WO2009119987A2 - 피라졸 유도체를 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

피라졸 유도체를 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 조성물 Download PDF

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    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2200/00—Function of food ingredients
    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
    • A23V2200/306—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health having an effect on bone mass, e.g. osteoporosis prevention

Definitions

  • the present invention relates to a composition for preventing and treating osteoporosis comprising a pyrazole derivative selected from the group consisting of the following Chemical Formulas 1 to 8, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the present invention also relates to a method for preventing and treating osteoporosis by administering the composition to a subject.
  • Bone modeling and remodeling play an important role in bone development, growth and metabolism. Bone formation begins in the early stages and continues until the young adulthood, when the skeleton matures and the growth ends, forming the maximum bone mass in the 20s and early 30s. After about 30 years, the bone formation process is repeated to remove the bone and replenish it again. In this case, the bone formation and bone absorption are paired with each other to maintain balance. After this period, bone loss due to bone resorption cannot follow enough bone formation, resulting in bone loss of 0.3% to 0.5% per year, especially in women at the beginning of menopause, with significant bone loss of 2-3% per year. There is a loss.
  • Bone is largely composed of four cells: osteoblast, osteoclast, osteoclast, lining cell, and osteocyte. At this time, osteoblasts derived from bone marrow stromal cells lead to bone formation as differentiated cells synthesizing bone matrix, and osteoclasts derived from hematopoietic stem cells lead to bone resorption.
  • Osteoporosis is a condition in which bone mineralization is reduced due to the reduction of bone tissue, and thus the bone marrow cavity is widened.
  • Bone mass is influenced by several factors, including genetics, nutrition, hormone changes, differences in exercise and lifestyle, and the causes of osteoporosis include old age, lack of exercise, low weight, smoking, low calcium diet, menopause, Ovarian ablation and the like are known.
  • blacks have lower bone resorption levels than whites, resulting in higher bone mass, usually the highest in 14 to 18 years of age, and decreasing by about 1% per year in old age.
  • women after 30 years of bone reduction continues to progress, and by the hormonal changes, bone reduction rapidly progresses.
  • estrogen concentration rapidly decreases at the end of menopause, in which a large amount of B-lymphocytes are produced, as in the case of IL-7 (interleukin-7), and the B cell precursor (pre-B) is added to the bone marrow. cells) accumulate, which increases the amount of IL-6, increasing the activity of osteoclasts, and ultimately decreases bone mass.
  • IL-7 interleukin-7
  • pre-B the B cell precursor
  • osteoporosis is an unavoidable symptom for elderly people, especially postmenopausal women, although the degree of osteoporosis is increasing, and as the population ages in developed countries, interest in osteoporosis and its therapeutics is gradually increasing. It is also known that there is a market of about $ 130 billion related to the treatment of bone diseases around the world, which is expected to increase further. have. In Korea, the prevalence of osteoporosis is rapidly increasing as the average life expectancy reaches 80. Recently, a study of local residents showed that 4.5% of men and 19.8% of women had osteoporosis when standardized to the national population. It has been reported to have. This suggests that osteoporosis is more common than diabetes or cardiovascular disease, and osteoporosis is a very important health problem when estimating the pain or cost of treating patients who suffer from fractures.
  • oxidative stress plays an important role in cell function.
  • Early studies were conducted mainly from the cytotoxic point of view (Boveris, A. and Chance, B., Biochem). J., 134: 707-716, 1973).
  • oxidative stress acts directly on cells, causing lipid peroxidation of cell membranes, DNA damage, oxidation of intracellular lipids and proteins, poly (ADP-ribosylation), and depletion of energy in cells, thereby promoting cell death.
  • causes various diseases (Beckman, KB and Ames, BN, Physiol. Rev., 78: 547-581, 1998).
  • oxidative stress not only has direct cytotoxicity, but also has various cellular functions such as acting as a secondary messenger in cells (Hensley, K. et al., Free Radic). Biol Med., 28: 1456-1462, 2000).
  • the action of oxidative stress is not a simple cytotoxic effect, but by causing a variety of actions on a variety of cells can mean a direct or indirect impact on human health and disease.
  • Multinuclear osteoclasts have cell adhesion, proliferation, motility, and cell-cell contact to form multi-nucleated giant cells. And monocyte macrophage lineage of hematopoietic progenitor cells through a multistep process of terminal fusion. This process involves a receptor called NF- ⁇ B receptor activator of nuclear factor (KAB), and a NF- ⁇ B receptor activator ligand (RANKL). RANKL, called “abbreviated”, begins by binding and is then delivered by activation of several signaling cascades.
  • KAB nuclear factor
  • RNKL NF- ⁇ B receptor activator ligand
  • Activated signaling pathways include NF- ⁇ B, extracellular signal-regulated kinase (TNF) via TNF receptor-associated factor 6 (hereinafter abbreviated as 'TRAF6'), and extracellular signal-regulated kinase.
  • TNF extracellular signal-regulated kinase
  • 'TRAF6' TNF receptor-associated factor 6
  • extracellular signal-regulated kinase Abbreviated "ERK”
  • c-Jun c-Jun
  • JNK N-terminal kinase
  • JNK N-terminal kinase
  • p38 mitogen-activated protein kinase p38 mitogen-activated protein kinase
  • the present inventors focused on the development of a therapeutic agent for osteoporosis using a molecular mechanism that inhibits the activity of RANKL, and as a result of intensive studies, the pyrazole derivatives of the present invention have excellent NADPH oxidase and RANKL inhibitory activity.
  • the present invention was completed by confirming that they can be used for the prevention or treatment of osteoporosis.
  • a composition for preventing and treating osteoporosis comprising a pyrazole derivative according to the present invention, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, has excellent NADPH oxidase and RANKL inhibitory activity and can be used to treat osteoporosis without any special side effects such as conventional therapeutics. have.
  • FIG. 1 is a schematic of a general bone reconstitution process for bone absorption and production.
  • Figure 2 is a graph measuring the degree of differentiation and TRAP staining by treating the osteoclast differentiation inhibitory ability by RANKL by concentration.
  • 3 is a photograph showing that the compound of the present invention inhibits the destruction of bone generated in mice by RANKL or LPS injection.
  • Figure 4 is a graph quantifying the extent to which the compound of the present invention inhibits the destructive action of bone generated in mice by RANKL or LPS injection.
  • the present invention relates to a composition for preventing and treating osteoporosis comprising a pyrazole derivative selected from the group consisting of the following Chemical Formulas 1 to 8, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the compound of Formula 1 is an enol form of the compound of Formula 2 produced by a keto-enol tautomer reaction of the compound of Formula 2.
  • the compounds of Formulas 3, 5, and 7 are enol forms of the compounds of Formulas 4, 6, and 8, respectively.
  • the pyrazole derivatives may be synthesized by a cyclization reaction of hydrazine and ⁇ -ketoester, as shown in Scheme 1, but are not limited thereto.
  • the cyclization reaction is Korean Patent No. 726,672, Min-Sup Park et al. Synthetic Communications 2004, 34, 1541-1550; Hyun-Ja Park, et. al. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2005, 15, 3307-3312.
  • R 1 is pyridine and R 2 is phenyl, methoxyphenyl, nitrophenyl or furanyl.
  • R 1 is pyridine
  • the hydrazine is 2-hydrazinopyridine
  • R 2 is phenyl, methoxyphenyl, nitrophenyl or furanyl
  • the ⁇ -ketoester is ethyl benzoyl acetate, 3- (3-methoxyphenyl) -3-oxo-propionic acid ethyl ester, 3- (4 -Nitrophenyl) -3-oxo-propionic acid or ethyl 3- (3-furyl) -3-oxopropanoate.
  • the cyclization reaction is preferably carried out for 2 to 72 hours at a temperature of 100 to 130 °C.
  • the product synthesized by Scheme 1 is expressed in keto form, but by keto-enol tautomer reaction, the product according to the present invention is also present in enol form.
  • the compounds of the present invention can be used in the form of pharmaceutically acceptable salts and include all salts, hydrates and solvates prepared by conventional methods.
  • salts are acid addition salts formed with pharmaceutically acceptable free acids.
  • Inorganic and organic acids may be used as the free acid, hydrochloric acid, bromic acid, sulfuric acid, phosphoric acid, etc. may be used as the inorganic acid, and citric acid, acetic acid, lactic acid, tartaric acid, fumaric acid, formic acid, propionic acid, oxalic acid, trifluoric acid, and the like.
  • Roacetic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, maleic acid, benzoic acid, gluconic acid, glycolic acid, succinic acid, 4-morpholine ethanesulfonic acid, camphorsulfonic acid, 4-nitrobenzenesulfonic acid, hydroxy-O-sulfonic acid, 4-toluenesulfonic acid, cal Luteuronic acid, emboic acid, glutamic acid, aspartic acid and the like can be used.
  • osteoporosis refers to a condition in which the absolute amount of bone is reduced in all bones except for empty areas such as the bone marrow cavity. May be included.
  • Pyrazole derivatives of the present invention or pharmaceutically acceptable salts thereof, have the property of inhibiting NADPH oxidase activity.
  • Pyrazole derivatives of the present invention have the property of inhibiting RANKL activity in osteoclasts.
  • RANKL activity is inhibited in proportion to the concentration of the pyrazole derivatives or salts thereof of the present invention, the higher the concentration of the pyrazole derivatives, the better the ability to inhibit osteoclast differentiation.
  • pyrazole derivatives of the present invention have the effect of inhibiting the destruction of bone caused by LPS and RANKL injection.
  • composition containing the pyrazole derivatives of the present invention, or pharmaceutically acceptable salts thereof is excellent in inhibiting osteoclast differentiation due to its excellent NADPH oxidase and RANKL inhibitory activity, and is effective in preventing and treating osteoporosis.
  • compositions for the prevention and treatment of osteoporosis comprising the pyrazole derivatives of the present invention, or pharmaceutically acceptable salts thereof, may further comprise a suitable carrier, excipient or diluent according to conventional methods.
  • Carriers, excipients or diluents that may be included in the compositions of the present invention include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, Cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • compositions comprising the pyrazole derivatives according to the invention, or pharmaceutically acceptable salts thereof, may be prepared according to conventional methods, oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups and aerosols, It may be formulated in the form of external preparations, suppositories or sterile injectable solutions.
  • diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, surfactants and the like, which are usually used in the formulation of pharmaceutical compositions.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, which may comprise at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose, or the like. (sucrose), lactose (lactose), gelatin can be prepared by mixing.
  • lubricants such as magnesium stearate, talc can also be used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, solvents, emulsions, syrups, and the like, and may include various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized formulations and suppositories.
  • non-aqueous solvent or suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used.
  • As the base of the suppository witepsol, macrogol, Tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • the invention also relates to a method for the prevention and treatment of osteoporosis comprising the step of administering said composition to a subject.
  • the method for preventing and treating osteoporosis in the present invention relates to a method for enhancing the therapeutic effect of osteoporosis by administering to a subject a composition comprising a pyrazole derivative of the present invention.
  • administration means introducing a composition for preventing and treating osteoporosis of the present invention by any suitable method to the patient, the composition for preventing and treating osteoporosis of the present invention can reach the target tissue. Administration can be by any common route as long as it is available.
  • Routes of administration include oral administration, intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, nasal administration, pulmonary administration, rectal administration, intranasal administration, intraperitoneal administration and intradural administration, It is not limited to this.
  • the composition for preventing and treating osteoporosis according to the present invention may be administered once a day or twice or three times a day at regular time intervals. It will be apparent to those skilled in the art that a suitable total daily dose may be determined by the practitioner within the correct medical judgment.
  • the specific therapeutically effective amount for a particular patient may be based on the specific composition, including the type and severity of the reaction to be achieved, whether or not other agents are used in some cases, the age, weight, general health, sex and diet of the patient, time of administration, Different applications are desired depending on the route of administration and the rate of release of the composition, the duration of treatment, the drug used in conjunction with or concurrently with the specific composition and similar factors well known in the medical arts.
  • osteoporosis prevention and treatment composition according to the present invention may be appropriately administered according to various methods commonly known to those skilled in the art in consideration of the type, dosage form, and therapeutic effect of osteoporosis.
  • Example 1 Inhibitory activity of osteoclast differentiation by RANKL of a compound according to the present invention
  • Bone marrow cells harvested from 5 to 6 week old mice were placed in a 48-well plate, containing hM-CSF (R & D system Inc.), a macrophage differentiation factor, at a concentration of 30 ng / ml. 37 ° C. at 4 ⁇ 10 4 cells / well for 3 days in differentiation medium ( ⁇ -MEM (Invitrogen.
  • Macrophages derived from bone marrow cells were obtained by culturing in 95% (v / v) air and 5% (v / v) CO 2 .
  • the osteoclast differentiation factor mouse RANKL was expressed in Escherichia coli, purified, purified, and added at a concentration of 100 ng / ml, followed by culturing in osteoclasts under the same conditions. Cell differentiation into.
  • the compounds of the present invention were added at the concentration of 2.5 ⁇ M, 5. ⁇ M, 10 ⁇ M and 20 ⁇ M, respectively, and cultured in cells.
  • the exchange of differentiation medium was performed every two days during the experiment. As a result, it was confirmed that cell differentiation was inhibited in a concentration-dependent manner in the experimental group unlike the control group in which normal differentiation into osteoclasts.
  • Figure 2 is a graph measuring the degree of differentiation and differentiation of TRAP staining by treating the effect of the compound of the present invention by concentration in the process of differentiating osteoclast progenitor cells isolated from mouse bone marrow by RANKL treatment, the present invention
  • TRAP thyroid resistant acid phosphatase
  • the TRAP staining was performed by fixing the cells at room temperature for 15 minutes in 3.7% formaldehyde and washing twice with distilled water, followed by acetate, phosphate, Leukocyte (TRAP) kitTM (Sigma Co.) at the rate described in the instructions for use. 200 ⁇ l / well of a dye solution prepared by mixing Fast Gargnet GBC base, naphthol AS-BI phosphoric acid, sodium nitrite, and tartrate was added and reacted at 37 ° C. for 20 minutes.
  • Figures 3 and 4 are photographs showing that the compounds of the present invention inhibit the bone destroying action that occurs in mice by RANKL or LPS injection and quantitative graphs.
  • the present invention relates to a composition for preventing and treating osteoporosis comprising a pyrazole derivative selected from the group consisting of Formulas 1 to 8 and a method for preventing and treating osteoporosis by administering the composition to a subject, which can be utilized in the medical field. Do.

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Abstract

본 발명은 피라졸 유도체, 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 조성물과, 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 골다공증의 예방 및 치료 방법에 관한 것으로서, 구체적으로는 본 발명에 따른 피라졸 유도체, 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염은 NADPH 옥시다아제 및 RANKL 억제 활성이 우수함으로 인해 파골세포 분화 억제 효과가 뛰어나 골다공증 치료 및 예방에 사용될 수 있다.

Description

피라졸 유도체를 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 조성물
본 발명은 하기 화학식 1 내지 8로 구성되는 군으로부터 선택되는 피라졸 유도체, 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 조성물을 개체에 투여하여 골다공증을 예방 및 치료하는 방법에 관한 것이다.
<화학식 1>
Figure PCTKR2009001315-appb-I000001
<화학식 2>
Figure PCTKR2009001315-appb-I000002
<화학식 3>
Figure PCTKR2009001315-appb-I000003
<화학식 4>
Figure PCTKR2009001315-appb-I000004
<화학식 5>
Figure PCTKR2009001315-appb-I000005
<화학식 6>
Figure PCTKR2009001315-appb-I000006
<화학식 7>
Figure PCTKR2009001315-appb-I000007
<화학식 8>
Figure PCTKR2009001315-appb-I000008
뼈의 발생, 성장 및 대사과정에서는 뼈의 형성(bone modeling)과 재형성(remodeling) 과정이 중요한 역할을 한다. 뼈의 형성은 태생기부터 시작하여 이후 골격이 성숙되어 성장이 끝나는 청장년기까지 지속되어 20대에서 30대 초반까지 최대 골량을 형성하게 된다. 이후 약 30년 동안은 뼈를 제거하고 다시 이를 보충하는 골재형성 과정을 반복하게 되는데 이때는 골형성과 골흡수가 서로 짝을 이루어 균형을 유지하게 된다. 이 시기가 지난 후에는 골흡수에 따른 골소실을 골형성이 충분히 따라갈 수 없어 결국 연 0.3 ~ 0.5% 정도의 골량 감소를 겪게 되며, 특히 여성의 경우에는 폐경 초기에 연 2 ~ 3%의 상당한 골손실을 겪게 된다.
뼈는 크게 조골세포(osteoblast), 파골세포(osteoclast), 라이닝세포(lining cell) 및 골세포(osteocyte)의 네 가지 세포로 구성되어 있다. 이때, 골수내 간질세포(bone marrow stromal cell)로부터 유래되는 조골세포는 골기질을 합성하는 분화된 세포로서 골형성을 주도하며, 조혈모세포로부터 유래되는 파골세포는 골흡수를 주도한다.
골다공증(osteoporosis)은 골 조직의 석회가 감소되어 뼈의 치밀질이 엷어지고 그로 인해 골수강(骨髓腔)이 넓어지는 상태로, 증세가 진전됨에 따라 뼈가 약해지기 때문에 작은 충격에도 골절되기 쉽다. 골량은 유전적 요인, 영양 섭취, 호르몬의 변화, 운동 및 생활 습관의 차이 등 여러 가지 요인들에 의해 영향을 받으며, 골다공증의 원인으로는 노령, 운동 부족, 저체중, 흡연, 저칼슘 식이, 폐경, 난소 절제 등이 알려져 있다. 한편, 개인차는 있지만 백인보다는 흑인이 골 재흡수 수준 (bone resorption level)이 낮아 골량이 더 높으며, 대개 골량은 14 ~ 18세에 가장 높고 노후에는 1년에 약 1%씩 감소한다. 특히, 여성의 경우 30세 이후부터 골 감소가 지속적으로 진행되며, 폐경기에 이르면 호르몬 변화에 의해 골 감소가 급격히 진행된다. 즉, 폐경기에 이르면 에스트로겐 농도가 급속히 감소하는데, 이때, IL-7(interleukin-7)에 의한 것처럼 B-임파구(B-lymphocyte)가 다량 생성되어 골수 (bone marrow)에 B 세포 전구체 (pre-B cell)가 축적되고, 이로 인해 IL-6의 양이 증가하여 파골 세포의 활성을 증가시키므로 결국 골량이 감소하게 된다.
이와 같이, 골다공증은 정도에 차이는 있으나 노년층, 특히 폐경기 이후의 여성에게 있어서는 피할 수 없는 증상으로, 선진국에서는 인구가 노령화됨에 따라 골다공증 및 그 치료제에 대한 관심이 점차 증가하고 있다. 또한, 전 세계적으로 골질환 치료와 관련되어 약 1300억 달러의 시장이 형성되어 있는 것으로 알려져 있으며, 앞으로 더 증가할 것으로 예상되기 때문에 세계적인 각 연구 기관과 제약회사에서는 골질환 치료제 개발에 많은 투자를 하고 있다. 국내에서도 근래에 평균수명이 80세에 육박하면서 골다공증 유병률이 급격하게 증가하고 있는데, 최근 지역 주민을 대상으로 실시된 연구에 의하면 전국 인구로 표준화하였을 경우 남성의 4.5%, 여성의 19.8%가 골다공증을 갖고 있다고 보고된 바 있다. 이는 골다공증이 당뇨병이나 심혈관계 질환보다 더 흔한 질환이며, 골절로 인해 받는 환자들의 고통이나 치료를 위해 들어가는 비용을 추정할 때 골다공증은 매우 중요한 보건 문제임을 시사한다.
지금까지 여러 물질이 골다공증 치료제로 개발되었다. 그 중 골다공증 치료제로 가장 많이 사용되는 에스트로겐은 그 실제적인 효능이 아직 검증되지 않은 상태이며 생애 내내 복용해야하는 단점이 있으며, 장기간 투여하는 경우 유방암이나 자궁암이 증가하는 부작용이 있다. 알렌드로네이트(alrendronate)도 그 효능이 명확하지 않고 소화관에서의 흡수가 더디며 위장과 식도점막에 염증을 유발하는 문제가 있다. 칼슘 제제는 부작용이 적으면서도 효과가 우수한 것으로 알려져 있지만 치료제라기보다는 예방제에 해당한다. 그 외에 칼시토닌과 같은 비타민 D 제제가 알려져 있으나 아직 그 효능 및 부작용에 대한 연구가 충분히 되어있지 않은 상태이다. 이에, 부작용이 적고 효과가 우수한 새로운 대사성 골 질환 치료제가 요구되고 있는 실정이다.
한편, 산화 스트레스가 세포 기능에 중요한 작용을 한다는 사실은 1970년대 초에 이미 알려지기 시작하였는데, 초기의 연구들은 주로 세포 독성학적 관점에서 연구가 진행되었다 (Boveris, A. and Chance, B., Biochem J., 134: 707-716, 1973). 즉, 산화 스트레스가 세포에 직접 작용하여 세포막의 지질 과산화 반응, DNA 손상, 세포내 지질과 단백질의 산화, poly(ADP-ribosylation) 및 세포 내 에너지 고갈 등을 일으킴으로써, 세포의 사멸을 촉진하여 다양한 여러 가지 질환을 야기할 수 있다는 것이다 (Beckman, K.B. and Ames, B.N., Physiol. Rev., 78: 547-581, 1998). 그러나, 이후의 연구들은 산화 스트레스가 직접적인 세포 독성을 가지고 있을 뿐만 아니라, 세포 내 이차전령 물질로서 작용하는 등 다양한 세포기능 조절 작용을 갖고 있음을 제시하고 있다 (Hensley, K. et al., Free Radic Biol Med., 28: 1456-1462, 2000). 즉, 산화 스트레스의 작용이 단순한 세포 독성 작용이 아닌, 다양한 세포에 다양한 작용을 일으킴으로써 인간의 건강 및 질환에 직간접적인 영향을 줄 수 있음을 의미한다.
따라서, 많은 질환 모델에서 산화 스트레스의 작용에 대한 연구들이 활발히 진행되고 있는바, 현재까지의 연구들은 혈관염, 사구체신염 및 전신성 홍반성 루프스 등의 염증성 질환, 허혈성 심질환, 중풍 및 장 허혈 등의 심혈관계 질환, 파킨슨씨병, 근육위축증 및 치매 등의 신경-근육계 질환, 암, 알코올 중독, 흡연과 연관된 질환, AIDS, 위궤양 및 고혈압 등 수많은 질환이 산화 스트레스와 연관되어 있다 (McCord, J.M., Am. J. Med., 108: 652-659, 2000).
최근에는 ROS (Reactive Oxygen Species)가 뼈의 대사에 연관이 있다는 연구들이 보고되고 있다 (Darden, A.G., et al., J. Bone Miner. Res., 11:671-675, 1996; Yang, S., et al., J. Biol. Chem., 276:5452-5458, 2001; Fraser, J.H., et al., Bone 19:223-226,1996; Yang, S., et al., Clacif. Tissue Int., 63:346-350, 1998). 더구나, 뼈의 재생(bone remodeling)은 뼈를 형성하는(bone forming) 조골세포(osteoblasts)와 뼈를 흡수하는(bone resorbing) 파골세포(osteoclast, OC)의 상대적인 작용을 통하여 이루어진다고 알려져 있다.
다중 핵 (multinuclear) 파골세포는 다중 핵화된 거대 세포(multi-nucleated giant cell)를 형성하기 위한 세포 부착 (cell adhesion), 증식 (proliferation), 운동성 (motility), 세포간 연접 (cell-cell contact) 및 말단 융합 (terminal fusion)의 다단계 과정을 통한 조혈전구세포 (hematopoietic progenitor cell)의 단핵구 대식세포 계통 (monocyte macrophage lineage)으로부터 분화된다. 이 과정은 NF-κB의 수용체 활성인자 (receptor activator of nuclear factor-κB, 이하 "RANK"로 약칭)라 불리는 수용체와 NF-κB의 수용체 활성인자 리간드 (receptor activator of NF-κB ligand, 이하 "RANKL"로 약칭)라 불리는 RANKL이 결합하면서 시작되고, 이어서, 몇 가지 신호전달계 (signaling cascade)의 활성화에 의해 전달된다. 활성화된 신호전달경로 (signaling pathway)는 TNF 수용체 연관성인자 (tumor necrosis factor receptor-associated factor) 6 (이하 ‘TRAF6“로 약칭)를 통한 NF-κB, 세포외 신호조절 키나제 (extracellular signal-regulated kinase, 이하 "ERK"로 약칭), c-Jun, N-말단 키나제 (N-terminal kinase, 이하 "JNK"로 약칭) 및 p38 MAP 키나제 (p38 mitogen-activated protein kinase)를 포함한다. 이러한 신호전달 현상은 파골세포의 분화 및 작용의 조절에 직접적인 영향을 미친다 (Boyle, W.J., et al., Nature, 423:337-342, 2003). 일단 파골세포들이 분화되면, 뼈의 흡수는 NADPH 옥시다제 (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase)에 의해 발생되어진 ROS에 의해 촉진된다. NADPH 옥시다제의 억제제(inhibitor)는 ROS와 뼈 흡수의 감소를 유도한다 (Yang, S., et al., Clacif. Tissue Int., 63:346-350, 1998). 이러한 결과는 파골세포에서 ROS의 발생이 NADPH 옥시다제 활성에 의존적이고 파골세포의 기능에 직접적인 연관이 있다는 이론과 일치한다.
이에, 본 발명자들은 RANKL의 활성을 억제하는 분자적 기전을 이용하여 골다공증의 치료제를 개발할 수 있다는 점에 착안하여 예의 연구를 거듭한 결과, 본 발명의 피라졸 유도체가 NADPH 옥시다아제 및 RANKL 억제 활성이 우수함을 발견하였으며 이들이 골다공증의 예방 또는 치료에 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명에 따른 피라졸 유도체, 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 조성물은 NADPH 옥시다아제 및 RANKL 억제 활성이 우수하며 또한 종래의 치료제와 같은 특별한 부작용 없이 골다공증 치료에 사용될 수 있다.
도 1은 뼈 흡수 및 생성에 관한 일반적인 뼈 재구성 과정을 도식화한 것이다.
도 2는 RANKL에 의한 파골세포 분화 저해능을 농도별로 처리하여 TRAP 염색한 사진 및 분화 정도를 측정한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 화합물이 RANKL 또는 LPS 주입에 의해 생쥐에서 발생되는 뼈의 파괴를 억제한다는 것을 나타내는 사진이다.
도 4는 본 발명의 화합물이 RANKL 또는 LPS 주입에 의해 생쥐에서 발생되는 뼈의 파괴 작용을 억제하는 정도를 정량화한 그래프이다.
본 발명은 하기 화학식 1 내지 8로 구성되는 군으로부터 선택되는 피라졸 유도체, 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
<화학식 1>
Figure PCTKR2009001315-appb-I000009
<화학식 2>
Figure PCTKR2009001315-appb-I000010
<화학식 3>
Figure PCTKR2009001315-appb-I000011
<화학식 4>
Figure PCTKR2009001315-appb-I000012
<화학식 5>
Figure PCTKR2009001315-appb-I000013
<화학식 6>
Figure PCTKR2009001315-appb-I000014
<화학식 7>
Figure PCTKR2009001315-appb-I000015
<화학식 8>
Figure PCTKR2009001315-appb-I000016
상기 화학식 1의 화합물은 상기 화학식 2의 화합물의 케토-엔올 토토머 반응에 의하여 생성되는 화학식 2의 화합물의 엔올형 (enol form)이다. 마찬가지로, 상기 화학식 3, 5 및 7의 화합물은 각각 상기 화학식 4, 6 및 8의 화합물의 엔올형이다.
상기 피라졸 유도체는 하기 반응식 1과 같이, 히드라진과 β-케토에스테르의 고리화반응에 의하여 합성될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 고리화반응은 한국등록특허 제726,672호, Min-Sup Park et al. Synthetic Communications 2004, 34, 1541-1550; Hyun-Ja Park, et. al. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2005, 15, 3307-3312에 개시되어 있다.
<반응식 1>
Figure PCTKR2009001315-appb-I000017
여기서, R1은 피리딘이고, R2는 페닐, 메톡시페닐, 니트로페닐 또는 퓨라닐이다.
R1이 피리딘일 때, 상기 히드라진은 2-히드라지노피리딘이다. 또한, R2가 페닐, 메톡시페닐, 니트로페닐 또는 퓨라닐일 때, 상기 β-케토에스테르는 에틸 벤조일아세테이트, 3-(3-메톡시페닐)-3-옥소-프로피온산 에틸 에스테르, 3-(4-니트로페닐)-3-옥소-프로피온산 또는 에틸 3-(3-퓨릴)-3-옥소프로파노에이트이다.
반응 용매로는 에탄올 또는 초산을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 고리화 반응은 100 내지 130℃의 온도에서 2 내지 72시간 동안 수행되는 것이 바람직하다.
통상적으로 반응식 1에 의하여 합성되는 생성물은 케토형 (keto form)으로 표현되나, 케토-엔올 토토머 반응에 의하여 본 발명에 따른 생성물은 엔올형 (enol form)으로도 존재한다.
본 발명의 화합물은 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 통상의 방법에 의해 제조되는 모든 염, 수화물 및 용매화물이 포함된다. 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산, 인산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플루오로아세트산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, 말레인산, 벤조산, 글루콘산, 글리콜산, 숙신산, 4-모폴린에탄술폰산, 캠포술폰산, 4-니트로벤젠술폰산, 히드록시-O-술폰산, 4-톨루엔술폰산, 칼룩투론산, 엠보산, 글루탐산, 아스파르트산 등을 사용할 수 있다.
본원에서, "골다공증"이라는 용어는 뼈 전체에서 골수강 등의 빈 부분을 제외한 뼈의 절대량이 감소된 상태를 가리키는 것으로서, 노인성 및 폐경 후 골다공증, 내분비성 골다공증, 선천성 골다공증, 부동성 골다공증 또는 외상성 골다공증이 포함될 수 있다.
본 발명의 피라졸 유도체, 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염은 NADPH 옥시다아제 활성을 억제하는 특성을 지닌다.
본 발명의 피라졸 유도체, 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염은 파골세포에서 RANKL 활성을 억제하는 특성을 지닌다. 특히, 본 발명의 피라졸 유도체 또는 그 염의 농도에 비례하여 RANKL 활성이 억제되므로, 피라졸 유도체의 농도가 고농도일수록 파골세포 분화 저해능이 우수하다.
또한, 본 발명의 피라졸 유도체, 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염은 LPS 및 RANKL 주입에 의해 발생하는 뼈의 파괴를 억제하는 효과를 나타낸다.
전술한 바와 같은 본원발명의 피라졸 유도체, 또는 그 염의 효과는 화학식 1 내지 8의 엔올형과 케토형의 화합물, 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염 모두에서 나타난다.
따라서, 본 발명의 피라졸 유도체, 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 조성물은 NADPH 옥시다아제 및 RANKL 억제 활성이 우수함으로 인해 파골세포 분화 억제 효과가 뛰어나 골다공증의 예방 및 치료에 효과적이다.
본 발명의 피라졸 유도체, 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 골다공증의 예방 및 치료용 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 또는 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명에 따른 피라졸 유도체, 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 조성물은, 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 및 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
상세하게는, 제형화할 경우에는 통상 약학 조성물의 제형화에 사용되는 충전제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형 제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 들 수 있으며, 이러한 고형 제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 활석과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 들 수 있는데, 통상 사용되는 단순 희석제인 물, 액상 파라핀 이외에 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등의 여러 가지 부형제가 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성 용제 또는 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(Tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 골다공증의 예방 및 치료 방법에 관한 것이다. 구체적인 일 양태로서, 본 발명에 있어서 골다공증의 예방 및 치료 방법은 개체에 본 발명의 피라졸 유도체를 포함하는 조성물을 투여하여 골다공증의 치료 효과를 높이는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, "투여"라 함은 환자에게 어떠한 적절한 방법에 의하여 본 발명의 골다공증 예방 및 치료용 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 골다공증 예방 및 치료용 조성물은 목적 조직에 도달할 수 있는 한 임의의 일반적인 경로에 의하여 투여될 수 있다.
투여 경로로는 경구 투여, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 강내 투여, 복강내 투여 및 경막내 투여를 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 골다공증 예방 및 치료용 조성물은 1일 1회 투여되거나, 일정한 시간 간격을 두고 1일 2회 또는 3회 투여될 수 있다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
골다공증의 종류나 투여 형태, 그리고 치료 효과 등을 고려하여 당업자에게 통상적으로 알려진 다양한 방법에 따라 본 발명에 따른 골다공증 예방 및 치료용 조성물을 적절히 투여할 수 있다.
하기 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것이다. 이들 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
제조예: 피라졸 유도체의 합성방법
화학식 1 (3-페닐-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-올)의 제조
둥근 바닥플라스크에 에틸 벤조일아세테이트(1당량)와 에탄올 4㎖을 넣고, 여기에 2-히드라지노피리딘(1.1당량)을 에탄올 3㎖에 희석시켜 0℃에서 천천히 적가하였다. 20분 동안 가열 환류시켰다. 감압 증류하여 용매를 제거한 다음 생성된 고체를 헥산과 에틸아세테이트로 세척한 후 진공 건조시켜 87%의 수율로 표제의 화합물을 얻었다.
화학식 3 (3-(3-메톡시페닐)-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-올)의 제조
둥근 바닥플라스크에 3-(3-메톡시페닐)-3-옥소-프로피온산 에틸 에스테르(1당량)와 에탄올 4㎖을 넣고, 여기에 2-히드라지노피리딘(1.1당량)을 에탄올 3㎖에 희석시켜 0℃에서 천천히 적가하였다. 20분 동안 가열 환류시켰다. 감압 증류하여 용매를 제거한 다음 생성된 고체를 헥산과 에틸아세테이트로 세척한 후 진공 건조시켜 67%의 수율로 표제의 화합물을 얻었다.
화학식 5 (3-(4-니트로페닐)-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-올)의 제조
둥근 바닥플라스크에 3-(4-니트로페닐)-3-옥소-프로피온산 에틸 에스테르(1당량)와 에탄올 4㎖을 넣고, 여기에 2-히드라지노피리딘(1.1당량)을 에탄올 3㎖에 희석시켜 0℃에서 천천히 적가하였다. 20분 동안 가열 환류시켰다. 감압 증류하여 용매를 제거한 다음 생성된 고체를 헥산과 에틸아세테이트로 세척한 후 진공 건조시켜 92%의 수율로 표제의 화합물을 얻었다.
화학식 7 (3-(퓨란-2-일)-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-올)의 제조
둥근 바닥 플라스크에 에틸 3-(3-퓨릴)-3-옥소프로파노에이트(1.2당량)와 초산 3㎖을 넣고, 여기에 2-히드라지노피리딘(1당량)을 초산 2㎖에 희석한 용액을 천천히 적가한 후, 130℃에서 72시간 동안 가열 환류시켰다. 감압 증류하여 용매를 제거한 다음 생성된 고체를 헥산으로 세척한 후 건조시켜 66%의 수율로 표제의 화합물을 얻었다.
실시예 1: 본 발명에 따른 화합물의 RANKL에 의한 파골세포 분화 저해능 실험
5 내지 6주령인 생쥐 (C57BL/6J)로부터 채취한 골수세포를 48-웰 플레이트에 넣고, 대식세포(macrophage) 분화 인자인 hM-CSF(R&D system Inc.)를 30ng/㎖의 농도로 포함하는 분화배지 (α-MEM (Invitrogen. co.,), 10%(v/v) 우태아혈청(FBS), 100units/㎖ 페니실린, 100㎍/㎖ 스트렙토마이신)에서 3일 동안 4x104 세포/웰로 37℃, 95%(v/v) 공기, 5% (v/v) CO2에서 배양하여 골수세포로부터 파생된 대식세포를 얻었다. 여기에 상기 30ng/㎖의 농도의 hM-CSF에 더하여, 파골세포 분화 인자인 생쥐 RANKL을 대장균에서 발현시켜 순수 분리 정제하여 100ng/㎖의 농도로 첨가한 후, 동일한 조건에서 배양을 계속하여 파골세포로의 세포분화를 유도하였다. 이때, 본 발명의 화합물을 각각 2.5μM, 5.μM, 10μM 및 20μM의 농도로 첨가하여 세포 배양하였다. 실험시 분화 배지의 교환은 2일 간격으로 해 주었다. 그 결과 파골세포로의 정상적인 분화가 이루어지는 대조군과는 달리 실험군에서는 세포분화가 농도 의존적으로 억제됨을 확인하였다.
도 2는 생쥐 골수에서 분리한 파골 전구세포가 RANKL 처리에 의하여 파골세포로 분화되는 과정에 있어서 본 발명의 화합물의 효과를 농도별로 처리하여 TRAP 염색한 사진 및 분화 정도를 측정한 그래프로서, 본 발명의 화합물을 첨가하여 배양하기 시작한 날로부터 5일째 되는 날에 TRAP (tartrate resistant acid phosphatase) 염색하고 광학현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 것이다. 구체적으로, 상기 TRAP 염색은 세포를 3.7% 포름알데히드로 15분 동안 실온에서 고정시키고 증류수로 2회 세척한 후 Acid Phosphatase, Leukocyte(TRAP) kitTM(Sigma Co.)의 사용설명서에 기재된 비율로 아세테이트, 패스트 가르넷 GBC 염기 (Fast Gargnet GBC base), 나프톨 AS-BI 인산, 소듐 니트라이트, 타르트레이트를 섞어 만든 염색액을 200㎕/웰을 넣고 37℃에서 20분 동안 반응시켜 이루어졌다.
도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 화합물의 농도에 비례하여 파골세포 분화가 저해됨을 확인할 수 있었다.
실시예 2: 본 발명에 따른 화합물의 RANKL 또는 LPS에 의해 유도되는 뼈 파괴 작용 억제 효능
골소실 생쥐모델에서 본 발명에 따른 화합물의 RANKL 또는 LPS에 의해 유도되는 뼈 파괴작용 억제 효능을 살펴보기 위하여, 7주령인 생쥐의 머리뼈 두개관(頭蓋冠 calvaria)에 대조군 3 그룹 (아무것도 처리하지 않은 무처리군, LPS(12.5㎎/㎏) 및 RANKL(2㎎/㎏) 처리 그룹)과, 본 발명의 화합물 40㎎/㎏을 처리한 실험군 3 그룹 (아무것도 처리하지 않은 무처리군, LPS(12.5㎎/㎏) 및 RANKL(2㎎/㎏) 처리 그룹)의 총 6개 그룹을 4일간 매일 주입하였다. 5일째 생쥐 두개관을 채취해 그 단면을 H&E 염색하여 살펴보고, Image-pro Plus4.5(Media Cybernetics, Inc.)를 이용하여 뼈 파괴작용 억제 정도를 분석하였다.
도 3 및 도 4는 본 발명의 화합물이 RANKL 또는 LPS 주입에 의해 생쥐에서 발생되는 뼈 파괴 작용을 억제함을 보여주는 사진 및 그 정도를 정량한 그래프이다.
도 3 및 도 4에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 화합물을 함께 투여할 때, LPS 주입에 의해 발생하는 뼈의 파괴가 평균 50% 저해되고, RANKL 주입에 의한 뼈의 파괴는 평균 64% 저해된다는 것을 알 수 있었다.
본원 발명은 화학식 1 내지 8로 구성되는 군으로부터 선택되는 피라졸 유도체를 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 조성물 및 상기 조성물을 개체에 투여하여 골다공증을 예방 및 치료하는 방법에 관한 것으로서, 의료 분야에서 활용 가능하다.

Claims (4)

  1. 하기 화학식 1 내지 8로 구성되는 군으로부터 선택되는 피라졸 유도체, 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 조성물:
    <화학식 1>
    Figure PCTKR2009001315-appb-I000018
    <화학식 2>
    Figure PCTKR2009001315-appb-I000019
    <화학식 3>
    Figure PCTKR2009001315-appb-I000020
    <화학식 4>
    Figure PCTKR2009001315-appb-I000021
    <화학식 5>
    Figure PCTKR2009001315-appb-I000022
    <화학식 6>
    Figure PCTKR2009001315-appb-I000023
    <화학식 7>
    Figure PCTKR2009001315-appb-I000024
    <화학식 8>
    Figure PCTKR2009001315-appb-I000025
  2. 제1항에 있어서, 상기 피라졸 유도체, 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염은 NADPH 옥시다아제(oxidase) 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 피라졸 유도체, 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염은 파골세포에서 RANKL 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제1항 또는 제3항의 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 골다공증의 예방 및 치료 방법.
PCT/KR2009/001315 2008-03-25 2009-03-17 피라졸 유도체를 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 조성물 Ceased WO2009119987A2 (ko)

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