WO2009113709A1

WO2009113709A1 - 粘着末端を有するｄｎａ断片の調製方法

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Publication number: WO2009113709A1
Application number: PCT/JP2009/054989
Authority: WO
Inventors: 小宮山眞; 葛谷明紀; 田中啓太
Original assignee: 国立大学法人東京大学
Priority date: 2008-03-11
Filing date: 2009-03-10
Publication date: 2009-09-17
Also published as: EP2270142A1; JP5397960B2; EP2270142A4; US20110009607A1; JPWO2009113709A1

Abstract

　本発明は、粘着末端を有する所望の２本鎖DNA断片を、PCR後の増幅産物（増幅断片）から制限酵素処理を介さずに直接的かつ容易に得る、DNA断片の調製方法等を提供する。本発明の粘着末端を有するDNA断片の調製方法は、（ｉ）鋳型DNAと、特定のプライマーとを用いてPCR反応を行うことにより増幅DNA断片を得る工程、及び（ｉｉ）前記増幅DNA断片に所定の処理を施すことにより当該断片中の保護基を脱離させる工程を含む方法である。ここで、前記特定のプライマーは、鋳型DNA中の増幅対象領域と相補的に結合する塩基配列からなる相補DNA部分と、当該相補DNA部分の5'末端に連結し且つ前記増幅対象配列と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補DNA部分とから構成され、当該非相補DNA部分の塩基配列中の少なくとも3'末端に相当する塩基がDNAポリメラーゼによるDNA複製の進行を停止させ得る保護基で修飾されたものである。

Description

明細書粘着末端を有する DNA断片の調製方法技術分野

本発明は、制限酵素等による処理を介さずに、直接、粘着末端（突出末端）を有する所望の 2本鎖 DNA断片を調製する方法に関する。さらに、当該方法により得られた DNA断片を用いた遺伝子組換え方法に関する。背景技術

従来より、分子生物学及びバイオテクノロジー分野においては、制限酵素を用いてプラスミド DNAを切断し、これをホスト DNAとして、リガーゼを用いて所望の遺伝子断片と結合させることでベクターを構築している。多くの場合、上記遺伝子断片は、 PCRにより様々な原料（铸型 DNA) から調製され、 PCR増幅産物の平滑末端は、プラスミド DNA (ホスト DNA) と結合させるために、制限酵素で処理をして粘着末端（突出末端）に変えられる（Sambrook, J. et al.， 2001， Molecular Cloning: A Laboratory Manual Edn.3. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) 。この技術により所望のベクタ一が得られる効率は比較的高いものであるが、例えば以下のような 2つの問題がある。 1つ目は、制限酵素の認識部位がいくつかの回文配列に制限されているため、目的の部位で（又はその近傍で） DNAを切断するのに適した制限酵素を見つけるのが困難なことがよくある、ということである。 2つ目は、利用可能な制限酵素の多くは 4〜 6塩基の DNA配列を認識するものであるが、サイズの大きな DNAを制限酵素処理する場合（同じ認識部位も多く存在する）、所望の部位以外にも多くの部位で切断されてしまうため、ホスト DNAのサイズが大きいと正確な遺伝子組換え操作ができない、ということである。

本発明者は、このような問題の解決策として、 Ce⁴⁺/EDTA複合体（分子ハサミ： molecular scissors) と一組の擬似相補性ペプチド核酸（pcPNA) ( 2本鎖 DNAへの侵入と局所的 1本鎖部位の作成）とを組み合わせることにより、人工的制限 DNAカッター（ARCUT) を作製した。これら pcPNAを 2本鎖 DNAに作用させると、 pcPNAは 2本鎖 DNAを部分的に解離させ、自身のターゲット配列に結合する（2本鎖 DNAへの侵入）。ここで、 pcPNAのターゲット配列を数塩基横にずらしておくと、複合体形成時に pcPNAが結合した部分の反対側が局所的に 1本鎖のまま残される。この複合体に Ce⁴⁺/EDTAを作用させると、 Ce⁴⁺/EDTAは 2本鎖 DNAよりも 1本鎖 DNAを選択的に切断するため、 pcPNAによって作られた 1本鎖部分が選択的切断される。それぞれの DNA鎖の切断位置が横方向にずれているため、切断後には粘着末端が形成される。 ARCUTにより形成された粘着末端は、別途調製された他の断片（例えば、制限酵素処理断片）の末端と直接的には結合しないが、これらの断片は、互いのスペースを埋めるジョイントオリゴヌクレオチドを利用することにより、見かけ上、相補的な構造を形成して、結合され得る（Yamamoto, Y. et al.， Chem. Bio. Chem., vol.7, p.673-677, 2006) 。しかしな力 ^ら、 ARCUTを用いた方法では、結合効率（ライゲーシヨン効率）が低く、また精製 Z分離工程がより困難なものとなるという問題があった。発明の開示

そこで、本発明が解決しょうとする課題は、粘着末端を有する所望の 2本鎖 DNA断片を、 PCR後の増幅産物（増幅断片）から制限酵素処理を介さずに直接的かつ容易に得る、 DNA断片の調製方法を提供することにある。さらに、本発明は、当該調製方法により得られた DNA断片を用いた、遺伝子組換え方法等を提供することにある。

本発明者は、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った。その結果、 PCR用プライマ一として、特定の機能を有する保護基を有するものを使用すれば、上記課題を解決し得ることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は以下の通りである。

( 1 ) PCR用のプライマ一であって、铸型 DNA中の増幅対象領域と相補的に結合する塩基配列からなる相補 DNA部分と、当該相補 DNA部分の 5'末端に連結し且つ前記増幅対象配列と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補 DNA部分とから構成され、当該非相補 DNA部分の塩基配列中の少なくとも 3'末端に相当する塩基が DNAポリメラーゼによる DNA複製の進行を停止させ得る保護基で修飾されていることを特徴とする、前記プライマー。

本発明のプライマ一において、前記保護基としては、例えば、光照射処理、ァルカリ処理、酸処理、酸化処理、還元処理、脱シリル化処理、熱処理、エステラーゼ処理又はホスファターゼ処理により被修飾塩基から脱離し得るものが挙げられる。

ここで、当該光照射処理により被修飾塩基から脱離し得る保護基としては、例えば、 2-(2-ニトロフエニル)プロピル基、 2-(2-ニトロフエニル)プロピルォキシメチル基、 1-(2-二トロフエニル)ェチル基及び 6-二ト口ピぺロニルォキシメチル基が挙げられる。当該アルカリ処理により被修飾塩基から脱離し得る保護基としては、例えば、イソプチリル基、ベンゾィル基及びァセトキシメチル基が挙げられる。当該酸処理により被修飾塩基から脱離し得る保護基としては、例えば、トリチル基又はそのメトキシ誘導体が挙げられる。当該酸化処理により被修飾塩基から脱離し得る保護基としては、例えば、ァリルォキシメチル基、ジメトキシベンジルォキシメチル基又はトリメトキシベンジルォキシメチル基が挙げられる。当該還元処理により被修飾塩基から脱離し得る保護基としては、例えば、ベンジルォキシメチル基、又は任意の置換基により置換されたべンジルォキシメチル基が挙げられる。当該脱シリル化処理により被修飾塩基から脱離し得る保護基としては、例えば、 t-ブチルジメトキシシリルォキシメチル基又は t-ブチルジフエ二ルシリルォキシメチル基が挙げられる。当該熱処理により被修飾塩基から脱離し得る保護基としては、例えば、イソシァネート基が挙げられる。当該エステラーゼ処理により被修飾塩基から脱離し得る保護基としては、例えば、ァセトキシメチル基が挙げられる。当該ホスファターゼ処理により被修飾塩基から脱離し得る保護基としては、例えば、リン酸メチル基が挙げられる。

また、本発明のプライマーにおいて、前記の非相補 DNA部分の塩基配列中の少なくとも 3'末端に相当する塩基としては、例えば、チミン及びグァニンが挙げられる。さらに、本発明のプライマーとしては、前記非相補 DNA部分の塩基長が、例えば 1〜 100塩基であるものが挙げられる。

( 2 ) ( i ) 鍀型 DNAと、上記 (1)のプライマ一とを用いて： PCR反応を行うことにより増幅 DNA断片を得る工程、及び（ i i ) 前記増幅 DNA断片に所定の処理を施すことにより当該断片中の保護基を脱離させる工程を含む、粘着末端を有する DNA断片の調製方法。

本発明の調製方法において、前記所定の処理としては、例えば、光照射処理、アルカリ処理、酸処理、酸化処理、還元処理、脱シリル化処理、熱処理、エステラーゼ処理又はホスファタ一ゼ処理により被修飾塩基から脱離し得る処理が挙げられる。

本発明の調製方法において、前記粘着末端としては、例えば、制限酵素処理により得られる粘着末端と同一の塩基配列からなるもの、又は、制限酵素処理により得られる粘着末端とは異なる塩基配列からなるものが挙げられる。

( 3 ) 上記 (2)の調製方法により得られた DNA断片と、ホスト DNAとを結合させる工程を含む、遺伝子組換え方法。

本発明の遺伝子組換え方法において、前記 DNA断片とホスト; DNAとの結合は、例えば、 DNA結合酵素を用いずに行うことができる。

( 4 ) 下記式（Γ) に示される化合物を含む置換基導入剤。

(1，）

〔式（Γ) 中、 Xは Cl、 I、 Br、 p-トルエンスルホン酸エステル又は硫酸ェステルを表す。〕

( 5 ) 2-(2-二卜口フエニル)プロピルォキシメチル基を有する生体分子。

本発明の生体分子としては、例えば、下記式（I) に示されるものが挙げられ

〔式（I) 中、 IIは生体分子を表す。〕

ここで、生体分子としては、例えば塩基等が挙げられ、具体的にはチミン及びグァニンが挙げられる。生体分子がチミン及びグァニンの場合、本発明の生体分子としては、下記式（II) 及び (III)に示されるものが挙げられる。

図面の簡単な説明

図 1は、本発明の一実施例である、 caged TNPPを用いた LACE-PCR (Light- assisted-cohesive-ending PGR) 法の該略図である。

図 2は、 DNAポリメラーゼによる伸長反応の結果を示す電気泳動（20%変性 PAGE) 写真である。レーン 1は C2のみ（コントロール）、レーン 2は C1 + C2 + Ex Taq (UV照射なし）、レーン 3は Cl + C2 + Ex Taq (UV照射あり）である。反応条件は、 [C1]=[C2]=4 ^ M、 [dNTPs]=100 ^ M、 [Ex Taq]=0.2U/ l、 37°C、 30分である。

図 3は、 LACE-PCR法を用いた組換えべクタ一構築の該略図である。

図 4は、 LACE-PCR法により調製した挿入 DNA断片の構造を示す図である。図 5は、 LACE-PCR法による増幅産物の電気泳動写真である。

図 6は、コロニー PCRの結果を示す電気泳動写真である。

図 7は、組換えベクターの塩基配列分析の結果を示す図である。図 8は、 UV照射による保護基（NPP) の脱保護化の経時変化を示すグラフである。

図 9は、 LACE-PCR法により調製した挿入 DNA断片の構造を示す図である。図 1 0は、 UV照射前後における、 LACE-PCR法による増幅産物の電気泳動写真である。レーン 1は UV照射前、レーン 2は UV照射後である。

図 1 1は、コロニー PCRの結果を示す電気泳動写真である。

図 1 2は、組換えベクターの塩基配列分析の結果を示す図である。（a)は

RI siteを結合させた組換えべクタ一であり、（b)は Hini/ III siteを結合させた組換えべクタ一である。

図 1 3は、 ARCUTによる標的切断部位と使用する pcPNAの塩基配列を示す図である。 aは、 ARCUTにより切断される標的部位周辺の塩基配列を示し、 bは、

ARCUTによる切断時の標的部位周辺の構造を示す。

図 1 4は、 a) ARCUTにより切断した標的フラグメント（ベクター）の構造を示す図である。 b) LACE-PCR法により調製した挿入 DNA断片（インサート）の構造を示す図である。

図 1 5は、 pBR322ベクター上の制限酵素サイトを示す図である。

図 1 6は、 a) ARCUTにより切断した標的フラグメント（ベクタ一）の構造を示す図である。 b) LACE-PCR法により調製した挿入 DNA断片（インサート）の構造を示す図である。

図 1 7は、 coRIや ARCUTによる pBR322ベクターの切断断片のァガロースゲル電気泳動写真である。レーン 1は ^oRIのみで切断、レーン 2は ^oRIで切断した後 ARCUTで切断、レーン Mは 1 kbpラダーマーカ一である。

図 1 8は、本実施例で使用した又は得られた各フラグメントのァガロースゲル電気泳動写真である。レーン 1は ARCUT切断断片 (2530 bp)、レーン 2は LACE- PCR法による増幅産物 (UV照射あり）、レーン 3は組換えべクタ一のみ、レーン 4 は《?RIで切断した組換えベクターである。

図 1 9は、組換えベクターの塩基配列分析の結果を示す図である。（a)は ARCUT siteを結合させた組換えベクターであり、（b)は W RI siteを結合させた組換えベクターである。図 2 0は、 BL21-Gold (DE3)の形質転換体における GFPの発光を示す写真である。

図 2 1は、 GFP-BFP融合タンパク質をコードする DNAを含むベクター構築の概略図である。左図は GFP遺伝子を含む pQBI T7-GFPベクタ一であり、右図は BFP遺伝子を含む pQBI 67ベクターである。

図 2 2は、 BFP遺伝子を含む DNA断片を LACE-PCRで増幅した産物のァガロ一スゲル電気泳動写真である。

図 2 3は、 BL21-Gold (DE3)の形質転換体における GFP-BFP融合タンパク質等の発光を示す写真である。

図 2 4は、 BL21-Gold (DE3)の形質転換体から回収した組換えべクタ一のァガロースゲル電気泳動写真である。

図 2 5は、 GFP-BFP融合タンパク質の蛍光スぺクトルを示す図である。

図 2 6は、 BL21-Gold (DE3)形質転換体で発現しているタンパク質の SDS- PAGE解析の結果を示す電気泳動写真である。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施し得る。なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願 2008 - 061678号（2008年 3月 11日出願）の明細書等の全体を包含する。また、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。

1 . 本発明の概要

図 1に示すように dNTPsと铸型 DNAとの塩基対形成を阻害するような修飾が施されていると（TNPP； 2-(2-ニトロフエニル)プロピル基により修飾（保護）されたチミジン塩基）、 DNAポリメラ一ゼによる伸長反応が阻害されることになり、 5'突出末端を有する DNA断片を容易に作製することができる。得られた DNA断片は、上記修飾（保護）がされたままでは、遺伝子組換え操作に応用することはできないが、 TNPPの保護基である 2-(2-二ト口フエニル)プロピル基

(NPP基）は、光照射により外すことができるため、容易に遺伝子組換え技術等に利用可能なものとなる。本発明者は、この技術を、 PCRの技術と組み合わせて応用することで、遺伝子組換え操作等に用い得るィンサート側の 5'突出末端 (粘着末端）を自在に設計できる方法となることを見出し、本発明を完成した。そこで、本発明者は、一部の塩基に前記修飾を施した様々な PCRプライマーを合成し（例えば、後述する実施例 1中のスキーム 1に示す C1のプライマーを参照）、得られた PCR増幅産物を、その後制限酵素によって処理することなく、そのままィンサートの断片としてベクターに挿入することで、組換えベクターの構築を行った。ところで、 ARCUT (人工的制限 DNAカッター； Yamamoto，Y. et al., Chem. Bio. Chem., vol.7, p.673-677, 2006 を参照）による DNAの切断断片は、その性質上、切断部分の塩基配列が、天然の制限酵素を用いた場合のような配列には決してならないことが知られている。そこで、 AECUTによってべクターを切断し、その切断部分の塩基配列に合うように、本発明の方法を用いてィンサートの DNA断片を調製して、ベクターへの挿入を試みた。従来は、 ARCUT を利用して遺伝子組換え操作を行う場合、インサート断片とベクターとをつなげる際に、互いの隙間を埋めるための Oligojointと呼ばれる断片を別途使用する必要があった。しかし、本発明の方法により調製したインサート断片を用いれば、 Oligojointを使用することなくベクタ一への挿入を極めて容易に行うことができた。これまでにも、任意に所望の突出末端（粘着末端）を有する DNA断片を作製する方法は、いくつか報告されているが、それらはいずれも、 PCR後に特殊な酵素処理が必要なものであった（Aslanidis, C. et al., (1990) Ligation- mdependent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Res" 18， 6069-6074.； Bitinaite, J. et al., (2007) USERTM friendly DNA engineering and cloning method by uracil excision. Nucleic Acids Res. , 35, 1992-2002.； Xin, W. et al., (2003) Construction of linear functional expression elements with DNA and RNA hybrid primers: a flexible method for proteomics., 25, 273-277.； Zhu, B. et al., (2007) In- Fusion™ assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. BioTechniques, 43, 354-359) 。本発明の方法によれば、酵素としては実質的に DNAポリメラーゼのみで所望の突出末端を有する DNA断片を作製することができ、種々の条件等の制限が少ないため、様々な利用及び応用が可能と考えられる。 2 . 粘着末端を有する DNA断片の調製方法

本発明に係る粘着末端を有する DNA断片の調製方法は、下記（ i ) 及び（ i i ) の工程を含む方法である。

( i ) 铸型 DNAと、所定の PCR用プライマーとを用いて； PCR反応を行うことにより増幅 DNA断片を得る工程

( i i ) 前記増幅 DNA断片に所定の処理を施すことにより当該断片中の保護基を脱離させる工程

ここで、上記（ i ) の工程で用いる所定の PCR用プライマーは、前記铸型 DNAの一部である当該铸型 DNA中の増幅対象領域と相補的に結合する塩基配列からなる相補 DNA部分と、当該相補 DNA部分の 5'末端に連結し且つ前記増幅対象配列と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補 DNA部分とから構成されるものであり、当該非相補 DNA部分の塩基配列中の少なくとも 3'末端に相当する塩基が DNAポリメラーゼによる DNA複製の進行を停止させ得る保護基で修飾されていることを特徴とするプライマーである。ここで、当該プライマー中の「非相補 DNA部分」とは、あくまでも、铸型 DNA中の PCRによる増幅対象領域に対して相補的ではない塩基配列からなる部分であればよい。よって、当該「非相補 DNA部分」は、铸型 DNA中の増幅対象領域以外の領域（例えば、増幅対象領域の 5'側又は 3'側に隣接する任意の長さの塩基配列領域）に対して相補的な塩基配列からなる部分であってもよく、限定はされない。

当該プライマ一中、非相補 DNA部分は、最終的に得られる DNA断片の粘着末端の部分（1本鎖 DNAの部分）となる部分である。ここで、当該非相補 DNA部分の塩基長は、特に限定はされないが、例えば 1〜100塩基であり、好ましくは 4 〜20塩基である。特に、本発明の調製方法によれば、得られる DNA断片の粘着末端の塩基長は、通常、制限酵素処理後の粘着末端では生成されない 5塩基以上にすることも容易に可能である。よって、得られる DNA断片の粘着末端は、公知の制限酵素を用いた処理により得られる粘着末端と同一の塩基配列からなるものであってもよいが、公知の制限酵素を用いた処理により得られる粘着末端とは異なる塩基配列からなるものであってもよく、限定はされない。

当該プライマーは、上述した所定の塩基（非相補 DNA部分の塩基配列中の少なくとも 3'末端に相当する塩基）に、 DNAポリメラーゼによる DNA複製の進行を停止させ得る保護基を有する。当該塩基の種類としては、限定はされないが、チミン及びグァニンであることが好ましい。通常、 PCI こおいては、プライマ一中の非相補 DNA部分についても DNAポリメラーゼによる DNA合成過程において相補鎖が合成され DNA複製が進行する。しかし、本発明においては、プライマー中の相補 DNA部分と非相補 DNA部分との境目となる塩基が、上記保護基で修飾されているため、 PCRの DNA合成過程においては、非相補 DNA部分に対する相補鎖は合成されない。よって、得られた DNA断片は、非相補 DNA部分に相当する粘着末端を有するものとなる。

ここで、上記保護基としては、 PCR後に得られた DNA断片から所定の処理により脱離し得るものであればよく、限定はされず、グリーンら（Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley ana Sons、第 2 fe、 1 9 9 1年) に記載の引用文献に従って保護する基が好ましく挙げられる力本発明においては、例えば、光照射処理、アルカリ処理、酸処理、酸化処理、還元処理、脱シリル化処理、熱処理、エステラーゼ処理又はホスファターゼ処理により被修飾塩基から脱離し得る保護基が好ましく挙げられ、中でも、光照射処理（特に UV照射処理が好ましい）、アルカリ処理、酸化処理、還元処理、脱シリル化処理等がより好ましい。よって、ここで列挙した各種処理が、上記（i i ) の工程で行う所定の処理として例示できる。

前記光照射処理（特に UV照射処理が好ましい）の場合は、保護基の種類にもよるが、例えば、 5〜60分照射することが好ましく、より好ましくは 15〜30分である。

以下に、光照射処理により脱離し得る保護基を例示する。破線で囲まれた基が、当該保護基の部分である。

2-(2-ニトロフ Iニル)プロピル基 1- (2 -ニトロフ Iニル)ェチル基これらも可

6-二卜ロピぺロニル才キシメチル基 2 - (2-二卜口フエニル)プロピルォキシメチル基

dGについても上記の保護基がそれぞれ利用可能

(上記構造式は、グァニンに対し、保護基としての

2 - (2-ニトロフエニル)プロピル基が結合したもの）

前記アルカリ処理の場合は、処理試薬として、例えば、濃アンモニア水及び濃ァンモニァ水一メチルァミン混合溶液等が好ましく用いられ、より好ましくは濃アンモニア水である。アルカリ処理は、保護基の種類にもよる力例えば室温で 24時間、または 55°Cで 8時間行うことが好ましく、より好ましくは室温で 24時間である。

以下に、アルカリ処理により脱離し得る保護基を例示する。破線で囲まれた基が、当該保護基の部分である。

イソプチリル基ペンゾィル基

ァセ卜キシメチル基前記酸処理の場合は、処理試薬として、例えば 2%〜50%トリフルォロ酢酸水溶液、 10%〜80%酢酸及び希塩酸等が好ましく用いられ、より好ましくは 2%トリフルォロ酢酸水溶液及び 80%酢酸である。酸処理は、保護基の種類にもよるが、例えば室温で 10分間〜一晚撹拌することが好ましく、より好ましくは室温で 1時間である。

酸処理により脱離し得る保護基としては、例えば、トリチル基及びそのメトキシ誘導体等が好ましく挙げられる。

前記酸化処理の場合は、処理試薬として、例えば、 2,3-ジクロロ- 5，6-ジシァノ -P-ベンゾキノン及びョゥ素等が好ましく用いられ、より好ましくは 2,3-ジク口口- 5,6-ジシァノ -P-ベンゾキノンである。酸化処理は、保護基の種類にもよるが、例えば水溶液中で 2， 3-ジクロロ- 5,6-ジシァノ -P-ベンゾキノンを加えて室温で 1〜数日間撹拌することが好ましく、より好ましくは 10時間の撹拌である。

酸化処理により脱離し得る保護基としては、例えば、ァリルォキシメチル基、が好ましく挙げられる。

前記還元処理の場合は、処理試薬として、例えば、水素ガスと組み合わせる触媒としてパラジウム炭素、ラネー触媒、アダムス触媒及びリンドラー触媒等が好ましく用いられ、より好ましくはパラジウム炭素である。また、水素化ホウ素ナトリウム、シァノ水素化ホウ素ナトリウムも単独で好ましく用いられる。還元処理は、保護基の種類にもよるが、例えば触媒と水素ガスを添加した後室温で一晩から数日反応することが好ましく、より好ましくは一晩の反応である。

還元処理により脱離し得る保護基としては、例えば、ベンジルォキシメチル基、及び任意の置換基により置換されたベンジルォキシメチル基等が好ましく挙げられる。任意の置換基としては、例えば、アルキル基、アルケニル基、ァリール基、ァラルキル基、シクロアルキル基、ァシル基及び複素環基等の置換基に含まれる公知の各種置換基が挙げられる。

前記脱シリル化処理の場合は、処理試薬として、例えば、 1 Mテトラブチルァンモニゥムフルオリド THF溶液及びトリェチルアミン三フッ化水素酸塩等が好ましく用いられ、より好ましくは 1 Mテトラプチルアンモニゥムフルオリド THF溶液である。脱シリル化処理は、 1 Mテトラプチルアンモニゥムフルオリド THF溶液を試料溶液に添加した後、室温で一晩〜数日反応することが好ましく、より好ましくは一晩の反応である。

脱シリル化処理により脱離し得る保護基としては、例えば、以下のものが挙げられ、破線で囲まれた基が、当該保護基の部分である。

t-プチルジメトキシシリルォキシメチル基 t-プチルジフエ二ルシリルォキシメチル基前記熱処理は、保護基の種類にもよるが、例えば、 60— 90 の温度で 10分一 360分加熱することが好ましく、より好ましくは 60°Cで 10分間である。

熱処理により脱離し得る保護基としては、例えば、イソシァネート基（特開 2006-248931参照）等が好ましく挙げられる。

前記エステラーゼ処理は、保護基の種類にもよるが、例えば、豚肝臓エステラーゼと 37°Cで 1時間または一晩反応することが好ましく、より好ましくは 37°C で 1時間の反応である。

エステラーゼ処理により脱離し得る保護基としては、例えば、以下のものが挙げられ、破線で囲まれた基が、当該保護基の部分である。

ァセトキシメチル基

前記ホスファターゼ処理は、保護基の種類にもよるが、例えば、アル力リホスファ夕ーゼと 37°Cで 1時間または一晩反応することが好ましく、より好ましくは 37°Cで 1時間の反応である。

ホスファターゼ処理により脱離し得る保護基としては、例えば、以下のものが挙げられ、破線で囲まれた基が、当該保護基の部分である。

リン酸メチル基本発明において、上述した各種保護基を有する PCR用プライマーの調製方法は、公知の方法'を用いればよく、限定されない。例えば、上述した各種保護基による所望の塩基の保護化は、 5'及び 3'水酸基をァセチル基で保護したチミジンをトシル化合物で活性化し、保護基のアルコール体を作用させる、もしくは、 5'及び 3'水酸基をァセチル基で保護したチミジンにクロロメチル体として活性化した保護基を作用させて行うことができる。

上記（ i ) の工程において、前述した以外の PCRの条件、例えば、反応組成液（踌型濃度、プライマー濃度、バッファーの種類 '濃度、 DNAポリメラ一ゼの種類 ·酵素量等）並びに反応条件（熱変性、アニーリング及び伸長の各反応時間 ·温度、合計サイクル数等）については、公知の知見及び技術常識により適宜任意に設定することができる。，上記（ i i ) の工程においても、脱保護化のための所定の処理は、前述した以外、公知の方法及び条件に基づいて行うことができる。

本発明の調製方法は、上記（ i ) 及び（ i i ) の工程以外に、他の任意の工程を含むものであってもよく、特に限定はされない。

また、本発明においては、前述した保護基としての置換基を導入するための置換基導入剤（すなわち当該置換基となり得る化合物を含む置換基導入剤）を提供することができ、さらには、当該置換基を有する生体分子（すなわち保護化生体分子）を提供することもできる。

具体的には、本発明の置換基導入剤の一態様としては、下記式（Γ) ： (1，）

に示される化合物を含むものが好ましく挙げられる。ここで、式（Γ) 中、 Xは、限定はされないが、 Cl、 I、 Br、 p-トルエンスルホン酸エステル及び硫酸エステルが好ましく式：

に示される Xが CIである化合物（すなわち、 2-[(2-ニトロフエニル) -クロロメトキシ] -プロパン（NPPOM-C1) ) がより好ましい。ここで、 NPPOM-C1は、例えば、後述する実施例 3に記載の方法（スキーム 2参照）に従って合成することができ、さらに NPPOM-C1を用いた置換基の形成についても同スキーム等に従つて行うことができる。また、式（Γ) 中の Xが C1以外の場合の化合物の合成及び置換基の形成についても、 NPPOM-C1の場合を参照し、当業者の技術常識等を用いて実施することができる。上記式（Γ) の化合物により形成される置換基（当該化合物由来の置換基）は、例えば、下記式のように表すことができる（具体的には 2-(2-ニトロフエニルロピルォキシメチル基である。）。

また、本発明の生体分子としては、 2-(2-ニトロフエニル)プロピルォキシメチル基（上記式（Γ) ) を有する生体分子（すなわち、当該基により置換された生体分子）が挙げれ、具体的には、下記式（I) ：

に示されるものが好ましく挙げられる。ここで、式（I) 中、 Rは任意の生体分子を表す。生体分子（R) としては、低分子（塩基、アミノ酸等）及び高分子（ DNA、 RNA、タンパク質等）のいずれであってもよく、また人工的に調製された生体適合分子（PNA等）であってもよいが、例えば、塩基が好ましい。塩基としては、限定はされないが、例えばチミン及びグァニンが好ましく挙げられる。生体分子（R) がチミン又はグァニンの場合、本発明の生体分子としては、例えば、下記式（II) ：

に示されるもの（すなわち、チミンが 2-(2-ニトロフエニル)プロピルォキシメチル基により置換された（保護化された）もの）、又は、下記式（III) ：

に示されるもの（すなわち、グァニンが 2-(2-二トロフエニル)プロピルォキシメチル基により置換された（保護化された）もの）が好ましく挙げられる。 3 . 遺伝子組換え方法

本発明の遺伝子組換え方法は、上述の本発明の調製方法により得られた DNA 断片と、ホスト DNAとを結合させる工程を含む方法である。

ここで、ホスト DNAとしては、特に限定はされず、各種ベクター（発現べク夕一、ウィルスベクター、ファージベクター等）や各種生物ゲノム DNA等、任意の DNAを用いることができる。

前述したように、本発明の調製方法により得られる DNA断片としては、所望により、制限酵素処理では生成し得ない長い塩基長の粘着末端とすることができる。この場合、当該 DNA断片とホスト DNAとの結合は、長い塩基長の粘着末端どうしの結合となるため、リガーゼ等の DNA結合酵素を特に用いなくても、特異性及び結合効率が高く、両者を混合するだけで結合させることが可能となる。よって、本発明は、簡便性、経済性、実用性に優れた遺伝子組換え方法を提供することもできる。

本発明の遺伝子組換え方法は、上述した結合工程以外に、他の任意の工程を含むものであってもよく、特に限定はされない。

本発明の遺伝子組換え方法は、例えば、遺伝子治療や iPS細胞関連で利用されるレトロウィルス及びアデノウィルスベクター等の遺伝子組換えに好適に用いることができる。当該アデノウイルス等は、ゲノム DNAサイズが大きいため、従来の方法では遺伝子組換えに過剰の手間と時間を要していたが、本発明の遺伝子組換え方法によれば、ゲノム全体を適当なサイズに区分けし、それぞれの部位を個別に PCRで増幅して本発明により作製した粘着末端を介してつなぎ合わせることで、容易に遺伝子組換えを行うことができる。

また本発明は、前述した本発明の調製方法により得られた DNA断片を備えた遺伝子組換え用キットを提供することもできる。当該キッ卜は、任意の他の構成要素を含むものであってもよく、例えば、発現ベクター等の各種ベクターや、各種バッファー、滅菌水、保存液、防腐剤、各種反応用容器、使用マニュアル（使用説明書）などが挙げられる。以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

〔実施例 1〕

<LACE-PCR (Light-assisted-cohesive-ending PCR) 法の開発と ARCUTへの応用 >

1 . TNPP による DNAポリメラ一ゼ伸長反応の阻害

図 1に示すように、 DNAポリメラーゼ（以下、本実施例では、単にポリメラ一ゼと言う）による伸長反応が阻害されることを確認するために、下記スキーム 1 中に示す C1及び C2を用いたポリメラーゼの伸長反応を確認した。なお、スキーム 1中の C1〜C6の塩基配列は、それぞれ順に、配列番号 1〜6に示されるものである。スキーム 1

C1 5 ' - AGCT^NPPGTCCGGCGTAGAgG¾TCG¾G -3 ^r (酉己列番号 1 )

3 ' -GCCGCATCTCCTAGCTC-FAM -5 * C2 (配列番号 2)

C3 5 ' - A¾T^NPPT^NPPCACCCTCACCCTOG GCTG -3 ' (配列番号 3)

C4 5 ' - AAT^PT^GTCCGGCGTAGAGGATCGAG -3 ' (酉己列番号 4)

C5 5 · - ATCATCAGT^PaACCCGTNPPCACCGTCACCCTGGATGCTG - 3，（配列番号 5)

C6 5 ' - ACGGG CGTAGAGGATCGAG -3 ' (配列番号 6)

τΝΡΡ

ここで、 CIは、 PCRプライマーとして使用する C2 のテンプレート（铸型 DNA) となっており、 TNPPを 1つだけ有する。 TNPPを有するプライマーの合成法は、先に述べた通りである。 C2の 5'末端は FAMでラベルした。様々なポリメラ一ゼを用いたが、中でも最も結果が明確であった Ex Taq を用いた反応による結果を図 2に示した。図 2中、レーン 3 において C1 は反応開始前に光照射（UV 照射）されたものを用いているが、レーン 1 と比較すると伸長反応は 24 mer まで進んでいることが分かった。しかし、レーン 2 において、伸長反応はレーン 3 ほどは進んでおらず、目的の 20 merのところで止まっていることが確認できた。 C4と C6による伸長反応の阻害も、同様に、目的の部分で伸長反応が止まっていることを確認した (デ一夕は示さず)。これらのことから、 2つのことが結論づけられた。 1つ目は、目的の T^NPP のところでポリメラーゼにょる伸長反応を止めることができるということ、 2つ目は、 TNPP の _caged保護（すなわち NPP基による DNAポリメラーゼ伸長反応からの保護（伸長反応阻害） ) が UV照射によつて効率よく外れるということであった。また、当該伸長反応を止めるためには TNPP は 1つ含まれていれば十分であるということも分かった。

ポリメラーゼの伸長反応が TTダイマ一によって抑制されるということは、従来から知られていることであり、このことを利用し、修飾塩基を 2つ並べたテンプレートを用意して伸長反応を阻害し、光照射によって片方が外れることで伸長反応が促進されたという報告がある（Tang, X. J. et al., (2005) Photoregulation of DNA polymerase I (Klenow) with caged fluorescent oligodeoxynucleotides. Bioorg. Med. Chem. Lett, 15, 5303-5306.) 。そのため、 2つ連続して導入した方が、阻害効率が高まると考えて C3のプライマ一には TNPP を 2つ導入した。本発明の方法によれば、所望の 5'突出末端を有する DNA断片の作製が可能となったので、実際に、所望の合成プライマーと PCR を用いて様々な挿入 DNA断片（インサート）を調製し、一般的な方法でインサートをべクタ一に挿入した。本実施例では、制限酵素 (EcoR や ARCUT により切断したベクターを用いた場合の方法について、その概要を図 3に示した。なお、 ARCUT (人工的制限 DNA力ッ夕一）については "Yamamoto, Y. et al., Chem. Bio. Chem., vol.7, p.673-677, 2006" を参照することができる。

2 . ^oRIによる 1ケ所切断部位への揷入

2-1. &0R1 LACE-プライマーの設計及び合成

ベクター (PUC18)を coRI で切断し、そこに調製したインサートを挿入するために、スキーム 1 に示す C3及び C4の PCRプライマ一を合成した。 C3及び C4 は、 pQBI T7-GFP (Qbiogene； 5115bp (配列番号 9)) の GFP遺伝子及び T7プロモー夕一配列を共に含む塩基配列領域 (121〜： 1170 bp)を増幅でき、増幅産物として得られるインサートは oRI切断断片と相補的な 5'突出末端を持つように設計した（図 4) 。なお、図 4に示したインサートの配列中、 T7-GFPと表示した部分の塩基配列（GFP遺伝子及び T7プロモ一夕一配列を含む；計 1031bp：配列番号 9の塩基配列中の第 131番目〜第 1161番目の塩基からなる）は、配列番号 10 に示した（図 9、図 14b及び図 16bにおいても同じ）。上で述べた通り、阻害効率を高めるために TNPP はそれぞれ 2つずつ導入した。以後、 LACE-PCR に用いたプライマ一を LACE-プライマーとした。 2-2. LACE-PCR産物のベクターへの挿入 (組換えベクターの作製）ベクター (pUC18)側の調製は、公知の一般的な方法で行った。プラスミド DNAの自己環化を防ぐためにホスファタ一ゼによって脱リン酸を行った。インサートを調製する際には、正確性の高い KOD-Plus を PCR のポリメラ一ゼとして用いた。図 5中の PCR後の産物を見ると、 l kbp のところにバンドが見え、問題なく PCRが行い得たことが分かった。その後、光照射により保護基を外し、キナーゼによるリン酸化を行った。この段階で脱保護を行わないとキナーゼがうまく働かない可能性が考えられた。なお、プライマーに初めから 5'末端がリン酸化されたものを用いた場合、この作業は省略可能である。調製したベクターとィンサートをライゲ一シヨンさせ、形質転換させたところ、形質転換体のコロニーが認められたので、コロニー PCR によって陽性（ポジティブ）コロニーを選択した。その結果を図 6に示した。

図 6中、レーン 2及びレーン 15 のポジティブコロニーのプラスミド DNA を抽出して塩基配列を読んだところ、目的の形でインサートが挿入されていることが確認できた (図 7)。 1ケ所切断で導入した場合、インサートの入り方が 2通りあり、レーン 2 はインサートが所望の向きに揷入されたもの、レーン 15 はインサ一卜が逆向きに挿入されたものとなっていることが分かった。また、片側では GAATTGという配列で挿入されており ^oRIにより認識される切断部位が 1ケ所つぶれたことが分かった。制限酵素サイトをつぶすことができることも、この方法の特徴であり、有用性及び実用性に優れたものである。

このことから、 LACE-PCR によって調製したインサートをべクタ一に正確に挿入し、組換えベクターが作製できることが示された。 3 . HPLC による LACE-プライマーの評価

UV照射によってどれくらい caged化合物（NPP基によって保護された塩基 (T) を有する DNA) が脱保護されるかを評価するため、 C3及び C4 を UV照射し、それぞれを RP-HPLC で分析した。その結果を図 8に示した。この際、検出波長を 260 nm としていたため、保護基である NPPが外れたものと、外れていないものとで、吸光係数が異なるので存在比とピーク面積比がずれる可能性が考えられた。しかし、 UV照射前後での総ピーク面積がそれほど違わなかったため、吸光係数の違いは無視できる範囲であると考えて割合を算出した。図 8のグラフから、 l h の UV照射によって 90%以上の NPPが脱保護されたことが分かつた。これにより、 l hの UV照射によって十分量の caged脱保護が進んだと考えられる。 2つの脱保護が 90%進んだと仮定すると、 80%は目的のものができた' と考えられる。

PCR の条件は、 90°C に加熱するなど比較的過激な条件となっているため、 NPP が熱によって脱離される可能性があった。そこで、 C3 を； PCR と同条件でインキュベーションした後、 HPLC で分析したところ、保護基である NPP が 2つとも脱離されたものが 7.7%、 1つ脱離されたものが 18.9%、脱保護されなかったもの力 73.4%となっている。つまり、 3'側の NPPが脱離せずに残ったものは、約 85%と考えられた。 PCRではプライマーを 2つ用いるので、目的の位置の塩基が caged保護されている確率は 70%であつた。

以上の 2つの要素から、 NPP保護を用いた場合、目的の 5'突出末端を持った PCR産物が得られる確率は、 50~60%程度と考えられた。

4. ^οΜ-^ίΓ ίΛΠによる 2ケ所切断部位への揷入

4-1. EcoRl- indlll LACE-プライマーの設計及び合成

前述の通り、 1ケ所切断の系では遺伝子組換え操作を成功したので、次に 2ケ所切断の系も挿入できるかどうかを試みた。基本的には、 1ケ所切断の系と同様の方法で行った。 LACE-プライマ一として C1 を用いて Himflll突出末端を持つようにした。また、《?RI突出末端を得るため C3 を用いた。このとき、

LACE-プライマーの中には 1つしか caged保護がないが、これにより、 PCR の条件下において、 1つの caged保護によってポリメラ一ゼ伸長反応が止まるかどうかについても同時に調べた。目的の通りに反応が成功すると、図 9 に示すようなィンサー卜が得られる。

4-2. LACE-PCR産物のベクターへの揷入（組換えベクターの作製) 基本的な手順は前記 2.項の記載と同様にして行った。 pUCl8 を Hinrfinによつて 37°C、 4 h反応させた後、さらに coRI によって 37°C、 16 h反応させて 2ケ所切断したベクター側を調製した。 C1 と C3 を LACE-PCR のプライマ一に用いることで、インサート側を調製した (図 10, レーン 2)。また、レーン 1より調製したインサートは UV照射によって切断のような目に見える損傷は起こつていないことが確認できた。調製したィンサー卜とベクターとをライゲーシヨンし、形質転換をしたところ、確認された形質転換体のコロニーは 6個と少なかつたが、そのうち 2個のコロニーがコロニー PCRでポジティブであった (図 11 のレーン 2， 3)。ポジティブであった形質転換体のプラスミド DNA を抽出して塩基配列を確認したところ、目的の形でインサートが挿入できていたことが分かつた (図 12)。これにより、 2ケ所切断の系においても、十分応用可能であることが確認できた。また、この PCR の条件において、 caged保護は 1つで十分であるということも示された。 5 . ARCUTによる 1力所切断部位への挿入

5-1. ARCUT LACE-プライマーの設計及び合成

前述の通り、天然の制限酵素でベクターを切断した系に関しては 1力所切断及び 2ケ所切断の両方の系において、 LACE-PCRで調製したィンサートを導入することに成功した。この方法による最大の特徴として好きな配列を持った突出末端を作ることができるということで、 ARCUT切断後に生じる天然には存在しない突出末端と直接ライゲーシヨンすることができるのではないかと考えた。そこで、 pBR322 (夕カラバイオ株式会社； 4361bp (配列番号 7)： GenBank Accession No. J01749) を ARCUTで一力所切断した系にィンサ一トを直接揷入することを試みた。図 13a に示すように ARCUT の標的切断部位は pBR322の 1830 bp付近にした。使用した pcPNA (擬似相補性ペプチド核酸）も同様に図 13aに示した。 ARCUT によるベクターの切断は、図 13b中に示す矢印のところのいずれかで起こるが、今回は青い矢印（両鎖とも、図 13bに示された 5本の矢印のうち右から 2番目の矢印）のところで起こった切断によって生じるベクター断片 (図 14a)をターゲットとした。なお、図 14aに示したベクター断片中、中間の pBR322と表示した部分の塩基配列（計 2501bp：配列番号 7の塩基配列中の第 1850番目〜第 4350番目の塩基からなる）は、配列番号 8に示した（図 16aにおいても同じ）。そこで、図 14b に示す突出末端を持つようなインサート断片を作製するように、前記スキーム 1の C5及び C6の: PCRプライマーを設計し、前述の 2-1.項の方法と同様に、 pQBI T7-GFPを铸型として PCR、及び光照射を行い、所望のインサート断片 (図 14b)を合成、精製した。ここで、プライマーの設計に非常に重要な点を一つ述べる。 ARCUT の突出末端は非常に長いため、 LACE- PCRで用いるプライマーもそれに応じて長くなる。このとき 2つのプライマーは相補的な配列を含むことになり、プライマーダイマーを形成しやすくなる。そこで、 C5及び C6のように、互いに相補的な部分にあえて TNPP を導入することでプライマ一どうしの相互作用を阻害し、プライマーダイマーを形成しないように設計を行った。

5-2. pBR322の ARCUTによる 1ケ所切断、及び切断断片の精製

スーパーコイルの pBR322 を ARCUTにより切断した断片を、ゲル精製し、線状化された断片を得た。さらに PNA と相補的な oligoDNA を過剰に加えて PNA 除去を行い、その後、ホスファタ一ゼ処理を行って脱リン酸化した。

5-3. IACE-PCR産物のベクターへの挿入 (組換えベクターの作製）

設計した通りに LACE-PCR でインサートが増幅されたことが確認されたので、 caged脱保護後にキナーゼ処理をし、 ARCUTにより線状化したベクターへの挿入を試みたが、結論から言うとこの系は全てうまくいかなかった。その主な原因として挙げられるのは突出末端が長いために、制限酵素で 1力所だけ切断した系と比較すると自己環化が起きやすくなつているからだと考えられる。インサートの量をベクターの 50 当量から 200 当量まで増やしてライゲーシヨンを行った力いずれの場合にもコロニー PCRでポジティブのものは得られてこなかった。また、ライゲーシヨン反応無しで大腸菌に形質転換した場合もコロニーが増えてきたことから、この系はライゲーション反応無しでも十分挿入することが可能であると考えられた。 6 . ^¾?RI-ARCUTによる 2ケ所切断部位への揷入

6- 1. oRI-ARCUT LACE-プライマーの設計

により線状化した pBR322 を 1830bp付近で ARCUT によって切断することで、 1830 bp と 2530 bp の 2つの断片が得られる。このうち 2530 bp の断片は、薬剤耐性遺伝子（Amp) と複製起点（ori) を持っているためベクターとしての働きを有するものであった（図 15) 。そこで、これまでに合成した C3 と C6 を LACE-プライマーとして用いることで、図 16bに示すような突出末端を有する断片を作製し、図 16aに示す ARCUT切断断片にインサートを挿入することを行った。

6-2. pBR322の ^oRIと ARCUTによる 2ケ所切断、及び切断断片の精製

により線状化した pBR322を、さらに ARCUTによって切断し、前記 4-2. 項と同様にして精製した。図 17に、 pBR322の切断後の電気泳動の結果を示した (レーン 1： ^coRIのみで切断、レーン 2： oRI及び ARCUTで切断）。

6-3. LACE-PCR産物のベクターへの挿入 (組換えべクタ一の作製）

設計した通りに LACE-PCR でィンサー卜が増幅されたことが確認されたので、 caged脱保護後にキナーゼ処理をし、前記 5-2.項で調製したベクター側とインサ —卜とを、 1： 40の比となるように混合し、ライゲ一シヨンした後に、 DH5 aに導入して形質転換した。コロニーの生成が確認されたので、これまでと同様にコロニー PCR を行い、ポジティブコロニ一のプラスミド DNAを抽出し、 EcoRiで 1力所切断し抽出してきたプラスミド DNAの大きさを確認した (図 18, レーン 4)。前述した方法と同様にして当該プラスミド DNAの塩基配列を確認したところ、図 19に示した通り、 A oE Iにより切断した部分も ARCUTにより切断した部分も、目的の位置でラィゲ一ションが行えたことが分かつた。

さらに、 T7 RNAポリメラーゼを持った BL21-Gold (DE3)に当該プラスミドを導入して形質転換させたところ、 GFPが発現することも確認できた（図 20) 。 7 . まとめ及び考察

本実施例をまとめると、ポリメラーゼは、 caged保護した DNA をテンプレー卜としたときに、保護基がついた塩基より先には伸長反応（相補鎖合成反応）を起こすことはできず、任意の 5'末端突出構造が形成された。 caged保護は UV 照射によって容易に脱保護することができるため、遺伝子組換え技術にもこのことを応用し、 caged保護された DNA をプライマ一として用いて； PCR を行うことで自由に 5'突出末端を調製することに成功した (LACE-PCR)。 LACE-PCRによって調製したィンサ一トを制限酵素処理したベクター及び ARCUT 処理したベクターに挿入することに成功した。このことにより、 ARCUT の挿入断片に Oligojointを用いることなく目的の位置でライゲーシヨンを行うことに成功した。この技術の確立により、例えば ARCUT を用いた遺伝子工学への応用が可能と考えられた。また、近年、細菌のゲノムを一から化学合成することに成功した力この際にも特定の突出末端を作製するという点が一つのキーポイントとなっていた。本発明の方法を応用することで遺伝子合成、 DNA-overhang cloning(DOC) などが可能になると考えられた。

〔実施例 2〕

< LACE-PCR法を利用したリガーゼを用いない遺伝子組換え（ Ligation-

Indepenaent Cloning)

1 . GFP遺伝子を含むプラスミドへの揷入による GFP-BFP遺伝子の作製

粘着末端がある程度長い断片同士を用いた場合、大腸菌の修復機構を利用してライゲーション無しに形質転換を行うことができることが知られている。 10塩基前後の長い粘着末端を有する LACE-PCRで増幅した、 pQBI T7-GFPベクター (Qbiogene； 5115 bp (配列番号 9)；図 21左）の全長と、同じく LACE-PCRで増幅した、 pQBl 67ベクター（Qbiogene； 6361 bp；図 21右）中の BFP断片とを結合し、 GFP-BFP融合タンパク質をコードする新たなベクターを構築した（図 21 参照）。

2 . LACE-プライマーの設計及び合成 2-1. pQBI-T7 GFPベクタ一増幅用プライマー

PQBI-T7 GFPベクターの全長を LACE-PCRで増幅するため、以下に示す C7 及び C8の PCRプライマ一を合成した。

C7 5 ' -PACCGCCACCT^NPPCCGTTGTACAGTTCATCCATGCC - 3 ' (配列番号 11) C8 5 ' -pAGGATCCGGCT^NPPGCTA¾CAAAGCCCGAA¾GGAAGC - 3 ¹ (配列番号 12)

C7及び C8は、 pQBI T7-GFPベクタ一のうちの第 314番目〜第 328番目の塩基を除いた塩基配列全領域を増幅するプライマ一である。この除かれる領域に GFP遺伝子の終止コドンが含まれているため、外来タンパク質の遺伝子を含む DNA 断片が挿入されると GFP との融合タンパク質が翻訳（生成）される。 LACE-PCR により粘着末端となるプライマーの TNPPより 5'側には、グリシンリンカ一をコードする 9塩基（C7) 又は pQBI T7-GFPの第 315番目〜第 324 番目の塩基と同一の 10塩基（C8) を付加した。 2-2. BFP遺伝子増幅用プライマー

pQBI 67ベクターにコードされた BFP遺伝子を LACE-PCRで増幅するため、以下に示す C9及び C10の PCRプライマ一を合成した。

C9 5 , - pAGCCQGATCCT^NPPCAGTTQTACAQTTCATCCATGCC - 3 ' (配列番号 13) C10 5 ' -pAGGTGGCGGT^NPPGGCAAAGGAGAAGAACTCTTCACTGG - 3 ¹ (配列番号 14)

C9及び C10は、 pQBI 67ベクターのうち第 335番目〜第 1035番目の塩基からなる BFP本体をコードする塩基配列領域（701 bp ;配列番号 15) を増幅するブライマ一である。 LACE-PCRにより粘着末端となるプライマーの TNPPより 5'側には、グリシンリンカ一をコードする 9塩基（C10) 又は pQBI T7-GFPの第 315番目〜第 324番目の塩基と同一の 10塩基（C9) を付加した。

2-3. LACE-PCR 前記プライマーを用いた LACE-PCR を行った。 C7及び C8 を用いたベクタ一断片の増幅には市販されている Pfu ultra, C9及び CIOを用いた BFPィンサ一トの増幅には Pfu turboを PCRのポリメラ一ゼとして使用した。 PCR後、メチル化された DNAを消化する Dpn Iで 37°C—晚処理した後、市販のキットを用いて増幅された断片を簡易精製し、それぞれの断片の水溶液（TE 緩衝液）を得た。次いで、 UV照射により、 NPP保護基の脱保護を行った。増幅した断片のァガロース電気泳動結果を図 22 に示した。レーン 1 に流した増幅断片は、 200 bpごとのラダーの 600 bpの断片と 800 bpの断片との間にバンドが観察され、設計通り 710 bpの断片が増幅していることが確認された。

2-4. LACE-PCR産物を用いた大腸菌の形質転換

ベクター断片 50 ng、 BFPインサート 24 ng (mole換算で約 3当量。全量 2 L ) に相当するそれぞれの溶液を混合した後、 37°Cで 1 h保温し、ライゲーシヨン反応を行わずに JM109大腸菌株の溶液に加え形質転換を行った。この大腸菌液をカルペニシリン 50 gのプレートでー晚培養した結果、 6個のコロニーを得た。コロニー PCRを行い、 5個のコロニーが目的の組換え体であることを確認した。それぞれを液体培養してプラスミドを抽出した後、これらを BL21(DE3)株に形質転換した。カルべニシリン 50 x gプレートで培養した結果、生えたコロニーは暗緑色蛍光を発した。図 23にこの大腸菌の蛍光の色を示した。「UT」の二文字が本実施例で作製した組換え体の蛍光であり、蛍光の色は GI 遺伝子のみをもつ「L」の文字、 BFPの遺伝子のみをもつ「ACE」の文字のどちらとも異なるものであった。

2-5. 組換えベクターが設計通り構築されているかどうかの確認

抽出したプラスミドを制限酵素で切断し、長さが正しいことを確認した。ァガロースゲル電気泳動の結果を図 24に示す。 Eco RIで処理して直鎖にした抽出したプラスミド（レーン 2) は、明らかに LACE-PCRで増幅したベクタ一断片（レーン 1, 5125 bp) よりも泳動度が遅く、正しく BFP断片が挿入されていることがわかる。このことは Eco RIに加えて Nhe Iの 2力所で切断したレーン 3でも予想される 1862 bp及び 3975 bpのバンドが明瞭に観察されることでも確認できた。

2-6. 組換えベクターにより発現されるタンパク質の確認

組換えベクターにより発現した夕ンパク質が正しく GIT-BFP融合夕ンパク質であることを確認するため、形質転換した大腸菌を液体培養した後、溶菌処理を行った。溶菌液の蛍光を測定した結果、 BITに由来する 448 nm及び GFPに由来する 504 nmの両方の蛍光ピークが確認された（図 25) 。また、溶菌液を SDS- PAGEで解析したところ、 BFP (26.9 kDa) とも GFP (26.9 kDa) とも異なる 50 kDa前後の新たなタンパク質（GP -BFP融合タンパク質； Fusion) が強く発現していることが確認された（図 26) 。

〔実施例 3〕

ぐ 2-(2-二トロフエニル)プロピルォキシメチル基で保護したチミン及びアミダイ卜モノマーの合成 >

2-(2-二トロフエニル)プ口ピルォキシメチル基で保護したチミン導入用のアミダイトモノマ一は、下記スキーム 2に従って合成した。

スキーム 2

4 (NPPOM-CI) q,

9 スキーム 2中の各化合物（化合物 2〜9) の合成は、具体的には、以下のようにして行った。

2-(2-ニトロフエニル)プロパノール（化合物 2)の合成

TritonB (40% MeOH溶液） (17 g)の中に、化合物 1の 2-ェチル二ト口べンゼン（6,0 g, 40 mmol)と (HCHO)_n (1.5 g, 40mmol)を加え、 7時間加熱還留させた。溶媒を留去させた後、酢酸ェチルに再溶解し、有機層を 5%塩酸で洗浄する。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、シリカゲルクロマトグラフィでへキサン：酢酸ェチル（3:1) を展開溶媒として精製し、赤紫色の油状の目的物（化合物 2) を 1.95 g (10.7 mmol, 収率 27%)得た。

NWIR (CDCI₃) S= 1.34 (3H, d, CH₃) , 3.50—3.58 (1Η, m, CH), 3.77-3.86 (2H, m, CH₂), 7.36 (1H， t， Ar— H)， 7.50 (1H， d, Ar-H) , 7.58 (1H, t， Ar-H) , 7.76 (1H， d， Ar-H) 2-『 -ニトロフエニル) - (メチルチオ)メトキシ 1-プロパン（化合物 3)の合成

化合物 2 (1.95 10.7mmol) を 20 mLの THFに溶解し、窒素雰囲気下、 0°C で冷却、撹拌しながら水素化ナトリウム (60%) (0.6 g)を加えた。 45 分間撹拌した後、ヨウ化ナトリウム (1.62 g, 10.7 mmol)を加え、次いでクロロメチルメチルスルフィド (C1CH₂SCH₃ ; 1.29 g， 13.35 mmol) を加えた。 4時間氷冷しながら撹拌した後、室温に戻し、次いで溶媒を留去した。 30 mL の水を加え、エーテルで抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、シリカゲルクロマトグラフィでジクロロメタンを展開溶媒として精製し、茶色油状の目的物（化合物 3) を 1.32 g (5.43 mmol, 収率 50%)得た。

^]W NMR (CDCI₃) 5=1.36 (3H， d, CH₃), 2.00 (3H， s， CH₃), 3.63-3.76 (3H, m， CH, CH₂), 4.58 (2H, d, CH₂)， 7.34 (1H, t, Ar-H) , 7.52 (2H, m, Ar-H) , 7.75 (1H， d, Ar-H)

2-IY2-ニトロフエニル) -クロロメトキシトプロパン（化合物 4)の合成

化合物 3 (1.32 g, 5.43 mmol)をジクロロメタン 20 mLに溶解し、窒素雰囲気下 0°Cで撹拌しながら S0₂C1₂ (0.94 g, 6.96 mmol)を加えた。 4時間氷冷化で撹拌し、室温に戻した後に過剰の S0₂C1₂を減圧留去した。反応は定量的で、得られた化合物（化合物 4) はこのまま精製せずに次の反応に用いた。

，H國 R (CDCI₃) 5=1.37 (3H, d, CH₃)， 3.66 (1H, m, CH), 3.81 (2H, m， CH₂), 5.43 (2H, q, CH₂) , 7.36 (1H, t, Ar—H), 7.48 (1H, d, Ar-H) , 7.57 (1H, t, Ar-H) , 7.76 (1H, d, Ar-H) チミジンアセテート（化合物 5)の合成

窒素雰囲気下、チミジン（2.93 g, 12.1 mmol) と DMAP (40 mg, 0.327 mmol) を 60 mL の無水酢酸に溶解し、 30 mLの乾燥ピリジンを加えて室温でー晚撹拌した。ピリジンおよび無水酢酸を減圧留去し、 100 mLのクロ口ホルムを加え、有機層を水 100 mLで洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、シリカゲルクロマ卜グラフィでへキサン：酢酸ェチル（1:3) を展開溶媒として精製し、 2.82 g (8.64 mmol, 収率 71%)の目的物（化合物 5) を得た。

H NMR (CDCI₃) (5=1.94 (3H, s, CH₃), 2.10-2.22 (8H, m, XCH₃, CH₂), 2.46 (1H， m， CH), 4.36 (2H, dd, CH₂), 5.22 (1H, d, CH), 6.32 (1H, q, CH) , 7.29 (1H, s， CH), 8.65 (1H， s， NH)

3-Aq2-(2-ニトロフエニル) -プロピルォキシメチル 1 チミジンァセテ一卜 (化合物 6)の合成

化合物 5を 20 mLの DMFに溶解し、炭酸セシウムを加えて室温で 1時間撹拌した。次いで溶液を氷冷して DMFに溶かした化合物 4 (1.26 g, 5.47 mmol)を滴下した。溶媒を減圧留去した後、酢酸ェチルを加えた。有機層を 30 mLの水で 2 回、飽和炭酸水素ナトリウム水で 1回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去し、シリカゲルクロマトグラフィでへキサン：酢酸ェチル (1:2) を展開溶媒として精製し、 1.50 g (2.89 mmol, 収率 52%)の目的物（化合物 6) を得た。

^]W NMR (CDC 1₃) «5=1.31 (3H, dd, CH₃), 1.93 (3H, d, CH₃), 2.11 (8H, m, 2XCH₃, CH₂), 3.57 (1H, m, CH), 3.74-3.88 (2H, m, CH₂), 4.25 (1H， s, CH) , 4.34 (2H， (n, CH₂), 5.21 (1H, d， CH), 5.36 (2H, m, CH₂), 7.28 (1H, s， CH), 7.31 (1H， t, Ar-H), 7.46 (1H, d， Ar-H), 7.51 (1H, t, Ar— H), 7.71 (1H, t, Ar-H) 3-i\^2-(2-ニトロフエニル) -プロピルォキシメチル 1 チミジン（化合物 7)の合成化合物 6(1.50 g, 2.89 mmol)をメタノール 20 mLに溶解し、濃アンモニア水 8 mLを加え、室温で 1時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、目的物（化合物 7) を定量的に得た。

¹H NMR (CDCI₃) (5=1.31 (3H, d, CH₃), 1.90 (3H, d, CH₃)， 2.31-2.42 (2H, m, CH₂)， 3.55-3.65 (1H, m, CH) , 3.75-3.95 (4H, m, 2 CH₂), 3.97 (1H, q, CH), 4.55 (1H, m, CH) , 5.34 (2H, m, CH₂)， 7.31 (1H， t, CH), 7.43 (2H， t, 2XAr-H), 7.52 (1H, t， Ar-H) , 7.70 (1H, dd, Ar-H)

3-i\ 2-(2-ニトロフエニル) -プロピルォキシメチル 1 チミジンジメトキシトリチルエーテル (化合物 8)の合成

化合物 7 (1.26 g, 2.89 mmol)と塩化ジメトキシトリチル (1.19 g, 3.51 mmol) をピリジン 20 mLに溶解し、窒素雰囲気下、室温で一晩撹拌した。溶媒を減圧留去し、残渣を酢酸ェチル 30 mLに溶解した。飽和食塩水で有機層を洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した。シリカゲルクロマトグラフィで 3%トリェチルァミン含有へキサン：酢酸ェチル（1:1) を展開溶媒として精製し、 1.31 g (1.77 mmol, 収率 61%)の目的物（化合物 8) を得た。

】H 隱 (CDCI₃) δ=].31 (3Η, d, CH₃), 1.92 (3H, d, CH₃) , 2.28-2.50 (2H, m, CH₂), 3.56 (1H， m， CH), 3.76-3.90 (10H, m， 2XCH₂， 2XCH₃), 3.92 (1H, m， CH), 4.56 (1H, m, CH), 5.37 (2H, m, CH₂), 6.16 (1H, d, CH) , 6.84 (4H, d, 4XAr-H), 7.17 (3H, d, 3 x Ar-H), 7.27-7.36 (7H, m， 6XAr—H, CH) , 7.36 (1H, d, Ar-H) , 7.47 (1H, d, Ar-H), 7.51 (1H, q, Ar-H) , 7.71 (1H， d， Ar - H)

ESI -WIS [M+Na]⁺ m/z= .8 3-Λ^2-(2-ニトロフエ二ル)-プロピルォキシメチル 1 チミジンホスホルアミダイ卜（化合物 9)の合成

化合物 8 (0.30 g, 0.406 mmol)を窒素雰囲気下で 2 mLの乾燥ァセトニトリルに溶解した。ジイソプロピルエヂルァミン、 2-シァノエチル -ジイソプロピル-クロロホスホルアミド（200 L， 0.912 mmol)を加え室温で、 1時間半撹拌した。溶媒を減圧留去し、飽和炭酸水素ナトリゥム水と酢酸ェチルを加えて有機層に抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥して溶媒を減圧留去した。 3 %トリェチルァミン含有クロ口ホルム：メタノール (20:1)を展開溶媒としてシリカゲルクロマトグラフィで精製し、 0.25 g (0.26 mmol, 収率 65%)の目的物（化合物 9) を得た。

ES I - S [M+Na] ⁺ m/z= \. 7 産業上の利用可能性

本発明によれば、粘着末端を有する所望の 2本鎖 DNA断片が、 PCR後の増幅産物（増幅断片）から制限酵素処理を介さずに直接的かつ容易に得られる、 DNA断片の調製方法提供することができる。また、本発明によれば、当該調製方法に用い得る新規な PCRプライマーを提供することができる。さらに、本発明によれば、当該調製方法により得られる DNA断片を用いた、遺伝子組換え方法を提供することができる。

本発明の調製方法によれば、粘着末端を有する 2本鎖 DNA断片として、制限酵素処理により得られる粘着末端と同一の塩基配列からなる粘着末端を有する DNA断片であっても、制限酵素処理により得られる粘着末端とは異なる塩基配列からなる粘着末端を有する DNA断片であっても、いずれも容易に得ることができる。ここで、後者の DNA断片としては、粘着末端部分（1本鎖 DNAの部分 ) の塩基長は、 PCRプライマー中の铸型 DNAと結合しない部分の塩基長を任意に設計することで、所望の長さとすることができ、特に制限がない。そのため、ホスト DNAとの結合に関し、特異性や結合効率を所望のレベルに向上させた DNA断片を調製することも容易に可能である。また、例えば、粘着末端部分の塩基長の長い DNA断片を遺伝子組換えに用いた場合、ホス卜 DNAとの結合に際し、従来のようにリガーゼ等の DNA結合酵素を使用しなくても、当該 DNA断片とホス卜 DNAとを混合するだけで互いに結合し得る反応を行うこともできる。よって、本発明は、簡便性、経済性、実用性に優れた遺伝子組換え方法を提供することもできる。配列表フリーテキス卜

配列番号 1 ：合成 DNA

配列番号 1 ： tは 2-(2-ニトロフエニル)プロピル基（NPP基）基で修飾されている（存在位置 4) 。

配列番号 2 ：合成 DNA

配列番号 3 ：合成 DNA

配列番号 3 ： tは 2-(2-ニトロフエニル)プロピル基（NPP基）基で修飾されている（存在位置 3) 。

配列番号 3 ： tは 2-(2-ニトロフエニル)プロピル基（NPP基）基で修飾されている（存在位置 4) 。

配列番号 4 ：合成 DNA

配列番号 4 ： tは 2-(2-ニトロフエニル)プロピル基（NPP基）基で修飾されている（存在位置 3) 。

配列番号 4 ： tは 2-(2-ニトロフエ二リレ)プロピル基（NPP基）基で修飾されている（存在位置 4) 。

配列番号 5 ：合成 DNA

配列番号 5 ： tは 2-(2-ニトロフエニル)プロピル基（NPP基）基で修飾されている（存在位置 9) 。

配列番号 5 ： tは 2-(2-ニトロフエニル)プロピル基（NPP基）基で修飾されている（存在位置 16) 。

配列番号 6 ：合成 DNA

配列番号 6 ： tは 2-(2-ニトロフエニル)プロピル基（NPP基）基で修飾されている（存在位置 8) 。

配列番号 6 ： tは 2-(2-ニトロフエニル)プロピル基（NPP基）基で修飾されている（存在位置 16) 。

配列番号 7 ：クローニングベクター pBR322

配列番号 8 ：クローニングベクター pBR322

配列番号 9 ：クローニングベクター pQBI T7-GFP

配列番号 1 0 ：クローニングベクタ一 pQBI T7-GFP

配列番号 1 1 ： tは 2-(2-ニトロフエニル)プロピル基（NPP基）基で修飾されている（存在位置 10) 。

配列番号 1 2 ： tは 2-(2-ニトロフエニル)プロピル基（NPP基）基で修飾されている（存在位置 11) 。

配列番号 1 3 ： tは 2-(2-ニトロフエニル)プロピル基（NPP基）基で修飾されている（存在位置 11) 。

配列番号 1 4 ： tは 2-(2-ニトロフエニル)プロピル基（NPP基）基で修飾されている（存在位置 10) 。

配列番号 1 5 ：クローニングベクタ一 pQBI67 (BF 遺伝子）

Claims

請求の範囲 PCR用のプライマーであって、

踌型 DNA中の増幅対象領域と相補的に結合する塩基配列からなる相補 DNA 部分と、当該相補 DNA部分の 5'末端に連結し且つ前記増幅対象配列と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補 DNA部分とから構成され、当該非相補 DNA部分の塩基配列中の少なくとも 3'末端に相当する塩基が DNAポリメラーゼによる DNA複製の進行を停止させ得る保護基で修飾されている

ことを特徴とする、前記プライマ一。

前記保護基は、光照射処理、アルカリ処理、酸処理、酸化処理、. 還元処理、脱シリル化処理、熱処理、エステラーゼ処理又はホスファターゼ処理により被修飾塩基から脱離し得るものである、請求項 1記載のプライマー。

前記光照射処理により被修飾塩基から脱離し得る保護基が、 2-(2-ニトロフェニル)プロピル基、 2-(2-ニトロフエニル)プロピルォキシメチル基、 1-(2-二トロフエニル)ェチル基、 6-ニトロピぺロニルォキシメチル基である、請求項 2記載のプライマー。

前記アルカリ処理により被修飾塩基から脱離し得る保護基が、イソプチリル基、ベンゾィル基又はァセトキシメチル基である、請求項 2記載のプライマ一。

前記酸処理により被修飾塩基から脱離し得る保護基が、トリチル基又はそのメトキシ誘導体である、請求項 2記載のプライマー。

前記酸化処理により被修飾塩基から脱離し得る保護基が、ァリルォキシメチル基、ジメトキシベンジルォキシメチル基又はトリメトキシベンジルォキシメチル基である、請求項 2記載のプライマー。

前記還元処理により被修飾塩基から脱離し得る保護基が、ベンジルォキシメチル基、又は任意の置換基により置換されたべンジルォキシメチル基である、請求項 2記載のプライマー。

前記脱シリル化処理により被修飾塩基から脱離し得る保護基が、 t-プチルジメトキシシリルォキシメチル基又は t-プチルジフエニルシリルォキシメチル基である、請求項 2記載のプライマ一。

9. 前記熱処理により被修飾塩基から脱離し得る保護基が、イソシァネート基である、請求項 2記載のプライマ一。

10. 前記エステラーゼ処理により被修飾塩基から脱離し得る保護基が、ァセトキシメチル基である、請求項 2記載のプライマー。

1 1. 前記ホスファターゼ処理により被修飾塩基から脱離し得る保護基が、リン酸メチル基である、請求項 2記載のプライマ一。

12. 前記非相補 DNA部分の塩基配列中の少なくとも 3'末端に相当する塩基が、チミン又はグァニンである、請求項 3〜 1 1のいずれか 1項に記載のプライマー。

13. 前記非相補 DNA部分の塩基長が、 1〜： 100塩基である、請求項 1記載のプライマ一。

14. ( 1 ) 铸型 DNAと、請求項 1〜13のいずれか 1項に記載のプライマーとを用いて PCR反応を行うことにより増幅 DNA断片を得る工程、及び

を含む、粘着末端を有する DNA断片の調製方法。

15. 前記所定の処理が、光照射処理、アルカリ処理、酸処理、酸化処理、還元処理、脱シリル化処理、熱処理、エステラーゼ処理又はホスファタ一ゼ処理により被修飾塩基から脱離し得るものである、請求項 14記載の方法。

16. 前記粘着末端が、制限酵素処理により得られる粘着末端と同一の塩基配列からなる、請求項 14記載の方法。

17. 前記粘着末端が、制限酵素処理により得られる粘着末端とは異なる塩基配列からなる、請求項 14記載の方法。

18. 請求項 14〜1 7のいずれか 1項に記載の方法により得られた： DNA断片と、ホスト DNAとを結合させる工程を含む、遺伝子組換え方法。

19. 前記結合が、 DNA結合酵素を用いずに行うものである、請求項 18記載の方法。下記式（Γ) に示される化合物を含む置換基導入剤。

(1，）

2-(2-ニトロフエニル)プロピルォキシメチル基を有する生体分子。

下記式（I) に示されるものである、請求項 2 1記載の生体分子。

〔式（I) 中、 Rは生体分子を表す。〕

前記生体分子が塩基である、請求項 2 1又は 2 2記載の生体分子。

前記塩基がチミン又はグァニンである、請求項 2 3記載の生体分子。下記式（II) ：

に示されるものである、請求項 2 4記載の生体分子。