ES2340119B1 - Metodo para crear una poblacion combinatoria de plantas transgenicas que expresan y acumulan una diversidad de metabolitos valiosos. - Google Patents

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Abstract

Método para crear una población combinatoria de plantas transgénicas que expresan y acumulan una diversidad de metabolitos valiosos.
La presente invención pertenece al campo técnico de la biotecnología vegetal y en particular se refiere a un método novedoso para obtener muchos análogos, derivados, metabolitos precursores diferentes de compuestos valiosos en una ruta biosintética a partir de una población novedosa de plantas generada a través de un método de transformación genética. Dicha población expresa y acumula perfiles únicos de compuestos valiosos en una ruta.

Description

Método para crear una población combinatoria de plantas transgénicas que expresan y acumulan una diversidad de metabolitos valiosos.
Campo técnico
La presente invención pertenece al campo técnico de la biotecnología vegetal y en particular se refiere a un método novedoso para obtener muchos análogos, derivados, metabolitos precursores diferentes de compuestos valiosos en una ruta biosintética a partir de una población novedosa de plantas generada a través de un método de transformación genética. Dicha población expresa y acumula perfiles únicos de compuestos valiosos en una ruta.
Técnica anterior
Desde la creación de las primeras plantas transgénicas en los primeros años 80 que expresaban transgenes individuales junto con un gen marcador seleccionable/detectable, se ha atestiguado una plétora de ejemplos en muchas especies de plantas diferentes, mediante los cuales se introdujeron uno o relativamente pocos transgenes o bien de manera secuencial o bien concomitante en plantas. La mayoría de las plantas transgénicas resultantes expresaban rasgos genéticos individuales, por ejemplo resistencia a insectos o tolerancia a herbicidas, tolerancia a diversos estreses, rasgos relacionados con el desarrollo y la morfología de la planta, manipulación del almacenamiento de semillas y otras proteínas y similares. En el contexto de la creación de plantas que contienen lo que se denomina comúnmente "rasgos de producción o de valor añadido", existe un grave obstáculo que es necesario superar, es decir, formas generales y eficaces de introducir en las plantas múltiples transgenes que necesitan expresarse secuencial y coordinadamente de manera que imite/potencie rutas de múltiples etapas endógenas o reconstituya rutas exógenas.
La manipulación de rasgos complejos esta comenzando ahora a tener lugar y algunos ejemplos iniciales incluyen la creación de plantas transgénicas que expresan anticuerpos secretores (Ma et al., 2003, Nicholson et al., 2005), producción de productos químicos industriales tales como bioplásticos (Van Beilen y Poirer 2007, Moire et al., 2003, Poirer et al., 1992), modificación de almidón (Firouzabadi et al., 2007), ácidos grasos (Truska et al., 2006, Qi et al., 2004, Abdadi et al., 2004, Wu et al., 2005) y coloración de flores (Tanaka et al., 2005), modificación por ingeniería de especies leñosas con composición alterada de lignina (Halpin 2004, Hopkins et al., 2007, Campbell et al., 2003), plantas para bioenergía (Sticklen et al., 2006, Biswass et al., 2006), la creación de germoplasma con niveles alterados de poliaminas y aminoácidos (Altenbach et al., 1992, Galili y Hofgen 2002) y vitaminas (Ye et al., 2000, Ducreaux et al, 2005, Diretto et al., 2005, Shintani y Della-Penna, 1998, Van Eenennaam et al., 2003). Ahora es evidente a partir de estos y otros ejemplos que la etapa de transferencia génica, es decir, la introducción de varios transgenes en una planta puede ser posible y quizá en alguna ocasión de rutina. Sin embargo, esto está limitado en la mayoría de los casos a dos o tres y en raras ocasiones a unos cuantos transgenes más. Varios informes describen incluso la introducción de múltiples transgenes en células de semilla de soja (12 plásmidos, Hadi et al., 1996) y plantas de arroz (14 transgenes, Chen et al; 9 transgenes, Wu et al., 2002). Sin embargo, en estos ejemplos los transgenes eran independientes entre sí, es decir, no eran parte de una ruta metabólica/biosintética. Además, no está claro a partir de estos ejemplos cómo se expresan realmente muchos de los transgenes transferidos y a qué niveles. En consecuencia, estos ejemplos sólo demuestran que es posible introducir múltiples genes en plantas pero no se proporciona información sobre la expresión o segregación no deseable en generaciones posteriores, de manera crucial para transgenes que necesitan expresarse coordinadamente como componentes de una ruta metabólica/biosintética. Varios informes posteriores cuestionan la utilidad de tales enfoques precisamente debido a las dos limitaciones de falta de expresión y segregación a través de la progenie (véase a continuación).
"Halpin C. 2005. Gene stacking in transgenic plants-the challenge for 21^{st} century plant biotechnology. Plant Biotech J. 3: 141-155". En este artículo, el autor identifica la modificación por ingeniería de múltiples genes, especialmente aplicada a rutas metabólicas, como la restricción principal de la biotecnología vegetal contemporánea que detiene la modificación por ingeniería de plantas para rasgos complejos y multigénicos.
"Ralley et al., 2004 Metabolic engineering of ketocarotenoid formation in higher plants The Plant J. 39:477-486". Las estrategias usadas en este artículo para introducir rutas de múltiples etapas en plantas superiores han estado precedidas clásicamente por la realización de experimentos de transformación individuales, caracterizando luego la progenie y cruzando posteriormente líneas adecuadas (Ma et al., 1995). También se han usado enfoques de transformación conjunta o nueva transformación pero es improbable que logren la expresión coordinada. Como alternativa, este artículo describe el uso de transgenes ligados que producen una poliproteína que se escinde mediante una secuencia autoescindible corta. Esto se pone como ejemplo para 2 genes sólo (véase la página 483, discusión, columna izquierda).
"Halpin et al., 1999 Self-processing 2A-polyproteins-a system for co-ordinate expression of múltiple proteins in transgenic plants. The Plant J 17:453-459""Achieving co-ordinate, high level and stable expression of múltiple transgenes in plants is currently difficult". Este artículo sólo demuestra el concepto con 2 genes, no más, tal como se demuestra en la presente invención.
"Kourtz et al., 2005 A novel thiolase-reductase gene fusión promotes the production of polyhydroxybutyrate in Arabidopsis. Plant Biotechnol J 3:435-447". Este artículo muestra claramente los tipos de experimentos difíciles que será necesario realizar para lograr la modificación compleja por ingeniería de rasgos múltiples y, en esencia, esto apoya la novedad de la presente invención.
"Daniell and Dhingra 2002 Multigene engineering: dawn of an exciting new era in biotechnology. Current Opinión in Biotechnology 13:136-141". Este es otro artículo que apoya la novedad de la presente invención por varias razones. En primer lugar, identifica problemas que ha resuelto el método de la presente invención (véase la primera página de la introducción en este artículo). De manera igualmente importante, sugiere que la modificación por ingeniería de plastos resolverá todos los problemas de la modificación por ingeniería metabólica, pero a pesar del hecho de que este artículo se redactó en 2002, no se han publicado artículos desde esa fecha que den ejemplos específicos y demuestren las ventajas de la modificación por ingeniería de plastos, particularmente para la modificación por ingeniería de rutas metabólicas que requieren la inserción de múltiples genes y su expresión coordinada. Todavía queda por demostrar para múltiples genes (más de 2-3).
"Halpin and Boerjan 2003 Stacking transgenes in forest trees. Trends in plant Science 8:363" Este documento establece los problemas con la modificación por ingeniería de múltiples genes y esto apoya de nuevo la novedad de la presente invención.
"Wurtzel 2004 Genomics, Genetics and biochemistry of maize carotenoid biosynthesis in ``Secondary metabolism in Model systems'' Recent Advances in Phytochemistry Vol 38: 85-110, JT Romeo Edt, Elsevier 2004". En las páginas 102-103, el autor reivindica que: ". . . en el maíz, la manipulación de carotenoides sólo será posible si se elimina una serie de restricciones. Específicamente, entender completamente cómo está regulada la ruta en cuanto a la expresión génica, ubicación de actividades enzimáticas y flujo de sustratos. El autor establece además que la tecnología está limitada por las deficiencias actuales en el entendimiento de la expresión de genes endógenos. Se sabe poco sobre las interacciones entre rutas endógenas e introducidas y su competencia por los sustratos. El descubrimiento de que muchas de las enzimas del maíz están codificadas por pequeñas familias de genes hace las cosas incluso más complicadas (véase el texto). La compartimentalización en diferentes orgánulos subcelulares también se presenta como un problema". La metodología reivindicada en la presente invención muestra que esto no es así y de hecho se puede lograr lo que el autor reivindica que no es posible sin preocuparse de todos los problemas que surgen.
El WO2006096392 se refiere principalmente al descubrimiento de genes. El componente principal de dicha solicitud de patente es una metodología para generar una multitud de genes y análogos usando tecnología de evolución molecular, incluyendo intercambio génico todo con el propósito de crear una diversidad máxima in vitro en cuanto a genes detectables que codificarían para proteínas/enzimas con actividad carotenogénica. Se describe una gama de otras técnicas incluyendo métodos basados en PCR y mutagénesis, de nuevo todos dirigidos a la creación de bibliotecas de proteínas y genes para la selección. Se usa mutagénesis de saturación de sitio junto con intercambio, quimerización, recombinación y otros procedimientos de mutagenización, junto con selección. El centro de atención de esta patente es clonar enzimas y sus genes correspondientes usando una variedad de enfoques de rutina así como novedosos y el uso de enfoques convencionales para sobreexpresar o regular por disminución genes específicos que participan en las rutas de los carotenoides y relacionadas con el objetivo de crear una fuente para el aislamiento de carotenoides valiosos. Tales fuentes incluyen células microbianas y de organismos superiores y animales y plantas intactos.
Por tanto, la solicitud de patente mencionada no constituye técnica anterior para la presente solicitud a pesar del hecho de que ciertas reivindicaciones se refieren implícitamente a la modificación por ingeniería de múltiples genes.
La invención del documento WO2006068946 se refiere a un constructo de ácido nucleico que tiene una molécula de ácido nucleico configurada para silenciar la expresión de [beta]-caroteno hidroxilasa en la patata. La invención proporciona una estrategia para modificar el contenido en provitamina A de plantas basándose no en la reconstrucción de la ruta de los carotenoides, sino en su lugar en la atenuación de la acción de un gen carotenogénico individual que se expresa todavía en la planta. Los inventores establecen que la principal ventaja de su invención es que resulta un aumento en el beta-caroteno mediante la simple "desactivación" de un gen, en oposición a la inserción de un gen foráneo. Sólo se pone como ejemplo la transformación de la patata con un gen. Todas las reivindicaciones se refieren a un gen específico y no a la modificación por ingeniería de múltiples genes. Solo se reivindica el beta-caroteno, no otros carotenoides. Por tanto, la solicitud de patente mencionada no es relevante para la presente invención.
El documento WO2004085656, esta solicitud de patente se refiere a la provisión de polinucleótidos mejorados que proporcionan un aumento de la acumulación de carotenoides en plantas y en particular en las semillas de dichas plantas. La invención también proporciona material vegetal, plantas y semillas que comprenden los polinucleótidos, en particular material vegetal de arroz, plantas de arroz y semillas de arroz. Sólo se insertan dos genes en el arroz. Las reivindicaciones se refieren a secuencias aisladas para un gen específico en la ruta y a constructos genéticos para introducir éste y un segundo gen en el arroz. Se reivindican plantas de maíz y arroz pero éstas sólo expresan los dos genes reivindicados en la invención.
El documento WO2006034501, se refiere a materiales y métodos para aumentar el contenido en folato de las plantas. En una realización de un método de la invención, se modifica por ingeniería una planta para que exprese niveles aumentados de pteridinas en la planta. En una realización puesta como ejemplo, se transforma una planta con un polinucleótido que codifica para un GCHI de tipo mamífero que está libre del control por retroalimentación cuando se expresa en una planta. En otra realización puesta como ejemplo, se transforma una planta con un polinucleótido que codifica para un GCHI bacteriano que no está sometido a regulación metabólica dentro de una célula vegetal. La invención objeto también se refiere a plantas que tienen un contenido en folato aumentado. En una realización, una planta de la invención comprende y expresa un polinucleótido que codifica para un polipéptido GCHI de tipo mamífero o un polipéptido GCHI bacteriano que está libre del control por retroalimentación cuando se expresa en la planta. Se centra en Arabidopsis y tomate y sólo se inserta un gen para aumentar la acumulación de folato. Por tanto, la solicitud de patente mencionada no es relevante para la presente invención.
El documento WO0188169 da a conocer plantas transformadas, células vegetales y semillas que tienen niveles de carotenoides alterados y/o composiciones de ácidos grasos modificados. Las plantas, células vegetales y semillas se transforman con al menos un gen de la biosíntesis de carotenoides, o una combinación del mismo. En la oleaginosa Brassica, la transformación con un gen de la biosíntesis de carotenoides de expresión temprana conduce a semillas que tienen aumentos significativos en los niveles de alfa-caroteno. Para la producción de una semilla que tiene un aumento en la biosíntesis de carotenoides, es suficiente la transformación de la planta con un gen de la biosíntesis de carotenoides de expresión temprana. Por gen de la biosíntesis de carotenoides de expresión temprana, se quiere decir geranilgeranil pirofosfato sintasa, fitoeno sintasa, fitoeno desaturasa e isopentenil difosfato (IPP) isomerasa. Como máximo tres genes de la biosíntesis de carotenoides de expresión temprana, crtB, crtE y crtI, usando procedimientos convencionales. Se ponen como ejemplo el algodón, Arabidopsis y maíz. Todos los métodos y reivindicaciones son limitados en cuanto al número de genes y no crean una población combinatoria, como en la presente invención.
En conclusión, el medio más eficaz de introducir grandes números de transgenes en plantas es a través de transformación conjunta a través de transferencia directa de ADN. Para un número de transgenes menor, también son adecuados los métodos basados en agrobacterias. Un obstáculo mucho más desafiante, técnica e intelectualmente, es entender y superar las restricciones que influyen en la expresión estable y predecible de múltiples transgenes introducidos conjuntamente en plantas, particularmente en los casos en los que éstos son miembros de una ruta compleja que requiere la expresión coordinada y secuencial de varios transgenes. Debido a la naturaleza del metabolismo vegetal, la compartimentalización de las enzimas y los sustratos en diferentes compartimentos subcelulares y complejidades adicionales de la regulación especial, temporal y de desarrollo de la expresión transgénica, hacen la situación extremadamente compleja. Esta no es una tarea sencilla incluso en el caso más simple, por ejemplo cuando se introducen conjuntamente transgenes no relacionados (es decir, transgenes que no constituyen una ruta metabólica o biosintética) en una planta. Incluso en tales casos, sólo un pequeño número de plantas expresan todos los genes transferidos a niveles adecuados. Por tanto, el desafio consiste en desarrollar la tecnología que logrará la expresión concordante de múltiples transgenes y cómo llegar a los niveles de expresión que serán prácticos en el contexto de rasgos metabólicos complejos modificados por ingeniería. En este contexto, es crucial del diseño de vectores de expresión, y es un requisito previo un entendimiento completo de los mecanismos de integración de múltiples transgenes en el genoma huésped. Una vez que se introducen y se integran múltiples transgenes en una planta huésped, en el contexto de la modificación por ingeniería metabólica, es necesario integrar estos transgenes de tal manera que no se segreguen en generaciones posteriores, ya que esto destruirá la ruta recién constituida.
Se ilustrará la utilidad de la presente invención usando una de las rutas metabólicas más compleja y económicamente significativa, la ruta de los carotenoides. Para demostrar la utilidad y flexibilidad y adaptabilidad adicionales del método, se incluirán también dos transgenes adicionales que codifican para etapas clave y limitantes de la velocidad en la biosíntesis de vitamina C y folato, además de un gen marcador seleccionable. Por tanto, a modo de ejemplo, se introducen 8 transgenes en las plantas, pero no existe una razón a priori para creer que el método sea limitante del número de genes de la especie. En otra realización de la presente invención, se contemplan genes que codifican para vitaminas y minerales esenciales adicionales, tales como vitamina E, Fe, Zn, Se, etc., y también para aminoácidos esenciales. Estas características o bien pueden introducirse conjuntamente con genes de carotenoides y otra vitamina o bien pueden modificarse por ingeniería por separado en una población diferente de plantas que entonces pueden cruzarse posteriormente con otras plantas transgénicas que expresan otros rasgos. Cualquier rasgo o combinación de rasgos cae dentro del alcance de esta invención, por ejemplo anticuerpos, estrés biótico y abiótico, aplicación de bioenergía, etc. Esto puede realizarse en cualquier planta que sea susceptible de transformación genética y a modo de ejemplo se ilustrará esto usando dos importantes plantas de cultivo, maíz y arroz (véanse los ejemplos). La invención abarca la introducción de un número ilimitado de transgenes en cualquier planta. Una ventaja clave del método dado a conocer es su naturaleza combinatoria junto con una gama de promotores específicos de múltiples órganos que dirigen la expresión de los transgenes transferidos. Por tanto, construyendo un número ilimitado de vectores de expresión individuales que codifican cada uno para una proteína/enzima y dirigidos por una gama de promotores específicos de órgano/tejido, mezclando estos vectores e introduciéndolos entonces en células vegetales, puede recuperarse una población de plantas que contienen y expresan combinaciones de los transgenes transferidos. Tras generar tal población combinatoria (tabla 1), puede explotarse la población para la producción de un metabolito específico o para una combinación de metabolitos en una planta dada. Una vez que se identifican tales plantas, se captura de manera estable el perfil específico en la semilla y puede mantenerse para siempre. Estas plantas o productos derivados de ellas a través de procesamiento limitado o sofisticado pueden usarse en varias aplicaciones diferentes que incluyen medicina, aromas y fragancias, aditivos en alimentos y piensos, etc.
TABLA 1
1 
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La tabla 1 muestra un número representativo de plantas derivadas de experimentos de transformación genética. Las filas 1, 7, 8, 13, 16 y 17 indican la expresión de los 7 genes transferidos más el gen marcador seleccionable. Las filas 2, 4, 6 y 19 indican la expresión de los genes requeridos para reconstituir sólo la ruta de los carotenoides.
Breve sumario de la invención
La presente invención se refiere a un método para obtener metabolitos valiosos tales como carotenoides, otras vitaminas y por extensión ligninas, ácidos grasos, flavonoides, terpenoides, alcaloides producidos a través de una ruta biosíntética/metabólica a partir de una población novedosa de plantas generada a través de un método de transformación genética que implica un número ilimitado de transgenes introducidos conjuntamente en dicha población.
Por tanto, en un aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento de obtención de plantas transgénicas, caracterizado porque dichas plantas se obtienen por medio de transformación genética, en una realización particularmente preferida, la transformación genética comprende un número ilimitado de genes introducidos conjuntamente en dichas plantas.
En una realización particularmente preferida, la transformación genética de la presente invención comprende al menos 2 genes introducidos conjuntamente en dichas plantas.
En una realización particularmente preferida, la transformación genética comprende al menos 3 genes introducidos conjuntamente en dichas plantas.
En una realización particularmente preferida, la transformación genética comprende al menos 4 genes introducidos conjuntamente en dichas plantas.
En una realización particularmente preferida, la transformación genética comprende al menos 5 genes introducidos conjuntamente en dichas plantas.
En una realización particularmente preferida, la transformación genética comprende al menos 6 genes introducidos conjuntamente en dichas plantas.
En una realización particularmente preferida, la transformación genética comprende al menos 7 genes introducidos conjuntamente en dichas plantas.
En una realización particularmente preferida, la transformación genética comprende al menos 8 genes introducidos conjuntamente en dichas plantas.
En una realización particularmente preferida, los genes introducidos conjuntamente en las plantas transgénicas de la presente invención participan en una ruta metabólica.
En una realización particularmente preferida, la ruta metabólica de la presente invención se selecciona de la ruta de los carotenoides, la vitamina C y/o la vitamina E.
En una realización particularmente preferida, las plantas transgénicas de la presente invención sobreexpresan o subexpresan los productos codificados por dichos genes en comparación con las plantas de tipo natural.
En una realización particularmente preferida, la planta transgénica de la presente invención es maíz.
En una realización particularmente preferida, la planta transgénica de la presente invención es arroz.
En una realización particularmente preferida, la planta transgénica de la presente invención es tabaco.
En otra realización, la presente invención se refiere a una planta transgénica obtenida por medio del procedimiento de la presente invención.
En otra realización, la presente invención se refiere al uso de la planta transgénica de la presente invención para la producción de metabolitos derivados de una ruta metabólica.
En una realización particularmente preferida, la ruta metabólica de la presente invención se selecciona de la ruta de los carotenoides, la vitamina C y/o la vitamina E.
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La esencia de esta invención es que el método da como resultado una población de plantas con propiedades diversas que producen y acumulan una gama de diferentes productos útiles en medicina, industrias alimentaria y forrajera, las industrias cosmética y farmacéutica, etc.
Se ilustrará la utilidad de la presente invención usando una de las rutas metabólicas más compleja y económicamente significativa, la ruta de los carotenoides. Para demostrar la utilidad y flexibilidad y adaptabilidad adicionales del método, se incluirán también dos transgenes adicionales que codifican para etapas clave y de limitantes de la velocidad en la biosíntesis de vitamina C y folato, además de un gen marcador seleccionable. Por tanto, a modo de ejemplo, se introducen 8 transgenes en las plantas, pero no existe una razón a priori para creer que el método sea limitante del número de genes de la especie. En otra realización de la presente invención, se contemplan genes que codifican para vitaminas y minerales esenciales adicionales, tales como vitamina E, Fe, Zn, Se, etc., y también para aminoácidos esenciales. Estos rasgos o bien pueden introducirse conjuntamente con genes de carotenoides y otras vitaminas o bien pueden modificarse por ingeniería por separado en una población diferente de plantas que entonces pueden cruzarse posteriormente con otras plantas transgénicas que expresan otros rasgos. Cualquier rasgo o combinación de rasgos cae dentro del alcance de esta invención, por ejemplo anticuerpos, estrés biótico y abiótico, aplicación de bioenergía, etc. Esto puede realizarse en cualquier planta que sea susceptible de transformación genética y a modo de ejemplo se ilustrará esto usando dos importantes plantas de cultivo, maíz y arroz (véanse los ejemplos). La invención abarca la introducción de un número ilimitado de transgenes en cualquier planta. Una ventaja clave del método dado a conocer es su naturaleza combinatoria junto con una gama de promotores específicos de múltiples órganos que dirigen la expresión de los transgenes transferidos. Por tanto, construyendo un número ilimitado de vectores de expresión individuales que codifican cada uno para al menos una proteína/enzima y dirigidos por una gama de promotores específicos de órgano/tejido, mezclando estos vectores e introduciéndolos entonces en células vegetales, puede recuperarse una población de plantas que contienen y expresan combinaciones de los transgenes transferidos. Tras generar tal población combinatoria, puede explotarse la población para la producción de un metabolito específico o para una combinación de metabolitos en una planta dada. Una vez que se identifican tales plantas, se captura de manera estable el perfil específico en la semilla y puede mantenerse para siempre. Estas plantas o productos derivados de ellas a través de procesamiento limitado o sofisticado pueden usarse en varias aplicaciones diferentes que incluyen medicina, aromas y fragancias, aditivos en alimentos y piensos, etc.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra la ruta de los carotenoides. Reconstrucción y extensión de la ruta biosintética de carotenoides en el endospermo de maíz blanco. Una representación esquemática de la acumulación de metabolitos en siete fenotipos distintos. A la derecha, se indica cada fenotipo por separado basándose en el color del endospermo y la expresión génica con el fin de diseccionar la ruta biosintética de carotenoides así como una extensión de esta ruta para producir cetocarotenoides a partir de \beta-caroteno. Las barras en las líneas descendentes indican las reacciones enzimáticas que tienen lugar en los diferentes fenotipos.
La figura 2 muestra los constructos/vectores genéticos para la transformación. Constructos genéticos usados en experimentos de transformación combinatoria. Se indican los promotores de la glutenina de trigo de bajo peso molecular, hordeína de cebada, prolamina de arroz, glutelina-1 de arroz y \gamma-zeína de maíz. Los constructos anteriores se introdujeron conjuntamente de manera simultánea en plantas tal como se describe en la presente invención.
Figura 3. Separación por HPLC de carotenoides en maíz WT y transgénico representativo. Análisis por HPLC de plantas transgénicas representativas que indica su perfil de carotenoides reconstruido como resultado de la transformación genética.
La figura 4 muestra el análisis por RT-PCR de acontecimientos transgénicos seleccionados. Análisis de la expresión de ARN para transgenes transferidos en plantas transgénicas representativas generadas a través de la transformación genética dada a conocer en la solicitud de patente.
Figura 5. Ruta biosintética del alcaloide indol, segmentos de la cual se introdujeron en tabaco y arroz. Se introdujeron conjuntamente los siguientes transgenes en un experimento de transformación genética tal como se previo en la descripción descrita en la presente solicitud de patente: antranilato sintasa, HMGR, geraniol 10-hidroxilasa, triptófano descarboxilasa, estrictosidina sintasa, estrictosidina glucosidasa, desacetoxivindolina 4-hidroxilasa, desacetilvindolina acetiltransferasa, peroxidasa de rábano. La planta de tabaco y arroz transgénica combinatoria contenía y expresaba diferentes complementos transgénicos.
Descripción detallada de la invención
En la presente invención, se construyeron vectores de transformación que comprendían diferentes promotores específicos de endospermo (glutenina LMW de trigo, hordeína de cebada, prolamina de arroz, glutelina 1 de arroz, zeína de maíz), que codifican para los siguientes transgenes que participan en la biosíntesis de carotenoides: psy1, crtI, lycb, bch, crtW más folE para folato y dhar (un ADNc de longitud completa que se aisló a partir de arroz) para la vitamina C. También se usó el gen marcador seleccionable bar (expresado constitutivamente para permitir la selección in vitro). En la bibliografía, se ha notificado el uso de un promotor específico de órgano/tejido para dirigir la expresión de transgenes. Sin embargo, esta invención es diferente en este aspecto. En la presente invención, se han usado 5 promotores de este tipo diferentes en combinación y esto no se ha hecho antes. Esto tiene importantes ventajas en el contexto de la ingeniería metabólica en plantas, particularmente para evitar el silenciamiento génico a través del uso del mismo promotor repetidamente. (Esto no se contempla en la bibliografía mencionada).
Por tanto, se usó un total de 8 transgenes en la presente invención. Se mezclaron los 8 transgenes en un tubo Eppendorf y luego se recubrieron partículas de oro con la mezcla y posteriormente se bombardeó el tejido de maíz según se ha descrito. Tras la selección con el herbicida fosfinotricina, se recuperaron más de 70 plantas independientes, que contenían y expresaban diferentes combinaciones de los transgenes transferidos.
Varias de las plantas recuperadas contenían y expresaban todos los transgenes, contrariamente a lo que se esperaba. Se clasificaron los genotipos clave (plantas que contenían diferentes combinaciones de transgenes) en grupos basándose en los metabolitos/productos que resultaban de la expresión de los genes transferidos. Se usó el análisis de HPLC para determinar el perfil de metabolitos sintetizados en cada planta.
Estas plantas tienen muchos usos. Además de ser útiles directamente en alimentos y piensos para seres humanos y animales, pueden usarse para extraer los numerosos compuestos valiosos y caros que requieren las industrias farmacéutica, alimentaria y forrajera.
A) Preparación de ADN y ARN
Se recogieron muestras de hojas y endospermo para análisis de extracción de ADN y ARN extracción, se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80ºC hasta su uso. Se aisló el ADN genómico de la planta a partir de las hojas según el método de extracción con CTAB para la lisis de los núcleos descrito por Sambrook et al. (1989). Se purificó el ADN genómico de Escherichia coli DH5\Box según el kit Easy-DNA^{TM} (Invitrogen). Se aisló el ARN de endospermo u hoja total usando el minikit para plantas RNeasy® (QIAGEN).
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B) Construcción de vectores
Se clonó ADNc de PSY1 de Zea mays a partir de la línea consanguínea de maíz B73 mediante RT-PCR basado en la información del gen PSY1 (número de registro de GenBank U32636) usando cebadores con sitios BamHI y EcoRI, enumerados respectivamente en la tabla 2. Se recogió el fragmento de ADN amplificado del tamaño esperado mediante Geneclean (BIO 101, La Jolla, CA) y se subclonó en el vector pGEM®-T (Promega) para generar pGEM-ZmPSY1. Se secuenciaron ambas cadenas de cada fragmento de ADNc en su totalidad. Entonces se subclonó el fragmento de ADNc de ZmPSY1 en el plásmido p326 digerido con BamHI y EcoRI que alberga el promotor del gen de la glutenina de trigo de bajo peso molecular (LMW) (Colot et al., 1987; Stoger et al., 1999) y el terminador de la nopalina sintasa. El plásmido resultante se designó como p326-ZmPSY1.
Se amplificó el gen CrtI de Pantoea ananatis fusionado en el marco con la señal del péptido de tránsito (TPS) de la subunidad pequeña de la ribulosa bisfosfato carboxilasa de Phaseolus vulgaris (Schreier et al., 1985) en el plásmido pYPIET4 (Misawa et al., 1993) mediante los cebadores con sitios XbaI y EcoRI, respectivamente (tabla 2) y se subclonó en el vector pGEM®-T para dar lugar a pGEM-PaCrtI con TPS. Se clonó el fragmento de ADN del gen CrtI fusionado con TPS en el plásmido pHor-P entre el promotor de D-hordeína de cebada (Sorensen et al., 1996) y el terminador del gen de la ADPGPP (ADP-glucosa pirofosforilasa) de arroz para generar pHor-P-PaCrtI.
Se amplificó el gen LYCB de Gentiana lútea mediante PCR habitual usando ADN del plásmido pBluescript-G1LYCB (Zhu et al., 2003) como molde usando los cebadores con BamHI y KpnI, respectivamente (tabla 2) y se subclonó en el vector pGEM-T easy para producir pGEM®-G1LYCB. Se digirió pGEM-G1LYCB mediante BamHI y luego se digirió parcialmente mediante EcoRI y se ligó el fragmento de LYCB de longitud completa liberado con el plásmido pRP5 digerido con las mismas enzimas para dar lugar a pRP5-G1LYCB. El plásmido pRP5 contiene el promotor PR5 del gen de la prolamina de arroz (Su et al. 2001) y el terminador de la nopalina sintasa.
Se amplificó el fragmento de ADNc de BCH de Zea mays se amplificó a partir de la línea consanguínea de maíz B73 mediante RT-PCR basado en la información del gen BCH (número de registro de GenBank AY84495) usando cebadores con sitios BamHI y XbaI, enumerados respectivamente en la tabla 2 y se subclonó en el vector pGEM®-T easy (Promega) para generar pGEM-ZmBCH. Se digirió este ADN de plásmido mediante EcoRI y XbaI, y se insertó el fragmento de ADNc de BCH resultante en el plásmido pHor-P digerido con las mismas enzimas para dar lugar a pHor-P-AntisenseZmBCH. Para ARNi o ZmBCH antisentido, se tiene como objetivo específicamente aumentos en el beta-caroteno. Esto significa que las transformaciones se llevan a cabo con una mezcla de psy1, crtI, lycb, ZmBCH antisentido más los genes para la vitamina C y el folato (dhar, folE) y cualquier otro gen que codifique para otras vitaminas o rasgos.
Se amplificó el gen BCH de Gentiana lútea usando ADN del plásmido pBluescript-G1BCH (Zhu et al., 2003) como molde mediante PCR usando los cebadores con sitios NotI y SacI, enumerados respectivamente en la tabla 2, y se subclonó en el vector pGEM®-T easy para producir pGEM-G1BCH. Se digirió este ADN de plásmido con NotI y se ligó en el vector pT0126, que contenía el promotor del gen de la glutelina-1 (Gt1) de arroz (Okita et al., 1989; Washida et al., 1999) y el terminador del gen de la ADPGPP (ADP-glucosa pirofosforilasa) de arroz para generar pTO126-G1BCH. Se obtuvo la orientación correcta mediante PCR y análisis de digestión con enzimas.
Se amplificó el gen crtW de Paracoccus sp. N81106 fusionado en el marco con la señal de péptido del tránsito (TPS) de la subunidad pequeña de ribulosa bisfosfato carboxilasa de Phaseolus vulgaris (Schreier et al., 1985) en el plásmido p35W2AZ (Ralley et al., 2004) mediante los cebadores con sitios BamHI y EcoRI, respectivamente (tabla 2) y se subclonó en el vector pGEM®-T easy para dar lugar a pGEM-ParococcusCrtW con TPS. Se clonó el fragmento de ADN del gen CrtW fúsionado con TPS en el plásmido pGZ63 entre el promotor de la \gamma-zeína de maíz (Torrent et al., 1997) y el terminador de la nopalina sintasa para generar pGZ63-ParacoccusCrtW.
Se aisló el ADNc de DHAR de longitud completa de Oryza sativa a partir del cultivar EYI105 mediante RT-PCR basado en la información del ARNm de DHAR (número de registro de GenBank: AY074786) usando cebadores con sitios Xbai y EcoRI, enumerados respectivamente en la tabla 2 y se subclonó en el vector pCR®II-TOPO (Invitrogen) para generar pCR-OsDHAR. Se subclonó el fragmento de ADNc de DHAR en el plásmido pHor-P digerido con XbaI y EcoRI. El plásmido resultante se designó como pHor-P-OsDHAR.
Se amplificó el gen folE de Escherichia coli a partir de ADN genómico de E. coli DH5\Box basado en la información del gen folE (número de registro de GenBank: X63910) usando cebadores con sitios BamHI y SacI, enumerados respectivamente en la tabla 2 y se subclonó en el vector pGEM®-T easy (Invitrogen) para generar pGEM-Ecfo1E. Se digirió este ADN de plásmido mediante NotI y SacI, y se insertó el fragmento de ADN de folE resultante en el plásmido pHor-P digerido con las mismas enzimas para dar lugar a pHor-P-Ecfo1E.
Se verificaron todos los constructos de transformación mencionados anteriormente mediante secuenciación.
En todos los experimentos de transformación, se usó el plásmido pAHC20 (Christensen y Quail, 1996) que contiene el gen bar, para el bombardeo conjunto para la selección con fosfinotricina.
TABLA 2 Secuencias de oligonucleótido de los cebadores de PCR para la construcción de vectores
2
C) Transformación y material vegetal
Se hicieron crecer plantas de maíz (Zea mays L., cv. M37W, cultivar de maíz de endospermo blanco, carente en general de carotenoides) en el invernadero y la sala de crecimiento a una temperatura diurna/nocturna de 28/20ºC con un fotoperiodo de 10 h y humedad relativa del 60-90% durante los primeros 50 días, seguido por mantenimiento a una temperatura diurna/nocturna de 21/18ºC con un fotoperiodo de 16 h después. Se extrajeron asépticamente embriones cigóticos inmaduros (ECI) M37W a los 10-14 días tras la polinización y se cultivaron en medio N6. Tras un cultivo de 5 días, se bombardearon los embriones con 10 mg de partículas de oro recubiertas (Christou et al., 1991). Se incubaron los tejidos diana en medio N6 que contenía un alto contenido en osmótico (manitol 0,2 M, sorbitol 0,2 M) durante de 5 a 6 horas antes del bombardeo y de 10 a 16 horas tras el bombardeo. Se recubrieron las partículas de oro a una razón molar de 3:1 del gen de interés (haciendo ajustes para el tamaño de cada constructo) y plásmido de marcador seleccionable derivado del plásmido pAHC20 que contiene el gen bar (Christensen y Quail, 1996) para la transformación conjunta (Christou et al., 1991). Se seleccionó el callo bombardeado en medio complementado con fosfinotrina según se describió previamente (Drakakaki et al., 2005). Se regeneraron satisfactoriamente las plantas transgénicas y se aclimataron al suelo. Se seleccionaron setenta acontecimientos independientes en total para el análisis en profundidad. En consecuencia, se identificaron acontecimientos transgénicos independientes y se caracterizaron mediante análisis de PCR de ADN genómico y de inmunotransferencia de tipo Southern. Los transformantes primarios o bien se polinizaron con M37W no transformado y/o plantas de endospermo amarillo, respectivamente, o bien se autopolinizaron para producir semillas T1. Se regeneraron las plantas control no transformadas (NC) a partir del mismo lote de material calloso que se usó para la transformacioiL Se hicieron crecer todas las plantas control al mismo tiempo y en las mismas condiciones de crecimiento que las líneas transgénicas.
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D) PCR de ADN genómico
Se usó el análisis de PCR del ADN genómico de las hojas para identificar las líneas de maíz transgénicas y para determinar el complemento transgénico de cada línea, su integridad y su probabilidad de expresión. Se diseñaron tres conjuntos de cebadores tal como se indica en la tabla 3. El conjunto 1 de cebadores es para el promotor y el transgén (cebador directo ubicado en el promotor y cebador inverso en el transgén); el conjunto 2 de cebadores es para el transgén únicamente (ambos cebadores en el transgén); el conjunto 3 de cebadores es para el transgén y el terminador (cebador directo en el transgén y cebador inverso ubicado en el terminador). Se usaron los ADN de plásmido de expresión con transgén apropiados como controles positivos.
Se llevaron a cabo las reacciones de PCR en una solución de 20 \mul que contenía tampón de reacción de PCR (tampón de reacción GoTaq®, Promega), MgCl_{2} 1,5 mM, cada dNTP 0,2 mM, cada uno de los cebadores directos e inversos 1 \muM, 100 ng de ADN genómico y 0,5 unidades de ADN polimerasa GoTaq®. El programa de PCR usado fue de 95ºC durante 3 min., seguido por 30 ciclos de 94ºC durante 45 seg., 60ºC durante 45 seg., 72ºC durante 90 seg. y una extensión final a 72ºC durante 5 min. Entonces se verificaron los productos de la PCR realizando una electroforesis en geles de agarosa al 1,0%.
TABLA 3 Secuencias de oligonucleótido de los cebadores de PCR para plantas transgénicas
3
E) RT-PCR para análisis de la expresión
Se extrajo el ARN de 120 mg de endospermo de maíz (30 semillas DAP) usando Trizol (1,20 ml) y cloroformo (0,25 ml). Se usó isopropanol (0,6 ml) para sedimentar el ADN en el extracto. Tras lavar el sedimento con etanol, se llevó a cabo la purificación del ARN usando el minikit para plantas RNAeasy de Qiagen (QIAGEN, Hilden, Alemania).
Se trató el ARN total (2 \mug) con ADNasa (ADNasa libre de ARNasa RQ1 (Promega) antes de someterse a transcripción inversa según el protocolo del kit de transcripción inversa Omniscript® (QIAGEN, Hilden, Alemania), para generar el molde de ADNc de primera hebra. Se usaron cebadores del gen de la actina de maíz (número de registro de GenBank J01238) (SEQ ID NO: 65 y SEQ ID NO: 66) como control para monitorizar la calidad del ADNc y la contaminación del ADN. Las secuencias de cebadores usadas fueron las mismas que las del conjunto 2 de cebadores de PCR de ADN genómico (tabla 3). Se llevaron a cabo las reacciones de PCR en una solución de 20 \mul que contenía tampón de reacción de PCR (tampón de reacción GoTaq®, Promega), MgCl_{2} 1,5 mM, cada dNTP 0,2 mM, cada uno de los cebadores directos e inversos 1 \muM, 1,25 \mul de solución de RT-PCR y 0,5 unidades de ADN polimersa GoTaq®. El programa de PCR usado fue de 95ºC durante 3 min., seguido por 30 ciclos de 94ºC durante 45 seg, 55ºC durante 45 seg, 72ºC durante 90 seg y una extensión final a 72ºC durante 5 min. Entonces se verificaron los productos de la PCR realizando una electroforesis en geles de agarosa al 1,0%.
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F) Análisis de carotenoides, tocoferoles, ácido ascórbico y folato
Se recogieron muestras de hojas y endospermo para análisis de HPLC, se liofilizaron y se almacenaron a -20ºC hasta su uso.
F.1) Extracción y análisis de carotenoides y tocoferoles
El procedimiento de extracción empleado es una modificación del método descrito por Weber (1987) y Kurlich & Juvik (1999). Todas las preparaciones y extracciones de muestras se realizaron bajo luces fluorescentes doradas. Se sometió el endospermo de maíz (600 mg) a precipitación con etanol durante 5 min. (6 ml de etanol que contenían un 0,1% de hidroxitolueno butilado (BHT) en un baño de agua a 85ºC antes de someterse a saponificación durante 10 min. con 120 \mul de hidróxido de potasio (KOH) al 80%. Se agitaron en vórtex todas las muestras una vez durante la saponificación. Con la eliminación, se pusieron inmediatamente en un baño de hielo en el que se añadieron 3 ml de agua destilada desionizada fría. Entonces, cada muestra recibió 3 ml de hexano, se agitó en vórtex y luego se centrifugó durante 10 min. a 1200 g. Se pipeteó la fase superior a un tubo de ensayo separado, y se volvió a extraer el sedimento dos veces usando hexano. Se lavaron las fracciones de hexano combinadas con 3 ml de agua destilada desionizada, se agitaron en vórtex y se centrifugaron durante 10 min. a 1200 g, antes de pipetearse a otro tubo de ensayo. Se redujo por secado la fracción de hexano en un evaporador a vacío, y se reconstituyeron las muestras con 200 ml de acetonitrilo:metanol:cloruro de metileno (45:20:35, v/v/v) antes de su inyección en un cromatógrafo de líquidos de alta resolución (HPLC).
Se separaron los carotenoides y los tocoferoles y se cuantificaron mediante HPLC usando detección UV-VIS. Se conectó una columna Vydac 201TP54, de fase inversa C_{18}, 5 \mum, 4,6 x 150 mm (Separation Group, Hesperia, CA) a una columna Waters Nova-Pak de fase inversa C_{18}, 4 \mum, 3,9 x 150 mm (Water Chromatography, Milford, MA). Se protegieron las columnas mediante una precolumna Adsorbosphere de fase inversa C_{18}, 5 \mum, 4,6 x 7,5 mm (Alltech Assoc., Deerfield, IL). El sistema de HPLC consistía en un desgasificador ERC 3510 de ERMA Optima LTD (Anspec Co., Ann Arbor, MI), una bomba Waters 510, un inyector automático 731a y un detector UV-VIS de múltiples longitudes de onda 490E (Waters Chromatography, Milford, MA). Se recogieron los datos y se trataron usando el software Waters Millenium 2010 (Waters Chromatography, Milford, MA). La fase móvil consistía en acetonitrilo:metanol:cloruro de metileno (75:20:5, v/v/v), que contenía un 0,05% de trietilamina (TEA) y un 0,1% de hidroxitolueno butilado (BHT) (Hart y Scott, 1995). La velocidad de flujo era de 1,8 ml/min a temperatura ambiente. Para maximizar la detección, se midió la absorbancia a 450 para los carotenoides y tocoferoles, respectivamente. Se adquirieron las muestras patrón (\beta-caroteno, \alpha-caroteno, luteína, \beta-criptoxantina, zeaxantina, astaxantina, equinenona, canxantina, \alpha-tocoferol, \beta-tocoferol, \delta-tocoferol y \gamma-tocoferol) de Sigma.
Protocolo alternativo usado para la extracción de carotenoides
Se molieron muestras liofilizadas hasta un polvo fino. Se incubaron las muestras en tetrahidrofurano (THF) + metanol (50:50) a 65ºC durante 20 min., se vertió la mezcla en un matraz de separación y con el fin de eliminar el residuo sólido, se llevó a cabo una filtración usando un papel de filtro. Para el reparto, se añadió petróleo-éter (90:10). Se eliminaron los residuos de acetona, metanol y THF lavando 2 veces con agua. Se recogió la fase orgánica que contema los carotenoides en tubos de vidrio y se secó bajo N_{2}, se almacenó a -20ºC hasta su uso. Se llevó a cabo toda el procedimiento de extracción en una campana extractara en la oscuridad. Se usó una columna Hypersil C18 para el análisis. La fase móvil usada era una mezcla de acetonitrilo: metanol: 2-propanol (425 ml: 50 ml: 25 ml).
F.2) Extracción y análisis de ácido ascórbico
Ensayo 1: Mediciones de AsA, DHA, GSH y glutatión oxidado (GSSG). Se midió AsA tal como se describe (Foyer, C. H., Rowell, J. & Walker, D. (1983) Measurement of the ascorbate content of spinach leaf protoplasts and chloroplasts during illumination. Planta 157: 239-244). Se molieron muestras de endospermo de maíz en HClO_{4} 2,5 M y se centrifugaron a 13.000 rpm (centrífuga Eppendorf 5417C) durante 10 min. Se añadieron dos volúmenes de Na_{2}CO_{3} 1,25 M al sobrenadante, y tras la centrifugación, se añadieron 100 \mul de la mezcla a 895 \mul de K_{2}HPO_{4}/KH_{2}PO_{4} 100 mM, pH 5,6. Se determinó AsA mediante el cambio en la absorbancia a 265 nm tras la adición de 0,25 unidades de ascorbato oxidasa. Se determinó la cantidad total de ácido ascórbico reducido y oxidado (es decir, AsA y DHA) reduciendo DHA en AsA (en una reacción que contenía K_{2}HPO_{4}/KH_{2}PO_{4} 100 mM a pH 6,5, GSH 2 mM, y 0,1 \mug de proteína DHAR de trigo recombinante incubada a 25ºC durante 20 min.) antes de medir AsA. Se determinó la cantidad de DHA como la diferencia entre estos dos ensayos. Se determinaron GSH y GSSG a partir de las hojas, tal como se describe (Griffith, O. W. (1980) Determination of glutathione and glutathione disulfide using glutathione reducíase and 2-vinylpyridine. Anal. Biochem. 106: 207-212).
Ensayos enzimáticos. Se sometió a ensayo la actividad de DHAR esencialmente tal como se describe (Hossain, M. A. & Asada, K. (1984) Purification of dehydroascorbate reducíase from spinach and its characterization as a thiol enzyme. Plant Cell Physiol. 25: 85-92.). Se molió endospermo de maíz en tampón de extracción (Tris HCl 50 mM, pH 7,4, NaCl_{2} 100 mM, EDTA mM, MgCl_{2} 1 mM), y se obtuvo la proteína soluble tras una centrifugación durante 5 min. a 13.000 rpm. Se sometió a ensayo DHAR a partir de una cantidad igual de proteína tal como se describe (24) en K_{2}HPO_{4}/KH_{2}PO_{4} 50 mM, pH 6,5, DHA 0,5 mM/GSH 1 mM, y se siguió su actividad mediante un aumento en la absorbancia a 265 nm. Se determinaron las actividades de glutatión reductasa (GR), MDHAR, ascorbato peroxidasa (APX), L-galactono-1,4-lactona deshidrogenasa (GLDH), superóxido dismutasa (SOD) y catalasa (CAT) tal como se describe (Foyer, C. & Halliwell, B. (1976) Presence of glutathione and glutathione reducíase in chloroplasts: a proposed role for in ascorbic acid metabolism. Planta 133, 21-25; de Pinto, M. C., Tommasi, F. & De Gara, L. (2000) Changes in the antioxidant systems as part of the signaling pathway responsible for the programmed cell death activated by nitric oxide and reactive oxygen species in tobacco Bright-Yellow 2 cells. Plant Physiol. Biochem. 38:541-550; Gainnopolitis, C. N. & Pies, S. K. (1977) Superoxide dismutases. I. Occurrence in higher plants. Plant Physiol. 59: 309-314; Aebi, H. (1984) Catalase in vitro. Methods Enzymol. 105: 121-126; Jimenez, A., Hernández, J. A., Del Rio, L. A. & Sevilla, F. (1997) vidence for the Presence of the Ascorbate-Glutathione Cycle in Mitochondria and Peroxisomes of Pea Leaves. Plant Physiol. 114: 275-284.).
Ensayo 2: Se prepararon extractos para el análisis de ascorbato según Kurlich et al (1999) mezclando 100 ml de ácido m-fosfórico al 1% y 25 g de tejido fresco congelado en una mezcladora Waring durante 2 min. Se lavaron los laterales del recipiente de la mezcladora con ácido m-fosfórico al 1% (50 ml) y se mezcló durante 2 min. adicionales. Se ajustó la suspensión hasta 250 ml con m-HPO_{3} al 1% y se filtró entonces usando papel de filtro ondulado Whatman 2V. Se mezclaron un mililitro de filtrado y 1 ml de ditiotreitol al 5%. Se diluyeron extractos de muestra hasta 10 ml con m-HPO_{3} al 1%. Se filtró la muestra a través de un filtro de 0,20 \mum, y se inyectaron 10 \mul en el cromatógrafo de líquidos. Se siguió también un método alternativo tal como se describe en Chen et al 2003.
Se midieron las concentraciones de ascorbato usando un sistema de HPLC isocrática que consistía en un controlador Beckman modelo 421, una bomba Beckman modelo 100A y un integrador Beckman Altex C-R1A. El detector era un Waters M-490 programable de múltiples longitudes de onda (Millipore, St. Louis, MO.). La fase estacionaria era una columna Rainin Dynamax -60 \ring{A} de amina, de 4,6 X 250 mm protegida por una precolumna Rainin Dynamax de amina de 8 \mum, 1,5 cm (Varion, Walnut Creek, CA). La fase móvil consistía en acetonitrilo/KH_{2}PO_{4} 0,05 M (pH 5,95), 75:25. La detección fue a 268 nm con una sensibilidad de 0,02 AUFS. La velocidad de flujo fue de 1,5 ml/min.
Se prepararon patrones de ácido ascórbico (USPC, Inc., Rockville, MD) diluyendo 0,01 (0,002 g de ácido L-ascórbico de calidad USP hasta 100 ml con m-HPO_{3} al 1%. Se mezcló esta solución (1 ml) con ditiotreitol al 5% (1 ml) y se diluyó hasta 10 ml con m-HPO_{3} al 1% para producir un patrón de 10 ppm de ácido ascórbico.
F.3. Extracción y análisis de folatos
Se realizó el análisis de folato tal como se describe por De la Garza et al. (2004). Se extrajeron los folatos de endospermo de maíz (0,5-1,0 g) mediante homogeneización con Polytron en 10 ml de Na-Hepes 50 mM/ácido 2-(N-ciclohexilamino)etanosulfónico 50 mM ajustado hasta pH 7,9 con HCl que contenía CaCl_{2} 1 mM, ascorbato de Na al 2% (p/v) y 2-mercaptoetanol 10 mM, seguido por ebullición durante 10 min. y centrifugación (13.000 g) durante 10 min. Se volvió a extraer el sedimento de la misma forma. Se trataron los extractos combinados con 1 ml de plasma de rata dializado a 37ºC durante 2 h para eliminar los grupos glutamilo de los folatos. Entonces se sometieron a ebullición las muestras durante 15 min., se centrifugaron como anteriormente, se filtraron a través de lana de vidrio y se aplicaron a columna de afinidad de folato preparadas tal como se describe por Gregory & Toth (1988). Tras lavar con 5 ml de fosfato de K 25 mM (pH 7,0)/ascorbato de Na al 1% (tampón 1) que contenía NaCl 1 mM, luego con 5 ml de tampón 1 solo, se eluyeron las columnas con 5 ml de fase móvil A de análisis por HPLC (tampón A, K_{2}HPO_{4} 28 mM y H_{3}PO_{4} 0,59 mM, pH 2,5) que contenía ácido ascórbico al 1%. Se tomaron muestras del eluato (400 \mul) para el análisis por HPLC con detección electroquímica, usando una columna Prodigy ODS2 de 5 \mum, 150 x 3,2 mm (Phenomenex) y un detector de cuatro canales (CoulArray modelo 5600A, ESA, Chelmsford, MA) con potenciales fijados a 0, 300, 500 y 600 mV. La fase móvil era una mezcla binaria de K_{2}HPO_{4} 28 mM y H_{3}PO_{4} 0,59 mM (pH 2,5) (tampón A) y una mezcla del 75% (v/v) de tampón A y el 25% de CH_{3}CN (tampón B) con un programa de elución no lineal de 55 min. desde el 90% de tampón A hasta el 100% de tampón B a 1 ml por min. Se calibró la respuesta del detector usando patrones de THF (tetrahidrofolato), 5-metil-THF, 5,10-metil-THF, 5-formil-THF y ácido fólico de Schircks.
Bibliografía
Ma, J K-C, Drake, PMW, Christou, P (2003). The production of recombinant Pharmaceutical Proteins in Plants. Nature Reviews Genetics, 4: 794-805.
L. Nicholson, P. Gonzalez-Melendi, C. van Dolleweerd, H Tuck, Y. Perrin, J. K-C Ma, R Fischer, P Christou and E. Stoger (2005) A recombinant multimeric immunoglobulin expressed in rice shows assembly-dependent subcellular localization in endosperm cells Plant Biotech J. 3, 115-127.
M.I. Claparols, L. Bassie, B. Miro, S. Del Duca, J. Rodriguez, P. Christou, D. Serafini. Fracassini, T. Capell (2004). Transgenic rice as a vehicle for the production of the industrial enzyme transglutaminase. Transgenic Research 13: 195-199.
T. Capell y P. Christou. Progress in Plant Metabolic Engineering (2004) Current Opinion in Biotechnology 15: 148-154.
Thu-Hang, P, L. Bassie, G. Sawfat, Pham T.-N., P. Christou, T. Capell (2002) Expression of a Heterologous S-adenosylmethionine decarboxylase cDNA in Plants Demonstrates that Changes in S-Adenosyl-L-Methionine Decarboxylase Activity Determine Levels of the Higher Polyamines Spermidine and Spermine. Plant Physiol. 129: 1744-1754.
Altenbach, S.B., Chiung-Chi, K., Staraci, L.C., Pearson, K.W., Wain-wright, C., Georgescu, A., y Townsend, J. (1992) Accumulation of a Brazil nut albumin in seeds of transgenic canola results in enhancing levels of seed protein methionine. Plant Mol. Biol. 18:235-245.
Galili, G., y Hofgen, R. (2002) Metabolic engineering of amino acids and storage proteins in plants. Metab. Eng. 4(1): 3-11.
Truksa, M. et al. (2006) Metabolic engineering of plants to produce very long-chain polyunsaturated fatty acids. Transgenic Res. 15, 131-137.
Qi, B. et al. (2004) Production of very long chain polyunsaturated omega-3 and omega-6 fatty acids in plants. Nature Biotechnol. 22, 739-745.
Abbadi, A. et al. (2004) Biosynthesis of very-long-chain polyunsaturated fatty acids in transgenic oilseeds: constraints on their accumulation. Plant Cell 16, 2734-2748.
Wu, G. et al. (2005) Stepwise engineering to produce high yields of very long-chain polyunsaturated fatty acids in plants. Nature Biotechnol. 23, 1013-1017.
Ye, X.D. et al. (2000) Engineering the provitamin A (\Box-carotene) biosynthetic pathway into (carotenoid-free) rice endosperm. Science 287, 303-305.
Ducreux, L.J.M. et al. (2005). Metabolic engineering of high carotenoid potato tubers containing enhanced levels of \Box-carotene and lutein. J. Exp. Bot. 56, 81-89.
Diretto, G. et al. (2007) Metabolic engineering of potato carotenoid content through tuber-specific overexpression of a bacterial mini-pathway. PLoS ONE 2, e350. doi: 10,1371/journal.pone.0000350.
Shintani, D. y Della-Penna, D. (1998) Elevating the vitamin E content of plants through metabolic engineering. Science 282, 2098-2100.
Van Eenennaam, A.L. et al. (2003) Engineering vitamin E content: From Arabidopsis mutant to soy oil. Plant Cell 15, 3007-3019.
Prospects for biopolyrner production in plants. van Beilen JB, Poirier, Y ADVANCES IN BIOCHEMICAL ENGINEERING/BIOTECHNOLOGY 107: 133-151 2007.
Synthesis of novel biomaterials in plants. Moire L, Rezzonico E. Poirier Y. JOURNAL OF PLANT PHYSIOLOGY 160 (7): 831-839 2003.
Polyhydroxybutyrate, a biodegradable thermoplastic, produced in transgenic plants. POIRIER Y, DENNIS DE, KLOMPARENS K. SOMERVILLE C. SCIENCE 256 (5056): 520-523 1992.
Expression of an engineered granule-bound Escherichia coli maltose acetyltransferase in wild-type and amf potato plants. Firouzabadi FN, Vincken JP, Ji Q, Suurs LCJM, Visser RGF. PLANT BIOTECHNOLOGY JOURNAL 5 (1): 134-145 2007.
Genetic engineering in floriculture. Tanaka Y, Katsumoto Y, Brugliera F, Mason J. PLANT CELL TISSUE AND ORGAN CULTURE 80 (1): 2005.
Investigating and manipulating lignin biosynthesis in the postgenomic era Author(s): Halpin C, ADVANCES IN BOTANICAL RESEARCH INCORPORATING ADVANCES IN PLANT PATHOLOGY 41: 63-106 2004.
Genetically modified lignin below ground. Hopkins DW, Webster EA, Boerjan W. Pilate G. Halpin C. NATURE BIOTECHNOLOGY 25 (2): 168-169 2007.
Forestry's fertile crescent: the application of biotechnology to forest trees. Campbell MM. Brunner AM. Jones HM. Strauss SH. PLANT BIOTECHNOLOGY JOURNAL 1 (3): 141-154 2003.
Plant genetic engineering to improve biomass characteristics for biofuels. Sticklen M CURRENT OPINION IN BIOTECHNOLOGY 17 (3): 315-319 2006.
Expression of biologically active Acidothermus cellulolyticus endoglucanase in transgenic maize plants. Biswas GCG, Ransom C, Sticklen M. PLANT SCIENCE 171 (5): 617-623 2006.
Hossain, M. A. & Asada, K. (1984) Purification of dehydroascorbate reductase from spinach and its characterization as a thiol enzyme. Plant Cell Physiol. 25: 85-92.
Bradford, M. M. (1976) A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye-binding. Anal. Biochem. 72: 248-254.
Foyer, C. & Halliwell, B. (1976) Presence of glutathione and glutathione reductase in chloroplasts: a proposed role for in ascorbic acid metabolism. Planta 133, 21-25.
De Pinto, M. C., Tommasi, F. & De Gara, L. (2000) Changes in the antioxidant systems as part of the signaling pathway responsible for the programmed cell death activated by nitric oxide and reactive oxygen species in tobacco Bright-Yellow 2 cells. Plant Physiol. Biochem. 38:541-550.
Gainnopolitis, C. N. & Pies, S. K. (1977) Superoxide dismutases. I. Occurrence in higher plants. Plant Physiol. 59: 309-314.
Aebi, H. (1984) Catalase in vitro. Methods Enzymol. 105: 121-126.
Jimenez, A., Hernández, J. A., Del Rio, L. A. & Sevilla, F. (1997) vidence for the Presence of the Ascorbate-Glutathione Cycle in Mitochondria and Peroxisomes of Pea Leaves. Plant Physiol. 114: 275-284.
Foyer, C. H., Rowell, J. & Walker, D. (1983) Measurement of the ascorbate content of spinach leaf protoplasts and chloroplasts during illumination. Planta 157: 239-244.
Griffih, O. W. (1980) Determination of glutathione and glutathione disulfide using glutathione reductase and 2-vinylpyridine. Anal. Biochem. 106: 207-212.
Chen Z., Young T.E., Ling J., Chang S.C. y Gallie D.R. (2003) Increasing vitamin C content of plants through enhanced ascorbate recycling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:3525-3530.
Christou P., Ford T. y Kofron M. (1991) Production of transgenic rice (Oryza sativa L.) plants from agronomically important indica and japónica varieties via electric discharge particle acceleration of exogenous DNA into immature zygotic embryos. Bio/Technology 9:957-962.
Christensen A.H. y Quail P.H. 1996. Ubiquitin promoterbased vectors for high-level expression of selectable and/or screenable marker genes in monocotyledonous plants. Transgenic Res. 5:213-218.
Colot V., Robert L.S., Kavanagh T.A., Bevan M.W. y Thompson R.D. (1987) Localization of sequences in wheat endosperm protein genes which confer tissue-specific expression in tobacco. EMBO J. 6:3559-3564.
De la Garza R.D., Quinlivan E.P., Klaus S.M., Basset G.J., Gregory J.F. y Hanson A.D. (2004) Folate biofortification in tomatoes by engineering the pteridine branch of folate synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:13720-13725.
Drakakaki G., Christou P. y Stoger E. 2000. Constitutive expression of soybean ferritin cDNA in transgenic wheat and rice results in increased iron levels in vegetative tissues but not in seeds. Transgenic Res. 9:445-452.
Gordon-Kamm W., Spencer T.M., Magnato M., Adams T.R., Daines R.J., Start W.G., O'Brien J.V., Chambers S.A., Adams W.R., Willets N.G., Rice T.B., Mackey C.J., Krueger R.W., Kausch A.P. y Lemaux P.G. 1990. Transformation of maize cells and regeneration of fertile transgenic plants. Plant Cell 2:603-618.
Kurilich A.C. y Juvik J.A (1999) Quantification of carotenoid and tocopherol antioxidants in Zea mays. J. Agric. Food Chem. 47:1948-1955.
Kurilich A.C., Tsau G.J., Brown A., Howard L., Klein B.P., Jeffery E.H., Kushad M., Wallig M.A. y Juvik J.A. (1999) Carotene, tocopherol, and ascorbate contents in subspecies of Brassica oleracea. J. Agric. Food Chem. 47:1576-1581.
Misawa N., Yamano S., Linden H., de Felipe M.R., Lucas M., Ikenaga H. y Sandmann G. (1993) Functional expression of the Erwinia uredovora carotenoid biosythesis gene crtI in transgenic plants showing an increase of \beta-carotene biosynthesis activity and resistance to the bleaching herbicide norflurazon. Plant J. 4:833-840.
Okita T.W., Hwang Y.S., Huilo J., Kim W.T., Aryan A.P., Larsen R. y Krishnan H.B. (1989) Structure and expression of the rice glutelin multigene family. J. Bio. Chem. 264:12573-12581.
Ralley L., Enfissi E.M.A., Misawa N., Schuch W., Bramley P.M. y Fraser P.D. (2004) Metabolic engineering of ketocarotenoid formation in higher plants. Plant J. 39:477-486.
Sambrook J., Fritsch E.F. y Maniatis T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY.
Schreier P.H., Seftor E.A., Schell J. y Bohnert H.J. (1985) The use of nuclear-encoded sequences to direct the light-regulated synthesis and transport of a foreign protein into plant chloroplasts. EMBO J. 4:25-32.
Sorensen M.B., Muller M., Skerritt J. y Simpson D. (1996) Hordein promoter methylation and transcriptional activity in wild-type and mutant barley endosperm. Mol. Gen. Genet. 250:750-760.
Stoger E., Williams S., Keen D. y Christou P. (1999) Constitutive versus seed specific expression in transgenic wheat: temporal and spatial control. Transgenic Research 8:73-82.
Su P.H., Yu S.M. y Chen C.S. (2001) Spatial and temporal expression of a rice prolamin gene RP5 promoter in transgenic tobacco and rice. J. Plant Physiol. 158:247-254.
Torrent M., Alvarez I., Geli M.I., Dalcol I y Ludevid D. (1997) Lysine-rich modified \gamma-zeins accumulate in protein bodies of transiently transformed maize endosperms. Plant Molecular Biology 34:139-149.
Washida H., Wu C.Y., Suzuki A., Yamanouchi U., Akihama T., Harada K. y Takaiwa F. (1999) Identification of cis-regulatory elements required for endosperm expression of the rice storage protein glutelin gene GluB-1. Plant Molecular Biology 40:1-12.
Zhu C., Yamamura S., Nishihara M., Koiwa H. y Sandmann G. (2003) cDNAs for the synthesis of cyclic carotenoids in petals of Gentiana lutea and their regulation during flower development. Biochemica et Biophysica Acta 1625:305-308.
<110> Universidad de Lleida e Institució Catalana de Recerca I Estudis Avançats.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Método para crear una población combinatoria de plantas transgénicas que expresan y acumulan una diversidad de metabolitos.
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<130> P-INCI-N-07-0156
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<211> 31
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<212> DNA
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<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo gen DHAR Orazy sativa 
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<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtctagatgg gcgtggaggt gtgcgtcaag g 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso gen DHAR orazy sativa 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agagctcgct cttacgcatt cacttttggt g 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo gen folE Escherichia coli 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aggatccatg ccatcactca gtaaagaagc gg 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso gen folE Escherichia coli 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agagctctaa tcagttgtga tgacgcacag cg 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo ZmPSY1 set 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aagtacgctt gtagctagtg ca 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso ZmPSY1 set 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
acaagctcat ctgtcctcct acac 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo ZmPSY1 set 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtgtaggagg acagatgagc ttgt 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso ZmPSY1 set 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
catctgctag cctgtgagag ctca 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo ZmPSY1 set 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gaaagcgtat acagtgctgc cttg 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso ZmPSY1 set 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cttctttact ccaccatctc gtc 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo PaCrtI set 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctaactaaca cagccgtgca cat 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso PaCrtI set 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
accttactgt aaacgcttct cca 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo PaCrtI set 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tggagaagcg tttacagtaa ggt 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso PacrtI set 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcgtgcagat aaagtgagaa gtc 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo PaCrtI set 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
catcatgatc agctcgcgca tcaca 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso PaCrtI set 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtgccttgaa ctgcttttat tctt 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo G1LYCB set 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggaaacatct ataaatagac aag 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso G1LYCB set 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccatgtagca tcaaggcaat ct 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo G1LYCB set 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agattgcctt gatgctacat gg 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso G1LYCB set 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agagttcttg ctaccatata acca 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo G1LYCB set 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tggttatatg gtagcaagaa ctct 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso G1LYCB set 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cttctttact ccaccatctc gtc 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo ZmBCH set 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctaactaaca cagccgtgca cat 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso ZmBCH set 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aggatcctat cgcttcagct ggcaa 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo ZmBCH set 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atctagaaac ttgtccatgt ggtgta 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso ZmBCH set 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aggatcctat cgcttcagct ggcaa 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo ZmBCH set 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atctagaaac ttgtccatgt ggtgta 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso ZmBCH set 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtgccttgaa ctgcttttat tctt 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo G1BCH set 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cacctttcgt gtaccacact tc 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso G1BCH set 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctctctgact tcttcctcgc caa 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo G1BCH set 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttggcgagga agaagtcaga gag 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso G1BCH set 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtgatgaagc gtgtgagcag cagc 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo G1BCH set 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atggcacatg catgagtcac ac 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso G1BCH set 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtgccttgaa ctgcttttat tctt 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo Paracoccus-Crtw set 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agaccattag ctttatctac tccag 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso Paracoccus-Crtw set 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cttgacgatc atcttgcgcc acga 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo Paracoccus-Crtw set 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atcgcgcatg acgcgatgca cgg 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso Paracoccus-Crtw set 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggtgcaggtg gtgttcgtga tgat 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo Paracoccus-Crtw set 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgtggcgca agatgatcgt caag 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso Paracoccus-Crtw set 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtgccttgaa ctgcttttat tctt 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo OsDHAR set 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctaactaaca cagccgtgca cat 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso OsDHAR set 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agagctcgct cttacgcatt cacttttggt g 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo OsDHAR set 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtctagatgg gcgtggaggt gtgcgtcaag g 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso OsDHAR set 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agagctcgct cttacgcatt cacttttggt g 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo osdhar set 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtctagatgg gcgtggaggt gtgcgtcaag g 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso OSDHAR set 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtgccttgaa ctgcttttat tctt 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo Ecfo1E set 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctaactaaca cagccgtgca cat 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso Ecfo1E set 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agagctctaa tcagttgtga tgacgcacag cg 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo Ecfo1E set 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aggatccatg ccatcactca gtaaagaagc gg 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso Ecfo1E set 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agagctctaa tcagttgtga tgacgcacag cg 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo Ecfo1E set 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aggatccatg ccatcactca gtaaagaagc gg 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso Ecfo1E set 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtgccttgaa ctgcttttat tctt 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo gen actina maiz
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtgacaatgg cactggaatg gtcaa 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso gen actina maiz
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gacctgacca tcaggcatct cgta 
\hfill
24

Claims (9)

1. Procedimiento de obtención de plantas transgénicas, caracterizado porque dichas plantas se obtienen por transformación genética conjunta en una planta de un número ilimitado de genes que participan en una ruta metabólica.
2. Procedimiento de obtención de plantas transgénicas según la reivindicación 1, en el que la ruta metabólica se selecciona de la ruta de los carotenoides, la vitamina C y/o la vitamina E.
3. Procedimiento de obtención de plantas transgénicas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las plantas transgénicas sobreexpresan o subexpresan los productos codificados por dichos genes en comparación con las plantas de tipo natural.
4. Procedimiento de obtención de plantas transgénicas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la planta transgénica es maíz.
5. Procedimiento de obtención de plantas transgénicas según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la planta transgénica es arroz.
6. Procedimiento de obtención de plantas transgénicas según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la planta transgénica es tabaco.
7. Planta transgénica obtenida por medio de un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
8. Uso de una planta transgénica según la reivindicación 7, para la producción de metabolitos derivados de una ruta metabólica.
9. Uso según la reivindicación 8, en el que la ruta metabólica se selecciona de la ruta de los carotenoides, la vitamina C, el folato y/o la vitamina E.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CA2401958A1 (en) * 2000-02-29 2001-09-07 Auburn University Multiple gene expression for engineering novel pathways and hyperexpression of foreign proteins in plants

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATTA, K. et al. Bioengineered 'golden' indica rice cultivars with beta-carotene metabolism in the endosperm with hygromycin and mannose selection systems. 2003. Plant Biotechnology Journal. Vol. 1, páginas 81-90. Página 81. *
FREDY, A. et al. Particle bombardment and the genetic enhancement of crops: myths and realities. 2005. Molecular Breeding. Vol. 15, páginas 305-327. Páginas 311-313. *

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