WO2009090284A1 - Método para crear una población combinatoria de plantas transgénicas que expresan y acumulan una diversidad d metabolitos valiosos - Google Patents

Método para crear una población combinatoria de plantas transgénicas que expresan y acumulan una diversidad d metabolitos valiosos Download PDF

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WO2009090284A1
WO2009090284A1 PCT/ES2009/000016 ES2009000016W WO2009090284A1 WO 2009090284 A1 WO2009090284 A1 WO 2009090284A1 ES 2009000016 W ES2009000016 W ES 2009000016W WO 2009090284 A1 WO2009090284 A1 WO 2009090284A1
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plant
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Paul Christou
Changfu Zhu
Shaista Naqvi
Teresa Capell Capell
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Universitat De Lleida
Institució Catalana De Recerca I Estudis Avancats (Icrea)
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    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
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    • C12N15/8207—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated by mechanical means, e.g. microinjection, particle bombardment, silicon whiskers
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Definitions

  • the present invention belongs to the technical field of plant biotechnology and in particular refers to a novel method for obtaining many analogues, derivatives, precursor metabolites different from valuable compounds in a biosynthetic route from a novel plant population generated through a combinatorial genetic transformation method. This population expresses and accumulates unique profiles of valuable compounds in a route.
  • PREVIOUS TECHNIQUE a novel method for obtaining many analogues, derivatives, precursor metabolites different from valuable compounds in a biosynthetic route from a novel plant population generated through a combinatorial genetic transformation method.
  • transgenic plants Since the creation of the first transgenic plants in the early 1980s that expressed individual transgenes along with a selectable / detectable marker gene, a plethora of examples has been witnessed in many different plant species, through which one or relatively few transgenes were introduced either sequentially or concomitantly in plants. Most of the resulting transgenic plants expressed individual genetic traits, for example insect resistance or herbicide tolerance, tolerance to various stresses, traits related to the development and morphology of the plant, manipulation of seed storage and other proteins and the like.
  • individual genetic traits for example insect resistance or herbicide tolerance, tolerance to various stresses, traits related to the development and morphology of the plant, manipulation of seed storage and other proteins and the like.
  • WO2006096392 mainly refers to the discovery of genes.
  • the main component of said patent application is a methodology to generate a multitude of genes and analogs using molecular evolution technology, including gene exchange all with the purpose of creating maximum in vitro diversity in terms of detectable genes that would code for proteins / enzymes with carotenogenic activity.
  • a range of other techniques including methods based on PCR and mutagenesis are described, again all directed to the creation of protein libraries and genes for selection. Site saturation mutagenesis is used in conjunction with exchange, chimerization, recombination and other mutagenization procedures, together with selection.
  • the invention of WO2006068946 relates to a nucleic acid construct having a nucleic acid molecule configured to silence the expression of [beta] -carotene hydroxylase in the potato.
  • the invention provides a strategy for modifying the provitamin A content of plants based not on the reconstruction of the carotenoid pathway, but instead on the attenuation of the action of an individual carotenogenic gene that is still expressed in the plant.
  • the inventors establish that the main advantage of their invention is that it results in a increase in beta-carotene by simply "deactivating" a gene, as opposed to the insertion of a foreign gene.
  • the example is the transformation of the potato with a gene. All claims relate to a specific gene and not to the engineering modification of multiple genes. Only beta-carotene is claimed, not other carotenoids. Therefore, the aforementioned patent application is not relevant to the present invention.
  • WO2004085656 this patent application refers to the provision of improved polynucleotides that provide an increase in the accumulation of carotenoids in plants and in particular in the seeds of said plants.
  • the invention also provides plant material, plants and seeds comprising polynucleotides, in particular rice plant material, rice plants and rice seeds. Only two genes are inserted in the rice.
  • the claims relate to isolated sequences for a specific gene in the pathway and to genetic constructs for introducing this and a second gene into the rice. Corn and rice plants are claimed but these only express the two genes claimed in the invention.
  • WO2006034501 refers to materials and methods for increasing the folate content of plants.
  • a plant is engineered to express increased levels of pteridines in the plant.
  • a plant is transformed with a polynucleotide encoding a mammalian type GCHI that is free of feedback control when expressed in a plant.
  • a plant is transformed with a polynucleotide encoding a bacterial GCHI that is not subjected to metabolic regulation within a plant cell.
  • the subject invention also relates to plants that have an increased folate content.
  • a plant of the invention comprises and expresses a polynucleotide encoding a mammalian-type GCHI polypeptide or a bacterial GCHI-polypeptide that is free of feedback control when expressed in the plant. It focuses on Arabidopsis and tomato and only one gene is inserted to increase folate accumulation. Therefore, the aforementioned patent application is not relevant to the present invention.
  • WOOl 88169 discloses transformed plants, plant cells and seeds that have altered carotenoid levels and / or modified fatty acid compositions. Plants, plant cells and seeds are transformed with at least one carotenoid biosynthesis gene, or a combination thereof.
  • transformation with an early expression carotenoid biosynthesis gene leads to seeds that have increases significant levels of alpha-carotene. For the production of a seed that has an increase in carotenoid biosynthesis, the transformation of the plant with an early expression carotenoid biosynthesis gene is sufficient.
  • carotenoid biosynthesis gene geranylgeranyl pyrophosphate synthase, phytoeno synthase, phytoeno desaturase and isopentenyl diphosphate (IPP) isomerase is meant.
  • IPP isopentenyl diphosphate
  • transgenes that do not constitute a metabolic or biosynthetic pathway are introduced together in a plant. Even in such cases, only a small number of plants express all genes transferred to adequate levels. Therefore, the challenge is to develop the technology that will achieve the concordant expression of multiple transgenes and how to reach the levels of expression that will be practical in the context of complex metabolic traits engineered.
  • the design of expression vectors is crucial, and a complete understanding of the mechanisms of integration of multiple transgenes into the host genome is a prerequisite. Once multiple transgenes are introduced and integrated into a host plant, in the context of metabolic engineering modification, it is necessary to integrate these transgenes in such a way that they are not segregated in later • generations, as this will destroy the newly constituted route.
  • the utility of the present invention will be illustrated using one of the most complex and economically significant metabolic rats, the carotenoid pathway.
  • two additional transgenes that also code for key and speed-limiting stages in the biosynthesis of vitamin C and folatp will be included, in addition to a selectable marker gene. Therefore, by way of example, 8 transgenes are introduced into plants, but there is no a priori reason to believe that the method is limiting the number of genes in the species.
  • genes encoding additional essential vitamins and minerals, such as vitamin E, Fe, Zn 5 Se, etc., and also for essential amino acids are contemplated.
  • any range or combination of traits falls within the scope of this invention, for example antibodies, biotic and biotic stress, bioenergy application, etc. This can be done in any plant that is susceptible to genetic transformation and by way of example this will be illustrated using two important crop plants, corn and rice (see examples).
  • the invention encompasses the introduction of an unlimited number of transgenes in any plant.
  • a key advantage of the method disclosed is its combinatorial nature along with a range of specific promoters of multiple organs that direct the expression of the transgenes transferred.
  • the plant produces beta-carotene (in addition to vitamin
  • the plant produces beta-carotene
  • Table 1 shows a representative number of plants derived from combinatorial genetic transformation experiments. Rows 1, 7, 8, 13. 16 and 17 indicate the expression of the 7 transferred genes plus the selectable marker gene. Rows 2, 4, 6 and 19 indicate the expression of the genes required to reconstitute only the carotenoid pathway.
  • the present invention relates to a method for obtaining valuable metabolites such as carotenoids, other vitamins and by extension lignins, fatty acids, flavonoids, terpenoids, alkaloids produced through a biosynthetic / metabolic pathway from a novel plant population generated at through a method of combinatorial genetic transformation that implies an unlimited number of transgenes introduced together in said population. Therefore, in one aspect, the present invention relates to a method of obtaining transgenic plants, characterized in that said plants are obtained by means of combinatorial genetic transformation, in a particularly preferred embodiment, the combinatorial genetic transformation comprises an unlimited number of genes. introduced together in these plants. In a particularly preferred embodiment, the combinatorial genetic transformation of the present invention comprises at least 2 genes introduced together in said plants.
  • the combinatorial genetic transformation comprises at least 3 genes introduced together in said plants.
  • the combinatorial genetic transformation comprises at least 4 genes introduced together in said plants.
  • the combinatorial genetic transformation comprises at least 5 genes introduced together in said plants.
  • the combinatorial genetic transformation comprises at least 6 genes introduced together in said plants. In a particularly preferred embodiment, the combinatorial genetic transformation comprises at least 7 genes introduced together in said plants.
  • the combinatorial genetic transformation comprises at least 8 genes introduced together in said plants.
  • the genes introduced together in the transgenic plants of the present invention participate in a metabolic pathway.
  • the methodic route of the present invention is selected from the route of the carotenoids, vitamin C and / or vitamin E.
  • the transgenic plants of the present invention overexpress or underexpress. the products encoded by these • genes compared to the wild type plants.
  • the transgenic plant of the present invention is corn.
  • the transgenic plant of the present invention is rice.
  • the transgenic plant of the present invention is tobacco. . ... .
  • the present invention relates to a transgenic plant obtained by means of the process of the present invention.
  • the present invention relates to the use of the transgenic plant of the present invention for the production of metabolites derived from a metabolic pathway.
  • the methodic route of the present invention is selected from the route of the carotenoids, vitamin C and / or vitamin E.
  • the essence of this invention is that the method results in a population of plants with diverse properties that produce and accumulate a range of different products useful in medicine, food and feed industries, the 2.5 cosmetic and pharmaceutical industries, etc.
  • the utility of the present invention will be illustrated using one of the most complex and economically significant metabolic pathways, the carotenoid pathway.
  • two additional transgenees that code for key stages and 30 speed limits in the biosynthesis of vitamin C and foliate will also be included, in addition to a selectable marker gene. Therefore, by way of example, 8 transgenes are introduced into plants, but there is no a priori reason to believe that the method is limiting the number of genes in the species.
  • genes encoding additional essential vitamins and minerals, such as vitamin E, Fe, Zn, Se, etc., and also for essential amino acids are contemplated. These traits can either be introduced in conjunction with carotenoid and other genes.
  • Vitamins can either be engineered separately in a different population of plants that can then be subsequently crossed with other transgenic plants that express other traits. Any feature or combination of features falls within the scope of this invention, for example antibodies, biotic and abiotic stress, bioenergy application, etc. This can be done in any plant that is susceptible to genetic transformation and by way of example this will be illustrated using two important crop plants, corn and rice '(see examples).
  • the invention encompasses the introduction of an unlimited number of transgenes in any plant.
  • a key advantage of the method disclosed is its combinatorial nature along with a range of specific promoters of multiple organs that direct the expression of the transgenes transferred.
  • Figure 1 shows the route of carotenoid ios. Reconstruction and extension of the biosynthetic pathway of carotenoids in the white corn endosperm.
  • the bars in the downlines indicate the enzymatic reactions that take place in the different phenotypes.
  • Figure 2 shows the genetic constructs / vectors for transformation.
  • FIG. 1 HPLC separation of carotenoids in WT corn and representative transgenic. HPLC analysis of representative transgenic plants indicating their reconstructed carotenoid profile as a result of combinatorial genetic transformation.
  • Figure 4 shows the RT-PCR analysis of selected transgenic events. Analysis of RNA expression for transgenes transferred in representative transgenic plants generated through the combinatorial genetic transformation disclosed in the patent application.
  • FIG. 5 Biosynthetic route of the indole alkaloid, segments of which were introduced into tobacco and rice.
  • the following transgenes were jointly introduced in a combinatorial genetic transformation experiment as previously described in the described description, in the present patent application: anthranilate synthase, HMGR, geraniol 10-hydroxylase, tryptophan decarboxylase, strytosidine synthase, strytosidine glucosidase, deacetoximeroline 4 -hydroxylase ,. deacetylvindoline acetyltransferase, horseradish peroxidase.
  • the combinatorial transgenic tobacco and rice plant contained and expressed different transgenic complements.
  • transformation vectors were constructed comprising different specific endosperm promoters (wheat gluten LMW, barley hordein, rice prolamine, rice glutelin 1, corn zein), which code for following transgenes involved in carotenoid biosynthesis: psyl, crtl, lycb, bch, crtW plus folE for folate and dhar (a full length cDNA that was isolated from rice) for vitamin C.
  • the marker gene was also used. Selectable bar (expressed constitutively to allow in vitro selection).
  • endosperm promoters wheat gluten LMW, barley hordein, rice prolamine, rice glutelin 1, corn zein
  • transgenes were used in the present invention.
  • the 8 transgenes were mixed in an Eppendorf tube and then gold particles were coated with the mixture and subsequently the corn tissue was bombarded as described After selection with the herbicide phosphinothricin, more than 70 independent plants were recovered, containing and expressing different combinations of the transferred transgenes.
  • DNA and RNA extraction frozen in liquid nitrogen and stored at -8th 0 C until use.
  • the genomic DNA of the plant was isolated from the leaves according to the CTAB extraction method for lysis of the nuclei described by Sambrook et al. (1989).
  • Escherichia coli DH5D genomic DNA was purified according to the Easy-DNA TM kit (Invitrogen). Endosperm RNA or total leaf RNA was isolated using the RNeasy® plant minikit (QIAGEN).
  • Zea mays PSYl cDNA was cloned from the B73 maize blood line by RT-PCR based on PSYl gene information (GenBank registration number U32636) using primers with BamHI and EcoRI sites, listed respectively in Table 2
  • the amplified DNA fragment of the expected size was collected by Geneclean (BIO 101, La Jolla, CA) and subcloned into the vector pGEM®-T (Promega) to generate pGEM-ZmPSYl. Both chains of each cDNA fragment were sequenced in its entirety.
  • the ZmPSYl cDNA fragment was then subcloned into plasmid p326 digested with
  • LMW low molecular weight wheat glutenin gene
  • the Crtl gene of Pantoea ananatis fused in the frame was amplified with the signal of the transit peptide (TPS) of the small subunit of the ribulose bisphosphate carboxylase of Phaseolus vulgaris (Schreier et al., 1985) in the plasmid pYPIET4 (Misawa et al., 1993) using primers with Xbal and EcoRI sites, respectively (table 2) and subcloned into the vector pGEM ® -T to give rise to pGEM-PaCrtl with TPS.
  • TPS transit peptide
  • the .Gentiana luteal LYCB gene was amplified by usual PCR using plasmid pBluescript-GlLYCB DNA (Zhu et al., 2003) as a template using primers with BamHI and Kpnl, respectively (table 2) and subcloned into the pGEM- vector T easy to produce pGEM ® -GlLYCB.
  • PGEM-GlLYCB was digested by BamHI and then partially digested by EcoRI and the full length LYCB fragment released with plasmid pRP5 digested with the same enzymes was ligated to give rise to pRP5-GlLYCB.
  • Plasmid pRP5 contains the PR5 promoter of the rice prolamine gene (Su et al. 2001) and the nopaline synthase terminator.
  • the Zea mays BCH cDNA fragment was amplified from the B73 maize blood line by RT-PCR based on the BCH gene information (GenBank registration number AY84495) using primers with BamHI and Xbal sites, listed respectively in table 2 and subcloned into the vector pGEM ® -T easy (Promega) to generate pGEM-ZmBCH.
  • This plasmid DNA was digested by EcoRI and Xbal, and the resulting BCH cDNA fragment was inserted into the pHor-P plasmid digested with the same enzymes to give rise to pHor-P-AntisenseZmBCH.
  • siRNA or antisense ZmBCH it is specifically aimed at increases in beta-carotene. This means that the transformations are carried out with a mixture of psyl, crtl, lycb, antisense ZmBCH plus the genes for vitamin C and folate (dhar, folE) and any other gene that codes for other vitamins or traits.
  • the Gentiana luteal BCH gene was amplified using plasmid pBluescript-GIBCH DNA (Zhu et al., 2003) as a template by PCR using primers with Notl and Sacl sites, listed respectively in Table 2, and subcloned into the pGEM vector ® -T easy to produce pGEM-GIBCH. He digested this
  • Plasmid DNA with Notl and ligated into vector pTO 126 which contained the rice glutelin-1 (GtI) gene promoter (Okita et al., 1989; Washida et al., 1999) and the gene terminator of the rice ADPGPP (ADP-glucose pyrophosphorylase) to generate pTO126-GlBCH.
  • GtI rice glutelin-1
  • ADPGPP ADP-glucose pyrophosphorylase
  • the crtW gene of Paracoccus sp: N81106 fused in the frame was amplified with the transit peptide signal (TPS) of the small ribulose bisphosphate carboxylase subunit of Phaseolus vulgaris (Schreier et al., 1985) in plasmid p35W2AZ (Ralley et al., 2004) using primers with BamHI and EcoRI sites, respectively (table 2) and subcloned into the pGEM ® -T easy vector to give rise to pGEM-ParococcusCrtW with TPS.
  • TPS transit peptide signal
  • the Escherichia coli folE gene was amplified from E. coli DH5 D genomic DNA based on folE gene information (GenBank registration number: - X63910) using primers with BamHI and Sacl sites, listed respectively in • the table 2 and subcloned into the vector pGEM ® -T easy (Invitrogen) to generate pGEM-EcfolE.
  • This plasmid DNA was digested by Notl and Sacl, and the resulting folE DNA fragment was inserted into the pHor-P plasmid digested with the same enzymes to give rise to pHor-P-EcfolE.
  • plasmid ⁇ AHC20 (Christensen and Quail, 1996) containing the bar gene was used, for joint bombardment, for phosphinothricin selection.
  • Table 2 Oligonucleotide sequences of the PCR primers for the construction of Zea mays PSY1 gene vectors
  • SEQ ID NO: 12 DHrazy gene from Orazy sativa
  • SEQ ID NO: 14 folcher gene from Escherichia coli
  • Corn plants (Zea mays L., cv. M37W, white endosperm corn cultivation, lacking in general carotenoids) were grown in the greenhouse and the growth room at a day / night temperature of 28 / 2O 0 C with a photoperiod of
  • Immature zygotic embryos (ECI) M37W were aseptically removed 10-14 days after pollination and cultured in N6 medium. After a 5-day culture, the embryos were bombarded with 10 mg of coated gold particles (Christou et al., 1991). The target tissues were incubated in N6 medium which It contained a high osmotic content (0.2 M mannitol, 0.2 M sorbitol) for 5 to 6 hours before the bombing and 10 to 16 hours after the bombing.
  • the gold particles were coated at a 3: 1 molar ratio of the gene of interest (making adjustments for the size of each construct) and selectable marker plasmid derived from plasmid pAHC20 containing the bar gene (Christensen and Quail, 1996) to joint transformation (Christou et al., 1991).
  • the bombarded callus was selected in medium supplemented with phosphinothrin as previously described (Drakakaki et al., 2005).
  • the transgenic plants were successfully regenerated and acclimatized to the soil. Seventy independent events in total were selected for in-depth analysis. Consequently, independent transgenic events were identified and characterized by PCR analysis of genomic DNA and Southern blot.
  • the primary transformants were either pollinated with unprocessed M37W and / or yellow endosperm plants, respectively, or self-pollinated to produce Tl seeds. They regenerated. the non-transformed control plants (NC) from the same batch of corpus callosum that was used for the transformation. All control plants were grown at the same time and under the same growth conditions as the transgenic lines.
  • N non-transformed control plants
  • PCR analysis of the genomic DNA of the leaves was used to identify the transgenic maize lines and to determine the transgenic complement of each line, its integrity and its probability of expression.
  • Three sets of primers were designed as indicated in Table 3.
  • Set 1 of primers is for the promoter and the transgene (direct primer located on the promoter and reverse primer on the transgene);
  • set 2 of primers is for the transgene only (both primers in the transgene);
  • set 3 of primers is for the transgene and the terminator (direct primer on the transgene and reverse primer located on the terminator).
  • Appropriate transgene expression plasmid DNAs were used as positive controls.
  • PCR reactions were carried out in a 20 ⁇ l solution containing PCR reaction buffer (GoTaq ® reaction buffer, Promega), MgCl 2
  • GlLYCB SEQ ID NO: 29 SEQ ID NO: 31 SEQ ID NO: 33 SEQ ID NO: 30 SEQ ID NO: 32 SEQ ID NO: 34
  • RNA of 120 mg of corn endospern ⁇ (30 DAP seeds) was extracted using Trizol (1.20 ml) and chloroform (0.25 ml). Isopropanol (0.6 ml) was used to sediment the DNA in the extract. After washing the sediment with ethanol, RNA purification was carried out using the Qiagen RNAeasy minikit plant
  • RNA (2 ⁇ g) was treated with DNase (DNase. RN1-free RNAse (Promega) before undergoing reverse transcription according to the protocol of the Omniscript reverse transcription kit ( B) (QIAGEN, Hilden, Germany), to generate the first strand cDNA template, corn actin gene primers were used
  • GoTaq ® Promega
  • 1.5 mM MgCl 2 each 0.2 mM dNTP, each of the primers 1 ⁇ M direct and inverse, 1.25 ⁇ l of RT-PCR solution and 0.5 units of GoTaq ® Polymer DNA.
  • the PCR program used was 95 0 C for 3 min., followeded by 30 cycles of 94 0 C for 45 sec, 55 0 C for 45 sec, 72 0 C for 90 sec and a final extension at 72 ° C for 5 min. The PCR products were then verified by electrophoresis in 1.0% agarose gels.
  • Endosperm and leaf samples for 'HPLC analysis was collected, lyophilized and stored at -20 0 C until use.
  • Carotenoids and tocopherols were separated and quantified by HPLC using UV-VIS detection.
  • a Vydac 201TP54 column, reverse phase C 18 , 5 ⁇ m, 4.6 x 150 mm (Separation Group, Hesperia, CA) was connected to a Waters Nova-Pak column of reverse phase C 18 , 4 ⁇ m, 3.9 x 150 mm (Water Chromatography, Milford, MA).
  • the columns were protected by an Adsorbosphere pre-column C 18 , 5 ⁇ m, 4.6 x 7.5 mm (Alltech Assoc, Deerfield, IL).
  • the HPLC system consisted of an ERC 3510 degasser from ERMA ⁇ ptima LTD (Anspec Co., Ann Arbor, MI), a Waters 510 pump, a 731a automatic injector and a 490E (Waters Chromatography, multiple wavelength UV-VIS detector). Milford, MA). Data were collected and processed using the Waters Millenium 2010 software (Waters Chromatography, Milford, MA).
  • the mobile phase consisted of acetonitrile: methanol: inethylene chloride (75: 20: 5 ? V / v / v), which contained 0.05% triethylamine (TEA) and 0.1% butylated hydroxytoluene (BHT) (Hart and Scott, 1995).
  • the samples were incubated in tetrahydroturan (THF) + methanol (50:50) at 65 ° C for 20 min., The mixture was poured into a separating flask and in order to remove the solid residue, filtration was carried out. Using a filter paper. For the distribution, petroleum-ether (90:10) was added. Residues of acetone, methanol and THF were removed by washing twice with water. The organic phase containing the carotenoids was collected in glass tubes and dried under N 2 , stored at -2O 0 C until use. The entire extraction procedure was carried out in a hood in the dark. A Hypersil Cl 8 column was used for the analysis.
  • the mobile phase used was a mixture of acetonitrile: methanol: 2-propanol (425 ml: 50 ml: 25 ml).
  • F.2) Extraction and analysis of ascorbic acid and Test 1: Measurements of AsA, DHA, GSH and oxidized glutathione (GSSG). AsA was measured as described (Foyer, CH, Rowell, J. & Walker, D. (1983) Measurement of the ascorbate contained of spinach leaf protoplasts and chloroplasts during illumination. Plant 157: 239-244). Corn endosperm samples were ground in 2.5M HClO 4 and centrifuged at 13,000 rpm (Eppendorf 5417C centrifuge) for 10 min.
  • the total amount of reduced and oxidized ascorbic acid i.e., AsA and DHA was determined by reducing DHA in AsA (in a reaction containing 100 mM K 2 HPO 4 ZKH 2 PO 4 at pH 6.5, 2 mM GSH, and 0.1 ⁇ g of recombinant wheat DHAR protein incubated at 25 ° C for 20 min.) Before measuring AsA. The amount of DHA was determined as the difference between these two trials. GSH and GSSG were determined from the leaves, as described (Griffith, OW (1980) Determination of glutathione and glutathione disulfide using glutathione reducéase and 2-vinyl ⁇ yridine. Anal. Biochem.
  • DHAR was tested from an equal amount of protein as described (24) in 50 mM K 2 HPCVKH 2 PO 4 , pH 6.5, 0.5 mM DHA / 1 mM GSH, and its activity was followed by an increase in absorbance at 265 nm.
  • the activities of glutathione reductase (GR), MDHAR, ascorbate peroxidase (APX), L-galactono-l, 4-lactone dehydrogenase (GLDH), superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) were determined as described (Foyer, C. & Halliwell, B.
  • Test 2 Ex ⁇ rac ⁇ os were prepared for the ascorbaio analysis according to Kurlich e ⁇ al (1999) by mixing 100 ml of 1% m-phosphoric acid and 25 g of fresh frozen tissue in a Waring mixer for 2 min. The laierales of the mixer bowl were washed with 1% m-phosphoric acid (50 ml) and mixed for 2 min. additional. The suspension was adjusted to 250 ml with m-HPO 3 to 1% and then filtered using Whatman paper fluted filter 2V. One milliliter of filtrate and 1 ml of 5% dilio ⁇ rei ⁇ ol were mixed. Mire exirates were diluted to 10 ml with 1% m-HPO 3 . The sample was filtered through a 0.20 ⁇ m filter, and 10 ⁇ l was injected into the liquid chromatograph. An alternative method was also followed as described in Chen et al 2003. r
  • Ascorbaium concentrations were measured using an isocracic HPLC system consisting of a Beckman model 421 controller, a Beckman model 100A pump and a Beckman Al ⁇ ex C-RlA inertor.
  • the deiror was a Wa ⁇ ers M-
  • the phase stationary was a Rainin Dynamax -60 ⁇ column of amine, 4.6 X 250 mm protected by a Rainin Dynamax amine pre-column of 8 ⁇ m, 1.5 cm (Varion, Walnut Creek, CA).
  • the mobile phase consisted of acetonitrile / 0.05 M KH 2 PO 4 (pH 5.95), 75:25.
  • the detection was at 268 nm with a sensitivity of 0.02 AUFS.
  • the flow rate was 1.5 ml / min.
  • Ascorbic acid standards (USPC, Inc., Rockville, MD) were prepared by diluting 0.01 (0.002 g of USP grade L-ascorbic acid up to 100 ml with 1% m-HPO 3 ; This solution was mixed (1 ml ) with 5% dithiothreitol (1 ml) and diluted to 10 ml with 1% m-HPO 3 to produce a 10 ppm standard of ascorbic acid.
  • Samples of the eluate (400 ⁇ l) were taken for HPLC analysis with electrochemical detection, using a Prodigy ODS2 column of 5 ⁇ m, 150 x 3.2 mm (Phenomenex) and a four-channel detector (CoulArray model 5600A, ESA, Chelmsford , MA) with potentials set at 0, 300, 500 and 600 mV.
  • the mobile phase was a binary mixture of
  • Polyhydroxybu ⁇ yra ⁇ e a biodegradable thermoplastic, produced in transgenic pla ⁇ s.

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Abstract

La presente invención pertenece al campo técnico de la biotecnología vegetal y en particular se refiere a un método novedoso para obtener muchos análogos, derivados, metábolitos precursores diferentes de compuestos valiosos en una ruta biosintética a partir de una población novedosa de plantas generada a través de un método de transformación genética combinatoria. Dicha población expresa y acumula perfiles únicos de compuestos valiosos en una ruta.

Description

MÉTODO PARA CREAR UNA POBLACIÓN COMBINATORIA DE PLANTAS TRANSGÉNICAS QUE EXPRESAN Y ACUMULAN UNA DIVERSIDAD DE METABOLITOS VALIOSOS DESCRIPCIÓN CAMPO TÉCNICO
La presente invención pertenece al campo técnico de la biotecnología vegetal y en particular se refiere a un método novedoso para obtener muchos análogos, derivados, metabolitos precursores diferentes de compuestos valiosos en una ruta biosintética a partir de una población novedosa de plantas generada a través de un método de transformación genética combinatoria. Dicha población expresa y acumula perfiles únicos de compuestos valiosos en una ruta. TÉCNICA ANTERIOR
Desde la creación de las primeras plantas transgénicas en los primeros años 80 que expresaban transgenes individuales junto con un gen marcador seleccionable/detectable, se ha atestiguado una plétora de ejemplos en muchas especies de plantas diferentes, mediante los cuales se introdujeron uno o relativamente pocos transgenes o bien de manera secuencial o bien concomitante en plantas. La mayoría de las plantas transgénicas resultantes expresaban rasgos genéticos individuales, por ejemplo resistencia a insectos o tolerancia a herbicidas, tolerancia a diversos estreses, rasgos relacionados con el desarrollo y la morfología de la planta, manipulación del almacenamiento de semillas y otras proteínas y similares. En el contexto de la creación de plantas que contienen lo que se denomina comúnmente "rasgos de producción o de valor añadido", existe un grave obstáculo que es necesario superar, es decir, formas generales y eficaces de introducir en las plantas múltiples transgenes que necesitar expresarse secuencial y coordinadamente de manera que imite/potencie rutas dí múltiples etapas endógenas o reconstituya rutas exógenas.
La manipulación de rasgos complejos esta comenzando ahora a tener lugar 3 algunos ejemplos iniciales incluyen la creación de plantas transgénicas que expresar anticuerpos secretores (Ma et al., 2003, Nicholson et al., 2005), producción d< productos químicos industriales tales como bioplásticos (Van Beilen y Poker 2007
Moire et al., 2003, Poirer et al., 1992), modificación de almidón (Firouzabadi et al. 2007), ácidos grasos (Truska et al., 2006, Qi et al., 2004, Abdadi et al., 2004, Wu e al., 2005) y coloración de flores (Tanaka et al., 2005), modificación por ingeniería di especies leñosas con composición alterada de lignina (Halpin 2004, Hopkins et al. 2007, Campbell et al., 2003), plantas para bioenergía (Sticklen et al, 2006, Biswass e al., 2006), la creación de germoplasma con niveles alterados de poliaminas y enzimas industriales (Thu Hang et al., 2002, Capell y Christou 2004, Claparols et al., 2004), aminoácidos (Altenbach et al., 1992, Galili y Hofgen 2002) y vitaminas (Ye et al., 2000, Ducreaux et al, 2005, Diretto et al., 2005, Shintani y Della-Penna, 1998, Van Eenennaam et al., 2003). Ahora es evidente a partir de estos y otros ejemplos que la etapa de transferencia génica, es decir, la introducción de varios tránsgenes en una planta puede ser posible y quizá en alguna ocasión de rutina. Sin embargo, esto está limitado en la mayoría de los casos a dos o tres y en raras ocasiones a unos cuantos transgenes más. Varios informes describen incluso la introducción de múltiples transgenes en células de semilla de soja (12 plásmidos, Hadi et al., 1996) y plantas de arroz (14 transgenes, Chen et al; 9 transgenes, Wu et al., 2002). Sin embargo, en estos ejemplos los transgenes eran independientes entre sí, es decir, no eran parte de una ruta metabólica/biosintética. Además, no está claro a partir de estos ejemplos cómo se expresan realmente muchos de los transgenes transferidos y a qué niveles. En consecuencia, estos ejemplos sólo demuestran que es posible introducir múltiples genes en plantas pero no se proporciona información sobre la expresión o segregación no deseable en generaciones posteriores, de manera crucial para transgenes que necesitan expresarse coordinadamente como componentes de una ruta metabólica/biosintética. Varios informes posteriores cuestionan la utilidad de tales enfoques precisamente debido a las dos limitaciones de falta de expresión y segregación a través de la progenie (véase a continuación).
"Halpin C. 2005. Gene stacking in transgenic plants-the challenge for 21st century plant biotechnology. Plant Biotech J. 3: 141-155". En este artículo, el autor identifica la modificación por ingeniería de múltiples genes, especialmente aplicada a rutas metabólicas, como la restricción principal de la biotecnología vegetal contemporánea que detiene la modificación por ingeniería de plantas para rasgos complejos y multigénicos.
"Ralley et al., 2004 Metabolic engineering of ketocarotenoid formation in higher plants The Plant J. 39:477-486". Las estrategias usadas en este artículo para introducir rutas de múltiples etapas en plantas superiores han estado precedidas clásicamente por la realización de experimentos de transformación individuales, caracterizando luego la progenie y cruzando posteriormente líneas adecuadas (Ma et al., 1995). También se han usado enfoques de transformación conjunta o nueva transformación pero es improbable que logren la expresión coordinada. Como alternativa^ este artículo describe el uso de transgenes ligados que producen una poliproteína que se escinde mediante una secuencia autoescindible corta. Esto se pone como ejemplo para 2 genes sólo (véase la página 483, discusión, columna izquierda). "Halpin et al., 1999 Self-processing 2A-polyproteins-a system for co-ordinate expression of múltiple proteins in transgenic plants. The Plant J 17:453-459" "Achieving co-ordinate, high level and stable expression of múltiple transgenes in plants is currently difficult". Este artículo sólo demuestra el concepto con 2 genes, no más, tal como se demuestra en la presente invención. "Kourtz et al., 2005 A novel thiolase-reductase gene fusión promotes the production of polyhydroxybutyrate in Arábidopsis. Plant Biotechnol J 3:435-447". Este artículo muestra claramente los tipos de experimentos difíciles que será necesario realizar para lograr la modificación compleja por ingeniería de rasgos múltiples y, en esencia, esto apoya la novedad de la presente invención. "Daniell and Dhingra 2002 Multigene engineering: dawn of an exciting new era in biotechnology. Current Opinión in Biotechnology 13:136-141". Este es otro artículo que apoya la novedad de la presente invención por varias razones. En primer lugar, identifica problemas que ha resuelto el método de la presente invención (véase la primera página de la introducción en este artículo). De manera igualmente importante, sugiere que la modificación por ingeniería de plastes resolverá todos los problemas de la modificación por ingeniería metábólica, pero a pesar del hecho de que este articuló se redactó en 2002, no se han publicado artículos desde esa fecha que den ejemplos específicos y demuestren las ventajas de la modificación por ingeniería de plastes, particularmente para la modificación por ingeniería de rutas metabólicas que requieren la inserción de múltiples genes y su expresión coordinada. Todavía queda por demostrar para múltiples genes (más de 2-3).
"Halpin and Boerjan 2003 Stacking transgenes in forest trees. Trends in plant Science 8:363" Este documento establece los problemas con la modificación por ingeniería de múltiples genes y esto apoya de nuevo la novedad de la presente invención.
"Wurtzel 2004 Genomics, Genetics and biochemistry of maize carotenoid biosynthesis in "Secondary metábolism in Model systems" Recent Advances in Phytochemistry VoI 38: 85-110, JT Romeo Edt, Elsevier 2004". En las páginas 102- 103, el autor reivindica que: "...en el maíz, la manipulación de carotenoides sólo será posible si se elimina una serie de restricciones. Específicamente, entender completamente cómo está regulada la ruta en cuanto a la expresión génica, ubicación de actividades enzimáticas y flujo de sustratos. El autor establece además que la tecnología está limitada por las deficiencias actuales en el entendimiento de la expresión de genes endógenos. Se sabe poco sobre las interacciones entre rutas endógenas e introducidas y su competencia por los sustratos. El descubrimiento de que muchas de las enzimas del maíz están codificadas por pequeñas familias de genes hace las cosas incluso más complicadas (véase el texto). La compartimentalización en diferentes orgánulos subcelulares también se presenta como un problema". La metodología reivindicada en la presente invención muestra que esto no es así y de hecho se puede lograr lo que el autor reivindica que no es posible sin preocuparse de todos los problemas que surgen.
El WO2006096392 se refiere principalmente al descubrimiento de genes. El componente principal de dicha solicitud de patente es una metodología para generar una multitud de genes y análogos usando tecnología de evolución molecular, incluyendo intercambio génico todo con el propósito de crear una diversidad máxima in vitro en cuanto a genes detectables que codificarían para proteínas/enzimas con actividad carotenogénica. Se describe una gama de otras técnicas incluyendo métodos basados en PCR y mutagénesis, de nuevo todos dirigidos a la creación de bibliotecas de proteínas y genes para la selección. Se usa mutagénesis de saturación de sitio junto con intercambio, quimerización, recombinación y otros procedimientos de mutagenización, junto con selección. El centro de atención de esta patente es clonar enzimas y sus genes correspondientes usando una variedad de enfoques de rutina así como novedosos y el uso de enfoques convencionales para sobreexpresar o regular por disminución genes específicos que participan en las rutas de los carotenoides y relacionadas con el objetivo de crear una fuente para el aislamiento de carotenoides valiosos. Tales fuentes incluyen células microbianas y de organismos superiores y animales y plantas intactos.
Por tanto, la solicitud de patente mencionada no constituye técnica anterior para la presente solicitud a pesar del hecho de que ciertas reivindicaciones se refieren implícitamente a la modificación por ingeniería de múltiples genes. La invención del documento WO2006068946 se refiere a un constructo de ácido nucleico que tiene una molécula de ácido nucleico configurada para silenciar la expresión de [beta]-caroteno hidroxilasa en la patata. La invención proporciona una estrategia para modificar el contenido en provitamina, A de plantas basándose no en la reconstrucción de la ruta de los carotenoides, sino en su lugar en la atenuación de la acción de un gen carotenogénico individual que se expresa todavía en la planta. Los- inventores establecen que la principal ventaja de su invención es que resulta un aumento en el beta-caroteno mediante la simple "desactivación" de un gen, en oposición a la inserción de un gen foráneo. Sólo se pone como ejemplo la transformación de la patata con un gen. Todas las reivindicaciones se refieren a un gen específico y no a la modificación por ingeniería de múltiples genes. Solo se reivindica el beta-caroteno, no otros carotenoides. Por tanto, la solicitud de patente mencionada no es relevante para la presente invención.
El documento WO2004085656, esta solicitud de patente se refiere a la provisión de polinucleótidos mejorados que proporcionan un aumento de la acumulación de carotenoides en plantas y en particular en las semillas de dichas plantas. La invención también proporciona material vegetal, plantas y semillas que comprenden los polinucleótidos, en particular material vegetal de arroz, plantas de arroz y semillas de arroz. Sólo se insertan dos genes en el arroz. Las reivindicaciones se refieren a secuencias aisladas para un gen específico en la ruta y a constructos genéticos para introducir éste y un segundo gen en el arroz. Se reivindican plantas de maíz y arroz pero éstas sólo expresan los dos genes reivindicados en la invención.
El documento WO2006034501, se refiere a materiales y métodos para aumentar el contenido en folato de las plantas. En una realización de un método de la invención, se modifica por ingeniería una planta para que exprese niveles aumentados de pteridinas en la planta. En una realización puesta como ejemplo, se transforma una planta con un polinucleótido que codifica para un GCHI de tipo mamífero que está libre del control por retroalimentación cuando se expresa en una planta. En otra realización puesta como ejemplo, se transforma una planta con un polinucleótido que codifica para un GCHI bacteriano que no está sometido a regulación metabólica dentro de una célula vegetal. La invención objeto también se refiere a plantas que tienen un contenido en folato aumentado. En una realización, una planta de la invención comprende y expresa un polinucleótido que codifica para un polípéptido GCHI de tipo mamífero o un -polipéptido GCHI bacteriano que está libre del control por retroalimentación cuando se expresa en la planta. Se centra en Arábidopsis y tomate y sólo se inserta un gen para aumentar la acumulación de folato. Por tanto, la solicitud de patente mencionada no es relevante para la presente invención.
El documento WOOl 88169 da a conocer plantas transformadas, células vegetales y semillas que tienen niveles de carotenoides alterados y/o composiciones de ácidos grasos modificados. Las plantas, células vegetales y semillas se transforman con al menos un gen de la biosíntesis de carotenoides, o una combinación del mismo. En la oleaginosa Brassica, la transformación con un gen de la biosíntesis de carotenoides de expresión temprana conduce a semillas que tienen aumentos significativos en los niveles de alfa-caroteno. Para la producción de una semilla que tiene un aumento en la biosíntesis de carotenoides, es suficiente la transformación de la planta con un gen de la biosíntesis de carotenoides de expresión temprana. Por gen de la biosíntesis de carotenoides de expresión temprana, se quiere decir geranilgeranil pirofosfato sintasa, fitoeno sintasa, fitoeno desaturasa e isopentenil difosfato (IPP) isomerasa. Como máximo tres genes de la biosíntesis de carotenoides de expresión temprana, crtB, crtE y crtl, usando procedimientos convencionales. Se ponen como ejemplo el algodón, Arabidopsis y maíz. Todos los métodos y reivindicaciones son limitados en cuanto al número de genes y no crean una población combinatoria, como en la presente invención.
En conclusión, el medio más eficaz de introducir grandes números de transgenes en plantas es a través de transformación conjunta a través de transferencia directa de ADN. Para un número de transgenes menor, también son adecuados los métodos basados en agrobacterias. Un obstáculo mucho más desafiante^ técnica e intelectualmente, es entender y superar las restricciones que influyen en la expresión estable y predecible de múltiples transgenes introducidos conjuntamente en plantas, particularmente en los casos en los que éstos son miembros de una ruta compleja que requiere la expresión coordinada y secuencial de varios transgenes. Debido a la naturaleza del metabolismo vegetal, la compartirnentalización de las enzimas y los sustratos en diferentes compartimentos subcelulares y complejidades adicionales de la regulación especial, temporal y de desarrollo de la expresión transgénica, hacen la situación extremadamente compleja. Esta no es una tarea sencilla incluso en el caso más simple, por ejemplo cuando se introducen conjuntamente transgenes no relacionados (es decir, transgenes que no constituyen una ruta metabólica o biosintética) en una planta. Incluso en tales casos, sólo un pequeño número de plantas expresan todos los genes transferidos a niveles adecuados. Por tanto, el desafío consiste en desarrollar la tecnología que logrará la expresión concordante de múltiples transgenes y cómo llegar a los niveles de expresión que serán prácticos en el contexto de rasgos metabólicos complejos modificados por ingeniería. En este contexto, es crucial del diseño de vectores de expresión, y es un requisito previo un entendimiento completo de los mecanismos de integración de múltiples transgenes en el genoma huésped. Una vez que se introducen y se integran múltiples transgenes en una planta huésped, en el contexto de la modificación por ingeniería metabólica, es necesario integrar estos transgenes de tal manera que no se segreguen en generaciones • posteriores, ya que esto destruirá la ruta recién constituida. Se ilustrará la utilidad de la presenté invención usando una de las ratas metabólicas más compleja y económicamente significativa, la ruta de los carotenoides. Para demostrar la utilidad y flexibilidad y adaptabilidad adicionales del método, se incluirán también dos transgenes adicionales que codifican para etapas clave y limitantes de la velocidad en la biosíntesis de vitamina C y folatp, además de un gen marcador seleccionable. Por tanto, a modo de ejemplo, se introducen 8 transgenes en las plantas, pero no existe una razón a priori para creer que el método sea limitante del número de genes de la especie. En otra realización de la presenté invención, se contemplan genes que codifican para vitaminas y minerales esenciales adicionales, tales como vitamina E, Fe, Zn5 Se, etc., y también para aminoácidos esenciales. Estas características o bien pueden introducirse conjuntamente con genes de carotenoides y otra vitamina o bien pueden modificarse por ingeniería por separado en una población diferente de plantas que entonces pueden cruzarse posteriormente con otras plantas transgénicas que expresan otros rasgos, CuaJquier.rasgo o combinación de rasgos cae dentro del alcance de esta invención, por ejemplo anticuerpos, estrés biótico y ábiótico, aplicación de bioenergía, etc. Esto puede realizarse en cualquier planta que sea susceptible de transformación genética y a modo de ejemplo se ilustrará esto usando dos importantes plantas de cultivo, maíz y arroz (véanse los ejemplos). La invención abarca la introducción dé un número ilimitado de transgenes en cualquier planta. Una ventaja clave del método dado a conocer es su naturaleza combinatoria junto con una gama de promotores específicos de múltiples órganos que dirigen la expresión de los transgenes transferidos./ Por tanto, construyendo un número ilimitado de vectores de expresión individuales que codifican cada uno para una protema/enzima y dirigidos por una gama de promotores específicos de órgano/tejido, mezclando estos vectores e introduciéndolos entonces en células vegetales, puede recuperarse una población de plantas que contienen y expresan combinaciones de los transgenes transferidos. Tras generar tal población combinatoria (tabla 1), puede explotarse la población para la producción de un metabolito específico o para una combinación de metabolitos en una planta dada. Una vez que se identifican tales plantas, se captura de manera estable el. perfil específico en la semilla y puede mantenerse para siempre. Estas plantas o productos derivados de ellas a través de procesamiento limitado o sofisticado pueden usarse en varias aplicaciones diferentes que incluyen medicina, aromas y fragancias, aditivos en alimentos y piensos, etc. Tabla 1
Figure imgf000010_0001
La planta produce beta-caroteno (además de vitamina
C y folato)
La planta produce beta-caroteno
La tabla 1 muestra un número representativo de plantas derivadas de experimentos de transformación genética combinatoria. Las filas 1, 7, 8, 13. 16 y 17 indican la expresión de los 7 genes transferidos más el gen marcador seleccionable. Las filas 2, 4, 6 y 19 indican la expresión de los genes requeridos para reconstituir sólo la ruta de los carotenoides.
BREVE SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un método para obtener metabolitos valiosos tales como carotenoides, otras vitaminas y por extensión ligninas, ácidos grasos, flavonoides, terpenoides, alcaloides producidos a través de una ruta biosíntética/metábólica a partir de una población novedosa de plantas generada a través de un método de transformación genética combinatoria que implica un número ilimitado de transgenes introducidos conjuntamente en dicha población. Por tanto, en un aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento de obtención de plantas transgénicas, caracterizado porque dichas plantas se obtienen por medio de transformación genética combinatoria, en una realización particularmente preferida, la transformación genética combinatoria comprende un número ilimitado de genes introducidos conjuntamente en dichas plantas. En una realización particularmente preferida, la transformación genética combinatoria de la presente invención comprende al menos 2 genes introducidos conjuntamente en dichas plantas.
En una realización particularmente preferida, la transformación genética combinatoria comprende al menos 3 genes introducidos conjuntamente en dichas plantas.
En una realización particularmente preferida, la transformación genética combinatoria comprende al menos 4 genes introducidos conjuntamente en dichas plantas.
En una realización particularmente preferida, "la transformación genética combinatoria comprende al menos 5 genes introducidos conjuntamente en dichas plantas.
En una realización particularmente preferida, la transformación genética combinatoria comprende al menos 6 genes introducidos conjuntamente en dichas plantas. En una realización particularmente preferida, la transformación genética combinatoria comprende al menos 7 genes introducidos conjuntamente en dichas plantas.
En una realización particularmente preferida, la transformación genética combinatoria comprende al menos 8 genes introducidos conjuntamente en dichas plantas. En una realización particularmente preferida, los genes introducidos conjuntamente en las plantas transgénicas de la presente invención participan en una ruta metábólica.
En una realización particularmente preferida, la ruta metábólica de la presente 5 invención se selecciona de la ruta de los carotenoides, la vitamina C y/o la vitamina E. En una realización particularmente preferida, las plantas , transgénicas de la presente invenpión sobreexpresan o subexpresan los productos codificados por dichos • genes en comparación con las plantas de tipo natural".
En una realización particularmente preferida, la , planta transgénica de la 10 presente invención es maíz.
En una realización particularmente preferida, la planta transgénica de la presente invención es arroz.
En una realización particularmente preferida, la planta transgénica de la presente invención es tabaco,. . .. . .
15 En otra realización, la presente invención se refiere a una planta transgénica obtenida por medio del procedimiento de la presente invención.
En otra realización, la presente invención se refiere al uso de la planta transgénica de la presente invención para la producción de metábolitos derivados de una ruta metábólica.
20 En una realización particularmente preferida, la ruta metábólica de la presente invención se selecciona de la ruta de los carotenoides, la vitamina C y/o la vitamina E. La esencia de esta invención es que el método da como resultado una población de plantas con propiedades diversas que producen y acumulan una gama de diferentes productos útiles en medicina, industrias alimentaria y forrajera, las 2.5 industrias cosmética y farmacéutica, etc.
Se ilustrará la utilidad de la presente invención usando una de las rutas metabólicas más compleja y económicamente significativa, la ruta de los carotenoides. Para demostrar la utilidad y flexibilidad y adaptabilidad adicionales del método, se incluirán también dos transgenés adicionales que codifican para etapas clave y de 30 limitantes de la velocidad en la biosíntesis de vitamina C y foláto, además de un gen marcador seleccionable. Por tanto, a modo de ejemplo, se introducen 8 transgenes en las plantas, pero no existe una razón a priori para creer que el método sea limitante del número de genes de la especie. En otra realización de la presente invención, se contemplan genes que codifican para vitaminas y minerales esenciales adicionales, 35 tales como vitamina E, Fe, Zn, Se, etc., y también para aminoácidos esenciales. Estos rasgos o bien pueden introducirse conjuntamente con genes de carotenoides y otras vitaminas o bien pueden modificarse por ingeniería por separado en una población diferente de plantas que entonces pueden cruzarse posteriormente con otras plantas transgénicas que expresan otros rasgos. Cualquier rasgo o combinación de rasgos cae dentro del alcance de esta invención, por ejemplo anticuerpos, estrés biótico y abiótico, aplicación de bioenergía, etc. Esto puede realizarse en cualquier planta que sea susceptible de transformación genética y a modo de ejemplo se ilustrará esto usando dos importantes plantas de cultivo, maíz y arroz' (véanse los ejemplos). La invención abarca la introducción de un número ilimitado de transgenes en cualquier planta. Una ventaja clave del método dado a conocer es su naturaleza combinatoria junto con una gama de promotores específicos de múltiples órganos que dirigen la expresión de los transgenes transferidos. Por tanto, construyendo un número ilimitado de vectores de expresión individuales que codifican cada uno para al menos una proteína/enzima y dirigidos por una gama de promotores específicos de órgano/tejido, mezclando estos vectores e introduciéndolos entonces en células, vegetales, puede recuperarse una población de plantas que contienen y expresan combinaciones de los transgenes transferidos. Tras generar tal población combinatoria, puede explotarse la población para la producción de un metabolito específico o para una combinación de metabolitos en una planta dada. Una vez que se identifican tales plantasj se captura de manera estable el perfil específico en la semilla y puede mantenerse para siempre. Estas plantas o productos derivados de ellas a través de procesamiento limitado o sofisticado pueden usarse en varias aplicaciones diferentes que incluyen medicina, aromas y fragancias, aditivos en alimentos y piensos, etc. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La figura 1 muestra la ruta de íos carotenoides. Reconstrucción y extensión de la ruta biosintética de carotenoides en el éndospermo de maíz blanco. Una representación esquemática de la acumulación de metabolitos en siete fenotipos distintos. A la derecha, se indica cada fenotipo por separado basándose en el color del éndospermo y la expresión génica con él fin de diseccionar la ruta biosintética de carotenoides así como una extensión de esta ruta para producir cetocarotenoides a partir de β-caroteno. Las barras en las líneas descendentes indican las reacciones enzimáticas que tienen lugar en los diferentes fenotipos.
La figura 2 muestra los constructos/vectores genéticos para la transformación.
Constructos genéticos usados en experimentos de transformación combinatoria. Se indican los promotores de la glutenina de trigo de bajo peso molecular, hordeína de cebada, prolamina de arroz, glutelina-1 de arroz y γ-zeína de maíz. Los constructos anteriores se introdujeron conjuntamente de manera simultánea en plantas tal como se describe en la presente invención.
Figura 3. Separación por HPLC de, carotenoides en maíz WT y transgénicp representativo. Análisis por HPLC de plantas transgénicas representativas que indica su perfil de carotenoides reconstruido como resultado de la transformación genética combinatoria.
La figura 4 muestra el análisis por RT-PCR de acontecimientos transgénicos seleccionados. Análisis de la expresión de ARN para transgenes transferidos en plantas transgénicas representativas generadas a través de la transformación genética combinatoria dada a conocer en la solicitud de patente.
Figura 5. Ruta biosintética del alcaloide indol, segmentos de la cual se introdujeron en tabaco y arroz. Se introdujeron conjuntamente los siguientes transgenes en un experimento de transformación genética combinatoria tal como se previo en la descripción descrita, en la presente solicitud de patente: antranilato sintasa, HMGR, geraniol 10-hidroxilása, triptófano descarboxilasa, estrictosidina sintasa, estrictosidina glucosidasa, desacetoxivindolina 4-hidroxilasa,. desacetilvindolina acetiltransferasa, peroxidasa de rábano. La planta de tabaco y arroz transgénica combinatoria contenía y expresaba diferentes complementos transgénicos. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En la presente invención, se construyeron vectores de transformación que comprendían diferentes promotores específicos de endospermo (glutenina LMW de trigo, hordeína de cebada, prolamina de arroz, glutelina 1 de arroz, zeína de maíz), que codifican para los siguientes transgenes que participan en la biosíntesis de carotenoides: psyl, crtl, lycb, bch, crtW más folE para folato y dhar (un ADNc de longitud completa que se aisló a partir de arroz) para la vitamina C. También se usó el gen marcador seleccionáble bar (expresado constitutivamente para permitir la selección in vitro). En la bibliografía, se ha notificado el uso de un promotor específico de órgano/tejido para dirigir la expresión de transgenes. Sin embargo, esta invención es diferente en este aspecto. En la presente invención, se han usado 5 promotores de este tipo diferentes en combinación y esto no se ha hecho antes. Esto tiene importantes ventajas en el contexto de la ingeniería metabólica en plantas, particularmente para evitar el silenciamiento génico a través del uso del mismo promotor repetidamente. (Esto no se contempla en la bibliografía mencionada.)
Por tanto, se usó un total de 8 transgenes en la presente invención. Se mezclaron los 8 transgenes en un tubo Eppendorf y luego se recubrieron partículas dé oro con la mezcla y posteriormente se bombardeó el tejido de maíz según se ha descrito. Tras la selección con el herbicida fosfinotricina, se recuperaron más de 70 plantas independientes, que contenían y expresaban diferentes combinaciones de los transgenes transferidos.
Varias de las plantas recuperadas contenían y expresaban todos los transgenes, contrariamente a lo que se esperaba. Se clasificaron los genotipos clave (plantas que contenían diferentes combinaciones de transgenes) en grupos basándose en los metabolitos/productos que resultaban de la expresión de los genes transferidos. Se usó el análisis de HPLC para determinar el perfil de metabolitos sintetizados en cada planta. Estas plantas tienen muchos usos. Además de ser útiles directamente en alimentos y piensos para seres humanos y animales, pueden usarse para extraer los numerosos compuestos valiosos y caros que requieren las industrias farmacéutica, alimentaria y forrajera.
A) Preparación de ADN V ARN . , Se recogieron muestras de hojas y endospermo para análisis de extracción de
ADN y ARN extracción, se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -8O0C hasta su uso. Se aisló el ADN genómico de la planta a partir de las hojas según el método de extracción con CTAB para la lisis de los núcleos descrito por Sambrook et al. (1989). Se purificó el ADN genómico de Escherichia coli DH5D según el kit Easy- DNA™ (Invitrogen). Se aisló el ARN de endospermo u hoja total usando el minikit para plantas RNeasy® (QIAGEN).
B) Construcción de vectores
Se clonó ADNc de PSYl de Zea mays a partir de la línea consanguínea de maíz B73 mediante RT-PCR basado en la información del gen PSYl (número de registro de GenBank U32636) usando cebadores con sitios BamHI y EcoRI, enumerados respectivamente en la tabla 2. Se recogió el fragmento de ADN amplificado del tamaño esperado mediante Geneclean (BIO 101, La Jolla, CA) y se subclonó en el vector pGEM®-T (Promega) para generar pGEM-ZmPSYl. Se secuenciaron ambas cadenas de cada fragmento de ADNc en su totalidad. Entonces se subclonó el fragmento de ADNc de ZmPSYl en el plásmido p326 digerido con
' BamHI y EcoRI que alberga el promotor del gen de la glutenina de trigo de bajo peso molecular (LMW) (Colot et al, 1987; Stoger et al., 1999) y el terminador de la nopalina sintasa. El plásmido resultante se designó como p326-ZmPSYl.
Se amplificó el gen Crtl de Pantoea ananatis fusionado en el marco con la señal del péptido de tránsito (TPS) de la subunidad pequeña de la ribulosa bisfosfato carboxilasa de Phaseolus vulgaris (Schreier et al., 1985) en el plásmido pYPIET4 (Misawa et al., 1993) mediante los cebadores con sitios Xbal y EcoRI, respectivamente (tabla 2) y se subclonó en el vector pGEM®-T para dar lugar a pGEM-PaCrtl con TPS. Se clonó el fragmento de ADN del gen Crtl fusionado con TPS en el plásmido pHor-P' entre el promotor de D-hordeíha de cebada (Sorensen et al., 1996) y el terminador del gen de" la ADPGPP (ADP-glucosa pirofosforilasa) de arroz para generar pHor-P-PaCrtl. ,
Se amplificó el gen LYCB de .Gentiana lútea mediante PCR habitual usando ADN del plásmido pBluescript-GlLYCB (Zhu et al., 2003) como molde usando los cebadores con BamHI y Kpnl, respectivamente (tabla 2) y se subclonó en el vector pGEM-T easy para producir pGEM®-GlLYCB. Se digirió pGEM-GlLYCB mediante BamHI y luego se digirió parcialmente mediante EcoRI y se ligó el fragmento de LYCB de longitud completa liberado con el plásmido pRP5 digerido con las mismas enzimas para dar lugar a pRP5-GlLYCB. El plásmido pRP5 contiene el promotor PR5 del gen de la prolamina de arroz (Su et al. 2001) y el terminador de la nopalina sintasa. Se amplificó el fragmento de ADNc de BCH de Zea mays se amplificó a partir de la línea consanguínea de maíz B73 mediante RT-PCR basado en la información del gen BCH (número de registro de GenBank AY84495) usando cebadores con sitios BamHI y Xbal, enumerados respectivamente en la tabla 2 y se subclonó en el vector pGEM®-T easy (Promega) para generar pGEM-ZmBCH. Se digirió este ADN de plásmido mediante EcoRI y Xbal, y se insertó el fragmento de ADNc de BCH resultante en el plásmido pHor-P digerido con las mismas enzimas para dar lugar a pHor-P-AntisenseZmBCH. Para ARNi o ZmBCH antisentidó, se tiene como objetivo específicamente aumentos en el beta-caroteno. Esto significa que las transformaciones se llevan a cabo con una mezcla de psyl , crtl, lycb, ZmBCH antisentido más los genes para la vitamina C y el folato (dhar, folE) y cualquier otro gen que codifique para otras vitaminas o rasgos.
Se amplificó el gen BCH de Gentiana lútea usando ADN del plásmido pBluescript-GIBCH (Zhu et al., 2003) como molde mediante PCR usando los cebadores con sitios Notl y Sacl, enumerados respectivamente en la tabla 2, y se subclonó en el vector pGEM®-T easy para producir pGEM-GIBCH. Se digirió este
ADN de plásmido con Notl y se ligó en el vector pTO 126, que contenía el promotor del gen de la glutelina-1 (GtI) de arroz (Okita et al., 1989; Washida et al., 1999) y el terminador del gen de la ADPGPP (ADP-glucosa pirofosforilasa) de arroz para generar pTO126-GlBCH. Se obtuvo la orientación correcta mediante PCR y análisis de digestión con enzimas. Se amplificó el gen crtW de Paracoccus sp: N81106 fusionado en el marco con la señal de péptido del tránsito (TPS) de la subunidád pequeña de ribulosa bisfosfato carboxilasa de Phaseolus vulgaris (Schreier et al., 1985) en el plásmido p35W2AZ (Ralley et al., 2004) mediante los cebadores con sitios BamHI y EcoRI, respectivamente (tabla 2) y se subclonó en el vector pGEM®-T easy para dar lugar a pGEM-ParococcusCrtW con TPS. Se clonó el fragmento de ADN del gen CrtW fusionado con TPS en el plásmido pGZ63 entre el promotor de la γ-zeína de maíz (Torrent et al., 1997) y el terminador de la nopalina sintasa para generar pGZ63- ParacoccusCrtW. , Se aisló el ADNc de DHAR de longitud completa de Oryza sativa a partir del cultivar EYIÍ05 mediante RT-PCR basado en la información del ARNm de DHAR (número de registro de GenBank: AY074786) usando cebadores con sitios Xbal y EcoRI, enumerados respectivamente en la tabla 2 y se subclonó en el vector ρCR®II- TOPO (Invitrogen) para generar pCR-OsDHAR, Se subclonó el fragmento de ADNc de DHAR en el plásmido pHor-P digerido con Xbal y EcoRI. El plásmido resultante se designó cómo pHor-P-OsDHAR.
Se amplificó el gen folE de Escherichia coli a partir de ADN genómico de E. coli DH5 D basado en lá información del gen folE (número de registro de GenBank: - X63910) usando cebadores con sitios BamHI y Sacl, enumerados respectivamente en • la tabla 2 y se subclonó en el vector pGEM®-T easy (Invitrogen) para generar pGEM- EcfolE. Se digirió este ADN de plásmido mediante Notl y Sacl, y se insertó el fragmento de ADN de folE resultante en el plásmido pHor-P digerido con las mismas enzimas para dar lugar a pHor-P-EcfolE.
Se verificaron todos los constructos de transformación mencionados ' anteriormente mediante secuenciación.
En todos los experimentos de transformación, se usó el plásmido ρAHC20 (Christensen y Quail, 1996) que contiene el gen bar, para el bombardeo conjunto, para la selección con fosfinotricina. Tabla 2 Secuencias de oligonucleótido de los cebadores de PCR para la construcción de vectores gen PSYl de Zea mays
SEQ ID NO: 1
SEQ ID NO: 2 gen Crtl de Pantoea ananatis
SEQ ID NO: 3
SEQ ID NOr 4 gen LYCB de Gentiana lútea
SEQ ID NO: 5
SEQ ID NO: 6 gen BCH de Zea mays
SEQ ID NO: 7
SEQ ID.N0: 8 . . gen BCH de Gentiana lútea
SEQ ED NO: 9
SEQ ID NO: 10 gen CrtW de Paracoccus sp. N81106
SEQ ID NO: 11
SEQ ID NO: 12 gen DHAR de Orazy sativa
SEQ ED NO: 13
SEQ ID NO: 14 gen folE de Escherichia coli
SEQ ID NO: 15
SEQ ID NO: 16
C) Transformación y material vegetal , , ,
Se hicieron crecer plantas de maíz (Zea mays L., cv. M37W, cultivar de maíz de endospermo blanco, carente en general de carotenoides) en el invernadero y la sala de crecimiento a una temperatura diurna/nocturna de 28/2O0C con un fotόperiodo de
10 h y humedad relativa del 60-90% durante los primeros 50 días, seguido por mantenimiento a una temperatura diurna/nocturna de 21/18°C con un fotoperiodo de
16 h después. Se extrajeron asépticamente embriones cigóticos inmaduros (ECI) M37W a los 10-14 días tras la polinización y se cultivaron en medio N6. Tras un cultivo de 5 días, se bombardearon los embriones con 10 mg de partículas de oro recubiertas (Christou et al., 1991). Se incubaron los tejidos diana en medio N6 que contenía un alto contenido en osmótico (manitol 0,2 M, sorbitol 0,2 M) durante de 5 a 6 horas antes del bombardeo y de 10 a 16 horas tras el bombardeo. Se recubrieron las partículas de oro a una razón molar de 3:1 del gen de interés (haciendo ajustes para el tamaño de cada constructo) y plásmido de marcador seleccionable derivado del plásmido pAHC20 que contiene el gen bar (Christensen y Quail, 1996) para la transformación conjunta (Christou et al., 1991). Se seleccionó el callo bombardeado en medio complementado con fosfinotrina según se describió previamente (Drakakaki et al., 2005). Se regeneraron satisfactoriamente las plantas transgénicas y se aclimataron al suelo. Se seleccionaron setenta acontecimientos independientes en total para el análisis en profundidad. En consecuencia, se identificaron acontecimientos transgénicos independientes y se caracterizaron mediante análisis de PCR de ADN genómico y de inmunotransferencia de tipo Southern. Los transformantes primarios o bien se polinizaron con M37W no transformado y/o plantas de endospermo amarillo, respectivamente, o bien se autopolinizaron para producir semillas Tl . Se regensraron. las plantas control no transformadas (NC) a partir del mismo lote de material calloso que se usó para la transformación. Se hicieron crecer todas las plantas control al mismo tiempo y en las mismas condiciones de crecimiento que las líneas transgénicas. D) PCR de ADN genómico
Se usó el análisis de PCR del ADN genómico de las hojas para identificar las líneas de maíz transgénicas y para determinar el complemento transgénico de cada línea, su integridad y su probabilidad de expresión. Se diseñaron tres conjuntos de cebadores tal como se indica en la tabla 3. El conjunto 1 de cebadores es para el promotor y el transgén (cebador directo ubicado en el promotor y cebador inverso en el transgén); el conjunto 2 de cebadores es para el transgén únicamente (ambos cebadores en el transgén); el conjunto 3 de cebadores es para el transgén y el - terminador (cebador directo en el transgén y cebador inverso ubicado en el terminador). Se usaron los ADN de plásmido de expresión con transgén apropiados como controles positivos.
Se llevaron a cabo las reacciones de PCR en una solución de 20 μl que contenía tampón de reacción de PCR (tampón de reacción GoTaq®, Promega), MgCl2
1,5 mM, cada dNTP 0,2 mM, cada uno de los cebadores directos e inversos lμM, 100 ng de ADN genómico y 0,5 unidades de ADN polimerasá GoTaq®. El programa de PCR usado fue de 95°C durante 3 min., seguido por 30 ciclos de 940C durante 45 seg., 6O0C durante 45 seg., 720C durante 90 seg. y una extensión final a 720C durante 5 min. Entonces se verificaron los productos de la PCR realizando una electroforesis en geles de agarosa al 1,0 %. Tabla 3 Secuencias de oligonucleótido de los ^cebadores de PCR para plantas transgénicas
Transgenes Conjunto 1 de Conjunto 2 de Conjunto 3 de cebadores cebadores cebadores
ZmPSYl SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 21 SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 22
PaCrtl SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO: 25 SEQ ID NO: 27 SEQ ID NO: 24 SEQ ID NO: 26 SEQ ID NO: 28
GlLYCB SEQ ID NO: 29 SEQ ID NO: 31 SEQ ID NO: 33 SEQ ID NO: 30 SEQ ID NO: 32 SEQ ID NO: 34
ZmBCH SEQ ID NO: 35 SEQ ID NO: ,37 SEQ ID NO: 39 SEQ ID NO: 36 SEQ ID NO: 38 SEQ ID NO: 40
GlBCH SEQ ID NO: 41 SEQ ID NO: 43 SEQ ID NO: 45 SEQ ID NO: 42 SEQ ID NO: 44 SEQ ID NO: 46 Paracoccus- SEQ ID NO: 47 SEQ ID NO: 49 SEQ ID NO: 51 CrtW SEQ ID NO: 48 SEQ ID NO: 50 SEQ ID NO: 52
OsDHAR SEQ ID NO: 53 SEQ ID NO: 55 SEQ ID NO: 57 SEQ ID NO: 54 SEQ ID NO: 56 SEQ ID NO: 58 EcfolE SEQ ID NO: 59 SEQ ID NO: 61 SEQ ID NO: 63
SEQ ID NO: 60 SEQ ID NO: 62 SEQ ID NO: 64 E) RT-PCR para análisis de la expresión
Se extrajo el ARN de 120 mg de endospernαo de maíz (30 semillas DAP) usando Trizol (1,20 mi) y cloroformo (0,25 mi). Se usó isopropanol (0,6 mi) para sedimentar el ADN en el extracto. Tras lavar el sedimento con etanol, se llevó a cabo la purificación del ARN usando el minikit para plantas RNAeasy de Qiagen
(QIAGEN, Hilden, Alemania).
Se trató el ARN total (2 μg) con ADNasa (ADNasa. libre de ARNasa RQl (Promega) antes de someterse a transcripción inversa según el protocolo del kit de transcripción inversa Omniscript(B) (QIAGEN, Hilden, Alemania), para generar el molde de ADNc de primera hebra. Se usaron cebadores del gen de la actina de maíz
(número de registro de GenBank J01238) (SEQ ID NO: 65 y SEQ ID NO: 66) como control para monitorizar la calidad del ADNc y la contaminación del ADN. Las secuencias de cebadores usadas fueron las mismas que las del conjunto 2 de cebadores de PCR de ADN genómico (tabla 3). Se llevaron a cabo las reacciones de PCR en una solución de 20 μl que contenía tampón de reacción de PCR (tampón de reacción
GoTaq®, Promega), MgCl2 1,5 mM, cada dNTP 0,2 mM, cada uno de los cebadores directos é inversos 1 μM, 1,25 μl de solución de RT-PCR y 0,5 unidades de ADN polimersa GoTaq®. El programa de PCR usado fue de 950C durante 3 min., seguido por 30 ciclos de 940C durante 45 seg, 550C durante 45 seg, 720C durante 90 seg y una extensión final a 72°C durante 5 min. Entonces se verificaron los productos de la PCR realizando una electroforesis en geles de agarosa al 1,0 %.
F) Análisis de carotenoides, tocoferoles, ácido ascórbico y folato
Se recogieron muestras de hojas y endospermo para 'análisis de HPLC, se liofilizaron y se almacenaron a -200C hasta su uso.
F.l) Extracción y análisis de carotenoides y tocoferoles El procedimiento de extracción empleado es una modificación del método descrito por Weber (1987) y Kurlich & Juvik (1999). Todas las preparaciones y extracciones de muestras se realizaron bajo luces fluorescentes doradas. Se sometió el endospermo de maíz (600 mg) a precipitación con etanol durante 5 min. (6 mi de etanol que contenían un 0,1% de bidroxitolueno butilado (BHT) en un baño de agua a 850C antes de someterse a saponificación durante 10 min. con 120 μl de hidróxido de potasio (KOH) al 80%. Se agitaron en vórtex todas las muestras una vez durante la saponificación. Con la eliminación, se pusieron inmediatamente en un baño de hielo en el que se añadieron 3 mi de agua destilada desionizada fría. Entonces, cada muestra recibió 3 mi de hexano, se agitó en vórtex y luego se centrifugó durante 10 min. a 1200 g. Se pipeteó la fase superior a un tubo de ensayo separado, y se volvió a extraer el sedimento dos veces usando hexano. Se lavaron las fracciones de hexano combinadas con 3 mi de agua destilada desionizada, se agitaron en vórtex y se centrifugaron durante 10 min. a 1200 g, antes de pipetearse a otro tubo de ensayo. Se redujo por secado la fracción de hexano en un evaporador a vacío, y se reconstituyeron las muestras con 200 mi de acetonitrilo:metanol:cloruro de metileno (45:20:35, v/v/v) antes de su inyección en un cromatógrafo de líquidos de alta resolución (HPLC).
Se separaron los carotenoides y los tocoferoles y se cuantificaron mediante HPLC usando detección UV-VIS. Se conectó una columna Vydac 201TP54, de fase inversa C18, 5 μm, 4,6 x 150 mm (Separation Group, Hesperia, CA) a una columna Waters Nova-Pak de fase inversa C18, 4 μm, 3,9 x 150 mm (Water Chromatography, Milford, MA). Se protegieron las columnas mediante una precolumna Adsorbosphere de fase inversa C18, 5 μm, 4,6 x 7,5 mm (Alltech Assoc, Deerfield, IL). El sistema de HPLC consistía en un desgasificador ERC 3510 de ERMA Óptima LTD (Anspec Co., Ann Arbor, MI), una bomba Waters 510, un inyector automático 731a y un detector UV-VIS de múltiples longitudes de onda 490E (Waters Chromatography, Milford, MA). Se recogieron los datos y se trataron usando el software Waters Millenium 2010 (Waters Chromatography, Milford, MA). La fase móvil consistía en acetonitrilo:metanol:cloruro de inetileno (75:20:5? v/v/v), que contenía un 0,05% de trietilamina (TEA) y un 0,1% de hidroxitolueno butilado (BHT) (Hart y Scott, 1995). La velocidad de flujo era de 1,8 ml/min a temperatura ambiente. Para maximizar la detección, se midió la ábsorbancia a 450 para los carotenoides y tocoferoles, respectivamente. Se adquirieron las muestras patrón (β-caroteno, α-caroteno, luteína, iδ-criρtoxantina, zeaxantina, astaxantina, equinenona, canxantina, α-tocoferol, β- tocoferol, δ-tocoferol y γ-tocoferol) de Sigma. Protocolo alternativo usado para la extracción de carotenoides: Se molieron muestras liofilizadas hasta un polvo fino. Se incubaron las muestras en tetrahidroturano (THF) + metanol (50:50) a 65°C durante 20 min., se vertió la mezcla en un matraz de separación y con el fin de eliminar el residuo sólido, se llevó a cabo una filtración usando un papel de filtro. Para el reparto, se añadió petróleo-éter (90:10). Se eliminaron los residuos de acetona, metanol y THF lavando 2 veces con agua. Se recogió la fase orgánica que contenía los carotenoides en tubos de vidrio y se secó bajo N2, se almacenó a -2O0C hasta su uso. Se llevó a cabo todo el procedimiento de extracción en una campana extractora en la oscuridad. Se usó una columna Hypersil Cl 8 para el análisis. La fase móvil usada era una mezcla de acetonitrilo : metanol : 2rpropanol (425 mi : 50 mi : 25 mi). F.2) Extracción y análisis de ácido ascórbico i Ensayo 1 : Mediciones de AsA, DHA, GSH y glutatión oxidado (GSSG). Se midió AsA tal como se describe (Foyer, C. H., Rowell, J. & Walker, D. (1983) Measurement of the ascorbate contení of spinach leaf protoplasts and chloroplasts during illumination. Planta 157: 239—244). Se molieron muestras de endospermo de maíz en HClO4 2,5 M y se centrifugaron a 13.000 rpm (centrífuga Eppendorf 5417C) durante 10 min. Se añadieron dos volúmenes de Na2CO3 1,25 M al sobrenadante, y tras la centrifugación, se añadieron 100 μl de la mezcla a 895 μl de K2HPO4ZKHaPO4 100 mM, pH 5,6. Se determinó AsA mediante el cambio en la ábsorbancia a 265 nm tras la adición de 0,25 unidades de ascorbato oxidasa. Se determinó la cantidad total de ácido ascórbico reducido y oxidado (es decir, AsA y DHA) reduciendo DHA en AsA (en una reacción que contenía K2HPO4ZKH2PO4 100 mM a pH 6,5, GSH 2 mM, y 0,1 μg de proteína DHAR de trigo recombinante incubada a 25°C durante 20 min.) antes de medir AsA. Se determinó la cantidad de DHA como la diferencia entre estos dos ensayos. Se determinaron GSH y GSSG a partir de las hojas, tal como se describe (Griffith, O. W. (1980) Determination of glutathione and glutathione disulfide using glutathione reducíase and 2-vinylρyridine. Anal. Biochem. 106: 207-212). Ensayos enzimáticos. Se sometió a ensayo la actividad de DHAR esencialmente tal como se describe (Hossain, M. A. & Asada, K. (1984) Purification of dehydroascorbate reducíase from spinach and its characterization as a thiol enzyme. Plant CeIl Physiol. 25: 85-92.). Se molió endospermo de maíz en tampón de extracción (Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, NaCl2 100 mM, EDTA mM, MgCl2 1 mM), y se obtuvo la proteína soluble tras una centrifugación durante 5 min. a 13.000 rpm. Se sometió a ensayo DHAR a partir de una cantidad igual de proteína tal como se describe (24) en K2HPCVKH2PO4 50 mM, pH 6,5, DHA 0,5 mM / GSH 1 mM, y se siguió su actividad mediante un aumento en la absorbancia a 265 nm. Se determinaron las actividades de glutatión reductasa (GR), MDHAR, ascorbato peroxidasa (APX), L- galactono-l,4-lactona deshidrogenasa (GLDH), superóxido dismutasa (SOD) y catalasa (CAT) tal como se describe (Foyer, C. & Halliwell, B. (1976) Presence of glutathione and glutathione reducíase in chloroplasts: a proposed role for in ascorbic acid meíabolism. Plañía 133, 21-25; de Pinto, M. C1 Tommasi, F. & De Gara, L. (2000) Changes in íhe aníioxidanl systems as parí of the signaling pathway responsible for the programmed cell death activaíed by niíric oxide and reactive oxygen species in tobáceo Brighí-Yellow 2 cells. Plañí Physiol. Biochem. 38:541-550; Gainnopolitis, C. N. & Pies, S. K. (1977) Superoxide dismuíases. I. Occurrence in higher plañís. Plañí Physiol. 59: 309-314; Aebi, H. (1984) Caíalase in viíro. Meíhods Enzymol. 105: 121- 126; Jiménez, A., Hernández, J. A., Del Rio, L. A. & Sevilla, F. (1997) vidence for íhe
Presence of íhe Ascorbaíe-Gluíathione Cycle in Miíochondria and Peroxisomes of Pea Leaves. Plañí Physiol. 114: 275-284.).
Ensayo 2: Se prepararon exíracíos para el análisis de ascorbaío según Kurlich eí al (1999) mezclando 100 mi de ácido m-fosfórico al 1% y 25 g de tejido fresco congelado en una mezcladora Waring durante 2 min. Se lavaron los laíerales del recipieníe de la mezcladora con ácido m-fosfórico al 1% (50 mi) y se mezcló duraníe 2 min. adicionales. Se ajustó la suspensión hasta 250 mi con m-HPO3 al 1% y se filtró entonces usando papel de filtro ondulado Whatman 2V. Se mezclaron un mililitro de filtrado y 1 mi de dilioíreiíol al 5%. Se diluyeron exíracíos de muesíra hasía 10 mi con m-HPO3 al 1%. Se filtró la muesíra a través de un filtro de 0,20 μm, y se inyectaron 10 μl en el cromatógrafo de líquidos. Se siguió íambién un método alternativo tal como se describé en Chen et al 2003. r
Se midieron las concentraciones de ascorbaío usando un sisíema de HPLC isocráíica que consistía en un controlador Beckman modelo 421, una bomba Beckman modelo 100A y un iníegrador Beckman Alíex C-RlA. El deíecíor era un Waíers M-
490 programable de múltiples longitudes de onda (Millipore, St. Louis, MO.). La fase estacionaria era una columna Rainin Dynamax -60 Á de amina, de 4,6 X 250 mm protegida por una precolumna Rainin Dynamax de amina de 8 μm, 1,5 cm (Varion, Walnut Creek, CA). La fase móvil consistía en acetonitrilo/KH2PO4 0,05 M (pH 5,95), 75:25. La detección fue a 268 nm con una sensibilidad de 0,02 AUFS, La velocidad de 5 flujo fue de 1,5 ml/min.
Se prepararon patrones de ácido ascórbico (USPC, Inc., Rockville, MD) diluyendo 0,01 (0,002 g de ácido L-ascórbico de calidad USP hasta 100 mi con m- HPO3 al 1%; Se mezcló esta solución (1 mi) con ditiotreitol al 5% (1 mi) y se diluyó hasta 10 mi con m-HPO3 al 1% para producir un patrón de 10 ppm de ácido ascórbico.
10. F.3. Extracción y análisis de folatos .
Se realizó el análisis de folato tal como se describe por De la Garza et al. (2004), Se extrajeron los folatos de endospermo de maíz (0,5-1,0 g) mediante homogeneización con Polytron en 10 mi de Na-Hepes 50 mM/ácido 2-(N- ciclohexilamino)etanosulfónico 50 mM ajustado hasta pH 7,9 con HCl que contenía
15 CaCl2 1 mM, ascorbato de Na al 2% (p/v) y 2-mercaptoetanol 10 mM, seguido por ebullición durante 10 min. y centrifugación (13.000 g) durante 10 min. Se volvió a extraer el sedimento de la misma forma. Se trataron los extractos combinados con 1 mi de plasma dé- rata dializado a 37°C durante 2 h para eliminar los grupos, glutamilo de los folatos. Entonces se sometieron a ebullición las muestras durante 15 min., se
20 centrifugaron como anteriormente, se filtraron a través de lana de vidrio y se aplicaron a columna de afinidad de folatό preparadas tal como se describe por Gregory & Toth (1988). Tras lavar con 5 mi de fosfato de K 25 mM (pH 7,0)/ascorbato de Na al 1% (tampón 1) que contenía NaCl 1 mM, luego con 5 mi de tampón 1 solo, se eluyeron las columnas con 5 mi de fase móvil A de análisis por HPLC (tampón A, K2HPQ4 28 25 mM y H3PO4 0,59 mM, pH 2,5) que contenía ácido ascórbico al 1%. Se tomaron muestras del eluato (400 μl) para el análisis por HPLC con detección electroquímica, usando una columna Prodigy ODS2 de 5 μm, 150 x 3,2 mm (Phenomenex) y un detector de cuatro canales (CoulArray modelo 5600A, ESA, Chelmsford, MA) con potenciales fijados a 0, 300, 500 y 600 mV. La fase móvil era una mezcla binaria de
30 K2HPO4 28 mM y H3PO4 0,59 mM (pH 2,5) (tampón A) y una mezcla del 75% (v/v) de tampón A y el 25% de CH3CN (tampón B) con un programa de elución no lineal de 55 min. desde el 90% de tampón A hasta el 100% de tampón B a 1 mi por min. Se calibró la respuesta del detector usando patrones dé THF (tetrahidrofolato), 5-metil- . THF, 5,10-metü-THF, ,5-formil-THF y ácido fólico de Schircks.. 35 Bibliografía , , Ma, J K-C, Drake, PMW5 Christou, P (2003). The production of recombinant
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Claims

REIVINDICACIONES 1.- Procedimiento de obtención de, plantas transgénicas, caracterizado porque
1 dichas plantas se obtienen por medio de transformación genética combinatoria.
2.- Procedimiento de obtención de plantas transgénicas según la reivindicación 1, en el que la transformación genética combinatoria comprende la transformación conjunta en dichas plantas de un número ilimitado de genes.
3.- Procedimiento de obtención de plantas transgénicas según la reivindicación 2, en el que la transformación genética combinatoria comprende 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 genes introducidos conjuntamente.
4.- Procedimiento de obtención de plantas transgénicas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los genes participan en una ruta metabólica.
5.- Procedimiento de obtención de plantas transgénicas según la reivindicación 4, en el que la ruta metabólica se selecciona de la ruta de los carotenoides, la vitamina C y/o la vitamina E.
6.- Procedimiento de obtención de plantas transgénicas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las plantas transgénicas sobreexpresan o subexpresan los productos codificados por dichos genes en comparación con las plantas de tipo natural.
7.- Procedimiento de obtención de plantas transgénicas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la planta transgénica es maíz.
8.- Procedimiento de obtención de plantas transgénicas según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que la planta transgénica es arroz.
9.- Procedimiento de obtención de plantas transgénicas según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que la planta transgénica es tabaco.
10.- Planta transgénica obtenida por medio de un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
11.- Uso de una planta transgénica según la reivindicación 10, para la producción de metabolitos derivados de una ruta metabólica.
12.- Uso de una planta transgénica según la reivindicación 11, en el que la ruta metabólica se selecciona de la ruta de los carotenoides, la vitamina C, el folato y/o la vitamina E.
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