WO2009096443A1 - １重項酸素の消去過程の解明とその過程に関わる分子の増強による菌類及び／又は植物の新規高能率変異株の単離法 - Google Patents

１重項酸素の消去過程の解明とその過程に関わる分子の増強による菌類及び／又は植物の新規高能率変異株の単離法 Download PDF

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plant
strain
wild
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Kohji Hasunuma
Yusuke Yoshida
Emdadul Haque Mohammed
Fuminori Satou
Hiroaki Harata
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Public University Corporation Yokohama City University
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    • C12N15/01—Preparation of mutants without inserting foreign genetic material therein; Screening processes therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
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    • A01H1/06—Processes for producing mutations, e.g. treatment with chemicals or with radiation
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1229—Phosphotransferases with a phosphate group as acceptor (2.7.4)

Definitions

  • the present invention relates to a method for obtaining a novel high-efficiency mutant of fungi and / or plants, and a fungal and plant mutant obtained by the method.
  • Plants carry out photosynthesis under intense light, which is difficult to reproduce in the laboratory, sunlight (1000-2500 ⁇ mole.m -2 .sec -1 ).
  • the photosynthetic rate in the open field shows a maximum value at 10:00 in the morning and 4 o'clock in the afternoon, and the photosynthetic rate decreases in the daytime.
  • Photosynthesis is performed under strong light in the daytime, but chlorophyll is excited to triplet chlorophyll by strong light, and its energy is transferred to triplet oxygen to generate a large amount of singlet oxygen (FIG. 1).
  • Singlet oxygen destroys lipids in the thylakoid membrane of photosynthetic organs as lipid peroxides. It enables ion outflow from the membrane structure and reduces the photosynthesis rate.
  • a technique for inducing a mutation that makes it possible to quickly erase the generated singlet oxygen is required.
  • the present inventors have developed a method using methyl viologen (Mv), hydrogen peroxide, and NO as mutagens as a method for obtaining mutant plants of various plants, and applied for a patent (Patent Document 1).
  • the inventors of the present invention have used the nucleoside diphosphate kinase (NDK-1) point mutant ndk-1 P72H (Y Ogura, Y Yoshida, N Yabe and K Hasunuma: A point mutation in nucleoside diphosphate kinase results in a deficient light response for perithecial polarity in Neurospora crassa.J. Biol. Chem. 276; 21228-21234, 2001.) and knockout strains (B Lee, Y Yoshida and K Hasunuma: Photomorphogenetic characteristics are severely affected in nucleoside diphosphate kinase-1 ( ndk-1) -disrupted mutants in Neurospora crassa.
  • NDK-1 and Cat-1 formed an NDK-1 / Cat-1 complex and involved in light transmission.
  • Both Cat-1 and Cat-3 are known to bind singlet oxygen (F Lledias, P Rangel, W Hansberg; Oxidation of catalase by singlet oxygen.J Biol Chem 273: 10630-10637, 1998).
  • the NDK-1 / Cat-1 complex has been shown to be involved in the singlet oxygen scavenging process.
  • the inventors of the present invention have used wild-type red mold, ndk-1 P72H mutant, cat-1 RIP mutant, and double mutants thereof, under a strong light irradiation (100 ⁇ mol / m 2 / sec).
  • the wild strain and the cat-1 RIP mutant were resistant to singlet oxygen, and the ndk-1 P72H mutant was sensitive.
  • ( 32 P) NADH binding experiments were performed using histag NDK-1, histag NDK-1 P72H protein.
  • Superoxide is converted to hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) by superoxide dismutase (SOD). Hydrogen peroxide is converted to H 2 O and O 2 by Cat-1, Cat-2, Cat-3, (Cat-4) and rendered harmless. Demonstration from singlet oxygen to oxygen evolution using red-spotted mold is ongoing. These processes are all reduction processes, but the electron donation of this reduction process is done by NDK-1, and NDK-1 P72H has no NADH binding ability, so the whole process is singlet oxygen, superoxide, peroxidation.
  • the present inventors isolated a paraquat (Methyl viologen; Mv) resistant strain using Alaskan pea. It was confirmed that the mutant strains R3-1 and R3-2 obtained by treatment with Mv 8 ⁇ M can germinate with Mv 8 ⁇ M, but the wild strain hardly germinates. Each of these mutants produced approximately twice as many seeds (weight g) as the wild type. These mutant strains had mutational traits at the enzyme level as described below. NDK activity was increased by about 40% of the wild type. Catalase activity increased by about 30%.
  • ascorbate peroxidase (APX) which uses hydrogen peroxide and ascorbic acid to make water and oxygen, did not change much as a whole. The activity disappeared depending on the molecular species.
  • the inventors measured the ( 32 P) NADH binding activity of chloroplast fraction, mitochondria, peroxisome fraction, and soluble fraction of Alaska pea leaves by native gel electrophoresis. After electrophoresis, the gel was directly subjected to autoradiography to detect the signal. One major band and two minor bands were detected in the soluble fraction, and each band simultaneously possessed NDK activity. Therefore, most of ( 32 P) NADH binding activity was considered to be NDK, and NDK was considered to be a major carrier of NADH.
  • NDK due to phosphorylation of ( ⁇ - 32 P) ATP there are three types of NDK due to phosphorylation of ( ⁇ - 32 P) ATP, but 18 kDa NDK has higher molecular mobility on SDS-PAGE in R3-1 and R3-2 mutants. Changes to 17 kDa.
  • the 15 kDa NDK is not present in the chloroplast fraction in the wild type, R3-1 and R3-2 mutants.
  • the soluble fraction of 16 kDa NDK is phosphorylated in mutants about twice as high as the wild type.
  • mitochondrial and peroxisome fractions there is a possibility that these NDK molecular species are attached to the outside and function.
  • the phosphorylation labeling method does not phosphorylate proteins existing inside these organelles.
  • 2007-171681 (Filing Date: June 29, 2007) and PCT / JP2007 / 070253 (International Filing Date: October 17, 2007) ) (Hereinafter, these three may be collectively referred to as “second patent application”), after germination or growth of seeds or shoot tips, after UV irradiation, randomly induced mutation, Riboflavin was added to the medium and exposed to sunlight. Plants are formed around cells that are resistant to a large amount of singlet oxygen. Thus, a singlet oxygen-tolerant mutant was obtained in sweet potato and rice. These strains showed approximately three times the harvest of the wild strain. When the phosphorylation activity of NDK was investigated in the leaves of sweet potato, NDK in the soluble fraction of the mutant strain showed phosphorylation activity approximately twice that of the wild strain.
  • the point was to provide an improvement for increasing the rate of capturing and detoxifying singlet oxygen more efficiently.
  • it is necessary to increase the catalase activity and NDK activity, and further increase the ability to supply NADH that is bound and transported to NDK.
  • It is considered necessary to donate electrons to singlet oxygen, introduce the generated superoxide into hydrogen peroxide into the erasing circuit, and further increase the hydrogen peroxide erasing ability.
  • NADH supply capacity it is impossible to enhance NADH by adding it to the medium because NADH cannot pass through the membrane.
  • ascorbic acid and reduced glutathione which can reduce dihydroascorbic acid to ascorbic acid, are added to the medium, increasing the electron donating ability (reducing power) in the cell, and enzymes that absolutely require reducing power are always free. Be ready for operation. For example, if ascorbic acid peroxidase is abundant in ascorbic acid, a mutant strain overexpressing it can be isolated.
  • the conventional methods of Japanese Patent Application 2005-125981, Japanese Patent Application 2006-283492, Japanese Patent Application 2007-171681, and PCT / JP2007 / 070253 do not consider this point.
  • the high-yield strain already obtained by the method of the first patent application or the high-yield strain obtained by the second patent application is subjected to mutagenesis treatment, and further 5-6 times that of the wild strain (High-yield wheat, etc., 5-6 times that of wild strains can be used for industrial purposes such as ethanol production).
  • rice has gained 2.1 times in the second generation of hybrids, three times in the method of the second patent application, and 3.8 times in the first and second treatments. .
  • the first method is 3 to 3.5 times, for barley 2.5 to 3 times, and for oats 3 to 3.8 times.
  • the probability of the candidate can be determined by measuring the activity of the enzyme in the leaves of the candidate strain.
  • This reaction is a plant response mutation to singlet oxygen and induces changes in various levels of enzymes such as at least 3 types of NDK, 1 type of catalase, and about 30 types of ascorbate peroxidase.
  • ROS reactive oxygen species
  • P NAD
  • ATP ATP of energy input as sunlight.
  • genes that are thought to control such a large energy system and control many factors has not been known so far. Such genes are considered to be active not only in singlet oxygen resistance but also in biological reactions generally called environmental response reactions such as high salt concentration resistance, low temperature resistance, high temperature resistance, drought resistance, pest damage resistance, etc. It is done. The decisive factor is that active oxygen is always involved. Reflecting the localization of these enzyme systems, when expressed as a three-dimensional matrix, it gives the possibility of expressing organisms numerically around active oxygen. Digitization using these three-dimensional matrices gives a reasonable way to answer various environmental responses. Therefore, it can be claimed as a technology.
  • the gist of the present invention is as follows. (1) A method for producing a useful mutant of a fungus or plant, comprising culturing the fungus or plant in the presence of an electron donor during or after mutagenesis treatment. (2) The method according to (1), wherein the mutagenesis treatment is exposure to active oxygen or an active oxygen generator. (3) The method according to (2), wherein the active oxygen or the active oxygen generator is at least one compound selected from the group consisting of methyl viologen, hydrogen peroxide, and Na nitroprusside. (4) The method according to (3), wherein the active oxygen or the active oxygen generator is methyl viologen.
  • mutagenesis treatment culturing the fungus or plant in the presence of an electron donor, selecting the grown strain, performing the second mutagenesis treatment on the selected strain, The method according to any one of (1) to (7), comprising culturing the selected strain under conditions where singlet oxygen is generated after the mutagenesis treatment of 2, and selecting the grown strain.
  • the second mutagenesis treatment is ultraviolet irradiation.
  • the ultraviolet irradiation is performed by irradiating a fungus or a plant with ultraviolet rays of 1 to 10 ⁇ mole ⁇ m ⁇ 2 ⁇ sec ⁇ 1 for 1 to 5 minutes.
  • mutagenesis treatment is performed on the next generation or later progeny of the fungal or plant useful mutants produced by culturing the fungus or plant in the presence of an electron donor (1)
  • the method according to any one of (19) to (19). (21) The method according to any one of (1) to (20), wherein the fungus belongs to the ascomycetous fungus.
  • (29) A method for producing a strain exhibiting a desired property and / or trait by self-fertilization or crossing of a plant mutant or its progeny produced by the method according to any one of (1) to (25).
  • (30) A plant strain produced by the method according to (29) or a progeny thereof.
  • (31) A cell or tissue of the plant strain or its progeny according to (30).
  • (32) The seed of the plant strain or its progeny according to (30).
  • (33) A composition for inducing mutations useful for fungi or plants, comprising an electron donor.
  • a fungal or plant mutant or a progeny thereof having a large amount of chlorophyll and a reduced amount of lipid peroxide formed as compared with a wild species.
  • a fungal or plant mutant containing a mutation related to NDK or a progeny thereof compared to a wild species (6) A fungal or plant mutant strain or a progeny thereof containing a mutation relating to NDK2 and / or NDK3 as compared to a wild species. (37) A fungal or plant mutant or a progeny thereof in which at least Ill2Leu and Glu205Lys amino acid substitutions are induced in NDK2 compared to wild type. (38) A fungal or plant mutant or progeny thereof in which at least an amino acid substitution of Pro45Ser is induced in NDK3 as compared to a wild type.
  • a part of the singlet oxygen elimination process has been elucidated, and a method for isolating a novel high-efficiency mutant of fungi and / or plants by enhancing the molecules involved in the process has been provided.
  • Reactive oxygen metabolism Active oxygen metabolism diagram mainly for active oxygen metabolism in humans. The red line in the figure is proved by the second patent application.
  • A Survival rate of Conidia to hydrogen peroxide treatment (see survival by germination), and
  • B using a red mold fungus , cat-1 RIP , ndk-1 P72H and its double mutant Colony formation rate against singlet oxygen due to riboflavin and strong light added to the medium; details are given in the text.
  • SOD superoxide dismutase
  • CAT catalase
  • APX ascorbate peroxidase
  • GR glutathione reductase
  • High-yielding mutants and ultra-high-yielding mutants showing good productivity have been isolated.
  • the number of branches is very large, the stem is thick, and the green is very dark.
  • High-yield mutants, RC4-1, and ultra-high-yield mutants FRC4-1 obtained by treating wild-type collective seeds with RC and FRC treatments.
  • the mutant strain shows not only the ear weight but also the cocoon weight.
  • High-yield mutants, RC4-1, and ultra-high-yield mutants FRC4-1 obtained by treating wild-type collective seeds with RC and FRC treatments. Compared to the wild strain, the mutant strain shows not only the ear weight but also the cocoon weight. Comparison of the whole picture of wheat ultra-high-yielding mutants RC4R2-1-1-3, RC40R2-1-1-7 and wild type R0-3-2. The ear remains bagged. Harvesting characteristics of highly productive wild strains and their RC4 treated strains. These obtained high-productivity wild strains are due to the assembly of small factors, and in the next generation, it is considered that productivity will return to the level of wild strains.
  • RC4R2-3-9-7 shows the high yield of ultra high yield mutants.
  • R8-1-1-19-2 is an ultra-high yield mutant.
  • RC4R8-1-1-19-1, RC8R8-1-1-23-2, and RC80R8-1-1-15-1 are ultra-high-yielding mutants.
  • RC80R8-1-1-15-1 strain is judged as an industrial ultra-high yield mutant.
  • Summary of industrial ultra-high yield mutants Among the ultra-high-yield mutants, mutants showing high productivity more than 5 times (66 g) of the wild-types were collected as industrial ultra-high-yield mutants.
  • the heel part (biomass) of these strains also shows a fairly high value.
  • the ears of the industrial ultra-high-yielding mutant RC4R2-1-1-3 are compared with the ears of the wild strain R0-3-2.
  • the ears of the industrial ultra-high yield mutant RC40R2-1-1-7 are compared with the ears of the wild strain R0-1-5.
  • Agar culture medium was placed in a large number of elongate traveling boxes, and conidia of sod-1 strain (Konidia) were inoculated at one end thereof.
  • the growth tips were sampled at circadian time intervals of 6 hours, and ROS mainly consisting of superoxide was measured.
  • Upper row Whole plant comparison, Saya comparison, root comparison.
  • a chlorophyll was extracted from the leaves and quantitatively compared. Comparison of the amount of B carotenoid, quantification of C anthocyanin, and estimation of the amount of lipid peroxide produced by the amount of D malonaldehyde produced.
  • the cDNAs of NDK1, NDK2, and NDK3 of Alaskan pea wild strains, R3-1 and R3-2 mutants were cloned and the nucleotide sequences were determined. The part that induces amino acid substitution is shown.
  • NDK2 and NDK3 possess a chloroplast transit peptide and a mitochondrial transit peptide, and these sequences are released (processed) when localized in chloroplasts and mitochondria.
  • chloroplasts two types of chloroplasts NDK2 are formed by this processing. Phosphorylation of soluble fractions from leaves, phosphorylation of NDK1, NDNDK2, and NDK2, NDK3 with cloned transfer peptide, and phosphorylation properties of purified chloroplasts and mitochondria.
  • B Phosphorylation properties of purified chloroplast NDK2 and mitochondrial NDK3: migrating peptides are excluded.
  • C Phosphorylation pattern of GST-NDK2 and GST-NDK3.
  • D Pattern of alkali treatment (phosphorylated histidine remains) and acid treatment (phosphorylated serine remains) after phosphorylation. Comparison of nucleoside diphosphate kinase activity of GST-NDK2 and GST-NDK3. Using pyruvate kinase, lactate dehydrogenase, and ATP using an absorptiometer, they are used as dGDP and dTDP receptors, and the absorbance change of NADH is measured and quantified. Investigation of the binding activity of ( 32 P) NADH to NDK1, NDK2, and NDK3 using wild type and mutant NDK.
  • A soluble fraction of NDK1, NDK2 phosphorylation activity from leaves, B; with soluble fraction from the leaves (32 P) soluble fraction from avidity :( 32 P) NADH and leaves of NADH to After mixing on ice, perform UV irradiation for 3 minutes.
  • C GST- was cleaved from GST-NDK1 and ( 32 P) NADH was bound.
  • ( 32 P) NADH was bound to GST-only and ( 32 P) NADH to GST-NDK2. Further, it was bound to GST-NDK3.
  • the amino acid sequence comparison of NDK2 of an Alaskan pea wild strain and mutant R3-1 is shown.
  • the nucleotide sequence and amino acid sequence of NDK2 of Alaska pea wild strain and mutant R3-1 are shown.
  • the amino acid sequence comparison of NDK3 of Alaskan pea wild strain and mutant R3-1 is shown.
  • the nucleotide sequence and amino acid sequence of NDK3 of Alaskan pea wild strain and mutant R3-1 are shown.
  • the present invention provides a method for producing a useful mutant of a fungus or plant, comprising culturing the fungus or plant in the presence of an electron donor during or after mutagenesis treatment.
  • a high-efficiency mutant of fungi and / or plants can be produced.
  • High-efficiency mutants of plants result in high yields.
  • the fungus or plant may be cultured in the presence of an electron donor, and the grown strain may be selected.
  • Examples of the mutagenesis treatment include exposure to active oxygen or an active oxygen generator, ultraviolet irradiation, and the like.
  • Examples of exposure to active oxygen or an active oxygen generator include culturing in a medium containing active oxygen or an active oxygen generator.
  • Examples of active oxygen include superoxide anion radical, hydroxy radical, peroxynitrite, hydrogen peroxide, nitric oxide, nitrogen dioxide, ozone, lipid peroxide, singlet oxygen, etc.
  • Reactive oxygen can be generated Hydrogen peroxide can permeate the cell plasma membrane, so it enters the cell fairly directly, It is said to have a secondary information function in a relatively stable manner.
  • Na nitroprusside dissolves well in water, is unstable as a solution, puts it in the medium, and produces NO.NO is NO ⁇ (NO In the cell, it inhibits cytochrome oxidase, reduces respiration, promotes the release of Ca ++ from mitochondria, and NO ⁇ binds to guanylate cyclase and activates it.
  • the active oxygen generator is Mv
  • Mv when the fungus or plant is cultured in a medium containing Mv of 0.1 to 250 ⁇ M, preferably 0.2 to 200 ⁇ M, more preferably 1 to 160 ⁇ M Good.
  • the ultraviolet light may be irradiated with a light amount of 1 to 10 ⁇ mole ⁇ m ⁇ 2 ⁇ sec ⁇ 1 for 1 to 5 minutes.
  • the mutagenesis treatment may be performed on fungal conidia (from which mycelia have been removed), plant germination seeds, plant seedlings, organs containing plant growth points (eg, stems, buds, spore, etc.).
  • Examples of the culture in the presence of an electron donor include culture in a medium containing an electron donor.
  • Examples of the electron donor include, but are not limited to, ascorbic acid, reduced glutathione (GSH), dithiothreitol (DTT), ⁇ mercaptoethanol, and the like.
  • An electron donor for example, ascorbic acid
  • GSH reduced glutathione
  • DTT dithiothreitol
  • ⁇ mercaptoethanol and the like.
  • An electron donor for example, ascorbic acid
  • is added to the medium to increase the intracellular electron donating ability (reducing ability) so that an enzyme that absolutely requires reducing ability can operate freely at any time. For example, if ascorbic acid peroxidase is abundant in ascorbic acid, a mutant strain that overexpresses it can be isolated.
  • the electron donor is ascorbic acid and / or reduced glutathione
  • the fungi or plants may be cultured in
  • the fungus or plant is cultured in the presence of an electron donor, the grown strain is subjected to a second mutagenesis treatment, and then the strain is subjected to conditions under which singlet oxygen is generated. You may select the strain
  • Examples of the second mutagenesis treatment include exposure to active oxygen or an active oxygen generator, ultraviolet irradiation, and the like.
  • the active oxygen and the active oxygen generator are as described above.
  • the active oxygen generator is Mv
  • the fungus or plant may be cultured in a medium containing 0.1 to 250 ⁇ M Mv.
  • the ultraviolet light is preferably irradiated for 1 to 5 minutes with a light amount of 1 to 10 ⁇ mole ⁇ m ⁇ 2 ⁇ sec ⁇ 1 .
  • Examples of the culture under conditions where singlet oxygen is generated include culture under light irradiation in a medium containing a singlet oxygen-generating photosensitizer.
  • Singlet oxygen generation photosensitizers include riboflavin (7,8-dimethyl-10-D-ribitylisoalloxazine), porphyrin, methylene blue, rose bengal, FMN (flavin mononucleotide), FAD (flavin adenine dinucleotide) ) Etc., but is not limited thereto.
  • Riboflavin can be permeated into cells even when applied to the leaf surface. Riboflavin is excited by light irradiation and passes its energy to triplet oxygen, producing singlet oxygen.
  • the irradiating light should be sunlight (direct sunlight), but heat is cut off in a 12 cm water tank, ventilated with a draft, and 1500 ⁇ mole ⁇ m -2 ⁇ sec -1 by two 400 W incandescent lamps.
  • the amount of light may be obtained, and these numerical values and materials may be appropriately changed.
  • fungi or plants are cultured in a medium containing 10 to 4000 ⁇ M riboflavin under irradiation with sunlight of 50 to 2500 ⁇ mole ⁇ m ⁇ 1 ⁇ sec ⁇ 1 Can be mentioned.
  • the types of fungi and plants that induce mutations according to the method of the present invention are not particularly limited, but fungi belonging to ascomycetous fungi (for example, Neurospora, Aspergillus) and basidiomytes at low temperatures.
  • fungi belonging to ascomycetous fungi for example, Neurospora, Aspergillus
  • basidiomytes for example, Neurospora, Aspergillus
  • this technique can be applied sufficiently to promote the induction.
  • Aspergillus oryzae which is used for fermentation in ascomycetes, has many similarities to red mold, and its application to fermentation can be expected.
  • the dicotyledonous plants such as sugar beet can be exemplified, but the present invention is not limited thereto.
  • the fungus or plant subjected to the mutagenesis treatment may be a wild strain, a mutant strain or a progeny thereof.
  • Mutant strains that are subjected to mutagenesis include mutants that are resistant to singlet oxygen, mutant plants, their progeny, mutants that are resistant to active oxygen other than singlet oxygen, mutant plants, their progeny, and the like. it can.
  • Mutant bacteria, mutant plants, and their progeny that are resistant to active oxygen other than singlet oxygen after exposing fungi and plants (either wild or mutant) to active oxygen or active oxygen generators other than singlet oxygen It can be produced by selecting a grown strain (see JP-A-2006-296359).
  • the exposure to active oxygen other than singlet oxygen or an active oxygen generator is, for example, cultivation of a wild-type fungus or plant in a medium containing 1 to 250 ⁇ M methylviologen.
  • Mutant bacteria, mutant plants and their progeny that are resistant to singlet oxygen can be prepared by culturing under conditions where singlet oxygen is generated after mutagenesis treatment and selecting the grown strain.
  • the mutagenesis treatment is, for example, irradiating fungi and plants for 1 to 5 minutes with ultraviolet rays having a light amount of 1 to 10 ⁇ mole ⁇ m ⁇ 2 ⁇ sec ⁇ 1 .
  • Examples of the culture under conditions where singlet oxygen is generated include culture under light irradiation in a medium containing a singlet oxygen-generating photosensitizer.
  • a medium containing a singlet oxygen-generating photosensitizer As an example of culturing under conditions where singlet oxygen is generated, fungi or plants are cultured in a medium containing 10 to 4000 ⁇ M riboflavin under solar irradiation of 50 to 2500 ⁇ mole ⁇ m ⁇ 1 ⁇ sec ⁇ 1 Can be mentioned.
  • the mutant strain subjected to the mutagenesis treatment is a next generation of useful mutant strains of fungi or plants produced by culturing fungi or plants in the presence of an electron donor during or after the mutagenesis treatment. Subsequent descendants may be used.
  • Fungal and / or plant mutants obtained by culturing fungi or plants in the presence of an electron donor during or after mutagenesis treatment are clearly resistant to Mv and singlet oxygen It is more resistant to hydrogen peroxide than to wild strains (intense light irradiation in the presence of riboflavin) and to hydrogen peroxide.
  • a large amount of high carotenoid expression is observed in red mold.
  • the number of branches, the number of branches, and the characteristics or traits such as high yield can be different from those of strains that have not been mutated (for example, wild strains). For example, it is cold tolerant and the yield is higher in severe winters.
  • the flowering time varies, and the plant height is lowered.
  • a self-incompatibility is partially cancelled
  • the method of the present invention is effective for producing a plant mutant having an improved yield (that is, resulting in increased production).
  • improved resistance to low temperature damage compared to fungi or plants that have not been exposed to active oxygen generators (for example, wild strains)
  • improved resistance to low temperature damage improved resistance to high temperature damage, improved resistance to oxidative stress damage, elimination of active oxygen Increase in ability, decrease in ability to generate active oxygen, change in circadian rhythm, change in characteristics related to temperature and / or photoperiodicity, change in bud formation time, change in flowering time (early flowering, late flowering) , Cancellation of self-incompatibility, changes in flowered nodes, changes in pod thickness, changes in the number of fruits, changes in the size of fruits, changes in the shape of fruits, changes in the length of floral patterns, plants Changes in organ size (leaf and stem), changes in internode length, changes in number of buds and associated nodes, changes in stem thickness, changes in pod lump size, bud formation Changes in the season, changes in leaf size, changes in the speed of growth, changes in greenness, plant height Changes, reduction in the degree of oxidation of fat, an
  • the second treatment which mutant strains resistant to singlet oxygen are selected by this treatment
  • a more useful mutant can be obtained than the mutant obtained by the single treatment.
  • an electron donor for example, ascorbic acid
  • reducing power intracellular electron donating ability
  • the present invention relates to a fungal or plant mutant obtained by culturing a fungus or plant in the presence of an electron donor, or its progeny, their cells or tissues, and their seeds during or after mutagenesis treatment.
  • a fungal or plant mutant obtained by culturing a fungus or plant in the presence of an electron donor, or its progeny, their cells or tissues, and their seeds during or after mutagenesis treatment.
  • Such cells, tissues and seeds are produced by known methods from fungal or plant mutants obtained by culturing fungi or plants in the presence of an electron donor during or after mutagenesis treatment. be able to.
  • the present invention may be carried out by self-fertilization or crossing of a fungal or plant mutant obtained by culturing a fungus or plant in the presence of an electron donor or progeny thereof during or after mutagenesis treatment.
  • a method for producing a strain exhibiting properties and / or traits, a plant strain produced by the method and its progeny, their cells, tissues and seeds are provided. Methods for self-fertilization or mating of plants are known, and methods for producing cells, tissues and seeds from plants are also known, and these methods can be used.
  • Desired properties and traits include increased yield, increased carotenoid expression, increased catalase activity and expression, increased NDK activity and expression, increased histidine kinase-like protein phosphorylation activity, vine Examples include, but are not limited to, an increase in the length of potatoes, an increase in the weight of potatoes, an increase in the number of tillers, and an increase in the number of heading.
  • improved resistance to low-temperature damage improved resistance to high-temperature damage, improved resistance to oxidative stress damage, increased active oxygen scavenging ability, reduced active oxygen generation capacity, self-incompatibility Release, change in circadian rhythm, change in temperature and / or photoperiodic characteristics, change in the time to form buds, change in the time to bloom (early bloom, late bloom), change in flowering nodes, pods Change in thickness, change in number of fruits, change in size of fruits, change in shape of fruits, change in length of floral pattern, change in size of plant organs (leaf and stem), internode Length, change in number of buds and associated nodes, change in stem thickness, change in pod lump size, change in bud formation time, change in leaf size, speed of growth Change of green, change of green depth, change of plant height, weight of cocoon, reduction of oxidation degree of fats and oils, antioxidant content
  • starch and / or carbohydrate can be exemplified well as further increases in
  • the present invention provides a composition for inducing mutations useful for fungi or plants, comprising an electron donor.
  • a “useful mutation” is a mutation that results in the desired properties and traits as described above.
  • the electron donor include, but are not limited to, ascorbic acid, reduced glutathione, dithiothreitol (DTT), ⁇ -mercaptoethanol, and the like.
  • composition of the present invention it becomes possible to produce fungi or plants in which useful mutations have been induced.
  • composition of the present invention may further contain a solvent, a medium component, a light source and the like.
  • Examples of media that can be used in the present invention include Murashige and Skoog medium and Hoagland medium for plants, and Fries medium and Vogel medium for fungi, but are not limited thereto.
  • the present invention also provides the following fungal or plant mutants or progeny thereof.
  • a fungal or plant mutant strain or a progeny thereof containing a mutation relating to NDK2 and / or NDK3 compared to a wild species.
  • FIG. 55 shows the amino acid sequence comparison of NDK2 between Alaskan pea wild strain and mutant R3-1.
  • FIG. 56 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence of NDK2 of Alaskan pea wild strain and mutant R3-1.
  • FIG. 57 shows an amino acid sequence comparison of NDK3 between Alaskan pea wild strain and mutant R3-1.
  • FIG. 58 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence of NDK3 of Alaskan pea wild strain and mutant R3-1.
  • Example 1 Isolation of a new singlet oxygen-tolerant mutant using red mold fungus Wang, N., Yoshida, Y. and Hasunuma, K. 2007, Catalase-1 (CAT-1) and nucleoside diphosphate kinase- 1 (NDK-1) play an important role in protecting conidial viability under light stress in Neurospora crassa.Molec. Genet.Genomics; 278: 235-242; This paper makes it possible to theoretically explain the following events: became.
  • CAT-1 Catalase-1
  • NDK-1 nucleoside diphosphate kinase- 1
  • FIG. 1 shows known events for the process of scavenging active oxygen.
  • I have thought that the process of conversion of singlet oxygen to superoxide is hypothesized by a complex of catalase and NDK.
  • the resistance to active oxygen has already been investigated using a wild strain of red- knot mold, ndk-1 P72H and sod-1 mutants. Both ndk-1 P72H and sod-1 mutants have similar properties and have been established to be sensitive to the superoxide generator Methyl viologen (Mv; paraquat) and hydrogen peroxide (Yoshida, Y , Ogura, Y. and Hasunuma, K.
  • Methyl viologen Mv
  • paraquat hydrogen peroxide
  • catalase CAT-1 which has been suggested to form a complex with NDK-1, by the RIP (Repeat induced point mutation) method, and isolated cat-1 RIP (Wang, N., Yoshida, Y. and Hasunuma, K. 2007, Loss of catalase-1 (Cat-1) results in decresed conidial viability enhanced by exposure to light in Neurospora crassa, Mol. Genet.Genomics 277: 13- twenty two).
  • cat-1 RIP was more sensitive to hydrogen peroxide in the amount of cordieria formed on colonies than in the wild strain. Mycelial growth was also sensitive to hydrogen peroxide.
  • cordieria was sensitive to the mutant under light irradiation. These characteristics were restored to the wild strain level by introducing a wild type gene. NDK-1 / CAT- occurring in cells using double strains of wild strain, cat-1 RIP mutant, ndk-1 P72H mutant, ndk-1 P72H and cat-1 RIP mutant We tried to analyze one interaction.
  • the ndk-1 P72H mutation could not bind NADH or NADPH necessary for the reduction reaction (electron donation reaction), and the function to operate as a carrier was lost.
  • Histag NDK-1 and Histag NDK-1 P72H (Histag NDK-1 and Histag NDK-1 P72H bind to nickel chelate sepharose), ( 32 P) NADH can be converted to these Histag NDK-1 or Histag NDK- 1 conjugated to P72H .
  • Histag NDK-1 and histag NDK-1 P72H were bound to nickel chelate sepharose and the radioactivity of ( 32 P) NADH was examined.
  • NADH has the same chemical structure as the ADP moiety and may bind at the ADP moiety.
  • NDK-1 Singlet oxygen generated by riboflavin and light irradiation is captured by catalase in the cell.
  • NDK-1 carries NADH bound there. It passes two molecules of electrons and generates two molecules of superoxide. If this process is predicted to be correct, both ndk-1 P72H and sod-1 mutants are likely to be sensitive to singlet oxygen. Therefore, under intense light irradiation (100 ⁇ mol / m 2 / sec), the riboflavin concentration in the Fries agar medium was changed to 0, 100, 200, 400, 800 ⁇ M, and the wild strain, ndk -1 P72H and sod-1 mutants were sprinkled on petri dishes.
  • Mv is effective as a mutagen that induces high yield mutations, but at the same time, Mv enters in place of ferredoxin and inhibits the production of ascorbic acid.
  • the mutant strain acquisition treatment with Mv results in a decrease in the production of NADH (NADPH) and further ascorbic acid (vitamin C), which are absolutely necessary for the process of reducing active oxygen. Therefore, enzymes that absolutely require them as coenzymes are inactive. Even if it is overexpressed by mutation, it cannot be active due to the absence of a coenzyme, and such a mutant strain has not been isolated.
  • the present invention has developed a formulation that induces mutations in the presence of Mv, and further adds vitamin C to the medium to increase the chances of new mutants being isolated.
  • Example 1 Mv was added to a Petri dish at 100 ⁇ M, and ascorbic acid was changed to 0, 10, 100, 1,000, 10,000 ⁇ M.
  • ndk-1 P72H and sod-1 mutant conidia were seeded in 4.8 ⁇ 10 5 cells and 2.3 ⁇ 10 4 cells / petri dish, respectively. The cells were grown at 30 ° C. under 40 ⁇ mol / m 2 / sec. Four petri dishes were used for one treatment. The number of colonies that had grown approximately 1 mm or more in the medium was counted. The number of colonies / number of conidia was defined as the mutation rate. As shown in FIG. 5 and Table 1, in the ndk-1 P72H and sod-1 mutant strains, a strain exhibiting good growth at a mutation rate of about 1 ⁇ 10 ⁇ 3 per conidia was obtained.
  • the incidence of the mutation was dependent on the concentration of ascorbic acid, and the sod-1 mutant showed the optimum value when the concentration of ascorbic acid was 100 to 1,000 ⁇ M.
  • the ndk-1 P72H mutant showed a minimum value at 100 ⁇ M, but a maximum value at 10,000 ⁇ M. The reason why such a good-growing mutation partially shows an inverse correlation is not clear, but suggests that a singlet oxygen-tolerant mutation that bypasses the ndk-1 P72H and sod-1 mutations has occurred. .
  • the ndk-1 P72H mutant has a possibility of back mutation, but the sod-1 mutant has a knockout mutation, and there is almost no possibility of back mutation.
  • the frequency of isolation of singlet oxygen-tolerant strains was roughly 10 times higher than the concentration of ascorbic acid 0 (control experiment) at 100 ⁇ M.
  • the acquisition frequency of the doublet oxygen resistant strain was dependent on the concentration of ascorbic acid.
  • the isolated colony was 10 strains / petri dish showing good growth, so 40 strains were obtained for each treatment.
  • the mutation rate was not statistically correct for singlet oxygen-resistant strains, the optimal value was obtained when the concentration of ascorbic acid was 100 to 1,000 ⁇ M, and the results were almost the same as those of the sod-1 mutant.
  • Ascorbic acid does not exist in FIG. 1, but ascorbic acid can convert oxidized glutathione (GSSG) to reduced glutathione as shown in FIG. 1)
  • Catapalase of red mold is defined as catalase because it does not require a coenzyme, but it requires NADH bound to NDK-1 in vivo, and in that sense it is proposed to be redefined as NADH peroxidase.
  • the In red mold, CAT-2 is said to correspond to glutathione peroxidase. 2
  • ascorbate peroxidase is present instead of GSH peroxidase, and an ascorbate production system is present.
  • GSH peroxidase is present in animals (humans). Oral intake of vitamin C converts reduced glutathione to reduced glutathione and activates GSH peroxidase.
  • catalase does not contain NADH in the standard reaction system for measuring its activity. This situation also appears in the characterization of Mv-resistant strains, and catalase has increased activity in the mutant strain, although the reaction proceeds to some extent without adding NADH. It has not been analyzed properly. This event prevented the plant from finding that the Mv resistant strain was a strain that overexpressed catalase or increased its reaction rate.
  • Kinusaya Pea is a target to eat as vegetables. Alaska pea is an indispensable crop plant as a control for basic research on legumes important as a source of bio-oil such as soybeans and peanuts for fats and oils.
  • Alaska pea Mv resistant strains R3-1 (HIGH YIELDING-1) and R3-2 (HIGH YIELDING-2) are mutant strains obtained by treatment with 8 ⁇ M Mv. Compared to the wild type, 8 ⁇ M Mv treatment clearly showed Mv resistance in stem growth and root growth. The flowering period is about 3 weeks later than the wild type, and it is late blooming. The high harvestability as seen by the weight of Saya is dependent on the temperature in winter. Harvesting of Alaskan pea mutants in 2006-2007, which was a warm winter in Yokohama, was not much different from wild strains. However, in the previous year, 2005-2006, the winter temperature was low, and the yield of mutant strains was approximately twice that of wild strains.
  • FIG. 8 shows SOD activity.
  • FIG. 8A shows the SOD activity of the crude extract. There is no essential difference between wild and mutant strains. Further, as shown in FIG. 8D, proteins were separated using an unmodified gel, and in-gel measurement was performed using the gel. Mn-SOD (manganese SOD) localized in mitochondria showed significantly higher enzyme activity than the wild type. The result of measuring it with the extract is shown in FIG. 8B. Cu, Zn-SOD includes molecular species present in cytosol (cyt) and Cu, Zn-SOD present in chloroplast (chl).
  • FIG. 8C shows the results obtained by collecting them together and measuring with the extract. In the mutant strain, the activity was rather decreased. The results of in-gel measurement of these are shown in FIG. The activity of Mn-SOD was significantly increased in the mutant strain.
  • Fig. 9 shows the measurement results of catalase.
  • the measurement result of the crude extract was carried out between the wild strain and the mutant strain, and no difference was observed in the enzyme activity (FIG. 9A).
  • the mobility of catalase of the mutant strains was lower than that of the wild strains.
  • This result means that the amount of singlet oxygen bound to the mutant catalase is less than the amount of singlet oxygen bound to the wild-type catalase.
  • NADH / NDK has a higher electron donating ability in mutants than the amount of singlet oxygen bound to intracellular catalase.
  • NADH should be added to the reaction solution, but the standard reaction solution does not contain molecules that appear to be electron donors. The situation is the same for the SOD reaction, and it is necessary to clarify how electron donation by NADH / NDK is involved.
  • glutathione reductase uses NADPH to convert oxidized glutathione to reduced glutathione.
  • Reduced glutathione can reduce dihydroascorbic acid to ascorbic acid, thus affecting the intracellular activity of ascorbate peroxidase. Whether the activity was measured with the crude extract or the in-gel measurement, no difference was observed between the wild strain and the mutant strain as shown in FIG. 10B and D.
  • the first stage is Mv treatment, and it is considered that the strain having the high-harvest mutation is contained in the second self-propagation (M2) of the seed in the drug-treated generation (M1).
  • M2 the strain with the highest yield is considered to be a homozygous strain, and the seeds are used to harvest the number of branches and the weight of the ear attached to the strain. Contrast with that of the wild strain.
  • the high-yield mutant strains used were R424 (Ho) and R458 (Ho), and 4 seedlings were transplanted into 1 cage.
  • the yield was investigated using 56 wild strains, 88 strains for R424 (Ho) and 24 strains for R458 (Ho).
  • FIG. 11A the number of fractions was 1.3 times and 1.4 times that of the wild type, respectively.
  • the weight of the ear attached to the stem is shown in FIG. 11B. Panicle weight was 1.5 times and 1.4 times that of the wild strain, respectively.
  • the number of fractions and the yield (g) both show a continuous distribution in each strain.
  • R424 (Ho) showed a germination rate of 85%
  • R458 (Ho) had a germination rate of 28%.
  • the reliability of the data is high in the former, but the latter requires reexamination of the germination conditions. is there.
  • the high productivity of the former and the high productivity of the latter exceed the maximum value, 1.3 times that of the conventional breeding method, and this method is an excellent method for obtaining a high-yield mutant strain in which this method is effective. It is shown that.
  • catalase CAT
  • superoxide dismutase SOD
  • ascorbate peroxidase APX
  • mutant strains By developing a method for isolating mutant strains that are theoretically difficult to isolate by Mv treatment using wild strains and isolated mutant strains, a mutant strain with improved productivity can be obtained. Propose a way to release.
  • the wild strains used were R0-1-5, and wild seed collective seeds.
  • mutants R2-1-1, R2-1-3, R2-3-9, and R8-1-1 showing high yield were used.
  • R0-3-1 a relatively highly productive strain, was found and used.
  • R0-3-1 is the highest yield among wild strains, and it is unclear whether this strain has a new mutation.
  • the photos of young plants (rosette state in the middle of March) grown in the open field of the second-generation hybrid are shown in FIGS.
  • FIG. 17 compares the wild strain R0-1-5 with the wild strain R0-3-1. Compared with the wild strain R0-1-5 and the wild strain R0-3-1, there is not much change in the leaf size and the greenness of the leaf. All of the R2-1-1, R2-1-3, R2-3-9, and R8-1-1 mutants exhibiting high productivity have better leaf growth than the wild strain R0-1-5 and are green. Was dark. Therefore, it can be judged that a highly productive mutant strain that is associated with enhanced active oxygen scavenging ability has good leaf elongation and green color.
  • Mv is a photosystem I electron transport system for photosynthesis. It enters in place of ferredoxin, receives electrons, and becomes reduced Mv. It gives electrons to triplet oxygen and produces superoxide.
  • Reduced ferredoxin originally has the function of reducing dihydroascorbic acid to ascorbic acid. However, ascorbic acid (vitamin C) is not produced because reduced ferredoxin is not produced. Since ascorbic acid is not supplied, hydrogen peroxide generated from superoxide is not converted into water and oxygen by ascorbate peroxidase.
  • NDK nucleoside diphosphate kinase
  • Electron donors such as ascorbic acid and NADH are used in various enzyme reactions and are called coenzymes. Therefore, when the intracellular levels of these factors are reduced, the action of enzymes that require these factors is extremely reduced, and it becomes impossible to operate. Even if an enzyme under such a state is overexpressed by mutation, it cannot be operated and is not isolated as a mutant strain. It is based on this principle that mutants of ascorbate peroxidase cannot be removed as Mv-resistant mutations. Therefore, we developed a method for isolating mutants by giving ascorbic acid that is permeable to the cell membrane from the outside of the cell, increasing intracellular electron-donating ability, increasing the activity of the enzyme acting on the reduction reaction.
  • the elimination process of singlet oxygen, superoxide, and hydrogen peroxide is all a reduction process, and the active oxygen is rendered harmless by donating electrons.
  • the NDK / NADH complex plays an important role in this process.
  • the NDK-1 P72H mutant protein cannot bind NADH, and the ndk-1 P72H mutant has an incomplete elimination process of singlet oxygen, superoxide, and hydrogen peroxide, and cannot reduce these active oxygens. Shows sensitivity characteristics.
  • a medium containing Mv of 0, 4, 8, 40, 80 ⁇ M was added to the MS medium, and the cells were grown in the greenhouse under sunlight for 7 to 7 days.
  • the actual processing schedule is shown at the top of the table.
  • germinated seeds were placed in the dark at 4 ° C. for 12 hours.
  • Riboflavin was added to MS medium at 80 ⁇ M, and the medium was added to a Petri dish containing treated germinated seeds. The germinated seeds in this dish were also grown in the greenhouse in the sunlight for 6-7 days. In fine weather, the light intensity is 1000-1300 ⁇ mol / m 2 / sec. Only strains that have acquired resistance during this period can survive (designated by FRC0, FRC4, FRC8, FRC40, and FRC80). The actual treatment and its schedule are shown at the top of the table.
  • the experimental example in Table 3 is a partial modification of the two examples in the previous second patent application so as to correspond to the examples performed in the present patent application. It was confirmed that the method according to these two previous patent applications is sufficiently effective even if a part of the method is changed.
  • FIG. 19 and FIG. 20 show the isolated mutants.
  • the four mutant strains indicated by F20-4-1 have good stem growth in rosettes and dark green. Obviously there are a lot of share points. The characteristics of the highly productive mutant are shown.
  • the mutant strain shown by F40-4-1 has very good growth of stems and leaves and has a large number of parts. However, the greenness was not much different from the wild strain. However, the good growth and the high number of fractions sufficiently indicate the characteristics of the large yield mutant. However, these strains were not mutants that could ultimately be called high-yield mutations. F80-4-2-1 grew well later and showed the characteristics of a high yield mutant.
  • the germinated seeds were sown in a planter, and after 7 days, the temperature was conditioned in the corridor of the greenhouse. Eight days later, the planter was moved to the open ground and then transplanted to the field.
  • the treatment and schedule are shown in Table 4 and Experimental Example 3. From the results of Experimental Example 3, it can be seen that the number of survivors is low by the above processing. Furthermore, growth in planters, especially acclimation to low temperatures, was poor and many died. The plants transplanted to the field also had poor growth and many died out in the control experiment. This method cannot be used very effectively when wild strains are used.
  • riboflavin was added to 80 ⁇ M except for the control experiment, transferred to a greenhouse, and exposed to sunlight for 4 days.
  • the temperature and light conditions are the same as described above.
  • the germinated seeds were sown in a planter, and after 7 days, the temperature was conditioned in the corridor of the greenhouse. Eight days later, the planter was moved to the open ground and then transplanted to the field.
  • the treatment and schedule are shown in Table 4 and Experimental Example 4. It can be seen from the results of Experimental Example 4 that the number of survival is low by the above processing. Furthermore, growth in planters, especially acclimation to low temperatures, was poor and many died. Many of the plants transplanted to the field also grow poorly in the strain used in the control experiment and die.
  • the growth number (g) in Experimental Examples 3 and 4 is the growth number in the planter before transplanting to the field. In the above Experimental Examples 3 and 4, a mutant strain that could be identified as a high yield mutation could not be isolated.
  • R0-4-4-1 WT1
  • R0-3-3-1 WT2
  • R0-3-3-2 WT3
  • R0-3-3-3 An experiment similar to that in Table 4 was performed using a single ear of a 3 cm (WT4) bag as a control.
  • the experimental treatment and schedule are shown in Table 5.
  • the processing is the same as in Table 4 and Experimental Examples 3 and 4.
  • the concentration of ascorbic acid may be too high, and the concentration was changed to 1 mM.
  • the treatment of adding riboflavin includes irradiation of germinated seeds with ultraviolet rays, which greatly affects the survival of plants. Therefore, the ultraviolet irradiation treatment was omitted.
  • R0-3-1 which showed the highest yield among wild strains, and R2-1-3, R2-3-9, R8-1-1 were used as high yield mutants.
  • the concentration of ascorbic acid was set to 1 ⁇ mM, and it was grown for 7 days in an artificial meteor (8 hours light irradiation 8 ° C / 16 hours darkroom 7 ° C).
  • Table 5 shows Experimental Example 9 and Experimental Example 10. The number of growth was investigated after 2 months of transplantation in the field. R0-3-1 showed good growth in the control experiment at 75% on average. In addition, 11 strains (represented by (G)) recognized as mutant strains, and 4 strains (represented by (VG)) recognized as mutant strains among them were 4 strains. The results are shown in FIGS. Compared to the control of seeds obtained from the same ear, it is clearly darker and has better growth of stems and leaves. In addition, the number of bunches was large, indicating the characteristics of the high yield mutant.
  • Table 6 shows Experimental Example 11 and Experimental Example 12.
  • the high-yielding mutant R2-3-9 grows in the control experiment on average at 63%, which is good. There are 4 double mutants, but 2 of them were confirmed to be very good. Compared to the control experiment with seeds from the same ear, the stems and leaves grow clearly better and the green color is darker. It has a large number of fractions and is recognized as a double mutant. The double mutants are shown in FIGS.
  • Experimental Example 12 shows the results of mutagenesis using the high yield mutant R8-1-1. It can be said that the number of growth in the control experiment is 62%. However, the ears separated into those with good growth and those with poor growth. Ten strains were confirmed as double mutant strains, but two of them were confirmed to be very good strains. As shown in FIG. 32, the growth of stems and leaves is clearly better and the green is darker than in the control experiment using seeds from the same ear. The width of the leaves is wide and the number of stems is high. It is recognized as a double mutant.
  • the total number of ultra-high-yielding mutants isolated was 16, and 7 of them were expected to yield more than 5 times the harvest of the wild type. These seven strains are considered to be profitable and used industrially as a source of bioethanol.
  • RC4 Mv treatment was performed in the presence of vitamin C and 10 mM
  • 4.5-fold mutant strain RC4-1 was isolated.
  • FRC4 treatment an FRC4-1 mutant strain having a 5.3 times higher possibility of ultra-high yield was isolated using R0-3-3-2.
  • R8-1-1-1 a nearly 6-fold strain was isolated by RC4 treatment, and an ultra-high-yield mutation more than 4-fold was isolated by RC40 treatment.
  • the R8-1-1 strain was originally isolated as a mutant strain showing 3.5 times higher yield by Mv treatment.
  • RC0, R8-1-1-16-1 a strain that showed 4.5 times higher yield even without treatment. From that fact, RC4, R8-1-1-11-2, RC4, R8-1-1-15-2, RC4, R8-1-1-16-1, RC40, R8-1-1- 3-1 is 4.5, 4.1, 4.5, and 4.1 times, respectively, and the possibility of being selected by the same mechanism cannot be denied.
  • the wheat seeds in Experimental Example 1 and Experimental Example 2 are aggregate seeds from a large number of wild strains. Among the seeds, good seeds (large round) are selected. Yes. For that reason, since the subsequent growth of the plant is also good, Experimental Example 1 and Experimental Example 2 are treated differently from other experimental examples. The number of survivors in the control experiment is low, and F0-0-1 and F0-0-2 in Experimental Example 2 are used as the control experiment. In the Mv treatment in Experimental Example 1, no spike weight exceeded the control experiment. There was a strain that seemed to be in early bloom, but the growth was extremely bad and it was discarded. In Experimental Example 1, the acclimatization in the process of taking it out from the greenhouse (25 ° C.) was not successful, and many strains died.
  • Experimental Example 2 is a method based on the second patent application.
  • the number of survivors was relatively high, and the plants grew well after transplanting.
  • F80-4-2 is a treated strain that has a fraction of double getts, a spike number of more than twice, a spike weight of 2.5 times, and a biomass amount of 2.5 times.
  • the plant height was 10 cm higher than the average of the wild strain, but was within the range of the wild strain.
  • F80-4-2 was identified as a high yield mutant.
  • Experimental Example 5 and Experimental Example 6 dealt with seeds obtained from four wild spikes. The number of survivors at the final harvest stage was small, and the mutant strain could not be isolated.
  • Fig. 37 shows the post-harvest image along with the wild strain R0-3-2 from another experiment conducted in parallel. The existence of these strains exhibiting ultra-high yield mutations indicates that at least wheat can show such a high yield. Whether this harvestability is stable and can be harvested in the field will be a new challenge in the future.
  • R0-3-1-1-1, R0-3-1-2-1, R0-3-1-2-4 shows high yield, but this characteristic causes the high yield seen in Chinese Spring strains. There is a good chance that it was gained by a collection of small factors to get.
  • R0-5-1-30 shows a high yield even in the self-grown seeds of the wild strain (R0-5-1). These high yielding wild strains occurring at a probability of approximately 2% could be brought to homogeneity by repeated selfing. These high-harvest wild strains and strains treated with this mutagen will show fundamentally different responses in Mv resistance. This point needs to be confirmed.
  • RC0 vitamin C, 1 mM
  • RC treatment were performed using the seeds of ear numbers 3, 11, 15, 16, 19, 22, 23, and 29 of the high yield mutant R8-1-1 in Experimental Example 12. Performed (Table 8). Table 17 shows the results of RC0.
  • FIG. 40 shows 6 high-yield mutant strains, R8-1-1, showing 3 to 4 times higher productivity. These strains are thought to have the mutation homozygously. These ear seeds were subjected to RC treatment, and the results are shown in Experimental Example 12 of Table 8 with some intermediate data.
  • Table 18 three ultra-high-yield mutants with higher productivity than the high-yield mutants were isolated. The productivity was 4.1 to 5.7 times that of the wild strain.
  • the RC80R80-1-1-15-1 strain which shows 5.7 times, has productivity that can be industrialized for bioethanol production, such as the number of cuts, the number of ears, and the straw as biomass. The result is shown in FIG.
  • the wheat high-yielding mutants showed high yield.
  • high yield mutations and seeds as the first generation of hybrids were used in order from the ear with the largest number of ears.
  • the seedlings from each seed are sowed at the apex of a regular triangle with a spacing of 28 cm, and the cocoon spacing is 1 m. Sufficient space is available, and the characteristics of the stock are clearly visible.
  • the hybrid first generation mutation is expected to enter a chimera, and the seeds from each ear are analyzed assuming that they are genetically identical. Whether this assumption is correct also needs to be verified. A pattern in which the mutation is chimerized into a part of the spike is often seen.
  • the spikes with mutations have mutations in all seeds.
  • the genotype of the first hybrid mutant is Rr.
  • Each gene may be in group A, group B, group D.
  • the first genotype of the hybrid is Ra ra, rb rb, and rd rd.
  • the genotypes of their offspring are Ra Ra, rb rb, rd rd, Ra ra, rb rb, rd rd, ra ra, rb rb, rd rd Become.
  • Ra ra ra, rb rb, and rd rd are equivalent to wild type, and their productivity is 13.2 g in ear weight
  • Ra ra, rb rb, rd rd is 26.4 -39.6 g
  • Ra Ra, rb rb, rd rd is also 26.4 It is considered to be ⁇ 39.6 g.
  • Ra ra, rb rb, and rd rd show values near 26.4 g
  • Ra Ra, rb rb, and rd rd show values near 39.6 g.
  • the R2-1-1, R8-1-1 strain shows values exceeding 50 g for Ra Ra, rb rb, and rd rd. In this case, it is better to show a dominant intermediate mutation rather than a dominant mutation.
  • the R2-1-1, R8-1-1 strains Ra Ra, rb rb, and rd ⁇ rd homozygous strains produced a large amount of hybrid second seeds, and the hybrid third homozygous strains.
  • the seeds are used to test the productivity in the field (transplantation at 5 cm intervals).
  • the germination ability of these seeds exceeds 95%, showing a good germination rate, and the leaves of seedlings are greener than the wild strain.
  • the summary is shown in Table 20. It can be expected to be about 5 times higher than wild strains.
  • FIG. 43 shows a comparison of RC4R2-1-1, RC40R2-1-1 with wild strawberry and root strains.
  • photographs of these ultra-high yield mutants and ears are shown in FIGS. 44 and 45. These seed productivity tests are also conducted.
  • Table 3 Experiment 1 is an ordinary Mv treatment using aggregated seeds, but the medium was washed, added with a new Mv medium, and exposed to sunlight for 7 days in a greenhouse. Before putting in, the medium was washed, put in fresh medium, irradiated with ultraviolet light, then changed the concentration of riboflavin, and exposed to sunlight for 7 days in a greenhouse.
  • the sod-1 mutant of red-knot mold exhibits a circadian rhythm of clean conidia formation (Y. Yoshida, T. Maeda, B. Lee and K. Hasunuma, 2008, Conidiation rhythm and light entrainment in superoxide dismutase mutant in Neurospora crassa Molec. Genet. Genomics, 279; 193-202.).
  • conidia were inoculated on an agar medium to form a circadian rhythm of hyphae and conidia formation.
  • the tip of the mycelium was cut out and the concentration of active oxygen molecular species was measured.
  • the concentration of ROS mainly composed of superoxide decreases from the formation of aerial hyphae, which is the start of conidia formation, to the formation of conidia. It becomes maximum in the hypha part. Therefore, it shows a beautiful circadian rhythm.
  • ROS mainly composed of superoxide acts as secondary information and has the possibility of controlling gene expression, the expression of many genes such as ccg-2 is controlled by circadian rhythm. . It is considered that there are fluctuations in the concentration of ROS mainly in the same superoxide in the circadian rhythm in plants.
  • the mechanism for determining the timing of flower bud formation is included in this, and the mutation that changes ROS mainly composed of superoxide may change the timing of flower bud formation. Therefore, the technique for inducing the change of flower bud formation time is given.
  • the extremely high yielding active oxygen resistant mutant R3-1 was tested for growth productivity in the field. As shown in the upper part of FIG. 47, the whole plant (whole plant) was three times as much as its raw weight (lower part D). The roots were more developed than the wild strains. As shown in the lower row, A; Saya productivity was about 2.9 times that of the wild type, and as shown in B, the number of seeds was 2.3 times, and C; the weight of dry Saya was 1.5 times.
  • riboflavin generates all active oxygen molecular species including singlet oxygen under strong light irradiation, so that singlet oxygen is specifically generated by methylene blue which specifically generates singlet oxygen, and its presence.
  • methylene blue which specifically generates singlet oxygen, and its presence.
  • Chlorophyll was extracted from persimmon leaves and wild and mutant strains were compared. As shown in FIG. 50A, the chlorophyll content is 15% higher than the mutant strain. As shown in B, the amount of carotenoids is 14% higher than the wild type. In C, anthocyanins are 67% higher. In D, peroxidation of membrane lipid was observed based on the amount of malonaldehyde produced. Most plant lipids are unsaturated fatty acids, and singlet oxygen is introduced into the double bond portion by lipoxygenase to generate hydroxy peroxide. The other bond is further cleaved to yield malonaldehyde. The degree of lipid peroxidation was investigated from the amount of malonaldehyde produced.
  • ndk-1 P72H is sensitive to paraquat in red mold. Histag NDK-1 binds NADH, but histag NDK-1 P72H has not been shown to bind NADH (N. Wang, Y. Yoshida and K. Hasunuma, 2007, Catalase-1 (CAT-1) and nucleoside diphosphate kinase-1 (NDK-1) play an important role in protecting conidial viability under light stress in Neurospora crassa. Molec. Genet. Gent. Genomics, 277: 13-22.).
  • isolating a paraquat resistant strain using the ndk-1 P72H mutant strain means that a mutation is further introduced into the ndk-1 P72H mutant gene to obtain a back mutant strain that binds NADH. .
  • the first candidate gene for a paraquat resistant strain is an NDK mutation.
  • Alaska pea R3-1 mutant can detect NDK by phosphorylation of its soluble fraction protein. As a result, the phosphorylation pattern of SDS-PAGE was different from the wild type in the mobility of Pea NDK2.
  • Pea NDK1 localized in cytosol
  • Pea NDK2 localized in chloroplast
  • Pea NDK3 localized in mitochondria
  • Ile12Leu is a mutation in the translocation peptide (chloroplast localization sequence) required for NDK2 to localize to the chloroplast, and another substitution is Glu205Lys, which is a protein substitution. It changes the charge and affects the mobility of electrophoresis. In other words, Glu is negatively charged and it is difficult to attach SDS, but Lys is positively charged and SDS is easy to attach. It can be considered that the amount of SDS attached to Pea NDK2 is large and negatively charged as a whole because the mutant type is more attached, and the mobility is also increased.
  • NDK halophilic bacteria
  • NDK3 localized in mitochondria was also analyzed. Five base substitutions were detected, but all five were identified as mutations induced by reactive oxygen species. One of them caused an amino acid substitution and was Pro45Ser. Proline is likely to have a function change due to mutations in the mitochondria translocation peptide, which forms the end of the alpha helix.
  • the mutations induced in NDK2 and NDK3 were identical in both R3-1 and R3-2 mutants, and these mutants were identified as the same mutation.
  • NDK1, NDK2, and NDK3 were analyzed.
  • NDK1 and NDK2 present in the soluble fraction are phosphorylated.
  • NDK2 is considered to exist to some extent in cytosol. It is also considered that chloroplasts are destroyed and partly mixed when preparing the soluble fraction.
  • the mobility of phosphorylated R3-1 mutant ⁇ NDK2 in SDS electrophoresis is large. Chloroplasts and mitochondria were purified, disrupted, and dialyzed to remove small molecules such as NADH. The phosphorylation pattern of that fraction is shown in FIG. 52B.
  • the amino acid phosphorylation of these phosphorylation signals is determined based on the upper alkali treatment (histidine phosphorylation and serine phosphorylation remain) and the lower acid treatment (serine phosphorylation remains). ) Indicates that at least phosphorylation of histidine is included. These indicate that they are representative of histidine kinase.
  • nucleoside diphosphate kinase activity was measured using dGDP and dTDP as substrates using wild-type and R3-1 mutant GST-NDK2 and GST-NDK3.
  • R3-1 mutant GST-NDK2 showed 1.8 times and 2.3 times the activity of the wild type, respectively. However, it was 1.1 times and 1.0 times when GST-NDK3 was used.
  • the R3-1 mutants NDK2leIle12Leu and Glu205Lys were attached with a transition peptide, and GST- was cut off and its autophosphorylation activity was twice that of the wild type. Moreover, when comparing the nucleoside diphosphate kinase activities of wild-type NDK2 and R3-1 mutant NDK2 Ile12Leu and Glu205Lys with GST- attached, the latter is also twice as high. Moreover, when the binding activity of NADH is seen in the state where GST- is cut off, the latter has high activity.
  • NDK2 Ile12Leu and Glu205Lys have high autophosphorylation activity, nucleoside diphosphate kinase activity, and NADH binding activity, and cause of R3-1 mutant strains that exhibit resistance to reactive oxygen species including singlet oxygen It was strongly suggested to be a gene. Therefore, this gene mutation induces substitution of the amino acid sequence of the combination shown in FIG. 56 not only in vivo, but also in vitro, and introduces the mutant gene into other crops as well as Alaska pea wild strains. Thus, a technique for providing a characteristic exhibiting extremely high yield is provided.
  • useful mutations can be induced in fungi and plants with high efficiency. As a result, it became possible to produce useful mutants of fungi and plants.
  • This research will contribute to agriculture (cereals, vegetables). In addition, it provides a large amount of raw materials for fuel ethanol and plant plastics as an alternative energy source for health food, vegetable oil industry, and fossil fuel resources. It will also improve the growth of pasture and provide large amounts of livestock feed.

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Abstract

　菌類及び植物の有用変異株を取得する方法を提供する。変異誘起処理の間又は後に、菌類又は植物を電子供与体の存在下で培養することを含む、菌類又は植物の有用変異株の作製方法。

Description

１重項酸素の消去過程の解明とその過程に関わる分子の増強による菌類及び／又は植物の新規高能率変異株の単離法
　本発明は、菌類及び／又は植物の新規高能率変異株の取得方法、並びに該方法により得られた菌類及び植物の変異株に関する。
　植物は太陽光（1000～2500μmole.m-2.sec-1）という実験室内では再現することが困難な強光下で光合成を行っている。露地での光合成速度は午前中の１０時、また午後の４時に最大値を示し、昼間は光合成速度が低下する。昼間は強光下で光合成をおこなっているが、強光により葉緑素は三重項クロロフィルへ励起され、そのエネルギーは３重項酸素にわたされ、多量の一重項酸素を発生する（図１）。一重項酸素は光合成器官のチラコイド膜の脂質を過酸化脂質として破壊する。膜構造からのイオン流出を可能とし、光合成速度を低下させる。この太陽光エネルギーを効率的に植物が利用するためには、発生した一重項酸素を速やかに消去することを可能とする変異を誘起する技術が必要となる。
　本発明者らは、種々の植物の変異株を得る方法として、メチルビオローゲン；Methyl viologen (Mv)、過酸化水素、NOを変異原として用いる方法を開発し、特許出願した（特許文献１）。
特開2006-296359号公報
　本発明者らは、アカパンカビにおいて、ヌクレオシド２リン酸キナーゼ(NDK-1)点突然変異株ndk-1P72H(Y Ogura, Y Yoshida, N Yabe and K Hasunuma : A point mutation in nucleoside diphosphate kinase results in a deficient light response for perithecial polarity in Neurospora crassa. J. Biol. Chem. 276 ; 21228-21234, 2001.)及びノックアウト株(B Lee, Y Yoshida and K Hasunuma : Photomorphogenetic characteristics are severely affected in nucleoside diphosphate kinase-1 (ndk-1)-disrupted mutants in Neurospora crassa. Mol. Genet. Genomics 275, 9-17, 2006.)を用いて光伝達に関わることを確立した。さらにNDK-1とカタラーゼ、Cat-1, Cat-3が複合体を形成することを明らかにした(Y Yoshida, Y Ogura and K Hasunuma : Interaction of nucleoside diphosphate kinase and catalases for stress and light responses in Neurospora crassa. FEBS Letters 580, 3282-3286, 2006.)。Cat-1をノックアウトすることにより、cat-1RIPを作成し、光伝達に関わることを確立した(N Wang, Y Yoshida and K Hasunuma ; Loss of Catalase-1 (Cat-1) results in decreased conidial viability enhanced by exposure to light in Neurospora crassa. Mol. Genet. Genomics 277:13-22, 2007.)。以上よりNDK-1及びCat-1はNDK-1/Cat-1複合体を形成し、光伝達に関わることを確立した。Cat-1, Cat-3はともに1重項酸素を結合することが知られている(F Lledias, P Rangel, W Hansberg; Oxidation of catalase by singlet oxygen. J Biol Chem 273:10630-10637, 1998). NDK-1/Cat-1複合体は1重項酸素の消去過程に関わることが示された。
　本発明者らは、アカパンカビの野生株、ndk-1P72H変異株、cat-1RIP変異株、それらの２重変異株を用いて、強光照射下(100μmol/m2/sec)での1重項酸素発生剤であるリボフラビン(0, 200, 400, 800μM)に対する耐性を測定した。その結果、野生株及びcat-1RIP変異株は1重項酸素に対して耐性で、ndk-1P72H変異株は感受性であった。さらにヒスタグNDK-1, ヒスタグNDK-1P72Hタンパク質を用い(32P)NADHの結合実験を行った。ヒスタグNDK-1は (32P)NADHを結合するが、ヒスタグNDK-1P72Hは(32P)NADHを結合しないことを突き止めた。以上の結果よりNDK-1はNADHを結合し、1重項酸素を結合したCat-1（２分子の1重項酸素を結合したCat-1cが圧倒的に多い）に２つの電子をあたえ、２分子のスーパーオキシド(・O2-)を生ずる過程が予想された(N Wang, Y Yoshida, K Hasunuma; Catalase-1(CAT-1) and nucleoside diphosphate kinase-1(NDK-1) play an important role in protecting conidial viability under light stress in Neurospora crassa, Mol. Genet. Genomics 278:235-242, 2007)。スーパーオキシドはスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)により、過酸化水素(H2O2)となる。過酸化水素はCat-1, Cat-2, Cat-3, (Cat-4)により、H2OとO2になり、無害化される。アカパンカビを用いて、1重項酸素から酸素発生までの証明は現在進行中である。これらの過程は全て還元過程であるが、この還元過程の電子供与はNDK-1によりなされ、NDK-1P72HはNADH結合能が無いことにより、全過程が1重項酸素、スーパーオキシド、過酸化水素に感受性と成ると考えられる(N Wang, Y Yoshida, K Hasunuma; Catalase-1(CAT-1) and nucleoside diphosphate kinase-1(NDK-1) play an important role in protecting conidial viability under light stress in Neurospora crassa, Mol. Genet. Genomics 278:235-242, 2007)。
　本発明者らは、アラスカエンドウを用いて、パラコート(Methyl viologen; Mv)耐性株を単離した。Mv  8μMで処理し得られた本変異株、R3-1, R3-2はMv  8μMで発芽が可能であるが、野生株はほとんど発芽しないことを確認した。これらの変異株はそれぞれおよそ野生株の２倍の種子（重量g）を実らせた。これらの変異株は以下に述べるような酵素レベルでの変異形質を有していた。NDK活性は野生株の40%程度その活性が上昇していた。カタラーゼ活性はおよそ30%程度その活性が上昇していた。しかし、過酸化水素とアスコルビン酸を用いて、水と酸素にするアスコルビン酸ペルオキシダーゼ(APX)は全体の活性としてはあまり変化がなかった。分子種によっては活性が消失していた。この結果はMv 8μM存在下に、光合成の系Iで生ずる還元型フェレドキシンのかわりに還元型Mvが生じ、スーパーオキシド(・O2 -)を生じたと考えられる。さらに還元型フェレドキシンが生産されないために、ジヒドロアスコルビン酸が還元されず、３０種類ほど存在すると考えられるAPXは働けない。そのためAPXは存在しないのと同じとなり、たとえ過剰発現した変異株が存在しても活性がでないために、そのような変異株は選抜の過程で除去されてしまう、と考えられる。NDK活性とカタラーゼ活性の上昇した変異株は1重項酸素を効率良く捕捉し、NDKに結合し運ばれたNADHより電子が供給され、スーパーオキシドへと還元され、SODおよびCATによる消去回路に入れられると考えられる。
　本発明者らは、アラスカエンドウの葉の葉緑体分画、ミトコンドリア、ペロキシゾーム分画、その可溶性分画の(32P)NADH結合活性を未変性ゲル電気泳動により測定した。電気泳動後に、ゲルを直接オートラジオグラフイーにかけ、シグナルを検出した。可溶性分画には1つの主バンドと２つの副バンドが検出され、各バンドは同時にNDK活性を保有していた。従って(32P)NADH結合活性の大部分はNDKと考えられ、NDKはNADHの主要な運搬体であると考えられた。カタラーゼとNDKは複合体を形成するとシロイヌナズナを用いて報告した(Y Fukamatsu, N Yabe and K Hasunuma : Arabidopsis NDK-1 is a component of ROS signaling by interacting with three catalases. Plant Cell Physiol. 44, 982-989, 2003.)。カタラーゼ活性の存在する部分のゲルは同時にNDK活性を保有していたが、(32P)NADH結合活性は検知することができなかった。
　各分画の(γ-32P)ATPによるリン酸化後のSDS-PAGE(SDS電気泳動)では、15, 16, 17, 18 kDaに３種のNDKバンドが検出された。このうち16 kDaバンドは(32P)NADHの結合活性が強いと考えられ、(32P)NADHの結合後紫外線でクロスリンクさせて、SDS-PAGEにかけても同一の場所に強いシグナルを検出した。15, 17, 18 kDaに存在する２種のNDKは、(32P)NADHの結合が弱く、紫外線によるクロスリンクを行っても効率良くクロスリンクしないと考えられる。(γ-32P)ATPのリン酸化によるNDKは３種類存在するが、18 kDa　NDKは各分画において、R3-1, R3-2変異株ではSDS-PAGEでの分子の移動度が大きくなり、17 kDa に変化する。また15 kDa NDKは葉緑体分画には野生株、R3-1, R3-2変異株ですべて存在しない。またミトコンドリア、ペロキシゾーム分画では野生株には存在するが、変異株には存在しない。可溶性分画の16 kDa  NDKは変異株ではともにリン酸化が野生株の２倍程度高い。これらの葉緑体分画、またミトコンドリア、ペロキシゾーム分画にはこれらのNDK分子種が外側に付着して機能している可能性が存在する。本リン酸化による標識法では、これらの細胞器官の内側に存在するタンパク質のリン酸化は行なっていない。
　以上の結果から強い光により発生した1重項酸素をより効率良く消去、無害化する変異株の単離法の開発を提案する。特願2005-125981（出願日：２００５年４月２５日、特開2006-296359）（以下、「第１特許出願」と呼ぶこともある）では、Mvをもちいて、活性酸素を発生させた。活性酸素により変異を誘導し、活性酸素耐性となった変異株を単離した。このような原理で、上記の特性を示す変異株を単離した。特願2006-283492（出願日：２００６年１０月１８日）、特願2007-171681（出願日：２００７年６月２９日）及びPCT/JP2007/070253（国際出願日：２００７年１０月１７日）（以下、これらの３つを総称して、「第２特許出願」と呼ぶこともある）では、種子、また茎頂の発芽また成長後、紫外線照射し、ランダムに変異を誘導したのち、リボフラビンを培地に加え、太陽光にさらした。多量に発生した1重項酸素に耐性を示す細胞を中心に植物体が形成される。このようにして1重項酸素耐性変異株が、サツマイモ、イネで得られた。これらの株は野生株のおよそ３倍の収穫を示した。サツマイモの葉でNDKのリン酸化活性を調査すると、変異株の可溶性分画のNDKは野生株のおよそ２倍のリン酸化活性がみられた。
　本発明では、1重項酸素をより効率良く捕捉し、無害化する速度を早めるための改良を与えることにポイントを置いた。そのためには、カタラーゼ活性とNDK活性を上昇させ、さらにNDKに結合し運ばれるNADHの供給能力を上昇させる必要がある。1重項酸素に電子を供与し、発生したスーパーオキシドを過酸化水素へと消去回路に導入し、さらに過酸化水素の消去能力を上昇させることが必要と考えられる。NADHの供給能力について、培地にNADHを加えてそれを増強することはNADHが膜を通過できないために不可能である。従って、アスコルビン酸、ジヒドロアスコルビン酸をアスコルビン酸に還元しうる還元型グルタチオンを培地に加え、細胞内の電子供与能力（還元力）を上昇させ、還元力を絶対的に必要とする酵素がいつでも自由に稼働できるようにしておく。例えばアスコルビン酸ペルオキシダーゼはアスコルビン酸が豊に存在すれば、それを過剰発現する変異株が単離できることになる。従来の特願2005-125981、特願2006-283492、特願2007-171681及びPCT/JP2007/070253の方法では、この点が考えられていない。
　種子及び茎のMS培地での生育の初期３日間に１または10 mMアスコルビン酸（還元型グルタチオン）を加え、細胞内にアスコルビン酸を充填しておく。同時にMvを0, 4,  8,  40,  80 μM培地にいれる。４日目に培地を水で置換し、さらにMS培地にMvを0, 4,  8,  40,  80 μMいれる。さらに3日間温室にいれ、変異の誘発および活性酸素耐性の選抜を行わせ、その種子をプランタに播種する（方法１）。又は、方法２として、水に置換し、さ らにMS培地にMvを0,  4,  8,  40,  80 μMいれた培地で置換する。紫外線照射後、リボフラビンを80 μMになるように入れ、温室で太陽光にさらす。3日後にプランタに播種する。更に第3ステップの方法３として、MS培地にMvを0,  4, 8,  40,  80 μMいれた培地に種子を生育し、同時にまたは１日後、0.1～50 mMアスコルビン酸を加え、計７日間同じ条件で生育する。この発芽種子をプランタに移植する。このようにすることにより、少なくとも多数存在するアスコルビン酸ぺルオキシダーゼの過剰発現された変異株の単離を可能とする。
　上記の3つの方法を用いて、既に第１特許出願の方法で得られた高収穫株、また第２特許出願で得られた高収穫株を変異誘起処理し、さらに野生株の５～６倍の高収穫の作物植物を作出する（野生株の５～６倍の高収穫のコムギ等はエタノール生産等工業用に採算のとれる使用ができる）。第１特許出願の方法で、イネは雑種第２代で、2.1倍、また第２特許出願の方法で3倍、第1及び第２の２回の処理で、3.8倍の収穫を得ている。コムギでは第1の方法で3～3.5倍、オオムギでは2.5～3倍、オートムギでは3～3.8倍の数値を得ている。本発明の３つの方法をさらに上記で得られた高収穫株に処理することにより、野生株の5～6倍の収穫を示す超高収穫変異株をうることは不可能ではない。現在これらの薬剤処理により、コムギで４倍～９倍の収穫を示す超高収穫変異株が単離されている。
　これらの薬剤処理を行い、生育等の良さから選抜の候補をうる。その候補の確からしさはその候補株の葉の上記酵素の活性を測定することにより、決定することが可能である。
　これらの変異株の、膜脂質の酸化度、光合成による炭酸ガスの固定速度、イオンの流出速度、クロロフィル濃度等は1重項酸素の消去能力により大きく変動する。これらの測定を行い高収穫にいたる機構の説明を行う。
　高収穫にいたる変異は1重項酸素の消去能力と大きな関係がある。この反応は1重項酸素に対する植物の応答変異であり、少なくとも3種のNDK,　 1種のカタラーゼ、３０種ほどのアスコルビン酸ペルオキシダーゼ、等の様々なレベルの酵素の変動を誘起している。これは太陽光として入力されたエネルギーの活性酸素分子種(Reactive oxygen species;ROS)、NAD(P)H,  ATPへの流入（生産）、分散、流動を意味する。自動車で言えば電気系統及び動力系統の制御によるエネルギー収支の計算を可能にするものである。これはマトリックスで表現されるもので、詳細に計算しうるものである。
　このような大きなエネルギー系を制御し、多数の因子を制御すると考えられる遺伝子の存在は今まで知られていない。このような遺伝子は、1重項酸素耐性ばかりでなく、高塩濃度耐性、低温耐性、高温耐性、乾燥耐性、病虫害耐性等、一般に環境応答反応と言われる生物反応にも稼働していると考えられる。その決定的因子として、恒に活性酸素が関わることが共通している。これら酵素系の局在性も反映し、3次元マトリックスとして表現した時に生物を活性酸素を軸に数値的に表現できる可能性を与える。これらの3次元的マトリックスによる数値化は、種々の環境応答の妥当な回答の出し方を与える。従って技術として主張できるものである。
　本発明は、これらの知見及び考察に基づいて完成されたものである。
　本発明の要旨は以下の通りである。
（１）変異誘起処理の間又は後に、菌類又は植物を電子供与体の存在下で培養することを含む、菌類又は植物の有用変異株の作製方法。
（２）変異誘起処理が、活性酸素若しくは活性酸素発生剤への暴露である（１）記載の方法。
（３）活性酸素又は活性酸素発生剤が、メチルビオローゲン、過酸化水素及びNaニトロプルシッドからなる群より選択される少なくとも１種類の化合物である（２）記載の方法。
（４）活性酸素又は活性酸素発生剤が、メチルビオローゲンである（３）記載の方法。
（５）活性酸素発生剤への暴露が、0.1～250μMのメチルビオローゲンを含有する培地中での菌類又は植物の培養である（４）記載の方法。
（６）電子供与体がアスコルビン酸及び／又は還元型グルタチオンである（１）～（５）のいずれかに記載の方法。
（７）0.001～50 ｍＭのアスコルビン酸及び／又は還元型グルタチオンの存在下で、菌類又は植物を培養する（６）記載の方法。
（８）変異誘起処理の間又は後に、菌類又は植物を電子供与体の存在下で培養し、生育した株を選択すること、前記の選択した株に第２の変異誘起処理を行うこと、第２の変異誘起処理の後に、前記の選択した株を一重項酸素が発生する条件下で培養し、生育した株を選択することを含む（１）～（７）のいずれかに記載の方法。
（９）第２の変異誘起処理が紫外線照射である（８）記載の方法。
（１０）紫外線照射が、1 ～１０ μmole・m-2・sec-1の紫外線を１～５分間菌類又は植物に照射することである（９）記載の方法。
（１１）一重項酸素が発生する条件下での培養が、一重項酸素発生光増感剤を含む培地中での光照射下の培養である（８）～（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）一重項酸素発生光増感剤が、リボフラビン、ポルフィリン、メチレンブルー、ローズベンガル、FMN(フラビンモノヌクレオチド)及びFAD(フラビンアデニンジヌクレオチド)からなる群より選択される（１１）記載の方法。
（１３）一重項酸素発生光増感剤がリボフラビンである（１２）記載の方法。
（１４）照射する光が太陽光である（１１）～（１３）のいずれかに記載の方法。
（１５）一重項酸素発生光増感剤を含む培地中での光照射下の培養が、１０～4000μMのリボフラビンを含有する培地中での50～2500μmole・m-1・sec-1の太陽光照射下の培養である（１４）記載の方法。
（１６）変異誘起処理を菌類の分生子又は植物の茎を含んでもよい種子に行う（１）～（１５）のいずれかに記載の方法。
（１７）変異誘起処理を野生株の菌類又は植物に行う（１）～（１６）のいずれかに記載の方法。
（１８）変異誘起処理を一重項酸素以外の活性酸素に耐性がある変異菌若しくは変異植物又はその子孫に行う（１）～（１６）のいずれかに記載の方法。
（１９）一重項酸素以外の活性酸素に耐性がある変異菌若しくは変異植物又はその子孫が、野生株の菌類又は植物を一重項酸素以外の活性酸素又は活性酸素発生剤に暴露して得られた変異菌若しくは変異植物又はその子孫である（１８）記載の方法。
（２０）変異誘起処理の間又は後に、菌類又は植物を電子供与体の存在下で培養することにより作製した菌類又は植物の有用変異株の次世代以降の子孫に変異誘起処理を行う（１）～（１９）のいずれかに記載の方法。
（２１）菌類が子嚢菌類に属するものである（１）～（２０）のいずれかに記載の方法。
（２２）子嚢菌類がアカパンカビである（２１）記載の方法。
（２３）植物が単子葉植物又は双子葉植物である（１）～（２０）のいずれかに記載の方法。
（２４）単子葉植物が、オートムギ、コムギ、オオムギ、イネ、トウモロコシ、ソルガム又はサトウキビである（２３）記載の方法。
（２５）双子葉植物が、ブロッコリー、ペチュニア、アブラナ、サツマイモ、ヒマワリ、ピーナツ、ダイズ、アラスカエンドウ又は甜菜である（２３）記載の方法。
（２６）（１）～（２５）のいずれかに記載の方法で作製した菌類若しくは植物の変異株又はその子孫。
（２７）（２６）記載の植物の変異株又はその子孫の細胞又は組織。
（２８）（２６）記載の植物の変異株又はその子孫の種子。
（２９）（１）～（２５）のいずれかに記載の方法で作製した植物の変異株又はその子孫の自家受精又は交配により、所望の性質及び／又は形質を示す株を作製する方法。
（３０）（２９）記載の方法で作製した植物株又はその子孫。
（３１）（３０）記載の植物株又はその子孫の細胞又は組織。
（３２）（３０）記載の植物株又はその子孫の種子。
（３３）電子供与体を含む、菌類又は植物に有用な変異を誘起するための組成物。
（３４）野生種と比較して　葉緑素量が多く、かつ過酸化脂質の形成量が抑制されている菌類若しくは植物の変異株又はその子孫。
（３５）野生種と比較して　ＮＤＫに関する変異を含む菌類若しくは植物の変異株又はその子孫。
（３６）野生種と比較して、ＮＤＫ２及び/又はＮＤＫ３に関する変異を含む菌類若しくは植物の変異株又はその子孫。
（３７）野生種と比較して、ＮＤＫ２において、少なくともＩｌｅｌ２Ｌｅｕ及びＧｌｕ２０５Ｌｙｓのアミノ酸置換が誘起されている菌類若しくは植物の変異株又はその子孫。
（３８）野生種と比較して、ＮＤＫ３において、少なくともＰｒｏ４５Ｓｅｒのアミノ酸置換が誘起されている菌類若しくは植物の変異株又はその子孫。
（３９）野生種と比較して、少なくともＮＤＫ２におけるヒスチジン及び/又はセリンのリン酸化活性が高い菌類若しくは植物の変異株又はその子孫。
（４０）野生種と比較して　ＮＤＫ２のヌクレオシド2リン酸キナーゼ活性が1.3倍以上ある菌類若しくは植物の変異株又はその子孫。
　本発明により、１重項酸素の消去過程の一部が解明され、その過程に関わる分子の増強による菌類及び／又は植物の新規高能率変異株の単離法が提供された。
　本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2008‐21811及び特願2008‐225509の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
活性酸素代謝；ヒトに於ける活性酸素代謝を主にした活性酸素代謝図。図中の赤線部分は第２特許出願でその証明をしている。 アカパンカビ野生株、cat-1RIP,  ndk-1P72H及びその２重変異株を用いた, (A)過酸化水素処理に対するコニディアの生残率（発芽能で生残を見る）, 及び (B)培地に加えられたリボフラビンと強光による１重項酸素に対するコロニー形成率；詳細は本文に記されている。 図３。アカパンカビのヒスタグを付加した野生型NDK-1、及び NDK-1P72Hを用いた (32P)NADHの結合活性。 (A) プルダウンアッセイによるヒスタグNDK-1及び ヒスタグNDK-1P72Hに結合した(32P)NADH の放射能を計数する。対照実験は用いたレジンのみ。(B)それぞれの分画に於けるタンパク質量の同定。 アカパンカビに於ける1重項酸素の還元過程（１）、スーパーオキシドの還元過程（２）、さらに過酸化水素の還元過程（３）を化学式を用いて説明する。 アカパンカビのsod-1変異株およびndk-1P72H 変異株を用いたMvにより誘起された耐性株の突然変異誘起率。詳細は本文を参照 1重項酸素耐性変異株誘起のビタミンC濃度依存性 アスコルビン酸による酸化型グルタチオン（GSSG）の自動還元を含む過酸化水素の無害化過程。詳細は本文に記されている。 野生株、R3-1, R3-2変異株の葉の粗抽出液に対するスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)の活性。詳細は本文に記されている。 野生株、R3-1, R3-2変異株の葉の粗抽出液に対するカタラーゼ (CAT) の活性。詳細は本文に記されている。 野生株、R3-1, R3-2変異株の葉の粗抽出液に対するアスコルビン酸ペルオキシダーゼ (APX)、またアスコルビン酸の供給に影響を及ぼすグルタチオンレダクターゼ(GR) の活性。詳細は本文に記されている。 野生株、高収穫変異株、R424(Ho) 及びR458(Ho)の１株あたりの分ゲツ数、及び１株あたりの穂の重量（収穫性）を示す。詳細は本文に示す。 野生株、高収穫変異株、R424(Ho) 及びR458(Ho)の発芽種子が示す、Mv耐性。発芽するが白化するものは感受性、緑を保つものは発芽耐性とする。詳細は本文に示す。 野生株R0-1-5及び高収穫変異株R2-1-1-5の3月中旬に於ける露地での生育状況。　野生株に比べ変異株は茎、及び葉の伸長生長がよく、また緑が濃い。 野生株R0-1-5及び高収穫変異株R2-1-3-14の生育状況。説明は図１と同一。 野生株R0-1-5及び高収穫変異株R2-3-9-8の生育状況。説明は図１と同一。 野生株R0-1-5及び高収穫変異株R8-1-1-7の生育状況。説明は図１と同一。 野生株R0-1-5及び高生産性野生株R8-1-1-7の生育状況。野生株に比べ高生産性野生株R0-3-1-3は茎、及び葉の伸長生長が少しよいが、葉の緑は野生株と変わらない。 野生株集合種子の無処理株F0-0-2とMv処理株R40-1株の3月下旬での圃場での生育状況。Mv処理株の生育が良く、緑も濃い。 野生株集合種子の無処理株F0-0-2とリボフラビン処理株F20-4-1株の3月下旬での圃場での生育状況。リボフラビン処理株の生育は少し良く、緑も少し濃い。しかし最終の生産性では決定的な高収穫性は示していない。 野生株集合種子の無処理株F0-0-2とリボフラビン処理株F40-4-1株の3月下旬での圃場での生育状況。リボフラビン処理株の生育は少し良いが、緑はあまり濃くない。最終の生産性でも決定的な高収穫性は示していない。この時点ではあまり明快な生育の良さを示していなかったF80-4-2が高収穫変異株となった。 高生産性野生株R0-3-1-2の薬剤無処理株と野生株集合種子をビタミンCを含む薬剤処理、RC処理、FRC処理により得られたRC4-1, FRC4-1株。ともに高収穫変異株及び超高収穫変異株としての高生産性を後に示した。この時点では生育は飛躍的に良いとは言えないが、葉の緑が少し濃い。 高収穫変異株、R2-1-1-10の無処理株とR2-1-1-3株のRC4処理によるRC4R2-1-1-3株。緑の濃さが一段と高いし、生育も良い。本変異株は超高収穫変異株として、その生産性は野生株の8倍を超えた。写真のRC8、RC40はRC4の誤り。 高生産性野生株R0-3-1-2の薬剤無処理株と其のRC4薬剤処理株。この時点での生育は良く、また緑も少し濃い。しかし高収穫変異以上の良い生産性を示す変異株は単離されていない。 高生産性野生株R0-3-1-9の薬剤無処理株と其のRC4薬剤処理株。この時点での生育は良く、また緑も少し濃い。しかし高収穫変異以上の良い生産性を示す変異株は単離されていない。 高生産性野生株R0-3-1-1の薬剤無処理株と其のRC8薬剤処理株。この時点での生育は良く、また緑も少し濃い。しかし高収穫変異以上の良い生産性を示す変異株は単離されていない。 高生産性野生株R0-3-1-2の薬剤無処理株と其のRC40, RC80薬剤処理株。この時点での生育は良く、また緑も少し濃い。しかし高収穫変異以上の良い生産性を示す変異株は単離されていない。 高収穫変異株R2-1-3-8株の薬剤無処理株及びそのRC4, RC8薬剤処理株。3月下旬の時点での生育は良く、また緑も少し濃い。高収穫変異以上の良い生産性を示す超高収穫変異株は単離されていない。 高収穫変異株R2-1-3-5株の薬剤無処理株及びそのRC4薬剤処理株。3月下旬の時点での生育は良く、また緑も少し濃い。高収穫変異以上の良い生産性を示す超高収穫変異株は単離されていない。 高収穫変異株R2-3-9-7株の薬剤無処理株及びそのRC4薬剤処理株。3月下旬の時点での生育は良く、また緑も少し濃い。高収穫変異以上の良い生産性を示す超高収穫変異株は単離されていない。 高収穫変異株R2-3-9-14株の薬剤無処理株及びそのRC4薬剤処理株。3月下旬の時点での生育は良く、また緑も少し濃い。高収穫変異以上の良い生産性を示す超高収穫変異株は単離されていない。 高収穫変異株R2-3-9-7株の薬剤無処理株及びそのRC40, RC80薬剤処理株。3月下旬の時点での生育は良く、また緑も少し濃い。高収穫変異以上の良い生産性を示す超高収穫変異株は単離されていない。 高収穫変異株R8-1-1-15株の薬剤無処理株及びそのRC4薬剤処理株。3月下旬の時点での生育は良く、また緑も少し濃い。高収穫変異株、またそれ以上の良い生産性を示す超高収穫変異株が単離されている。 野生株R0-1-5の５月初旬での生育状況。出穂が始まっている。 コムギ超高収穫変異株RC4R2-1-1-3, RC40R2-1-1-7 及び高収穫変異株RC8R2-1-1-7の５月初旬での生育状況。出穂が始まっている。野生株に比べ、分ゲツ数が非常に多く、茎が太く、緑が非常に濃い。 野生株集合種子をRC処理、FRC処理することにより得られた高収穫変異株，RC4-1及び超高収穫変異株FRC4-1。　野生株に比べ変異株は穂重量のみならず藁重量も高い数値を示している。 野生株集合種子をRC処理、FRC処理することにより得られた高収穫変異株，RC4-1及び超高収穫変異株FRC4-1。　野生株に比べ変異株は穂重量のみならず藁重量も高い数値を示している。 コムギ超高収穫変異株RC4R2-1-1-3, RC40R2-1-1-7と野生株R0-3-2の全体像の比較。穂は袋掛けしたままである。 高生産性野生株の収穫特性及びそのRC４処理株。これらの得られた高生産性野生株は小因子の集合によるもので、次世代ではまた野生株レベルの生産性に戻ってしまうと考えられる。 高収穫変異株R2-3-9のRC４処理による超高収穫性変異株の単離。RC4R2-3-9-7は超高収穫変異株のレベルの高収穫性を示す。 高収穫変異株R8-1-1の自殖により得られたホモ変異株と考えられる超高収穫変異株。R8-1-1-19-2株は超高収穫変異株。 高収穫変異株R8-1-1のRC処理により得られた超高収穫変異株。RC4R8-1-1-19-1, RC8R8-1-1-23-2, RC80R8-1-1-15-1株は超高収穫変異株。特にRC80R8-1-1-15-1株は工業用超高収穫変異株と判定される。 工業用超高収穫変異株のまとめ。超高収穫変異株の中から野生株の５倍（66 g）以上の高生産性を示す変異株を工業用超高収穫変異株としてまとめた。これらの株の藁部分（バイオマス）もかなり高い数値を示す。 工業用超高収穫変異株の野生株との比較。わら及び根の特性を示す。 工業用超高収穫変異株RC4R2-1-1-3の穂を野生株R0-3-2の穂と比較する。 工業用超高収穫変異株RC40R2-1-1-7の穂を野生株R0-1-5の穂と比較する。 多数の細長い走行箱に寒天培地を入れ、その一端にsod-1株の分生子（コ二ディア）を植菌した。概日時間6時間間隔で生育先端をサンプリングし、スーパーオキシドを主としたROSを測定した。縦軸（RLU;ROSによるルミネッセンス）, 横軸（概日時間で6時間間隔 (5.5時間に相当) ）. 圃場での野生株およびR3-1変異株の生育の比較及び生産力の比較。上段；全草の比較、サヤの比較、根の比較。下段；A；一株あたりのさやの数の比較、B；一株あたりの種子の数の比較、C；乾燥サヤの重さの比較、D；全草の生重量 メチレンブルー存在下、光照射下 (1５0μmol/m2/sec) での野生株、R3-1及びR3-2変異株の種子のA;発芽特性、B; 茎の伸長生長、C; 根の伸長生長。 葉緑素計によるSPAD値の測定。野生株、R3-1及びR3-2変異株の茎頂の第１、第２、第3葉をそれぞれ５枚ずつ５回葉緑素計で測定した。 光受容に関わる色素、葉緑素、カロテノイド及びアントシア二ン、及び膜脂質（不飽和脂肪酸）の一重項酸素による過酸化脂質への変換。　葉よりA葉緑素を抽出し定量比較した。B カロテノイド量の比較、C　アントシア二ンの定量、及び　Dマロンアルデヒド生成量による過酸化脂質の生成量の推定。 アラスカエンドウの野生株、R3-1及びR3-2変異株のNDK1,  NDK2,  NDK3のcDNAをクロー二ングし、塩基配列を決定した。そのうちアミノ酸置換を誘起する部分を示した。NDK2, NDK3は葉緑体移行ペプチド、ミトコンドリア移行ペプチドを保有し、これらの配列は葉緑体、ミトコンドリアに局在する時にはず（プロセス）される。なお葉緑体ではこのプロセッシングにより２種類の葉緑体NDK2が形成される。 葉からの可溶性分画のNDK1, NDK2のリン酸化およびクローンされた移行ペプチドの付いたNDK2, NDK3のリン酸化、また精製された葉緑体およびミトコンドリアのリン酸化特性。　A;可溶性分画のNDK1, NDK2のリン酸化、B; 精製された葉緑体NDK2およびミトコンドリアNDK3のリン酸化特性：移行ペプチドは除かれている。C;GST-NDK2, GST-NDK3のリン酸化パターン。D; リン酸化後にアルカリ処理（リン酸化ヒスチジンは残る）及び酸処理（リン酸化セリンは残る）のパターン。 GST-NDK2, GST-NDK3のヌクレオシド２リン酸キナーゼ活性の比較。吸光度計を用いたピルビン酸キナーゼ、乳酸脱水素酵素、ATP、を用い、dGDP,  dTDP受容体として用い、NADHの吸光度変化を測定し、定量する。 (32P)NADHのNDK1、NDK2、NDK3への結合活性を野生型及び変異型NDKを用いた調査。A; 葉からの可溶性分画のNDK1, NDK2のリン酸化活性、B; 葉からの可溶性分画を用いた (32P)NADHの結合活性：(32P)NADHと葉からの可溶性分画を氷上で混合後、紫外線照射を3分おこなう。C;GST-NDK1からGST-を切り離し、(32P)NADHを結合させた。また(32P)NADHをGST-のみ、GST-NDK2に(32P)NADHに結合させた。更にGST-NDK3に結合させた。 アラスカエンドウ野生株と変異株R3-1のNDK2のアミノ酸配列比較を示す。 アラスカエンドウ野生株と変異株R3-1のNDK2のヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。 アラスカエンドウ野生株と変異株R3-1のNDK3のアミノ酸配列比較を示す。 アラスカエンドウ野生株と変異株R3-1のNDK3のヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明は、変異誘起処理の間又は後に、菌類又は植物を電子供与体の存在下で培養することを含む、菌類又は植物の有用変異株の作製方法を提供する。本発明の方法により、菌類及び／又は植物の高能率変異株を作製することができる。植物の高能率変異株は高収穫をもたらす。本発明の方法において、変異誘起処理の間又は後に、菌類又は植物を電子供与体の存在下で培養し、生育した株を選択するとよい。
　変異誘起処理としては、活性酸素又は活性酸素発生剤への暴露、紫外線照射などを挙げることができる。
　活性酸素又は活性酸素発生剤への暴露としては、活性酸素又は活性酸素発生剤を含有する培地中での培養を挙げることができる。活性酸素としては、スーパーオキシドアニオンラジカル、ヒドロキシラジカル、ペルオキシナイトライト、過酸化水素、一酸化窒素、二酸化窒素、オゾン、過酸化脂質、一重項酸素などを例示することができ、活性酸素発生剤としては、メチルビオローゲン(Mv)、過酸化水素、Naニトロプルシッド、一重項酸素発生光増感剤（例えば、リボフラビン(7,8-ジメチル-10-D-リビチルイソアロキサジン)、ポルフィリン、メチレンブルー、ローズベンガル、FMN(フラビンモノヌクレオチド)、FAD(フラビンアデニンジヌクレオチド)などを例示することができるが、これらに限定されることはない。Mvは、光照射下で菌体及び植物の体内で活性酸素を発生させることができる。過酸化水素は、細胞の形質膜を透過しうる。そのためかなり直接的に細胞内に入り，比較的安定に，2次情報の機能を持つと言われている。Naニトロプルシッドは、水に良く解け，溶液としては不安定で，培地に入れ，NOを生ずる。NO はNO・(NOラジカル)となり，細胞の中で，チトクロムオキシダーゼを阻害し，呼吸を低下させ，またミトコンドリアからのCa++の放出を促進する。またNO・はグア二ル酸シクラーゼに結合して，それを活性化し，cGMPレベルを上昇させる。活性酸素発生剤がMvの場合、0.1 ～ 250 μM、好ましくは0.2 ～ 200 μM、より好ましくは１～１６０ μMのMvを含有する培地中で菌類又は植物を培養するとよい。
　また、変異誘起処理が紫外線照射である場合、紫外線は、1～１０ μmole・m-2・sec-1の光量で、１～５分間照射するとよい。
　変異誘起処理は、菌類の分生子（菌糸を取り除いたもの）、植物の発芽種子、植物の苗、植物の成長点を含む器官（例えば、茎、腋芽、芽子など）などに施すとよい。
　電子供与体の存在下での培養としては、電子供与体を含有する培地中での培養を挙げることができる。電子供与体としては、アスコルビン酸、還元型グルタチオン(GSH)、ジチオスレイトール(DTT),βメルカプトエタノールなどを例示することができるが、これらに限定されることはない。電子供与体（例えば、アスコルビン酸）を培地に加え、細胞内の電子供与能力（還元力）を上昇させ、還元力を絶対的に必要とする酵素がいつでも自由に稼働できるようにしておく。例えば、アスコルビン酸ペルオキシダーゼは、アスコルビン酸が豊に存在すれば、それを過剰発現する変異株が単離できることになる。電子供与体がアスコルビン酸及び／又は還元型グルタチオンである場合、0.001 ～ 50mM、好ましくは0.005 ～ 20 mM、より好ましくは０．０１～１０ ｍMのアスコルビン酸及び／又は還元型グルタチオンを含有する培地中で菌類又は植物を培養するとよい。
　変異誘起処理の間又は後に、菌類又は植物を電子供与体の存在下で培養し、生育した株に第２の変異誘起処理を行い、その後に、前記の株を一重項酸素が発生する条件下で培養し、生育した株を選択してもよい。
　第２の変異誘起処理としては、活性酸素又は活性酸素発生剤への暴露、紫外線照射などを挙げることができる。活性酸素及び活性酸素発生剤は上記の通りである。活性酸素発生剤がMvの場合、0.1 ～ 250μMのMvを含有する培地中で菌類又は植物を培養するとよい。また、紫外線は、1～１０ μmole・m-2・sec-1の光量で、１～５分間照射するとよい。
　一重項酸素が発生する条件下での培養としては、一重項酸素発生光増感剤を含む培地中での光照射下の培養を挙げることができる。一重項酸素発生光増感剤としては、リボフラビン(7,8-ジメチル-10-D-リビチルイソアロキサジン)、ポルフィリン、メチレンブルー、ローズベンガル、FMN(フラビンモノヌクレオチド)、FAD(フラビンアデニンジヌクレオチド)などを例示することができるが、これらに限定されることはない。リボフラビンは、葉の表面に塗布しても細胞内に透過させることができる。リボフラビンは光照射により励起され、そのエネルギーを三重項酸素に渡し、一重項酸素を生ずる。照射する光は、太陽光（直射日光）であるとよいが、12 cmの水槽で熱遮断し、ドラフトで換気し、400 Wの白熱燈２基により1500 μmole・m-2・sec-1の光量を得てもよく、これらの数値や材料は適宜変更するとよい。一重項酸素が発生する条件下での培養の一例として、１０～4000 μMのリボフラビンを含有する培地中で、50～2500μmole・m-1・sec-1の太陽光照射下に菌類又は植物を培養することを挙げることができる。
　本発明の方法により変異を誘発させる菌類及び植物の種類は、特に限定されるものではないが、子嚢菌類に属する菌類（例えば、アカパンカビ(Neurospora)、コウジカビ(Aspergillus)）の他、低温で担子形成誘導のかかる担子菌類（例えばシイタケ，マツタケ，エノキダケ，シメジ，ナメコ等）のカロテノイド生成においてはその誘導促進に充分この技術を応用することができる。また子嚢菌類では発酵に用いられる，コウジカビ（Aspergillus oryzae）はアカパンカビに類似するところが多く，その発酵への応用が期待できる。以上の子嚢菌類および担子菌類、オートムギ、トウモロコシ、コムギ，オオムギ，イネ（水稲，および陸稲）、ソルガム、サトウキビなどの単子葉植物、ブロッコリー、ペチュニア、アブラナ、サツマイモ、ヒマワリ、アラスカエンドウ、ピーナツ、ダイズ、甜菜などの双子葉植物を例示することができるが、これらに限定されるわけではない。
　本発明の方法において、変異誘起処理を施す菌類又は植物は、野生株であってもよいし、変異株やその子孫であってもよい。変異誘起処理を施す変異株としては、一重項酸素に耐性がある変異菌、変異植物、その子孫、一重項酸素以外の活性酸素に耐性がある変異菌、変異植物、その子孫などを挙げることができる。一重項酸素以外の活性酸素に耐性がある変異菌、変異植物及びその子孫は、一重項酸素以外の活性酸素又は活性酸素発生剤に菌類及び植物（野生株でも変異株でもよい）を暴露した後に生育した株を選択することにより作製することができる（特開2006-296359号公報参照）。一重項酸素以外の活性酸素又は活性酸素発生剤への暴露は、例えば、１～２５０μMのメチルビオローゲンを含有する培地中での野生株の菌類又は植物の培養である。一重項酸素に耐性がある変異菌、変異植物及びその子孫は、変異誘起処理の後に、一重項酸素が発生する条件下で培養し、生育した株を選択することにより作製することができる。変異誘起処理は、例えば、１～１０ μmole・m-2・sec-1の光量の紫外線で、菌類及び植物を１～５分間照射することである。一重項酸素が発生する条件下での培養としては、一重項酸素発生光増感剤を含有する培地中での光照射下の培養を挙げることができる。一重項酸素が発生する条件下での培養の一例として、１０～４０００ μMのリボフラビンを含有する培地中で、50～2500μmole・m-1・sec-1の太陽光照射下に菌類又は植物を培養することを挙げることができる。
　本発明の方法において、変異誘起処理を施す変異株は、変異誘起処理の間又は後に、菌類又は植物を電子供与体の存在下で培養することにより作製した菌類又は植物の有用変異株の次世代以降の子孫であってもよい。
　変異誘起処理の間又は後に、菌類又は植物を電子供与体の存在下で培養することにより得られた菌類及び／又は植物の変異株は、明確にMvに対して耐性を示し、１重項酸素（リボフラビン存在のもと強光照射）に対して、また過酸化水素に対して野生株より高い耐性を示す。アカパンカビでは高いカロテノイドの発現が多く見られる。作物植物では分ゲツ数、また枝分かれが多くなり、高収穫と成る、などの性質又は形質が、変異を導入していない株（例えば、野生株）と異なりうる。例えば、耐寒性がでて、厳冬のほうが高収穫となる。また花の咲く時期が変動し、また植物の草丈が低くなる。さらに自家不和合性が部分的に解除される、などの性質又は形質の変化を例示することができるが、これらに限定されることはない。
　本発明の方法は、収穫量が向上した（すなわち、増産をもたらす）植物変異株の作製に有効である。
　活性酸素又は活性酸素発生剤に菌類又は植物を暴露することにより、低温障害に対する耐性、高温障害に対する耐性、酸化ストレス障害に対する耐性、活性酸素消去能、活性酸素発生能、概日性リズム、温度及び／又は光周性に関わる特性、蕾を形成する時期また蕾を付する節、花を咲かせる時期、花の付く節、自家不和合性の解除、さやの厚さ、実の数、実の大きさ、実の形、花柄の長さ、植物の器官（托葉および茎）の大きさ、節間の長さ，腋芽の数およびその付する節、茎の太さ、蕾の塊の大きさ、蕾の形成の時期、葉の大きさ、成長の早さ、緑の濃さ、草丈、油脂の酸化度、抗酸化物質含量、デンプン及び／または糖質、更に油脂含量などの性質又は形質が変化した変異株を得ることができる。例えば、活性酸素発生剤に暴露していない菌類又は植物（例えば、野生株）と比較して、低温障害に対する耐性の向上、高温障害に対する耐性の向上、酸化ストレス障害に対する耐性の向上、活性酸素消去能の上昇、活性酸素発生能の低下、概日性リズムの変化、温度及び／又は光周性に関わる特性の変化、蕾を形成する時期の変化、花を咲かせる時期の変化（早咲き、遅咲き）、自家不和合性の解除、花の付く節の変化、さやの厚さの変化、実の数の変化、実の大きさの変化、実の形の変化、花柄の長さの変化、植物の器官（托葉および茎）の大きさの変化、節間の長さ，腋芽の数の変化およびその付する節、茎の太さの変化、蕾の塊の大きさの変化、蕾の形成の時期の変化、葉の大きさの変化、成長の早さの変化、緑の濃さの変化、草丈の変化、油脂の酸化度の低下、抗酸化物質含量の増加、デンプン含量の増加などが見られる変異株を得ることができる。本発明者らは、メチルビオローゲンに菌類又は植物を暴露することにより、以下のような一般的特性を有する変異株を得た。
１）アラスカエンドウ；花をさかせる時期の変動（遅咲き）、緑が濃い、茎の数（分げつ数）および枝の増加、高収穫（野生株の２～2.5倍）
２）ダイズ；サヤ数の３倍の増加、葉の大きさの変動、緑が濃い
３）オートムギ；花をさかせる時期の変動（早咲き）、分げつ数の増加、高収穫（野生株の2.5倍）
４）イネ；分げつ数の増加、高収穫、緑が濃い（野生株の2～6倍の収穫）（後述の実施例3）
５）コムギ；花をさかせる時期の変動（早咲き）、分げつ数の増加、高収穫（野生株の２～3.5倍）
６）オオムギ；分げつ数の増加、緑の増加、高収穫（野生株の２～3倍）
７）トウモロコシ；生育の早さの増加（緑が濃い、生育が早い）
８）ブロッコリー；生育の早さの増加、花をさかせる時期の変動（遅咲き）、自家不和合性の解除、耐寒性
９）サツマイモ；生育の早さの増加、収穫の増加（野生株の２～３倍）
１０）ペチュニア；葉の大きさの増加、緑が濃い、自家不和合性の部分的解除
　メチルビオローゲン（Mv）などの活性酸素発生剤に暴露する処理（第１の処理、この処理により変異が誘起され、かつ活性酸素に対して耐性がある変異株が選抜される）とリボフラビンなどの一重項酸素発生光増感剤を含有する培地中での培養のような一重項酸素発生条件下での培養処理（第２の処理、この処理により一重項酸素に対する耐性がある変異株が選抜される）という２つの処理を組み合わせることにより、単独の処理で得られる変異株よりもさらに有用な変異株が得られる可能性が高くなる。本発明では、電子供与体（例えば、アスコルビン酸）を培地に加え、細胞内の電子供与能力（還元力）を上昇させ、還元力を絶対的に必要とする酵素がいつでも自由に稼働できるようにしておく（第３の処理）。例えば、アスコルビン酸ペルオキシダーゼはアスコルビン酸が豊に存在すれば、それを過剰発現する変異株が単離できることになる。この第３の処理を第１及び／又は第２の処理と組み合わせることにより、単独の処理で得られる変異株よりもさらに有用な変異株が得られる可能性が高くなる。
　本発明は、変異誘起処理の間又は後に、菌類又は植物を電子供与体の存在下で培養することにより得られた菌類若しくは植物の変異株又はその子孫、それらの細胞又は組織、及びそれらの種子を提供する。このような細胞、組織及び種子は、変異誘起処理の間又は後に、菌類又は植物を電子供与体の存在下で培養することにより得られた菌類又は植物の変異株から、公知の方法により作製することができる。
　また、本発明は、変異誘起処理の間又は後に、菌類又は植物を電子供与体の存在下で培養することにより得られた菌類若しくは植物の変異株又はその子孫の自家受精又は交配により、所望の性質及び／又は形質を示す株を作製する方法、該方法で作製した植物株及びその子孫、それらの細胞、組織及び種子を提供する。植物の自家受精又は交配の方法は公知であり、また、植物から、細胞、組織及び種子を作製する方法も公知であり、これらの方法を利用することができる。
　所望の性質及び形質としては、収穫量の増加、カロテノイドの発現量の増加、カタラーゼの活性および発現量の増加、NDKの活性および発現量の増加、ヒスチジンキナーゼ様タンパク質のリン酸化活性の増加、つるの長さの増加、イモの重量の増加、分げつ数の増加、出穂数の増加などが例示されるが、これらに限定されることはない。また、前述の性質に加えて、低温障害に対する耐性の向上、高温障害に対する耐性の向上、酸化ストレス障害に対する耐性の向上、活性酸素消去能の上昇、活性酸素発生能の低下、自家不和合性の解除、概日性リズムの変化、温度及び／又は光周性に関わる特性の変化、蕾を形成する時期の変化、花を咲かせる時期の変化（早咲き、遅咲き）、花の付く節の変化、さやの厚さの変化、実の数の変化、実の大きさの変化、実の形の変化、花柄の長さの変化、植物の器官（托葉および茎）の大きさの変化、節間の長さ，腋芽の数の変化およびその付する節、茎の太さの変化、蕾の塊の大きさの変化、蕾の形成の時期の変化、葉の大きさの変化、成長の早さの変化、緑の濃さの変化、草丈の変化、藁の重さ、油脂の酸化度の低下、抗酸化物質含量の増加、デンプン及び／または糖質、更に油脂含量の増加なども例示できるが、これらに限定されることはない。
　さらにまた、本発明は、電子供与体を含む、菌類又は植物に有用な変異を誘起するための組成物を提供する。「有用な変異」とは、上記のような所望の性質及び形質をもたらす変異である。電子供与体としては、アスコルビン酸、還元型グルタチオン、ジチオスレイトール(DTT),βメルカプトエタノールなどを例示することができるが、これらに限定されることはない。
　本発明の組成物を用いることにより、有用な変異を誘発した菌類又は植物を作製することが可能となる。
　本発明の組成物は、さらに、溶媒、培地成分、光源などを含んでもよい。
　本発明において利用可能な培地としては、植物用としてはMurashige and Skoog培地、Hoagland 培地、また菌類用としてはFries培地、Vogel培地などを例示することができるが、これらに限定されることはない。
　また、本発明は、下記の菌類若しくは植物の変異株又はその子孫も提供する。
・野生種と比較して、葉緑素量が多く、かつ過酸化脂質の形成量が抑制されている菌類若しくは植物の変異株又はその子孫。
・野生種と比較して、ＮＤＫに関する変異を含む菌類若しくは植物の変異株又はその子孫。
・野生種と比較して、ＮＤＫ２及び/又はＮＤＫ３に関する変異を含む菌類若しくは植物の変異株又はその子孫。
・野生種と比較して、ＮＤＫ２において、少なくともＩｌｅｌ２Ｌｅｕ及びＧｌｕ２０５Ｌｙｓのアミノ酸置換が誘起されている菌類若しくは植物の変異株又はその子孫。
・野生種と比較して、ＮＤＫ３において、少なくともＰｒｏ４５Ｓｅｒのアミノ酸置換が誘起されている菌類若しくは植物の変異株又はその子孫。
・野生種と比較して、少なくともＮＤＫ２におけるヒスチジン及び/又はセリンのリン酸化活性が高い菌類若しくは植物の変異株又はその子孫。
・野生種と比較して、ＮＤＫ２のヌクレオシド2リン酸キナーゼ活性が1.3倍以上ある菌類若しくは植物の変異株又はその子孫。
　図55に、アラスカエンドウ野生株と変異株R3-1のNDK2のアミノ酸配列比較を示す。
　図56に、アラスカエンドウ野生株と変異株R3-1のNDK2のヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。
　図57に、アラスカエンドウ野生株と変異株R3-1のNDK3のアミノ酸配列比較を示す。
　図58に、アラスカエンドウ野生株と変異株R3-1のNDK3のヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。
　以下、本発明を実施例により具体的に説明する。本発明の範囲はこれらの実施例により限定されることはない。
［実施例１］アカパンカビを用いた新しい1重項酸素耐性変異株の単離法
　Wang, N., Yoshida, Y. and Hasunuma, K. 2007, Catalase-1 (CAT-1) and nucleoside diphosphate kinase-1 (NDK-1) play an important role in protecting conidial viability under light stress in Neurospora crassa. Molec. Genet. Genomics; 278:235-242; この論文により、以下のような事象の理論的な説明が可能となった。
　図１に活性酸素の消去過程に対する既知の事象を示す。1重項酸素がスーパーオキシドへ変換される過程は仮説的にカタラーゼ及びNDKの複合体により行われると私は考えてきた。アカパンカビの野生株、ndk-1P72H及び sod-1変異株を用いて、活性酸素に対する耐性度が既に調査されている。ndk-1P72H及びsod-1変異株はともに類似した性質を示し、スーパーオキシド発生剤であるMethyl viologen (Mv; パラコート)および過酸化水素に対して感受性であることを確立してきた（Yoshida, Y., Ogura, Y. and Hasunuma, K. 2006, Interaction of nucleoside diphosphate kinase and catalase for stress and light responses in Neurospora crassa. FEBS Lett. 580, 3282-3286）.しかしながら、 sod-1変異株がその基質であるスーパーオキシドに対して感受性である以外は、過酸化水素及びスーパーオキシドに対してndk-1P72H及び sod-1変異株がともに感受性であることは、明快には説明出来ない。
　王らは上記の事実をふまえ、NDK-1と複合体を形成することが示唆されているカタラーゼ、CAT-1をRIP (Repeat induced point mutation) 法によりノックアウトし、cat-1RIPを単離した (Wang, N., Yoshida, Y. and Hasunuma, K. 2007, Loss of catalase-1 (Cat-1) results in decresed conidial viability enhanced by exposure to light in Neurospora crassa,  Mol. Genet. Genomics  277: 13-22)。cat-1RIPはコロ二ー上に形成するコ二ーディアの量が野生株にくらべて、過酸化水素に感受性であった。また菌糸の生育も過酸化水素に感受性であった。更にコ二ーディアの発芽能が光照射下では変異株は感受性であった。これらの特性は野生型の遺伝子を導入することにより、野生株レベルに回復した。野生株、cat-1RIP　変異株、ndk-1P72H変異株、ndk-1P72H及び cat-1RIP　変異株の二重変異株を用いて、細胞内で起っているNDK-1/ CAT-1の相互作用を解析することを試みた。
　王らの論文に示すように、野生株、cat-1RIP　変異株、ndk-1P72H変異株、ndk-1P72H及び cat-1RIP　変異株の二重変異株２株を用い、液体培地中の過酸化水素の濃度を0,  0.5, 1,  1.5,  2.0, 2.5,  3.0  mMと変化させ、液体震盪培養でこれらの株の発芽能を調査した。ndk-1P72H変異株はその発芽が、野生株より、また更に cat-1RIP　変異株より、過酸化水素に対して感受性であることを明らかにした。更に1重項酸素発生剤であるリボフラビンの濃度を0, 200, 400, 800μM含むVogel寒天培地にこれらの株のコニーディアを播き、強い光照射 (100μmol/m2/sec) のもとでコロニーを形成させた。野生株及びcat-1RIP　変異株に比べ、ndk-1P72H変異株は明確に感受性であることが判明した（図２）。これらのことから、ndk-1P72H変異株は1重項酸素、スーパーオキシド及び過酸化水素に対して、感受性であることが判明した。これらの３段階に共通に存在する還元反応に対して、ndk-1P72H変異株はその能力が低下していると考えられる。従って、ndk-1P72H変異は還元反応（電子供与反応）に必要なNADHまたはNADPHを結合出来ず、その運搬体として稼働する機能が失われていることが示唆された。ヒスタグNDK-1及びヒスタグNDK-1P72H (ヒスタグNDK-1及びヒスタグNDK-1P72H はニッケルキレートセファロースに結合する。) を用いて、 (32P)NADHをこれらのヒスタグNDK-1またヒスタグNDK-1P72Hに結合させた。ヒスタグNDK-1及びヒスタグNDK-1P72Hをニッケルキレートセファロースに結合させ、(32P)NADHの放射能活性を調べた。その結果前者は(32P)NADHを結合するが、後者は結合しないことを証明した（図３）。NDK-1はATP, ADPを結合する。NADHはADP部分が化学構造が同一であり、ADP部分で結合する可能性がある。
　理論的考察から、リボフラビン存在下、強い光照射のもとで、発生した1重項酸素は、細胞内でカタラーゼに捕捉される。以下図４に示すReaction process 1, Reaction process 2, Reaction process 3で予測される反応を行い、これらの活性酸素が還元され、消去、無害化されて行くと考えられる。この反応はまだ証明されているわけではないので、それを証明するべく以下の実験例を示す。
　リボフラビンと光照射により発生した1重項酸素は、細胞内でカタラーゼに捕捉される。そこにNDK-1がNADHを結合した状態で運んでくる。二分子の電子を渡し、二分子のスーパーオキシドを発生する。この過程の存在予測が正しいとするとndk-1P72H　及び sod-1変異株はともに1重項酸素に対して感受性と成ると考えられる。従って強い光照射(100μmol/m2/sec)のもとで、Fries寒天培地中のリボフラビンの濃度を0, 100, 200, 400, 800 μM と変化させ、３枚のペトリ皿に野生株、ndk-1P72H　及び sod-1変異株をペトリ皿にまいた。その結果ndk-1P72H　及び  sod-1変異株は同程度、又後者はそれ以上のリボフラビン（1重項酸素）感受性を示した。この結果は1重項酸素の消去は、Process 1, Process 2, Process 3で予測された反応により、その活性酸素が還元され、消去されて行くと考えられる。其の他にバイパスのようなルートは存在したとしても、その活性は低いと考えられる。以上が第２特許出願（特願2006-283492、特願2007-296359及びPCT/JP2007/070253）で示された。
　ここで図１に戻る。図1に示す活性酸素の代謝ルートにより、第1の特許出願(特願2005-125981、特開2006-296359)では、変異原をMvによるスーパーオキシド、過酸化水素、及びNaニトロプルシッドによるNO　として変異株を単離した。第２の特許出願では紫外線で変異を誘起し、リボフラビンで強い光（太陽光）にあて、1重項酸素耐性株を単離する方法を確立した。本方法では活性酸素の還元過程に関係するNADH, (NADPH),　さらにアスコルビン酸（ビタミンC）を変異誘起に関連させる処方を提供する。Mvは高収穫変異を誘起する変異原として有効であるが、同時にフェレドキシンの代わりにMvが入り、アスコルビン酸の生成を阻害してしまう。結果的にMvによる変異株取得処理は活性酸素の還元過程に絶対的に必要とされるNADH　(NADPH),　さらにアスコルビン酸（ビタミンC）の生産が低下してしまう。従ってこれらを補酵素として、絶対的に要求するような酵素は不活性となる。たとえ変異により過剰発現されたとしても、補酵素が存在しないために活性を持てず、そのような変異株は単離されてこない。この欠点を補うために、Mv存在下で変異を誘起させ、更にその培地にビタミンCを加え、新しい変異株が単離されてくる機会を増加させる処方を本発明では開発した。
（実験例１）
　ペトリ皿にMvを100μM いれ、アスコルビン酸を0, 10, 100, 1,000, 10,000μMと変化させた。ndk-1P72H 及び sod-1変異株の分生子 (conidia) をそれぞれ4.8x105細胞、及び2.3x104細胞／ペトリ皿で播いた。30 ℃で40μmol/m2/secのもとで生育させた。 1処理に4枚のペトリ皿を用いた。培地中におよそ 1 mm以上の生育を示し、コロ二ーを形成した数を計数した。コロ二ー数／分生子数を変異率とした。図５及び表１に示すようにndk-1P72H 及び sod-1変異株では、コニーディア当たりおよそ1x10-3 の変異率で良い生育を示す株が得られた。
　その変異の発生率はアスコルビン酸濃度に依存性を示し、sod-1変異株ではアスコルビン酸の濃度が100 ～ 1,000μM で最適値を示した。ndk-1P72H 変異株では100μMで最小値をしめしたが、10,000μMで最高値を示した。このように良い生育を示す変異が部分的に逆の相関を示す理由は明快ではないが、ndk-1P72H 及び sod-1変異をバイパスする１重項酸素耐性変異が起きていることを示唆する。ndk-1P72H 変異株は復帰突然変異の可能性があるが、 sod-1変異株はノックアウト変異であり、復帰突然変異の可能性はほとんど存在しない。
　これらの単離した株に等量の200μMリボフラビンを含む液体培地を交ぜ、温室（25 ℃）にて太陽光(1,100～1,400μmol/m2/sec)に２日間さらした。この条件下では1重項酸素耐性株は生育するが、感受性株は生育しない。生育する株を1重項酸素耐性株として、その結果を図６、表２に示す。ndk-1P72H 変異株から141株、sod-1変異株から47株を単離した。アスコルビン酸の濃度が100 ～ 1,000μM で最適値を示した。sod-1変異株からの生育の良い変異株は全て単離した。それらの変異株をもとにして、1重項酸素耐性株が単離される頻度はアスコルビン酸の濃度0（対照実験）に対して、アスコルビン酸の濃度が100μMでおよそ10倍となり、明らかに1重項酸素耐性株の取得頻度はアスコルビン酸の濃度に依存した。ndk-1P72H 変異株の場合、単離したコロ二ーは良い生育を示す１０株／ペトリ皿としたため、各処理４０株が得られた。統計的に正しい1重項酸素耐性株への変異率とはできないが、アスコルビン酸の濃度が100 ～ 1,000μM で最適値を示し、ほぼsod-1変異株の場合と同じ結果を得た。
　図１の中ではアスコルビン酸（ビタミンC）が存在しないが、図７に示すように、アスコルビン酸は酸化型グルタチオン(GSSG)を還元型グルタチオンにすることが出来る。
１）アカパンカビのカタラーゼは補酵素を必要としないためにカタラーゼと定義されているが、生体内ではNDK-1に結合したNADHを必要としており、その意味でNADHペルオキシダーゼと再定義することが提唱される。アカパンカビではCAT-2がグルタチオンペルオキシダーゼに相当すると言われている。
２）植物ではGSHペルオキシダーゼの代わりにアスコルビン酸ペルオキシダーゼが存在し、アスコルビン酸の生成系が存在する。また還元型フェレドキシンを用いて、ジヒドロアスコルビン酸をアスコルビン酸に還元する過程が光合成の系Iからの電子伝達系のなかに存在する。
３）動物(ヒト)ではGSHペルオキシダーゼが存在する。ビタミンCを経口摂取することにより、酸化型グルタチオンを還元型グルタチオンにし、GSHペルオキシダーゼを稼働させる。
従って動物は植物によって作られたアスコルビン酸の還元力を用いて、活性酸素の無害化を行なっていることになる。その全体像を反映した説明を図７として示す。
　図７に示した様に、カタラーゼはその活性測定の標準反応系に、NADHが含まれていない。この状況がMv耐性株の特徴付けにも出ており、カタラーゼは変異株内の活性が上昇しているのにも拘らず、NADHを加えなくても有る程度反応が進むため、その活性上昇を適格に解析できていない。この事象が植物のMv耐性株がカタラーゼの過剰発現、又はその反応速度の上昇を示す株であることを見いだすことを妨げた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 表1。突然変異率の詳細なデータ
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 表２。sod-1及びndk-1変異株を用いたビタミンC濃度に依存した１重項酸素耐性株の単離
〔実施例２〕アラスカエンドウMv耐性株で高収穫を示す株の生化学的解析
　アラスカエンドウは光生物学の良い研究材料で、多くの生理学的知識が集積している。モデル植物としてはシロイヌナズナ以上に形態的な特性を有している。染色体数は2n = 14で、ゲノムサイズ は4,800 Mbpである。更にキヌサヤエンドウとして、野菜として食する対象と成っている。アラスカエンドウはダイズ、油脂用ピーナッツ等のバイオオイルの供給源として重要なマメ科植物の基礎研究を行なう対照として、欠かせない作物植物である。アラスカエンドウMv耐性株R3-1(HIGH YIELDING-1), R3-2(HIGH YIELDING-2)は8 μM Mv処理で得られた変異株である。野生株に比べ、8 μM Mv処理で、茎の伸長生長、根の伸長生長にMv耐性が明確に出た。また花の咲く時期も野生株に比べ3週間程度遅く、遅咲きである。サヤの重量で見た高収穫性は、冬季の温度依存性が出る。横浜で暖冬であった2006 ～ 2007年のアラスカエンドウ変異株の収穫は野生株とあまり変わらなかった。しかし、その前年の2005 ～ 2006年では、冬季の温度が低く、変異株の収穫量はおよそ野生株の２倍であった。横浜よりより寒い地方に適した変異株と言える。また冬季の温度に変わりなく、茎の枝分かれの頻度は、これらの変異株では野生株の２倍～3倍で、草丈は低かった。これらの野生株と、Mv耐性株R3-1, R3-2の葉を用いて、その粗抽出液に於けるカタラーゼ (CAT) 活性、スーパーオキシドジスムターゼ(SOD)活性、アスコルビン酸ペルオキシダーゼ (APX)、またアスコルビン酸の供給に影響を及ぼすグルタチオンレダクターゼ(GR) 活性を測定した。以下に2006 ～ 2007年のアラスカエンドウの葉を用い、その粗抽出液で上に示した酵素の活性測定の結果を示す。
　図８にSOD活性を示す。図８Aに粗抽出液のSOD活性を示す。野生株と変異株の間に本質的な相違は存在しない。更に図８Dに示すように、未変成ゲルでタンパク質を分離し、そのゲルを用いて、インゲル測定を行なった。ミトコンドリアに局在するMn-SOD（マンガンSOD）は野生株に比べ変異株は有意にその酵素活性が高かった。それを抽出液で測定した結果を図８Bに示す。Cu,Zn-SODはサイトゾル(cyt)に存在する分子種と葉緑体(chl)に存在するCu,Zn-SODがある。それをまとめて抽出液で測定した結果を図８Cに示す。変異株では活性はむしろ低下していた。これらをインゲル測定した結果を図８D, Eに示す。Mn-SODは有意にその活性が変異株で上昇していた。
　図９にカタラーゼの測定結果を示す。粗抽出液の測定結果は野生株と変異株で行なわれ、酵素活性に差異は認められなかった（図９A）。しかしこれらの変異株の未変成ゲル電気泳動では、野生株に比べ、変異株のカタラーゼの移動度が低かった。この結果は野生株のカタラーゼが結合している１重項酸素量に対して、変異株のカタラーゼが結合している１重項酸素量が少ないことを意味する。これは細胞内のカタラーゼに結合した１重項酸素量に対して、NADH/NDKによる電子供与能力が変異株では高いことを意味している。この生化学的測定に対し、反応液にNADHを加えるべきで有るが、標準反応液には電子供与体と思われる分子は含まれていない。この状況はSOD反応の場合も同様で、NADH/NDKによる電子供与がどの様に関わるかを解明する必要がある。
　アスコルビン酸ペルオキシダーゼの場合は、補酵素がアスコルビン酸で明確である。図１０A, Cに示すように、粗抽出液で測定した場合、またインゲル測定した場合は、野生株と変異株では差異が見られなかった。
　またグルタチオン還元酵素はNADPHを用いて、酸化型グルタチオンを還元型グルタチオンに変換する。還元型グルタチオンはジヒドロアスコルビン酸をアスコルビン酸に還元できるのでアスコルビン酸ペルオキシダーゼの細胞内活性に影響を与える。その活性は粗抽出液で測定しても、インゲル測定をしても、図１０B, Dに示すように野生株と変異株では差異が見られなかった。
〔実施例３〕イネのMv耐性株の特性
　イネは世界の主要食料であり、また近年イネ及びその藁はバイオマスとしてもその利用価値は高い評価を得ている。イネの染色体数は2n = 24で、そのゲノムDNAは420 Mbpといわれ、アカパンカビの約10倍、シロイヌナズナは100 Mbpで、イネはその約4.2倍である。コムギは5000 Mbpであり、イネの約12倍に相当する。
　超高収穫植物を作出するためには、２段階の薬剤処理が必要と成る。その第１段階はMv処理で、その高収穫変異をホモに持つ株が薬剤処理当代（M１）の種子の自殖第２代（M２）に含まれていると考えられる。自殖第２代（M２）の中で、最も高収穫性を示す株はホモ株と考えられ、その種子を用いて、分ゲツ数、またその株に付いた穂の重さを収穫として、野生株のそれと対比した。
　用いた高収穫変異株はR424(Ho),及び R458(Ho)で、１盥に４本の苗を移植した。野生株は56株、R424(Ho)は88株、R458(Ho)は24株を用いて、収穫量調査を行なった。図１１Aに示すように分ゲツ数は野生株のそれぞれ、1.3倍及び1.4倍であった。その茎に付いた穂の重さを図１１Bに示す。穂の重さは野生株のそれぞれ、1.5倍および1.4倍であった。分ゲツ数、及び収穫量（g）はともに各々の株に於いて、連続的な分布を示す。更にR424(Ho)は85%の発芽率を示したが、R458(Ho)は28%の発芽率であり、そのデータの信頼度において前者は高いが後者は発芽の条件の再検討が必要である。しかし、前者の高生産性、また後者の高生産性は従来の育種法による方法の最大値、1.3倍を超えるもので、本方法が有効な高収穫変異株を取得するための、優れた方法であることを示している。
　MS培地のpH等を厳格に決め、発芽の条件を90% 以上にすることが出来た。MS培地に加えるMvの濃度を0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1, 2, 3, 4, 5μMとし、10粒／ペトリ皿の種子を滅菌後、発芽試験に用いた。更に発芽した後に、葉の緑が明確なものを耐性とし、葉が全て白化したものは感受性として、発芽耐性率を調査した。図１２に示すようにR424(Ho) 及びR458(Ho)株はMv濃度1, 2, 3, 4μMで明らかに発芽耐性を示した。野生株はMvの濃度が0.4μM以上では完全に白化し、感受性であった。このように得られた２株は明確に変異株であることが証明された。
　この現象は4μM Mvにより細胞内生じた活性酸素により突然変異を起こしたR424(Ho) 及びR458(Ho)変異株が、3μM　Mvにより、活性酸素消去系酵素またはその活性制御因子の活性上昇により、発芽耐性を示したと考えられる。太陽の強光下に１重項酸素、スーパーオキシド、過酸化水素が過剰に発生したときに、高収穫変異株は活性酸素消去系を誘導し、高いレベルの活性酸素に対応していると考えられる。つまりカタラーゼ(CAT)、スーパーオキシドジスムターゼ(SOD),アスコルビン酸ペルオキシダーゼ(APX)が活性化すると考えられ、またその補酵素である、NADHの供給量またその運搬を行なうNDKの活性上昇、またアスコルビン酸の供給量の上昇が存在することが示唆される。
〔実施例４〕コムギ（Triticum aestivum Chinese Spring）
　パンコムギとして知られるTriticum aestivum Chinese Springは品種改良の基本系統として広く用いられている。染色体数はA, B, D群それぞれ7本のセットを有しており、2n = 42が確立されている。またコムギはウィスキーの原材料でもあり、バイオエタノールの原材料としての育種開発にも適している。とくにコムギは広く食用に供され、世界の穀類生産では最も生産高の高いものである。その食料としての安全性の高さの見地からも、食料のみ成らずバイオエタノールの原材料としての開発が望まれる作物植物である。
　既述ではあるが、提出日2005年4月25日で、特許出願、特願2005-125981を出願している。この中で、本発明者はMethyl viologen (Mv;パラコート) による突然変異の誘起法を提唱している。その方法によるMv耐性株の中に、大収穫を可能とする遺伝子が発現され、およそ2～3.5倍の種子の高生産性を示す株を単離した（出願日2006年10月18日、特願2006-283492、出願日2007年6月29日、特願2007-171681及び出願日2007年10月17日、PCT/JP2007/070253）。野生株及び単離された変異株を用いて、上記のMv処理では理論的に単離が困難な変異株を単離する方法を開発することにより、更に生産性を向上させた変異株を単離する方法を提唱する。野生株はR0-1-5,　及び野生株の集合種子を用いた。また変異株は 高収穫を示すR2-1-1, R2-1-3, R2-3-9, R8-1-1を用いた。 更に野生株の中に、比較的高い生産性を持つ株、R0-3-1を見いだし、それもあわせ用いた。R0-3-1は野生株のなかで最も高収穫を示した株で、この株が新しい変異を有しているかは不明である。その雑種第２代に当たる株の露地で生育させた幼植物（３月中旬でロゼット状態）の写真を、それぞれ野生株R0-1-5との対比において、図１３、１４、１５、１６、１７に示す。図１７に野生株R0-1-5と野生株R0-3-1を対比した。野生株R0-1-5と野生株R0-3-1の対比では葉の大きさ、さらに葉の緑の濃さにあまり変化はない。高生産性を示す、R2-1-1, R2-1-3, R2-3-9, R8-1-1変異株は全て、野生株R0-1-5より葉の伸長成長がよく、緑が濃かった。従って活性酸素の消去能の亢進が関わる高生産性変異株は葉の伸長成長が良く、緑が濃いと判断して良い。
　既述のように、Mvを用いた植物の生長点での突然変異誘起により、活性酸素（スーパーオキシド）耐性、更に過酸化水素耐性になった変異株が単離されてくる。Mvは光合成の光化学系Iの電子伝達系で、フェレドキシンの代わりに入り、電子を受け、還元型Mvとなる。それは３重項酸素に電子をあたえ、スーパーオキシドを生ずる。還元型フェレドキシンは本来ジヒドロアスコルビン酸をアスコルビン酸に還元する働きがある。しかし還元型フェレドキシンが生産されないために、アスコルビン酸（ビタミンC）は生産されない。アスコルビン酸が供給されないため、スーパーオキシドから生じた過酸化水素はアスコルビン酸ペルオキシダーゼによっては水と酸素に変換されないことになる。従って、この過程に稼働するカタラーゼが過剰発現された変異株が得られることになる。アラスカエンドウで示されたように、多数（100株程度）のMv耐性株の中に、大収穫性を示す株, HIGH YIELD-1(R3-1),　及び HIGH YIELD-2(R3-2)の２株が得られた。それらの大収穫性変異株は更にヌクレオシド２リン酸キナーゼ(NDK)が過剰発現されていた。NDKはアカパンカビで示されたようにNADH結合能が有り、アラスカエンドウでは、主要なNADH運搬体であることを第２特許出願（出願日2006年10月18日、特願2006-283492、出願日2007年6月29日、特願2007-171681及び出願日2007年10月17日、PCT/JP2007/070253）で示してきた。アスコルビン酸、NADHというような電子供与体は様々な酵素反応に使用され、補酵素と呼ばれている。従ってこれらの因子の細胞内レベルが低下すると、これらの因子を必要とする酵素の働きが極端に低下し、稼働出来ない状態となる。このような状態のもとにある酵素は変異によって過剰発現されても、稼働できず、変異株として単離されてくることはない。Mv耐性変異としてアスコルビン酸ペルオキシダーゼの変異株がとれてこないのは、この原理による。従って細胞膜透過性のあるアスコルビン酸を細胞外から与えて、細胞内の電子供与能力をあげ、還元反応に作用する酵素の活性を引き上げることを行い、その変異株を単離する方法を開発した。アカパンカビの実施例（論理考証）で示したように、1重項酸素、スーパーオキシド、過酸化水素の消去過程は全て還元過程であり、電子を供与することにより、活性酸素を無害化している。この過程はNDK/NADHの複合体が重要な働きを行う。NDK-1P72H 変異タンパク質はNADHを結合出来ず、ndk-1P72H変異株は1重項酸素、スーパーオキシド、過酸化水素の消去過程は全て不完全となり、これらの活性酸素を還元できず、これらに感受性の特性を示す。
　以下に示す実験例はすべて、これらの事象を念頭にいれておこなわれた。ペトリ皿で滅菌種子を浸潤させた後、MS 培地にMvを0, 4, 8, 40, 80 μMいれ、この全ての培地にアスコルビン酸を10 mM又は１mM加えた。それらを含む培地をそのペトリ皿に加えた（記号でRC0, RC4, RC8, RC40, RC80で示す）。この培地条件下に3～4日人工気象器（8時間光照射8 ℃/16時間暗黒 7 ℃）で生育させた。光強度は100～150μmol/m2/secである。その後培地を無菌水で洗浄し、4 ℃暗黒下に12時間おいた。更に無菌水を除いた後、MS 培地にMvを0, 4, 8, 40, 80 μMいれた培地を加え、温室で太陽光下に6～7日生育させた。実際の処理日程は表の上部に示した。更に別処理として、上記処理をした培地を洗後に、発芽種子を4 ℃暗黒下に12時間おいた。MS 培地にリボフラビンを80 μMいれ、その培地を処理発芽種子を含むペトリ皿に加えた。この皿の発芽種子も温室で太陽光下に6～7日生育させた。晴天では光強度は1000～1300μmol/m2/secである。この間に耐性を獲得した株のみ生残できる（記号でFRC0, FRC4, FRC8, FRC40, FRC80で示す）。実際の処理及びその日程は表の上部に示した。
　最初に以下のような実験をおこなった。表３の実験例は先の第２特許出願での２つの実施例を本特許出願で行う実施例に対応できるように、一部変更したものである。これらの先行する２つの特許出願による方法が一部変更しても十分に有効であることが確認された。
　表３に示す実験例１では、滅菌種子を4 ℃暗黒下に浸潤させた後、4 ℃暗黒下に12時間おいた。MS 培地にMvを0, 4, 8, 40, 80 μMいれた培地を加えた。５日間人工気象器（8時間光照射8 ℃/16時間暗黒 7 ℃）で生育させ、温室(25 ℃)で7日間太陽光にさらしたのち、プランタに播種した。温室で6日間生育させ、更に温室の廊下で外気に触れさせ、馴化した後、露地にプランタを移動した。その後畑に移植した。この間大部分が死滅したが、生残したR40変異株4株について、図１８に示す。対照実験は実験例２の無処理を用いた。ロゼットでは有るが変異株は茎及び葉の生育がよく、緑も濃い。また明らかに分ゲツ数も多い。変異株の特性を示している。しかしこれらの４株の中から、はっきりと高収穫変異株として良いほどの変異株は得られなかった。
　表３に示す実験例２では、滅菌種子を4 ℃暗黒下に浸潤させ、12時間おいた。MS 培地を加え、５日間人工気象器（8時間光照射8 ℃/16時間暗黒 7 ℃）で生育させた。対照実験を除いて4分紫外線照射 (3.1μmol/m2/sec)し、リボフラビンを0, 20, 40, 80, 160 μMいれ、温室 (25 ℃)で7日間太陽光にさらしたのち、プランタに播種した。温室で6日間生育させ、更に温室の廊下で外気に触れさせ、馴化した後、露地にプランタを移動した。その後畑に移植した。図１９、図２０に単離された変異株を示す。F20-4-1で示す変異株4株はロゼットでの茎の成長が良く、緑も濃い。また明らかに分ゲツ数も多い。高生産性変異株の特性を示している。F40-4-1で示す変異株は茎及び葉の生育が非常によく、分ゲツ数も多い。しかし緑の濃さについては、野生株とあまり変化がなかった。しかし、生育の良さ、及び分ゲツ数の多さは大収穫変異株の特性を十分に示している。しかしこれらの株は最終的には高収穫変異と言えるほどの変異株ではなかった。F80-4-2-1は後に良く生育し、高収穫変異株の特性を示した。
　野生株集合種子（2006年7月収穫）を用いて、上記の方法により、50種子／ペトリ皿を２セット計、10皿、500種子を滅菌処理し、4 ℃ 暗黒下に12時間おいた。Mvを0, 4, 8, 40, 80μM及びアスコルビン酸を10 mM含むMS培地下に4日間人工気象器（8時間光照射8 ℃/16時間暗黒 7 ℃）で生育させた。培地をすて、無菌水で洗浄し、4 ℃ 暗黒下に12時間おいた。各々にMvを0, 4, 8, 40, 80μM含むMS培地を加え、温室に置き太陽光に4日間さらした。温度及び光条件は既述と同一である。その発芽種子をプランタに播種し、7日後、温室の廊下で温度の馴化をおこなった。8日後露地にプランタを移動し、その後畑に移植した。その処理及び日程は表４、実験例３に示されている。実験例３の結果から以上の処理で、生残数が低いことが分かる。さらにプランタでの生育、特に低温に対する馴化が悪く、多くが枯死した。畑に移植した植物は対照実験に用いた株も生育が悪く、枯死するものが多かった。野生株を用いた場合本方法はあまり有効に用いることはできない。
　表４、実験例４に示されているように、上記と全く並列して50種子／ペトリ皿を２セット計、10皿、500種子を滅菌処理し、4 ℃ 暗黒下に12時間おいた。Mvを0, 4, 8, 40, 80μM及びアスコルビン酸を10 mM含むMS培地下に4日間人工気象器（8時間光照射8 ℃/16時間暗黒 7 ℃）で生育させた。培地をすて、無菌水で洗浄し、4 ℃ 暗黒下に12時間おいた。MS培地を加え、対照実験を除いて、紫外線照射を4分行った。その後、対照実験以外リボフラビンを80μMになるように加え、温室に移し、太陽光に4日間さらした。温度及び光条件は既述と同一である。その発芽種子をプランタに播種し、7日後、温室の廊下で温度の馴化をおこなった。8日後露地にプランタを移動し、その後畑に移植した。その処理及び日程は表４、実験例４に示されている。実験例４の結果からも以上の処理で、生残数が低いことが分かる。さらにプランタでの生育、特に低温に対する馴化が悪く、多くが枯死した。畑に移植した植物は対照実験に用いた株も生育が悪く、枯死するものが多い。野生株を用いた場合本方法はあまり有効に用いることはできない。実験例３、４の生育数(g)は畑へ移植前のプランタでの生育数である。以上の実験例3，４では高収穫変異と同定できるような変異株は単離できなかった。
　更に野生株の中で成績の良い株、R0-4-4-1 (WT1), R0-3-3-1 (WT2), R0-3-3-2 (WT3), R0-3-3-3 (WT4)の袋がけした一つの穂を対照に用いて、上記表４と同様の実験をおこなった。実験例５に示すRC実験にはR0-4-4-1 (WT1), R0-3-3-1 (WT2),  また実験例６に示すFRC実験にはR0-3-3-2 (WT3), R0-3-3-3 (WT4)を用いた。実験処理及び日程は表５に示してある。また処理は表４、実験例３、４と同一である。この場合も生残数が低く、最終的に生残した株は実験例５に示すRC実験でのR0-3-3-1 (WT2),  また実験例６に示すFRC実験でのR0-3-3-2 (WT3)のみであった。その結果を図２１に示す。無処理株として、成績の最も良かった、R0-3-1の無処理株の生育を示した。変異株FRC4-1は葉の緑が明らかに濃く、分ゲツ数も多い。明らかに変異株の性質を示している。以上のように野生株を用いて上記の処理で変異株を取得する方法はその処理が少し強すぎ、生残できず、あまり効率が良い方法とは言えない。しかしFRC4-1のみならずRC4-1ともに、それぞれ超高収穫変異株、高収穫変異株として、同定された。
　以上の結果から、高収穫変異株、R2-1-1の粒数の多い袋がけをした穂、8穂、1, 3, 6, 7, 13, 14, 16, 18を選び、高収穫変異株を用いて、上記と同様の実験を行った。処理及び日程は表６に記載されている。実験例７ではRC実験を、実験例８ではFRC実験を行ない、それらの結果をまとめた。植物の生残数は畑への移植前の数である。生残数が低いが、R2-1-1-3株は良い結果を出した。単離された２重変異株、を図２２に示す。対照は同一の穂からの無処理ではないが、およそ１月前に移植した株と同等の大きさで、緑が濃く、変異株の特性を十分に有している。図２２に示されているRC40-R-2-1-1-3-1は順調に生育し、野生株の8倍をこえる超高収穫変異株として同定された。さらにRC4-R2-1-1-3-1は野生株の8倍をこえる 超高収穫変異株として同定され,　RC8-R2-1-1-7-1も高収穫変異株として同定された。
　以上の実験例では変異株の新しい単離法を開発するべく種々条件を変化させ、最適条件を求めてきた。その中で、アスコルビン酸の濃度が高過ぎる可能性が考えられ、その濃度を1 mMに変更した。またリボフラビンを加える処理は、発芽種子に紫外線照射行うことが含まれ、植物の生残に大きく影響をあたえる。従って紫外線照射処理は省いた。野生株で最高の収穫を示したR0-3-1,　また高収穫変異株として、R2-1-3, R2-3-9, R8-1-1を用いた。薬剤処理は従来のRC処理のなかで、アスコルビン酸の濃度を1 mMとし、そのまま7日間人工気象器（8時間光照射8 ℃/16時間暗黒 7 ℃）で生育させ、処理をおこなった。
　表５に実験例９、及び実験例１０を示す。生育数は畑に移植後、２か月での生育を調査した。R0-3-1は対照実験での生育は平均で、75%で良ことが認められた。また変異株と認められる株 ((G)で示す) は１１株で、その中でも取り分け良い変異株と認められる株 ((VG)で示す)は4株であった。 その結果を図２３、２４、２５、２６に示す。同一の穂より得られた種子の対照に比べ、明らかに緑が濃く、また茎、葉の生育が良い。また分ゲツ数も多く、多収穫変異株の特性を示した。
　実験例１０ではR2-1-3株を用いた。対照実験での生育は平均で71 %で高い数値を示した。２重変異と認められる株が7株単離され、そのうち３株は大変良い変異株であった。その変異株を図２７、２８に示す。同じ穂からの種子による対照実験に比べて明らかに茎、葉の生育が良く、緑が濃い。分ゲツ数も多く、２重変異株と認められる。
　表６に実験例１１、及び実験例１２を示す。多収穫変異株R2-3-9は対照実験での生育は平均で63 %で、良いと言える。２重変異株は4株だが、そのうち２株は大変良い株であると確認した。同じ穂からの種子による対照実験に比べ明らかに茎、葉の生育が良く、緑が濃い。分ゲツ数も多く、２重変異株と認められる。その２重変異株を図２９、３０、３１に示す。
　実験例１２に高収穫変異株R8-1-1を用いた変異誘起処理の結果を示す。対照実験での生育数は62 %で、良いと言える。しかし穂により、生育数の良い穂と、良くない穂に別れた。２重変異株と確認できたのは10株だが、そのうち2株は大変良い株であると確認した。図３２に示すように同じ穂からの種子による対照実験に比べ明らかに茎、葉の生育が良く、緑が濃い。葉の幅が広く、茎の分ゲツ数も多い。２重変異株と認められる。
高収穫変株の遺伝的特性
　コムギの高収穫変異の単離について2006年10月18日申請の第２特許出願(特願2006-283492)に述べたが、その高収穫の特性の詳細は明らかにしていない。表９に示すように変異株の単離時に対照実験で無処理の野生株を生育させている。３２株の野生株のなかで、生育があまり良くない株、計１７株については解析の対照から除外した。この扱いにより単離された高収穫変異株が確たる変異株であることを示すためである。これらのなかで、次世代の解析に用いた野生株、R0-1-5が比較的よい野生株であること、また野生株のなかで、非常に高い収穫を示したR0-3-1株は高収穫変異株にせまる収穫を示したことを示す。これらの事実はこれらの株を次世代の解析にまわした論拠となる。次の更に高収穫になる変異を誘起する方法の開発には、野生株として、R0-3-1株を用い、更に高収穫変異株を得ることを試みた。更にすでに得られている高収穫変異株であるR2-1-1, R2-1-3, R2-3-9, R8-1-1変異株を用いた。また高収穫性の属性として、バイオマスとなる藁（根を含む）に付いても、十分乾燥させたものの重さ（g）を測定し、データに加えた。
　これらの高収穫変異がアラスカエンドウで見られるように、その遺伝的特性が、優性変異であることを示す必要がある。野生株はR0-1-5また高収穫を示すR0-3-1株を用いた。また高収穫変異株R2-1-1, R2-1-3, R2-3-9, R8-1-1の種子は雑種第1代の子孫、雑種第２代と考えて良い。従ってこの雑種第２代の形質がどう出るかを調査した。R0-1-5株を除き、種子はすべて袋がけをした穂より得られたものであり、遺伝的調査に耐え得るものである。また変異はキメラのように雑種第1代で入っている可能性がある。従って穂は変異遺伝子を含むと考えられる、粒数の多い８穂を選んで使用した。１２月の下旬に種子を各穂より１２粒とり、滅菌後無菌水をいれ、4日間人工気象器（8時間光照射8 ℃/16時間暗黒 7 ℃）で浸潤させた。光強度は100～150μmol/m2/secである。それをプランタに播種し、温室で太陽光下に７日間生育させた。更に７日間温室の廊下に生育させ、温度に馴化させ、露地に出した。1月中旬に畑に移植した。３月下旬にコムギのロゼットを観察し、野生株、野生株で生育が遅延した植物、さらに高収穫変異株、その分ゲツ数、茎及び葉の生育、さらにその緑の濃さより、野生株と変異株を見分けた。表１０にその結果を示す。野生株R0-1-5の結果は生育の遅い株が１１％出ることを示す。また野生株で高収穫性のR0-3-1株は更に低い１０％以下の生育遅延株の発生状況であった。この結果、野生株は常に１０％前後で生育が遅い株を発生していることになる。更に高収穫性のR0-3-1株はその高収穫性が雑種第１代の結果ではなく、すでにホモの状態で高収穫性を持つ可能性も考えられる。しかしその点については実際に高収穫を確認する必要がある。通常の生育では、野生株R0-1-5は生育がR0-3-1株より少し遅いて程度で、両者の識別は困難である。高収穫変異株R2-1-1, R2-1-3, R2-3-9, R8-1-1は雑種第1代の子孫、雑種第２代と考えて良い。従って理論的には高収穫変異の特性を７５％の子孫が示し、２５％が野生株の特性を示すことが予想される。この生育段階でのこれらの数値は全て２５％以下で、少し低いが、十分に通常の優性変異と予想される。茎及び葉の生育の良さ、また緑の濃さ、分ゲツ数の多さだけでなく、さらに収穫量、分ゲツ数、バイオマス量をいれて野生株の分離を見る必要がある。
新規変異処理によるコムギ大収穫変異株の出穂状況
　コムギの新規変異株取得処理による高収穫変異株の取得状況をまとめた。表１０に示すように、野生株R0-1-5, の出穂を43株すべてに亘り５月の生育途中の段階で調査した。出穂は不完全ではあるがかなりあり、それを各株調査し統計をとった。その結果、出穂は平均4.88本で、標準誤差は0.35であった。本変異株取得法は高度に高収穫性を獲得した変異株を単離するのが目的であるから、出穂数が野生株の4倍以上の変異株をここでは超高収穫性変異株として扱かった。単離された超高収穫性変異株は表１１に示す。単離された超高収穫性変異株の総数は、16株で、そのうち７株が野生株の５倍以上の収穫が予想される結果であった。これらの７株はバイオエタノールの供給源として、採算がとれ、工業的に用いられると考えられる。野生株R0-3-3-1のRC4処理（ビタミンC, 10 mMの存在下で、Mv処理を行なう）では4.5倍の変異株RC4-1が単離された。またさらにリボフラビン処理を加える方法、FRC4処理では、R0-3-3-2を用いて、5.3倍の超高収穫の可能性が高いFRC4-1変異株が単離された。Mv処理で得られた高収穫変異株、R2-1-1株からは、3株の超高収穫変異株が単離されたが、そのうち1株、RC40,R2-1-1-3-1株は6.6倍の高収穫が予想される。この株は野生株R0-1-5より3週間以上遅れて畑に移植されており、その生育の遅れを考慮に入れ計数すると、野生株の8.6倍の生産性を示すことになる。野生株の写真（図３３）およびRC40,R2-1-1-3-1株の写真（図３４）を示す。其の緑の濃さ、分ゲツ数の多さは一目瞭然である。R2-1-3株をもちいて、RC8処理で、野生株の５倍近い超高収穫変異株が単離された。R2-3-9を用いて、RC4処理により6倍近い株、またRC40処理により、4倍強の超高収穫変異が単離された。R8-1-1株はもともと、Mv処理により、3.5倍の高収穫を示す変異株として単離された。自殖第２代では、無処理でも4.5倍の超高収穫を示す株、RC0,R8-1-1-16-1を見いだした。其の事実からすると、RC4,R8-1-1-11-2, RC4,R8-1-1-15-2,  RC4,R8-1-1-16-1,  RC40,R8-1-1-3-1 はそれぞれ、4.5, 4.1, 4.5, 4.1倍であり、同様の機構で選抜されてきた可能性を否定出来ない。しかし、超高収穫変異として単離されたRC4,R8-1-1-15-3, RC8,R8-1-1-15-1, およびRC40,R8-1-1-15-1はそれぞれ5.1, 5.5,　および 5.5倍の超高収穫変異の特性を示す。更に新しい変異を誘起したと考えられる。
コムギの高収穫変異及び超高収穫変異の収穫特性
　実験例１及び実験例２のコムギ種子は多数の野生株からの集合種子であり、その種子の中でも良い種子（大きく丸い）種子を選抜している。そのためか、その後の植物の生育も良いので、実験例１及び実験例２は他の実験例とは対照実験も別の扱いとする。また対照実験での生残数が低く、実験例２のF0-0-1, F0-0-2を対照実験とする。実験例１でのMv処理では穂重量が対照実験をこえるものが存在しなかった。また早咲きと思われる株があったが、生育が極端に悪く、捨てた。実験例１では温室(25 ℃)から露地に出す過程での馴化がうまくいかなく、多くの株が枯死した。
　実験例２は第２特許出願による方法である。本実験例では比較的生残数が高く、また植物は移植後の生育も良かった。表１２に示すように、野生株（無処理株）に比べ、処理株でF80-4-2は分ゲツ数が２倍弱、穂数は２倍強、穂重量は2.5倍、バイオマス量も2.5倍となった。草丈は野生株の平均より10 cm高いが、野生株の振れの範囲内であった。F80-4-2は高収穫変異株と同定した。
　実験例3，及び実験例４に於いても、生残数は非常に少ない。しかし、実験例２の野生株のデータを対照実験とすると、図３５に示す様になり、明らかにRC4処理、またFRC4処理により生残した２株はともに高収穫変異株として同定できる特性を示した。RC4-1変異株において穂重量は野生株の２倍であり、FRC4-1変異株では野生株の3.5倍の高収穫性を示した。
　実験例５及び実験例６は野生株の４つ穂から得られた種子を扱った。最終の収穫をみる段階での生残数が少なく、変異株は単離できなかった。
　実験例７及び８では、R2-1-1高収穫変異株の最も粒数の多い４つの各穂からの種子を用い、それぞれRC処理、また次に粒数の多い４つの穂からFRC処理をおこなった。この実験に先立ち、表１０に示す実験をおこなった。野生株R0-1-5の１つの穂より種子を５０浸潤した。４３株が生育し、その生育および収穫特性を表１３に示す。
　R2-1-1変異株のRC処理においては、対照実験の株が全て枯死した。しかし、図３６に示すように、RC4R2-1-1-3株及びRC40R2-1-1-7は超高収穫性をしめし、その生産性（穂重量）は野生株のそれぞれ、8.9 倍および8.1倍となった。RC8R2-1-1-7は、穂重量が4.5倍で、FRC処理実験の対照実験、FRC0R2-1-1-18-1, FRC02-1-1-18-2の6.2倍および4.5倍のレベルであることが判明した。RC処理により、更に高い収穫性の変異を獲得したと考えられる。FRC処理では処理された発芽種子は全て枯死した。RC4R2-1-1-3株及びRC40R2-1-1-7は超高収穫性をしめし、その生育途中の野生株R0-1-5との比較で、図３３及び図３４に示す。
　図３７に収穫後の像を平行して行なわれた別実験の野生株R0-3-2とともに示す。これらの超高収穫変異を示す株の存在は少なくともコムギはここまで高い収穫性をしめすことができることを示している。この収穫性が安定して畑で収穫できるかどうか、はこれからの新たな課題となる。
　一方現在の５倍の収穫量を作物植物が行なえたら、問題なく工業的に採算がとれる収穫レベルであると言われている。種々のマイナスの要因を克服すれば、その数値は比較的に容易に乗り越えられると考えられる。これらの超高収穫変異株は工業用超高収穫変異株と名付けた。
　実験例９及び実験例１０からはビタミンCの濃度を1 mMとした（表７）。対照実験に含まれる10 mMビタミンCは変異原処理薬剤０でも種子の発芽率を低下させることが問題と成った。野生株で特別に高収穫であったR0-3-1株の穂で特に粒数の多い１、２、７、９番に付いて、その成績を表１４に纏める。R0-3-1-1, R0-3-1-2ではそれぞれR0-3-1-1-1, R0-3-1-2-1, R0-3-1-2-4の収穫特性が良かった。R0-3-1-7, R0-3-1-9には高収穫を示す株は存在しなかった。RC処理による変異原処理は、R0-3-1-7株に高収穫性を与えた。その高収穫特性を図３８に示す。R0-3-1-1-1, R0-3-1-2-1, R0-3-1-2-4は高収穫性を示すが、この特性はChinese Spring株に見られる高収穫を起こし得る小因子の集まりによりえられた可能性が十分にある。野生株(R0-5-1)の自殖種子でもR0-5-1-30は高収穫性を示している。およそ２％の確率で起きているこれらの高収穫性を示す野生株は自殖を繰り返せばホモの状態に持ってゆくことができるであろう。またこれらの高収穫野生株と本変異原処理による株はMv耐性に於いて基本的に異なる反応を示すであろう。この点は確認する必要がある。
　実験例１０ではR2-1-3変異株を用いた（表７）。粒数の多い穂番号５及び８を用いた。表１５に示すように、これらの穂に高収穫変異は含まれていないと考えられる。RC処理により、高収穫性を示すRC8R2-1-3-8は高収穫変異を含まない種子に変異が誘導された可能性が高い。
　実験例１１ではR2-3-9変異株の自殖第２代に当たる種子を用いた（表８）。粒数の多い穂番号７及び１４の穂を用いた。表１６に示すように、RC0R2-3-9-7-3はホモ個体と考えられ、それによる生産性は野生株のおよそ3倍に成った。穂１４には変異が入っている証拠が見られなかった。RC処理によりRCR2-3-9-7-2はその収穫性が高く、野生株の4.2倍で、超高収穫変異株と同定した。またRC4R2-3-9-14-3は高い収穫性を示し、その収穫高は野生株の3.9倍であり、高収穫変異株と考えられる。この株は変異を含まない種子がRC処理により高収穫性に変異した可能性を否定出来ない。この結果を図３９に示す。
　実験例１２に高収穫変異株R8-1-1の穂番号、３、１１、１５、１６、１９、２２、２３、２９の種子を用いて、RC0（ビタミンC,１mM），またRC処理を行なった（表８）。RC0の結果を表１７に示す。高収穫変異株、R8-1-1,で3～４倍の高生産性を示す６株を図４０に示す。これらの株は変異をホモに有すると考えられる。これらの穂の種子にRC処理を行い、その結果は表８の実験例１２に一部中間段階のデータが示されている。表１８に示すように高収穫変異株以上に生産性の高い超高収穫性変異株が3株単離された。その生産性は野生株の4.1～5.7倍であった。5.7倍を示すRC80R80-1-1-15-1株は分ゲツ数、穂数、バイオマスとしての藁、等バイオエタノール生産のための工業化にたえる生産性を有する。その結果を図４１に示す。
　以上のようにして、工業化の指標である現在の作物植物の生産性の５倍の生産性を示すコムギに付いて纏める。表１９に工業用超高収穫変異株と示すように、R2-1-1-18-1株及びFRC4-1株は野生株の５倍以上の超高生産性を示すが、R2-1-1-18-1株についてはホモに成った故に更に生産性が上がったと考えられる。FRC4-1株は野生株より1度の処理で超高生産性を示した。またRC42-1-1-3-1, RC40R2-1-1-3-1, RC80R8-1-1-15-1の3株は高収穫変異株に更にRC処理をすることにより、超高収穫の特性を獲得した。其の結果を図４２に示す。ビタミンCを含む本処理法が十分に有効であることが証明された。
コムギ高収穫変異株の示す遺伝的特性
　コムギ高収穫変異株は予想したように、高い収穫性を示した。上記の解析では高収穫変異、雑種第１代の子孫としての種子を、穂の粒数の多いものから、順に使用した。また各々の種子からの苗は２８cm間隔の正3角形の頂点の２条播きで、畝の間隔は１mである。十分なスペースがとってあり、株の持つ特性がはっきりと出易い。雑種第１代の変異がキメラの様に入ることが予想され、各々の穂からの種子を遺伝的に同一と仮定して解析している。この仮定が正しいかどうかも、検証が必要とされる。穂の１部に変異がキメラ状に筋の様に入るパターンはよく見られる。従って研究その物が、変異を起こした部位をうまく使用し、変異が入った種子が高収穫性を示すと仮定して、研究を実施している。その高収穫性を示す変異株が最終的に仮定した様に、Mv耐性の形質を示せば、その仮定は間違ってはいなかったことに成る。イネではその様に、高収穫性で選抜してきた高収穫変異株はMv耐性であった。コムギでもそれを確認する必要がある。
　変異が入っている穂は全ての種子に変異が入っていると仮定する。変異を優性変異のRとすると、雑種第１代の変異株の遺伝子型は、Rrとなる。各遺伝子がA群, B群, D群にあることが考えられる。これらをa, b, dで示すと、雑種第１代の遺伝子型はRa ra, rb rb, rd rdと成る。これらが自殖した場合、その子孫の遺伝子型はRa Ra, rb rb, rd rd,  Ra ra, rb rb, rd rd,  ra ra, rb rb, rd rd が1:2:1で存在することになる。ra ra, rb rb, rd rdは野生型に相当し、その生産性は穂重量が13.2 g、Ra ra, rb rb, rd rdは26.4 ～39.6 g, Ra Ra, rb rb, rd rdはやはり26.4 ～39.6 gと成ると考えられる。しかし得られたデータから解析すると、Ra ra, rb rb, rd rdは26.4 g近傍の数値、またRa Ra, rb rb, rd rdは39.6 g近傍の数値を示す。その中で、R2-1-1, R8-1-1株はRa Ra, rb rb, rd rdでは50 gを越す数値を示す。このような場合優性変異と言うよりは、優性中間変異を示すといった方が良いだろう。
　R2-1-1, R8-1-1株のRa Ra, rb rb, rd rdホモ株（と考えられる株）では雑種第２代の種子は多量生産され、更にその雑種第3代のホモ株種子を用いて、圃場に於ける生産力テスト（５cm間隔で移植）を行なっている。これらの種子の発芽能は９５％を超え、良い発芽率を示し、さらに幼苗の葉は野生株より緑が濃い。そのまとめを表２０に示す。野生株の５倍前後の高い収穫性が期待できる。
　またRC4R2-1-1, RC40R2-1-1の藁及び根の野生株との比較を図４３に示す。またこれらの超高収穫変異株と穂の写真を図４４、図４５に示す。これらの種子の生産力テストも行なっている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 （表３　実験例１では集合種子を用いた通常のMv処理であるが、とくに培地を洗浄し、新しいMv培地を加え温室で７日間太陽光にさらす処理を入れた。実験例２では温室に入れる前に、培地を洗い、新しい培地をいれ、紫外線照射をし、その後リボフラビンの濃度をかえていれ、温室で７日間太陽光にさらした。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 （表４　実験例３では集合種子を用いた。アスコルビン酸存在下にMv濃度を変化させた。温室に入れる前に洗浄し、新しいMv培地をいれ、温室で太陽光にあてた。実験例4でも集合種子を用いた。アスコルビン酸存在下にMv濃度を変化させた。温室に入れる前に洗浄し、紫外線照射し、培地にリボフラビンを入れ、温室で太陽光にさらした。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
 （表５　実験例５では野生株の袋がけした穂からの種子を用いて、表２の実験を行なった。実験例６では同様にリボフラビンの実験を行なった。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
 （表６　実験例７では高収穫変異株R2-1-1の袋がけした穂からの種子を用いた。実験例３と同じ処理をした。実験例８では高収穫変異株R2-1-1の袋がけした種子を用いた。実験例４とおなじ処理をした。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
 （表７　実験例９では高収穫性野生株R0-3-1の袋がけをした穂からの種子を用いた。アスコルビン酸濃度を1 mMとし、Mv濃度を変化させた。低温での発芽処理を7日間行ない、そのままプランタに播種した。実験例１０では、高収穫性変異株R2-1-3を用いた。実験例９と同じ条件を用いて種子を処理した。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
 （表８　実験例１１では高収穫性変異株R2-3-9の穂からの種子を用いた。実験例９と同じ条件を用いて種子を処理した。実験例１２では高収穫性野生株R0-3-1の穂からの種子を用いた。実験例９と同じ条件を用いて種子を処理した。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
 （表９　Mv処理法によるコムギの高収穫性変異株の単離状況。生育のあまり良くない１７株は野生株の統計から削除した。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
 （表１０　コムギの野生株R0-1-5, 高収穫性野生株R0-3-1, 高収穫変異株 R2-1-1, R2-1-3, R2-3-9, R8-1-1の収穫調査．４株の高収穫変異株は各々８つの穂を用いているが、どれもそれ以前に既に変異原処理に最も良い粒数の穂を用い、それらの穂に次ぐ粒数の穂を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
 （表１１　高収穫変異株の薬剤処理による超高収穫変異株に成ると５月初旬に予想される株のリスト。野生株の４倍以上の生産性を見込める株（超高収穫変異株）で、後にその超高収穫性が確認された株がほとんどである。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
 （表１２　リボフラビンを用いた高収穫変異株の取得法にしたがって、野生株の集合種子を用いて変異原処理を行なった。F80-4-2が超高収穫変異株として単離された。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
 （表１３　野生株R0-5-1の１つの穂より種子をとり、それを本文の方法で播いた。収穫結果をまとめた。このデータによる収穫性（野生株の穂の重量の平均値 13.2 g）を以下のデータの基礎とした。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
 （表１４　高生産性野生株R0-3-1の成績の良い（粒数の多い）穂、1, 2, 7, 9を無処理で播種し、結果を上部に記述した。RC処理株で、生産性の高い結果を得た株は下部に記述した。RC4R0-3-1-7株のみはっきりと高収穫変異の特性を示したが、多数の小因子の集合により高収穫性を示した可能性が残る。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
 （表１５　高収穫変異株R2-1-3の粒数の多い穂、5, 8を用いてRC変異原処理を行なった。これらの穂に変異が入っているとは考えにくいが、RC処理によりRC8R2-1-3-8が高収穫変異の比較的良い結果をだした。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
 （表１６　高収穫変異株R2-3-9の粒数の多い穂、7, 14を用いてRC変異原処理を行なった。7の穂に変異が入っているが、14の穂には変異が入っているとは考えにくい。RC処理によりRC4R2-3-9-7が超高収穫変異の良い結果をだした。RC4R2-3-9-14もRC処理により高収穫変異の良い結果を出したと考えられる。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
 （表１７　高収穫変異株R8-1-1の粒数の多い穂、3, 11, 15, 16, 19, 22, 23, 29を用いてRC変異原処理の無処理実験を行なった。16, 19, 22, 23の穂に変異が入っていると考えられる。RC0R8-1-1-19-2が超高収穫変異の良い結果をだした。RC0R8-1-1-16-9も高収穫の良い結果を出した。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
 （表１８　高収穫変異株R8-1-1の粒数の多い穂、3, 11, 15, 16, 19, 22, 23, 29を用いてRC変異原処理を行なった。11, 15, 16, 19, 22, 23の穂に変異が入っていると考えられる。RC4R8-1-1-19-1が超高収穫変異の良い結果をだした。RC4R8-1-1-23-2も超高収穫の良い結果を出した。RC8R8-1-1-11-1が高収穫変異の良い結果をだした。RC80R8-1-1-15-1は超高収穫変異で、更に工業用超高収穫変異の大変良い結果を出した。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
 （表１９　工業用超高収穫変異株の特性。野生株の５倍以上の生産性がある変異株を工業用超高収穫変異株とし、その形質をまとめた。最高値を示したRC4R2-1-1-3-1は8.9倍の生産力を示した。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
 （表２０　超高収穫変異株で、ホモと考えられる、R2-1-1-18-1, R2-1-1-18-2また超高収穫変異株及び高収穫変異株で、ホモと考えられる、R8-1-1-16-9, R8-1-1-7-1, R8-1-1-7-2を用いた生産力テスト。その準備としてこれらの株の発芽率を調査した。生産力をテストするために野生株はR0-1-5の中で、最も粒数の多い穂の２株、野生株の平均の１株、両者の中間の生産性を示す２株を用いた。）
〔実施例５〕アラスカエンドウ極多収性活性酸素耐性変異株の特性
アカパンカビの概日性リズムについて
アカパンカビは分生子（無性胞子、コニディア）形成の概日性リズムを示す。そのリズムは光によりその位相が制御される。光は光受容体に吸収され、そのエネルギーは周辺の基底状態の酸素ガス（3重項酸素）に転移され、一重項酸素(1O2)を含む活性酸素分子種（Reactive oxygen species; ROS）に渡されることを示唆してきた（Y. Yoshida and K. Hasunuma, 2004. Reactive oxygen species affect photomorphogenesis in Neurospora crassa. J. Biol. Chem. 279, 6986-6993. ）。活性酸素分子種と分生子形成には関連があることが示唆されて来たが、細胞内の活性酸素分子種の濃度がどのように変化するかは未知であった。アカパンカビのsod-1変異株はきれいな分生子形成の概日性リズムを示す（Y. Yoshida, T. Maeda, B. Lee and K. Hasunuma, 2008, Conidiation rhythm and light entrainment in superoxide dismutase mutant in Neurospora crassa.　Molec. Genet. Genomics, 279;193-202. ）。sod-1変異株を用いて寒天培地上に分生子を植菌し、菌糸と分生子形成の概日性リズムを形成させた。その間に菌糸の先端を切り取り、活性酸素分子種の濃度を測定した。図46に示すように、スーパーオキシドを主とするROSの濃度は分生子形成のスタートである気菌糸形成から、分生子形成にかけて低下する。菌糸の部分では極大となる。従ってきれいな概日性リズムを示すことになる。スーパーオキシドを主とするROSは２次情報として働き、遺伝子発現をも制御する可能性が示唆されているので、ccg-2など多数の遺伝子の発現が概日性リズムで制御されることになる。植物でも同様のスーパーオキシドを主とするROSの概日性リズムでの濃度の変動が存在すると考えられる。従って花芽形成の時期を決定する機構もこの中に入っていると考えられ、スーパーオキシドを主とするROSを変化させる変異は花芽形成の時期を変化させることが考えられる。従って花芽形成時期の変化を誘起するための技術を与える。
アラスカエンドウ極多収性活性酸素耐性変異株の特性
  アラスカエンドウの極多収性活性酸素耐性変異株はパラコート(Methyl viologen ) 耐性変異株として、単離された。その株はR3-1, R3-2の２株が報告されたが（Md E. Haque, Y. Yoshida and K. Hasunuma, 2008, Paraquat-resistant mutant lines in Pisum sativum cv Alaska: biochemical and phenotypic characterization. Plant Biotechnol. Rep., 2: 21-31.）、その２株はもともと一株から生じ、２つの分枝の１つずつである。変異原処理植物がキメラとなる可能性が高く、性質が少し異なると考えられたので、別々に扱った。しかしその後の解析結果は遺伝的に全く同一の変異株であることが判明した。
　極多収性活性酸素耐性変異株R3-1は、圃場での生育生産性テストを行なった。図47上段に示すように植物体全体（全草）はその生重量で3倍であった（下段D）。根は野生株より発達していた。下段に示すように、A;サヤの生産性は野生株のおよそ2.9倍、またBに示すように種子の数は2.3倍、C;乾燥サヤの重さは1.5倍であった。
　更にリボフラビンは強い光照射下に一重項酸素を含む活性酸素分子種すべてを発生するので、一重項酸素を特異的に発生するメチレンブルー (Methylene blue) により一重項酸素を特異的に発生させ、その存在下で、野生株と変異株の生育特性をみた。図48に示すように種子の発芽、茎の伸長生長、また根の伸長生長の結果はリボフラビンの場合とあまり変化はなかった。
　活性酸素耐性株は細胞内で破壊的に作用する一重項酸素をどのように迅速に無害化しているかを確認する必要が有る。図49に示すように野生株に比べ変異株の葉は太陽光照射下(1,800μmol/m2/sec)で、第2、第3葉の葉緑素計でのSPAD値が14~25 % 高い。
   葉から葉緑素を抽出して野生株と変異株の比較を行なった。図５0Aに示すように葉緑素含量は変異株より15 % 高い。Bにしめすようにカロテノイドの量も野生株より14 % 高い。Cではアントシアニンが67 % 高い。Dではマロンアルデヒドの産生量より、膜脂質の過酸化反応をみた。植物の脂質はそのほとんどが不飽和脂肪酸で、その２重結合部分に一重項酸素がリポキシゲナーゼにより導入され、ヒドロキシペルオキシドを生ずると考えられる。もう１つの結合は更に切断され、マロンアルデヒドを生ずる。そのマロンアルデヒドの産生量から脂質の過酸化反応の度合いを調査した。その結果、変異株では脂質の過酸化反応がおよそ21 % 抑制されていた。葉緑素量が変異株で高いこと及び過酸化脂質の形成量が抑制されていることは、発生した一重項酸素の迅速な無害化が変異株で起っていることを示す。カロテノイドの含量が多いことはキサントフィルサイクルに必要な、カロテノイドの産生があがっていることも示唆し、一重項酸素を発生する前にそのエネルギーを熱として水をとうして発散し、逃している可能性をしめす。またカロテノイドおよびアントシアニンの過剰生産はこの変異株が光誘導を起こすカロテノイドおよびアントシアニン合成系の構成的発現誘導が起っていることも示唆する。
　次にR3-1変異株の特性を誘起する原因遺伝子変異の同定を目指した。その第一候補を考える基礎として、アカパンカビではndk-1P72Hはパラコートに感受性を示す。またヒスタグNDK-1はNADHを結合するが、ヒスタグNDK-1P72H  はNADHを結合しないことを示してきた(N. Wang, Y. Yoshida and K. Hasunuma, 2007, Catalase-1 (CAT-1) and nucleoside diphosphate kinase-1 (NDK-1) play an important role in protecting conidial viability under light stress in Neurospora crassa. Molec. Genet. Genomics, 277:13-22.)。従ってndk-1P72H変異株を用いて、パラコート耐性株を単離することは、ndk-1P72H変異遺伝子に更に変異を導入して、NADHを結合する復帰突然変異株を取得することを意味する。その他の可能性もあるが、パラコート耐性株を植物の野生株から単離する場合も同じ論理が通ずる。パラコート耐性株の原因遺伝子の第一候補はNDKの変異であると推論して良い。アラスカエンドウR3-1変異株はその可溶性分画タンパク質のリン酸化によりNDKを検知できる。その結果、SDS-PAGEのリン酸化パターンはPea NDK2の泳動度に野生株との相違が存在した。従ってこれらの推論より野生株及びR3-1及びR3-2変異株のPea NDK1（サイトゾルに局在）, Pea NDK2（葉緑体に局在）, Pea NDK3（ミトコンドリアに局在）のcDNAを全てクローニングし、その塩基配列を比較した。Pea NDK2ではそれらを比較検討することにより、８つの塩基に置換が見られたが、そのうち７つは報告のある活性酸素分子種による変異誘導と同定された。そのうち２つがアミノ酸配列に変化を誘起した。Ile12Leu, Glu205Lysの２つのアミノ酸置換である。図51Aに示すように、Ile12LeuはNDK2が葉緑体に局在するために必要な移行ペプチド（葉緑体局在配列）内の変異で、もう１つの置換はGlu205Lysで、この置換はタンパク質のチャージを変化させ、電気泳動の移動度に影響を与える。つまりGluは負にチャージし、SDSが付きにくいが、Lysは正にチャージし、SDSは付き易い。Pea NDK2に付くSDSの量は変異型のほうが多く付くために全体として大きく負にチャージし、移動度も大きくなると考えることができる。好塩性バクテリアのNDKを用いてそれを支持する論文も存在する（H. Tokunaga, M. Ishibashi, F. Arisaka, S. Arai, R. Kuroki, T. Arakawa, M. Tokunaga, 2008, Residue 134 determines the dimmer-tetramer assembly of nucleoside diphosphate kinase from moderately halophilic bacteria, FEBS Lett. 582, 1049-1054）。
　Bに示すようにミトコンドリアに局在するNDK3についても解析された。5つの塩基置換が検出されたが、5つ全てが活性酸素分子種により誘起される変異として同定された。そのうち１つがアミノ酸置換を引き起こし、Pro45Serであった。プロリンはアルファへリックスの終点を形成することがおおく、ミトコンドリアへの移行ぺプチドに変異が入り、機能に変化が生じた可能性が高い。またR3-1及びR3-2変異株ともにNDK2, NDK3に誘起された変異は全く同一であり、これらの変異株が同一変異であることが同定された。
　葉緑体、ミトコンドリアともに活性酸素発生をする細胞器官であることもあわせ、これらの突然変異により、活性酸素耐性度が上昇した可能性が高い。これらの突然変異がR3-1変異株の遺伝的形質を全て説明しうる変異で有るかどうか、この変異がR3-1変異株の原因遺伝子変異で有るかどうかを確認する解析が必要である。そのためにNDK1, NDK2, NDK3の細胞分画からの分子及びクロー二ングで得られた精製されたGST- NDK1, GST-NDK2, GST-NDK3を用いてその生化学的特性を解析した。
　図52に示すようにNDK1, NDK2, NDK3のリン酸化活性およびリン酸化されたタンパク質のSDS電気泳動での移動度を解析した。Aでは可溶性分画に存在するNDK1, NDK2がリン酸化される。NDK2はサイトゾルに有る程度存在すると考えられる。また可溶性分画を調製する際に葉緑体が破壊され、一部が混入してくるとも考えられている。リン酸化されたR3-1変異株, NDK2のSDS電気泳動での移動度は大きい。葉緑体及びミトコンドリアを精製し、破砕し、透析してNADH等小分子を除去した。その分画のリン酸化パターンが図52Bに示されている。葉緑体分画では野生株では２本のリン酸化バンドが見られるが、R3-1変異株では２本のバンドがほとんど重なり、リン酸化シグナルも強い。ミトコンドリア分画では一本のリン酸化バンドがみられ、変異株のリン酸化シグナルは少し弱い。図52Cでは GST-NDK2, GST-NDK3からGST-をプロテアーゼで切り離し、タンパク質量をあわせて、リン酸化を行なった。R3-1変異株, NDK2は明らかにリン酸化シグナルが強く、２倍の強度を示した。しかしミトコンドリアのNDK3はわずかにシグナル強度が強かった。これらのタンパク質は葉緑体、またミトコンドリアに局在する移行ペプチドを結合している状態でのリン酸化であり、葉緑体、またミトコンドリアに局在する機構との関連を示唆する。
図52Dに示すように、これらのリン酸化シグナルがどのアミノ酸のリン酸化によるのかを上段のアルカリ処理（ヒスチジンのリン酸化及びセリンのリン酸化が残る）及び下段の酸処理（セリンのリン酸化が残る）により少なくともヒスチジンのリン酸化が含まれていることを示す。これらがヒスチジンキナーゼの代表であることを示している。
　図53では野生型及びR3-1変異型GST-NDK2, GST-NDK3を用いて、dGDP, dTDPを基質とし、ヌクレオシド２リン酸キナーゼ活性を測定した。R3-1変異型GST-NDK2は野生型に比べ、それぞれ1.8倍、及び2.3倍の活性を示した。しかしGST-NDK3を用いた場合1.1倍および1.0倍であった。
　図54では(32P)NADHを用いて、GST-NDK1, GST-NDK2, GST-NDK3の(32P)NADH結合活性、GST-をプロテアーゼで切り離したNDK1, NDK2, NDK3の(32P)NADH結合活性を調べた。可溶性分画に(32P)NADHを入れ、紫外線照射し、クロスリンクを行なった。Bに示すように野生株でもR3-1変異株でも、ともにNDK1の位置に強い(32P)NADH結合活性を検知した。Cに示すようにGST-NDK1はGST-を切り離すと(32P)NADH結合活性を示した。GST-NDK2はGST-を切り離すと、野生型よりR3-1変異型が強く(32P)NADH結合活性を示した。GST-のみでも弱いシグナルを出すが、GST-NDK2は野生型でもR3-1変異型でも比較的強いシグナルを示した。GST-NDK3はGST-のみとあまり変わらなかった。ここでのNDK2, NDK3は移行ペプチドを含んでおり、その(32P)NADH結合活性は葉緑体、ミトコンドリアへの局在の機構と関連することが示唆される。
　このようにR3-1変異型のNDK2 Ile12Leu, Glu205Lysでは移行ペプチドを付し、GST-を切り離した状態で、その自己リン酸化活性は野生型の２倍であった。またGST-を付した状態での野生型NDK2及びR3-1変異型のNDK2 Ile12Leu, Glu205Lysのヌクレオシド２リン酸キナーゼ活性を比較すると、後者はやはり２倍高い。またGST-を切り離した状態でNADHの結合活性を見ると、後者はその活性が高い。まとめるとNDK2 Ile12Leu, Glu205Lysは自己リン酸化活性、ヌクレオシド２リン酸キナーゼ活性及びNADH結合活性が高くなっており、一重項酸素を含む活性酸素分子種に対する耐性の特性を示すR3-1変異株の原因遺伝子であることを強く示唆した。従ってこの遺伝子変異は図56に示す組み合わせのアミノ酸配列の置換を生体内での変異誘起のみならず、試験管内で誘起し、その変異遺伝子をアラスカエンドウの野生株のみならず他の作物に導入することにより、極多収性を示す特性を付与する技術を与える。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
　本発明により、有用な変異を高効率で菌類及び植物に誘導することができるようになった。その結果、菌類及び植物の有用変異株を作製することができるようになった。
　本研究は今地球が置かれている状況を少しでも良くする可能性を含む技術であると考える。例えばトヨタ自動車工業（株）は植物プラスッチックの開発を行ない，またブラジルではトウモロコシ、サトウキビから植物アルコールを生産し，石油に依存しない国家体制をひいている。資源の少ない化石燃料に依存度の高い日本では，このような研究を必要としている。
　本研究は農業（穀類，野菜類）へ充分貢献すると考える。更に健康食品，植物油脂工業，また化石燃料資源の代替えエネルギー原として，燃料エタノール，また植物プラスチックの原材料を多量に提供する。また牧畜における牧草の成育を改良し，家畜の飼料を多量に提供する。

Claims (40)

  1. 変異誘起処理の間又は後に、菌類又は植物を電子供与体の存在下で培養することを含む、菌類又は植物の有用変異株の作製方法。
  2. 変異誘起処理が、活性酸素若しくは活性酸素発生剤への暴露である請求項１記載の方法。
  3. 活性酸素又は活性酸素発生剤が、メチルビオローゲン、過酸化水素及びNaニトロプルシッドからなる群より選択される少なくとも１種類の化合物である請求項２記載の方法。
  4. 活性酸素又は活性酸素発生剤が、メチルビオローゲンである請求項３記載の方法。
  5. 活性酸素発生剤への暴露が、0.1～250 μMのメチルビオローゲンを含有する培地中での菌類又は植物の培養である請求項４記載の方法。
  6. 電子供与体がアスコルビン酸及び／又は還元型グルタチオンである請求項１～５のいずれかに記載の方法。
  7. 0.001～50ｍＭのアスコルビン酸及び／又は還元型グルタチオンの存在下で、菌類又は植物を培養する請求項６記載の方法。
  8. 変異誘起処理の間又は後に、菌類又は植物を電子供与体の存在下で培養し、生育した株を選択すること、前記の選択した株に第２の変異誘起処理を行うこと、第２の変異誘起処理の後に、前記の選択した株を一重項酸素が発生する条件下で培養し、生育した株を選択することを含む請求項１～７のいずれかに記載の方法。
  9. 第２の変異誘起処理が紫外線照射である請求項８記載の方法。
  10. 紫外線照射が、1～１０ μmole・m-2・sec-1の紫外線を１～５分間菌類又は植物に照射することである請求項９記載の方法。
  11. 一重項酸素が発生する条件下での培養が、一重項酸素発生光増感剤を含む培地中での光照射下の培養である請求項８～１０のいずれかに記載の方法。
  12. 一重項酸素発生光増感剤が、リボフラビン、ポルフィリン、メチレンブルー、ローズベンガル、FMN(フラビンモノヌクレオチド)及びFAD(フラビンアデニンジヌクレオチド)からなる群より選択される請求項１１記載の方法。
  13. 一重項酸素発生光増感剤がリボフラビンである請求項１２記載の方法。
  14. 照射する光が太陽光である請求項１１～１３のいずれかに記載の方法。
  15. 一重項酸素発生光増感剤を含む培地中での光照射下の培養が、10～4000μMのリボフラビンを含有する培地中での50～2500μmole・m-1・sec-1の太陽光照射下の培養である請求項１４記載の方法。
  16. 変異誘起処理を菌類の分生子又は植物の茎を含んでもよい種子に行う請求項１～１５のいずれかに記載の方法。
  17. 変異誘起処理を野生株の菌類又は植物に行う請求項１～１６のいずれかに記載の方法。
  18. 変異誘起処理を一重項酸素以外の活性酸素に耐性がある変異菌若しくは変異植物又はその子孫に行う請求項１～１６のいずれかに記載の方法。
  19. 一重項酸素以外の活性酸素に耐性がある変異菌若しくは変異植物又はその子孫が、野生株の菌類又は植物を一重項酸素以外の活性酸素又は活性酸素発生剤に暴露して得られた変異菌若しくは変異植物又はその子孫である請求項１８記載の方法。
  20. 変異誘起処理の間又は後に、菌類又は植物を電子供与体の存在下で培養することにより作製した菌類又は植物の有用変異株の次世代以降の子孫に変異誘起処理を行う請求項１～１９のいずれかに記載の方法。
  21. 菌類が子嚢菌類に属するものである請求項１～２０のいずれかに記載の方法。
  22. 子嚢菌類がアカパンカビである請求項２１記載の方法。
  23. 植物が単子葉植物又は双子葉植物である請求項１～２０のいずれかに記載の方法。
  24. 単子葉植物が、オートムギ、コムギ、オオムギ、イネ、トウモロコシ、ソルガム又はサトウキビである請求項２３記載の方法。
  25. 双子葉植物が、ブロッコリー、ペチュニア、アブラナ、ヒマワリ、サツマイモ、ダイズ、ピーナツ、アラスカエンドウ又は甜菜である請求項２３記載の方法。
  26. 請求項１～２５のいずれかに記載の方法で作製した菌類若しくは植物の変異株又はその子孫。
  27. 請求項２６記載の植物の変異株又はその子孫の細胞又は組織。
  28. 請求項２６記載の植物の変異株又はその子孫の種子。
  29. 請求項１～２５のいずれかに記載の方法で作製した植物の変異株又はその子孫の自家受精又は交配により、所望の性質及び／又は形質を示す株を作製する方法。
  30. 請求項２９記載の方法で作製した植物株又はその子孫。
  31. 請求項３０記載の植物株又はその子孫の細胞又は組織。
  32. 請求項３０記載の植物株又はその子孫の種子。
  33. 電子供与体を含む、菌類又は植物に有用な変異を誘起するための組成物。
  34. 野生種と比較して、葉緑素量が多く、かつ過酸化脂質の形成量が抑制されている菌類若しくは植物の変異株又はその子孫。
  35. 野生種と比較して、ＮＤＫに関する変異を含む菌類若しくは植物の変異株又はその子孫。
  36. 野生種と比較して、ＮＤＫ２及び/又はＮＤＫ３に関する変異を含む菌類若しくは植物の変異株又はその子孫。
  37. 野生種と比較して、ＮＤＫ２において、少なくともＩｌｅｌ２Ｌｅｕ及びＧｌｕ２０５Ｌｙｓのアミノ酸置換が誘起されている菌類若しくは植物の変異株又はその子孫。
  38. 野生種と比較して、ＮＤＫ３において、少なくともＰｒｏ４５Ｓｅｒのアミノ酸置換が誘起されている菌類若しくは植物の変異株又はその子孫。
  39. 野生種と比較して、少なくともＮＤＫ２におけるヒスチジン及び/又はセリンのリン酸化活性が高い菌類若しくは植物の変異株又はその子孫。
  40. 野生種と比較して、ＮＤＫ２のヌクレオシド2リン酸キナーゼ活性が1.3倍以上ある菌類若しくは植物の変異株又はその子孫。
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