WO2009096252A1 - 蛍光検出ユニット及び反応検出装置 - Google Patents

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Yukito Nakamura
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Konica Minolta Medical & Graphic, Inc.
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    • G01N2201/0696—Pulsed

Definitions

  • the present invention relates to a fluorescence detection unit and a reaction detection apparatus having the fluorescence detection unit.
  • a reagent such as blood is sealed in a microchip in which a microchannel is formed, a liquid is injected into the microchannel by a micropump, the reagent is moved, and the sample is flowed to the reaction unit and then to the detection unit, thereby allowing a sample such as blood to flow.
  • a reaction detection device that can measure the reaction result of the reaction. In such a reaction detection device, excitation light is emitted from the light emission part of the fluorescence detection unit to the detection part of the microchip, and the very weak fluorescence emitted by the fluorescent substance contained in the reagent is emitted from the light reception part of the fluorescence detection unit. Configured to detect.
  • the measurement value of the received light amount is the transient fluorescence after the excitation light irradiation is stopped.
  • the change in state will be measured.
  • the measurement value is not stable, and it is difficult to apply to the above-mentioned application fields where the measurement result requires accuracy.
  • the fluorescence cannot be detected if the excitation light irradiation time zone and the fluorescence measurement time zone are different.
  • the present invention provides a fluorescence detection unit that provides stable measurement values and provides accurate measurement results, and provides the fluorescence detection unit to stabilize measurement values and obtain accurate measurement results. It is an object of the present invention to obtain a reaction detection device.
  • a fluorescence detection unit having a light emitting unit that irradiates a sample with excitation light and a light receiving unit that receives and detects fluorescence emitted from the sample by irradiation of the excitation light, after the light emission of the light emitting unit is started, The detection of the light reception of the light receiving unit is started, and the amount of fluorescent light is measured in a sequence that is performed simultaneously with the stop of the light emission of the light emitting unit or during the light emission of the light emitting unit. Fluorescence detection unit.
  • a reaction detection apparatus comprising: the fluorescence detection unit according to (1) or (2) described above; and a driving liquid pump that injects a driving liquid into a flow path of the microchip.
  • a fluorescence detection unit that can obtain a stable measurement value and obtain an accurate measurement result
  • a reaction detection device that can obtain an accurate measurement result by including the fluorescence detection unit. Can be obtained.
  • FIG. 1 is an external view showing an example of a reaction detection device 80 according to the present embodiment.
  • the reaction detection device 80 is a device that automatically detects a reaction between a sample previously injected into the microchip 1 and a reagent, and displays a test result on the display unit 84.
  • the housing 82 of the reaction detection device 80 has an insertion port 83, and the microchip 1 is inserted into the insertion port 83 and set inside the housing 82.
  • the insertion port 83 is sufficiently higher than the thickness of the microchip 1 so as not to contact the insertion port 83 when the microchip 1 is inserted.
  • Reference numeral 85 denotes a memory card slot
  • 86 denotes a print output port
  • 87 denotes an operation unit
  • 88 denotes an input / output terminal.
  • the person in charge of inspection inserts the microchip 1 in the direction of the arrow in FIG. 1 and operates the operation unit 87 to start the inspection. Inside the reaction detector 80, the reaction in the microchip 1 is automatically inspected, and when the inspection is completed, the result is displayed on the display unit 84 constituted by a liquid crystal panel or the like.
  • the inspection result can be output from the print output port 86 or stored in a memory card inserted in the memory card slot 85 by operating the operation unit 87. Further, the data can be output from the external input / output terminal 88 using, for example, a LAN cable and stored in a personal computer or the like.
  • the window 111 in FIG. 2A is provided for optically detecting the reaction between the specimen and the reagent containing the fluorescent substance performed by the detection unit 19 inside the microchip 1, and is a transparent member such as glass or resin. It consists of Reference numerals 110a, 110b, 110c, 110d, and 110e denote driving liquid injection units that communicate with the internal fine flow paths. The driving liquids are injected from the respective driving liquid injection units 110a to 110e to drive the internal reagents and the like.
  • Reference numeral 113 denotes a sample injection unit for injecting a sample into the microchip 1.
  • the microchip 1 includes a groove forming substrate 108 and a covering substrate 109 that covers the groove forming substrate 108.
  • the detection unit 19 optically detects a fluorescent substance, at least a portion corresponding to the window 111 uses a light-transmitting material (for example, alkali glass, quartz glass, transparent plastics), Light is transmitted.
  • a light-transmitting material for example, alkali glass, quartz glass, transparent plastics
  • a minute groove-like flow path (fine flow path) and a functional component (flow path element) for performing inspection, sample processing, and the like are suitable for the application. Are arranged in such a manner.
  • FIG. 2 (c) is an explanatory diagram for explaining the functions of the micro flow channel and the flow channel element inside the microchip 1.
  • a sample storage unit 121 that stores a sample liquid
  • reagent storage units 120a, 120b, and 120c that store reagents are provided in the microchannel, so that a rapid test can be performed regardless of location or time.
  • Necessary reagents, a cleaning solution, a denaturing solution, and the like are stored in advance in the reagent storage units 120a to 120c.
  • the reagent storage units 120a to 120c, the sample storage unit 121, and the flow path element are represented by squares, and the fine flow path therebetween is represented by a solid line and an arrow.
  • the fine channel is formed on the order of micrometers, for example, the width is several ⁇ m to several hundred ⁇ m, preferably 10 to 200 ⁇ m, and the depth is about 25 to 500 ⁇ m, preferably 25 to 250 ⁇ m.
  • the above-described fine flow path is formed.
  • the coated substrate 109 needs to cover at least the fine flow path of the groove forming substrate in close contact, and may cover the entire surface of the groove forming substrate.
  • the microchannel 1 is provided with a part for controlling liquid feeding, such as a liquid feeding control unit (not shown), a backflow prevention unit (a check valve, an active valve, etc.), and the like. In this case, liquid feeding is performed according to a predetermined procedure.
  • the driving liquid injected from the driving liquid injection unit 110b pushes out the reagent containing the fluorescent substance stored in the reagent storage unit 120a through the communicating fine channel.
  • the reagent containing the fluorescent material pushed out from the reagent storage unit 120a is sent to the amplification unit 122 by the driving liquid.
  • the solution containing the sample after reaction sent out from the amplification unit 122 by the driving liquid reaches the detection unit 19.
  • the detection unit 19 By irradiating the detection unit 19 with excitation light from the window 111, the reagent that has reacted with the specimen emits fluorescence, and the reaction result can be measured by measuring the amount of fluorescence.
  • FIG. 3 is a perspective view showing an example of the internal configuration of the reaction detection device 80 according to the present embodiment.
  • FIG. 4 is a cross-sectional view showing an example of the internal configuration of the reaction detection device 80 according to the present embodiment. is there.
  • the reaction detection device 80 includes a temperature adjustment unit 152, a fluorescence detection unit 15, a driving liquid pump 92, a packing 90, a driving liquid tank 91, and the like.
  • 3 and 4 show a state in which the microchip 1 is in close contact with the temperature adjustment unit 152 and the packing 90b.
  • the embodiment will be described with reference to FIGS. 3 and 4.
  • the temperature control unit 152 and the microchip 1 are driven by a driving member (not shown) and can move in the vertical direction on the paper surface.
  • the temperature adjustment unit 152 is raised from the state of FIG. 3 by the thickness of the microchip 1 by the driving member.
  • the person in charge of inspection inserts the microchip 1 in the direction of arrow A until it comes into contact with a regulating member (not shown) from the insertion port.
  • the chip detection unit 95 using a photo interrupter or the like detects the microchip 1 and starts operation.
  • the temperature adjustment unit 152 is a unit that incorporates a Peltier element, a power supply device, a temperature control device, and the like and adjusts the surface of the microchip 1 to a predetermined temperature by generating heat or absorbing heat.
  • the temperature adjustment unit 152 and the microchip 1 are lowered by the driving member, and the microchip 1 is brought into close contact with the temperature adjustment unit 152 and the packing 90b to be in the illustrated state.
  • the driving liquid pump 92 is driven, and the driving liquid in the driving liquid tank 91 is sequentially allowed to flow into the microchip 1.
  • the reagent including the fluorescent material accommodated in the reagent accommodating portion disposed in the fine flow path of the microchip 1 is pushed out.
  • the sample solution containing the reagent and the specimen sent out from the amplification unit by the driving liquid reaches the detection unit 19.
  • the sample arrival detection unit includes, for example, a light emitting unit 17a composed of an LED that emits light of a predetermined wavelength, and a light receiving unit 17b that receives light from the light emitting unit 17a, and sandwiches the microchip 1 as illustrated. Is arranged in.
  • the microchip 1 at a position corresponding to the sample arrival detection unit is formed with a translucent window 29 so that light can pass through the front and back.
  • the position of the window 29 is disposed on the flow channel immediately before or immediately after communicating with the detection unit 19. Note that the window 111 of the detection unit 19 may be shared.
  • the sample arrival detection unit emits light from the light emitting unit 17a for a predetermined time every predetermined time during the injection of the driving liquid, and light received through the window 29 of the microchip 1 is received by the light receiving unit 17b.
  • the amount of transmitted light is detected.
  • the amount of transmitted light that is, the amount of light received by the light receiver 17b changes, and can be detected.
  • the operation of the fluorescence detection unit 15 according to the present embodiment is started after a lapse of a predetermined time after the sample arrival detection unit detects the presence of the sample solution. By doing so, unnecessary operation of the fluorescence detection unit when the sample solution has not reached the detection unit 19 can be prevented, waste of performing unnecessary measurement can be eliminated, and the reaction detection apparatus can be saved in power. Is possible.
  • FIG. 5 is a cross-sectional view showing an example of the configuration of the fluorescence detection unit 15 according to the present embodiment.
  • a lens 155 that collects the fluorescence, an excitation light cut filter 156 that blocks the excitation light and transmits the fluorescence emitted by the fluorescent material, and a light receiving unit 161 that converts the fluorescence into an electric signal are placed on an optical axis L perpendicular to the microchip 1. Are arranged along. A photodiode or the like is used for the light receiving unit 161.
  • the light emitting unit 160 that emits the excitation light, the slit 157 that restricts the luminous flux of the excitation light, and the lens 158 that collects the excitation light are arranged along the optical axis M. Excitation light emitted from the light emitting unit 160 enters the lens 158 through the slit 157, is condensed by the lens 158, and is applied to the sample of the detection unit 19 from an oblique angle.
  • the fluorescent substance in the detection unit 19 emits fluorescence by the excitation light emitted from the light emitting unit 160, and the light quantity is detected and measured by receiving the fluorescence by the light receiving unit 161.
  • the control unit 99 includes a CPU 98 (central processing unit), a RAM 97 (Random Access Memory), a ROM 96 (Read Only Memory), and the like. Each part of the reaction detector 80 is centrally controlled according to the program.
  • the chip detection unit 95 transmits a detection signal to the CPU 98 when the microchip 1 comes into contact with the regulating member.
  • the CPU 98 receives the detection signal, it instructs the mechanism driving unit 32 to lower or raise the microchip 1 according to a predetermined procedure.
  • the driving liquid pump 92 drives the piezoelectric element to inject a predetermined amount of driving liquid into the microchip.
  • the pump drive controller 412 controls the operation of the drive fluid pump 92 so as to inject a predetermined amount of drive fluid based on the program.
  • the CPU 98 performs inspection in a predetermined sequence and stores the inspection result in the RAM 97.
  • the light amount calculation unit 410 calculates the light amount of the fluorescence from the electrical signal output from the light receiving unit 161 and uses it as the inspection result.
  • the inspection result can be stored in the memory card 501 by the operation of the operation unit 87 or printed by the printer 503.
  • FIG. 7 is a flowchart showing an outline of the operation of the reaction detection device 80 according to the present embodiment
  • FIG. 8 is a flowchart showing an outline of the operation of the fluorescence detection unit 15 according to the present embodiment.
  • description will be made based on the flow shown in FIGS.
  • the reaction detection apparatus waits for the microchip to be inserted (step S101).
  • step S101 the temperature adjustment unit and the packing are brought into close contact with the microchip by the driving member (step S102).
  • step S103 driving of the driving fluid pump is started.
  • the driving liquid pushes the sample stored in the sample storage unit through the communicating fine flow path, and sends the sample to the amplification unit.
  • the driving liquid injected from the driving liquid injection section pushes out the reagent containing the fluorescent substance stored in the reagent storage section through the communicating fine flow path, and is sent to the amplification section by the driving liquid.
  • the sample arrival detection unit (the light emitting unit 17a and the light receiving unit 17b shown in FIGS. 3 and 4) starts detection, and whether or not the sample solution has reached the detection unit that detects the reaction. Is monitored (step S104).
  • the sample arrival detection unit detects the presence of the sample solution (step S104; Yes)
  • measurement of the amount of fluorescence by the fluorescence detection unit according to the present embodiment, that is, the fluorescence detection operation is started after a predetermined time has elapsed (step S104).
  • this time T2 is the fluorescence detection time by the light receiving unit of the fluorescence detection unit, and the reaction result is measured by measuring the light amount of the fluorescence from the reagent that has reacted with the specimen by the light receiving unit.
  • step S209 When the preset number of times of fluorescence detection is completed (step S209; Yes), the fluorescence detection operation by the fluorescence detection unit (step S105 shown in FIG. 7) is completed.
  • FIG. 9 is a time chart showing the flow of the fluorescence detection operation of the fluorescence detection unit 15 described in FIG.
  • the reagent that has reacted with the specimen starts to fluoresce and then becomes stable.
  • the light receiving unit (the light receiving unit 161 shown in FIG. 5) is set so that the light emission starts after the fluorescence emission becomes stable. That is, the time T1 is set to a time longer than the time until the amount of fluorescent light emitted by the irradiation of the excitation light from the light emitting unit is stabilized. Further, the detection of light received by the light receiving unit is stopped after the time T2, and then the emission of the excitation light by the light emitting unit, that is, the irradiation is stopped after the time T3 has elapsed.
  • the next fluorescence detection operation is started after the elapse of time T4.
  • the fluorescence from the reagent that has reacted with the sample is not emitted. That is, the time T4 is set to a time longer than the time until the fluorescence is not emitted after the excitation light irradiation is stopped.
  • the times T1, T2, T3, and T4 can be individually set by input from the operation unit 87 (see FIG. 1), and an appropriate time can be set depending on the type of specimen and the content of the examination. It can be done. Further, it is desirable to set at least time (T1 + T2) so as not to cause fluorescence fading, and it is more preferable that time (T1 + T2 + T3) is set to an extent at which fluorescence fading does not occur.
  • the light reception detection of the light receiving unit is started, the light reception detection of the light receiving unit is stopped during the light emission of the light emitting unit, and then the light emission of the light emitting unit is stopped.
  • the stability of the detection value obtained can be improved, and the reliability of measurement, that is, inspection can be improved.
  • the reliability of inspection is further improved even if the reaction tends to cause fluorescence fading. be able to.
  • FIG. 10 is a diagram illustrating an example of sampling of the received light detection value obtained by the light receiving unit at time T2.
  • the received light detection value obtained by the light receiving unit may not be a constant value because various noises are superimposed. For this reason, if output such as display is performed using only data of a single received light detection value, the inspection accuracy may be reduced.
  • sampling is performed a plurality of times (in the figure, S1 to S6) at predetermined intervals, for example, (S1 + S2 + S3) / 3, (S2 + S3 + S4) / 3, (S3 + S4 + S5) / 3, ( S4 + S5 + S6) / 3 is calculated, and the average value of the four values obtained is calculated, and the received light detection value from the light receiving unit is subjected to moving average processing, and the display is output based on the result after the moving average processing. It is preferable to be configured to perform. By doing in this way, the S / N ratio of the received light detection value can be improved, and the reliability of inspection can be further improved.
  • the light reception detection value gradually decreases with respect to the time axis, for example, the excitation light irradiation power from the light emitting unit is reduced, the time during which the light emitting unit emits light (T1 + T2 + T3) is shortened, and the time T4 described above is used.
  • the measurement is started so that at least one of the change is made to be longer, and it is confirmed that the amount of change with respect to the time axis has become a predetermined value or less.
  • the light reception detection value gradually increases with respect to the time axis, for example, at least one of increasing the excitation light irradiation power from the light emitting unit and changing the time (T1) to be longer is performed. After confirming that the amount of change with respect to is less than a predetermined value, the main measurement is started.
  • the setting of the above-mentioned times T1 to T4 is somewhat inappropriate, and when the fluorescent fading occurs or the time setting is such that measurement is performed in a state where the reaction is not stable Even so, the setting for measurement can be automatically set to an appropriate value, and a reaction detection device with improved test reliability can be obtained.
  • FIG. 11 is a flowchart showing a modified example of the schematic operation of the fluorescence detection unit according to the present embodiment.
  • FIG. 12 is a timing chart showing the flow of the fluorescence detection operation of the fluorescence detection unit shown in FIG.
  • the outline of the operation of the reaction detector 80 is the same as that shown in FIG.
  • FIG. 11 is a modification of the fluorescence detection operation by the fluorescence detection unit 15 in step S105 of the flowchart shown in FIG.
  • step S301 irradiation of excitation light from the light emitting unit (light emitting unit 160 shown in FIG. 5) is started (step S301). Then, it waits for the elapse of a preset time T1 from the start of excitation light irradiation (step S302). When the time T1 elapses (step S302; Yes), detection of fluorescence reception by the light receiving unit (the light receiving unit 161 shown in FIG. 5) is started (step S303). Next, it waits for a preset time T2 to elapse after the light reception detection of the fluorescence by the light receiving unit is started (step S304).
  • step S304 When the time T2 has elapsed (step S304; Yes), as shown in FIG. 12, the detection of fluorescence received by the light receiving unit and the irradiation of excitation light by the light emitting unit are stopped simultaneously (step S305).
  • step S306 it waits for the elapse of a preset time T4 after the detection of the fluorescence of the light receiving unit and the irradiation of the excitation light by the light emitting unit are stopped (step S306).
  • step S306 it is determined whether or not a predetermined number of fluorescence detections have been completed (step S307).
  • step S307 it is not the preset number of times (step S307; No)
  • step S301 to S306 are repeated.
  • step S307 When the preset number of times of fluorescence detection ends (step S307; Yes), the fluorescence detection operation by the fluorescence detection unit (step S105 shown in FIG. 7) ends.
  • the received light detection value which is the obtained light receiving unit output
  • a moving average process step S106
  • data such as display is displayed using the data after the moving average process.
  • Output step S107
  • the same effect as described above can be obtained by measuring the amount of fluorescent light in a sequence in which the detection of light reception by the light receiving unit is stopped simultaneously with the stop of light emission by the light emitting unit.

Abstract

　測定値が安定し、正確な測定結果の得られる蛍光検出ユニットを得ること及び、該蛍光検出ユニットを備えることにより、測定値が安定し、正確な測定結果の得られる反応検出装置を得るために、試料に励起光を照射する発光部と、励起光の照射により試料から発する蛍光を受光検出する受光部と、を有する蛍光検出ユニットにおいて、発光部の発光開始の後、受光部の受光検出を開始させ、受光部の受光検出の停止を、発光部の発光の停止と同時もしくは、発光部の発光中に行うシーケンスで蛍光の光量の測定を行う蛍光検出ユニットとする。

Description

蛍光検出ユニット及び反応検出装置
　本発明は、蛍光検出ユニット及び該蛍光検出ユニットを有する反応検出装置に関するものである。
　近年、マイクロマシン技術および超微細加工技術を駆使することにより、従来の試料調製、化学分析、化学合成などを行うための装置、手段（例えばポンプ、バルブ、流路、センサなど）を微細化して１チップ上に集積化したシステムが開発されている。これは、μ－ＴＡＳ（Ｍｉｃｒｏ　ｔｏｔａｌ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ：マイクロ総合分析システム）、バイオリアクタ、ラブ・オン・チップ（Ｌａｂ－ｏｎ－ｃｈｉｐｓ）、バイオチップとも呼ばれ、医療検査・診断分野、環境測定分野、農産製造分野でその応用が期待されている。現実には遺伝子検査に見られるように、煩雑な工程、熟練した手技、機器類の操作が必要とされる場合には、自動化、高速化および簡便化されたミクロ化分析システムは、コスト、必要試料量、所要時間のみならず、時間および場所を選ばない分析を可能とすることによる恩恵は多大と言える。
　また、微細流路が形成されたマイクロチップに試薬などを封入し、マイクロポンプによって微細流路に液体を注入して試薬などを移動させ、反応部、次いで検出部へ流すことにより、血液など検体との反応結果を測定することができる反応検出装置も知られている。このような反応検出装置では、マイクロチップの被検出部に蛍光検出ユニットの発光部から励起光を照射し、試薬に含まれる蛍光物質の発光する非常に微弱な蛍光を蛍光検出ユニットの受光部で検出するように構成されている。
　一方、蛍光の測定のために、発光部と試料の間と試料と受光部の間に機械的なチョッパを配置し、励起光の照射中は蛍光の受光を行わせず、励起光の遮断中に蛍光の受光を行わせる蛍光測定装置が知られている（例えば、特許文献１参照）。
特開２００３－２０７４５３号公報
　しかしながら、上記特許文献１に記載されている蛍光測定装置では、試料への励起光照射と蛍光測定に重複する時間がないため、受光量の測定値は、励起光照射停止後の過渡的な蛍光状態の変化を測定することになる。過渡的な状態では測定値が安定性に欠ける問題があり、測定結果に正確性が求められる上記の応用分野に対して適用が困難である。
　同様の理由で、励起光に対し反応変化の早い試料であった場合、励起光照射の時間帯と蛍光測定の時間帯が異なると蛍光の検出ができない問題となる。
　本発明は上記問題に鑑み、測定値が安定し、正確な測定結果の得られる蛍光検出ユニットを得ること及び、該蛍光検出ユニットを備えることにより、測定値が安定し、正確な測定結果の得られる反応検出装置を得ることを目的とするものである。
　上記の目的は、下記構成により解決される。
　（１）試料に励起光を照射する発光部と、前記励起光の照射により前記試料から発する蛍光を受光検出する受光部と、を有する蛍光検出ユニットにおいて、前記発光部の発光開始の後、前記受光部の受光検出を開始させ、前記受光部の受光検出の停止を、前記発光部の発光の停止と同時もしくは、前記発光部の発光中に行うシーケンスで蛍光の光量の測定を行うことを特徴とする蛍光検出ユニット。
　（２）前記シーケンスを複数回繰り返すことを特徴とする前記（１）に記載の蛍光検出ユニット。
　（３）試料の混合、反応、検出が行われる流路の形成されたマイクロチップを収容するマイクロチップ収容部と、該マイクロチップ収容部に収容されたマイクロチップの被検出部に対応して設けられた前記（１）又は前記（２）に記載の蛍光検出ユニットと、前記マイクロチップの流路に駆動液を注入する駆動液ポンプと、を有することを特徴とする反応検出装置。
　（４）前記蛍光検出ユニットの受光部の受光範囲内に試料が存在するか否かを検知する試料到達検知部を有し、該試料到達検知部により試料の存在を検知した後に、前記蛍光検出ユニットの発光部の発光を開始させることを特徴とする前記（３）に記載の反応検出装置。
　（５）前記受光部の受光検出値を移動平均処理することを特徴とする前記（３）又は前記（４）に記載の反応検出装置。
　（６）前記受光部の受光検出値が時間軸に対し漸減もしくは漸増しているとみなした場合には、予め決められた対処法に基づいて測定を行うことを特徴とする前記（３）から前記（５）までの何れかに記載の反応検出装置。
　本発明によれば、安定した測定値が得られ、正確な測定結果の得られる蛍光検出ユニットを得ることが可能となり、当該蛍光検出ユニットを備えることで、正確な測定結果の得られる反応検出装置を得ることが可能となる。
本実施の形態に係る反応検出装置の一例を示す外観図である。 マイクロチップの一例の外観図である。 本実施の形態に係る反応検出装置の内部構成の一例を示す斜視図である。 本実施の形態に係る反応検出装置の内部構成の一例を示す断面図である。 本実施の形態に係る蛍光検出ユニットの構成の一例を示す断面図である。 本実施の形態に係る反応検出装置の構成を示すブロック図である。 本実施の形態に係る反応検出装置の動作の概要を示すフローチャートである。 本実施の形態に係る蛍光検出ユニットの動作概略を示すフローチャートである。 図８で説明した蛍光検出ユニットの蛍光検出動作のフローをタイミングチャートで示した図である。 時間Ｔ２に受光部で得られた蛍光の受光量の値のサンプリングの一例を示す図である。 本実施の形態に係る蛍光検出ユニットの動作概略の変形例を示すフローチャートである。 図１１で説明した蛍光検出ユニットの蛍光検出動作のフローをタイミングチャートで示した図である。
符号の説明
　１　マイクロチップ
　１５　蛍光検出ユニット
　１７ａ　発光部（試料到達検知部）
　１７ｂ　受光部（試料到達検知部）
　１９　検出部
　８０　反応検出装置
　９１　駆動液タンク
　９２　駆動液ポンプ
　１６０　発光部（蛍光検出ユニット）
　１６１　受光部（蛍光検出ユニット）
　以下、実施の形態により本発明を詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
　図１は、本実施の形態に係る反応検出装置８０の一例を示す外観図である。
　反応検出装置８０はマイクロチップ１に予め注入された検体と、試薬との反応を自動的に検出し、表示部８４に検査結果の表示等を行う装置である。
　反応検出装置８０の筐体８２には挿入口８３があり、マイクロチップ１を挿入口８３に差し込んで筐体８２の内部にセットするようになっている。なお、挿入口８３はマイクロチップ１の挿入時に挿入口８３に接触しないように、マイクロチップ１の厚みより十分高さがある。８５はメモリカードスロット、８６はプリント出力口、８７は操作部、８８は入出力端子である。
　検査担当者は図１の矢印方向にマイクロチップ１を挿入し、操作部８７を操作して検査を開始させる。反応検出装置８０の内部では、マイクロチップ１内の反応の検査が自動的に行われ、検査が終了すると液晶パネルなどで構成される表示部８４に結果が表示される。検査結果は操作部８７の操作により、プリント出力口８６よりプリントを出力したり、メモリカードスロット８５に挿入されたメモリカードに記憶することができる。また、外部入出力端子８８から例えばＬＡＮケーブル等を使って出力し、パソコンなどにデータを保存することもできる。
　次に、本実施の形態に係るマイクロチップ１の一例について説明する。
　図２（ａ）、図２（ｂ）はマイクロチップ１の一例の外観図である。図２（ａ）において矢印は、反応検出装置８０にマイクロチップ１を挿入する挿入方向であり、図２（ａ）は挿入時にマイクロチップ１の下面となる面を図示している。図２（ｂ）はマイクロチップ１の側面図である。
　図２（ａ）の窓１１１はマイクロチップ１内部の検出部１９で行われる検体と蛍光物質を含む試薬の反応を光学的に検出するために設けられており、ガラスや樹脂などの透明な部材で構成されている。１１０ａ、１１０ｂ、１１０ｃ、１１０ｄ、１１０ｅは内部の微細流路に連通する駆動液注入部であり、各駆動液注入部１１０ａ～１１０ｅから駆動液を注入し内部の試薬等を駆動する。１１３はマイクロチップ１に検体を注入するための検体注入部である。
　図２（ｂ）に示すように、マイクロチップ１は溝形成基板１０８と、溝形成基板１０８を覆う被覆基板１０９から構成されている。
　本実施の形態では、検出部１９において、蛍光物質の検出を光学的に行うので、少なくとも窓１１１に相当する部位は光透過性の材料（例えばアルカリガラス、石英ガラス、透明プラスチック類）を用い、光が透過するようになっている。
　本実施の形態に係るマイクロチップ１には、検査、試料の処理などを行うための、微小な溝状の流路（微細流路）および機能部品（流路エレメント）が、用途に応じた適当な態様で配設されている。
　図２（ｃ）はマイクロチップ１内部の微細流路および流路エレメントの機能を説明するための説明図である。
　微細流路には、例えば検体液を収容する検体収容部１２１、試薬類を収容する試薬収容部１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃなどが設けられており、場所や時間を問わず迅速に検査ができるよう、試薬収容部１２０ａ～１２０ｃには必要とされる試薬類、洗浄液、変性処理液などがあらかじめ収容されている。図２（ｃ）において、試薬収容部１２０ａ～１２０ｃ、検体収容部１２１および流路エレメントは四角形で表し、その間の微細流路は実線と矢印で表す。
　微細流路はマイクロメーターオーダーで形成されており、例えば幅は数μｍ～数百μｍ、好ましくは１０～２００μｍで、深さは２５～５００μｍ程度、好ましくは２５～２５０μｍである。
　少なくともマイクロチップ１の溝形成基板１０８には、上記の微細流路が形成されている。被覆基板１０９は、少なくとも溝形成基板の微細流路を密着して覆う必要があり、溝形成基板の全面を覆っていても良い。なお、マイクロチップ１の微細流路には、例えば、図示せぬ送液制御部、逆流防止部（逆止弁、能動弁など）などの送液を制御するための部位が設けられ、逆流を防止し、所定の手順で送液が行われるようになっている。
　検体注入部１１３はマイクロチップ１に検体を注入するための注入部であり、駆動液注入部１１０はマイクロチップ１に駆動液を注入するための注入部である。マイクロチップ１による検査を行うに先立って、検査担当者は検体を検体注入部１１３から注射器などを用いて注入する。図２（ｃ）に示すように、検体注入部１１３から注入された検体は、連通する微細流路を通って検体収容部１２１に収容される。
　次に、駆動液注入部１１０ａから駆動液を注入すると、駆動液は連通する微細流路を通って検体収容部１２１に収容されている検体を押し出し、増幅部１２２に検体を送り込む。
　一方、駆動液注入部１１０ｂから注入された駆動液は、連通する微細流路を通って試薬収容部１２０ａに収容されている蛍光物質を含む試薬を押し出す。試薬収容部１２０ａから押し出された蛍光物質を含む試薬は増幅部１２２に駆動液によって送り込まれる。なお、反応条件により増幅部１２２の部分を所定の温度にする必要がある場合は、加熱または吸熱して所定の温度になされる。
　所定の反応時間の後、さらに駆動液により増幅部１２２から送り出された反応後の検体を含む溶液は、検出部１９に到達する。窓１１１から検出部１９に励起光を照射し、検体と反応した試薬が蛍光を発光し、この蛍光の光量を測定することにより反応結果を計測することができる。
　図３は、本実施の形態に係る反応検出装置８０の内部構成の一例を示す斜視図であり、図４は、本実施の形態に係る反応検出装置８０の内部構成の一例を示す断面図である。
　反応検出装置８０は、温度調節ユニット１５２、蛍光検出ユニット１５、駆動液ポンプ９２、パッキン９０、駆動液タンク９１などから構成されている。図３、図４はマイクロチップ１を温度調節ユニット１５２とパッキン９０ｂに密着させている状態である。以下、図３、図４を用いて実施形態を説明する。
　温度調節ユニット１５２とマイクロチップ１は、図示せぬ駆動部材により駆動され、紙面上下方向に移動可能である。初期状態において、駆動部材により温度調節ユニット１５２を、図３の状態からマイクロチップ１の厚み以上上昇させる。検査担当者は挿入口から図示せぬ規制部材に当接するまでマイクロチップ１を矢印Ａ方向に挿入する。所定の位置までマイクロチップ１を挿入するとフォトインタラプタなどを用いたチップ検知部９５がマイクロチップ１を検知し、動作を開始する。
　温度調節ユニット１５２は、ペルチェ素子、電源装置、温度制御装置などを内蔵し、発熱または吸熱を行ってマイクロチップ１の面を所定の温度に調整するユニットである。
　次に、駆動部材により温度調節ユニット１５２とマイクロチップ１を下降させて、マイクロチップ１を温度調節ユニット１５２とパッキン９０ｂに密着させ図示の状態となる。
　次いで、駆動液ポンプ９２を駆動し、駆動液タンク９１の駆動液をマイクロチップ１へ順次流入させる。これにより、図２で説明したようにマイクロチップ１の微細流路に配置された試薬収容部に収容されている蛍光物質を含む試薬の押し出し等が行われる。
　さらに、駆動液により増幅部から送り出された試薬及び検体を含む試料の溶液は、検出部１９に到達する。
　この試薬及び検体を含む試料の溶液が、検出部１９に到達したか否かは、試料到達検知部（１７ａ、１７ｂ）により検知される。試料到達検知部は、例えば所定の波長の光を発光するＬＥＤ等で構成された発光部１７ａと、発光部１７ａの光を受光する受光部１７ｂで構成され、図示の如く、マイクロチップ１を挟んで配置されている。試料到達検知部に対応する位置のマイクロチップ１は、光が表裏で通過できるよう透光性の窓２９を有して形成されている。この窓２９の位置は、検出部１９に連通する直前又は直後の流路上に配置されている。なお、検出部１９の窓１１１を共用してもよい。
　試料到達検知部は、駆動液の注入中の所定の時間毎に、発光部１７ａより所定時間、光を発光させ、マイクロチップ１の窓２９を透過した光を受光部１７ｂで受光させることで、透過光量を検知する。検出部１９に試料の溶液が到達した場合には、透過光量即ち受光部１７ｂの受光光量が変化し、検知することができる。
　試料到達検知部が、試料の溶液の存在を検知した後に、所定の時間経過後に本実施の形態に係る蛍光検出ユニット１５の動作が開始されるようになっている。このようにすることで、検出部１９に試料の溶液が未到達である場合の蛍光検出ユニットの不要な動作を防止でき、不要な測定をおこなう無駄を排除できると共に反応検出装置を省電化することが可能となる。
　図５は、本実施の形態に係る蛍光検出ユニット１５の構成の一例を示す断面図である。
　蛍光を集光するレンズ１５５、励起光を遮断し蛍光物質の発光する蛍光を透過する励起光カットフィルタ１５６と、蛍光を電気信号に変換する受光部１６１はマイクロチップ１に鉛直な光軸Ｌに沿って配置されている。受光部１６１にはフォトダイオードなどが用いられる。
　一方、励起光を発光する発光部１６０、励起光の光束を制限するスリット１５７、励起光を集光するレンズ１５８は光軸Ｍに沿って配置されている。発光部１６０から照射される励起光は、スリット１５７を介してレンズ１５８に入射し、レンズ１５８で集光されて、斜めの角度から検出部１９の試料に照射される。
　検出部１９の蛍光物質は発光部１６０から照射される励起光により蛍光を発光し、この蛍光を受光部１６１により受光することで蛍光の光量が検出測定される。
　図６は、本実施の形態に係る反応検出装置８０の構成を示すブロック図である。
　制御部９９は、ＣＰＵ９８（中央処理装置）とＲＡＭ９７（Ｒａｎｄｏｍ　Ａｃｃｅｓｓ　Ｍｅｍｏｒｙ）、ＲＯＭ９６（Ｒｅａｄ　Ｏｎｌｙ　Ｍｅｍｏｒｙ）等から構成され、不揮発性の記憶部であるＲＯＭ９６に記憶されているプログラムをＲＡＭ９７に読み出し、当該プログラムに従って反応検出装置８０の各部を集中制御する。
　以下、いままでに説明した機能と同一機能を有する機能ブロックには同符号を付与し、説明を省略する。
　チップ検知部９５はマイクロチップ１が規制部材に当接すると検知信号をＣＰＵ９８に送信する。ＣＰＵ９８は検知信号を受信すると、機構駆動部３２に指令し所定の手順でマイクロチップ１を下降または上昇させる。
　駆動液ポンプ９２は圧電素子を駆動して所定量の駆動液をマイクロチップに注入する。ポンプ駆動制御部４１２はプログラムに基づいて、所定量の駆動液を注入するように駆動液ポンプ９２の動作を制御する。
　ＣＰＵ９８は所定のシーケンスで検査を行い、検査結果をＲＡＭ９７に記憶する。光量算出部４１０は受光部１６１の出力する電気信号から蛍光の光量を算出し検査結果とする。検査結果は、操作部８７の操作によりメモリカード５０１に記憶したり、プリンタ５０３によってプリントすることができる。
　図７は、本実施の形態に係る反応検出装置８０の動作の概要を示すフローチャートであり、図８は、本実施の形態に係る蛍光検出ユニット１５の動作概略を示すフローチャートである。以下、図７及び図８に示すフローに基づいて説明する。
　まず、図７に示すように、反応検出装置はマイクロチップが挿入されるのを待機する（ステップＳ１０１）。マイクロチップが所定の位置まで挿入されたことを検知（ステップＳ１０１；Ｙｅｓ）すると、マイクロチップに温度調節ユニットとパッキンとを駆動部材により密着させる（ステップＳ１０２）。
　次いで、駆動液ポンプの駆動を開始させる（ステップＳ１０３）。
　これにより、駆動液は順次マイクロチップ内に流入させられる。上述のように、駆動液は連通する微細流路を通って検体収容部に収容されている検体を押し出し、増幅部に検体を送り込む。一方、駆動液注入部から注入された駆動液は、連通する微細流路を通って試薬収容部に収容されている蛍光物質を含む試薬を押し出し、増幅部に駆動液によって送り込まれる。なお、反応条件により増幅部の部分を所定の温度にする必要がある場合は、加熱または吸熱して所定の温度になされる。
　駆動液ポンプの駆動開始後、試料到達検知部（図３、図４に示す発光部１７ａ及び受光部１７ｂ）は検知を開始し、試料の溶液が、反応を検出する検出部に到達したか否かを監視する（ステップＳ１０４）。試料到達検知部が試料の溶液の存在を検知すると（ステップＳ１０４；Ｙｅｓ）、所定の時間経過後に本実施の形態に係る蛍光検出ユニットによる蛍光の光量の測定すなわち蛍光検出動作が開始される（ステップＳ１０５）。
　このステップＳ１０５の蛍光検出ユニット１５による蛍光検出動作について、図８のフローチャートを用いて、より詳しく説明する。
　図８に示すように、ステップＳ１０５（図７）における蛍光検出ユニット１５による蛍光検出動作は、まず、発光部（図５に示す発光部１６０）からの励起光の照射を開始（ステップＳ２０１）し、励起光の照射を開始してから予め設定されている時間Ｔ１が経過するのを待機する（ステップＳ２０２）。時間Ｔ１が経過する（ステップＳ２０２；Ｙｅｓ）と、受光部（図５に示す受光部１６１）による蛍光の受光検出を開始する（ステップＳ２０３）。次いで、受光部による蛍光の受光検出を開始してから予め設定されている時間Ｔ２が経過するのを待機する（ステップＳ２０４）。
　時間Ｔ２が経過する（ステップＳ２０４；Ｙｅｓ）と、受光部による蛍光の受光検出を停止させる（ステップＳ２０５）。即ち、この時間Ｔ２が、蛍光検出ユニットの受光部による蛍光検出時間であり、検体と反応した試薬からの蛍光の光量を受光部で測定することにより反応結果が計測される。
　次いで、受光部の蛍光の受光検出を停止させてから予め設定されている時間Ｔ３が経過するのを待機する（ステップＳ２０６）。時間Ｔ３が経過する（ステップＳ２０６；Ｙｅｓ）と、発光部による励起光の照射を停止させる（ステップＳ２０７）。これにより、１回の蛍光検出が終了する。
　次いで、発光部の励起光照射を停止させてから予め設定されている時間Ｔ４が経過するのを待機し（ステップＳ２０８）、時間Ｔ４が経過する（ステップＳ２０８；Ｙｅｓ）と、予め設定された回数の蛍光検出が終了したか否か判断する（ステップＳ２０９）。予め設定された回数でないとき（ステップＳ２０９；Ｎｏ）は、上記のステップＳ２０１～ステップＳ２０８を繰り返す。
　予め設定された回数の蛍光検出が終了する（ステップＳ２０９；Ｙｅｓ）と、蛍光検出ユニットによる蛍光検出動作（図７に示すステップＳ１０５）が終了する。
　図７に戻り、蛍光検出ユニットによる蛍光検出動作が終了すると、得られた受光部出力である受光検出値を移動平均処理（ステップＳ１０６）し、この移動平均処理後のデータを用いて表示等の出力（ステップＳ１０７）がなされる。これにより、反応検出装置８０の動作が終了する。
　図９は、図８で説明した蛍光検出ユニット１５の蛍光検出動作のフローをタイムチャートで示した図である。
　同図に示すように、発光部（図５に示す発光部１６０）から励起光の照射を開始すると、図示の如く、検体と反応した試薬は蛍光を発し始め、その後安定した状態となる。受光部（図５に示す受光部１６１）は、蛍光の発光が安定した状態となって後に受光が開始されるよう設定されている。即ち、時間Ｔ１は、発光部からの励起光の照射により発する蛍光の光量が安定するまでの時間以上の時間に設定されている。さらに、受光部の受光検出を時間Ｔ２の間行った後停止させ、その後、時間Ｔ３経過後に発光部による励起光の発光すなわち照射を停止させている。
　一方、発光部を停止させた後、時間Ｔ４経過後に、次回の蛍光検出動作が開始されるが、この時は、検体と反応した試薬からの蛍光は発しない状態となっている。即ち、時間Ｔ４は、励起光照射を停止した後に蛍光を発しなくなるまでの時間以上の時間に設定されている。
　なお、上記の時間Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４は、操作部８７（図１参照）からの入力で個々に設定可能であり、検体の種類や検査の内容により適切な時間の設定を行うことができるようになっている。また、少なくとも時間（Ｔ１＋Ｔ２）では、蛍光退色を生じないように設定されることが望ましく、時間（Ｔ１＋Ｔ２＋Ｔ３）が蛍光退色を生じない程度に設定されていれば、より好ましい。
　このように、発光部の発光開始の後、受光部の受光検出を開始させ、発光部の発光中に受光部の受光検出を停止させ、この後、発光部の発光を停止させるシーケンスで蛍光の光量の測定を行うことにより蛍光退色等による蛍光の変化を抑制し、得られる検出値の安定性を向上させることができ、測定すなわち検査の信頼性を向上させることができる。更に、このようなシーケンスを複数回繰り返して行うことで、発する蛍光の光量が少ない反応や励起光の照射パワーを上げると蛍光退色の生じやすい反応であっても、より検査の信頼性を向上させることができる。
　図１０は、時間Ｔ２に受光部で得られる受光検出値のサンプリングの一例を示す図である。
　同図に示すように、受光部で得られる受光検出値は各種のノイズが重畳され一定値とはならない場合がある。このため単一の受光検出値のデータのみを用いて表示等の出力を行うと、検査精度が低下する恐れがある。
　そこで、同図に示すように、所定の刻みで複数回（同図では、Ｓ１～Ｓ６）のサンプリングを行い、例えば、（Ｓ１＋Ｓ２＋Ｓ３）／３、（Ｓ２＋Ｓ３＋Ｓ４）／３、（Ｓ３＋Ｓ４＋Ｓ５）／３、（Ｓ４＋Ｓ５＋Ｓ６）／３、を演算し、更に得られた４つの値の平均値とする方法等、受光部からの受光検出値を移動平均処理し、移動平均処理後の結果に基づいて表示等の出力を行うように構成することが好ましい。このようにすることで、受光検出値のＳ／Ｎ比を向上させることができ、より検査の信頼度を向上させることができる。
　また、サンプリングにおいて、受光部からの受光検出値が時間軸に対し漸減もしくは漸増していると見なされる場合は、これに対処する手順を、予めプログラミングしておき、これに基づいて測定を行うよう構成することが望ましい。以下、受光検出値が時間軸に対し漸減もしくは漸増し、その変化量が所定の値を越える場合の対処の手順の一例を示す。
　受光検出値が時間軸に対し漸減する場合には、例えば、発光部からの励起光照射パワーの低減、上記の発光部の発光している時間（Ｔ１＋Ｔ２＋Ｔ３）を短くするよう変更、上記の時間Ｔ４を長くするよう変更、の少なくとも何れかを行い、時間軸に対する変化量が所定の値以下となったことを確認した後、本測定を開始させるようにする。一方、受光検出値が時間軸に対し漸増する場合には、例えば、発光部からの励起光照射パワーの増大、上記の時間（Ｔ１）を長くするよう変更、の少なくとも何れかを行い、時間軸に対する変化量が所定の値以下となったことを確認した後、本測定を開始させるようにする。
　このようにすることで、上記の時間Ｔ１～Ｔ４の設定等が、やや適切でなく、蛍光退色が生じる場合や、反応が安定していない状態で測定を行うような時間設定となっている場合であっても、測定のための設定を自動的に適切な値とすることが可能となり、検査の信頼性を向上させた反応検出装置を得ることができる。
　図１１は、本実施の形態に係る蛍光検出ユニットの動作概略の変形例を示すフローチャートである。図１２は、図１１で示した蛍光検出ユニットの蛍光検出動作のフローをタイミングチャートで示した図である。なお、反応検出装置８０の動作の概要は図７に示したものと同様であるので省略する。
　図１１は、図７に示すフローチャートのステップＳ１０５の蛍光検出ユニット１５による蛍光検出動作の変形例である。
　図１１に示すように、ステップＳ１０５（図７）における蛍光検出ユニット１５による蛍光検出動作は、まず、発光部（図５に示す発光部１６０）からの励起光の照射を開始（ステップＳ３０１）し、励起光の照射を開始してから予め設定されている時間Ｔ１が経過するのを待機する（ステップＳ３０２）。時間Ｔ１が経過する（ステップＳ３０２；Ｙｅｓ）と、受光部（図５に示す受光部１６１）による蛍光の受光検出を開始する（ステップＳ３０３）。次いで、受光部による蛍光の受光検出を開始してから予め設定されている時間Ｔ２が経過するのを待機する（ステップＳ３０４）。
　時間Ｔ２が経過する（ステップＳ３０４；Ｙｅｓ）と、図１２に示すように、受光部による蛍光の受光検出と発光部による励起光の照射を同時に停止させる（ステップＳ３０５）。
　次いで、受光部の蛍光の受光検出と発光部による励起光の照射を停止させてから予め設定されている時間Ｔ４が経過するのを待機する（ステップＳ３０６）。時間Ｔ４が経過する（ステップＳ３０６；Ｙｅｓ）と、予め設定された回数の蛍光検出が終了したか否か判断する（ステップＳ３０７）。予め設定された回数でないとき（ステップＳ３０７；Ｎｏ）は、上記のステップＳ３０１～ステップＳ３０６を繰り返す。
　予め設定された回数の蛍光検出が終了する（ステップＳ３０７；Ｙｅｓ）と、蛍光検出ユニットによる蛍光検出動作（図７に示すステップＳ１０５）が終了する。
　図７に戻り、蛍光検出ユニットによる蛍光検出動作が終了すると、得られた受光部出力である受光検出値を移動平均処理（ステップＳ１０６）し、この移動平均処理後のデータを用いて表示等の出力（ステップＳ１０７）がなされる。これにより、反応検出装置８０の動作が終了する。
　このように、受光部の受光検出の停止を、発光部の発光の停止と同時に行うシーケンスで蛍光の光量の測定を行っても、上記と同様の効果を奏することができる。

Claims (6)

  1. 試料に励起光を照射する発光部と、前記励起光の照射により前記試料から発する蛍光を受光検出する受光部と、を有する蛍光検出ユニットにおいて、
    前記発光部の発光開始の後、前記受光部の受光検出を開始させ、
    前記受光部の受光検出の停止を、前記発光部の発光の停止と同時もしくは、前記発光部の発光中に行うシーケンスで蛍光の光量の測定を行うことを特徴とする蛍光検出ユニット。
  2. 前記シーケンスを複数回繰り返すことを特徴とする請求の範囲第１項に記載の蛍光検出ユニット。
  3. 試料の混合、反応、検出が行われる流路の形成されたマイクロチップを収容するマイクロチップ収容部と、該マイクロチップ収容部に収容されたマイクロチップの被検出部に対応して設けられた請求の範囲第１項又は第２項に記載の蛍光検出ユニットと、前記マイクロチップの流路に駆動液を注入する駆動液ポンプと、を有することを特徴とする反応検出装置。
  4. 前記蛍光検出ユニットの受光部の受光範囲内に試料が存在するか否かを検知する試料到達検知部を有し、該試料到達検知部により試料の存在を検知した後に、前記蛍光検出ユニットの発光部の発光を開始させることを特徴とする請求の範囲第３項に記載の反応検出装置。
  5. 前記受光部の受光検出値を移動平均処理することを特徴とする請求の範囲第３項又は第４項に記載の反応検出装置。
  6. 前記受光部の受光検出値が時間軸に対し漸減もしくは漸増しているとみなした場合には、予め決められた対処法に基づいて測定を行うことを特徴とする請求の範囲第３項から第５項までの何れか一項に記載の反応検出装置。
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