WO2009056205A1

WO2009056205A1 - Konfiguration eines laser-scanning-mikroskops für eine rasterbildkorrelationsspektroskopiemessung sowie verfahren zur durchführung und auswertung einer solchen messung

Info

Publication number: WO2009056205A1
Application number: PCT/EP2008/008271
Authority: WO
Inventors: Stephan Wagner-Conrad; Frank Hecht; Klaus Weisshart; Ralf Netz
Original assignee: Carl Zeiss Microimaging Gmbh
Priority date: 2007-10-30
Filing date: 2008-09-30
Publication date: 2009-05-07
Also published as: US20100225910A1; DE102007052551A1; DE102007052551B4; US8120771B2

Abstract

1.1. Verfahren zur Konfiguration eines Laser-Scanning-Mikroskops für eine Rasterbildkorrelationsspektroskopiemessung sowie Verfahren zur Durchführung und Auswertung einer solchen Messung 2.1. Die manuelle Einstellung der Abtastparameter für eine Rasterbildkorrelationsspektroskopiemessung (RICS) ist aufwendig, weil die Auswirkungen einer Einstellung eines bestimmten Parameters durch die komplexe Wechselwirkung zwischen den verschiedenen Parametern nicht offensichtlich sind und auch von den physikalisch-technischen Eigenschaften des Mikroskops abhängen. Mit einem verbesserten Konfigurationsverfahren sollen mathematische Transportmodelle mit geringem Fehler an mittels abtastender Fluoreszenzspektroskopie ermittelte Korrelationen angepasst werden können. Mit verbesserten Verfahren zum Durchführen oder zum Auswerten einer RICS-Messung soll die zu speichernde Datenmenge reduziert beziehungsweise sollen RICS-Korrelationen mit hoher statistischer Qualität in kurzer Zeit ermittelt werden können. 2.2. Erfindungsgemäß wird für eine Rasterbildkorrelationsspektroskopiemessung ein Bestwert für einen Abtastparameter ermittelt und für einen späteren Abtastvorgang an einer Probe vorgegeben. Zum Durchführen oder Auswerten einer RICS-Messung werden ausschließlich in einem Probenbereich, innerhalb dessen sich eine Pixelzeit (ΔP) längs einer harmonisch angesteuerten Abtastachse (X) um weniger als oder höchstens um einen vorgegebenen oder vorgebbaren Wert ändert, Abtastwerte aufgenommen beziehungsweise eine Korrelation ermittelt. 2.3. Die Erfindung wird vorzugsweise bei Laser-Scanning-Mikroskopen verwendet.

Description

Konfiguration eines Laser-Scanning-Mikroskops für eine

Rasterbildkorrelationsspektroskopiemessung sowie Verfahren zur Durchführung und Auswertung einer solchen Messung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Konfiguration eines Laser-Scanning-Mikroskops für eine Rasterbildkorrelationsspektroskopiemessung sowie Verfahren zum Durchführen einer Rasterbildkorrelationsspektroskopiemessung und zum Auswerten von Abtastwerten einer Rasterbildkorrelationsspektroskopiemessung. Darüber hinaus betrifft die Erfindung eine entsprechend eingerichtete Steuereinheit, ein entsprechend eingerichtetes Laser-Scanning- Mikroskop und ein entsprechend eingerichtetes Computerprogramm.

Zur Untersuchung von veränderlichen Stofϊkonzentrationen im mikroskopischen Größenbereich, hervorgerufen durch Diffusions- und andere Transportprozesse in einer Probe, kann die sogenannte Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) verwendet werden. Damit können physikalische und biologische Transportprozesse in einem einzelnen beziehungsweise durch ein einzelnes Volumen mit einem Durchmesser von etwa 200 nm beobachtet werden. Um Aussagen über die Transportvorgänge in der Probe machen zu können, werden Korrelationen der Fluoreszenzmessdaten ermittelt und mathematische Transportmodelle an diese Korrelationen angepasst, beispielsweise mittels Ausgleichsrechnungen. So können aus den angepassten Modellen beispielsweise Difϊusionskonstanten bestimmt werden. Die Transportmodelle sind typischerweise mathematische Funktionen, deren Parameter angepasst werden.

Eine räumliche Auflösung von mikroskopischen Transportvorgängen wird durch die abtastende Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (S-FCS), auch als

Bildkorrelationsspektroskopie (ICS) bezeichnet, erreicht. Hierbei können zeitliche Größenordnungen von Sekunden bis Minuten verfolgt werden. Die zwei- oder dreidimensional ortsaufgelöste Verfolgung innerhalb einer Zelle oder zwischen durch Membranen getrennten Zellen im Zeitbereich zwischen Mikro- und Millisekunden wird durch die Rasterbildkorrelationsspektroskopie (RICS) ermöglicht. Hier wird die Probe in zwei oder drei Dimensionen rasterförmig optisch abgetastet („Scanning"). Für die abtastende Korrelationsspektroskopie wird zweckmäßigerweise ein Laser-Scanning-Mikroskop eingesetzt. Während der optischen Abtastbewegung einer RICS-Messung werden mit typischerweise konstanter Abtastwertaufhahmefrequenz („Sampling-Frequenz") digitale Abtastwerte („Sampling-Werte", „Samples") längs einer ersten Abtastrichtung („Scan-Zeile") elektronisch aufgenommen und zu Pixelwerten weiterverarbeitet. Jeder Pixelwert wird dabei aus einem oder mehreren Abtastwerten ermittelt. Als Pixelzeit wird dabei ein Intervall, innerhalb dessen eine Anzahl von Abtastwerten einem bestimmten Pixel zugeordnet wird, oder die Periode beziehungsweise Frequenz solcher Intervalle bezeichnet. Die Abtastung längs der ersten Abtastrichtung wird nach Versetzung des Abtaststrahls längs einer zweiten Abtastrichtung („Scan-Spalte") wiederholt durchgeführt, so dass eine Folge von Pixelzeilen aufgenommen wird. Intervalle beziehungsweise Perioden von aufeinanderfolgenden Pixelzeilen werden als Linienzeit bezeichnet. Im Falle einer zeitlich nichtlinearen Abtastbewegung längs der ersten Abtastrichtung und konstanter Abtastwertaufnahmefrequenz wird für eine verzerrungsfreie Aufnahme mit konstanter Ortsschrittweite die Zeitschrittweite in Form der Pixelzeit variiert.

Die Fehler der Anpassung der mathematischen Transportmodelle an die anhand der Abtastoder Pixelwerte ermittelten Korrelationen hängen unmittelbar von der Eignung der Abtastwerte beziehungsweise der daraus abgeleiteten Pixelwerte für eine solche Auswertung ab. Die Eignung der Abtast- beziehungsweise Pixelwerte wiederum hängt in komplexer Weise von der Größe des zu untersuchenden Probenbereichs, der Dichte der Fluoreszenzmarker in der Probe, Verunreinigungen des Probenträgers mit Fluoreszenzmarkern, den Abtastfrequenzen und -geschwindigkeiten, den optischen Eigenschaften des Mikroskops, der Art der Abtastungsbewegung, der Beleuchtungsstärke und der Empfindlichkeit der Detektoren ab. Der Begriff der Eignung schließt statistische und systematische Fehlerquellen ein.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, Verfahren und Vorrichtungen der eingangs genannten Art anzugeben, mit deren Hilfe mathematische Transportmodelle mit geringem Fehler an mittels abtastender Fluoreszenzspektroskopie ermittelte Korrelationen angepasst werden können.

Die Aufgabe wird gelöst durch Verfahren, welche die in den Ansprüchen 1 , 16 und 20 angegebenen Merkmale aufweist, sowie durch Anordnungen, welche die in den Ansprüchen 24, 25 und 26 angegebenen Merkmale aufweist. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.

Erfindungsgemäß ist für ein Verfahren zur Konfiguration eines Laser-Scanning-Mikroskops für eine Rasterbildkorrelationsspektroskopiemessung vorgesehen, dass ein Bestwert für einen Abtastparameter ermittelt und für einen späteren Abtastvorgang an einer Probe vorgegeben wird. Insbesondere können Bestwerte für mehrere Abtastparameter ermittelt und vorgegeben werden.

Im Sinne der Erfindung sind Abtastparameter („Scan-Parameter") alle diejenigen bei einer RICS-Messung am Laser-Scanning-Mikroskop einstellbaren Größen, die die Abtastbewegung („Scan-Bewegung") einer Abtasteinrichtung, auch als Scan-Einrichtung oder als Scanner bezeichnet, relativ zur Probe oder die elektronische Aufnahme des von der Probe reflektierten oder emittierten Lichts beeinflussen.

Ein Bestwert ist im Sinne der Erfindung ein einzelner Wert oder auch ein Wertebereich, in dem eine Auswertung einer RICS-Messung mit geringstem Fehler beziehungsweise innerhalb eines Intervalls um den geringsten Fehler möglich ist. Die Auswertung kann beispielsweise das Ermitteln von Pixelwerten aus Abtastwerten sowie von Auto- und Kreuzkorrelationen und die anschließende Anpassung mittels Ausgleichsrechnung umfassen. Vor der Auswertung können die Abtastwerte oder die Pixelwerte in geeigneter Weise modifiziert werden, beispielsweise durch Filterung. Falls mehrere lokale Fehlerminima vorliegen, kann der Bestwert aus mehreren Einzelwerten oder Wertebereichen bestehen. Die Vorgabe kann dann beispielsweise in Form einer Auswahlliste erfolgen.

Nachfolgend kann stets anstelle eines Abtastwerts ein aus einem oder mehreren Abtastwerten abgeleiteter Pixelwert eingesetzt werden.

Die manuelle Einstellung der Abtastparameter für eine RICS-Messung ist aufwendig, weil die Auswirkungen einer Einstellung eines bestimmten Parameters durch die komplexe Wechselwirkung zwischen den verschiedenen Parametern nicht offensichtlich sind und auch von den physikalisch-technischen Eigenschaften des Mikroskops abhängen. Insbesondere deshalb kann die zu erwartende Eignung einer Messung für eine einzelne Kombination von Einstellungen aller Parameter nur grob vorhergesagt werden. Durch die erfindungsgemäße automatische Ermittlung eines Bestwerts für einen oder vorzugsweise mehrere solcher Parameter kann die Vorbereitung und Konfiguration einer RICS-Messung erheblich erleichtert und beschleunigt werden. Dabei können insbesondere die physikalisch-technischen Eigenschaften und Einstellungen des Mikroskops mit hoher Genauigkeit berücksichtigt werden. Dadurch können mathematische Transportmodelle mit geringem Fehler an aus den Abtastwerten ermittelte Korrelationen angepasst werden.

Vorzugsweise werden als Abtastparameter eine oder mehrere der folgenden Größen verwendet: räumliche Schrittweite, Abtastgeschwindigkeit, Pixelzeit, Linienzeit, Abtastwertaufnahmefrequenz. Unter Abtastgeschwindigkeit („Scan-Geschwindigkeit") wird dabei die räumliche Geschwindigkeit verstanden, mit welcher sich der abtastende Punkt beziehungsweise - bei Verwendung von Beleuchtungs- und Detektionsspaltblenden anstelle von Lochblenden - die abtastende Linie („Linien-Scanning") über die Probe bewegen. Die genannten Größen wechselwirken miteinander, so dass eine manuelle Konfiguration besonders viel Wissen über die Funktionsweise des Mikroskops und des Abtastvorgangs erfordert und somit aufwendig ist. Insbesondere wird durch die Verwendung und Optimierung dieser Abtastparametern eine konstante Abtastamplitude („Scan-Amplitude") ermöglicht. Zu diesem Zweck werden beispielsweise erfindungsgemäß die Pixel- und Linienzeiten ausschließlich über die Abtastgeschwindigkeit eingestellt, insbesondere unter Berücksichtigung der Abtastwertaufhahmefrequenz.

In einer vorteilhaften Ausführungsform wird der Bestwert der räumlichen Schrittweite anhand einer Breite einer Punktübertragungsfunktion des Laser-Scanning-Mikroskops so ermittelt, dass die räumliche Schrittweite signifikant kleiner ist als die Breite der Punktübertragungsfunktion (PSF). Dies stellt eine optische Überabtastung (engl. Oversampling) dar. Auf diese Weise kann die Dämpfung der RICS-Korrelationen gering gehalten werden, was gleichbedeutend mit einer hohen statistischen Qualität und damit einem geringen Fehler nachfolgender Funktionsanpassungen ist. Beispielweise ergibt sich die Korrelation für den Fall freier Diffusion in drei Raumdimensionen als

Darin sind ξ,ψ Pixelkoordinaten, «frdie räumliche Schrittweite beim Abtasten, τ_P die Pixelzeit, τ_L die Linienzeit, D die Difϊusionskonstante, ß^ und ω_z die Breite der PSF in lateraler beziehungsweise axialer Richtung, N die Anzahl der fluoreszierenden Partikel im konfokalen Volumen und γ ein Formfaktor, der die Form des konfokalen Volumens berücksichtigt. Wird die räumliche Schrittweite ά klein gegenüber der lateralen Breite W₀ der

PSF eingestellt, so bleibt der Exponentialfaktor („Scanning-Term") stets in der Größenordnung um 1 , wodurch eine hohe Eignung der Abtastwerte für die Auswertung ermöglicht wird.

Zweckmäßigerweise wird der Bestwert der räumlichen Schrittweite anhand mindestens eines Objektivparameters und einer beim späteren Abtasten zu verwendenden Lichtwellenlänge ermittelt. Dadurch kann eine hohe Genauigkeit der RICS-Auswertung erreicht werden.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird der Bestwert ermittelt, indem mehrere Versuchsabtastungen der später abzutastenden Probe mit jeweils unterschiedlichem Versuchswert für den Abtastparameter durchgeführt werden. Diese Vorgehensweise kann ähnlich einer Versuch-Irrtum-Strategie mit geringem Aufwand durchgeführt werden.

Dabei kann der Bestwert durch Suchen des Minimums des insbesondere statistischen Fehlers einer Zielgröße ermittelt werden, insbesondere indem aus den Abtastwerten der Versuchsabtastungen ein Minimum eines Fehlers einer eine Dynamik eines Probenvorgangs charakterisierenden Größe ermittelt wird. Vorzugsweise wird zum Ermitteln der Zielgröße und ihres Fehlers für jede Versuchsabtastung eine Korrelation ermittelt und eine Modellfunktion daran angepasst. Die Zielgröße kann dabei ein fehlerbehafteter Parameter der Modellfunktion oder zumindest aus solchen Parametern abgeleitet sein.

Vorzugsweise wird als eine die Dynamik charakterisierende Größe eine Diffusionskonstante verwendet. Alternativ oder zusätzlich kann der Bestwert bestimmt werden, indem aus den Abtastwerten der Versuchsabtastungen ein Maximum einer Breite einer Korrelation einer Versuchsabtastung ermittelt wird. Diese kann ebenfalls mit geringem Aufwand als Maß für die statistische Qualität der Korrelation verwendet werden.

Vorteilhafterweise wird in den Versuchsabtastungen die Probe bidirektional mit in Hin- und Rückrichtung unterschiedlichem Versuchswert des zu optimierenden Abtastparameters abgetastet. So kann die Anzahl von Versuchsabtastungen reduziert werden. Die Konfiguration kann dadurch schneller erfolgen. Besonders vorteilhaft sind Ausgestaltungen, in denen die Abtastung in Hin- und Rückrichtung innerhalb derselben Abtastzeile erfolgt. Auf diese Weise können in einer Abtastzeile Abtastwerte mit zwei verschiedenen Pixelzeiten bei derselben Linienzeit aufgenommen werden, ohne die Anzahl der Zeilen pro Richtung zu reduzieren. Mit nur einmaligem Abtasten des abzutastenden Probenbereichs können so bereits drei Zeitparameter geprüft werden. Dies senkt nicht nur die Beleuchtungsdauer der Probe, sondern ermöglicht auch die Konfiguration mit hoher Geschwindigkeit und hoher Genauigkeit. Eine solche Ausgestaltung des Verfahrens kann auch bei linienförmiger Beleuchtung und Abtastung mittels Schlitzblenden eingesetzt werden. Bei dieser Art der Aufnahme werden mehrere in derselben Scan-Spalte liegende Pixel gleichzeitig aufgenommen. Die Pixelzeit hat hierbei für alle Pixel der Scan-Spalte denselben Wert. Durch eine bidirektionale Abtastung längs einer Scan-Zeile können also zwei Pixelzeiten in einer Versuchsabtastung geprüft werden.

Vorzugsweise werden zur Ermittlung des Bestwerts eine Simulation eines Transportvorgangs in der Probe und/oder eine virtuelle Versuchsabtastung durchgeführt. Die virtuellen Versuchsabtastungen können beispielsweise anhand einer Modellierung der zu untersuchenden Probe und daraus resultierender Abtastwerte oder durch Veränderung real gemessener Abtastwerte durchgeführt werden, um eine Beschädigung der Probe durch zu häufige oder zu lange Belichtung zu vermeiden. Insbesondere können Korrelationsdaten ausschließlich rechnerisch durch Simulation anhand eines Modells ermittelt werden, beispielsweise eines Modells dynamischer Partikelwechselwirkungen. So kann die Belichtung der Probe auf den eigentlichen Messvorgang unter Verwendung des zuvor virtuell ermittelten Bestwerts beschränkt werden.

In einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung werden die Probe real elektronisch überabgetastet und mindestens eine virtuelle Versuchsabtastung basierend auf der Überabtastung durchgeführt, indem die Anzahl der dabei aufgenommenen Abtastwerte für die virtuelle Versuchsabtastung nachträglich rechnerisch variiert wird. Dies stellt eine schnelle Möglichkeit dar, um die Abtastparameter Pixelzeit und Linienzeit mit verschiedenen Werten versuchshalber zu ermitteln und den Wert mit der besten Eignung zu bestimmen, ohne eine reale Abtastung mit diesen Pixel- und/oder Linienzeiten durchführen zu müssen. Insbesondere können so verschiedene Werte des Abtastparameters „räumliche Schrittweite" versuchshalber eingestellt werden. Zur Variation der Anzahl der Abtastwerte können vorteilhafterweise mehrere der Abtastwerte zusammengefasst oder ausgelassen werden. Dies kann mit hoher Geschwindigkeit und hoher Genauigkeit durchgeführt werden.

In einer vorteilhaften Ausführungsform wird der abzutastende Probenbereich anhand von geometrischen Vorgaben eines Benutzers ermittelt. Der abzutastende Probenbereich kann dabei aus einem oder mehreren, jeweils in sich zusammenhängenden Gebieten bestehen beziehungsweise es werden mehrere separate Probenbereiche parallel behandelt. Für jedes Gebiet beziehungsweise jeden Probenbereich ergeben sich dann eigene Bestwerte für den oder die Abtastparameter. Die geometrischen Vorgaben werden vorzugsweise anhand eines Übersichtsbildes der Probe grafisch durch Auswahl von interessierenden Bereichen der Probe (ROI) gemacht. Sowohl bei der Konfiguration als auch bei der RICS-Messung werden dann vorzugsweise ausschließlich die vorgegebenen Gebiete/Bereiche abgetastet. Die RICS- Auswertung erfolgt durch Korrelationsanalyse, vorzugsweise einschließlich Kreuzkorrelation und ebenfalls vorzugsweise ausschließlich in den interessierenden Bereichen.

In solchen Ausführungsformen wird der Bestwert vorzugsweise ausschließlich für den und ausschließlich anhand von Abtastwerten beziehungsweise abgeleiteten Pixelwerten aus dem abzutastenden Probenbereich ermittelt. Dies reduziert die Dauer des Konfigurationsvorgangs.

In besonderen Ausgestaltungen der Erfindung wird der Bestwert als Vorschlag ausgegeben und vor einem späteren Abtastvorgang eine Bestätigung eines Benutzers für den optimierten Wert ermittelt. Durch solches Vorschlagen des Bestwerts beziehungsweise eines Bereichs für den Abtastparameters hat der Benutzer die Möglichkeit, den Bestwert vor der eigentlichen Messung zu überprüfen und zu modifizieren. Zweckmäßigerweise bietet die Benutzerschnittstelle die Möglichkeit, den vorgeschlagenen Bestwert durch eine Bedienungshandlung für den späteren Abtastvorgang festzulegen beziehungsweise aus dem vorgeschlagenen Bereich auszuwählen.

Erfindungsgemäß ist für ein Verfahren zum Auswerten von Abtastwerten einer Rasterbildkorrelationsspektroskopiemessung einer Probe vorteilhafterweise vorgesehen, dass eine Korrelation ausschließlich in einem Probenbereich ermittelt wird, innerhalb dessen sich eine Pixelzeit längs einer harmonisch angesteuerten Abtastachse um weniger als oder höchstens um einen vorgegebenen oder vorgebbaren Wert, insbesondere um 10 %, ändert. So können RICS-Korrelationen mit hoher statistischer Qualität in kurzer Zeit ermittelt werden. Entsprechend ist für ein spezielles Verfahren zum Durchfuhren einer Rasterbildkorrelationsspektroskopiemessung an einer Probe vorgesehen, dass Abtastwerte ausschließlich in einem Probenbereich aufgenommen werden, innerhalb dessen sich eine Pixelzeit längs einer harmonisch angesteuerten Abtastachse um weniger als oder höchstens um einen vorgegebenen oder vorgebbaren Wert, insbesondere um 10 %, ändert. So kann die zu speichernde Datenmenge reduziert werden. Abtastwerte außerhalb des Bereichs mit nahezu konstanter Pixelzeit, also Abtastwerte, deren zugeordnete Pixel eine um mehr als 10% schwankende Pixelzeit aufweisen, werden nicht gespeichert.

In einer besonderen Ausführungsform können für eine hohe Eignung des Abtastparameters Abtastwerte ausschließlich in mehreren Abtastbereichen ermittelt werden, innerhalb derer sich die Pixelzeit längs der harmonisch angesteuerten Abtastachse jeweils um weniger als oder höchstens um einen vorgegebenen oder vorgebbaren Wert ändert. Entsprechend ist für ein Verfahren zum Auswerten von Abtastwerten einer

Rasterbildkorrelationsspektroskopiemessung einer Probe vorteilhafterweise vorgesehen, dass separate Korrelationen in mehreren Abtastbereichen ermittelt werden, innerhalb derer sich die Pixelzeit längs der harmonisch angesteuerten Abtastachse jeweils um weniger als oder höchstens um einen vorgegebenen oder vorgebbaren Wert ändert. Dabei können die Höchstwerte für die Abweichungen in den verschiedenen Abtastbereichen unterscheiden oder einheitlich sein, beispielsweise nicht mehr als 10 % in jedem Bereich. Die Gesamtkorrelation G ergibt sich dann als Superposition der Einzelkorrelationen G₁ der einzelnen Abtastbereiche beispielsweise zu:

Darin sind ξ, ψ Pixelkoordinaten, <5r die räumliche Schrittweite beim Abtasten, τ_P die Pixelzeit, τ_L die Linienzeit, D die Diffusionskonstante,

ω_z die Breite der PSF in lateraler beziehungsweise axialer Richtung und N₁ die Anzahl der jeweils im konfokalen Volumen enthaltenen Fluoreszenzpartikel. Erfindungsgemäß kann für eine gute statistische Qualität der Korrelationen die Probe vorzugsweise optisch und/oder elektronisch überabgetastet werden.

Vorteilhafterweise werden die Abtastwerte mittels eines Laser-Scanning-Mikroskops aufgenommen. Zweckmäßigerweise wird aus Abtastwerten einer Rasterbildkorrelationsspektroskopiemessung mittels einer Steuereinheit eines Laser- Scanning-Mikroskops eine Korrelation ermittelt.

Dabei kann vorzugweise für die Ermittlung der Korrelation die Anzahl der Abtastwerte durch Zusammenfassen oder Auslassen verändert werden, um unterschiedliche Abtastparameter zu simulieren. Damit kann der Abtastparameter nach der eigentlichen Datenerfassung unter Betrachtung der resultierenden Eignung der damit erreichbaren Abtastwerte für die Korrelations- und Modellanalyse variiert werden, insbesondere in einer oder mehreren virtuellen Versuchsabtastungen.

Die Erfindung umfasst auch eine Steuereinheit für ein Laser-Scanning-Mikroskop, die programmtechnisch zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens eingerichtet ist, ein Laser-Scanning-Mikroskop mit einer solchen Steuereinheit und ein Computerprogramm, das zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens eingerichtet ist.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.

In den Zeichnungen zeigen:

Fig. 1 ein Laser-Scanning-Mikroskop,

Fig. 2 Diagramme der Abtastbewegungen und der Pixelzeit,

Fig. 3 die Beschränkung des Datenaufhahme- und Korrelationsbereichs,

Fig. 4 die Einteilung des abzutastenden Probenbereichs in Abschnitte mit nahezu konstanter Pixelzeit,

Fig. 5 die Abtastung mit unterschiedlicher Abtastgeschwindigkeit in Hin- und Rückrichtung, Fig. 6 die Variation der Anzahl von Abtastwerten,

Fig. 7 die Auswahl von interessierenden Bereichen und

Fig. 8 ein Flussdiagramm eines Konfigurations-, Datenaurhahme- und Auswertungsverfahrens .

In allen Zeichnungen haben übereinstimmende Teile gleiche Bezugszeichen.

Fig. 1 zeigt beispielhaft ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop, das insbesondere zur Ausübung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet ist. Darin ist ein Lasermodul 1 vorgesehen, das mit Lasern 2, 3 und 4 zur Erzeugung von Laserlicht der Wellenlängen 633 nm, 543 nm beziehungsweise 488 nm für den sichtbaren Bereich ausgestattet ist. Die von den Lasern 2, 3 und 4 ausgehende Strahlung wird über mehrere Strahlvereiniger 5, ein AOTF 6 und eine Lichtleitfaser 7 in eine Scan-Einrichtung 8 eingekoppelt, die mit einer in den Koordinaten X und Y strahlablenkenden Einheit 9 ausgestattet ist. Die Abtastbewegung entlang der Abtastachse X kann in Form einer harmonischen Schwingung oder beispielsweise in Form eines Dreicksverlaufs erfolgen. In einem zweiten Lasermodul 10 ist ein UV-Laser vorgesehen, dessen Licht über ein AOTF I l und eine Lichtleitfaser 12 in die Scan- Einrichtung 8 eingekoppelt wird.

In beiden Strahlengängen sind den Lichtleitfasern 7 und 12 jeweilige Kollimationsoptiken 13 nachgeordnet, deren Abstände zum jeweiligen Faserende veränderbar sind und die zu diesem Zweck mit einer ansteuerbaren Stelleinrichtung (zeichnerisch nicht dargestellt) gekoppelt sind.

Von der strahlablenkenden Einrichtung 9 wird die Laserstrahlung durch ein Scan-Objektiv 14 in den Strahlengang des vereinfacht dargestellten Mikroskops 15 eingekoppelt und hier auf eine Probe 16 gerichtet, die einen fluoreszierenden Farbstoff enthält oder auf die ein solcher Farbstoff aufgebracht worden ist. Auf dem Weg zur Probe passiert die Laserstrahlung eine Tubuslinse 17, einen Strahlteiler 18 und das Mikroskopobjektiv 19. Das von dem jeweils beaufschlagten Ort der Probe reflektierte und/oder emittierte Licht gelangt durch das Mikroskopobjektiv 19 zurück zur strahlablenkenden Einrichtung 9, passiert danach einen Strahlteiler 20 und wird mit Hilfe der Abbildungsoptik 21 nach Aufspaltung in mehrere Detektionskanäle 22 auf Detektoren 23 in Form von

Sekundärelektronenvervielfachern (engl, „photomultiplier"; PMT) gerichtet, von denen jeweils einer einem der Detektionskanäle 22 zugeordnet ist. Zum Zweck der Aufspaltung in die einzelnen Detektionskanäle 22 wird das Licht beispielhaft von einem Umlenkprisma 24 auf dichroitische Strahlteiler 25 gerichtet. In jedem Detektionskanal 22 sind sowohl in Richtung als auch senkrecht zur Strahlungsrichtung verstellbare und in ihren Durchmessern veränderbare Pinholes 26 sowie Emissionsfilter 27 vorgesehen.

Die Ausgänge der Detektoren 23 fuhren zu den Signaleingängen einer Auswerteschaltung 28, die ihrerseits mit einer Steuereinheit 29 verbunden ist, um die Signale der Detektoren 23 pixelweise zu integrieren und auszuwerten. Die Ausgänge der Steuereinheit 29 sind mit den Signaleingängen der Lasermodule 1 und 10, mit Signaleingängen der Stelleinrichtungen zur Beeinflussung der Position von optischen Elementen beziehungsweise Baugruppen, beispielsweise der Position der Kollimationsoptiken 13 und der Pinholes 26, mit der Scan- Einrichtung 8 und mit der Auswerteschaltung 28 verbunden (im Detail nicht dargestellt). Die Steuereinheit 29 ist außerdem mit einer Anzeige (nicht dargestellt) und Bedienelementen (nicht dargestellt) zur Dateneingabe und -modifikation verbunden.

Beispielhaft ist die in die Scan-Einrichtung 8 eingekoppelte Laserstrahlung durch einen Strahlteiler 30 verzweigt, wobei einer der Zweige zur Überwachung der Laserstrahlung auf einen optoelektronischen Empfanger 31 gerichtet ist, dem mehrere auf Filterrädern angeordnete und durch Drehung der Filterräder gegeneinander austauschbare Linienfilter 32 und ebenso gegeneinander austauschbare Neutralfilter 33 vorgeordnet sind. Der Ausgang des Empfängers 31 liegt ebenfalls an einem Signaleingang der Auswerteschaltung 28. Die Filterräder, auf denen die Linienfilter 32 und die Neutral filter 33 angeordnet sind, sind mit Stelleinrichtungen gekoppelt, deren Steuereingänge mit Signalausgängen der Steuereinheit 29 verbunden sind (zeichnerisch nicht dargestellt).

Das erfindungsgemäße Verfahren kann selbstverständlich auch mit deutlich einfacher aufgebauten Laser-Scanning-Mikroskopen realisiert werden. In Fig. 2 sind für den Fall einer sinusförmigen harmonischen Bewegung eines der Ablenkspiegel der strahlablenkenden Einheit 9 in Teilfigur 2A der Auslenkwinkel φ des betreffenden Ablenkspiegel, in Teilfigur 2B die Auslenkung X des Abtaststrahls auf der Probe 16 und in Teilfigur 2C die ortsabhängige Pixelzeit τ_P dargestellt. Die Pixelzeit Tp ist die Dauer über welche ein Signal eines Sekundärelektronenvervielfachers 23 zu einem Abtastwert für einen jeweiligen Pixel integriert und gemittelt wird. Aufgrund der harmonischen Bewegung sind die Pixelzeiten Xp an den äußeren Rändern des abtastbaren Bereichs deutlich länger als im Zentrum. Analytisch ergibt sich die Auslenkung X des Abtaststrahls in der Probenebene als: x - f tan[fesin(ö) t)]~ f b sin(<» 0 _» wobei t die Zeit, b die

Amplitude und ω die Drehfrequenz angibt und die Näherung für kleine Ablenkwinkel anwendbar ist. Die Ortsschrittweite ΔX=δr wird vorzugsweise konstant gehalten, um unverzerrte Bilder aufzunehmen. Daraus folgt eine sich ändernde Zeitschrittweite Δt beziehungsweise Pixelzeit Tp: At = τ_P = Ax / r^"-'l b . ^'-^]1 ω^~

COS(ßJ /)

Fig. 3 zeigt die erfindungsgemäße örtliche Beschränkung der Datenaufhahme (engl. Sampling) bei einer RICS-Messung mit einer harmonischen Abtastbewegung des Lichtstrahls entlang der Abtastachse X und einer linearen Abtastbewegung entlang der Abtastachse Y. Teilfigur 3A zeigt die Beschränkung in einem Ablenkungs-Zeit-Diagramm, Teilfigur 3B örtlich in einem Bild (X-Y-Diagramm) einer beispielhaften Probe. Um Modellfunktionen, die auf der Annahme einer konstanten Pixelzeit Tp basieren, auf die ermittelten Pixelwerte mit geringem Fehler anwenden zu können, erfolgt die RICS-Auswertung erfolgt erfindungsgemäß nur in einem eingeschränkten mittleren X-Bereich, in dem sich die Pixelzeit Tp um weniger als 10 % ändert. In alternativen Ausführungsformen können auch in den Bereichen mit größeren Abweichungen die Daten mit an die sich ändernde Pixelzeit Tp angepassten Modellfunktionen analysiert werden. In einer speziellen weitergehenden Ausführungsform der Datenaufnahme (nicht abgebildet) generiert beispielsweise die Auswerteschaltung 28 Abtastwerte nur, während sich der Abtaststrahl in dem mittleren X-Bereich befindet. Dies reduziert das Datenaufkommen und die zu speichernde Datenmenge.

Die Datenaufhahme gemäß Fig. 4 ist nicht in einer solchen Weise beschränkt. Vielmehr ist die Probe in mehrere Bereiche i=0...3 unterteilt, die verschiedenen Einzelkorrelationen G, zugeordnet werden. Innerhalb jedes der Bereiche ändert sich die Pixelzeit Tp,, um nicht mehr als jeweils 10 %. Es wird also näherungsweise eine stückweise Linearität der Abtastbewegung angenommen. Zu jeden Bereich wird die mittlere Pixelzeit Xp_,, für die RICS-Auswertung gespeichert.

Bevor die Probe 16 für eine eigentliche RICS-Auswertung abgetastet wird, können mittels der Steuereinheit 29 auf Anforderung eines Anwenders/Benutzers Bestwerte für einzeln auswählbare Abtastparameter ermittelt und auf der Anzeige vorgeschlagen werden. Dies ist unabhängig von der Art der Abtastbewegung (harmonisch, dreiecksfÖrmig usw.) möglich. Der Anwender/Benutzer hat dann mittels der Bedienelemente die Möglichkeit, die vorgeschlagenen Abtastparameter für einen nachfolgenden Abtastvorgang zu übernehmen oder sie zuvor zu modifizieren. Alternativ können die Abtastparameter vorzugsweise nach Start einer eigentlichen RICS-Messung als Teil des Messvorgangs vor der eigentlichen Abtastung obligatorisch optimiert werden, ohne dass der Benutzer darüber informiert wird. Dies ermöglicht es auch Anwendern/Benutzern, die keine detaillierten Kenntnisse des optischen und elektronischen Abtastverfahrens besitzen, mittels RIC S -Messungen und -Auswertungen Modellparameter von Transportprozessen mit geringen Fehlern zu ermitteln. Mit derselben Wirkung ist es denkbar, dass besonders qualifiziertes Bedienpersonal eine Optimierung von ausgewählten oder allen Abtastparametern gemäß der Erfindung außerhalb des regulären Betriebs vornimmt und die so gefundenen Bestwerte oder einen Wert eines so gefundenen Bestwertintervalls für spätere RICS-Messungen und -Auswertungen im regulären Betrieb vorgibt, die von weniger qualifizierten Benutzern durchgeführt werden. Bestwerte können beispielsweise für die miteinander in Wechselwirkung stehenden Abtastparameter räumliche Schrittweite δr und Pixelzeit Xp ermittelt werden.

Ein Bestwert für einen Abtastparameter kann einerseits rein rechnerisch, andererseits durch eine Anzahl von experimentellen Versuchsabtastungen mit variierenden Abtastparametern ermittelt werden. Beispielsweise kann ein Bestwert für die räumliche Schrittweite δr aus den Objektivparametern und einer beim späteren Abtasten zu verwendenden Lichtwellenlänge rein rechnerisch ermittelt werden. Die beste Pixelzeit Xp und die beste Linienzeit X_L können beispielsweise rein durch reale Versuchsabtastungen mit jeweils unterschiedlichem Wert für die Zeiten Xp, X_L ermittelt werden. Auch Mischformen sind denkbar, beispielsweise die anteilig rechnerische Ermittlung des Bestwerts für die räumliche Schrittweite δr und die anteilig experimentelle Ermittlung für die Pixelzeit Xp, während die Linienzeit X_L nicht optimiert, sondern dem Benutzer zur freien Einstellung überlassen wird. Anstelle von realen Versuchsabtastungen (Testmessungen) in Kombination mit einer Variation mindestens eines Abtastparameters kann der Bestwert durch rein rechnerische Simulationen auf der Basis dynamischer Modelle ermittelt werden. Dies bietet sich beispielsweise an, um die in der Probe deponierte Lichtenergie zu minimieren, wenn die Probe phototoxisch reagiert und genügend Informationen über den dynamischen Transportprozess für die Modellierung vorhanden sind.

Es ist auch möglich, auf der Grundlage einer oder mehrerer realer Versuchsabtastungen eine artifizielle Variation mindestens eines Abtastparameters durchzuführen. Dies kann als virtuelle Versuchsabtastung angesehen werden. Beispielsweise kann ein realer Abtastparameter wie die Pixelzeit Tp durch Zusammenfassen oder Auslassen unterschiedlicher Anzahlen von Abtastwerten einer realen Versuchsabtastung modifiziert werden.

Sowohl für die rein rechnerische Simulation virtueller Versuchsabtastungen als auch für virtuelle Versuchsabtastungen ausgehend von einer oder mehreren realen Testmessungen kann die Steuereinheit (nicht abgebildet) eine Benutzerschnittstelle bereitstellen. Die ermittelten Bestwerte werden dann automatisch oder auf Nachfrage für eine anschließende RICS-Messung und -Auswertung vorgegeben.

Aus mehreren Versuchsabtastungen, unabhängig davon, ob diese real oder virtuell durchgeführt werden, kann ein Bestwert ermittelt werden, indem aus den Abtastwerten der Versuchsabtastungen die RICS-Korrelationen und, nach Anpassung einer Modellfunktion durch eine Ausgleichsrechnung, ein Minimum eines Fehlers einer eine Dynamik eines Probenvorgangs charakterisierenden Zielgröße, beispielsweise einer Diffusionskonstante, ermittelt wird. Dies kann beispielsweise in einem an sich bekannten Intervallhalbierungsverfahren erfolgen, bis ein Minimum des Zielgrößenfehlers gefunden wird.

Fig. 5 zeigt die erfindungsgemäße Lösung zur Beschleunigung des Konfigurationsverfahrens bei einer Abtastung mit etwa dreiecksfδrmigem Verlauf, die Lösung ist aber auch bei harmonischer Bewegung anwendbar. Das Abtasten der Probe in einer realen Versuchsabtastung erfolgt bidirektional. Dabei wird von der Steuereinheit 29 in der Hin- Abtastung eine erste Abtastgeschwindigkeit V_{X L-R} der strahlablenkenden Einheit 9 von links nach rechts und in der Rück-Abtastung eine zweite Abtastgeschwindigkeit Vχ_,R-L der strahlablenkenden Einheit 9 von rechts nach links eingestellt. Daraus ergibt sich in Hin- Abtastrichtung eine andere Pixelzeit T_P,L-_R als in Rück-Abtastrichtung mit T_P,R._L- Dabei findet die Datenaufhahme beispielhaft nur in zwei Bereichen statt, in denen die Pixelzeiten Tp_1R-L und Xp_1R-L näherungsweise konstant sind. In einer alternativen Ausgestaltung (nicht abgebildet) kann die Datenaufnahme über die gesamte Abtastamplitude erfolgen, wobei für die Auswertung lediglich Abtastwerte aus den beiden Bereichen mit jeweils näherungsweise konstanter Pixelzeit Tp, _L-_R beziehungsweise Tp_1R-L verwendet werden. In beiden Alternativen werden die Daten der beiden Abtastrichtungen separat zu Pixelwerten (Bilddaten) verarbeitet und separat bezüglich der Optimierung der Abtastparameter analysiert. Durch Variation der Pixelzeit Tp zwischen mehreren vollständigen Versuchsabtastungen des abzutastenden Probenbereichs kann nach Korrelationsbildung, Anpassung der Modell funktion und Fehlerbestimmung des Zielgrößenparameters der Bestwert anhand derjenigen Pixelzeit Tp ermittelt werden, bei welcher der Fehler des Zielgrößenparameters minimal ist.

In Fig. 6 ist eine Ausführungsform gezeigt, in welcher anstelle der Änderung der Abtastgeschwindigkeit Vx die Pixelzeit Tp variiert wird, indem die Anzahl der bei einer elektronischen Überabtastung aufgenommenen Abtastwerte, genauer gesagt der gemittelten Rohdaten der Auswerteschaltung 28, reduziert wird. Dies kann, insbesondere bei konstanter Abtastwertaufnahmefrequenz der Auswerteschaltung 28, durch Zusammenfassen oder Auslassen von Abtastwerten erfolgen. Im Ergebnis wird die Anzahl der für Korrelationen zur Verfügung stehenden Pixel reduziert, was eine entsprechende Änderung der effektiven räumlichen Schrittweite δr der virtuellen Versuchsabtastungen erfordert. Beispielsweise ist die räumliche Schrittweite δr bei Vergrößerung der Pixelzeit Tp, beispielsweise bei Erhöhung der Anzahl der Abtastwerte pro Pixel, zu vergrößern.

Die Abtastwertaufnahmefrequenz beträgt beispielsweise konstant 40 MHz. Die Abtastgeschwindigkeit V_X^.R_/R-_L) wird von der Steuereinheit 29 so eingestellt, dass eine elektronische Überabtastung bewirkt wird. Durch unterschiedliche Varianten der Reduktion der Anzahl können virtuelle Abtastversuche mit verschiedenen Pixelzeiten Tp,_k durchgeführt werden, um den Bestwert zu bestimmen. Beispielsweise kann eine virtuelle Pixelzeit Tp_>2 virtuell aus einer Pixelzeit Tp,ι ermittelt werden, indem jeweils zwei benachbarte Abtastwerte gemittelt zusammengefasst werden. Die Pixelzeit Tp_>2 ist dann doppelt so groß wie Tp_,i. Die Reduktion der Anzahl des Abtastwerte kann vorteilhafterweise in Verbindung mit optischer Überabtastung eingesetzt werden, weil der Exponentialfaktor nahezu konstant gehalten werden kann.

In alternativen Ausgestaltungen (nicht dargestellt) kann als Abtastparameter auch die Abtastwertaufhahmefrequenz variiert werden.

Fig. 7 zeigt mehrere interessierende Bereiche ROl, die von einem Benutzer grafisch anhand eines Übersichtsbildes der Probe ausgewählt worden sind. Die erfindungsgemäßen Konfigurations- Aufnahme-, und Auswertungsverfahren können in jedem interessierenden Bereich separat und unabhängig von den anderen interessierenden Bereichen durchgeführt werden. Dabei sind in der RIC S -Auswertung auch Kreuzkorrelationen zwischen den Bereichen möglich.

In Fig. 8 sind die Schritte eines erfindungsgemäßen Verfahrens, das sowohl die Konfiguration des Laser-Scanning-Mikroskops als auch die Datenaufhahme und -auswertung zur Bestimmung von Difirusionskonstanten D₁ in verschiedenen interessierenden Bereichen i umfasst, in einem Flussdiagramm schematisch zusammengefasst. Die schnelle Abtastachse X wird dabei beispielhaft harmonisch angesteuert, die langsame Abtastachse Y linear.

Bezugszeichenliste

1 Erstes Lasermodul

2,3,4 Laser

5 Strahlvereiniger

6 AOTF

7 Lichtleitfaser

8 Scan-Einrichtung

9 Strahlablenkende Einheit

10 Zweites Lasermodul

1 1 AOTF

12 Lichtleitfaser

13 Kollimationsoptik

14 Scan-Objektiv

15 Mikroskops

16 Probe

17 Tubuslinse

18 Strahlteiler

19 Mikroskopobj ekti v

20 Strahlteiler

21 Abbildungsoptik

22 Detektionskanal

23 Sekundärelektronenvervielfacher

24 Umlenkprisma

25 Strahlteiler

26 Pinholes

27 Emissionsfilter

28 Auswerteschaltung

29 Steuereinheit

30 Strahlteiler

31 Optoelektronischer Empfänger

32 Linienfilter

33 Neutralfilter

Vx_1L-R Hin-Abtastgeschwindigkeit vχ,R-_L Rück- Abtastgeschwindigkeit φ Auslenkwinkel

X,Y Auslenkung, Abtastachsen

Δt Zeitschrittweite δr Räumliche Schrittweite

Tp Pixelzeit

ROI Interessierender Bereich i Nummer des interessierenden Bereichs

G, Gj Korrelation

F Modellfunktion

D Diffusionskonstante

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Konfiguration eines Laser-Scanning-Mikroskops für eine Rasterbildkorrelationsspektroskopiemessung, wobei folgende Schritte durchgeführt werden:

- Ermitteln eines Bestwerts für einen Abtastparameter und

- Vorgeben des Bestwerts für einen späteren Abtastvorgang an einer Probe (16).

2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei als Abtastparameter eine oder mehrere der folgenden Größen verwendet wird: räumliche Schrittweite, Abtastgeschwindigkeit (vχ)₅ Pixelzeit (τp), Linienzeit, Abtastwertaufnahmefrequenz.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Bestwert der räumlichen Schrittweite anhand einer Breite einer Punktübertragungsfunktion des Laser-Scanning-Mikroskops so ermittelt wird, dass die räumliche Schrittweite signifikant kleiner ist als die Breite der Punktübertragungsfunktion.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei der Bestwert der räumlichen Schrittweite anhand mindestens eines Objektivparameters und einer beim späteren Abtasten zu verwendenden Lichtwellenlänge ermittelt wird.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Bestwert ermittelt wird, indem mehrere Versuchsabtastungen der später abzutastenden Probe (16) mit jeweils unterschiedlichem Versuchswert für den Abtastparameter durchgeführt werden.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Bestwert bestimmt wird, indem aus den Abtastwerten der Versuchsabtastungen ein Minimum eines Fehlers einer eine Dynamik eines Probenvorgangs charakterisierenden Größe ermittelt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei als eine die Dynamik charakterisierende Größe eine Diffusionskonstante verwendet wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei der Bestwert bestimmt wird, indem aus den Abtastwerten der Versuchsabtastungen ein Maximum einer Breite einer Korrelation (G) einer Versuchsabtastung ermittelt wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, wobei in den Versuchsabtastungen die Probe bidirektional mit in Hin- und Rückrichtung unterschiedlichem Versuchswert des zu optimierenden Parameters abgetastet wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Abtastung in Hin- und Rückrichtung innerhalb derselben Abtastzeile erfolgt.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei zur Variation der Anzahl der Abtastwerte mehrere der Abtastwerte zusammengefasst oder ausgelassen werden.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei zur Ermittlung des Bestwerts eine Simulation eines Transportvorgangs in der Probe (16) und/oder eine virtuelle Versuchsabtastung durchgeführt werden.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Probe (16) real elektronisch überabgetastet wird und mindestens eine virtuelle Versuchsabtastung basierend auf der Überabtastung durchgeführt wird, indem die Anzahl der realen Abtastwerte für die virtuelle Versuchsabtastung rechnerisch variiert wird.

14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der abzutastende Probenbereich anhand von geometrischen Vorgaben eines Benutzers ermittelt wird.

15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Bestwert ausschließlich für den und ausschließlich anhand von Abtastwerten aus dem abzutastenden Probenbereich ermittelt wird.

16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Bestwert als Vorschlag ausgegeben und vor einem späteren Abtastvorgang eine Bestätigung eines Benutzers für den optimierten Wert ermittelt wird.

17. Verfahren zum Durchführen einer Rasterbildkorrelationsspektroskopiemessung an einer Probe (16), wobei Abtastwerte ausschließlich in einem Probenbereich aufgenommen werden, innerhalb dessen sich eine Pixelzeit (Tp) längs einer harmonisch angesteuerten Abtastachse (X) um weniger als oder höchstens um einen vorgegebenen oder vorgebbaren Wert, insbesondere um 10 %, ändert.

18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei Abtastwerte ausschließlich in mehreren Abtastbereichen ermittelt werden, innerhalb derer sich die Pixelzeit (τp) längs der harmonisch angesteuerten Abtastachse (X) jeweils um weniger als oder höchstens um einen vorgegebenen oder vorgebbaren Wert ändert.

19. Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, wobei die Probe (16) optisch und/oder elektronisch überabgetastet wird.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 19, wobei die Abtastwerte mittels eines Laser-Scanning-Mikroskops aufgenommen werden.

21. Verfahren zum Auswerten von Abtastwerten einer

Rasterbildkorrelationsspektroskopiemessung einer Probe (16), wobei eine Korrelation (G) ausschließlich in einem Probenbereich ermittelt wird, innerhalb dessen sich eine Pixelzeit (τp) längs einer harmonisch angesteuerten Abtastachse (X) um weniger als oder höchstens um einen vorgegebenen oder vorgebbaren Wert, insbesondere um 10 %, ändert.

22. Verfahren nach dem Anspruch 21, wobei separate Korrelationen (Gi) in mehreren Abtastbereichen ermittelt werden, innerhalb derer sich die Pixelzeit (τp) längs der harmonisch angesteuerten Abtastachse (X) jeweils um weniger als oder höchstens um einen vorgegebenen oder vorgebbaren Wert ändert.

23. Verfahren nach Anspruch 21 oder 22, wobei für die Ermittlung der Korrelation (G) die Anzahl der Abtastwerte durch Zusammenfassen oder Auslassen verändert wird.

24. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 23, wobei die Korrelation (G) mittels einer Steuereinheit (29) eines Laser-Scanning-Mikroskops aus Abtastwerten einer Rasterbildkorrelationsspektroskopiemessung ermittelt werden.

25. Steuereinheit (29) für ein Laser-Scanning-Mikroskop, die programmtechnisch zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 23 eingerichtet ist.

26. Laser-Scanning-Mikroskop mit einer Steuereinheit (29) nach Anspruch 25.

27. Computerprogramm, eingerichtet zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 24.