nebenreaktion um einen Faktor von mehr als 25 unter der der erwünschten Reaktion.
Beispiel 7: Versuch zur Produktinhibition
Zum Ausschluss etwaiger Produktinhibition wurden 2 parallele Versuche durchgeführt. Dazu wurden jeweils 1,59g Phy- tosphingosin zusammen mit 7,45g Methylstearat in 25 mL Di- oxan bei 8O0C gelöst und mit je 0,49g Novozyme 435 versetzt. Zu einem der beiden Reaktionsmischungen wurde zusätzlich 1,3 g N-Stearoylphytosphingosin (Cosmoferm, Delft, NL) beigemischt. Wie der Vergleich der beiden Zeit-Umsatz- kurven zeigt (Abbildung 2) sind die Reaktionsverläufe identisch so dass eine ausgeprägte Produktinhibition ausgeschlossen werden kann.
Bespiel 8 : Wiederverwertbarkeit des Biokatalysators
Zur Evaluation der Wiederverwertbarkeit des Biokatalysators wurde eine Versuchsreihe wie folgt durchgeführt: 3,3 g Phy- tosphingosin wurden zusammen mit 14,9 g Methylstearat in 50 mL Dioxan bei 8O0C gelöst und die Reaktion durch Zugabe von 0,98 g Novo435 gestartet. Es werden periodisch Proben entnommen und gaschromatographisch analysiert und daraus Anfangsgeschwindigkeit und Umsatz errechnet. Nach 24h wird der Reaktionsansatz heiß filtriert und das zurückbleibende Enzym dreimal mit jeweils 50ml heißen (5O0C) Dioxan gewa- sehen. Anschließend wird der so recyclisierte Biokatalysator erneut unter gleichen Bedingungen wie oben beschrieben eingesetzt. Dieses Vorgehen wird insgesamt sechsmal wiederholt. Wie aus Abbildung 3 deutlich wird, kann der Biokatalysator wenigstens siebenmal für die Reaktion eingesetzt werden ohne dass ein Aktivitätsrückgang zu beobachten ist.
Beispiel 9: Bestimmung der Kinetischen Parameter des Bioka- takysators
Die kinetischen Parameter der enzymatischen N-Acylierung wurden wie folgt bestimmt: Unter Beibehaltung der Konzent- ration des einen Reaktanden wurde die Konzentration des anderen Variiert. Die Reaktionen wurden in Dioxan bei 8O0C unter Verwendung jeweils der gleichen Enzymmenge durchgeführt. Es wurden periodisch Proben entnommen und gaschroma- tographisch analysiert; daraus wurden die jeweiligen An- fangsraten bestimmt und diese nach Lineweaver-Burk analysiert. Als Resultat wurden für Phytosphingosin ein KM-Wert von 400 mM und für Methylstearat ein KM-Wert von 196 mM bestimmt .
Beispiel 10: Einfluss der Temperatur auf die Reaktionsge- schwindigkeit
Es wurden enzymatische Umsetzungen bei verschiedenen Temperaturen durchgeführt. Allen gemein war dass die Substrate äquimolar eingesetzt wurden. Die eingesetzte Enzymmenge betrug jeweils 1,4% (w/w) . Die Ergebnisse der gaschromatogra- phischen Auswertung der Anfangsgeschwindigkeit sowie des Umsatzes nach 4 Stunden sind in Tabelle 2 widergegeben.
Tabelle 2: Einfluss der Reaktionstemperatur auf die enzyma- tische Synthese von N-Stearoylphytosphingosin .
T [oC] Anfangskonzentration Aspec [Ug- Umsatz nach
[M] / Lösungsmittel 1] 4h [%]
80 0, 98 (in Dioxan) 840 49,5
100 2,8 (kein) 1182 79
120 2,8 (kein) 1224 92
Beispiel 11: Verwendung verschiedener Lösungsmittel
Phytosphingosin und Methylstearat wurden beide IM in dem jeweiligen Lösungsmittel bei 8O0C gelöst, mit 5% (w/w) Novozym 435 versetzt und gerührt. Periodisch wurden Proben entnommen und gaschromatographisch analysiert. Wie aus Abbildung 4 ersichtlich wird, sind die Umsatz-Zeit-Kurven sowie die Umsätze nach 24h der Einzelreaktionen nahezu deckungsgleich.
Beispiel 12: Enzymatische Umsetzung von Phytosphingosin mit verschiedenen Fettsäureestern
Phytosphingosin und die in
Tabelle 3 angegebenen Acyldonoren wurden jeweils IM im Lösungsmittel bei 8O0C gelöst, mit 5% (w/w) Novozym 435 versetzt und gerührt. Periodisch wurden Proben entnommen und gaschromatographisch analysiert
Tabelle 3: Ergebnisse der enzymatischen Umsetzung verschiedener Säureester mit Phytosphingosin .
Substrat Umsatz in % (Reaktionszeit,
Lösungsmittel)
Hexansäureethylester 98,2 (24h, MIBK) Ölsäuremethylester 97,4 (23h, tert-Butanol)
Ricinolsäuremethylester 96,5 (24h, tert-Butanol) o-Salizylsäureethylester 36,5 (24h, MIBK)
Beispiel 13: Selektive Kristallisation des Produkts
Methylstearat (734mM) und Phytosphingosin (146 mM) wurden in 2-Methyl-2-butanol bei 8O0C gelöst, mit 5% w/w Novozym 435 versetzt und 20h bei 8O0C gerührt. Anschließend wurde das Enzym heiß abfiltriert und die klare Ausgangslösung über Nacht bei 450C temperiert. Der ausgefallene Feststoff wurde abfiltriert, Filtrat und Filterrückstand wurden gaschromatographisch analysiert. Wie aus Tabelle 4 ersicht- lieh wird ist durch fraktionierte Präzipitation eine selektive Anreicherung des gewünschten Produktes auch in Gegenwart von hohen Substratüberschüssen möglich.
Tabelle 4: Ergebnisse der selektiven Präzipitation des Reaktionsproduktes aus einer Reaktionsmischung (Angaben: Flächenprozent laut GC) .
Methylstearat Phytosphingosin-Base Cerlll
Ausgangslösung 69,3 0,14 30,5
Filtrat 90,1 0,1 9,8
Präzipitat 5,0 0,08 94,9 Beispiel 14: Tristearin als Acyldonor
Es wurden enzymatische Umsetzungen unter Verwendung von Triglycerid (Tristearin) als Acyldonor durchgeführt. Zu ei- ner Lösung von 5,4 g Phytosphingosin und 5g Tristearin in 17g Dioxan bei 8O0C wurden 0,5g Novozyme 435 zugegeben und bei Normaldruck gerührt. Es wurden periodisch Proben entnommen und gaschromatographisch analysiert.
Wie aus Abbildung 5 deutlich wird, ist ein vollständiger Umsatz des Acyldonors möglich. Überraschenderweise ergab die gaschromatographische Analyse dass intermediär keine Partialglyceride (Glycerindistearat oder Glycerinmonostea- rat) in signifikanten Mengen beobachtbar waren.
Beispiel 15: EintopfSynthese von N-Stearoylphytosphingosin ausgehend von Phytosphingosin-Sulfat
100g Phytosphingosin-Sulfat (Cosmoferm, Delft, NL) werden in 100ml MIBK (Methylisobutylketon) bei 550C suspendiert, mit 46g Natriummethanolat versetzt und 180 Minuten bei 550C gerührt. Anschließend werden 73,3 g Methylstearat und 5g
Novo435 hinzugegeben. Die so erhaltene Suspension wird 36
Stunden bei 8O0C gerührt und heiß abfiltriert. Das klare Filtrat wird 4 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen und der ausgefallene hell-beige Feststoff (122,3g
N-Stearoylphytosphingosin, Reinheit >97%) abfiltriert.
Beispiel 16: Pilotansatz im Fetbettreaktor
207,8 g Phytosphingosin-Sulfat werden zusammen mit 108,04 g NaOCH3-Lsg (25%ig in Methanol) in 500 ml MIBK bei 550C suspendiert und anschließend heiß über eine Filterpresse in einen Festbettreaktor überführt und mit 149,3g Methylstea- rat versetzt. Im Festbett befinden sich 17,8g Novozyme 435. Der gesamte Reaktor ist auf 8O0C thermostatisiert . Das Festbett wird mit einer Pumprate von ca. 25 ml min"1 mit der Reaktionsmischung durchspült. Es wird ein Unterdruck von 0,8 bar angelegt, um überschüssiges Methanol zu entfernen. Nach 24h wird der Reaktor mit Stickstoff belüftet, entleert und die Reaktionslösung über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Der ausgefallene Feststoff wird ab- filtriert (287,1g N-Stearoylphytosphingosin, Reinheit
9 Q T4 \

Claims

Patentansprüche :
1. Verfahren zur biokatalytischen Herstellung von
Sphingolipiden der allgemeinen Formel I
:V^
Figure imgf000042_0001
Formel I
durch Umsetzung eines Lysosphingolipids der allgemeinen Formel II
Figure imgf000042_0002
Formel II
mit einem Carbonsäureester der allgemeinen Formel III
Figure imgf000042_0003
Formel III
wobei R1 eine lineare oder verzweigte, gegebenenfalls eine oder mehrere Mehrfachbindungen und/oder aromatische oder heteroaromatische Ringe enthaltende, gegebe- nenfalls durch Sauerstoffatome oder Ester- oder Amid- funktionalitäten unterbrochene, gegebenenfalls durch mindestens eine weitere Gruppe ausgewählt aus Alkyl- Hydroxy-, Keto- oder Amingruppen substituierte Alkyl- kette mit 2 bis 55 Kohlenstoffatomen darstellt,
R2 H, Phosphocholin, Etanolamin, Serin oder einen Zucker darstellt, X CH=CH, CH2-CH2 oder CH2-HCOH darstellt,
R3 einen verzweigten oder unverzweigten Alkylrest mit 1 bis 12 C-Atomen, der mit mindestens einem Rest -OR4 substituiert sein kann, darstellt,
wobei R4 unabhängig voneinander gleiche oder ungleiche Reste ausgewählt aus der Gruppe umfassend
H und
-C(O)R1 mit R1 wie oben definiert
ist,
dadurch gekennzeichnet, dass ein Biokatalysator eingesetzt wird, der mindestens eine Carboxylester-Hydrolase der Enzymklasse E. C. 3.1.1 ausgewählt aus der Gruppe umfassend
Carboxylester-Hydrolasen der Enzymklasse E. C. 3.1.1, die sich aus einem Organismus des Reiches der Pilze isolieren lassen und Carboxylester-Hydrolasen der Enzymklasse E. C. 3.1.1, die auf Aminosäureebene mindestens 80 % homolog zu den sich aus einem Organismus des Reiches der Pilze isolieren lassenden sind,
aufweist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R ein unsubstituierter Alkylrest mit 1 bis 4 C-Atomen ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Carbonsäureester der allgemeinen Formel III einen Voll- oder Partialestern von Polyolen mit mindestens einer Säure R1COOH darstellt.
4. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Lysosphingolipid durch Deprotonierung eines Säureadditionsprodukts des Ly- sosphingolipids vor der enzymatischen Umsetzung hergestellt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen der Deprotonierung des Säureadditionsprodukts des Lysosphingolipids und biokatalytischer Herstellung ein Filtrationsschritt erfolgt.
6. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Lysosphingolipid durch Deprotonierung eines Säureadditionsprodukts des Ly¬ sosphingolipids während der Biokatalyse hergestellt wird.
7. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass als Säureadditionsprodukt des Lysosphingolipids das Carbonsäurecarboxylat , SuI- fat, Phosphat, Nitrat, Carbonat, Hydroxid oder Haloge- nid des Lysosphingolipids eingesetzt wird.
8. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass zur Deprotonierung eine organische oder anorganische Base eingesetzt wird.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass Basen eingesetzt werden, die nach Protonierung kein Wasser frei setzen.
10. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass als Base ein Alkalimetall- alkoholat eingesetzt wird.
11. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das molare Verhältnis zwi- sehen Säureadditionsprodukt des Lysosphingolipids und Base im Bereich zwischen 10 zu 1 bis 0,05 zu 1 beträgt.
12. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Organismus des Reiches der Pilze ausgewählt ist aus der Gruppe der Gattungen Aspergillus , Bipolaris , Candida , Fusarium, Geotrichum, Humicola , Microsporum, Mucor, Pichia, Thermomyces , Pe- nicilium, Pichia, Rhizopus , Rhizomucor, Microsporum, Mucor, Nocardia, Saccharomyces , Streptomyces , Thermomy- ces , Trichosporon, Zygosaccharomyces .
13. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Biokatalysatormenge bezogen auf die Gesamtmasse an Edukten in einem Bereich zwischen 1% (w/w) und 100% (w/w) eingesetzt wird.
14. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Biokatalysator zurückgewonnen wird.
15. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktanden zu Beginn der enzymatischen Umsetzung in einem molaren Verhältnis von Lysosphingolipid zu Carbonsäureester von 1:10 bis 10:1 vorliegen.
16. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion im organischen Lösungsmittel durchgeführt wird.
17. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion unter wasserfreien Bedingungen, definiert als Wassergehalt von maximal 0,1 M, nachgewiesen nach Karl Fischer, durchgeführt wird.
18. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktandenkonzentra- tion zu Beginn der Reaktion im Bereich zwischen 0,01 M bis 3 M je Reaktand liegt.
19. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionstemperatur im Bereich zwischen 20 0C und 130 0C liegt.
20. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion unter einem Druck von kleiner 1 bar durchgeführt wird.
21. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass der Umsatz in Bezug auf die Zielverbindung gemäß Formel I bei über 80 % des theoretisch zu erwartenden Umsatzes liegt.
22. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass eine Zusammensetzung enthaltend Formel I und von 0,001 bis 19 Massen-%, des korrespondierenden N, O-Diacetlyierungsproduktes erhal- ten wird.
23. Sphingolipid, hergestellt mit einem Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 21.
24. Zusammensetzungen enthaltend Formel I und von 0,001 bis 19 Massen-% korrespondierenden N, O-Diacetylierungspro- duktes, hergestellt mit einem Verfahren nach Anspruch 22.
25. Kosmetische oder pharmazeutische Formulierung enthaltend mindestens ein Sphingolipid gemäß Anspruch 23 und/oder eine Zusammensetzung gemäß Anspruch 24.
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