WO2009057812A1 - ポリエチレングリコールの結合した核酸のコンジュゲートとリン酸力ルシウムの有機一無機ハイブリッド型ナノ粒子 - Google Patents

ポリエチレングリコールの結合した核酸のコンジュゲートとリン酸力ルシウムの有機一無機ハイブリッド型ナノ粒子 Download PDF

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Kazunori Kataoka
Mingzhen Zhang
Atsushi Ishii
Nobuhiro Nishiyama
Satoru Matsumoto
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The University Of Tokyo
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
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    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Definitions

  • the present invention relates to organic-inorganic hybrid-type nanoparticles for delivering a nucleic acid to a target, and a method for producing the same and use for delivery.
  • sma l i nt er f e r i n gRNA is a fascinating research tool for controlling cellular processes related to gene silencing at the post-transcriptional level. Since introduction of siRNA into mammalian cells results in highly sequence-specific gene expression inhibition at the mRNA level, this technique is known to be significantly more effective than using antisense. (Refer to Non-Patent Document 1 below). Genes mediated by RNA interference (RNA i) in mammalian cells several years ago. From the discovery of silencing, there is a vast number of research activities that use siRNA to knock down target genes (see below, Non-Patent Documents 2, 3 and 4).
  • Non-Patent Document 5 There is a consensus that one of the major barriers to incorporation into clinically relevant therapies is the development of efficient gene delivery vectors.
  • Viral vectors have been shown to be useful gene delivery vectors, but their clinical use is limited by their immunogenicity, carcinogenicity and high manufacturing costs (eg, see below, Non-patent documents 6 and 7).
  • Non-viral vectors are promising viral vectors There is a growing interest as an alternative to ⁇ ".
  • non-viral vectors there is a strong interest in delivery systems based on cationic lipids and polymers.
  • their usefulness in gene therapy has increased. In order to expand, the problems to be solved remain to stay in the blood, reduce toxicity, improve the efficiency of use in inyo, and lower the cost.
  • HAp hydroxyapatite
  • C a P calcium phosphate
  • Nano-sized C a P particles have been proven to be an efficient carrier for DNA (see, eg, Non-Patent Documents 9 and 10 below). It was also found that the size of C a P nanoparticles plays an important role in achieving efficiency and transfection, while the rapid growth of C a P crystals is significant. It was also known to generate precipitates and dramatically reduce transfection efficiency (see Non-Patent Document 11 below).
  • Non-Patent Document 12 poly (ethylene glycol) and b-poly (methacrylic acid) (PEG-PMA) to form PE G-PMA / C a P / si RNA hybrid nanoparticles.
  • PEG-PMA poly (ethylene glycol) and b-poly (methacrylic acid)
  • Patent Document 1 • W O 0 3/0 1 8 6 9 0
  • Non-patent literature 1 CD • No Vina, eta 1 •, Nature 2 0 4, 4 3 0 1 6
  • Non-patent literature 2 Y-Dorsertteta 1 Nature Re V iews Drug Drug isco V er 2 0 0 4 3
  • Non-Patent Document 4 • R • C c • R y t h er te a 1-ene T h er a P y 2 0 0 5, 1 2
  • Non-Patent Document 8 M-O k aza k i, e t a 1-B i o m a t e r i a 1 s 2 0 0 1 2 2 2 4 5 9
  • Non-Patent Document 9 F L-G r a h a m e t a 1-V i r o 1 o g y 1 9 7 3 5 2 4 5 6
  • Non-patent document 1 0 A • Mai rt a E x P er t R e V i e w o f M o 1 e c u 1 r D i a n o s t i c s 2 0 0 5
  • Non-patent literature 1 1 M • Jordaneta 1 • N uc 1 eic A cids R esearch 1 9 9 6, 2 4 5 9 6
  • Non-Patent Literature 1 2 Y. K akizawa. Ataoka, Langmuir 2 0 0 2, 1 8, 4 5 3 9
  • Non-Patent Document 1 3 Y. K a k i z a w a e t a 1., J o u r ⁇ a 1 o f C o n t r o l l e d R e l e a s e 2 0 0 4, 9 7, 3 4 5
  • Non-Patent Document 14 Y. K a kiz awa a t a 1., J o u r ⁇ a 1 o f C o n r r o l l e d R e l e a s e 2 0 0 6, 1 1 1, 3 6 8
  • siRNA is encapsulated in the PEG-PMA / CaP hybrid-type nanoparticles.
  • the presence of the cation species, PMA and siRNA always causes competition in the binding between the anionic PMA / siRNA and the positive charge on the CaP surface.
  • the efficiency of 3 i RNA incorporation into &? Decreases.
  • the present inventors have found that the above problem is essential when a complex in which a polyethylene glycol chain is covalently bonded to siRNA is combined with the above system without using PEG-PMA. It was speculated that there was a possibility that it could be solved.
  • the present invention comprises a conjugate of polyethylene glycol covalently bound to the 3 ′ or 5 ′ end of a nucleic acid, and calcium ions (C a 2+ ) and phosphate ions (PO 4 3 ).
  • Organic-inorganic hybrid nanoparticles are provided.
  • the conjugate is of the general formula I
  • P E G represents a polyethylene glycol chain
  • A represents a terminal group or terminal portion of P E G
  • L represents a linker that covalently binds the other end of the A-binding end of P E G to the 3 ′ or 5 ′ end of NuA, and
  • NuA is selected from the group consisting of oligo or poly double stranded RNA, oligo or poly double stranded DNA, oligo or poly single stranded RNA and oligo or poly single stranded DNA, and calcium ion is phosphate ion More excess equivalents are present.
  • an aqueous solution in the 3 'or 5' end of the nucleic acid is polyethylene glycol chain comprising the covalently bound Konjiyugeto and C a 2 +, P 0 4 3 - an aqueous solution comprising
  • a method for producing organic-inorganic hybrid-type nanoparticles which comprises a step of mixing calcium phosphate and the above-mentioned compound under conditions capable of forming nanoparticles.
  • the nanoparticles thus provided are efficiently taken up by mammalian cells, they can also be used as research or medical tools for delivering nucleic acids to mammalian cells.
  • the nucleic acid (or NuA) referred to in the present invention is a molecule of a nucleic acid chain in which more than one nucleotide is bound in the 5 ′ ⁇ 3 ′ direction, and is involved in the life phenomenon of animals or plants, particularly mammals. Means a molecule to get.
  • 'Such nucleic acid chains include single- or double-stranded RNA or DNA, and double The strand can be DNA / DNA, RNA / RNA or DNAZRNA.
  • the nucleotide is selected from adenosine (A), guanosine (G), uridine (U), cytidine (C), and thymidine (T), but the nucleic acid is within the range that does not adversely affect the object of the present invention. It may include naturally occurring modified nucleotides or nucleotides having non-natural bases that can be replicated and transcribed and translated in animals or plants, particularly mammalian cells.
  • Nucleic acid molecules that can participate in biological phenomena can be genes that cause some disease by being deficient. In addition, it refers to a molecule that can ultimately regulate gene expression in specific cells through, for example, RNA interference (RNA i) or binding to target DNA.
  • RNA i RNA interference
  • a relatively short (contained in the oligo concept) nucleotide chain for example, a short chain or small oligonucleotide comprising up to about 400 nucleotides within an organic-inorganic hybrid nanoparticle.
  • RNA can be efficiently and stably encapsulated, so that it can be used for nucleic acid molecules included in the concept of known RN A or DN A aptamers, and RN A i, for example, small (or short) interfering RNA (si).
  • RN A for example, small (or short) interfering RNA (si)
  • the present invention can be conveniently applied to nucleic acid molecules encompassed within the concept of (RNA).
  • the size of a nucleic acid molecule that is suitable and can be used effectively in the present invention is a nucleotide chain length of about 16 to about 400 0 when it is a double-stranded nucleic acid.
  • a single-stranded nucleic acid it can be a nucleotide chain of about 40 to about 400.
  • a nucleic acid molecule that can be suitably used in the present invention may have an overhang of 3, 3 nucleotides at the end, about 19 to 30 in a single strand, preferably about Mention may be made of siRNA having 19 to 23 nucleotides, and RNA or DNA aptamers having about 50 to 140 nucleotides.
  • siRNA specific examples can be designed with reference to genes that can be the target of gene therapy.
  • genes include: PKC ⁇ related to non-small cell lung cancer, BCL-2 related to malignant melanoma, ICAM-1 related to Crohn's disease, HCV related to hepatitis C, rheumatoid arthritis or 'psoriasis' relevant to TNF alpha, adenosine AI receptor that is relevant to asthma, c one rafkinase that are relevant, such as ovarian cancer, relevant like ⁇ cancer H- ras, relevant to coronary artery disease c one myc PKA Ria related to colon cancer, HIV related to AIDS, DN A methyltransferase related to solid cancer, VEGF receptor related to cancer, ribonucleotide reductase related to kidney cancer, CMV IE 2 related to CMV retinitis, MMP-9 related to prostate cancer, TGF 2 related to malignant glioma
  • a conjugate in which a polyethylene glycol chain is covalently bonded to the nucleic acid 3 ′ or 5 ′ end is a conjugate that can be produced by covalently binding the above nucleic acid molecule and polyethylene glycol by a known linking method (for example, WO 2006/0 2541 9 , WO 2007/02 1 1 42), can organic-inorganic hybrid nanoparticles be formed in an aqueous solution in the presence of calcium ions (C a 2+ ) and phosphate ions (P 0 4 3- )? It also includes the following conduit. Typical examples of such conduits include those represented by the following general formula I:
  • P EG represents a polyethylene glycol chain
  • A represents a terminal group or terminal portion of PEG
  • L represents a linker that covalently binds the other end of the PEG A-binding end to the 3 'or 5 end of Nu A
  • NuA is selected from the group consisting of the above-mentioned oligo or poly double stranded RNA, oligo or poly double stranded DNA, oligo or poly single stranded RNA and oligo or poly single stranded DNA.
  • the molecular weight of PEG is not limited as long as it can form the organic-inorganic hybrid-type nanoparticles of the present invention, but it is about 60,000 Da to about 500,000 Da, preferably about 70.
  • the force S can be within the range of 0 0 D a to about 2 5 0 0 0 D a, more preferably about l OOOOD a to about 2 5 0 0 0 D a.
  • a which is the terminal group or terminal part of PEG is a hydrogen atom, — i.
  • a linear or branched alkyl or alkenyl group eg, methyl, ethyl, propyl, isopropyl, hexyl or allyl
  • an aralkyl group eg, benzyl, fu; n-netyl, etc.
  • a hydroxy group C i — I.
  • a group or a functional group selected from the group consisting of a carboxy group (a protective group in the case of being referred to as protected means a protective group for an amino group or a carboxyl group conventionally used in peptide synthesis)
  • a functional group or a binding moiety such as a ligand (eg, sugar, peptide, etc.) or an antibody bound via the functional group capable of binding to a cell surface receptor. Door can be.
  • Linker L binds to the 3 'or 5' end of either the sense strand or antisense strand when binding to double stranded nucleic acid, and 3 'or 5, It is covalently bonded to one of the ends by any bonding mode known in the art, such as a phosphate bond, and a carbon-carbon bond, an ether bond, a tioite at the other end with respect to A of the PEG chain. It is a linking group that is covalently bonded via a benzene bond, an ester bond, a thioester bond, an amide bond, a urea bond, a urea bond, and the like.
  • the linker L may contain, in addition to the bonds having both ends as described above, an alkylene group having a total number of atoms of 30 to 30 which may be interrupted at one or more oxygen or sulfur atoms. it can.
  • alkylene chains include, but are not limited to, one CH 2 CH 2 CH 2 —, one CH 2 CH 2 — O— CH 2 CH 2 —, one CH 2 CH 2 — (O- CH 2 CH 2 ) 2 —, — CH 2 CH 2 — S— CH 2 CH 2 — and CH 2 CH 2 — S— (CH 2 ) 6 — and the like.
  • a bond that can be cleaved under physiological conditions in such an alkylene chain such as an ester bond that can be cleaved at low pH (5.0 to 6.0) in endosomes or under reducing conditions or reduced It is preferred to include a disulfide bond that can be cleaved in the presence of a substance that can act as an agent.
  • alkylene chains containing such bonds include, but are not limited to, 1 CH 2 CH 2 OCOCH 2 —, 1 CH 2 CH 2 SS CH 2 _, 1 CH 2 CH 2 CH 2 — COO— CH 2 — and _C H 2 CH 2 OCH 2 CH 2 SS CH 2 CH 2 — can be mentioned.
  • the A—P EG—L—nucleic acid conjugate described above is not limited by theory, but the calcium ion (C a 2 + ) and phosphate ion can be converted via an anion-charged nucleic acid moiety.
  • Inorganic hybrid nanoparticles are provided that are defined or incorporated within the cationic surface of calcium phosphate (C a P) particles and Z or microparticles containing (PO 4 3 —) in a specific ratio Is done.
  • C a P in the nanoparticles calcium ions are present in an excess equivalent amount than phosphate ions, and preferably, the molar ratio of calcium ions to phosphate ions of C a P is 20 to 500, preferably Is between 30 and 300, more preferably between 50 and 200.
  • excess calcium ions in C a P and the anion-charged phosphate moiety derived from the nucleic acid of the above-mentioned complex interact with each other by ion-ion interaction, so It is presumed that the nucleic acid portion is partially or wholly encapsulated. Please refer to the transmission electron micrograph of the nanoparticles described below.
  • the CaP and conjugate should be contained in such a ratio that the phosphate portion in each molecule of the conduit can at least partially interact with the above excess calcium ion.
  • the phosphoric acid moiety and the excess calcium ion in the nucleic acid are in a molar ratio of 0.0 0 1 to 0.05 to 1, preferably 0.0 0 2 to 0.0 1 Chosen to be one-on-one.
  • Calcium ions may also be partially replaced by another multivalent force thione, eg, Mg 2 + .
  • the nanoparticles referred to in the present invention have a cumulant average particle diameter of nano-order, but not limited, but 30 nm to 100 nm, preferably 50 ⁇ ! ⁇ 300 nm, but particles having an average particle size of a few microns have also been used as a concept that can be included.
  • an aqueous solution comprising said Konjiyuge bets and C a 2 +, PO 4 3 - the comprising at aqueous solution with calcium phosphate the Konjiyugeto can form nanoparticles conditions It can be produced by mixing below.
  • the mixing condition of this aqueous solution may be that the liquid mixture is allowed to stand for 1 hour to 40 hours at 10 ° C. to 50 ° C. under conditions that do not adversely affect the nucleic acid.
  • the concentration of the conjugate in the aqueous solution after mixing is not particularly limited as long as the conjugate can be dissolved, but is usually 0.1 mM to 20 mM, preferably 0.2 mM to 5 m based on the nucleotide.
  • M and the calcium ion concentration is 30 m! V! ⁇ 500 mM, preferably 50 mM ⁇ 300 mM, and the concentration of phosphate ions for forming CaP is 0.1 mM ⁇ 20 mM, preferably 0.2 mM ⁇ 1 0 m: ⁇ ⁇ ; i Can be set.
  • polyvalent cations other than calcium ions e.g., M g 2 + can be included 0.0 1-1 equivalents relative to C a 2 +.
  • the organic mono-inorganic hybrid nanoparticles that can be provided by the present invention are in contact with animal or plant cells, particularly mammalian cells, under physiological conditions. In this way, these particles are efficiently taken up by these cells, and the particles thus taken up can be gradually broken down in cells with a low calcium ion concentration to release A-PEG-L-nucleic acid conjugates. .
  • the conjugate linker has a bond that can be cleaved under physiological conditions, the nucleic acid can be released from the conjugate within the cell.
  • calcium ions are expected to release a cationic polymer in the cell, since calcium ions essentially do not adversely affect the function of the cell's physiological nucleic acids. It can be used safely compared to the siRNA—PEG complex and cationic polymer ion complex described in 0 0 6/0 2 5 4 1 9 or WO 2 0 0 7/0 2 1 1 4 2.
  • Such organic mono-inorganic hybrid type nanoparticles can also be provided as a composition with a pharmaceutically acceptable diluent or carrier.
  • a pharmaceutically acceptable diluent or carrier examples include deionized purified water, a buffer solution having a physiologically acceptable pH value, and examples of the carrier include sugars or sugars such as glucose, sucrose, and mannitol. Mention may be made of alcohol.
  • Figure 1 shows the results of electrophoresis using 20% polyatrylamide gel to confirm the formation of PEG (12k) — SS—siRNA, PEG (15k) -SS-siRNA. It is a photograph showing the result.
  • Lane 1 PEG (12 k) — SS—siRNA
  • Lane 2 PEG— (15 k) One SS—siRNA
  • Lane 3 siRNA
  • Lane 4 PEG treated with 10 mM DTT (1 2 k) — SS— si RNA
  • lane 5 PEG treated with 10 mM DTT— (15 k) — SS— si RNA
  • ⁇ 2 is the particle size of calcium phosphate particles (1) measured by dynamic light scattering
  • FIG. 3 is a graph showing the results of evaluating the expression suppression activity for firefly luciferase gene in i n vitro for the calcium phosphate particles of the present invention.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of evaluating the stability of the calcium phosphate particles of the present invention in the presence of serum.
  • M w 1 5 0 0 0
  • 2'-dipyridyldisulfide A ldrich
  • n-propylamine 1.75 ml
  • the SH-si RNA (targeting the luciferase gene) used in this example is 5′-CUUAC G CUGAGU ACUUC GA dT d T-3 ′ as the sense strand and 5′—UCG AAGUACU C as the antisense strand.
  • AG C GUAAG d T d T— 3 ′ is used to form a double strand, and the 5 ′ end of the sense strand is SH-modified (C 6 S—S modifier, G len R eserch). It is a thing.
  • SH—si RNA (0. 1 mo 1) was dissolved in 10 ml of 10 mM Tris 13 11 £ £ 6 (117.4) containing 0.05 M dithiothreitol at room temperature. After 6 hours, dithiothreitol was removed using a NA P-5 column (GE Healthcare Bioscience). PEG (12 kDa) -SS-py1 (12 mg) was added to the SH-siRNA and allowed to react at room temperature for 24 hours. The reaction product was purified by fractionation with reverse phase HP.
  • Reversed-phase HPLC uses TSK ge 1 O 1 igo -DNA RP (Tosoichi) as the column and 0.1 M ammonium acetate solution (eluent A) containing 5% acetonitrile as the eluent. 7 Elution was performed using a 0.1 M ammonium acetate solution containing 0.1% acetonitrile (eluent B) and a linear gradient from eluent A to eluent B (40 min, flow rate lml per minute). . UV (detection wavelength 2600 nm) was used for detection.
  • PEG (1 2 k) — SS— si RN A-containing fractions are concentrated on a centrifugal evaporator and then processed through a NAP—5 column to obtain 33 ⁇ PEG (1 2 k) — SS— si A 1 mM Trisbuffer solution (pH 7.4) containing RNA was obtained.
  • PEG (5 kDa) -SS-pyl and PEG (15 kDa) -one SS-pyl are used respectively.
  • PEG (5 kDa) mono-SS-si RNA and PEG (15 kDa) mono-SS-si RNA were obtained.
  • solution ⁇ was mixed with 200 1 and then allowed to stand at 25 ° C for 24 hours, so that particles (1) to (8 ) And (C-1) solution was obtained.
  • si RNA (5 '— CUUAC G CUGAGUACUU C GA d T d T-3' as sense strand and 5 '-UC GAAGUA CUCAG C GUAAG d T d T-3' as antisense strand to form a double strand 1) 70 ⁇ g Zm Calcium chloride 25 500 mM
  • a solution having the above composition was prepared using 1 mM Trisbuffer (pH 7.6).
  • P E G Poly (aspartic acid) (P E G molecular weight 1 2 0 0 0, polymerization degree of polyaspartic acid 2 4) 3 0 0 g / m 1

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Abstract

核酸にポリエチレングリコール鎖の共有結合したコンジュゲートと、力ルシウムイオン（Ｃａ２＋）およびリン酸イオン（ＰＯ４ ３-）を含んでなる有機一無機ハイブリッド型のナノ粒子が提供される。かような粒子は核酸の効果的な細胞への送達系として利用できる。

Description

ポリエチレングリコールの結合した核酸のコンジユゲートとリン酸カル シゥムの有機一無機ハイプリ ッド型ナノ粒子 技術分野 - 明
本発明は、 核酸を標的に送達するための有機一無機ハイプリ ッド型の ナノ粒子、 ならびにその製造方法および送達用の使用に関する。
田
背景技術
s ma l l i n t e r f e r i n g RNA ( s i RNA) は、 転 写後レベルでのジーン ·サイレンシングに関する細胞過程を制御するた めの魅惑的な研究手段である。 s i RNAの哺乳類細胞内への導入は m RN Aレベルで高度の配列特異的な遺伝子の発現阻害をもたらすので、 この手法はアンチセンスの使用よりも有意に優れた効能を示すことが知 られている （下記、 非特許文献 1参照） 。 数年前の哺乳類細胞内での R NA干渉 （RNA i ) が媒介するジーン . サイレンシングの発見から、 s i RNAを標的遺伝子のノックダウンに利用する膨大な数の研究活動 が存在する （下記、 非特許文献 2、 3および 4参照） 。 ウィルス疾患や 癌などの各種遺伝子疾患の治療における s i RNAの使用についての潜 在力は極めて高いとはいえ、 ヌクレアーゼに対して本質的に不安定であ り、 生体利用能も低いため s i RNAの実用的な用途は限定されている (下記、 非特許文献 5参照） 。 臨床に適する療法に組み入れる上での主 要な障壁の一つは効率のよい遺伝子送達ベクターの開発にあることは衆 目の一致するところである。
ウィルスベクターは、 有用な遺伝子送達ベクターであることが明らか にされている一方で、 それらの免疫原性、 発癌性および高い製造コスト、 等により臨床上の使用が制限されている （例えば、 下記、 非特許文献 6 および 7参照） 。 非ウィルス性ベクターは見込みのあるウィルスベクタ ^"の代替物としての考えが高まっている。 非ウィルスベクターの中でも、 カチオン性リピッドおよぴポリマーをベースとする送達系に強い興味が 集まっている。 しかし、 遺伝子療法でそれらの有用性を拡大するために は、 血中滞留性、 毒性の低減、 i n y oでの使用効率の向上およ びコス トの低下が解決すべき課題として残存する。
リン酸カルシウムの結晶形態物 （以下、 C a Pと略記する） であるハ イ ドロキシアパタイ ト （HAp) が DNAに対して結合親和性を示すこ とは既に報告されている （以下、 非特許文献 8参照） 。 ナノサイズの C a P粒子は DNAについての効率のよいキヤリア一であることが証明さ れてきた （例えば、 下記、 非特許文献 9および 1 0参照） 。 また、 C a Pナノ粒子のサイズが効率のょレ、トランスフエクションを達成する上で 重要な役割を担うことも見出されていたが、 一方で、 C a P結晶の迅速 な成長が大きな沈殿を生成し、 トランスフエクション効率を劇的に低下 させることも知られていた （下記、 非特許文献 1 1参照） 。
遺伝子送達用の新規なキヤリァ一の開発に向けた本発明者等のここ数 年に亙る連続する研究を通じて、 本発明者等は DNAおよび s i RNA の送達用に C a Pをベースとするハイブリッ ドナノベクターを至適化す ベ鋭意研究してきた （例えば、 それぞれ、 下記、 非特許文献 1 2および 非特許文献 1 3参照） 。 先に、 本発明者等の一部は、 ポリ （エチレング リコール） 一 b—ポリ （メタクリル酸） （P EG— PMA) を用いて P E G- PMA/C a P/ s i RNAハイプリッ ド型ナノ粒子を作製した (下記、 非特許文献 1 4および特許文献 1参照） 。 培養細胞株では、 か なり高濃度の P EG— PMA (すなわち、 4 5 0— 5 5 0 g Zm 1 ) で有意なジーン ·サイレンシングが達成された。 しかし、 単分散ナノ粒 子の形成にとって高い P E G— PMA濃度が必要であり、 これが効率的 なジーン ·サイレンシングおよびハイプリ ッドナノ粒子中への s i RN Aの取り込み効率に悪影響を及ぼすことから、 可能ならば、 さらに効果 的な遺伝子または核酸の送達系を提供することが必要である。
従来技術文献の一覧
特許文献 1 • W O 0 3 / 0 1 8 6 9 0
非特許文献 1 ； C D • N o V i n a ， e t a 1 • , N a t u r e 2 0 0 4 ， 4 3 0 1 6 1 - 非特許文献 2 ： Y - D o r s e r t t e t a 1 N a t u r e R e V i e w s D r u g D i s c o V e r 2 0 0 4 3
3 1 8 .
非特許文献 3 '· R • M • S c h i f f e 1 e r s j e t a 1
P h a r m a c e u t i c a 1 R e s e a r c h 2 0 0 4 , 2 1 丄
非特許文献 4 • R • C c • R y t h e r e t a 1 - e n e T h e r a P y 2 0 0 5 ， 1 2 5 - 非特許文献 5 - R - M • S c h i f f e 1 e r s , e t a 1
N u c 1 e i c A c i d s R e s e a r c h 2 0 0 4 , 3 2 - 非特許文献 6 ； R - G - C r y s t a 1 S c i e n c e 1 9
9 5 , 2 7 0 , 4 0 4
非特許文献 7 '· S - K • T r i P a t h y e t a 1 . N a t u r e M e d i c i n e 1 9 9 6 2 5 4 5
非特許文献 8 ； M - O k a z a k i , e t a 1 - B i o m a t e r i a 1 s 2 0 0 1 2 2 2 4 5 9
非特許文献 9 F . L - G r a h a m e t a 1 - V i r o 1 o g y 1 9 7 3 5 2 4 5 6
非特許文献 1 0 ； A • M a i t r a E x P e r t R e V i e w o f M o 1 e c u 1 r D i a n o s t i c s 2 0 0 5
5 , 8 9 3
非特許文献 1 1 M • J o r d a n e t a 1 • N u c 1 e i c A c i d s R e s e a r c h 1 9 9 6 ， 2 4 5 9 6 非特許文献 1 2 : Y. K a k i z a w a . a t a o k a , L a n g m u i r 2 0 0 2 , 1 8 , 4 5 3 9
非特許文献 1 3 : Y. K a k i z a w a e t a 1. , J o u r η a 1 o f C o n t r o l l e d R e l e a s e 2 0 0 4, 9 7， 3 4 5
非特許文献 1 4 : Y. K a k i z a w a e t a 1 . ， J o u r η a 1 o f C o n t r o l l e d R e l e a s e 2 0 0 6 , 1 1 1 , 3 6 8
発明の開示
上記 P EG- PMA/C a Pハイブリ ッド型ナノ粒子内へ s i RN A が内包される現象について、 理論に拘束されるものでないが、 本発明者 等は、 次の推測を行った。 ァ-オン種、 つまり PMAおよび s i R NA の存在が、 ァニオン性 PMA/ s i RN Aと C a P表面上の陽電荷の間 の結合の際にかならず競合を起こす。 言い換えれば、 このような競合の 結果として、 & ?への 3 i RNAの取り込み効率は低下する。 本発明 者等は、 こうような競合を避ける手段として、 P EG— PMAを使用す ることなく、 s i RN Aにポリエチレングリコール鎖の共有結合したコ ンジユゲートを上記系と組み合わせると前記問題点が本質的に解決でき る可能性があると推測した。 こうして、 s i RNAにポリエチレングリ コール鎖の共有結合したコンジュゲートを生成し、 得られたコンジュゲ ートを C a Pの形成系で使用してみたところ、 現に、 効率よく s i RN Aを C a Pに取り込むことができることのみならず、 容易に安定な単分 散ナノ粒子を取得できることを見出した。 そして、 このようなナノ粒子 は、 標的細胞に効率よく取り込まれ、 細胞内で該コンジュゲートを放出 し、 核酸の機能が効率よく発揮されることが確認された。 また、 短鎖の オリゴヌクレオチドもしくは小型の分子である s i RNAを効率よく C a Pに取り込むことができることから理解できるように、 他の一定の核 酸も同様にこの新規な系に取り込み得ることも見出した。 こうして、 本発明によれば、 核酸の 3 ' または 5 ' 末端にポリエチレ ングリコールの共有結合したコンジュゲートと、 カルシウムイオン （C a 2+) およびリン酸イオン （PO4 3一） を含んでなる有機一無機ハイ プリッド型ナノ粒子が提供される。
好適な態様のナノ粒子では、 前記コンジュゲートが、 一般式 I
A— P E G- L -N u A ( I )
式中、
P E Gはポリエチレングリコール鎖を表し、
Aは P E Gの末端基または末端部分を表し、
Lは P E Gの A結合末端の別の末端と N u Aの 3 ' または 5 ' 末端を 共有結合するリンカ一を表し、 そして
NuAは、 オリゴもしくはポリ二本鎖 RNA、 オリゴもしくはポリ二 本鎖 DNA、 オリゴもしくはポリ一本鎖 RN Aおよびオリゴもしくはポ リー本鎖 DNAからなる群より選ばれ、 かつ、 カルシウムイオンがリン 酸イオンより過剰当量存在する。
別の態様の本発明としては、 核酸の 3 ' または 5 ' 末端にポリエチレ ングリコール鎖が共有結合したコンジユゲートおよび C a 2 +を含んで なる水溶液と、 P 04 3—を含んでなる水溶液を、 リン酸カルシウムと前 記コンジユゲートがナノ粒子を形成しうる条件下で混合する工程を含ん でなる、 有機一無機ハイブリ ッ ド型ナノ粒子の製造方法、 が提供される。 また、 こうして提供されるナノ粒子は、 哺乳類細胞に効率よく取り込 まれるので、 哺乳類細胞へ核酸を送達するための研究用または医療用の ツールとしての用途も提供される。
発明の詳細な記述
本発明にいう、 核酸 （または NuA) は、 1より多くのヌクレオチド が 5 ' → 3 ' の方向に結合した核酸鎖の分子であって、 動物または植物、 特に、 哺乳動物の生命現象に関与し得る分子を意味する。 'このような核 酸鎖には、 一本鎖または二本鎖の RN Aまたは DNAが包含され、 二本 鎖は、 DNA/DNA、 RNA/RNAまたは DNAZRNAであるこ とができる。 ヌクレオチドは、 アデノシン （A) 、 グアノシン （G) 、 ゥリジン （U) 、 シチジン （C) 、 チミジン （T) から選ばれるが、 前 記核酸には、 本発明の目的に悪影響を及ぼさない範囲内で天然に存在す る修飾ヌクレオチドまたは動物または植物、 特に、 哺乳動物細胞で複製 でき、 転写 ·翻訳の可能な非天然型塩基を有するヌクレオチドが含まれ ていてもよい。
生命現象に関与し得る核酸分子は、 欠損することにより何らかの疾患 をもたらす遺伝子であることができる。 また、 特定の細胞内で、 例えば、 RNA干渉 （RNA i ) や標的 D N Aとの結合等を介して究極的には遺 伝子発現を調節し得る分子をいう。 本発明に従えば、 比較的短い （オリ ゴ概念に包含される） ヌクレオチド鎖の、 例えば、 約 400までのヌク レオチドを含んでなる短鎖もしくは小型のオリゴヌクレオチドを有機一 無機ハイプリッド型ナノ粒子内へ効率よく安定に内包せしめ得るので、 それ自体公知の RN Aもしくは DN Aァプタマ一の概念に包含される核 酸分子、 および RN A iに利用できる、 例えば、 s m a l l (または s h o r t) i n t e r f e r i n g RNA ( s i RNA) の概念に包 含される核酸分子に本発明を都合よく適用することができる。
限定されるものではないが、 本発明で好適、 かつ、 効果的に使用でき る核酸分子のサイズは、 二本鎖核酸である場合には、 約 1 6〜約 40 0 のヌクレオチド鎖長であり、 一本鎖核酸である場合には約 4 0〜約 4 0 0のヌクレオチド鎖であることができる。 特に、 本発明で好適に使用で きる核酸分子は、 3， 末端に 2、 3個のヌクレオチドのオーバーハング を有していてもよい、 一本鎖に約 1 9〜 3 0、 好ましくは、 約 1 9〜 2 3のヌクレオチドを有する s i RN A、 および約 5 0〜 1 4 0のヌクレ ォチドを有する RN Aもしくは DNAァプタマ一を挙げることができる。 限定されるものでないが、 s i RNAの具体例は、 遺伝子療法の対象と なり うる遺伝子を参照して設計でき、 このような遺伝子の例としては、 非小細胞肺癌などに関係のある PKC α、 悪性黒色腫などに関係のある B C L— 2、 クローン病に関係のある I CAM— 1、 C型肝炎に関係の ある HCV、 関節リ ウマチもしくは'乾癬に関係のある TNF α、 喘息に 関係のあるアデノシン A I受容体、 卵巣がんなどに関係のある c一 r a f k i n a s e , 滕臓癌などに関係のある H— r a s、 冠動脈疾患に 関係のある c一 m y c、 大腸癌に関係のある PKA R i a、 エイズに 関係のある H I V、 固形癌に関係のある DN Aメチルトランスフェラー ゼ、 癌に関係のある VEGF受容体、 腎臓癌に関係のあるリボヌクレオ チド還元酵素、 CMV性網膜炎に関係のある CMV I E 2、 前立腺癌 に関係のある MMP— 9、 悪性グリォーマに関係のある TGF 2、 多 発性硬化症に関係のある CD 4 9 d、 糖尿病に関係のある P T P— 1 B、 癌に関係のある c—my b、 乳癌などに関係のある E G F R、 癌に関係 のある md r l、 a u t o t a x i nおよび GLUT— 1の遺伝子を挙 げることができる。
核酸 3 ' または 5 ' 末端にポリエチレングリコール鎖の共有結合した コンジユゲートは、 上記の核酸分子とポリエチレングリコールを公知の 連結方法で共有結合して生成できるコンジユゲートであって （例えば、 WO 2006/0 2541 9 , WO 2007/02 1 1 42参照） 、 カルシウムイオン （C a 2+) およびリン酸イオン （P 04 3-) の存在 する水性溶液中で有機—無機ハイプリ ッ ド型ナノ粒子を形成できるいか なるコンジユゲートをも包含する。 このようなコンジユゲートの典型的 なものとしては、 下記一般式 Iで表されるものを挙げることができる ：
A-P EG-L-NuA ( I )
式中、
P EGはポリエチレングリコール鎖を表し、
Aは P EGの末端基または末端部分を表し、
Lは P E Gの A結合末端の別の末端と N u Aの 3 ' または 5， 末端を 共有結合するリンカ一を表し、 そして NuAは、 上述したオリゴもしくはポリ二本鎖 RNA、 オリゴもしく はポリ二本鎖 DNA、 オリゴもしくはポリ一本鎖 RN Aおよびオリゴも しくはポリ一本鎖 DN Aからなる群より選ばれる。
P E Gの分子量は、 本発明の有機—無機ハイプリッ ド型ナノ粒子を形 成できるものであれば限定されないが、 約 6 0 0 0 D a〜約 5 0 0 0 0 D a、 好ましくは約 7 0 0 0 D a〜約 2 5 0 0 0 D a、 より好ましくは 約 l O O O O D a〜約 2 5 0 0 0 D aの範囲内にあるものであること力 S できる。
P E Gの末端基または末端部分である Aは、 水素原子、 — i。の直 鎖もしくは分岐したアルキルもしくはアルケニル基 （例、 メチル、 ェチ ル、 プロピル、 イソプロピル、 へキシルまたはァリル等） 、 ァラルキル 基 （例、 ベンジル、 フ； nネチル等） 、 ヒ ドロキシ基、 C i— i。の直鎖も しくは分岐したアルコキシ基、 アルデヒ ド基 （またはホルミル： 一 CH O) 、 ァセタール化ホルミル基 〔一 CH (OR 1) (OR 2) 、 ここで、 R1および R2は相互に独立して、 C i— 4アルキルである力 、 または一 緒になって — 4アルキレン鎖であることもできる〕 、 アミノ基、 カル ボキシル基、 マレイミ ド基、 保護されたァミノ基おょぴ保護されたカル ポキシル基 （ここで、 保護されたと称する場合の保護基は、 ペプチド合 成で慣用されているアミノ基またはカルボキシル基についての保護基を 意味する。 ） からなる群より選ばれる基もしくは官能基であることがで き、 また、 細胞表面受容体に結合しうる前記官能基を介して結合したリ ガンド （例、 糖、 ペプチド、 等） または抗体等の機能性もしくは結合性 部分であることができる。
リンカ一 Lは、 二本鎖核酸に結合する場合には、 センス鎖またはアン チセンス鎖のいずれか一方の 3， または 5 ' 末端に、 また一本鎖核酸の 場合も、 その 3 ' または 5， 末端のいずれかにリン酸エステル結合等の 当該技術分野で公知のいずれかの結合様式で共有結合し、 P E G鎖の A に対してもう一方の末端に炭素一炭素結合、 エーテル結合、 チォエーテ ル結合、 エステル結合、 チォエステル結合、 アミ ド結合、 ゥレイ ド結合、 尿素結合等を介して、 共有結合する連結基である。 リンカ一 Lは、 上記 のような両端を有する結合以外に、 酸素原子もしくは硫黄原子 1もしく は 2以上の箇所で中断されていてもよい総原子数 3〜 3 0のアルキレン 基を含むことができる。 このようなアルキレン鎖としては、 限定される ものでないが、 例えば、 一CH2CH2CH2—、 一 CH2CH2— O— CH2CH2—、 一 CH2CH2— (O- CH2 CH2) 2—、 — CH2 C H2— S— CH2 CH2—および CH2 CH2— S— (CH2) 6—等を挙 げることができる。 本発明では、 このようなアルキレン鎖中に生理的条 件下で開裂しうる結合、 例えば、 エンドソームにおける低 p H (5. 0 〜6. 0) において開裂しうるエステル結合または還元条件下もしくは 還元剤として作用しうる物質の存在下で開裂し得るジスルフィ ド結合を 含めることが好ましい。 このような結合を含むアルキレン鎖の例として は、 限定されるものでないが、 一 CH2 CH2OCOCH2—、 一 CH2 CH2 S S CH2_、 一 CH2CH2 CH2— COO— CH2—および _C H2CH2OCH2CH2 S S CH2CH2—を挙げることができる。
本発明では、 理論に拘束されるものではないが、 上記の A— P EG— L—核酸コンジュゲートが、 ァニオン荷電性の核酸部分を介して、 カル シゥムイオン （C a 2 +) およびリン酸イオン （P O4 3— ) を特定の比 率で含んでなるリン酸カルシウム （C a P) 粒子のカチオン性表面およ ぴ Zまたは微小粒子内部に画定されまたは取り込まれた無機ハイプリッ ド型のナノ粒子が提供される。 そのため、 該ナノ粒子における、 C a P では、 カルシウムイオンがリン酸イオンより過剰当量存在し、 好ましく は、 C a Pのカルシウムイオン対リン酸イオンのモル比率が、 2 0〜 5 0 0、 好ましくは 3 0〜 3 0 0、 より好ましくは 5 0〜 2 0 0にある。 こうして、 該ナノ粒子では、 C a Pにおける過剰のカルシウムイオンと 前記コンジユゲートの核酸に由来するァニオン荷電性のリン酸部分がィ オン一イオン相互作用をすることにより、 C a P中に該コンジユゲート 中の核酸部分を部分的にかまたは全体的に内包した形態にあるものと推 測される。 後述する当該ナノ粒子の透過型電子顕微鏡写真を参照された い。 該ナノ粒子では、 C a Pとコンジュゲートが、 上述した過剰のカル シゥムイオンにコンジユゲートの各分子内のリン酸部が少なく とも部分 的に相互作用できるような比率で含まれておればよい。 しかし、 限定さ れるものでないが、 核酸におけるリン酸部と過剰のカルシウムイオンが、 モル比で、 0. 0 0 1〜0. 0 5対 1、 好ましくは 0. 0 0 2〜0. 0 1対 1になるように選ばれる。 また、 カルシウムイオンは、 別の多価力 チオン、 例えば、 M g 2 +で部分的に置き換えられていてもよい。
本願発明にいう、 ナノ粒子は、 キュムラント平均粒子径がナノオーダ 一、 限定されるのもでないが、 3 0 nm〜1 0 0 0 nm、 好ましくは、 5 0 η π！〜 3 0 0 n mであるが、 数ミクロンの平均粒径を有する粒子も 包含し得る概念として使用してきる。
このような有機一無機ハイプリッ ド型ナノ粒子は、 前記コンジユゲー トおよび C a 2 +を含んでなる水溶液と、 P O4 3—を含んでなる水溶液 をリン酸カルシウムと前記コンジユゲートがナノ粒子を形成しうる条件 下で混合することにより製造できる。 この水溶液の混合条件は、 核酸に 悪影響を及ぼさない条件下、 例えば、 1 0°C〜5 0°Cで、 1時間〜 4 0 時間混合液を静置すればよい。 混合後の水溶液中のコンジユゲートの濃 度は、 コンジュゲートが溶解できる濃度であればよいが、 通常、 ヌクレ ォチドを基準に 0. 1 mM〜 2 0 mM、 好ましくは、 0. 2 mM〜 5 m Mであり、 カルシウムイオン濃度は、 3 0 m!V！〜 5 0 0 mM、 好ましく は 5 0 mM〜 3 0 0 mMであり、 C a Pを形成するためのリン酸イオン の濃度は、 0. l mM〜2 0 mM、 好ましくは 0. 2 mM〜1 0 m:\^;i 設定できる。 また、 カルシウムイオン以外の多価カチオン、 例えば、 M g 2 +は、 C a 2 +に対して 0. 0 1〜 1当量含めることができる。
こう して、 本発明により提供できる有機一無機ハイプリッ ド型のナノ 粒子は、 生理的条件下で動物または植物細胞、 特に哺乳類細胞と接触さ せることにより、 これらの細胞に効率よく取り込まれ、 こうして取り込 まれた粒子は、 通常、 カルシウムイオン濃度の低い細胞内で徐々に崩壊 して A— P E G— L—核酸コンジユゲートを放出することができる。 ま た、 コンジュゲートのリンカ一中に生理的条件下で開裂し得る結合を有 する場合には、 細胞内でコンジュゲートから核酸を開放し得る。 カルシ ゥムイオンおょぴリン酸イオンは、 本質的に細胞の生理おょぴ核酸の機 能に悪影響を及ぼさないので、 例えば、 細胞内でカチオン性ポリマーが 放出されることが予測される、 WO 2 0 0 6 / 0 2 5 4 1 9または W O 2 0 0 7/0 2 1 1 4 2に記載されている s i RNA— P E Gコン ジユゲートとカチオン性ポリマーのイオンコンプレックスに比べて安全 に使用できる。
このような有機一無機ハイプリッ ド型のナノ粒子は、 製薬学的に許容 される希釈剤または担体との組成物としても提供できる。 希釈剤の例と しては、 脱イオン精製水、 生理的に許容される p H値を有する緩衝液等 を挙げるができ、 担体の例としては、 グルコース、 スクロース， マンニ トール等の糖類または糖アルコールを挙げることができる。
以下、 本発明をより具体的に説明するが、 本発明はこれらの例に限定 されることは意図されていない。
図面の簡単な説明
図 1は、 P E G ( 1 2 k) — S S— s i RNA, P E G ( 1 5 k) - S S - s i RN Aの生成を確認するため、 2 0 %ポリアタリルァミ ドゲ ルを用いた電気泳動により分析を行った結果を表す写真である。 レーン 1 ： P E G ( 1 2 k ) — S S— s i RNA、 レーン 2 ： P E G— （ 1 5 k ) 一 S S— s i RNA, レーン 3 ： s i RN A レーン 4 ： 1 0 mM D T Tで処理した P E G ( 1 2 k) — S S— s i RNA、 レーン 5 ： 1 0 mM DT Tで処理した P E G— ( 1 5 k) — S S— s i RNA 囱 2は、 動的光散乱測定によるリン酸カルシウム粒子 （ 1 ) の粒径測 定の結果を示すグラフ （A) および透過型電子顕微鏡写真 （B) である (写真中のバーのサイズは 1 0 0 n mを表す） である。
図 3は、 本発明のリン酸カルシウム粒子について、 i n v i t r o におけるホタルルシフェラーゼ遺伝子に対する発現抑制活性を評価した 結果を示すグラフである。
図 4は、 本発明のリン酸カルシウム粒子について、 血清存在下におけ る安定性を評価した結果を示すグラフである。
製造例 1 ： P E G ( 1 2 k D a ) - S S - p y 1の合成
Figure imgf000013_0001
α—メ トキシー ω—メルカプト一ポリエチレングリコール （日本油脂、 S UNB R I GHT S Η、 重量平均分子量 M w = 1 2 0 0 0 ) 1 0 0 m gをテトラヒ ドロフラン （TH F) 1 5 m lに溶解させ、 さらに 2， 2， ージピリジルジスルフィ ド （A l d r i c h) 1 8 4 m g及ぴ n― プロピルアミン 1. 7 5 m l を加えた。 反応液を室温で 3時間撹拌した 後、 ジェチルエーテル 5 0 0 m l 中に滴下することにより白色沈殿を得 た。 この沈殿物を減圧ろ過により回収した後、 ベンゼン 3 0 m 1に溶解 させ、 凍結乾燥を行うことにより表題の化合物を得た。
製造例 2 : P E G ( 1 5 k D a ) _ S S— p y lの合成
Figure imgf000013_0002
a—メ トキシーの一メルカプトーポリエチレンダリコール （日本油脂、 S UNB R I GHT S H、 重量平均分子量 M w = 1 5 0 0 0 ) 1 2 5 m gを TH F 1 5 m 1に溶解させ、 さらに 2， 2 ' —ジピリジルジスル フイ ド （A l d r i c h) 1 8 4 m g及び n—プロピルアミン 1. 7 5 m lを加えた。 反応液を室温で 3時間撹拌した後、 ジェチルエーテル 5 0 0 m l中に滴下することにより白色沈殿を得た。 この沈殿物を減圧ろ 過により回収した後、 ベンゼン 3 0 m 1に溶解させ、 凍結乾燥を行うこ とにより表題の化合物を得た。
製造例 3 : P E G ( 5 k D a ) - S S - y 1 の合成
Figure imgf000014_0001
一メルカプト一ポリエチレングリコール （日本油脂、
S UN B R I GHT S H、 重量平均分子量 M w = 5 0 0 0 ) 4 1. 7 m gを TH F 1 5 m lに溶解させ、 さらに 2 , 2 ' —ジピリジルジスル フイ ド （A l d r i c h) 1 8 4 m g及ぴ n—プロピルァミン 1. 7 5 m lを加えた。 反応液を室温で 3時間撹拌した後、 ジェチルエーテル 5 0 0 m l 中に滴下することにより白色沈殿を得た。 この沈殿物を減圧ろ 過により回収した後、 ベンゼン 3 0 m 1に溶解させ、 凍結乾燥を行うこ とにより表題の化合物を得た。
製造例 4 : P E G ( 1 2 k D a ) — S S— s i RN Aの調製
本実施例で用いる S H— s i RNA (ルシフェラーゼ遺伝子をターゲ ッティングする）は、 センス鎖として 5 ' - CUUAC G CUGAGU ACUUC GA d T d T - 3 ' 、 アンチセンス鎖として ： 5 ' — U CG AAGUACU C AG C GUAAG d T d T— 3 ' を用い、 2本鎖を形 成させたものであり、 かつセンス鎖の 5 ' 末端に S H修飾 （C 6 S— S m o d i f i e r、 G l e n R e s e r c h) がなされたもので ある。
S H— s i RNA (0. 1 m o 1 ) を、 0. 0 5 Mジチォスレイ ト ールを含有する 1 0 mM T r i s 13 11 £ £ 6 ( 117. 4) の 1 0 m lに溶解させ、 室温で 6時間置いた後に NA P— 5カラム （G Eへ ルスケアバイオサイエンス） を用いてジチオスレィ トールを除去した。 この S H— s i RNAに対し P E G ( 1 2 k D a ) - S S - p y 1 ( 1 2 m g ) を加え、 室温で 2 4時間反応させた。 反応物は逆相 HP で 分取することにより精製を行った。 逆相 H P L Cにはカラムとして T S K g e 1 O 1 i g o - DNA R P (東ソ一） を用い、 溶離液として 5 %ァセ トニト リル含有 0. 1 M酢酸アンモニゥム溶液 （溶離液 A) お ょぴ 7 0 %ァセ トニ ト リル含有 0. 1 M酢酸アンモユウム溶液 （溶離液 B) を用い、 溶離液 Aから溶離液 Bへのリニアグラジェント （4 0分、 流速毎分 l m l ) により溶出を行った。 検出には UV (検出波長 2 6 0 nm) を用いた。 P E G ( 1 2 k) — S S— s i RN Aを含有するフラ クシヨンは、 遠心エバポレーターにより濃縮した後に NAP— 5カラム によつて処理し、 3 3 μ Μの P E G ( 1 2 k) — S S— s i RN Aを含 有する 1 mM T r i s b u f f e r溶液 （ p H 7. 4 ) を得た。
また、 上記の P E G ( 1 2 k D a ) 一 S S— p y lに代え、 それぞれ、 P E G ( 5 k D a ) — S S— p y lおよび P E G ( 1 5 k D a ) 一 S S - p y lを用いて相当する P E G ( 5 k D a ) 一 S S— s i RNAおよ ぴ P E G ( 1 5 k D a ) 一 S S— s i RN Aを得た。
実施例 1 ： リン酸カルシウム粒子の調製
以下の溶液を調製した。
溶液 A
P E G- S S - s i R N A 3 0 ^ M
C a C 1 2 2 5 0 mM
Mg C 1 2
T r i s h y d r o c h l o r i d e 1 mM
溶液 Aの p H、 P E Gの分子量及び M g C 1 2の濃度については 表 1に示した。
溶液 B ( p H 7. 5 )
N a 2 H P O 4 1. 5 mM
N a C 1 1 4 0 mM H e p e s s o d i um s a l t 5 0 mM
表 1に示した各組成の溶液 A 2 0 0 μ 1に対し、 溶液 Βを 2 0 0 1 混合した後、 2 5 °Cで 2 4時間静置することで、 粒子 （ 1 ) 〜 （ 8 ) 及 ぴ （C— 1 ) の溶液を得た。
実施例 2 ： リン酸カルシウム粒子 （C— 2 ) の調製
以下の溶液を調製した。
溶液 A ：
s i RNA (センス鎖として 5 ' — CUUAC G CUGAGUACUU C GA d T d T - 3 ' 、 アンチセンス鎖として 5 ' -U C GAAGUA CUCAG C GUAAG d T d T- 3 ' を用い、 2本鎖を形成させたも の） 7 0 μ g Zm 1塩化カルシウム 2 5 0 mM
以上の組成の溶液を、 1 mM T r i s b u f f e r ( p H 7. 6 ) を用いて調製した。
溶液 B ：
リン酸一水素ニナトリウム 1. 5 mM
N a C 1 1 4 0 mM
P E G—ポリ （ァスパラギン酸） （P E G分子量 1 2 0 0 0、 ポリア スパラギン酸の重合度 2 4 ) 3 0 0 g /m 1
以上の組成の溶液を、 5 0 mM HE P E S b u f f e r ( p H 7. 6 ) を用いて調製した。
溶液 A 2 0 0 1 と溶液 Β 2 0 0 /1 1 を混合し、 2 5 °Cで 2 4時間静 置することで、 粒子 （C一 2 ) の溶液を得た。 表 1
Figure imgf000017_0001
実施例 3 : P E G— S S— s i R N Aの調製の確認
P EG— S S— s i RN Aの生成を確認するため、 2 0 %アクリルァ ミ ドゲルを用いた電気泳動により分析を行った。 泳動後のゲルは S YB R G r e e n I I . RNA g e l s t a i n ( I n v i t r o g e n) により染色した。 結果を図 1に示す。 s i RNA (レーン 3) にく らべ、 P EG— S S— s i RNA (レーン 1及び 2 ) では泳動度が 小さくなり、 P E Gの付加により高分子量化が起きたことを確認できた。 また、 S S結合の還元環境応答性を確認するため P E G— S S— s i R NAに 1 0 mMジチォスレイ トールを加え、 3 Ί °Cで 2時間置いた後の サンプルについても分析を行ったところ、 元の s i RNAと同じ位置に パンドが現れ （レーン 4及ぴ 5) 、 P E Gの切断が確認できた。
実施例 4 ： リン酸カルシウム粒子に含有された s i RNA濃度の評価 各リン酸カルシウム粒子溶液 4 0 0 μ 1 を Am i c o n U l t r a 一 4 1 0 k (M i 1 1 i p o r e ) を用いて 2 5 0 0 X gで 1 0分間 遠心ろ過し、 ろ液の 2 6 0 nmにおける吸光度を ND— 1 0 0 0 (N a n o d r o p T e c h n o l o g i e s ) により測定した。 リン酸カ ルシゥム粒子に含有された s i RNAの濃度は、 粒子の調製時に添加し た s i RNAの濃度と、 ろ液中の s i RNAの濃度の差から算出した。 その結果、 粒子 （ 1 ) において粒子に含有された s i RNAの量は 6 であり、 良好な結果であった。 これに対し、 粒子 （C一 2 ) にお いて粒子に含有された s i RNAの量は 8. l z gと低い値であった。 実施例 5 ： 粒子径と粒子径分布の測定
粒子 （1 ) 〜 （8 ) 、 (C - 1 ) 及ぴ （C— 2 ) について、 キュムラ ント平均粒径及び分散度 （P D I ) の測定を Z e t a s i z e r N a n o Z S (M a 1 v e r n I n s t r u m e n t s ) 用いて打つ た。 結果を表 1に示す。 粒子 （1 ) から （8 ) 及ぴ粒子 （C一 2 ) のリ ン酸カルシウム粒子については分散度の狭い単分散な粒子が生成された。 これに対し、 粒子 （C _ l ) のでは粒子径 1 μ m以上の沈殿が生成され た。 この粒子においては、 P E Gの分子量が 5 0 0 0と小さいため P E Gによる凝集防止効果が弱く、 沈殿が生成したと考えられる。 実施例 1 のサンプル （ 1 ) の粒子溶液について、 粒子径分布のヒス トグラムを図 2 (A) に、 そして透過型電子顕微鏡で撮影した顕微鏡写真 （バーの寸 法： 1 0 0 n m) 図 2 (B) に示した。
実施例 6 ： i n V i t r o活性の評価
本発明の s i RNA内包粒子について、 i n y i r oにおけるホ タルルシフェラーゼ遺伝子に対する発現抑制活性を評価した。
2 4穴ポリスチレン製細胞培養プレート （B D F a l c o n) に、 ヒ ト肝癌由来細胞株 （H u h 7 c e l l ) を l x l O 4 c e l l / w e l l 播種し 2 4時間培養した後、 ホタルルシフェラーゼベクター p G L 3— c o n t r o l (0. 3 6 g / w e 1 1 , P r o m e g a ) とゥミシィタケルシフェラーゼベクター p R L— CMV ( 0. 0 4 μ g, /-w e 1 1 , P r o m e g a ) の各レポーター遺伝子を、 L i p o f e e t AM I N E 2 0 0 0 ( 1 / l /w e l l , I n v i t r o g e n) を用い、 製品の添付書に従って細胞に導入した。 4時間インキ ュペートした後に培地を交換し、 各粒子の溶液を加えた後 4 8時間細胞 と接触させた。 培地中での s i RN Aの最終濃度は Ι Ο Ο ηΜとなるよ うに各粒子を添加した。 4 8時間培養後に細胞を回収し、 両レポーター 遺伝子の発現量を D u a 1 L u c i f e r a s e R e p o r t e r A s s a y S y s t e m (P r o m e g a ) により測定した。 ゥミ シィタケルシフエラーゼ発現量に対するホタルルシフエラーゼ発現量の 相対値 （p G L 3 / p R L) により抑制活性を評価した （N= 3 ) 。 結 果を図 3に示す。
図 3のグラフから、 本発明の s i RNA内包粒子は、 効率よく癌細胞 に取り込まれ、 該細胞における標的遺伝子の発現を有意に抑制すること が分る。
実施例 7 ： 血清中での安定性評価
粒子 （ 1 ) の溶液 1 0 0 1に対し、 1 0 %牛胎児血清 （ I C N B i o m e d i c a l s ) 有す D u l b e c c o s m o d i f i e d E a g l e s m e d i u m 、 S i g m a A l d r i c h) 1 0 0 t 1を加え、 混合した。 この溶液を 3 7°Cの恒温槽中に静置 し、 一定時間毎に、 前記溶液中の粒子の 3 7でにおけるキュムラント平 均粒径を Z e t a s i z e r N a n o Z S (M a l v e r n I n s t r u m e n t s ) を用いて測定した。 その結果を図 4に示す。 1 1 時間後まで平均粒径に大きな変化は見られず、 この粒子は血清存在下で も安定であることが示された。
実施例 8 ： C y 3—標識 s i RNAを含有する C a Pナノ粒子のゾ 2
V 1 o評価
この評価実験では、 P E G ( 1 2 k ) 一 S S— s i RNAであって、 製造例 4に記載された方法に従って調製された C a Pナノ粒子が使用さ れた。 ここで、 s i RNAは、 そのアンチセンス鎖が C y 3標識された ものである （ 5， - C y 3 -UC GAAGUACUCAG C GUAAG d T d T- 3 ' ) 。 マウス （b a l bZn u d e , n = 3 ) にナノ粒子 （1 0 μ g /m o u s e ) を静脈内注入し， 7. 5分後に血液を採取し、 血漿を回収した。 血漿中の C y 3の発光を測定した値を検量線と比較した。 試験した 2匹 の動物について血中に残存する C y 3— s i RNAの量は、 それぞれ約 2 8 %および 3 7 %であった。 なお， フリーの s i RN Aをマウスに静 脈投与すると， 7. 5分後には s i RNAは殆ど血中から消失し， 残存 率は 0 %になることが知られている。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 核酸の 3， または 5， 末端にポリエチレングリコールの共有結 合したコンジュゲートと、 カルシウムイオン （C a 2 + ) およびリン酸 イオン （P O4 3一） とを含んでなる有機一無機ハイブリッド型のナノ粒 子。
2. コンジュゲー トが、 一般式 I
A— P E G- L-NuA ( I )
式中、
P E Gはポリエチレングリ コール鎖を表し、
Aは P E Gの末端基または末端部分を表し、
Lは P E Gの A結合末端の別の末端と N u Aの 3 ' または 5 ' 末端を 共有結合するリンカ一を表し、 そして
NuAは、 オリゴもしくはポリ二本鎖 RNA、 オリゴもしくはポリ二 本鎖 DNA、 オリゴもしくはポリ一本鎖 RNAおよびオリゴもしくはポ リー本鎖 DNAからなる群より選ばれ、 かつ、
カルシウムイオンがリン酸イオンより過剰当量存在する、
請求項 1記載のナノ粒子。
3. コンジユゲートにおける P EGが分子量 7 0 0 0 D a〜2 5 0 O O D aの範囲内にあり、 N u Aが約 1 6〜約 4 0 0のヌクレオチド鎖 長の二本鎖または約 4 0〜約 4 0 0のヌク レオチド鎖を含んでなる RN Aまたは DN Aであり、 リンカ一中に生体内で開裂しうる結合が含まれ ており、 かつ
カルシウムイオン対リン酸イオンのモル比率が、 5 0〜 2 0 0にあり、 そして
NuAにおけるリン酸イオンの少なく とも一部と過剰のカルシウムィォ ンが、 イオン結合した状態にある、 請求項 2記載のナノ粒子。
4. 生体内で開裂しうる結合がジスルフイ ド結合 （一 S S— ) また はエステル結合 （一 oco—） もしくは （_COO— ) である請求項 3 記載のナノ粒子。
5. NuAが s i RNAおよび DNAもしくは RNAァプタマ一か らなる群より選ばれる請求項 1に記載のナノ粒子。
6. Nu Aが s i RNAである請求項 2に記載のナノ粒子。
7. NuAが s i RNAである請求項 3に記載のナノ粒子。
8. NuAが s i RNAである請求項 4に記載のナノ粒子。
9. M g 2 +がさらに含まれている請求項 1に記載のナノ粒子。
1 0. Mg 2 +がさらに含まれている請求項 2に記載のナノ粒子。
1 1. 核酸の 3 ' または 5 ' 末端にポリエチレングリコールが共有 結合したコンジュゲートおょぴ C a 2 +を含んでなる水溶液と、 P O 4 3 —を含んでなる水溶液を、 リン酸カルシウムと前記コンジユゲートがナ ノ粒子を形成しうる条件下で混合することを含んでなる、 有機一無機ハ イブリッ ド型のナノ粒子の製造方法。
1 2. コンジユゲートが一般式 I
A—P EG— L— NuA ( I )
式中、
P EGはポリエチレングリコ一 鎖を表し、
Aは P E G末端基または末端部分を表し、
Lは P E Gの A結合末端の別の末端と核酸の 3 または 5 ' 末端を共有 結合するリンカ を表し、 そして
NuAは、 オリゴもしくはポリ二本鎖 RNA、 オリゴもしくはポリ二本 鎖 DNA、 オリゴもしくはポリ一本鎖 RN Aおよびオリゴもしくはポリ 一本鎖 DNAからなる群より選ばれ、 かつ、 C a 2 +を含んでなる水溶 液が C a C 1 2を用いて調製され、 P 04 3—を含んでなる水溶液が N a 2HP04を用いて調製される請求項 1 1に記載の製造方法。
1 3. 有効成分としての、 核酸の 3 ' または 5， 末端にポリェチレ ングリ コールの共有結合したコンジュゲートと、 カルシウムイオン （C a 2+) およびリン酸イオン （P 04 3一） とを含んでなる有機一無機ハ イブリ ツ ド型のナノ粒子請求項 1に記載のナノ粒子おょぴ製薬学的に許 容される希釈剤または担体を含んでなる、 該ナノ粒子に含有されている 核酸を導入することが望まれる哺乳類の細胞内に該核酸を送達するため の組成物。
1 4. ナノ粒子における、 コンジュゲートが、 一般式 I
A— P EG-L-Nu A ( I )
式中、
P E Gはポリエチレングリコール鎖を表し、
Aは P E Gの末端基または末端部分を表し、
Lは P E Gの A結合末端の別の末端と核酸の 3 ' または 5， 末端を共 有結合するリンカ一を表し、 そして
NuAは、 オリゴもしくはポリ二本鎖 RNA、 オリゴもしくはポリ二 本鎖 DNA、 オリゴもしくはポリ一本鎖 RN Aおよびオリゴもしくはポ リー本鎖 DNAからなる群より選ばれ、 かつ、
カルシウムイオンがリン酸イオンより過剰当量存在する、 請求項 1 3記 載の組成物。
1 5. 核酸が s i RN Aである請求項 1 3記載の組成物。
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