WO2009112149A2 - Verfahren zur reinigung therapeutischer proteine - Google Patents

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WO2009112149A2
WO2009112149A2 PCT/EP2009/001313 EP2009001313W WO2009112149A2 WO 2009112149 A2 WO2009112149 A2 WO 2009112149A2 EP 2009001313 W EP2009001313 W EP 2009001313W WO 2009112149 A2 WO2009112149 A2 WO 2009112149A2
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phase
extraction
molecular weight
therapeutic protein
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PCT/EP2009/001313
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WO2009112149A8 (de
WO2009112149A3 (de
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Werner BÄCKER
Sven Sommerfeld
Martina Mutter
Paula Alexandra Albuquerque De Jesus Rose
Maria Raquel Murias Dos Santos Aires-Barosl
Ana Margarida Nunes Da Mata Pires De Azevedo
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Bayer Technology Services Gmbh
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Publication of WO2009112149A8 publication Critical patent/WO2009112149A8/de

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/145—Extraction; Separation; Purification by extraction or solubilisation

Definitions

  • the present invention relates to a process for the purification of proteins, in particular therapeutic proteins by means of multistage extraction.
  • aqueous 2-phase extraction (ATPE). It can be used simultaneously for cell separation, concentration and first purification of the target component from complex mixtures such as fermentation broths or biological extracts [P. A. Albertsson, Partition of Cell Particles and Macromolecules, Wiley, New York, 1986; M. Rito-Palomares, J. Chromatogr., B807 (2004) 3] and thus represents a robust purification process for a variety of separation problems from blends containing biological material.
  • the technical effect of this separation operation relies on mutual incompatibility of two polymers or a polymer and a salt at certain concentrations.
  • US 2007/0048786 discloses a method in which proteins are fractionated into classes by single-stage or multi-stage extraction or liquid-liquid separation.
  • Extraction is for example an aqueous 2-phase extraction.
  • the method relates to the further analysis of the concentrated fractions.
  • the object of providing individual proteins of quality useful for therapeutic use is not disclosed.
  • the resulting fractions, as well as the extractive process are therefore to be described as coarse.
  • a revelation regarding a manual for the pure representation of proteins therefore does not take place.
  • Suitable polymers include polyethylene glycols, amines of polyethylene glycols, carboxylates of polyethylene glycols, polypropylene glycols, as well as their amines and carboxylates, polyethylene glycol esters, polyethyleneimines, trimethylamino-polyethylene glycols, polyvinyl alcohols, polyvinylpyrrolidones and mixtures thereof.
  • the method comprises only one extraction step, and optionally a separation of the enzyme from the aqueous polymer phase.
  • the purity of the enzyme after its recovery is only about 90-92%.
  • the enzyme-rich phase is significantly contaminated with 5-20% by volume of the salt phase. Thus, the method is not suitable for the production of high purity proteins.
  • US 4,879,234 discloses a complex process in which formate dehydrogenase is obtained from Candida boidinii by subjecting cell material to two successive extractions.
  • the cell material containing the formate dehydrogenase is exposed to a first 2-phase system, wherein the one phase comprises an aqueous solution of polyethylene or polypropylene glycol and the other phase comprises an aqueous phase containing dextran, methylcellulose or Ficoll as phase images, and a triazine dye which is chemically bound to polyethylene or polypropylene glycol.
  • the formate dehydrogenase is then in the upper phase after a certain time.
  • the lower phase of the first 2-phase system is discarded and an aqueous phosphate solution is added to the upper phase, whereby again a second 2-phase system is formed, whereby, according to the disclosure, the formate dehydrogenase now accumulates in the lower phase. This is separated from the upper and from this in turn, for example by ultrafiltration, the formate dehydrogenase obtained.
  • the upper phase in the second step comprising the triazine dye chemically bound to polyethylene or polypropylene glycol, can be reused.
  • the formation of the first 2-phase system is according to the disclosure an affinity separation system. The separation of the two phases can be carried out in each case using technical apparatus such as a nozzle separator or a Tellerseparator. - -
  • US 4,879,234 discloses as the only further treatment step according to the procedure described above, a lyophilization. However, this is unsuitable to achieve a reliable separation of the extraction agents (in particular the chemically modified polyethylene glycol, or polypropylene glycol), which would be essential in particular for therapeutic proteins. Furthermore, it is questionable in how far the method is economically efficient, if the safe in the production of expensive, modified polyethylene glycol or polypropylene glycol can not be recovered quantitatively. However, a quantitative recovery is physically impossible, since in the context of extraction processes always parts of a phase are dragged into another phase. Thus, the process disclosed in US 4,879,234 is considered to be economically detrimental to application to therapeutic proteins.
  • the extraction agents in particular the chemically modified polyethylene glycol, or polypropylene glycol
  • US 6,437,101 discloses the isolation of human growth hormone (HGH), a growth hormone antagonist, or a mixture of both from a biological source using aqueous 2-phase extraction.
  • a two-stage extraction is also disclosed wherein the low-target-phase phase produced in the first extraction stage is subjected to further back-extraction while the target-protein-rich phase resulting from the first extraction stage is not subjected to any further extraction step.
  • the re-extraction thus obviously serves to increase the yield of the process.
  • US Pat. No. 6,437,101 does not disclose further extraction of the target protein-rich fraction to further increase the purity. Thus, the use of a back-extraction can not be understood as a further purification step. Nevertheless, US Pat. No.
  • 6,437,101 discloses that the purity of proteins is of importance especially for later use as a therapeutic agent and refers to the state of the art for further purification of the target protein from the respective target-protein-rich phases of the two extraction stages. These include in particular the chromatographic methods already described, as well as precipitations, centrifugation or gel electrophoresis. US 6,437,101 excludes the use of chaotrophic agents. Chaotropic agents include, for example, detergents. A wash, e.g. in the form of a further extraction of the target protein-rich phase to increase its purity is also not disclosed.
  • Extraction columns allows the purification of therapeutic proteins from mixtures with at least one high molecular weight impurity and at least one low molecular weight impurity in an economically advantageous manner. It has surprisingly been found that a method for purifying therapeutic proteins, starting from a mixture A comprising at least one therapeutic protein (P), at least one high-molecular impurity (H) and at least one low-molecular impurity (N), characterized in that it at least the Steps:
  • step b) Extraction of the solution 1 resulting from step a) using a phase B (PB), containing a solution bl comprising a portion of phase B (PB), at least a portion of the therapeutic protein (P) and at least a portion of the low molecular weight impurity (N), and obtaining a solution b2 comprising a portion of phase A (PA), at least a portion of the high molecular weight impurity
  • PB phase B
  • PA phase A
  • step b) further extraction of the resulting from step b) solution bl using a phase C (PC), obtaining a solution cl, comprising at least a portion of the supplied phase C (PC), at least a portion of the therapeutic protein (P) and optionally one Proportion of the low-molecular-weight impurity (N), as well as obtaining a solution c2 comprising at least a portion of the solution B-fed phase B (PB), at least a portion of the low-molecular-weight impurity (N) and optionally a portion of the therapeutic protein (P),
  • PC phase C
  • N Proportion of the low-molecular-weight impurity
  • PA phase A
  • H high molecular weight impurity
  • P therapeutic protein
  • PC therapeutic protein
  • P therapeutic protein
  • N low molecular weight impurity
  • PC at least a portion of the therapeutic protein
  • N optionally a portion of the low molecular weight impurity
  • P2 receiving a solution e2 comprising at least a portion of the phase B (PB), at least a portion of the low molecular weight impurity (N) and optionally a portion of the therapeutic protein (P).
  • therapeutic proteins all molecules comprising a sequence of amino acids, which are formed within the biological activity of or are chemically identical to living organisms and which can be used in mammalian medical procedures ,
  • therapeutic proteins Preferred are therapeutic proteins (P) that can be used in human medical procedures.
  • Non-limiting examples are immunoglobulins (e.g., IgG, IgM, IgD), myoglobins and albumins.
  • Contamination in the context of the present invention refers to any substance which comprises the mixture A which is not the therapeutic protein (P).
  • Impurities may also include proteins which also have a therapeutic use as defined above, which are not intended to be the sole object of purification in the particular embodiment of the present invention.
  • Mixture A may also contain organisms or other solids.
  • low molecular weight and high molecular weight are to be understood in the context of this invention as relative to the molecular mass of the therapeutic molecule.
  • a low molecular contaminant (N) refers to impurities of lower molecular mass than that of the therapeutic protein (P)
  • high molecular contaminant (H) comprises an impurity having a higher molecular mass than the therapeutic protein (P).
  • Non-exhaustive examples of low molecular weight or high molecular weight impurities are insulin, growth hormones, albumins, interleukins, interferons, DNA, lecithin, erythropoietin, glucose, lactate and / or amino acids. Whether it is in the individual case to low molecular weight impurities (N) or high molecular weight impurities (H) depends, as already stated, on the molecular mass of the therapeutic protein (P).
  • Phases A and C (PA, PC) usually comprise solutions of at least one salt and / or at least one polymer in water.
  • the at least one salt of the cations can be selected from the list: ammonium, lithium, sodium, potassium, cesium, magnesium , Calcium, strontium, barium, iron, manganese and thiocyanate, and anions selected from the list borate, bromide, bicarbonate, carbonate, chloride, citrate, fluoride, nitrate, nitrite, phosphate, monohydrogen phosphate, dihydrogen phosphate, sulfate, sulfite and 2-amino-2- (hydroxymethyl) - ⁇ ropane-1,3-diolate (TRIS).
  • the cations are potassium and / or sodium.
  • the anions Citrate, chloride, phosphate, monohydrogen phosphate, dihydrogen phosphate and / or sulfate.
  • the salts are particularly preferably sodium chloride, sodium dihydrogen phosphate, potassium hydrogen phosphate and / or sodium citrate.
  • the salts can be used in different proportions and in different mixtures in phases A and C (PA, PC).
  • the total proportion of the salts in phases A and C (PA, PC) is preferably between 0 and 40% by weight.
  • phases A and / or C are solutions comprising at least one salt in water
  • phases A (PA) particularly preferably comprise sodium chloride in a proportion of 0-20% by weight and more preferably comprise phases C (PC) less Sodium chloride as phases A (PA).
  • phase A (PA) for the therapeutic protein (P) is a less good solvent than for the phase B (PB)
  • Phase C (PC) for the therapeutic protein (P) is a better solvent than Phase B (PB).
  • This difference in the solubility of the therapeutic protein (P) in phases A and C (PA, PC) is used in the further extraction according to step c) of the method according to the invention to further purify the therapeutic protein (P).
  • phases A and C are characterized by being substantially immiscible with phase B (PB).
  • PB phase B
  • the phases A and / or C may have a higher or lower density than the phase B (PB).
  • the density of the phases A and / or C and / or B can be adjusted, for example, via the proportion and / or the nature of the salts and / or polymers contained in them.
  • at least the phase A (PA) has a higher density than the phase B (PB).
  • phases A and C (PA, PC) have a higher density than phase B (PB).
  • the at least one polymer may be a dextran or a starch or a derivative of the starch.
  • suitable starches or derivatives of starch include waxy starch (93-95% by weight amylopectin and 5-7% by weight amylase having a molecular weight of about 500 kDa) or hydroxypropyl starches, preferably having a molecular weight of about 100 kDa up to about 200 kDa.
  • Suitable starches and derivatives of Starches may, for example, be obtained under the trade names Reppal®PES100 or Reppal®PES200 from Lyckeby Culinar AB, Sweden.
  • phase B (PB) usually comprises a solution of at least one polymer, which is preferably soluble in water at least up to a proportion of 10% by weight.
  • phase B (PB) also comprises salts as used in phases A and / or C (PA, PC) according to the invention.
  • Preferred polymers are polyethylene glycols, polypropylene glycols and derivatives of the two abovementioned block copolymers of these, polyvinyl, polymethyl, polyethyl, polyether polyvinylpyrrolidones, polyacrylates, dextranes, starch derivatives, as previously described, maltodextrans, cellulose derivatives.
  • polyethylene glycol is particularly preferred.
  • a particularly preferred phase B comprises 5-40% by weight of polyethylene glycol having a molar mass of about 3350 g / mol, as well as sodium chloride, a hydrogen phosphate salt and a dihydrogen phosphate salt.
  • thermosensitive polymers may be thermosensitive or not.
  • thermosensitive polymers are used.
  • thermosensitive polymers are polymers which cause the aqueous solution in which they are dissolved to separate by heating in two phases of different densities.
  • An example of a thermosensitive polymer is about a block co-polymer of polyethylene and polypropylene.
  • extraction refers to a two-stage procedure, wherein in a first step two liquid phases are brought into contact with one another and in a second step the phases are separated again.
  • the contacting of the phases may be carried out, for example, by stirring, by forcing a turbulent flow, by methods known to those skilled in the art, such as passage through a gap or by passing the two phases countercurrently past one another.
  • the second step of the extraction can be achieved for example by the method of centrifugation known to those skilled in the art, but also simply by calming the two phases.
  • the Calming in this case corresponds to the centrifugation in the gravitational field of the earth.
  • each wash / extraction is carried out in Mixler-settler apparatus comprising at least one countercurrent flow extraction zone and at least one settling zone.
  • Washing therefore, in contrast to the extraction according to the invention, refers to the special case that the therapeutic protein (P) remains in the same phase before and after carrying out such a process step and instead an impurity (H, N) is transferred from one phase to another.
  • washing and extraction refer to that substance (impurity or therapeutic protein), which is preferably converted from one phase to the other by the most favorable distribution coefficient in the 2-phase system.
  • the distribution coefficient is a substance system-specific parameter and denotes a quotient K, calculated from the concentration of a substance in a phase X, divided by the concentration of the same substance in a phase Y, at chemical equilibrium (ie after an infinite time) at a certain pressure and a certain temperature.
  • Non-exhaustive examples of such methods include the setting of sufficiently long residence times in settling zones in which the two phases are separated from each other, the use of suitable means to assist the separation (such as centrifuges), and the adjustment of the intensity of the mixing of the two phases the respective separation, such as by setting lower speeds of optionally used stirrers.
  • Suitable devices in which the two steps of extraction or washing are preferably carried out include mixer-settler apparatuses and extraction columns, embodiments known in the art.
  • the mixing according to step a) of the inventive method is usually carried out so that the mixture A and the phase A (PA) after mixing in each case to proportions of 50 to 90% by weight of the phase A (PA) and 10-50 Gew. % of the mixture A in solution 1.
  • the proportions of phase A (PA) are preferably between 60 and 80% by weight after mixing and the proportions of mixture A between 20 and 40% by weight.
  • the proportion of mixture A in solution 1 after step a) of the process according to the invention is about 25% by weight and the proportion of phase A (PA) in solution 1 is about 75% by weight. Solution 1 thus forms a homogeneous mixed phase of mixture A with phase A (PA)
  • step b) the therapeutic protein (P) is extracted together with the low molecular weight impurity (N) from the phase A (PA) to the phase B (PB) of the solution bl and the high molecular weight impurity (H) remains substantially in the Phase A (PA) of solution b2.
  • Solution bl particularly preferably comprises more than 90% by weight of the low molecular weight impurity (N) contained in mixture A and more than 90% by weight of the therapeutic protein (P) contained in mixture A. Most preferably, solution bl comprises more than 99% by weight of the low molecular weight impurity (N) present in mixture A and more than 99% by weight of the therapeutic protein (P) contained in mixture A.
  • Solution b2 particularly preferably comprises less than 10% by weight of the therapeutic protein (P) contained in mixture A and more than 90% by weight of the high molecular weight impurity (H) present in mixture A. Most preferably, solution b2 comprises less than 1% by weight of the therapeutic protein (P) contained in mixture A and more than 99% by weight of the high molecular weight impurity (H) contained in mixture A.
  • step c) of the process according to the invention is characterized in that a phase C (PC) is used which is used in a combination with the phase B (PB) in which the distribution coefficient of the therapeutic protein (P) and the low-molecular impurity ( N) is so pronounced that the therapeutic protein (P) is extracted from the phase B (PB) of the solution b1 into the phase C (PC) of the solution c1, and the low-molecular impurity (N) is concentrated in the phase B (PB), if possible the solution c2 remains.
  • a phase C (PC) is used which is used in a combination with the phase B (PB) in which the distribution coefficient of the therapeutic protein (P) and the low-molecular impurity ( N) is so pronounced that the therapeutic protein (P) is extracted from the phase B (PB) of the solution b1 into the phase C (PC) of the solution c1, and the low-molecular impurity (N) is concentrated in the phase B (PB), if possible the solution c2
  • This procedure is particularly advantageous because by means of the change of the partition coefficient a further purification of the therapeutic protein (P) can be made possible in a simple manner, without a separate third phase, which is similar to one of the phases (PA, PC) , must be used.
  • An alternative embodiment of the method according to the invention is characterized in that in step c) an extraction is brought about only by temperature change, wherein at least one thermosensitive polymer in the phase B (PB) is used, so that in the context of step c) by temperature treatment of Formulate solution bl two phases with different solubilities for the therapeutic protein.
  • PB thermosensitive polymer in the phase B
  • step c) of the new method two solutions cl and c2 are then formed again with the properties stated below with regard to their content of therapeutic protein (P) and / or low molecular weight and / or high molecular weight impurity (H, N) ,
  • Solution c1 particularly preferably comprises more than 90% by weight of the therapeutic protein (P) contained in solution 1 and less than 40% by weight of the low molecular weight impurity (N) contained in solution b.
  • Solution c2 particularly preferably comprises more than 60% by weight of the low molecular weight impurity (N) contained in solution b and less than 10% by weight of the therapeutic protein (P) contained in solution b.
  • step d) the therapeutic protein (P) is extracted from the phase A (PA) to the phase B (PB) of the solution d2 and the high molecular weight impurity (H) remains in the phase A (PA) of the solution dl.
  • Solution d1 particularly preferably comprises at least over 90% by weight of the high molecular weight impurity (H) contained in solution b2.
  • Solution d2 particularly preferably comprises at least over 90% by weight of the therapeutic protein (P) contained in solution b2.
  • step e) the therapeutic protein (P) remains in solution el comprising phase C (PC), while the low molecular weight impurity (N) is extracted into phase B (PB) of solution e2.
  • PC phase C
  • N low molecular weight impurity
  • Solution el thus particularly preferably comprises at least more than 90% by weight of the therapeutic protein (P) contained in solution cl.
  • Solution e2 thus particularly preferably comprises at least over 90% by weight of the low molecular weight impurity (N) present in solution cl.
  • the method according to the invention described hereby is characterized in particular by the achievement of very high purities of the therapeutic protein (P), which is achieved by the succession of the extraction and washing steps.
  • P therapeutic protein
  • the separate extractive separation of the at least one high-molecular-weight impurity (H) and the further extractive separation of the at least one low-molecular-weight impurity (N) together with the washing solve the task particularly advantageously, since none of the steps according to the invention is particular Devices are required, which go beyond the known to those skilled devices for extraction. Rather, all individual steps can be carried out in devices of identical construction, since the inventive method can always be carried out by means of identical or similar phases.
  • a first preferred further development of the process according to the invention is characterized in that the solution d2 obtained from step d) together with the phase B (PB) is again fed to step b) of the process according to the invention.
  • the phase B (PB) is particularly preferably fed only to step d) of the process according to the invention, and the solution d2 replaces the phase B (PB) of the step b) according to the invention.
  • phase B (PB) contained in solution d2 can be repeated be used for extraction, which in turn reduces the operating costs of such a process operated.
  • a further, likewise preferred, further development of the process according to the invention is characterized in that after step d) of the process according to the invention in a step d *) the solution d 1 obtained from step d) is subjected to ultrafiltration or nanofiltration and optionally to a reverse osmosis, in which high molecular weight impurity (H) is separated from the phase A (PA) and this optionally after addition of further salt to compensate for the losses together with the solution 1 again step b) of the inventive method is supplied.
  • H high molecular weight impurity
  • phase A PA
  • step d *) is particularly advantageous, because on the one hand, the high-molecular impurity (H) can be provided in very pure form in phase A (PA), and these may also be a valuable product, as described above. representing what increases the economics of the entire process.
  • PA phase A
  • a likewise preferred further development of the method according to the invention is characterized by a step c *), in the form of a further extraction of the solution c2 resulting from step c) using phase C (PC), or a phase D (PD ), containing a solution c * l comprising at least a portion of phase C or D (PC, PD) and at least a portion of the therapeutic protein (P), and receiving a solution c * 2 comprising at least a portion of phase B ( PB) and at least a portion of the low molecular weight impurity (N).
  • a step c * in the form of a further extraction of the solution c2 resulting from step c) using phase C (PC), or a phase D (PD ), containing a solution c * l comprising at least a portion of phase C or D (PC, PD) and at least a portion of the therapeutic protein (P), and receiving a solution c * 2 comprising at least a portion of phase B ( PB) and at least
  • step c *) the remaining therapeutic protein (P) is extracted from the phase B (PB) to the phase C or D (PC, PD) of the solution c * l and the low-molecular impurity (N) remains in the phase B. (PB) of solution c * 2.
  • Solution c * l particularly preferably comprises over 90% by weight of the therapeutic protein (P) contained in solution c2. Most preferably, solution c * l comprises over 99% by weight of the therapeutic protein (P) contained in solution c2.
  • Solution c * 2 particularly preferably comprises more than 90% by weight of the low molecular weight impurity (N) contained in solution c2. Most preferably, solution c * 2 comprises over 99% by weight of the low molecular weight impurity (N) contained in solution c2.
  • step c *) is preferred because it enables the low molecular weight impurity (N) to be provided in very pure form in phase B (PB) and, under certain circumstances, it may also be a valuable product, as described above increases the profitability of the entire process.
  • a likewise preferred further development of the method according to the invention is characterized by a step e *), in the form of a further extraction of the solution e2 resulting from step e) using phase C (PC), or a phase E substantially similar to phase C (PE ), containing a solution e * l, comprising at least a portion of the supplied phase C or E (PC, PE) and at least a portion of the therapeutic protein (P), and receiving a solution e * 2, comprising at least a portion of the phase B. (PB) and at least a portion of the low molecular weight impurity (N).
  • step e *) the therapeutic protein (P) remains in solution e * l comprising phase C or E (PC, PE) while the low molecular weight impurity (N) extracts into phase B (PB) of solution e * 2 becomes.
  • Solution e * l particularly preferably comprises at least over 90% by weight of the therapeutic protein (P) contained in solution e2.
  • Solution e * 2 particularly preferably comprises at least over 90% by weight of the low molecular weight impurity (N) contained in solution e2.
  • step e *) is preferred, because in this way the low-molecular impurity (N) can be provided in very pure form in phase B (PB) and under certain circumstances this likewise represents a desired product, as already described above, which represents the Profitability of the whole process increased.
  • the steps c *) and e *) are carried out and the solution c * l is combined with solution e * l and this in turn either together with the step c) fed phase C (PC), or at Place this used in step c) of the method according to the invention.
  • the steps c *) and e *) are carried out and the solution c * 2 and solution e * 2 are combined and either fed together with the phase B (PB) step e) or used instead of phase B (PB) in step e) of the method according to the invention.
  • phase B can be used several times in the entire process, thus reducing the operating costs of the process.
  • the solution c * 2 and solution e * 2 are most preferably fed instead of the phase B (PB) step e), where appropriate beforehand the combined solution of the solutions solution c * 2 and solution e * 2 according to a step f) of a subjected to further treatment.
  • PB phase B
  • a step f) may comprise extraction of the low-molecular-weight impurity (N) from the combination of the solution c * 2 and solution e * 2 using a phase F (PF), the phase F (PF) being a thermosensitive Polymer and the extraction according to the alternative embodiment of step c) is carried out.
  • PF phase F
  • step f) may also include evaporative crystallization and / or crystallization and / or precipitation and / or ultrafiltration or nanofiltration in which the low molecular weight impurity (N) is separated.
  • step f) The further development of the process by a step f) is particularly advantageous, because in this way the low-molecular impurity (N) can be made available in particularly high purity as a further by-product of the process according to the invention and thus the economic efficiency of the process is increased by the sale thereof. Further, this can be used to recycle Phase B (PB) and optionally reused elsewhere in the process, thereby reducing the operating costs of the process.
  • PB Phase B
  • step f) of the preferred further development of the process according to the invention is preferably operated as already described in the preferred or alternative variants of step c) according to the invention.
  • the phase F (PF) used is particularly preferably recirculated with the prior use of an ultrafiltration or nanofiltration for the separation of the low molecular weight impurity (N).
  • step f) in the form just described is particularly advantageous because the devices used for this purpose are identical in construction to the devices already used in the method according to the invention.
  • this embodiment is particularly economical, since the design of the devices has already taken place for the inventive method.
  • the solution e1 obtained from step e) can be subjected to at least one further purification step g), which is characterized _ _
  • This further purification step g) may comprise ultrafiltration, nanofiltration or chromatographic methods.
  • the solution g obtained from the preferred purification step g) comprising the phase C (PC) is particularly preferably combined with the solution c * l and the solution e * l and, together with the step c) fed phase C (PC), or in place this used in step c) of the method according to the invention.
  • Fig. 1 shows how in step a) the mixture A is combined with a phase A (PA) and is first subjected to countercurrent extraction b) using a second phase B (PB).
  • PB phase A
  • PB phase B
  • the solution bi is subjected to a further countercurrent extraction c) using a phase C (PC).
  • the solution ci is subjected to a countercurrent washing using a further phase B (PB) according to a step e), from which, after settling, two phases ⁇ i and e 2 comprising solutions ei and e 2 result.
  • phase b 2 obtained from step b) comprising the solution b 2 is subjected to a further countercurrent extraction d) using the phase B (PB), from which, after settling, the phases di and d 2 comprising the solutions di and d 2 result.
  • the phase ei comprising the solution ei contains the high purity therapeutic protein.
  • the total protein content in the respective saline or polymer solution is determined by a Bradford assay according to the scientific paper of MM. Bradford, Anal. Biochem 27 (1976) 248. To avoid influences by the solution components, the samples are first diluted and analyzed against a blank.
  • the antibody concentration in both solutions is determined by protein A affinity chromatography on a Porous Protein A column (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
  • the binding buffer is a 10 mM sodium phosphate buffer with 15 mM NaCl with a pH of 8.5. Elution is carried out with 12 mM HCl with 15 mM NaCl. The absorption is considered at 280nm.
  • the samples of both phases are diluted in a sample buffer consisting of 0.05% by volume of Tween80, 15 mM of NaCl in 10 mM sodium phosphate buffer of pH 8.5.
  • the purity of both phases is determined by size exclusion chromatography (SEC) using a TSK-GeI Super SW3000 column (30 cm x 4.6 mm I.D., 4 ⁇ m) from Tosoh Bioscience (Stuttgart, Germany). Samples are diluted at least 10X with phosphate buffered saline (PBS) prior to analysis. The analysis is isocratic at 0.35mL / min with a 5OmM phosphate buffer with 30OmM NaCl at a wavelength of 215nm.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the distribution coefficient K P describes the concentration ratio of the protein in the respective phase of lower density relative to phase with the respective higher density in a respective two-phase system of the individual steps.
  • the protein yield in the respective phases with the lower density Y ⁇ op is defined as the ratio of the Antikörpe ⁇ nasse in this phase based on the whole supplied to the system Anti body mass.
  • the product purity in the respective phase with the lower density P SEC is determined from the described SEC measurement as the quotient of the area of the IgG peak and the sum of all peaks in this phase.
  • Table 1 Composition of the stock solutions 40 wt .-% - phosphate buffer
  • human IgG was used for therapeutic applications (Gammanorm® Octa pharma, Lachen, Switzerland) containing a concentration of 165 mg / mL at a content of 95% by weight of IgG in the total protein content, as well as a cell culture supernatant of a Chinese hamster ovary (CHO) cell culture with an IgGi against a human surface antigen (Excellgene, Monthey, Switzerland).
  • the latter was used in a concentration of 120 mg / L based on the final volume and enriched with 0.5 g / L Gammanorm®.
  • the aqueous two-phase systems were prepared by preparing each of the polymer solution and the salt solution separately from the stock solutions.
  • the polymer solution and the saline solution formed the two phases.
  • the saline solution was prepared so that the required concentrations of NaCl and phosphate buffer were obtained after addition of the CHO cell supernatant.
  • the CHO cell supernatant was added at a concentration of 25% by weight of the resulting saline solution.
  • the polymer solution was formed by stock solution PEG and a salt solution consisting of NaCl and phosphate and fed to the process.
  • the salt solution and the polymer solution in the process originally consisted together of 8% by weight PEG with an average molar mass of 3350 g / mol (PEG 3350 ), 10% by weight of phosphate buffer with a pH of 6 and 10% by weight. NaCl.
  • composition of the phases after adjustment of the distribution equilibrium of the process corresponded with respect to PEG 335O and phosphate of the composition shown in Table 2 at a phase ratio of 0.4.
  • a countercurrent mixer-settler (MSB) battery consisting of an extraction comprising six extraction and settling zones, a back extraction comprising an extraction and settling zone and a scrubber comprising three extraction and settling zones.
  • Example 1 Unlike Example 1, ten instead of six extraction and settling zones were used for the extraction step. In addition, the concentration of IgG was increased to 1.5 g / L to demonstrate that the method can also be used for fermentation supernatants with high product concentrations. The exact operating conditions are shown in Table 6. The solutions used have been prepared analogously to Example 1.
  • a global yield of 80% and a final purity of 99% could be achieved. This means that more than 99% of the impurities could be removed here as well.
  • An even higher yield could be achieved by subjecting the heavy phase (essentially the salt solution) from the first extraction step to further extraction. In this case, the global yield increased to 85%.
  • the total depletion of all minor components is more than 99%.
  • the heavy phase (essentially the saline solution) from the wash was batchwise concentrated and diafiltered in PBS buffer.
  • a laboratory cross-flow filtration as commercially available, was used (eg Sartoflow® Slice 200 benchtop crossflow system).
  • the membrane used had a cut-off of 30 kDa with a membrane area of 200cm 2 per cartridge. Three cassettes were used in parallel, so that an active membrane area of 600 cm 2 was obtained.
  • the starting volume was 90OmL.
  • the original heavy phase essentially the saline
  • PBS buffer The exchange factor was about seven (90OmL starting solution against 690OmL PBS buffer).
  • the temperature was kept constant at 22-24 ° C and the flow through the filters to 450 rnL / min set.
  • the major component was retained while the salts (detected via conductivity) were washed out.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von Proteinen, insbesondere therapeutischen Proteinen mittels mehrstufiger Extraktion.

Description

Verfahren zur Reinigung therapeutischer Proteine
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von Proteinen, insbesondere therapeutischen Proteinen mittels mehrstufiger Extraktion.
Die Aufreinigung biologischer Produkte erfolgt oftmals durch chromatographische Verfahren. Dabei werden normalerweise Trennmechanismen wie z.B. Ionenaustausch, hydrophobe
Wechselwirkung, Affinität und Größenausschluss genutzt. Neben dem Vorteil der hohen
Selektivität haben diese Techniken jedoch eine Reihe von Nachteilen, wie z.B. das aufwändige
Packen der Säulen, die niedrige intrapartikuläre Diffusion, den hohen Druckverlust über die
Packung, eine niedrige Kapazität, geringe chemische und proteolytische Stabilität und die hohen Kosten für das Adsorbens.
Eine Alternative bietet hier die wässrige 2-Phasen-Extraktion (ATPE). Sie kann gleichzeitig zur Zellabtrennung, Aufkonzentrierung und ersten Reinigung der Zielkomponente aus komplexen Mischungen wie Fermentationsbrühen oder biologischen Extrakten verwendet werden [P. A. Albertsson, Partition of Cell Particles and Macromolecules, Wiley, New York, 1986; M. Rito- Palomares, J. Chromatogr., B807 (2004) 3] und stellt somit ein robustes Reinigungsverfahren für eine Vielzahl von Trennproblemen aus Mischungen, enthaltend biologisches Material, dar. Der technische Effekt dieser Trennoperation beruht auf einer gegenseitigen Inkompatibilität von zwei Polymeren oder eines Polymers und eines Salzes bei bestimmten Konzentrationen. Neben einer sehr guten Biokompatibilität aufgrund des hohen Wassergehalts (80-90% (w/w) Wasser) und der niedrigen Oberflächenspannung dieser Systeme können in einstufigen Verfahren allgemein schon eine gewisse Selektivität und Ausbeute durch Variieren der experimentellen Bedingungen (z.B. Konzentration, pH-Wert, Ionenstärke, Molekulargewicht des Polymers) erreicht werden [P. A. Albertsson, Partition of Cell Particles and Macromolecules, Wiley, New York, 1986].
In US 2007/0048786 wird ein Verfahren offenbart, in dem Proteine mittels einstufiger oder mehrstufiger Extraktion oder Flüssig-Flüssig-Trennung in Klassen fraktioniert werden. Die
Extraktion ist zum Beispiel eine wässrige 2-Phasen-Extraktion. Das Verfahren bezieht sich auf die weitere Analyse der aufkonzentrierten Fraktionen. Die Aufgabe, einzelne Proteine in für therapeutische Anwendung verwendbarer Qualität bereit zu stellen, wird nicht offenbart. Die resultierenden Fraktionen, als auch das extraktive Verfahren sind somit als grob zu bezeichnen. Eine Offenbarung bezüglich einer Anleitung zur reinen Darstellung von Proteinen findet daher nicht statt.
In US 4,728,613 wird ein Verfahren offenbart, mittels dessen eine Gewinnung von extrazellulären Enzymen aus Bierfermentationen möglich ist. Das Verfahren umfasst die Mischung der gesamten Fermentationsbrühe mit einem Polymer und einem anorganischen Salz, wodurch sich ein wässriges 2-Phasensystem bildet. Die gesuchten Enzyme reichern sich dabei in der Polymerphase an. Als verwendbare Polymere werden Polyethylenglykole, Amine von Polyethylenglykolen, Carboxylate von Polyethylenglykolen, Polypropylenglykole, wie auch deren Amine und Carboxylate, Polyethylenglykolester, Polyethylenimine, Trimethylamino-polyethylenglykole, Polyvinylalkohole, Polyvinylpyrrolidone und Mischungen dieser offenbart. Das Verfahren umfasst nur einen Extraktionsschritt, sowie gegebenenfalls eine Abtrennung des Enzyms aus der wässrigen Polymerphase. Die Reinheit des Enzyms nach seiner Gewinnung beträgt nur etwa 90-92 %. Weiterhin ist die enzymreiche Phase signifikant mit 5-20 Vol-% der Salzphase verunreinigt. Damit ist das Verfahren für die Herstellung hochreiner Proteine nicht geeignet.
Das Problem der unzureichenden Reinheit des Extraktionsproduktes adressiert die Offenbarung der US 5,151,358, sowie der US 5,139,943. Beide leiten die Extraktionsprodukte einer ersten wässrigen 2-Phasen-Extraktion über eine Ionenaustauschersäule, um das Zielprotein Chymosin in reinerer Form zu erhalten. Hieraus folgt die Anforderung, dass das Protein von der Säule zurück gewonnen werden muss, was wiederum die bereits beschriebenen Nachteile der Chromatographie mit sich bringt.
In US 4,879,234 wird ein aufwändiges Verfahren offenbart, in dem Formiat-Dehydrogenase aus Candida boidinii gewonnen wird, indem Zellmaterial zwei aufeinanderfolgenden Extraktionen unterzogen wird. Im ersten Schritt wird das Zellmaterial enthaltend die Formiat-Dehydrogenase einem ersten 2-Phasensystem ausgesetzt, wobei die eine Phase eine wässrige Lösung von Polyethylen- oder Polypropylenglykol umfasst und die andere Phase eine wässrige Phase enthaltend Dextran, Methylcellulose oder Ficoll als Phasenbilder, sowie einen Triazinfarbstoff, der chemisch an Polyethylen- oder Polypropylenglykol gebunden ist, umfasst. Nach US 4,879,234 befindet sich nach einer gewissen Zeit die Formiat-Dehydrogenase dann in der oberen Phase. Die untere Phase des ersten 2-Phasensystems wird verworfen und der oberen Phase wird eine wässrige Phosphatlösung zugegeben, womit wieder ein zweites 2-Phasensystem entsteht, wobei sich offenbarungsgemäß die Formiat-Dehydrogenase nun in der unteren Phase ansammelt. Diese wird von der oberen abgetrennt und aus dieser wiederum z.B. mittels Ultrafiltration die Formiat- Dehydrogenase gewonnen. Die im zweiten Schritt obere Phase, umfassend den chemisch an Polyethylen- oder Polypropylenglykol gebundenen Triazinfarbstoff, kann wieder verwendet werden. Bei der Ausbildung des ersten 2-Phasensystems handelt es sich offenbarungsgemäß um ein Affinitätstrennsystem. Die Trennung der beiden Phasen kann jeweils unter Verwendung von technischen Apparaten wie z.B. einem Düsenseparator oder einem Tellerseparator erfolgen. - -
Die US 4,879,234 offenbart als einzigen weiteren Aufbereitungsschritt nach der oben beschriebenen Verfahrensweise eine Lyophilisation. Diese ist aber ungeeignet eine sichere Abtrennung der Extraktionsagenzien (insbesondere des chemisch modifizierten Polyethylenglykol, oder Polypropylenglykol) zu erreichen, was insbesondere für therapeutische Proteine unerlässlich wäre. Weiterhin ist es fraglich inwiefern das Verfahren wirtschaftlich effizient ist, wenn das sicher in der Herstellung teure, modifizierte Polyethylenglykol oder Polypropylenglykol nicht quantitativ zurück gewonnen werden kann. Eine quantitative Rückgewinnung ist aber physikalisch ausgeschlossen, da im Rahmen von Extraktionsverfahren stets Teile einer Phase in eine andere Phase geschleppt werden. Somit ist das in US 4,879,234 offenbarte Verfahren als wirtschaftlich nachteilig für die Anwendung auf therapeutische Proteine zu bezeichnen.
In US 6,437,101 wird die Isolierung des menschliches Wachstumshormons (HGH), eines Wachstumshormonantagonisten oder einer Mischung beider aus einer biologischen Quelle unter Benutzung einer wässrigen 2-Phasen-Extraktion offenbart. Eine zweistufige Extraktion wird ebenfalls offenbart, wobei die in der ersten Extraktionsstufe entstehende, zielproteinarme Phase einer weiteren Rückextraktion unterworfen wird, während die in der ersten Extraktionsstufe entstehende, zielproteinreiche Phase keinem weiteren Extraktionsschritt unterworfen wird. Die Rückextraktion dient also offenbar der Steigerung der Ausbeute des Verfahrens. US 6,437,101 offenbart keine weitere Extraktion der zielproteinreichen Fraktion zur weiteren Steigerung der Reinheit. Somit kann der Einsatz einer Rückextraktion nicht als eine weitere Aufreinigungsstufe verstanden werden. Trotzdem offenbart US 6,437,101, dass die Reinheit von Proteinen gerade bei einer späteren Verwendung als therapeutisches Agens von Wichtigkeit ist und verweist auf den Stand der Technik zur weiteren Aufreinigung des Zielproteins aus den jeweiligen zielproteinreichen Phasen der beiden Extraktionsstufen. Diese umfassen insbesondere die bereits beschriebenen chromatographischen Verfahren, als auch Fällungen, Zentrifugation oder auch Gelelektrophorese. US 6,437,101 schließt die Verwendung von chaotrophischen Agenzien aus. Chaotrophische Agenzien umfassen zum Beispiel Detergenzien. Ein Waschen, z.B. in Form einer weiteren Extraktion der zielproteinreichen Phase zur Steigerung seiner Reinheit wird auch nicht offenbart.
Da bei vielen Trennungen mit wässrigen Zwei-Phasen-Systemen jedoch mehr als ein Trennschritt nötig ist, um die geforderten Ausbeuten und/oder Reinheiten zu erreichen, ist es eine technische
Aufgabe ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, das unter Verwendung von möglichst einfachen
Standardvorrichtungen in mehrstufiger Bauweise wie z.B. Mixer-Settler-Vorrichtungen oder
Extraktionskolonnen die Aufreinigung von therapeutischen Proteinen aus Mischungen mit mindestens einer hochmolekularen Verunreinigung und mindestens einer niedermolekularen Verunreinigung in wirtschaftlich vorteilhafter Art und Weise ermöglicht. Es wurde überraschend gefunden, dass ein Verfahren zur Reinigung therapeutischer Proteine, ausgehend von einer Mischung A umfassend mindestens ein therapeutisches Protein (P), mindestens eine hochmolekulare Verunreinigung (H) und mindestens eine niedermolekulare Verunreinigung (N), dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens die Schritte:
a) Vermengen der Mischung A mit einer Phase A (PA), erhaltend eine Lösung 1,
b) Extraktion der aus Schritt a) resultierenden Lösung 1 unter Verwendung eine Phase B (PB), erhaltend eine Lösung bl umfassend einen Anteil der Phase B (PB), mindestens einen Anteil des therapeutischen Proteins (P) und mindestens einen Anteil der niedermolekularen Verunreinigung (N), sowie erhaltend eine Lösung b2 umfassend einen Anteil der Phase A (PA), mindestens einen Anteil der hochmolekularen Verunreinigung
(H) und gegebenenfalls einen Anteil des therapeutische Protein (P),
c) weitere Extraktion der aus Schritt b) resultierenden Lösung bl unter Verwendung einer Phase C (PC), erhaltend eine Lösung cl, umfassend mindestens einen Anteil der zugeführten Phase C (PC), mindestens einen Anteil des therapeutischen Proteins (P) und gegebenenfalls einen Anteil der niedermolekularen Verunreinigung (N), sowie erhaltend eine Lösung c2, umfassend mindestens einen Anteil der mit Lösung bl zugeführten Phase B (PB), mindestens einen Anteil der niedermolekularen Verunreinigung (N) und gegebenenfalls einen Anteil des therapeutischen Proteins (P),
d) weitere Extraktion der aus Schritt b) resultierenden Lösung b2 unter Verwendung weiterer Phase B (PB), erhaltend eine Lösung dl umfassend mindestens einen Anteil der mit
Lösung b2 zugeführten Phase A (PA) und mindestens einen Anteil der hochmolekularen Verunreinigung (H), sowie erhaltend eine Lösung d2 umfassend mindestens einen Anteil Phase B (PB) und gegebenenfalls einen Anteil des therapeutischen Proteins (P),
e) Waschen der aus Schritt c) resultierenden Lösung cl unter Verwendung weiterer Phase B (PB), erhaltend das eine Lösung el, umfassend mindestens einen Anteil der Phase C
(PC), mindestens einen Anteil des therapeutischen Proteins (P), gegebenenfalls einen Anteil der niedermolekularen Verunreinigung (N), sowie erhaltend eine Lösung e2, umfassend mindestens einen Anteil der Phase B (PB), mindestens einen Anteil der niedermolekularen Verunreinigung (N) und gegebenenfalls einen Anteil des therapeutischen Proteins (P).
umfasst, diese Aufgabe zu lösen vermag. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bezeichnen therapeutische Proteine (P), alle Moleküle, die eine Aneinanderreihung von Aminosäuren umfassen und die im Rahmen der biologischen Aktivität von lebenden Organismen gebildet werden oder mit solchen chemisch identisch sind und die in medizinischen Verfahren an Säugetieren verwendet werden können.
Bevorzugt werden therapeutische Proteine (P), die in medizinischen Verfahren am Menschen verwendet werden können. Nicht abschließende Beispiele sind Immunoglobuline (z.B. IgG, IgM, IgD), Myoglobine und Albumine.
Verunreinigung bezeichnet im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung jeden Stoff, den die Mischung A umfasst, der nicht das therapeutische Protein (P) ist. Verunreinigungen können auch Proteine, die ebenfalls eine therapeutische Anwendung nach der obigen Definition haben, umfassen, die in der jeweiligen Ausgestaltungsform der vorliegenden Erfindung lediglich nicht Ziel der Reinigung darstellen. Mischung A kann auch Organismen oder andere Feststoffe enthalten.
Die Bezeichnungen niedermolekular und hochmolekular sind im Zusammenhang mit dieser Erfindung als relativ zu der molekularen Masse des therapeutischen Moleküls zu verstehen. Eine niedermolekulare Verunreinigung (N) bezeichnet also Verunreinigungen einer geringeren molekularen Masse als jene des therapeutischen Proteins (P), während hochmolekulare Verunreinigung (H) eine Verunreinigung umfasst, die eine höhere molekulare Masse hat als das therapeutische Protein (P).
Nicht abschließende Beispiele für niedermolekulare oder hochmolekulare Verunreinigungen (H, N) sind Insulin, Wachstumshormone, Albumine, Interleukine, Interferone, DNA, Lecitin, Erythropoetin, Glukose, Laktat und/oder Aminosäuren. Ob es sich hierbei im Einzelfall um niedermolekulare Verunreinigungen (N) oder hochmolekulare Verunreinigungen (H) handelt, hängt, wie bereits festgestellt, von der molekularen Masse des therapeutischen Proteins (P) ab.
Die erfindungsgemäßen Phasen A und C (PA, PC) umfassen üblicherweise Lösungen von mindestens einem Salz und/oder mindestens einem Polymer in Wasser. Handelt es sich bei den Phasen A und/oder C (PA, PC) um Lösungen umfassend mindestens ein Salz in Wasser, so kann das mindestens eine Salz aus den Kationen ausgewählt aus der Liste: Ammonium, Lithium, Natrium, Kalium, Cäsium, Magnesium, Calcium, Strontium, Barium, Eisen, Mangan und Thio- cyanat, sowie Anionen ausgewählt aus der Liste: Borat, Bromid, Hydrogencarbonat, Carbonat, Chlorid, Citrat, Fluorid, Nitrat, Nitrit, Phosphat, Monohydrogenphosphat, Dihydrogenphosphat, Sulfat, Sulfit und 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-ρropan-l,3-diolate (TRIS) zusammengesetzt sein. Bevorzugt sind die Kationen Kalium und/oder Natrium. Ebenfalls bevorzugt sind die Anionen Citrat, Chlorid, Phosphat, Monohydrogenphosphat, Dihydrogenphosphat und/oder Sulfat. Besonders bevorzugt sind die Salze Natriumchlorid, Natriumdihydrogenphosphat, Kaliumhydrogen- phosphat und/oder Natriumeitrat.
In den einzelnen Schritten des erfindungsgemäßen Verfahrens können die Salze in unterschiedlichen Anteilen und in unterschiedlichen Mischungen in den Phasen A und C (PA, PC) verwendet werden. Der gesamte Anteil der Salze an den Phasen A und C (PA, PC) beträgt bevorzugt zwischen 0 und 40 Gew-%.
Handelt es sich bei den Phasen A und/oder C um Lösungen umfassend mindestens ein Salz in Wasser, so umfassen Phasen A (PA) besonders bevorzugt Natriumchlorid in einem Anteil von 0- 20 Gew-% und umfassen Phasen C (PC) besonders bevorzugt weniger Natriumchlorid als Phasen A (PA).
Der Unterschied der beiden Phasen A und C (PA, PC) liegt neben dem bevorzugt anderen Anteil an Natriumchlorid vor allem in der Tatsache, dass die Phase A (PA) für das therapeutische Protein (P) ein weniger gutes Lösungsmittel ist als für die Phase B (PB), wohingegen die Phase C (PC) für das therapeutische Protein (P) ein besseres Lösungsmittel ist, als die Phase B (PB).
Dieser Unterschied in der Löslichkeit des therapeutischen Proteins (P) in den Phasen A und C (PA, PC), wird in der weiteren Extraktion gemäß Schritt c) des erfindungsgemäßen Verfahrens genutzt, um das therapeutische Protein (P) weiter zu reinigen.
Weiter werden die Phasen A und C (PA, PC) dadurch gekennzeichnet, dass Sie mit der Phase B (PB) im Wesentlichen nicht mischbar sind. Im Wesentlichen bezeichnet im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung, einen Anteil kleiner als 1 Gew-%.
Die Phasen A und/oder C (PA5 PC) können eine höhere oder niedrigere Dichte als die Phase B (PB) haben. Die Dichte der Phasen A und/oder C und/oder B können z.B. über den Anteil und/oder die Art der in ihnen enthaltenen Salze und/oder Polymere eingestellt werden. Bevorzugt hat mindestens die Phase A (PA) eine höhere Dichte als die Phase B (PB). Besonders bevorzugt haben die Phasen A und C (PA, PC) eine höhere Dichte als die Phase B (PB).
Handelt es sich bei den Phasen A und C (PA, PC) um Lösungen umfassend mindestens ein Polymer in Wasser, so kann das mindestens eine Polymer ein Dextran oder eine Stärke oder ein Derivat der Stärke sein. Nicht abschließende Beispiele für geeignete Stärken oder Derivate der Stärke bilden etwa Wachsgerstenstärke (93-95 Gew.-% Amylopectin und 5-7 Gew.-% Amylase mit einem Molekulargewicht von etwa 500 kDa) oder Hydroxypropylstärken, bevorzugt mit einem Molekulargewicht von etwa 100 kDa bis etwa 200 kDa. Geeignete Stärken und Derivate der Stärken können zum Beispiel unter den Handelsnamen Reppal®PES100 oder Reppal®PES200 von der Firma Lyckeby Culinar AB, Schweden bezogen werden.
Die erfindungsgemäße Phase B (PB) umfasst üblicherweise eine Lösung von mindestens einem Polymer, das bevorzugt zumindest bis zu einem Anteil von 10 Gew-% in Wasser löslich ist. Ebenfalls bevorzugt umfasst die Phase B (PB) auch Salze, wie sie in den erfindungsgemäßen Phasen A und/oder C (PA, PC) verwendet werden.
Bevorzugte Polymere sind Polyethylenglykole, Polypropylenglykole sowie Derivate der beiden vorgenannten, Block-co-polymere dieser, Polyvinyl-, Polymethyl-, Polyethyl-, Polyetheralkohole Polyvinylpyrrolidone, Polyacrylate, Dextrane, Stärkederivate, wie zuvor bereits beschrieben Maltodextrane, Zellulosederivate.
Besonders bevorzugt ist Polyethylenglykol.
Ganz besonders bevorzugt ist Polyethlyenglykol mit molaren Massen zwischen 400 und 22.000 g/mol. Eine insbesondere bevorzugte Phase B (PB) umfasst 5-40 Gew-% Polyethlenglykol einer molaren Masse von etwa 3350 g/mol, sowie Natriumchlorid, ein Hydrogenphosphatsalz und ein Dihydrogenphosphatsalz.
Die verwendeten Polymere können thermosensitiv sein, oder nicht. In einer alternativen Ausfuhrungsform der Erfindung werden thermosensitive Polymere verwendet. Unter thermosensitiven Polymeren werden im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung Polymere verstanden, die dazu führen, dass die wässrige Lösung, in der sie gelöst sind, sich durch Erwärmen in zwei Phasen unterschiedlicher Dichte auftrennt. Ein Beispiel für ein thermosensitives Polymer ist etwa ein Block-co-polymer von Polyethylen und Polypropylen.
Extraktion bezeichnet im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung eine jeweils zweistufige Verfahrensweise, wobei in einem ersten Schritt zwei flüssige Phasen miteinander in Kontakt gebracht werden und in einem zweiten Schritt die Phasen wieder separiert werden. Das in Kontakt bringen der Phasen kann zum Beispiel durch Rühren, durch Erzwingen einer turbulenten Strömung, nach dem Fachmann bekannten Methoden wie etwa Durchtritt durch einen Spalt oder durch aneinander vorbeiführen der beiden Phasen im Gegenstrom, durchgeführt werden.
Bevorzugt ist eine Verfahrensweise, in der der Kontakt durch das aneinander vorbeifuhren der beiden Phasen im Gegenstrom erreicht wird. Hierdurch erreicht man einen guten Stoffaustausch zwischen den beiden Phasen, ohne dass die spätere Separation zu aufwändig wird. Der zweite Schritt der Extraktion kann zum Beispiel durch die dem Fachmann bekannte Methode der Zentrifugation, aber auch einfach durch Beruhigung der beiden Phasen erreicht werden. Die Beruhigung entspricht in diesem Fall der Zentrifugation im Schwerefeld der Erde. Bevorzugt ist eine einfache Beruhigung der Phasen, da hierdurch der apparative Aufwand des Verfahrens gering gehalten werden kann.
Besonders bevorzugt wird jedes Waschen / jede Extraktion in Mixler-Settler- Vorrichtungen, umfassend mindestens eine Extraktions-ΛVaschzone mit Gegenstromführung und mindestens eine Beruhigungszone durchgeführt.
Weiterhin kennzeichnend für eine Extraktion im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist die Tatsache, dass das therapeutische Protein (P) in einer Extraktion von einer Phase des wässrigen 2-Phasen-Extraktionssystems in die andere Phase überführt wird.
Waschen bezeichnet daher im Unterschied zur erfindungsgemäßen Extraktion den Sonderfall, dass das therapeutische Protein (P) vor und nach dem Durchführen eines solchen Verfahrensschrittes in der gleichen Phase verbleibt und stattdessen eine Verunreinigung (H, N) von einer Phase in eine andere überführt wird.
Dem Fachmann ist bekannt, dass weder im Falle der Extraktion noch im Falle des Waschens eine exakte Selektion des therapeutischen Proteins (P) oder der Verunreinigung (H, N) möglich ist. Vielmehr beziehen sich die beiden Definitionen von Waschen und Extraktion auf jenen Stoff (Verunreinigung oder therapeutisches Protein), der durch den günstigsten Verteilungskoeffizienten im 2-Phasensystem bevorzugt von einer Phase in die andere Phase überführt wird.
Der Verteilungskoeffizient ist ein stoffsystemspezifischer Parameter und bezeichnet einen Quotienten K, errechnet aus der Konzentration eines Stoffs in einer Phase X, dividiert durch die Konzentration des gleichen Stoffs in einer Phase Y, bei chemischem Gleichgewicht (d.h. nach unendlich langer Zeit) bei einem bestimmten Druck und einer bestimmten Temperatur.
Hieraus wird auch klar, dass ebenfalls ein Verteilungskoeffizient zwischen den Phasen selber besteht, so dass stets Anteile einer Phase in der jeweils anderen Phase vorhanden sind, wenn diese in Kontakt gebracht worden sind. Wie oben geschildert ist dies aber bevorzugt nur zu einem Anteil kleiner 1 Gew-% der Fall.
Dem Fachmann sind die Möglichkeiten bekannt mittels derer die Ausprägung des Verteilungskoeffizienten der mindestens zu extrahierenden/waschenden Stoffe (H, P, N) verändert werden kann. Als nicht abschließende Beispiele dienen hier die Änderung der Verhältnisse der in den Phasen (PA, PB, PC, PD, PE, PF) gegebenenfalls enthaltenen Salze, die Veränderung der Temperatur oder auch die Veränderung des Drucks. Dem Fachmann sind darüber hinaus die Methoden bekannt mittels derer er im Folgenden die Anteile der jeweiligen Extraktions- oder Waschphasen (PA, PB, PC) in den aus der Extraktionen, bzw. aus dem Waschen erhaltenen Lösungen erreichen kann. Nicht abschließende Beispiele für solche Methoden bilden die Einstellung genügend langer Verweilzeiten in Beruhigungszonen, in denen die beiden Phasen voneinander separiert werden, die Verwendung von geeigneten Vorrichtungen zur Unterstützung der Separation (wie etwa Zentrifugen), sowie die Einstellung der Intensität der Vermischung der beiden Phasen vor der jeweiligen Separation, etwa durch Einstellung geringerer Drehzahlen von gegebenenfalls verwendeten Rührern.
Geeignete Vorrichtungen, in denen die zwei Schritte der Extraktion oder des Waschens bevorzugt durchgeführt werden, umfassen Mixer-Settler- Apparate und Extraktionskolonnen, in dem Fachmann bekannten Ausführungsformen.
Das Vermengen gemäß Schritt a) des erfϊndungsgemäßen Verfahrens wird üblicherweise so durchgeführt, dass die Mischung A und die Phase A (PA) nach dem Vermengen jeweils zu Anteilen von 50 bis 90 Gew-% der Phase A (PA) und 10-50 Gew-% der Mischung A in Lösung 1 vorliegen. Bevorzugt liegen die Anteile der Phase A (PA) nach dem Vermengen zwischen 60 und 80 Gew-% und die Anteile der Mischung A zwischen 20 und 40 Gew-%. Besonders bevorzugt beträgt der Anteil der Mischung A an Lösung 1 nach dem Schritt a) des erfϊndungsgemäßen Verfahrens etwa 25 Gew-% und der Anteil der Phase A (PA) an Lösung 1 beträgt etwa 75 Gew- %. Lösung 1 bildet also eine homogene Mischphase der Mischung A mit Phase A (PA)
Bevorzugt wird in Schritt b) das therapeutische Protein (P) zusammen mit der niedermolekularen Verunreinigung (N) von der Phase A (PA) in die Phase B (PB) der Lösung bl extrahiert und die hochmolekulare Verunreinigung (H) verbleibt im Wesentlichen in der Phase A (PA) der Lösung b2.
Lösung bl umfasst besonders bevorzugt über 90 Gew-% der in Mischung A enthaltenen niedermolekularen Verunreinigung (N) und über 90 Gew-% des in Mischung A enthaltenen therapeutischen Proteins (P). Ganz besonders bevorzugt umfasst Lösung bl über 99 Gew-% der in Mischung A enthaltenen niedermolekularen Verunreinigung (N) und über 99 Gew-% des in Mischung A enthaltenen therapeutischen Proteins (P).
Lösung b2 umfasst besonders bevorzugt weniger als 10 Gew-% des in Mischung A enthaltenen therapeutischen Proteins (P) und über 90 Gew-% der in Mischung A enthaltenen hochmolekulare Verunreinigung (H). Ganz besonders bevorzugt umfasst Lösung b2 weniger als 1 Gew-% des in Mischung A enthaltenen therapeutischen Proteins (P) und über 99 Gew-% der in Mischung A enthaltenen hochmolekulare Verunreinigung (H). Bevorzugt wird Schritt c) des erfϊndungsgemäßen Verfahrens dadurch gekennzeichnet, dass eine Phase C (PC) eingesetzt wird, die in einer Kombination mit der Phase B (PB) verwendet wird, in der der Verteilungskoeffizient des therapeutischen Proteins (P) und der niedermolekularen Verunreinigung (N) so ausgeprägt ist, dass das therapeutische Protein (P) von der Phase B (PB) der Lösung bl in die Phase C (PC) der Lösung cl extrahiert wird und die niedermolekulare Verunreinigung (N) möglichst in der Phase B (PB) der Lösung c2 verbleibt.
Diese Verfahrensweise ist besonders vorteilhaft, weil mittels der Änderung des Verteilungskoeffizienten in einfacher Weise eine weitere Reinigung des therapeutischen Proteins (P) ermöglicht werden kann, ohne dass eine separate dritte Phase, die von einer der Phasen (PA, PC), die einander ähnlich sind, verwendet werden muss.
Eine alternative Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt c) eine Extraktion nur durch Temperaturänderung herbeigeführt wird, wobei mindestens ein thermosensitives Polymer in der Phase B (PB) verwendet wird, so dass sich im Rahmen von Schritt c) durch Temperaturbehandlung der Lösung bl zwei Phasen mit unterschiedlichen Löslichkeiten für das therapeutische Protein ausbilden.
Im Rahmen des alternativen Schrittes c) des neuen Verfahrens werden dann wieder zwei Lösungen cl und c2, mit den im Folgenden angegebenen Eigenschaften bzgl. ihres Gehaltes an therapeutischem Protein (P) und/oder niedermolekularer und/oder hochmolekularer Verunreinigung (H, N) gebildet.
Diese Alternative ist besonders vorteilhaft, weil hierdurch eine Extraktion ohne weitere Phase C (PC) stattfinden kann.
Lösung cl umfasst besonders bevorzugt über 90 Gew-% des in Lösung bl enthaltenen therapeutischen Proteins (P) und weniger als 40 Gew-% der in Lösung bl enthaltenen niedermolekularen Verunreinigung (N).
Lösung c2 umfasst besonders bevorzugt über 60 Gew-% der in Lösung bl enthaltenen niedermolekularen Verunreinigung (N) und weniger als 10 Gew-% des in Lösung bl enthaltenen therapeutischen Proteins (P).
Bevorzugt wird in Schritt d) das therapeutische Protein (P) von der Phase A (PA) in die Phase B (PB) der Lösung d2 extrahiert und die hochmolekulare Verunreinigung (H) verbleibt in der Phase A (PA) der Lösung dl . Lösung dl umfasst besonders bevorzugt mindestens über 90 Gew-% der in Lösung b2 enthaltenen hochmolekularen Verunreinigung (H).
Lösung d2 umfasst besonders bevorzugt mindestens über 90 Gew-% des in Lösung b2 enthaltenen therapeutischen Proteins (P).
Bevorzugt verbleibt in Schritt e) das therapeutische Protein (P) in Lösung el umfassend die Phase C (PC), während die niedermolekulare Verunreinigung (N) in die Phase B (PB) der Lösung e2 extrahiert wird.
Lösung el umfasst somit besonders bevorzugt mindestens über 90 Gew-% des in Lösung cl enthaltenen therapeutischen Proteins (P).
Lösung e2 umfasst somit besonders bevorzugt mindestens über 90 Gew-% der in Lösung cl enthaltenen niedermolekularen Verunreinigung (N).
Das hiermit beschriebene erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich insbesondere durch die Erzielung sehr hoher Reinheiten des therapeutischen Proteins (P) aus, die durch die Aufeinanderfolge der Extraktions- und Waschschritte erreicht wird. Es ist insbesondere überraschend gefunden worden, dass die separate extraktive Abrennung der mindestens einen hochmolekularen Verunreinigung (H) und die weitere extraktive Abtrennung der mindestens einen niedermolekularen Verunreinigung (N) zusammen mit dem Waschen die Aufgabe besonders vorteilhaft lösen, da für keinen der erfindungsgemäßen Schritte besondere Vorrichtungen benötigt werden, die über die dem Fachmann bekannten Vorrichtungen zur Extraktion hinaus gehen. Vielmehr können alle Einzelschritte in baugleichen Vorrichtungen durchgeführt werden, da das erfinderische Verfahren stets vermittels gleicher oder ähnlicher Phasen durchgeführt werden kann.
Diese Eigenschaften des erfindungsgemäßen Verfahrens ermöglichen die im Folgenden dargestellten bevorzugten Weiterentwicklungen des Verfahrens.
Eine erste bevorzugte Weiterentwicklung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird dadurch gekennzeichnet, dass die aus Schritt d) erhaltene Lösung d2 zusammen mit der Phase B (PB) wieder Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens zugeführt wird. Besonders bevorzugt wird die Phase B (PB) nur noch Schritt d) des erfindungsgemäßen Verfahrens zugeführt und die Lösung d2 ersetzt die Phase B (PB) des erfindungsgemäßen Schrittes b).
Diese Weiterentwicklung ist vorteilhaft, weil hiermit die Ausbeute des therapeutischen Proteins (P) aus dem erfindungsgemäßen Verfahren gesteigert wird, ohne dass ein apparativer
Mehraufwand entsteht. Außerdem kann die Phase B (PB), enthalten in Lösung d2, noch einmal zur Extraktion verwendet werden, was wiederum die Betriebskosten eines so betriebenen Verfahrens verringert.
Eine weitere, ebenfalls bevorzugte Weiterentwicklung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird dadurch gekennzeichnet, dass nach Schritt d) des erfϊndungsgemäßen Verfahrens in einem Schritt d*) die aus Schritt d) erhaltene Lösung dl einer Ultra- oder Nanofiltration und gegebenenfalls einer Umkehrosmose unterzogen wird, in der die hochmolekulare Verunreinigung (H) von der Phase A (PA) getrennt wird und diese gegebenenfalls nach Zugabe von weiterem Salz zum Ausgleich der Verluste zusammen mit der Lösung 1 wieder Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens zugeführt wird.
Findet im Rahmen von Schritt d*) eine Umkehrosmose statt, so entfällt die Zugabe von weiterem Salz zum Ausgleich der Verluste, da die Phase A (PA) hiermit wieder auf den gewünschten Anteil der Salze angepasst werden kann.
Sowohl die Ultra- oder Nanofiltration, als auch die Umkehrosmose werden hierbei in dem Fachmann allgemein bekannter Weise betrieben. Weiterhin ist dem Fachmann bekannt, welche Vorrichtungen zur Durchführung dieser Verfahren verwendet werden.
Die Durchführung des Schrittes d*) ist besonders vorteilhaft, weil hierdurch zum einen die hochmolekulare Verunreinigung (H) in sehr reiner Form in der Phase A (PA) zur Verfügung gestellt werden kann und diese unter Umständen ebenfalls ein Wertprodukt, wie oben bereits beschrieben, darstellt, was die Wirtschaftlichkeit des gesamten Verfahrens erhöht.
Eine ebenfalls bevorzugte Weiterentwicklung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird gekennzeichnet durch einen Schritt c*), in Form einer weiteren Extraktion der aus Schritt c) resultierenden Lösung c2 unter Verwendung der Phase C (PC), oder einer zu Phase C im Wesentlichen ähnlichen Phase D (PD), erhaltend eine Lösung c*l, umfassend mindestens einen Anteil der Phase C oder D (PC, PD) und mindestens einen Anteil des therapeutischen Proteins (P), sowie erhaltend eine Lösung c*2, umfassend mindestens einen Anteil der Phase B (PB) und mindestens einen Anteil der niedermolekularen Verunreinigung (N).
Bevorzugt wird in Schritt c*) das verbleibende therapeutische Protein (P) von der Phase B (PB) in die Phase C oder D (PC, PD) der Lösung c*l extrahiert und die niedermolekulare Verunreinigung (N) verbleibt in der Phase B (PB) der Lösung c*2.
Lösung c*l umfasst besonders bevorzugt über 90 Gew-% des in Lösung c2 enthaltenen therapeutischen Proteins (P). Ganz besonders bevorzugt umfasst Lösung c*l über 99 Gew-% des in Lösung c2 enthaltenen therapeutischen Proteins (P). Lösung c*2 umfasst besonders bevorzugt über 90 Gew-% der in Lösung c2 enthaltenen niedermolekularen Verunreinigung (N). Ganz besonders bevorzugt umfasst Lösung c*2 über 99 Gew-% der in Lösung c2 enthaltenen niedermolekularen Verunreinigung (N).
Die Durchführung des Schrittes c*) ist bevorzugt, weil hierdurch die niedermolekulare Verunreinigung (N) in sehr reiner Form in der Phase B (PB) zur Verfügung gestellt werden kann und diese unter Umständen ebenfalls ein Wertprodukt, wie oben bereits beschrieben, darstellt, was die Wirtschaftlichkeit des gesamten Verfahrens erhöht.
Eine ebenfalls bevorzugte Weiterentwicklung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird gekennzeichnet durch einen Schritt e*), in Form einer weiteren Extraktion der aus Schritt e) resultierenden Lösung e2 unter Verwendung der Phase C (PC), oder einer zu Phase C im Wesentlichen ähnlichen Phase E (PE), erhaltend eine Lösung e*l, umfassend mindestens einen Anteil der zugeführten Phase C oder E (PC, PE) und mindestens einen Anteil des therapeutischen Proteins (P), sowie erhaltend eine Lösung e*2, umfassend mindestens einen Anteil der Phase B (PB) und mindestens einen Anteil der niedermolekularen Verunreinigung (N).
Bevorzugt verbleibt in Schritt e*) das therapeutische Protein (P) in Lösung e*l umfassend die Phase C oder E (PC, PE), während die niedermolekulare Verunreinigung (N) in die Phase B (PB) der Lösung e*2 extrahiert wird.
Lösung e*l umfasst besonders bevorzugt mindestens über 90 Gew-% des in Lösung e2 enthaltenen therapeutischen Proteins (P).
Lösung e*2 umfasst besonders bevorzugt mindestens über 90 Gew-% der in Lösung e2 enthaltenen niedermolekularen Verunreinigung (N).
Die Durchführung des Schrittes e*) ist bevorzugt, weil hierdurch die niedermolekulare Verunreinigung (N) in sehr reiner Form in Phase B (PB) zur Verfügung gestellt werden kann und diese unter Umständen ebenfalls ein Wertprodukt, wie oben bereits beschrieben, darstellt, was die Wirtschaftlichkeit des gesamten Verfahrens erhöht.
In einer besonders bevorzugten Weiterentwicklung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Schritte c*) und e*) durchgeführt und die Lösung c*l mit Lösung e*l vereinigt und diese wiederum entweder zusammen mit der Schritt c) zugeführten Phase C (PC), oder an Stelle dieser in Schritt c) des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet.
In einer ebenfalls besonders bevorzugten Weiterentwicklung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Schritte c*) und e*) durchgeführt und die Lösung c*2 und Lösung e*2 vereinigt und entweder zusammen mit der Phase B (PB) Schritt e) zugeführt oder an Stelle von Phase B (PB) in Schritt e) des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet.
Diese Weiterentwicklung ist besonders vorteilhaft, weil hiermit die Phase B (PB) im gesamten Verfahren mehrfach verwendet werden kann, so dass somit die Betriebskosten des Verfahrens gesenkt werden.
Ganz besonders bevorzugt werden die Lösung c*2 und Lösung e*2 an Stelle der Phase B (PB) Schritt e) zugeführt, wobei gegebenenfalls zuvor die vereinigte Lösung der Lösungen Lösung c*2 und Lösung e*2 gemäß eines Schrittes f) einer weiteren Behandlung unterworfen wird.
Wird ein Schritt f) durchgeführt, so kann dieser eine Extraktion der niedermolekularen Verunreinigung (N) aus der Vereinigung der Lösung c*2 und Lösung e*2 unter Verwendung einer Phase F (PF) umfassen, wobei die Phase F (PF) ein thermosensitives Polymer umfasst und die Extraktion gemäß der alternativen Ausführungsform des Schrittes c) ausgeführt wird.
Alternativ kann der Schritt f) auch eine Verdampfungskristallisation und/oder eine Kristallisation und/oder Präzipitation und/oder Ultra- oder Nanofiltration umfassen, in der die niedermolekulare Verunreinigung (N) abgetrennt wird.
Die Weiterentwicklung des Verfahrens durch einen Schritt f) ist besonders vorteilhaft, weil hierdurch die niedermolekulare Verunreinigung (N) in besonders hoher Reinheit als weiteres Nebenprodukt des erfmdungsgemäßen Verfahrens zur Verfügung gestellt werden kann und somit die Wirtschaftlichkeit des Verfahrens durch den Verkauf derselben gesteigert wird. Weiter kann hierdurch die Phase B (PB) recycelt und gegebenenfalls im Verfahren an anderer Stelle wieder verwendet werden, wodurch die Betriebskosten des Verfahrens verringert werden.
Wird als Schritt f) der bevorzugten Weiterentwicklung des erfindungsgemäßen Verfahrens eine Extraktion eingesetzt, so wird diese bevorzugt so betrieben, wie dies in den bevorzugten oder alternativen Varianten des erfindungsgemäßen Schrittes c) bereits beschrieben ist. Besonders bevorzugt wird hierbei die verwendete Phase F (PF) unter vorherigem Einsatz einer Ultra- oder Nanofiltration zur Abtrennung der niedermolekularen Verunreinigung (N) im Kreislauf geführt.
Die Ausgestaltung des Schrittes f) in der gerade dargelegten Form ist besonders vorteilhaft, weil die hierfür verwendeten Vorrichtungen baugleich zu den bereits im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Vorrichtungen sind. Somit ist diese Ausgestaltung besonders wirtschaftlich, da die Auslegung der Vorrichtungen bereits für das erfindungsgemäße Verfahren stattgefunden hat.
In weiteren bevorzugten Weiterentwicklungen des Verfahrens kann die aus Schritt e) erhaltene Lösung el mindestens einem weiteren Reinigungsschritt g) unterworfen werden, der dadurch _ _
gekennzeichnet ist, dass er keine erfindungsgemäße Extraktion oder kein erfindungsgemäßes Waschen umfasst.
Dieser weitere Reinigungsschritt g) kann eine Ultrafiltration, Nanofiltration oder Chromato- graphische Verfahren umfassen. Die aus dem bevorzugten Reinigungsschritt g) erhaltene Lösung g umfassend die Phase C (PC) wird besonders bevorzugt mit der Lösung c*l und der Lösung e*l vereinigt und zusammen mit der Schritt c) zugeführten Phase C (PC), oder an Stelle dieser in Schritt c) des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet.
Für alle erfindungsgemäßen Verfahrensschritte und deren bevorzugten Varianten, wie auch für die Weiterentwicklungen und deren bevorzugten Varianten gilt, dass sie kontinuierlich oder diskonti- nuierlich durchgeführt werden können. Bevorzugt werden alle Verfahrensschritte kontinuierlich durchgeführt.
Alle Verfahrensschritte können auch in ähnlicher Form mehrfach ausgeführt werden, ohne dass ein weiterer erfinderischer Gedanke notwendig würde. Dies gilt ebenso für die Weiterentwicklungen des Verfahrens.
Eine spezielle Ausführungsform des neuen Verfahrens wird Anhand von Fig. 1 näher erläutert, ohne die Erfindung hierauf zu beschränken.
Fig. 1 zeigt, wie in einem Schritt a) die Mischung A mit einer Phase A (PA) vereinigt wird und zunächst einer Gegenstromextraktion b) unter Verwendung einer zweiten Phase B (PB) unterworfen wird. Hieraus resultieren nach Beruhigung zwei Phasen bi und b2 umfassend Lösungen bi und b2. Die Lösung bi wird einer weiteren Gegenstromextraktion c) unter Verwendung einer Phase C (PC) unterworfen. Hieraus resultieren nach Beruhigung zwei Phasen Ci und C2 umfassend Lösungen Ci und C2. Die Lösung ci wird einem Gegenstromwaschen unter Verwendung einer weiteren Phase B (PB) gemäß einem Schritt e) unterzogen, aus dem nach Beruhigung zwei Phasen βi und e2 umfassend Lösungen ei und e2 resultieren. Die aus Schritt b) erhaltene Phase b2 umfassend die Lösung b2 wird einer weiteren Gegenstromextraktion d) unter Verwendung der Phase B (PB) unterworfen, aus der nach Beruhigung die Phasen di und d2 umfassend die Lösungen di und d2 resultieren. Die Phase ei umfassend die Lösung ei enthält das hochreine therapeutische Protein.
Nachfolgend werden spezielle Ausführungsformen der Erfindung anhand von Beispielen erläutert, ohne jedoch die Erfindung auf diese zu beschränken. Beispiele:
Analytische Methoden und Definitionen
Der Gesamtproteingehalt in der jeweiligen Salzlösung bzw. Polymerlösung wird durch einen Bradford-Assay gemäß der wissenschaftlichen Veröffentlichung von MM. Bradford, Anal. Biochem 27 (1976) 248 bestimmt. Um Einflüsse durch die Lösungskomponenten zu vermeiden, werden die Proben zunächst verdünnt und gegen eine Leerprobe analysiert.
Die Antikörperkonzentration in beiden Lösungen wird durch Protein A Affinitätschromatographie auf einer Porös Protein A Säule (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) bestimmt. Als Bindungspuffer wird ein 1OmM Natriumphosphatpuffer mit 15OmM NaCl mit einem pH- Wert von 8.5 benutzt. Die Elution erfolgt mit 12mM HCl mit 15OmM NaCl. Die Absorption wird bei 280nm betrachtet. Die Proben beider Phasen werden in einem Probenpuffer bestehend aus 0.05 Vol.-% Tween80, 15OmM NaCl in 1OmM Natriumphosphatpuffer pH 8.5 verdünnt.
Die Reinheit beider Phasen wird durch eine Größenausschlusschromatographie (SEC) mit Hilfe einer TSK-GeI Super SW3000 Säule (30 cm x 4.6 mm I.D., 4μm) von Tosoh Bioscience (Stuttgart, Deutschland) bestimmt. Die Proben werden vor der Analyse mindestens lOfach mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung (PBS) verdünnt. Die Analyse erfolgt isokratisch bei 0.35mL/min mit einem 5OmM Phosphatpuffer mit 30OmM NaCl bei einer Wellenlänge von 215nm.
Um die Leistung der Verfahren beurteilen zu können, wurden unterschiedliche Parameter verwendet. Der Verteilungskoeffizient KP beschreibt das Konzentrationsverhältnis des Proteins in der jeweiligen Phase geringerer Dichte bezogen auf Phase mit der jeweils höheren Dichte in einem jeweiligen 2-Phasen-System der Einzelschritte. Die Proteinausbeute in der jeweiligen Phase mit der geringeren Dichte Yτop ist definiert als das Verhältnis der Antikörpeπnasse in der dieser Phase bezogen auf die gesamte dem System zugeführte Antikörpermasse. Die Produktreinheit in der jeweiligen Phase mit der geringeren Dichte PSEC wird aus der beschriebenen SEC-Messung bestimmt als der Quotient aus der Fläche des IgG-Peaks und der Summe aller Peaks in dieser Phase.
Zusätzlich wird die Produktreinheit anhand des Bradford-Assays bestimmt Peraäford- In diesem Fall ist die Reinheit das Verhältnis der IgG-Konzentration bezogen auf die Konzentration aller Proteinkomponenten in der jeweiligen Phase mit geringerer Dichte. Der Aufreinigungsfaktor wird angegeben als Prozentwert der entfernten Verunreinigungen. Beispiel 1:
Es wurde eine Stammlösung von 50 Gew-% Polyethylenglykol (PEG) mit einem mittleren Molekulargewicht von 3350 g/mol (Sigma St. Louis, MO, USA) in Wasser hergestellt. Weiter wurden Stammlösungen von Phosphatpuffern bestehend aus wasserfreiem Kaliumhydrogen- phosphat (K2HPO4), wasserfreiem Natriumdihydrogenphosphat (NaH2PO4) und Natriumchlorid (NaCl) zu 40 Gew-% in Wasser, eingestellt auf verschiedene pH- Werte gemäß Tabelle 1, hergestellt.
Tabelle 1: Zusammensetzung der Stammlösungen 40 Gew.-%-igen Phosphatpuffers
Puffer pH NaH2PO4 (g) K2HPO4 (g) H2O (g)
~6 28 22 75
7 16 34 75
8 6 44 75
Für die Versuche wurde menschliches IgG für therapeutische Anwendungen (Gammanorm®Octa- pharma, Lachen, Schweiz) enthaltend eine Konzentration von 165mg/mL bei einem Anteil von 95 Gew-% IgG am Gesamtproteingehalt, sowie ein Zellkulturüberstand einer Chinese Hamster Ovary (CHO) Zellkultur mit einem IgGi gegen eine menschliches Oberflächenantigen (Fa. Excellgene, Monthey, Schweiz) verwendet. Letzteres wurde in einer Konzentration von 120mg/L bezogen auf das Endvolumen eingesetzt und mit 0,5 g/L Gammanorm® angereichert.
Die wässrigen Zwei-Phasen-Systeme wurden vorbereitet, indem die Polymerlösung und die Salzlösung jeweils für sich aus den Stammlösungen erstellt wurden. Die Polymerlösung und die Salzlösung bildeten die zwei Phasen.
Die Salzlösung wurde so vorbereitet, dass die benötigten Konzentrationen von NaCl und Phosphatpuffer nach der Hinzugabe des CHO-Zellüberstandes erreicht wurden. Der CHO- Zellüberstand wurde in einer Konzentration von 25 Gew.-% der resultierenden Salzlösung zugesetzt.
Die Polymerlösung wurde durch Stammlösung PEG und eine Salzlösung bestehend aus NaCl und Phosphat gebildet und dem Verfahren zugeführt. Die Salzlösung und die Polymerlösung in dem Verfahren bestanden ursprünglich zusammen aus 8 Gew.-% PEG mit einer mittleren molaren Masse von 3350 g/mol (PEG3350), 10 Gew.-% Phosphatpuffer mit einem pH von 6 und 10 Gew.-% NaCl.
Eie Zusammensetzung der Phasen nach Einstellung des Verteilungsgleichgewichts des Verfahrens entsprach in Bezug auf PEG335O und Phosphat der in Tabelle 2 gezeigten Zusammensetzung bei einem Phasenverhältnis von 0.4.
Tabelle 2: Zusammensetzung und physikalische Eigenschaften der Salzlösung und der Polymerlösung
Komponenten / Eigenschaften Salzlösung Polymerlösung
% (w/w) Phosphate (PO4 3") 14.6 2.7 % (w/w) PEG 3350 O.Ol 29.1
% (w/w) er 12.6 8.5 p (Kg/m3) 1236 1161 μ (cp) 2.8 27.0
Für die Durchführung des Versuches wurde eine Gegenstrom-Mixer-Settler-Batterie (MSB) verwendet, bestehend aus einer Extraktion umfassend sechs Extraktions- und Beruhigungszonen, einer Rückextraktion umfassend eine Extraktions- und Beruhigungszone und einer Wäsche, umfassend drei Extraktions- und Beruhigungszonen.
13.5 kg der Salzlösung (ohne den CHO Zeilüberstand) und 9 kg der Polymerlösung wurden vorbereitet. Die Abscheider wurden zunächst halb mit der Polymerlösung gefüllt. Anschließend wurde die Salzlösung und der CHO Zeilüberstand (angereichert mit Gammanorm, s.o.) in die MSB gegeben.
Sobald die oben genannte Salzlösung den dritten Abscheider erreichte, wurden die Polymerlösung, sowie die Salzlösung für die leichte Phase im Gegenstrom in die MSB gefahren. Für die Rückextraktion wurden 15 kg einer 14 Gew.-%-igen Phosphatlösung mit pH 6 vorbereitet. Der Abscheider im Rückextraktionsschritt wurde zur Hälfte mit dieser Lösung gefüllt. Sobald die leichtere Phase (im Wesentlichen Polymerlösung) aus dem Extraktionsschritt im Mixer des Rückextraktionsschrittes angekommen war, wurde die Phosphatlösung in den gleichen Mixer gefördert. Anschließend wurden 20 kg einer 35 Gew.-%-igen PEG335O Lösung ebenfalls vorbereitet. Alle drei Abscheider der Waschstufe wurden zur Hälfte hiermit gefüllt. Tabelle 3: Betriebsbedingungen der MSB gemäß Beispiel 1
F BP ' CHO Zellüberst F 50% PEG 3350 F salzsol. F 14% Phosphate F 35% PEG 3350
Schritt
(ml/h) (ml/h) (ml/h) (ml/h) (ml/h) (ml/h)
Extraktion 450 195 202 131
Rück¬
1011 extraktion Wäsche 1559
Alle Verfahrensschritte wurden im Gegenstromverfahren betrieben. Die genauen Betriebsbedingungen der einzelnen Verfahrensschritte sind Tabelle 3 zu entnehmen
Die Ergebnisse für die Aufreinigung von IgG aus CHO Zellkulturüberstand sind in Tabelle 4 dargestellt.
Tabelle 4: Kennzahlen der Reinigung von IgG gemäß Beispiel 1
[IgG] Top/Bottom I Top/Bottom P SEC Aufreiniguns
Schritt
(mg/ml) (%) (%) faktor (%)
Start — 20 —
Extraktion 0.28 89 26 42
Rückextration 0.08 89 43 79
Wäsche 0.33 101 98 99.6
Es zeigten sich insbesondere die Vorteile einer mehrstufigen Gegenstrombetriebsweise. Eine globale Ausbeute von 80% und eine abschließende Reinheit von 98% konnten erreicht werden. Gleichzeitig ließ sich hieraus ableiten, dass mehr als 99% aller Nebenkomponenten mittels des Verfahrens entfernt werden konnten.
Damit ergab sich eine Gesamtabreicherung aller Nebenkomponenten von über 99%. Das therapeutische Protein konnte mit diesem Verfahren in typischen Extraktionsapparaten von seinen Verunreinigungen getrennt werden und mit hoher Reinheit und Ausbeute gewonnen werden. Tabelle 5: Prozentualer Anteil der entfernten Verunreinigungen des CHO-Zellüberstandes (*:Retentionszeit von Verunreinigungen in chromatographischer Analyse)
Entfernung der Komponenten des CHO-Zellüberstandes(%)
5.5 9.8 11.5 11.9 13.1 13.6 14.5 16.3 17.2
Schritt min IgG min min min min min min min min
Extraktion 100 — 67 65 32 26 0 0 0 0
Rückextraktion 100 76 100 47 100 59 100 100 100
Wäsche 100 — 85 100 100 100 100 100 100 100
Beispiel 2:
Abweichend zu Beispiel 1 wurden zehn statt sechs Extraktions- und Beruhigungszonen für den Verfahrensschritt der Extraktion verwendet. Darüber hinaus wurde die Konzentration an IgG auf 1,5 g/L erhöht, um zu demonstrieren, dass das Verfahren auch für Fermentrationsüberstände mit hohen Produktkonzentrationen verwendet werden kann. Die genauen Betriebsbedingungen sind in Tabelle 6 dargestellt. Die verwendeten Lösungen sind analog zu Beispiel 1 angesetzt worden.
Tabelle 6: Betriebsbedingungen für die MSB zur Reinigung von IgG
F BP F CHO Zellüberst F 50% PEG 3350 F Salz sol. F 14% Phosphate F 30% PEG 3350
Schritt
(ml/h) (ml/h) (ml/h) (ml/h) (ml/h) (ml/h)
Extraktion 410 185 205 130 — —
Rück¬
— — — — 485 — extraktion
Wäsche — — — — — 580
Die Ergebnisse des Verfahrens gemäß Beispiel 2 sind in Tabelle 7 dargestellt.
Eine globale Ausbeute von 80% und eine abschließende Reinheit von 99% konnten erreicht werden. Das bedeutet, dass auch hier mehr als 99% der Verunreinigungen entfernt werden konnten. Eine noch höhere Ausbeute konnte dadurch erzielt werden, dass die schwere Phase (im Wesentlichen die Salzlösung) aus dem ersten Extraktionsschritt einer weiteren Extraktion unterzogen wurde. In diesem Fall erhöhte sich die globale Ausbeute auf 85%.
Tabelle 7: Kennzahlen der Reinigung von IgG gemäß Beispiel 2
[IgG] Aggregat Aufreinigungs¬
* Top/Bottom P SEC Pßradford
Schritt Top/Bottom Entfernung faktor (%) (%) (%)
(mg/ml) (%) (%)
Start — — 41 78 — —
Extraktion 0.66 77 46 102 69 45
Rückextraktion 0.57 102 64 100 74 73
Wäsche 1.07 102 99 101 75 99.5
Ein Großteil der hochmolekularen Verunreinigungen wurde bereits während des ersten Extraktionsschrittes abgetrennt (siehe Tabelle 8). Die niedermolekularen Verunreinigungen hingegen wurden erst durch Rückextraktion bzw. Wäsche entfernt.
Die Gesamtabreicherung aller Nebenkomponenten beträgt mehr als 99%.
Tabelle 8: Prozentualer Anteil der entfernten Verunreinigungen (*:Retentionszeit von Verunreinigungen in Chromatographischer Analyse)
Entfernung der Komponenten des CHO-Zellüberstandes(%)
5.5 9.5 11.6 13.0-13.9 16.4 17.9
Schritt IgG min* min* min* min* min* min*
Extraktion 100 77 44 7 0 0
Rückextraktion 100 79 70 74 100 100
Wäsche 100 84 100 100 100 100
Im Anschluss an die Wäsche wurde die erhaltene Lösung diafiltriert. Dazu wurde die schwere Phase (im Wesentlichen die Salzlösung) aus der Wäsche absatzweise konzentriert und in PBS- Puffer diafiltriert.
Es wurde eine Laborquerstromfiltration, wie sie kommerziell erhältlich ist, verwendet (z.B. Sartoflow® Slice 200 benchtop crossflow System). Die verwendete Membran hatte einen Cut-Off von 30 kDa mit einer Membranfläche von 200cm2 pro Kassette. Drei Kassetten wurden parallel genutzt, so dass eine aktive Membranfläche von 600cm2 erhalten wurde.
Das Ausgangsvolumen betrug 90OmL. Während der Diafiltration wurde die ursprüngliche schwere Phase (im Wesentlichen die Salzlösung) gegen PBS-Puffer ausgetauscht. Der Austauschfaktor betrug ca. sieben (90OmL Ausgangslösung gegen 690OmL PBS-Puffer).
Die Temperatur wurde konstant bei 22-24°C gehalten und die Durchströmung der Filter auf 450 rnL/min eingestellt.
Die Hauptkomponente wurde zurück gehalten, während die Salze (über die Leitfähigkeit detektiert) ausgewaschen wurden.
Während des gesamten Versuchs konnte kein IgG im Permeat gefunden werden.
Es konnte somit gezeigt werden, dass es möglich ist den Puffer auszutauschen und den Antikörper ohne Ausbeuteverluste um Faktor 5,87 aufzukonzentrieren. Phosphat sowie PEG sind quantitativ entfernt worden.

Claims

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Reinigung therapeutischer Proteine, ausgehend von einer Mischung A umfassend mindestens ein therapeutisches Protein (P), mindestens eine hochmolekulare Verunreinigung (H) und mindestens eine niedermolekulare Verunreinigung (N), dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens die Schritte:
a. Vermengen der Mischung A mit einer Phase A (PA), erhaltend eine Lösung 1,
b. Extraktion der aus Schritt a) resultierenden Lösung 1 unter Verwendung eine Phase B (PB), erhaltend eine Lösung bl umfassend einen Anteil der Phase B (PB), mindestens einen Anteil des therapeutischen Proteins (P) und mindestens einen Anteil der niedermolekularen Verunreinigung (N), sowie erhaltend eine
Lösung b2 umfassend einen Anteil der Phase A (PA), mindestens einen Anteil der hochmolekularen Verunreinigung (H) und gegebenenfalls einen Anteil des therapeutische Protein (P),
c. weitere Extraktion der aus Schritt b) resultierenden Lösung bl unter Verwendung einer Phase C (PC), erhaltend eine Lösung cl, umfassend mindestens einen Anteil der zugeführten Phase C (PC), mindestens einen Anteil des therapeutischen Proteins (P) und gegebenenfalls einen Anteil der niedermolekularen Verunreinigung (N), sowie erhaltend eine Lösung c2, umfassend mindestens einen Anteil der mit Lösung bl zugeführten Phase B (PB), mindestens einen Anteil der niedermolekularen Verunreinigung (N) und gegebenenfalls einen Anteil des therapeutischen Proteins (P),
d. weitere Extraktion der aus Schritt b) resultierenden Lösung b2 unter Verwendung weiterer Phase B (PB), erhaltend eine Lösung dl umfassend mindestens einen Anteil der mit Lösung b2 zugeführten Phase A (PA) und mindestens einen Anteil der hochmolekularen Verunreinigung (H), sowie erhaltend eine Lösung d2 umfassend mindestens einen Anteil Phase B (PB) und gegebenenfalls einen Anteil des therapeutischen Proteins (P),
e. Waschen der aus Schritt c) resultierenden Lösung cl unter Verwendung weiterer Phase B (PB), erhaltend das eine Lösung el, umfassend mindestens einen Anteil der Phase C (PC), mindestens einen Anteil des therapeutischen Proteins (P), gegebenenfalls einen Anteil der niedermolekularen Verunreinigung (N), sowie erhaltend eine Lösung e2, umfassend mindestens einen Anteil der Phase B (PB), mindestens einen Anteil der niedermolekularen Verunreinigung (N) und gegebenenfalls einen Anteil des therapeutischen Proteins (P).
umfasst.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das therapeutische Protein (P), in medizinischen Verfahren am Menschen verwendet werden kann.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die hochmolekulare, oder die niedermolekulare Verunreinigung (H, N) Insulin, Wachstumshormone, Albumine, Interleukine, Interferone, DNA, Lectin, Erythropoetin, Glukose, Laktat, Aminosäuren sind.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass Mischung A Organis- men oder andere Feststoffe enthält.
5. Verfahren nach einem der vorigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Phasen A (PA) und C (PC) Lösungen von mindestens einem Salz und/oder mindestens einem Polymer in Wasser sind.
6. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Phase B (PB) eine Lösung von mindestens einem Polymer umfasst, wobei das Polymer zumindest bis zu einem Anteil von 10 Gew-% in Wasser löslich ist.
7. Verfahren nach einem der vorigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt c) eine Extraktion nur durch Temperaturänderung herbeigeführt wird, wobei mindestens ein thermosensitives Polymer in der Phase B (PB) der Lösung bl vorhanden ist.
8. Verfahren nach einem der vorigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die aus Schritt d) erhaltene Lösung d2 zusammen mit der Phase B (PB) oder anstelle dieser Schritt b) zugeführt wird.
9. Verfahren nach einem der vorigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass nach Schritt d) die Lösung dl einer Ultra- oder Nanofiltration und gegebenenfalls einer Umkehrosmose unterzogen wird.
10. Verfahren nach einem der vorigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung c2 einer weiteren Extraktion, erhaltend eine Lösung c*l und Lösung c*2 unterzogen wird.
11. Verfahren nach einem der vorigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung e2 einer weiteren Extraktion, erhaltend eine Lösung e*l und Lösung e*2 unterzogen wird.
12. Verfahren nach einem der vorigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösungen c*2 und e*2 vereinigt und zusammen mit/anstelle von Phase B (PB) Schritt e) zugeführt werden, wobei sie gegebenenfalls zuvor einer weiteren Behandlung unterworfen werden.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die weitere Behandlung eine Extraktion der niedermolekularen Verunreinigung (N) unter Verwendung einer Phase F
(PF) umfassend ein thermosensitives Polymer ist, oder eine Verdampfungskristallisation und/oder eine Kristallisation und/oder Präzipitation und/oder Ultra- oder Nanofiltration ist.
14. Verfahren nach einem der vorigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung el einem Reinigungsschritt erhaltend eine Lösung g unterworfen wird, wobei der Reinigungsschritt eine Ultrafiltration, eine Nanofiltration oder eine chromatographisches
Verfahren umfasst.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass Lösung g mit den Lösungen c*l und Lösung e*l vereinigt und zusammen mit /anstelle von Phase C (PC) Schritt c) zugeführt wird.
16. Verfahren nach einem der vorigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass jedes
Waschen / jede Extraktion in Mixler-Settler- Vorrichtungen, umfassend mindestens eine Exrtaktions-/Waschzone mit Gegenstromführung und mindestens eine Beruhigungszone durchgeführt wird.
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