WO2009054754A1 - Plasmide recombinant phins21 codant une protéine hybride avec la proinsuline humaine, souche de bactéries escherichia coli jm109/ phins21 productrice de la protéine hybride avec la proinsuline humaine et procédé de fabrication de proinsuline humaine - Google Patents

Plasmide recombinant phins21 codant une protéine hybride avec la proinsuline humaine, souche de bactéries escherichia coli jm109/ phins21 productrice de la protéine hybride avec la proinsuline humaine et procédé de fabrication de proinsuline humaine Download PDF

Info

Publication number
WO2009054754A1
WO2009054754A1 PCT/RU2008/000658 RU2008000658W WO2009054754A1 WO 2009054754 A1 WO2009054754 A1 WO 2009054754A1 RU 2008000658 W RU2008000658 W RU 2008000658W WO 2009054754 A1 WO2009054754 A1 WO 2009054754A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
hybrid protein
proinsulin
phins21
human proinsulin
protein
Prior art date
Application number
PCT/RU2008/000658
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Petr Ivanovich Rodionov
Petr Petrovich Rodionov
Vadim Vasilievich Shmatchenko
Alexey Vyacheslavovich Stepanov
Alexandr Nikolaevich Baidus
Natalya Anatolievna Shmatchenko
Taras Alexeevich Gorkun
Original Assignee
Obschestvo S Ogranichennoi Otvetstvennostyu 'gerofarm'
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Obschestvo S Ogranichennoi Otvetstvennostyu 'gerofarm' filed Critical Obschestvo S Ogranichennoi Otvetstvennostyu 'gerofarm'
Priority to EA201070461A priority Critical patent/EA201070461A1/ru
Publication of WO2009054754A1 publication Critical patent/WO2009054754A1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/57—IFN-gamma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Definitions

  • the invention relates to the field of biotechnology, namely, to the production of recombinant human proinsulin, and can be used in medicine.
  • Proinsulin is synthesized in the rough endoplasmic reticulum of b-cells of pancreatic islets of Langerhans in the form of a precursor, preproinsulin (molecular weight 11500 Da).
  • the leader sequence consisting of 23 amino acid residues, directs the precursor molecule to the Golgi apparatus and is cleaved there.
  • a proinsulin molecule is formed (molecular weight about 9000 Da), which takes the conformation necessary for the proper formation of disulfide bridges.
  • proinsulin is cleaved in several specific sites with the formation of mature insulin and C-peptide, which are deposited in secretory granules.
  • proinsulin can block the destruction of pancreatic b-cells, acting as a local protector, and also stimulate their regeneration.
  • the disadvantages of the described method are the multi-stage process and the use of a highly toxic reagent - cyanide bromide when cleaving a hybrid protein.
  • the present invention relates to a human proinsulin precursor fusion protein having the general formula: [leader] - [linker] - [enterokinase site] - [proinsulin], wherein the leader is human gamma interferon, the N-terminal fragment of human gamma interferon, immunoglobulin -binding domain of protein A of Starhulosossus augeus [4-6], bovine protimosin [7], glutathione-S-transferase [8], the leader sequence encoded by the vector pET23 artificial sequences MetAsPHisPro and MetAsPHisGlu; the linker is a sequence selected from
  • SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 6; His 6 GlySeg; ⁇ s 4 GlySeg; and peptides, preferably containing glycine and series of about 10-15 length amino acid residues. Examples of these peptides are presented, for example, in US patent N ° 5258698, given in the present description by reference in full.
  • the enterokinase site has the sequence (Asp) 4 Lys; proinsulin is the sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the present invention relates to a particular case of a fusion protein of the general formula presented above with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 comprising the amino acid sequences of a leader peptide representing the N-terminal fragment of human gamma interferon (SEQ ID NO: 1 ), a peptide linker (SEQ ID NO: 2) containing the enterokinase cleavage site, and human proinsulin (SEQ ID NO: 3).
  • SEQ ID NO: 4 comprising the amino acid sequences of a leader peptide representing the N-terminal fragment of human gamma interferon (SEQ ID NO: 1 ), a peptide linker (SEQ ID NO: 2) containing the enterokinase cleavage site, and human proinsulin (SEQ ID NO: 3).
  • the present invention relates to a particular case of a hybrid protein of the General formula above, with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, including the amino acid sequence of the leader peptide, which is an N-terminal fragment of human gamma interferon (SEQ ID NO: 5) a peptide linker (SEQ ID NO: 6) containing the enterokinase cleavage site and human proinsulin (SEQ ID NO: 3).
  • the invention relates to DNA encoding the specified hybrid protein of General formula.
  • the invention also relates to DNA molecules encoding particular variants, that is, encoding the hybrid proteins of SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 7.
  • the invention also relates to a recombinant plasmid comprising said DNA encoding said fusion protein of the general formula, as well as regulatory elements and genetic markers.
  • regulatory elements and genetic markers can be mentioned as regulatory elements and genetic markers that are used in the recombinant plasmid of the present invention: the tac transcription promoter, the transcription terminator of the E. coli ribosomal operon, the ⁇ -lactamase gene (bla), used as a genetic marker determining the resistance of bacterial cells transformed by plasmid pHINS21 to ampicillin.
  • the invention relates to a recombinant plasmid pHINS21 (Fig. 1), containing DNA encoding a fusion protein with the sequence SEQ ID NO: 4, and includes unique restriction sites recognized by the endonuclease located at the following distance to the right of the EcoRI: BamHI - site 159 bp, ⁇ modifierl - 185 bp, ⁇ pd ⁇ II - 442 bp, ⁇ vul - 1382 bp
  • the invention also relates to a recombinant plasmid pHINS35 (FIG. 2) containing DNA encoding a fusion protein with the sequence SEQ ID NO: 7, and includes unique restriction sites recognized by the endonuclease located at the following distance to the right of the EcoRI: Sacl site - 121 p. o., BamNI - 144 bp, ⁇ modifierl - 170 bp, ⁇ pd ⁇ II - 427 bp, ⁇ vul - 1367 bp
  • New hybrid proteins provide a high yield of the target product - human proinsulin due to efficient renaturation and efficient cleavage of the specified hybrid protein by enterokinase, and, in addition, their use in the production of proinsulin eliminates the use of a highly toxic cyan bromide reagent.
  • the invention also relates to transformed Escherichia coli cells containing said recombinant plasmid comprising DNA encoding a fusion protein of the general formula that are producers of the fusion protein.
  • the invention relates to transformed Escherichia coli cells containing a recombinant plasmid comprising DNA encoding a fusion protein with the sequence SEQ ID NO: 4, which are a producer of the fusion protein.
  • the invention also relates to transformed Escherichia coli cells containing a recombinant plasmid comprising DNA encoding a fusion protein with the sequence SEQ ID NO: 7, which are a producer of the fusion protein.
  • the invention relates to a strain of bacteria Escherichia coli
  • JM109 / pHINS21 - a producer of a hybrid protein that is a precursor of human proinsulin, and to a strain of bacteria Escherichia coli JM109 / pHINS35, a producer of a fusion protein that is a precursor of human proinsulin.
  • the claimed fusion protein for example, produced by E. coli strain JM109 / pHINS21 or E. coli strain JM109 / pHINS35, can be used in a method for producing human insulin.
  • a new hybrid protein is transformed into insulin by enzymatic cleavage of the specified hybrid protein by enterokinase, trypsin and carboxypeptidase B.
  • the invention relates to a new method for producing human proinsulin.
  • the inventive method for producing human proinsulin includes culturing transformed Escherichia coli cells containing the indicated recombinant plasmid, including DNA encoding a hybrid protein of the general formula, destroying these cells, isolating inclusion bodies, dissolving them in a buffer containing urea and dithiothreitol, renaturation and purification of the renaturation protein , its cleavage by a specific proteinase, followed by purification and obtaining the target product, that is, proinsulin.
  • the method involves culturing a new E. coli strain JM109 / pHGNS21 carrying the new plasmid pHINS21, purifying the renatured fusion protein, cleaving the fusion protein with enterokinase (or its catalytic subunit), and purifying ion exchange exchange chromatography obtained after enzymatic cleavage of proinsulin by S-exchange chromatography followed by high performance reverse phase liquid chromatography.
  • the method includes culturing a new strain of E. coli
  • JM109 / pHGNS35 carrying the new plasmid pHGNS35 purification of the renatured fusion protein, cleavage of the fusion protein with enterokinase (or its catalytic subunit), and purification of proinsulin after enzymatic cleavage by ion exchange chromatography on SP-Sepharose followed by high performance phase chromatography.
  • the advantage of the claimed method for producing human proinsulin is the simplification of the process and the exclusion from the technology of a highly toxic reagent.
  • a new recombinant plasmid pHINS21 has been created which determines the synthesis of a hybrid protein with a molecular weight of about 15.85 kDa and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, in which the amino acid sequence of the leader peptide, which is an N-terminal fragment of gamma human interferon and human proinsulin are connected by a peptide linker containing an enterokinase cleavage site.
  • a new hybrid protein the properties of which determine its effective renaturation and efficient enzymatic cleavage by enterokinase, provides a high yield of the target product, human proinsulin.
  • the optimal leader length of the indicated fusion protein was experimentally selected.
  • the leader sequence is presented in SEQ ID NO: 1.
  • the optimal amino acid composition of the hybrid protein linker encoded by the pHGNS21 plasmid was experimentally selected.
  • the linker sequence is presented in SEQ ID NO: 2.
  • the recombinant plasmid pHGNS21 was constructed on the basis of the known plasmid pHINS05 [9].
  • the DNA plasmid pHINS05 was subjected to complete hydrolysis with restriction enzymes BcII and Hl, and the obtained Bll-Hll fragment (4.2 kb) was ligated with the oligonucleotide duplex obtained by annealing synthetic oligonucleotides: the meaning presented in the sequence SEQ ID NO: 8 and the antisense sequence shown in SEQ ID NO: 9.
  • a nucleotide sequence encoding an enterokinase cleavage site namely, the (Asp) 4 Ly s peptide fragment
  • Competent cells of E. coli strain JM 109 were transformed with a ligation mixture, seeded, and a plasmid designated pHINS20 was isolated from the grown colonies.
  • a plasmid designated pHINS20 was isolated from the grown colonies.
  • pHINS20 in the bacterial cell it was deleted according to the G-gene (negative regulator of copy number) [10].
  • pHINS20 plasmid DNA was subjected to complete hydrolysis with restriction enzymes Eco47Sh and Spal, and the resulting Eco47Sh-SnaI fragment (3.6 kb) was ligated.
  • the result was a recombinant plasmid pHINS21, the structure of which was confirmed by restriction analysis and sequencing.
  • the new recombinant plasmid pHINS21 encodes a 143 amino acid fusion protein with a molecular weight of 15.85 kDa (SEQ ID NO: 4), in which the amino acid sequences of the leader peptide, which is the N-terminal fragment of human gamma interferon (SEQ ID NO: 1), and human proinsulin (SEQ ID NO: 3) are linked by a peptide linker (SEQ ID NO: 2) containing an enterokinase cleavage site.
  • the indicated plasmid consists of a BamHI-EcoRI fragment of plasmid pKK223-3 [11] containing the tac transcription promoter; the EcoRI-Ni ⁇ d ⁇ II fragment encoding the N-terminal fragment of human gamma interferon, a peptide linker with an enterokinase cleavage site and the amino acid sequence of human proinsulin; a fragment of ⁇ d ⁇ -Sp réelle ⁇ plasmid pKK223-3 containing the transcription terminator of the ribosomal operon E.
  • the E. coli producing strain JM109 / pHINS21 is obtained by transforming E. coli cells of strain JM 109 with the plasmid pHINS21. After transformation, colonies grown on ampicillin medium are selected, plasmids are isolated from them and subjected to restriction analysis and sequencing. The cell line carrying the pHINS21 plasmid is plated several times on agarose medium supplemented with ampicillin, and the resulting monoclonal culture is inoculated with 5 ml of liquid medium with ampicillin. The culture is checked for the presence of inducible expression of the hybrid protein, packaged, glycerol is added and stored at minus 4O 0 C.
  • the new Escherichia coli strain JM109 / pHINS21, carrying the plasmid pHINS21, is a producer of a hybrid protein containing the amino acid sequence of human proinsulin, and is characterized by the following features. Morphological signs: small, rod-shaped cells, gram-negative, non-spore-bearing, 1 x 3.5 microns in size, motile, with distinct inclusion bodies after induction of fusion protein synthesis.
  • ammonium mineral salts and organic compounds are used: amino acids, peptone, tryptone, yeast extract.
  • amino acids are used as a carbon source.
  • Antibiotic resistance cells of the producer strain show resistance to ampicillin (up to 500 mg / ml), due to the presence of the ⁇ -lactamase (bl Harbor) gene in the plasmid. Stability of the plasmid in the strain: when cells are maintained for several months on an agarized LB medium containing ampicillin, no loss or rearrangement of the plasmid that affects the expression of the hybrid protein is observed.
  • the hybrid protein after induced expression accumulates in the form of inclusion bodies, and its content is at least 30% of the total protein of the cell.
  • the resulting producer strain E. coli JM109 / pH ⁇ NS21 was deposited in the collection of microorganisms of the State Scientific Center for Applied Microbiology and Biotechnology under the number B-6429.
  • the new recombinant plasmid pHGNS21 provides efficient biosynthesis of a hybrid protein containing human proinsulin in other bacterial Escherichia coli strains, for example, in the E. coli host strain BL21 as described below.
  • the new recombinant plasmid pHINS35 determines the synthesis of a hybrid protein with a molecular weight of about 15.2 kDa, in which the amino acid sequences of the leader peptide, which is the N-terminal fragment of human gamma interferon, and human proinsulin are connected by a peptide linker containing the enterokinase cleavage site.
  • the new fusion protein has the sequence of SEQ ID NO: 7.
  • Recombinant plasmid pHINS35 was constructed based on plasmid pHINS21.
  • the DNA of plasmid pHINS21 was subjected to complete hydrolysis with restriction enzymes EcoRI and Smal, and the resulting fragment EcoRI-Sma ⁇ (3.5 kb) was ligated with an amplified DNA fragment encoding the shortened leader sequence of the hybrid protein plasmid pHINS21.
  • Competent cells of E. coli strain JM 109 were transformed with the ligation mixture, seeded, and a plasmid designated pHINS35 was isolated from the grown colonies.
  • the new recombinant plasmid pHGNS35 encodes a 138 amino acid fusion protein with a molecular weight of 15.2 kDa, in which the amino acid sequences of the leader peptide, which is the N-terminal fragment of human gamma interferon (SEQ ID NO: 5), and human proinsulin (SEQ ID NO : 3) connected by a peptide linker (SEQ ID NO: 6) containing the enterokinase cleavage site.
  • the indicated plasmid consists of a BamHI-EcoRI fragment of plasmid pKK223-3 [11] containing the tac transcription promoter; an EcoRI-Ni ⁇ d ⁇ II fragment comprising a fusion protein gene encoding the N-terminal fragment of human gamma interferon, a peptide linker with an enterokinase cleavage site and the amino acid sequence of human proinsulin; a fragment of ⁇ d ⁇ -Sp réelle ⁇ plasmid pKK223-3 containing the transcription terminator of the ribosomal operon E.
  • the E. coli producing strain JM109 / pHGNS35 is obtained by transforming E. coli cells of strain JM109 with plasmid pHINS35. After transformation, colonies grown on ampicillin medium are selected, plasmids are isolated from them and subjected to restriction analysis and sequencing. The cell line carrying the pHINS35 plasmid is subcultured several times on agarose medium supplemented with ampicillin, and the resulting monoclonal culture is inoculated with 5 ml of liquid medium with ampicillin. The culture is checked for the presence of inducible expression of the hybrid protein, packaged, glycerol is added and stored at minus 4O 0 C.
  • the new Escherichia coli strain JM109 / pHINS35 carrying the plasmid pHINS35 is a producer of a hybrid protein containing the amino acid sequence of human proinsulin and is characterized by the following features. Morphological signs: small, rod-shaped cells, gram-negative, non-spore-bearing, 1 x 3.5 microns in size, motile, with distinct inclusion bodies after induction of fusion protein synthesis.
  • Physiological and biochemical characteristics cells grow at a temperature of 4-42 ° C, optimum pH is 6.8-7.6.
  • optimum pH is 6.8-7.6.
  • ammonium mineral salts and organic compounds are used: amino acids, peptone, tryptone, yeast extract.
  • amino acids are used as a carbon source.
  • Antibiotic resistance cells of the producer strain exhibit resistance to ampicillin (up to 500 mg / ml), due to the presence of the ⁇ -lactamase (bl Harbor) gene in the plasmid.
  • Stability of the plasmid in the strain when cells are maintained for several months on an agarized LB medium containing ampicillin, no loss or rearrangement of the plasmid that affects the expression of the hybrid protein is observed.
  • the hybrid protein after induced expression accumulates in the form of inclusion bodies, and its content is at least 30% of the total protein of the cell.
  • the resulting producer strain E. coli JM109 / pHINS35 deposited in the collection of microorganisms of the State Scientific Center for Applied Microbiology and Biotechnology under the number B-6430.
  • novel recombinant plasmid pHINS35 provides efficient biosynthesis of a hybrid protein containing human proinsulin and other Escherichia coli bacterial strains, for example, E. coli BL21 host strain, as described below.
  • the description provides a method for producing human proinsulin using E. coli cells transformed with DNA encoding a fusion protein of the general formula described above.
  • the cultivation conditions of the producer strain and the isolation of inclusion bodies are not determining, and the specialist in this field, based on general knowledge, will select similar conditions that do not affect the achievement of the technical result.
  • a method for producing human proinsulin is presented using strains of the producers E. coli JM109 / pHINS21 and E. coli JM109 / pHGNS35.
  • inclusion bodies are dissolved in 0.1 M Tris-Hcl buffer, pH 8.0, containing 8 M urea and 10 mM dithiothreitol for 16-24 hours; • the hybrid protein is renatured in a 10-fold volume of 0.1 M glycine buffer, pH 9-11, at a temperature of 10-14 0 C for 20-24 hours;
  • purified hybrid protein is cleaved with enterokinase (or its catalytic subunit) in the ratio of 1-10 Units of enterokinase per 1 mg of protein for 10 to 24 hours at a pH of 7.0-8.5 and a temperature of 4-36 ° C.
  • the reaction is stopped by acidifying the hydrolyzate with hydrochloric acid to a pH of 4.6-5.0, and the resulting precipitate of impurity proteins is separated by centrifugation;
  • proinsulin is purified by ion exchange chromatography on SP-Sepharose FF in 0.05-0.2 M ammonium acetate buffer, pH 3.0-6.0, containing 1-2 M urea. The sorbed protein is eluted with a linear gradient of potassium chloride from 0 to 0.5 M in equilibration buffer; • further purification of proinsulin is carried out by the method of reverse phase high performance liquid chromatography (RP HPLC).
  • RP HPLC reverse phase high performance liquid chromatography
  • the cells are grown on a nutrient medium based on casein hydrolyzate and extract of Sasshotus servisiae yeast.
  • IPTG 1-isopropyl- ⁇ -Dl-thiogalactopyranoside
  • Isolation of the hybrid protein from inclusion bodies, its enzymatic cleavage and purification of proinsulin is carried out according to the following scheme:
  • inclusion bodies are dissolved in 0.1 M Tris-Hcl buffer, pH 8.0, containing 8 M urea and 10 mM dithiothreitol for 16-24 hours;
  • the hybrid protein is renatured in a 10-fold volume of 0.1 M glycine buffer, pH 9-11, at a temperature of 10-14 0 C for 20-24 hours;
  • the reaction is stopped, acidifying the hydrolyzate with hydrochloric acid to a pH of 4.6-5.0, and the resulting precipitate of impurity proteins is separated by centrifugation; • proinsulin is purified by ion exchange chromatography on SP-Sepharose FF in 0.05-0.2 M ammonium acetate buffer, pH 3.0-6.0, containing 1-2 M urea.
  • the sorbed protein is eluted with a linear gradient of potassium chloride from 0 to 0.5 M in equilibration buffer;
  • the claimed fusion protein for example, produced by E. coli strain JM109 / pHINS21 or E. coli strain JM109 / pHINS35, can be used in a method for producing human insulin.
  • a new hybrid protein is transformed into insulin by enzymatic cleavage of the specified hybrid protein by enterokinase, trypsin and carboxypeptidase B.
  • the production of insulin from a fusion protein produced by E. coli JM109 / pHINS21 and E. coli JM109 / pHINS35 strains is carried out according to the following scheme:
  • insulin is purified by ion exchange chromatography on SP-sepharose FF in 0.05-0.2 M ammonium acetate buffer, pH 3.0-6.0, containing 1-6 M urea and 10-50 mM KCl . Sorbed protein is eluted with a linear gradient of potassium chloride from 0 to 0.5 M in equilibration buffer. Similar examples of the production of proinsulin and insulin can be carried out with any fusion protein of the general formula presented above. Examples using plasmids pHGNS21 and pHINS35 are given as illustrative only and are not intended to limit the claims of the inventors. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • Figure l presents a physical map of the recombinant plasmid pHINS21.
  • Scheme of the recombinant plasmid pHINS21 P tac - transcription promoter, TiT 2 - rpB terminators of transcription of the ribosomal operon E. coli, ori - replication initiation site, Ba - ⁇ -lactamase gene.
  • the coding sequences are indicated in the hybrid protein gene: leader — leader, N-terminal fragment of human gamma-interferon (SEQ ID NO: 1); lipker - peptide linker (SEQ ID NO: 2) containing the enterokinase cleavage site (EK); rpoiipsilip - human proinsulin (SEQ ID NO: 3).
  • Figure 2 presents the physical map of the recombinant plasmid pHINS35.
  • Scheme of the recombinant plasmid pHINS35 P tac — transcription promoter, TiT 2 –rpB terminators of transcription of the E. coli ribosomal operon, ori — replication initiation site, Na — ⁇ -lactamase gene.
  • the coding sequences are indicated in the hybrid protein gene: leader — leader, N-terminal fragment of human gamma interferon (SEQ ID NO: 8); lipker - peptide linker (SEQ ID NO: 9) containing the enterokinase cleavage site (EK); rpoiipsilip - human proinsulin (SEQ ID NO: 3).
  • FIG. 3 shows an HPLC analysis of material obtained after purification of a renatured fusion protein (HINS21) (SEQ ID NO: 4) with human proinsulin on DEAE-Sepharose.
  • HINS21 renatured fusion protein
  • FIG. 4 shows an HPLC analysis of fusion protein cleavage products (HINS21) (SEQ ID NO: 4) with human proinsulin enterokinase.
  • Figure 5 shows an HPLC analysis of fusion protein cleavage products (HINS21) (SEQ ID N0: 4) with human proinsulin enterokinase, trypsin and carboxypeptidase B.
  • HINS35 renatured fusion protein
  • HINS35 fusion protein cleavage products
  • FIG. 8 shows an HPLC analysis of fusion protein cleavage products (HINS35) (SEQ ID NO: 7) with human insulin enterokinase, trypsin and carboxypeptidase B.
  • Figure 9 shows an HPLC analysis of human proinsulin derived from a fusion protein (HINS21) (SEQ ID NO: 4) and purified by reverse phase high performance liquid chromatography.
  • Example 1 Construction of the plasmid pHINS21
  • the plasmid pHINS21 is constructed on the basis of the known plasmid pHINS05 [9].
  • the plasmid DNA pHINS05 is subjected to complete hydrolysis with restriction enzymes BcII and Hpl.
  • BcII and Hpl restriction enzymes
  • 5 ⁇ g of plasmid DNA pHINS05 in 20 ⁇ l of buffer containing 33 mm Tris acetate, pH 7.9, 66 mm K-acetate, 10 mm Mg-acetate and 0.1 mg / ml BSA (buffer 1) and 10 Units BcII and Hl1 restriction enzymes were incubated for 1.0 hour at 37 ° C.
  • a BcII-Hpl DNA fragment of about 4.2 kb was isolated from the resulting hydrolyzate.
  • the DNA is deproteinized with phenol, a mixture of phenol with chloroform (1: 1), chloroform, precipitated with ethyl alcohol, and dissolved in 20 ⁇ l of water.
  • the obtained Bll-Hral fragment containing the fusion protein gene and the vector part of the pHINS05 plasmid is ligated with a 20-fold molar excess of the oligonucleotide duplex obtained by annealing the synthetic oligonucleotides: sense, shown in the sequence SEQ ID NO: 8, and antisense, shown in the sequence SEQ ID NO: 9.
  • a nucleotide sequence encoding an enterokinase cleavage site is inserted in front of the human proinsulin DNA into the hybrid protein gene.
  • Competent cells of E. coli strain JM 109 were transformed with a ligation mixture (10 ⁇ l) and plated on LB agar containing 100 ⁇ g / ml ampicillin. Plasmid DNA was isolated from the grown colonies and sequenced between the restriction enzyme sites EcoRI and Hpl to confirm insertion into the linker part of the gene of the hybrid protein. The result is the plasmid pHINS20.
  • coli strain JM 109 are transformed with a ligated mixture (10 ⁇ l) and plated on LV agar containing 100 ⁇ g / ml ampicillin. Bacterial clones carrying plasmid DNA of 3.6 kbp were selected. The isolated plasmids are subjected to restriction analysis and sequenced according to the Sanger method. The result is the plasmid pHINS21.
  • Example 2 Obtaining strain E. coli JM109 / pHINS21 and determining the level of its productivity
  • the plasmid pHINS21 transforms the competent cells of the E. coli strain JM 109 and plated on LV agar containing 100 ⁇ g / ml ampicillin. Separately, a localized colony is subcultured three times on plates with LV agar containing 100 ⁇ g / ml ampicillin. The resulting monoclonal culture was inoculated with 5 ml of liquid LB medium with ampicillin and incubated overnight with vigorous shaking at 37 ° C. The resulting producer strain E. coli JM109 / pHINS21 was stored in 20% glycerol at minus 4O 0 C.
  • the overnight culture was seeded at a dilution of 1: 50 in 5 ml of LB liquid medium containing 100 ⁇ g / ml ampicillin and grown to a turbidity of 0.8 at 37 ° C on a shaker at 200 rpm.
  • IPTG was added to the culture to a concentration of 1.0 mM, and incubation was continued under the same conditions for 3 hours.
  • the resulting producer strain E. coli BL21 / pHINS21 is stored in 20% glycerol at minus 40 0 C.
  • the productivity of E. coli strain BL21 / pHINS21 is determined by the same method as for E. coli strain JM109 / pHINS21 described in Example 2. According to densitometry, the content of the hybrid protein in the induced cells of the obtained strain is at least 30% of the total cell protein .
  • Example 4 Obtaining human proinsulin using a producer strain E. coli JM 109 / pHINS21 Step 1. Isolation of inclusion bodies containing a hybrid protein with human proinsulin
  • a culture of E. coli strain JM109 / pHINS21 is grown on a nutrient medium based on casein hydrolyzate and baker's yeast extract. Induction of the biosynthesis of the hybrid protein is carried out by introducing an IPTG inducer in the middle of the logarithmic phase of the culture growth. Cultivation is continued until the formation of intracellular inclusions of the fusion protein. After completion of cultivation, the culture is precipitated and used to isolate inclusion bodies containing a hybrid protein.
  • Cells are suspended in buffer A containing 50 mM sodium disubstituted phosphate, 1 mM EDTA, 0.2 M sodium chloride based on 1 g of biomass 5-10 ml of buffer, and destroyed on the Gaulin disintegrator.
  • the destroyed cells are centrifuged for 20 minutes on a Beckman J-301 at 8000 rpm.
  • the resulting pellet was resuspended in buffer A containing 1% Tritop X-100, incubated for 1 hour, and the suspension was centrifuged for 20 minutes on a Beckman J-ZOI at 8000 rpm.
  • the pellet was resuspended in buffer A and pelleted in a centrifuge.
  • the washed precipitate of inclusion bodies (paste) containing about 5% of the hybrid protein, Packed, frozen and stored at minus 40 0 C.
  • Thawed inclusion Taurus paste (5 g) was dissolved in 100 ml of a buffer solution containing 0.1 M Tris-Hcl, pH 8.0, 10 mM dithiothreitol and 8 M urea, and incubated with stirring for 20 hours at 14 ° C.
  • the solution was centrifuged for 20 min at Veskmap J-ZOI at a speed of 8000 rpm at 14 ° C. Renaturation of the fusion protein contained in the supernatant is carried out by 10-fold dilution in 0.1 M glycine buffer, pH 9-11.
  • the solution of the hybrid protein is incubated for 24 hours, stirring and maintaining a temperature of 10-14 0 C.
  • the process of renaturation of the hybrid protein is controlled by RP-HPLC. After the formation of correctly closed SS bonds in 50-70% of the molecules of the hybrid protein, the solution is acidified with 2 N hydrochloric acid to a pH of 7.0-7.2, and the precipitate formed is separated by centrifugation.
  • the content of the renatured hybrid protein in the supernatant is 112 mg.
  • the hybrid protein solution is applied to a 100 ml column filled with DEAE-Sepharose FF, pre-equilibrated with 0.05 M Tris-Hcl buffer, pH 7.0-7.5.
  • the column is washed with equilibration buffer containing 0.15 M NaCl. Sorbed protein is eluted with a linear gradient of 0.15-0.4 M sodium chloride in equilibration buffer.
  • the content of the hybrid protein is analyzed by RP HPLC (Fig.Z). Fractions containing a fusion protein with a purity of at least 50% are combined. The result is 95 mg of purified fusion protein, the concentration of which is 1, 34 mg per 1 ml of solution.
  • the correspondence of the obtained hybrid protein was confirmed by mass spectrometry by coincidence with the calculated molecular weight of the specified protein.
  • the enzymatic hydrolysis reaction is carried out at a temperature of 25 ° C with constant stirring.
  • the purified fusion protein solution was made alkaline to pH 8.0 and CaCl 2 was added to a concentration of 1 mM.
  • a recombinant enterokinase solution is added to the reaction mixture. (bovine enterokinase catalytic subunit) (Novagep) at the rate of 4 units per
  • FIG. 4 presents the HPLC analysis of the cleavage products of the hybrid protein by enterokinase after 16 hours of incubation.
  • the clarified solution containing proinsulin is applied to a 50 ml chromatographic column filled with SP-sepharose FF, previously equilibrated with 0.03 M ammonium acetate buffer, pH 5.0, s
  • the column is washed with a balancing buffer until the baseline of the control flow densitometer is reached.
  • the adsorbed proinsulin is eluted using a linear gradient of potassium chloride from 0 to 0.5 M in a balancing buffer.
  • the content and purity of human proinsulin in the collected fractions is determined by RP HPLC.
  • the combined fractions contain 54 mg of human proinsulin with a purity of at least 85%.
  • proinsulin is carried out by reverse phase high performance liquid chromatography.
  • a 250x30 mm column filled with Cromasil C 18 was equilibrated with 10% acetonitrile with 0.1% trifluoroacetic acid, and a 54 mg protein solution of proinsulin from the previous purification step was fed.
  • the protein is eluted with a gradient of acetonitrile (with 0.1% trifluoroacetic acid) from 10% to 50%.
  • the collected fractions of the main peak of proinsulin are analyzed for impurities by RP-HPLC.
  • the hybrid protein is obtained as described in example 4 (step 2).
  • the purified fusion protein is digested with enterokinase from a natural source.
  • the enzymatic cleavage reaction of the hybrid protein is carried out at a temperature of 25 0 C with constant stirring.
  • CaCl 2 was added to a solution of purified fusion protein to a concentration of 1 mM.
  • enterokinase solution (Sigma, USA) was added to the reaction mixture at the rate of 2 Units per 1 mg of protein and incubated for 16 hours.
  • the hydrolysis products of the hybrid protein are analyzed by RP-HPLC.
  • the cleavage reaction is stopped by acidifying the material with 2 N hydrochloric acid to a pH of 4.0-5.0.
  • proinsulin Further purification of proinsulin is carried out as described in example 4 (step 4).
  • Example 6 Obtaining human insulin using a producer strain of E. coli JM 109 / pHINS21
  • the purified fusion protein is prepared as described in Example 4 (step 2) and co-hydrolyzed with enterokinase, trypsin and carboxypeptidase B.
  • recombinant enterokinase Novagep
  • bovine pancreatic trypsin treated with tazylphenylalanyl chloromethyl ketone trypsin-TPCA, Sigma
  • porcine pancreatic carboxypeptidase B in a weight ratio of fusion protein: trypsin: carboxypeptidase B equal to 5000: 1: 1.3 are added, and hydrolysis is carried out under stirring for 8 hours while stirring hours at a pH of 8.0 and a temperature of 24 ° C.
  • the reaction is stopped by acidifying the hydrolyzate with a 10% hydrochloric acid solution to a pH of 3.6 ⁇ 0.3.
  • HINS21 fusion protein cleavage products
  • the purified fusion protein is prepared as described in Example 4 (step 2) and co-hydrolyzed with enterokinase, trypsin and carboxypeptidase B.
  • CaCl 2 is added to a 10 ml solution of purified fusion protein (1.2 mg / ml) to a concentration of 1 mM and recombinant enterokinase (Novagep) is added at the rate of 2 U per 1 mg of fusion protein, and hydrolysis is carried out with constant stirring for 2 hours at pH 8.0 and a temperature of 24 ° C.
  • bovine pancreatic trypsin treated with tazylphenylalanyl chloromethyl ketone (trypsin-TPCA, Sigma) and porcine pancreatic carboxypeptidase B in a weight ratio of fusion protein: trypsin: carboxypeptidase B of 4000: 1: 1.3 are added and further hydrolysis is added.
  • the reaction is stopped by acidifying the hydrolyzate with a 10% hydrochloric acid solution to a pH of 3.6 ⁇ 0.3.
  • Example 9 Joint hydrolysis of a hybrid protein from E. coli strain JM109 / pHINS21 enterokinase, trypsin and carboxypeptidase B
  • the pHINS35 plasmid encoding the shortened leader sequence of the fusion protein with human proinsulin is constructed using the pHINS21 plasmid.
  • a polymerase chain reaction is carried out on the pHINS21 plasmid using oligonucleotide primers: direct, shown in SEQ ID NO: 10, and reverse, shown in SEQ ID NO: 11.
  • PCR is carried out on a matrix of 5-10 ng plasmid DNA pHINS21 in the presence of 20 pmol of each of the primers in 50 ⁇ l of amplification buffer and 2.5 U of thermostable DNA polymerase, in the following mode: denaturation - 95 ° C, 20 sec; annealing - 66 0 C, 20 sec; polymerization - 72 ° C, 20 sec; 30 cycles of amplification.
  • the amplification product is deproteinized with phenol, a mixture of phenol with chloroform (1: 1), chloroform, precipitated with ethanol, and dissolved in 30 ⁇ l of water.
  • the amplified DNA is hydrolyzed with restriction enzyme EcoRI in a buffer containing 33 mM Tris acetate, pH 7.9, 66 mM K-asetate, 10 mM Mg-acetate and 0.1 mg / ml BSA 3.0 h at 37 ° C.
  • the mixture is then heated for 10 min at 70 ° C to inactivate the enzyme, and the DNA is precipitated with ethanol.
  • a DNA fragment of about 120 bp is obtained. with a protruding sticky end formed by the restriction enzyme EcoRI.
  • the resulting fragment is inserted into the plasmid pHINS21 between the restriction enzyme site EcoRI and the restriction enzyme Smal, located at a distance of 138 bp to the right of the EcoRI website.
  • plasmid DNA pHINS21 is subjected to complete hydrolysis with restriction enzymes EcoRI and Smal.
  • a fragment of the EcoRI-Smaz plasmid pHHNS21 about 3.5 in size was isolated from the resulting hydrolyzate. about. by electrophoresis in a 0.8% gel fusible agarose.
  • the DNA is deproteinized with phenol, a mixture of phenol with chloroform (1: 1), chloroform, precipitated with ethyl alcohol, and dissolved in 20 ⁇ l of water.
  • the resulting EcoRI-SmA ⁇ fragment of the pHINS21 plasmid is ligated with a previously amplified DNA fragment with the protruding sticky end of the EcoRI restrictase.
  • Competent cells of E. coli strain JM 109 were transformed with the ligation mixture and plated on LV agar containing 100 ⁇ g / ml ampicillin.
  • Bacterial clones carrying plasmid DNA of 3.6 size are selected. about.
  • the isolated plasmids are subjected to restriction analysis and sequenced according to the Sanger method. The result is the plasmid pHINS35.
  • Example 1 1. Obtaining strain E. coli JM109 / pHNS35
  • the plasmid pHINS35 transforms the competent cells of the E. coli strain JM 109 and plated on LV agar containing 100 ⁇ g / ml ampicillin. Separately, a localized colony is subcultured three times on plates with LV agar containing 100 ⁇ g / ml ampicillin. The resulting monoclonal culture was inoculated with 5 ml of liquid LB medium with ampicillin, and incubated overnight with vigorous shaking at 37 ° C.
  • the resulting producer strain E. coli JM109 / pHINS35 is stored in 20% glycerol at minus 4O 0 C.
  • Determination of the productivity of the E. coli strain BL21 / pHINS35 is carried out by the same method as for the E. coli strain JM109 / pHINS21 described in example 2. According to densitometry, the content of the hybrid protein in the induced cells of the obtained strain is at least 30% of total protein cells.
  • Example 12 Obtaining human proinsulin when using the producer strain E. coli JM109 / pHINS35
  • Step 1 Isolation of inclusion bodies containing fusion protein with human proinsulin
  • the culture of E. coli strain JM109 / pHINS35 is grown on a nutrient medium based on casein hydrolyzate and baker's yeast extract. Induction of the biosynthesis of the hybrid protein is carried out by introducing an IPTG inducer in the middle of the logarithmic phase of the culture growth. Cultivation is continued until the formation of intracellular inclusions of the fusion protein. After cultivation is complete, the culture is precipitated and used to isolate inclusion bodies containing the proinsulin fusion protein.
  • Cells are suspended in buffer A containing 50 mM sodium disubstituted phosphate, 1 mM EDTA, 0.2 M sodium chloride per 1 g of biomass 5-10 ml of buffer, and destroyed on a disintegrator
  • Thawed paste Taurus inclusion (5 g) is dissolved in 100 ml of a buffer solution containing 0.1 M Tris-Hcl, pH 8.0, 10 mm dithiothreitol and
  • the solution was centrifuged for 20 minutes on a Beckman J-ZOI at a speed of 8000 rpm at 14 0 C. Renaturation of the hybrid protein; ⁇ contained in the supernatant is carried out by 10-fold dilution in 0.1 M glycine buffer, pH 9-11. The solution of the hybrid protein is incubated for 24 hours, stirring and maintaining a temperature of 10-14 0 C. The process of renaturation of the hybrid protein is controlled by RP-HPLC. After the formation of properly closed SS bonds in 50-70% of the molecules of the hybrid protein, the solution is acidified with 2 N hydrochloric acid to a pH of 7.0-7.2, and the precipitate formed is separated by centrifugation.
  • the content of the renatured hybrid protein in the supernatant is 97 mg.
  • the fusion protein solution was applied to a 100 ml column filled with Q-Sepharose FF, pre-equilibrated with 0.01 M Tris-HCl buffer, pH 8.0, and the column was washed with equilibration buffer. Sorbed protein is eluted with a linear gradient from 0 to 0.5 M sodium chloride in equilibration buffer.
  • the content of the hybrid protein is analyzed by RP-HPLC ( Figure 6). Fractions containing a fusion protein with a purity of at least 50% are combined. The result is 81 mg of purified fusion protein, the concentration of which is 1.27 mg per 1 ml of solution.
  • the enzymatic hydrolysis reaction is carried out at a temperature of 25 0 C with constant stirring. CaCl 2 was added to a solution of purified fusion protein to a concentration of 1 mM. Then, a solution of recombinant enterokinase (Novagep) was added to the reaction mixture at the rate of 4 Units per 1 mg of protein and incubated for 20 hours.
  • the hydrolysis products of the hybrid protein are analyzed by RP-HPLC.
  • Figure 7 presents the HPLC analysis of the products of the cleavage of the hybrid protein by enterokinase after 20 hours of incubation. The cleavage reaction is stopped by acidifying the material with 2 N hydrochloric acid to a pH of 4.0-5.0. The resulting precipitate of impurity proteins is separated by centrifugation.
  • the clarified solution containing proinsulin is applied to a 50 ml chromatographic column filled with SP-sepharose FF, previously equilibrated with 0.03 M ammonium acetate buffer, pH 5.0, s
  • the column is washed with equilibration buffer until reaching the baseline of the control flow densitometer.
  • the adsorbed proinsulin is eluted using a linear gradient of potassium chloride from 0 to 0.5 M in a balancing buffer.
  • the content and purity of human proinsulin in the collected fractions is determined by RP HPLC.
  • the combined fractions contain 47 mg of human proinsulin with a purity of at least 85%.
  • proinsulin Further purification of proinsulin is carried out by RP HPLC as described in example 4 (step 4). After purification, 39 mg of highly purified human proinsulin with a basic substance content of 94% are obtained.
  • Example 13 Obtaining human insulin using a producer strain E. coli JM109 / pHINS35
  • step 2 the hybrid protein with human proinsulin was subjected to hydrolysis by enterokinase, trypsin and carboxypeptidase B at the same time.
  • enterokinase trypsin
  • carboxypeptidase B carboxypeptidase B
  • 10 ml of a purified fusion protein solution (1.16 mg / ml) of the solution recombinant enterokinase (Novagep) is added at the rate of 4 IU per 1 mg of fusion protein.
  • bovine pancreatic trypsin treated with tazylphenylalanyl chloromethyl ketone (trypsin-TPCA, Sigma) and porcine pancreatic carboxypeptidase B in a weight ratio of fusion protein: trypsin: carboxypeptidase B equal to 5000: 1: 1.5 are added, and hydrolysis is carried out under stirring while stirring hours at a pH of 8.0 and a temperature of 24 ° C.
  • the reaction is stopped by acidifying the hydrolyzate with a 10% hydrochloric acid solution to a pH of 3.6 ⁇ 0.3.
  • Fig presents an HPLC analysis of the products of the cleavage of the hybrid protein by enterokinase, trypsin and carboxypeptidase B after 8 hours of incubation.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pHINS21, КОДИРУЮЩАЯ
ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК С ПРОИНСУЛИНОМ ЧЕЛОВЕКА, ШТАММ
БАКТЕРИЙ Еsсhеriсhiа соli JM109/pHINS21 - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО
БЕЛКА С ПРОИНСУЛИНОМ ЧЕЛОВЕКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ Изобретение относится к области биотехнологии, а именно, к получению рекомбинантного проинсулина человека, и может быть использовано в медицине. УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Проинсулин синтезируется в шероховатом эндоплазматическом ретикулуме b-клеток островков Лангерганса поджелудочной железы в виде предшественника - препроинсулина (молекулярная масса 11500 Да). Лидерная последовательность, состоящая из 23 аминокислотных остатков, направляет молекулу-предшественник в аппарат Гольджи и там отщепляется. В результате образуется молекула проинсулина (молекулярная масса около 9000 Да), принимающая конформацию, необходимую для правильного образования дисульфидных мостиков. Затем проинсулин расщепляется в нескольких специфических участках с образованием зрелого инсулина и С-пептида, которые депонируются в секреторных гранулах.
Последние медицинские исследования демонстрируют, что проинсулин может блокировать разрушение b-клеток поджелудочной железы, действуя в качестве локального протектора, а также стимулировать их регенерацию.
Поэтому разработка способов получения рекомбинантного проинсулина человека для профилактики и лечения сахарного диабета крайне актуальна.
Известен способ получения рекомбинантного проинсулина человека [1-3], который включает лизис клеток E. соli, экспрессирующих гибридные белки с проинсулином человека в форме телец включения, растворение телец включения в буферном растворе, содержащем мочевину или гуанидин хлорид, сульфирование гибридных белков сульфонатом натрия и тетратионатом натрия, центрифугирование гибридного белка S-сульфоната проинсулина, отщепление S-сульфоната проинсулина от лидерного пептида путем обработки бромистым цианом, очистку S-сульфоната проинсулина анионообменной хроматографией, повторную укладку цепи S-сульфоната проинсулина и очистку проинсулина человека адсорбционной хроматографией.
Недостатками описанного способа являются многостадийность технологического процесса и использование при расщеплении гибридного белка высокотоксичного реагента - бромистого циана.
Поэтому в настоящее время существует необходимость в разработке усовершенствованных способов получения рекомбинантного проинсулина человека, которые были бы высокопроизводительными и нетоксичными. Для получения рекомбинантных белков из гибридных полипептидов известны подходы, в которых отщепление конечного продукта проводится при помощи высокоспецифических протеолитических ферментов. Такие способы предусматривают конструирование гибридных белков, содержащих сайт узнавания специфической протеиназы между белком-носителем (лидерным пептидом) и целевым белком, очистку синтезированного гибридного белка и его ферментативное расщепление. Одной из высокоспецифических протеиназ, используемых для этой цели, является энтерокиназа (энтеропептидаза, КФ 3.4.21.9), которая расщепляет пептидную связь после последовательности (Asp)4Lys. ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к гибридному белку предшественнику проинсулина человека, имеющему общую формулу: [лидер] - [линкер] - [энтерокиназный сайт] - [проинсулин] , где лидер представляет собой гамма-интерферон человека, N-концевой фрагмент гамма-интерферона человека, иммуноглобулин-связывающий домен белка А Stарhуlососсus аuгеus [4-6], бычий протимозин [7], глутатион-S- трансферазу [8], лидерную последовательность, кодируемую вектором pET23 МеtАlаSегМеtТhгGlуGlуGlпGlпМеtGlуАгgΙlеАгgΙlе; искусственные последовательности МеtАsрНisРrо и МеtАsрНisGlу; линкер представляет собой последовательность, выбранную из
SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:6; His6GlySeг; Шs4GlySeг; и пептидов, предпочтительно содержащих глицин и серии длиной приблизительно 10-15 аминокислотных остатков. Примеры указанных пептидов представлены, например, в патенте США N°5258698, приведенном в настоящем описании в качестве ссылки в полном объеме. энтерокиназный сайт имеет последовательность (Asp)4Lys; проинсулин представляет собой последовательность SEQ ID NO:3.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к частному случаю гибридного белка общей формулы, представленной выше, с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:4, включающей аминокислотные последовательности лидерного пептида, представляющего собой N-концевой фрагмент гамма-интерферона человека (SEQ ID NO: 1), пептидного линкера (SEQ ID NO:2), содержащего сайт расщепления энтерокиназы, и проинсулина человека (SEQ ID NO:3).
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к частному случаю гибридного белка общей формулы, представленной выше, с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7, включающей аминокислотные последовательности лидерного пептида, представляющего собой N-концевой фрагмент гамма-интерферона человека (SEQ ID NO:5), пептидного линкера (SEQ ID NO: 6), содержащего сайт расщепления энтерокиназы, и проинсулина человека (SEQ ID NO:3). Кроме того, изобретение относится к ДНК, кодирующей указанный гибридный белок общей формулы. Также изобретение относится к молекулам ДНК, кодирующим частные варианты, то есть, кодирующим гибридные белки SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:7.
Также изобретение относится к рекомбинантной плазмиде, включающей указанную ДНК, кодирующей указанный гибридный белок общей формулы, а также регуляторные элементы и генетические маркеры. В качестве регуляторных элементов и генетических маркеров, которые используются в рекомбинантной плазмиде по настоящему изобретению, можно привести следующие неограничивающие элементы и маркеры: tас-промотор транскрипции, терминатор транскрипции рибосомного оперона Е.соli, ген β-лактамазы (blа), использующийся в качестве генетического маркера, определяющий устойчивость трансформированных плазмидой pHINS21 клеток бактерий к ампициллину.
В частном случае, изобретение относится к рекомбинантной плазмиде pHINS21 (фиг.l), содержащей ДНК, кодирующей гибридный белок с последовательностью SEQ ID NO :4, и включает уникальные сайты рестрикции, распознаваемые эндонуклеазой, расположенные на следующем расстоянии вправо от сайта ЕсоRI: ВаmНI - 159 п.о., Нраl - 185 п.о., НiпdΙII - 442 п. о., Рvul - 1382 п.о.
Также изобретение относится к рекомбинантной плазмиде pHINS35 (фиг.2), содержащей ДНК, кодирующей гибридный белок с последовательностью SEQ ID NO:7, и включает уникальные сайты рестрикции, распознаваемые эндонуклеазой, расположенные на следующем расстоянии вправо от сайта ЕсоRI: Sасl - 121 п.о., ВаmНI - 144 п.о., Нраl - 170 п.о., НiпdΙII - 427 п.о., Рvul - 1367 п.о.
Новые гибридные белки обеспечивают высокий выход целевого продукта - проинсулина человека за счет эффективной ренатурации и эффективного расщепления энтерокиназой указанного гибридного белка, и, кроме того, их использование при получении проинсулина позволяет исключить использование высокотоксичного реагента - бромистого циана.
Также изобретение относится к трансформированным клеткам Еsсhеriсhiа соli, содержащим указанную рекомбинантную плазмиду, включающую ДНК, кодирующую гибридный белок общей формулы, которые являются продуцентом гибридного белка. В частном случае, изобретение относится к трансформированным клеткам Еsсhеriсhiа соli, содержащим рекомбинантную плазмиду, включающую ДНК, кодирующую гибридный белок с последовательностью SEQ ID NO:4, которые являются продуцентом гибридного белка. Также изобретение относится к трансформированным клеткам Еsсhеriсhiа соli, содержащим рекомбинантную плазмиду, включающую ДНК, кодирующую гибридный белок с последовательностью SEQ ID NO:7, которые являются продуцентом гибридного белка. Конкретно, изобретение относится к штамму бактерий Еsсhеriсhiа соli
JM109/pHINS21 - продуценту гибридного белка, который является предшественником проинсулина человека, и к штамму бактерий Еsсhеriсhiа соli JM109/pHINS35 - продуценту гибридного белка, который является предшественником проинсулина человека.
Кроме того, заявленный гибридный белок, например, продуцируемый штаммом Е.соli JM109/pHINS21 или штаммом Е.соli JM109/pHINS35, может быть использован в способе получения инсулина человека. При этом новый гибридный белок трансформируют в инсулин путем ферментативного расщепления указанного гибридного белка энтерокиназой, трипсином и карбоксипептидазой В.
Изобретение относится к новому способу получения проинсулина человека. Заявляемый способ получения проинсулина человека включает культивирование трансформированных клеток Еsсhеriсhiа соli, содержащих указанную рекомбинантную плазмиду, включающую ДНК, кодирующую гибридный белок общей формулы, разрушение указанных клеток, выделение телец включения, растворение их в буфере, содержащем мочевину и дитиотреитол, ренатурацию и очистку ренатурированного гибридного белка, его расщепление специфической протеиназой с последующей очисткой и получением целевого продукта, то есть проинсулина.
В частном случае, способ включает культивирование нового штамма Е.соli JM109/pHГNS21, несущего новую плазмиду pHINS21, очистку ренатурированного гибридного белка, расщепление гибридного белка энтерокиназой (или ее каталитической субъединицей), и очистку полученного после ферментативного расщепления проинсулина ионообменной хроматографией на SР-сефарозе с последующей высокоэффективной жидкостной хроматографией на обращенных фазах. В другом случае, способ включает культивирование нового штамма Е.соli
JM109/pHГNS35, несущего новую плазмиду pHГNS35, очистку ренатурированного гибридного белка, расщепление гибридного белка энтерокиназой (или ее каталитической субъединицей), и очистку полученного после ферментативного расщепления проинсулина ионообменной хроматографией на SР-сефарозе с последующей высокоэффективной жидкостной хроматографией на обращенных фазах.
Преимуществом заявленного способа получения проинсулина человека является упрощение технологического процесса и исключение из технологии высокотоксичного реагента.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Рекомбинантная плазмида pШNS21 Была создана новая рекомбинантная плазмида pHINS21, которая определяет синтез гибридного белка с молекулярной массой около 15,85 кДа и аминокислотной последовательностью SEQ ID NO :4, в которой аминокислотная последовательность лидерного пептида, представляющего собой N-концевой фрагмент гамма-интерферона человека, и проинсулина человека соединены пептидным линкером, содержащим сайт расщепления энтерокиназы. Новый гибридный белок, свойства которого определяют его эффективную ренатурацию и эффективное ферментативное расщепление энтерокиназой, обеспечивает высокий выход целевого продукта - проинсулина человека.
Оптимальная длина лидерной последовательности указанного гибридного белка была подобрана экспериментально. Лидерная последовательность представлена в SEQ ID NO: 1.
Оптимальный аминокислотный состав линкера гибридного белка, кодируемого плазмидой pHГNS21, был подобран экспериментально. Последовательность линкера представлена в SEQ ID NO:2. Рекомбинантную плазмиду pHГNS21 конструировали на основе известной плазмиды pHINS05 [9]. ДНК плазмиды pHINS05 подвергали полному гидролизу рестриктазами BcII и Нраl, а полученный фрагмент Всll-Нраl (4,2 т.п. о.) лигировали с олигонуклеотидным дуплексом, полученным в результате отжига синтетических олигонуклеотидов: смыслового, представленного в последовательности SEQ ID NO: 8, и антисмыслового, представленного в последовательности SEQ ID NO: 9. В результате в ген гибридного белка перед ДНК проинсулина человека встраивается нуклеотидная последовательность, кодирующая сайт расщепления энтерокиназы, а именно пептидный фрагмент (Asp)4Ly s. Компетентные клетки штамма Е.соli JM 109 трансформировали лигированной смесью, высевали и из выросших колоний выделяли плазмиду, обозначенную как pHINS20. Для увеличения числа копий полученной плазмиды pHINS20 в бактериальной клетке ее делетировали по гор-гену (негативному регулятору копийности) [10]. С этой целью ДНК плазмиды pHINS20 подвергали полному гидролизу рестриктазами Eco47Ш и Sпаl, а полученный фрагмент Eco47Ш-SnaI (3,6 т.п.о.) лигировали. В результате получали рекомбинантную плазмиду pHINS21, строение которой подтверждали рестрикционным анализом и секвенированием.
Новая рекомбинантная плазмида pHINS21 кодирует гибридный белок размером 143 аминокислоты с молекулярной массой 15,85 кДа (SEQ ID NO:4), в котором аминокислотные последовательности лидерного пептида, представляющего собой N-концевой фрагмент гамма-интерферона человека (SEQ ID NO: 1), и проинсулина человека (SEQ ID NO:3) соединены пептидным линкером (SEQ ID NO:2), содержащим сайт расщепления энтерокиназы.
Указанная плазмида состоит из фрагмента ВаmНI-ЕсоRI плазмиды pKK223-3 [11], содержащего промотор транскрипции tас; фрагмента ЕсоRI- НiпdΙII, кодирующего N-концевой фрагмент гамма-интерферона человека, пептидный линкер с сайтом расщепления энтерокиназы и аминокислотную последовательность проинсулина человека; фрагмента НiпdШ-SпаΙ плазмиды pKK223-3, содержащего терминатор транскрипции рибосомного оперона Е.соli, ген β-лактамазы (blа), участок инициации репликации (оri); и Eco47Ш-EheI фрагмента плазмиды pKK223-3; уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, расположенные на следующем расстоянии вправо от сайта ЕсоRI: ВаmНI - 159 п.о., Нраl - 185 п.о., НiпdΙII - 442 и.о., Рvul - 1382 п.о.
Штамм-продуцент Е.соli JM109/pHINS21 получают путем трансформации клеток Е.соli штамма JM 109 плазмидой pHINS21. После трансформации отбирают колонии, выращенные на среде с ампициллином, выделяют из них плазмиды и подвергают их рестрикционному анализу и секвенированию. Линию клеток, несущую плазмиду pHINS21, несколько раз пересевают на среду с агарозой с добавлением ампициллина, и полученной моноклональной культурой инокулируют 5 мл жидкой среды с ампициллином. Культуру проверяют на наличие индуцируемой экспрессии гибридного белка, фасуют, добавляют глицерин и хранят при минус 4O0C. Новый штамм Еsсhеriсhiа соli JM109/pHINS21, несущий плазмиду pHINS21, является продуцентом гибридного белка, содержащего аминокислотную последовательность проинсулина человека, и характеризуется следующими признаками. Морфологические признаки: клетки мелкие, палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные, размером 1x3,5 мкм, подвижные, с хорошо различимыми тельцами включения после индукции синтеза гибридного белка.
Культуральные признаки: при росте на агаризованной среде LB колонии круглые, гладкие, полупрозрачные, блестящие, серые. Край ровный, диаметр колоний 1-3 мм, консистенция пастообразная. Рост в жидких средах (LB, минимальная среда с глюкозой) характеризуется ровным помутнением.
Физиолого-биохимические признаки: клетки растут при температуре 4-
420C, оптимум рН 6,8-7,6. В качестве источника азота используют как минеральные соли аммония, так и органические соединения: аминокислоты, пептон, триптон, дрожжевой экстракт. В качестве источника углерода при росте на минимальной среде используют глицерин, углеводы, аминокислоты.
Устойчивость к антибиотикам: клетки штамма-продуцента проявляют устойчивость к ампициллину (до 500 мг/мл), обусловленную наличием в плазмиде гена β-лактамазы (blа). Стабильность плазмиды в штамме: при поддержании клеток в течение нескольких месяцев на агаризованной среде LB, содержащей ампициллин, не наблюдаются потери или перестройки плазмиды, влияющие на экспрессию гибридного белка.
В новом штамме гибридный белок после индуцированной экспрессии накапливается в виде телец включения, и его содержание составляет не менее 30% от общего белка клетки.
Полученный штамм-продуцент E. соli JM109/pHГNS21 депонирован в коллекции микроорганизмов Государственного Научного Центра Прикладной Микробиологии и Биотехнологии под номером B-6429. Новая рекомбинантная плазмида pHГNS21 обеспечивает эффективный биосинтез гибридного белка, содержащего проинсулин человека, и в других бактериальных штаммах Еsсhеriсhiа соli, например, в штамме-хозяине E. соli BL21, как описано ниже.
Рекомбинантная плазмида pHINS35
Новая рекомбинантная плазмида pHINS35 определяет синтез гибридного белка с молекулярной массой около 15,2 кДа, в котором аминокислотные последовательности лидерного пептида, представляющего собой N-концевой фрагмент гамма-интерферона человека, и проинсулина человека соединены пептидным линкером, содержащим сайт расщепления энтерокиназы. Новый гибридный белок имеет последовательность SEQ ID NO:7. Его свойства, как и случае плазмиды pHINS21, определяют его эффективную ренатурацию и эффективное ферментативное расщепление энтерокиназой, что обеспечивает высокий выход целевого продукта - проинсулина человека, без применения высокотоксичного реагента - бромистого циана.
Рекомбинантную плазмиду pHINS35 конструировали на основе плазмиды pHINS21. ДНК плазмиды pHINS21 подвергали полному гидролизу рестриктазами ЕсоRI и Smаl, а полученный фрагмент ЕсоRI-SmаΙ (3,5 т.п. о.) лигировали с амплифицированным фрагментом ДНК, кодирующим укороченную лидерную последовательность гибридного белка плазмиды pHINS21.
Компетентные клетки штамма Е.соli JM 109 трансформировали лигированной смесью, высевали, и из выросших колоний выделяли плазмиду, обозначенную как pHINS35.
Новая рекомбинантная плазмида pHГNS35 кодирует гибридный белок размером 138 аминокислоты с молекулярной массой 15,2 кДа, в котором аминокислотные последовательности лидерного пептида, представляющего собой N-концевой фрагмент гамма-интерферона человека (SEQ ID NO:5), и проинсулина человека (SEQ ID NO:3) соединены пептидным линкером (SEQ ID NO: 6), содержащим сайт расщепления энтерокиназы.
Указанная плазмида состоит из фрагмента ВаmНI-ЕсоRI плазмиды pKK223-3 [11], содержащего промотор транскрипции tас; фрагмента ЕсоRI- НiпdΙII, включающего ген гибридного белка, кодирующий N-концевой фрагмент гамма-интерферона человека, пептидный линкер с сайтом расщепления энтерокиназы и аминокислотную последовательность проинсулина человека; фрагмента НiпdШ-SпаΙ плазмиды pKK223-3, содержащего терминатор транскрипции рибосомного оперона Е.соli, ген β-лактамазы (blа), участок инициации репликации (оri); и Eco47Ш-EheI фрагмента плазмиды pKK223-3; уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, расположенные на следующем расстоянии вправо от сайта ЕсоRI: Sасl - 121 п. о., ВаmНI - 144 п.о., Нраl - 170 и.о., НiпdΙII - 427 п.о., Рvu 1 - 1367 п.о.
Штамм-продуцент Е.соli JM109/pHГNS35 получают путем трансформации клеток Е.соli штамма JM109 плазмидой pHINS35. После трансформации отбирают колонии, выращенные на среде с ампициллином, выделяют из них плазмиды и подвергают их рестрикционному анализу и секвенированию. Линию клеток, несущую плазмиду pHINS35, несколько раз пересевают на среду с агарозой с добавлением ампициллина, и полученной моноклональной культурой инокулируют 5 мл жидкой среды с ампициллином. Культуру проверяют на наличие индуцируемой экспрессии гибридного белка, фасуют, добавляют глицерин и хранят при минус 4O0C.
Новый штамм Еsсhеriсhiа соli JM109/pHINS35, несущий плазмиду pHINS35, является продуцентом гибридного белка, содержащего аминокислотную последовательность проинсулина человека, и характеризуется следующими признаками. Морфологические признаки: клетки мелкие, палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные, размером 1x3,5 мкм, подвижные, с хорошо различимыми тельцами включения после индукции синтеза гибридного белка.
Культуральные признаки: при росте на агаризованной среде LB колонии круглые, гладкие, полупрозрачные, блестящие, серые. Край ровный, диаметр колоний 1-3 мм, консистенция пастообразная. Рост в жидких средах (LB, минимальная среда с глюкозой) характеризуется ровным помутнением.
Физиоло го-биохимические признаки: клетки растут при температуре 4- 420C, оптимум рН 6,8-7,6. В качестве источника азота используют как минеральные соли аммония, так и органические соединения: аминокислоты, пептон, триптон, дрожжевой экстракт. В качестве источника углерода при росте на минимальной среде используют глицерин, углеводы, аминокислоты.
Устойчивость к антибиотикам: клетки штамма-продуцента проявляют устойчивость к ампициллину (до 500 мг/мл), обусловленную наличием в плазмиде гена β-лактамазы (blа).
Стабильность плазмиды в штамме: при поддержании клеток в течение нескольких месяцев на агаризованной среде LB, содержащей ампициллин, не наблюдаются потери или перестройки плазмиды, влияющие на экспрессию гибридного белка.
В новом штамме гибридный белок после индуцированной экспрессии накапливается в виде телец включения, и его содержание составляет не менее 30% от общего белка клетки. Полученный штамм-продуцент Е.соli JM109/pHINS35 депонирован в коллекции микроорганизмов Государственного Научного Центра Прикладной Микробиологии и Биотехнологии под номером B-6430.
Новая рекомбинантная плазмида pHINS35 обеспечивает эффективный биосинтез гибридного белка, содержащего проинсулин человека, и в других бактериальных штаммах Еsсhеriсhiа соli, например, в штамме-хозяине Е.соli BL21, как описано ниже.
Способ получения проинсулина человека
В качестве неограничивающего примера в описании приведен способ получения проинсулина человека с использованием клеток Е.соli, трансформированных ДНК, кодирующей гибридный белок общей формулы, описанной выше. Условия культивирования штамма-продуцента и выделение телец включения не являются определяющими, и специалист в данной области на основании общих знаний подберет аналогичные условия, не влияющие на достижение технического результата. В качестве неограничивающего примера способ получения проинсулина человека представлен с использованием штаммов продуцентов Е.соli JM109/pHINS21 и Е.соli JM109/pHГNS35.
В случае штамма-продуцента Е.соli JM109/pHINS21, клетки выращивают на питательной среде на основе гидролизата казеина и экстракта дрожжей Sассhаrотусеs сеrеvisiае. Для индукции синтеза гибридного белка в середине логарифмической фазы роста вносят 1-изoпpoпил-β-D-l-тиoгaлaктoпиpaнoзид
(ИПТГ). Культивирование продолжают до образования желательного уровня внутриклеточных включений гибридного белка (телец включения). После окончания выращивания культуру осаждают, клетки разрушают одним из приемлемых методов, и тельца включения отделяют центрифугированием. Осадок телец включения (паста) содержит около 5-7% гибридного белка проинсулина.
Выделение гибридного белка из телец включения, его ферментативное расщепление и очистку проинсулина проводят по следующей схеме:
• тельца включения растворяют в 0,1 M буфере трис-НСl, рН 8,0, содержащем 8 M мочевину и 10 мМ дитиотреитол в течение 16-24 часов; • гибридный белок ренатурируют в 10-кратном объеме 0, 1 M глицинового буфера, рН 9-11, при температуре 10-140C в течение 20-24 час;
• очистку ренатурированного гибридного белка проводят хроматографией на DЕАЕ-сефарозе FF, уравновешенной 0,05 M трис-НСl буфером, рН 7,0-7,5, содержащим 0,15 M NaCl. Белок элюируют линейным градиентом 0,15-0,4 M хлористого натрия в уравновешивающем буфере;
• очищенный гибридный белок расщепляют энтерокиназой (или ее каталитической субъединицей) в соотношении 1-10 Ед энтерокиназы на 1 мг белка в течение от 10 до 24 час при рН 7,0-8,5 и температуре 4-36°C. Реакцию останавливают, подкисляя гидролизат соляной кислотой до рН 4,6-5,0, а образовавшийся осадок примесных белков отделяют центрифугированием;
• проинсулин очищают ионообменной хроматографией на SР-сефарозе FF в 0,05-0,2 M аммоний-ацетатном буфере, рН 3,0-6,0, содержащем 1-2 M мочевину. Сорбированный белок элюируют линейным градиентом хлористого калия от 0 до 0,5 M в уравновешивающем буфере; • дальнейшую очистку проинсулина проводят методом обращенно- фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ).
В случае штамма-продуцента Е.соli JM109/pHINS35 клетки выращивают на питательной среде на основе гидролизата казеина и экстракта дрожжей Sассhаrотусеs сеrеvisiае. Для индукции синтеза гибридного белка в середине логарифмической фазы роста вносят 1-изoпpoпил-β-D-l-тиoгaлaктoпиpaнoзид (ИПТГ). Культивирование продолжают до образования желательного уровня внутриклеточных включений гибридного белка (телец включения). После окончания выращивания культуру осаждают, клетки разрушают одним из приемлемых методов, и тельца включения отделяют центрифугированием. Осадок телец включения (паста) содержит около 5-7% гибридного белка проинсулина. Выделение гибридного белка из телец включения, его ферментативное расщепление и очистку проинсулина проводят по следующей схеме:
• тельца включения растворяют в 0,1 M буфере трис-НСl, рН 8,0, содержащем 8 M мочевину и 10 мМ дитиотреитол в течение 16-24 часов;
• гибридный белок ренатурируют в 10-кратном объеме 0,1 M глицинового буфера, рН 9-11, при температуре 10-140C в течение 20-24 час;
• очистку ренатурированного гибридного белка проводят хроматографией на Q-сефарозе FF, уравновешенной 0,01 M трис-НСl буфером, рН 8,0. Белок элюируют линейным градиентом от 0 до 0,5 M хлористого натрия в уравновешивающем буфере; • очищенный гибридный белок расщепляют энтерокиназой (или ее каталитической субъединицей) в соотношении 1-10 Ед энтерокиназы на 1 мг белка в течение от 10 до 24 час при рН 7,0-8,5 и температуре 40-360C. Реакцию останавливают, подкисляя гидролизат соляной кислотой до рН 4,6-5,0, а образовавшийся осадок примесных белков отделяют центрифугированием; • проинсулин очищают ионообменной хроматографией на SР-сефарозе FF в 0,05-0,2 M аммоний-ацетатном буфере, рН 3,0-6,0, содержащем 1-2 M мочевину. Сорбированный белок элюируют линейным градиентом хлористого калия от 0 до 0,5 M в уравновешивающем буфере;
• дальнейшую очистку проинсулина проводят методом обращенно- фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ).
Способ получения инсулина
Кроме того, заявленный гибридный белок, например, продуцируемый штаммом Е.соli JM109/pHINS21 или штаммом Е.соli JM109/pHINS35, может быть использован в способе получения инсулина человека. При этом новый гибридный белок трансформируют в инсулин путем ферментативного расщепления указанного гибридного белка энтерокиназой, трипсином и карбоксипептидазой В. В качестве неограничивающего примера получение инсулина из гибридного белка, продуцируемого штаммами Е.соli JM109/pHINS21 и Е.соli JM109/pHINS35, проводят по следующей схеме:
• очищенный гибридный белок расщепляют совместным гидролизом энтерокиназой, трипсином и карбоксипептидазой В при соотношении 1-10 Ед. активности энтерокиназы на 1 мг гибридного белка и при массовом соотношении гибридный бeлoк:тpипcин:кapбoкcипeптидaзa В = (2000- 10000): l :(0,3- 10) при pH=7,0-8,5 и температуре 4-36°C. Реакцию останавливают добавлением 10%-нoгo раствора соляной кислоты до рН 3,6±0,3. • после ферментативного гидролиза гибридного белка инсулин очищают ионообменной хроматографией на SР-сефарозе FF в 0,05-0,2 M аммоний- ацетатном буфере, рН 3,0-6,0, содержащем 1-6 M мочевину и 10-50 мМ KCl. Сорбированный белок элюируют линейным градиентом хлористого калия от 0 до 0,5 M в уравновешивающем буфере. Аналогичные примеры получения проинсулина и инсулина можно проводить с любым гибридным белком общей формулы, представленной выше. Примеры с использованием плазмиды pHГNS21 и pHINS35 даны лишь в качестве иллюстративных и не предназначены для ограничения притязаний авторов изобретения. КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
На фиг.l представлена физическая карта рекомбинантной плазмиды pHINS21. Схема рекомбинантной плазмиды pHINS21 : Ptac - промотор транскрипции, TiT2 - rrпВ терминаторы транскрипции рибосомного оперона Е.соli, оri - участок инициации репликации, Ыа - ген β-лактамазы. В гене гибридного белка указаны кодирующие последовательности: lеаdеr - лидера, N- концевого фрагмента гамма-интерферона человека (SEQ ID NO: 1); liпкеr - пептидного линкера (SEQ ID NO:2), содержащего сайт расщепления энтерокиназой (EK); рrоiпsиliп - проинсулина человека (SEQ ID NO:3). Указанные уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции расположены на следующем расстоянии вправо от сайта EcoRI:BamHI - 159 п. о., Нраl - 185 п.о., НiпdΙII - 442 п.о., Рvu 1 - 1382 п.о.
На фиг.2 представлена физическая карта рекомбинантной плазмиды pHINS35. Схема рекомбинантной плазмиды pHINS35: Ptac - промотор транскрипции, TiT2 - rrпВ терминаторы транскрипции рибосомного оперона Е.соli, оri - участок инициации репликации, Ыа - ген β-лактамазы. В гене гибридного белка указаны кодирующие последовательности: lеаdеr - лидера, N- концевого фрагмента гамма-интерферона человека (SEQ ID NO: 8); liпкеr - пептидного линкера (SEQ ID NO: 9), содержащего сайт расщепления энтерокиназой (EK); рrоiпsиliп - проинсулина человека (SEQ ID NO:3). Указанные уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции расположены на следующем расстоянии вправо от сайта ЕсоRI: Sасl - 121 п. о., ВаmНI - 144 и.о., Нраl - 170 п.о., НiпdΙII - 427 п.о., Рvu 1 - 1367 п.о.
На фиг.З показан ВЭЖХ анализ материала, полученного после очистки ренатурированного гибридного белка (HINS21) (SEQ ID NO :4) с проинсулином человека на DЕАЕ-сефарозе.
На фиг.4 показан ВЭЖХ анализ продуктов расщепления гибридного белка (HINS21) (SEQ ID NO:4) с проинсулином человека энтерокиназой.
На фиг.5 показан ВЭЖХ анализ продуктов расщепления гибридного белка (HINS21) (SEQ ID N0:4) с проинсулином человека энтерокиназой, трипсином и карбоксипептидазой В.
На фиг.6 показан ВЭЖХ анализ материала, полученного после очистки ренатурированного гибридного белка (HINS35) (SEQ ID NO:7) с проинсулином человека на Q-сефарозе.
На фиг.7 показан ВЭЖХ анализ продуктов расщепления гибридного белка (HINS35) (SEQ ID NO:7) с проинсулином человека энтерокиназой.
На фиг.8 показан ВЭЖХ анализ продуктов расщепления гибридного белка (HINS35) (SEQ ID NO:7) с инсулином человека энтерокиназой, трипсином и карбоксипептидазой В.
На фиг.9 показан ВЭЖХ анализ проинсулина человека, полученного из гибридного белка (HINS21) (SEQ ID NO :4) и очищенного методом обращено- фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. ПРИМЕРЫ
Изобретение иллюстрируется следующими не ограничивающими его примерами. Пример 1. Конструирование плазмиды pHINS21
Плазмиду pHINS21 конструируют на основе известной плазмиды pHINS05 [9]. Плазмидную ДНК pHINS05 подвергают полному гидролизу рестриктазами BcII и Нраl. Для этого 5 мкг плазмидной ДНК pHINS05 в 20 мкл буфера, содержащего 33 мМ трис-ацетата, рН 7,9, 66 мМ К-ацетата, 10 мМ Mg- ацетата и 0,1 мг/мл БСА (буфер 1) и 10 Ед рестриктазы BcII и Нраl инкубируют 1,0 час при 370C. Из полученного гидролизата выделяют фрагмент ДНК BcII- Нраl размером около 4,2 т.п.о. при помощи электрофореза в 0,8% геле легкоплавкой агарозы. Далее ДНК депротеинизируют фенолом, смесью фенола с хлороформом (1 :1), хлороформом, осаждают этиловым спиртом, растворяют в 20 мкл воды. Полученный фрагмент Всll-Нраl, содержащий ген гибридного белка и векторную часть плазмиды pHINS05, лигируют с 20-кратным молярным избытком олигонуклеотидного дуплекса, полученного в результате отжига синтетических олигонуклеотидов: смыслового, представленного в последовательности SEQ ID NO:8, и антисмыслового, представленного в последовательности SEQ ID NO:9.
В результате в ген гибридного белка перед ДНК проинсулина человека встраивается нуклеотидная последовательность, кодирующая сайт расщепления энтерокиназы. Компетентные клетки штамма Е.соli JM 109 трансформируют лигированной смесью (10 мкл) и высевают на LВ-агар, содержащий 100 мкг/мл ампициллина. Из выросших колоний выделяют плазмидную ДНК и секвенируют между сайтами рестриктаз ЕсоRI и Нраl для подтверждения вставки в линкерную часть гена гибридного белка. В результате получают плазмиду pHINS20.
Для получения плазмиды с делецией по rор-гену (негативному регулятору копийности) к 5 мкг плазмидной ДНК pHINS20 в 20 мкл буфера 1 добавляют 10 Ед рестриктазы Eco47Ш и Sпаl, генерирующие "тупые" концы, и смесь инкубируют 1 час при 370C. Далее ДНК депротеинизируют фенолом, смесью фенола с хлороформом (1 :1), хлороформом, осаждают этиловым спиртом, растворяют в 20 мкл воды. Полученную таким образом ДНК лигируют в 30 мкл буфера для лигирования в присутствии 5 Ед ДНК лигазы фага T4 в течение 16 час при 80C. Лигированной смесью (10 мкл) трансформируют компетентные клетки штамма Е.соli JM 109 и высевают на LВ-агар, содержащий 100 мкг/мл ампициллина. Отбирают бактериальные клоны, несущие плазмидную ДНК размером 3,6 т.п.о. Выделенные плазмиды подвергают рестрикционному анализу и секвенируют по методу Сенгера. В результате получают плазмиду pHINS21.
Пример 2. Получение штамма Е.соli JM109/pHINS21 и определение уровня его продуктивности
Плазмидой pHINS21 трансформируют компетентные клетки штамма Е.соli JM 109 и высевают на LВ-агар, содержащий 100 мкг/мл ампициллина. Отдельно локализованную колонию трижды пересевают на чашки с LВ-агаром, содержащим 100 мкг/мл ампициллина. Полученной моноклональной культурой инокулируют 5 мл жидкой среды LB с ампициллином и инкубируют в течение ночи при интенсивном встряхивании, при 370C. Полученный штамм-продуцент Е.соli JM109/pHINS21 хранят в 20% глицерине при минус 4O0C.
Для определения уровня индуцируемой экспрессии гибридного белка, ночную культуру засевают в разведении 1 :50 в 5 мл жидкой среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и выращивают до мутности 0,8 при 370C на шейкере при 200 об/мин. К культуре добавляют ИПТГ до концентрации 1,0 мМ, и продолжают инкубацию в тех же условиях в течение 3 час. Клетки собирают центрифугированием, осадок суспендируют в буфере, содержащем 62,5 мМ трис-НСl, рН 6,8, 3% додецилсульфата натрия, 5% 2-мepкaптoэтaнoлa, 10% глицерина и 0,01% бромфенолового синего, и прогревают 3 мин на кипящей водяной бане. Полученный лизат клеток анализируют электрофорезом в 18% полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия [12]. Гель окрашивают Сооmаssiе R-250, сканируют и проводят его денситометрию. По данным денситометрии содержание гибридного белка составляет не менее 30% от общего белка клетки. Пример 3. Получение штамма Е.соli BL21/pHГNS21 и определение уровня его продуктивности
Компетентные клетки штамма Е.соli BL21 трансформируют плазмидной ДНК pHINS21 и высевают на LВ-агар, содержащий 100 мкr/мл ампициллина. Отдельно локализованную колонию трижды пересевают на чашки с LВ-агаром, содержащим 100 мкг/мл ампициллина. Полученной моноклональной культурой инокулируют 5 мл жидкой среды LB и инкубируют в течение ночи при интенсивном встряхивании, при 37°C.
Полученный штамм-продуцент Е.соli BL21/pHINS21 хранят в 20% глицерине при минус 400C.
Определение продуктивности штамма Е.соli BL21/pHINS21 проводят таким же методом, как и для штамма Е.соli JM109/pHINS21, описанным в примере 2. По данным денситометрии содержание гибридного белка в индуцированных клетках полученного штамма составляет не менее 30% от общего белка клетки.
Пример 4. Получение проинсулина человека при использовании штамма- продуцента E. соli JM 109/pHINS21 Этап 1. Выделение телец включения, содержащих гибридный белок с проинсулином человека
Выращивают культуру штамма Е.соli JM109/pHINS21 на питательной среде на основе гидролизата казеина и экстракта пекарских дрожжей. Индукцию биосинтеза гибридного белка проводят внесением индуктора ИПТГ в середине логарифмической фазы роста культуры. Культивирование продолжают до образования внутриклеточных включений гибридного белка. После завершения выращивания культуру осаждают и используют для выделения телец включения, содержащих гибридный белок.
Клетки суспендируют в буфере А, содержащем 50 мМ натрия фосфорнокислого двузамещенного, 1 мМ ЭДТА, 0,2 M хлорида натрия из расчета на 1 г биомассы 5-10 мл буфера, и разрушают на дезинтеграторе Гаулина. Разрушенные клетки центрифугируют в течение 20 мин на Beckman J- 301 при 8000 об./мин. Полученный осадок ресуспендируют в буфере А, содержащем 1% Тritоп X-100, инкубируют в течение 1 час, и суспензию центрифугируют в течение 20 мин на Beckman J-ЗОI при 8000 об/мин. Осадок повторно ресуспендируют в буфере А и осаждают на центрифуге. Отмытый осадок телец включения (паста), содержащий около 5% гибридного белка, фасуют, замораживают и хранят при минус 400C.
Этап 2. Ренатурация и выделение гибридного белка
Размороженную пасту телец включения (5 г) растворяют в 100 мл буферного раствора, содержащего 0,1 M трис-НСl, рН 8,0, 10 мМ дитиотреитол и 8 M мочевину, и инкубируют при перемешивании в течение 20 час при 140C. Раствор центрифугируют в течение 20 мин на Весkmап J-ЗОI при скорости 8000 об./мин при 14°C. Ренатурацию гибридного белка, содержащегося в супернатанте, проводят 10-кратным разбавлением в 0,1 M глициновом буфере, рН 9-11. Раствор гибридного белка инкубируют в течение 24 час, перемешивая и поддерживая температуру 10-140C. Процесс ренатурации гибридного белка контролируют методом ОФ ВЭЖХ. После образования правильно замкнутых S-S связей у 50-70% молекул гибридного белка, раствор подкисляют 2 н соляной кислотой до рН 7,0-7,2, а образующийся осадок отделяют центрифугированием.
Содержание ренатурированного гибридного белка в супернатанте составляет 112 мг.
Раствор гибридного белка наносят на колонку объемом 100 мл, заполненную DЕАЕ-сефарозой FF, предварительно уравновешенную 0,05 M трис-НСl буфером, рН 7,0-7,5. Колонку промывают уравновешивающим буфером, содержащим 0,15 M NaCl. Сорбированный белок элюируют линейным градиентом 0,15-0,4 M хлорида натрия в уравновешивающем буфере. Содержание гибридного белка анализируют методом ОФ ВЭЖХ (фиг.З). Фракции, содержащие гибридный белок с чистотой не менее 50%, объединяют. В результате получают 95 мг очищенного гибридного белка, концентрация которого составляет 1 ,34 мг на 1 мл раствора. Соответствие полученного гибридного белка подтверждали методом масс-спектрометрии по совпадению с расчетной молекулярной массой указанного белка.
Этап 3. Ферментативное расщепление гибридного белка
Реакцию ферментативного гидролиза проводят при температуре 25°C при постоянном перемешивании. Раствор очищенного гибридного белка подщелачивают до рН 8,0 и добавляют CaCl2 до концентрации 1 мМ. Затем в реакционную смесь вносят раствор рекомбинантной энтерокиназы (каталитической субъединицы энтерокиназы быка) (Nоvаgеп) из расчета 4 Ед на
1 мr белка и инкубируют в течение 16 час. Продукты гидролиза гибридного белка анализируют методом ОФ ВЭЖХ. Реакцию расщепления останавливают, подкисляя материал 2 н соляной кислотой до рН 4,0-5,0. Образовавшийся осадок примесных белков отделяют центрифугированием. На фиг.4 представлен анализ ВЭЖХ продуктов расщепления гибридного белка энтерокиназой после 16 час инкубации.
Этап 4. Очистка проинсулина человека
Осветленный раствор, содержащий проинсулин, наносят на хроматографическую колонку объемом 50 мл, заполненную SР-сефарозой FF, предварительно уравновешенную 0,03 M аммоний-ацетатным буфером, рН 5,0, с
2 M мочевиной. Колонку промывают уравновешивающим буфером до достижения базовой линии контрольного проточного денситометра. Элюцию сорбированного проинсулина проводят линейным градиентом хлористого калия от 0 до 0,5 M в уравновешивающем буфере. Содержание и чистоту проинсулина человека в собираемых фракциях определяют методом ОФ ВЭЖХ. Объединенные фракции содержат 54 мг проинсулина человека с чистотой не менее 85%.
Дальнейшую очистку проинсулина проводят методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией. Колонку 250x30 мм, заполненную Кромасилом С 18, уравновешивают 10%-м ацетонитрила с 0,1% трифторуксусной кислотой, и подают раствор проинсулина с предыдущей стадии очистки в количестве 54 мг белка. Белок элюируют градиентом ацетонитрила (с 0,1% трифторуксусной кислотой) от 10% до 50%. Собранные фракции основного пика проинсулина анализируют на содержание примесей методом ОФ ВЭЖХ.
После очистки получают 46 мг высокоочищенного проинсулина человека с содержанием основного вещества 95% (фиг.9).
Подлинность полученного целевого продукта подтверждена по совпадению расчетной молекулярной массы проинсулина человека с молекулярной массой целевого продукта, определенной методом масс- спектрометрии . Пример 5
Гибридный белок получают, как описано в примере 4 (этап 2). Очищенный гибридный белок расщепляют энтерокиназой из природного источника. Реакцию ферментативного расщепления гибридного белка проводят при температуре 250C при постоянном перемешивании. К раствору очищенного гибридного белка добавляют CaCl2 до концентрации 1 мМ. Затем в реакционную смесь вносят раствор энтерокиназы (Sigmа, США) из расчета 2 Ед на 1 мг белка и инкубируют в течение 16 час. Продукты гидролиза гибридного белка анализируют методом ОФ ВЭЖХ. Реакцию расщепления останавливают, подкисляя материал 2 н соляной кислотой до рН 4,0-5,0.
Дальнейшую очистку проинсулина проводят, как описано в примере 4 (этап 4).
Пример 6. Получение инсулина человека при использовании штамма- продуцента E. соli JM 109/pHINS21
Очищенный гибридный белок получают, как описано в примере 4 (этап 2), и подвергают совместному гидролизу энтерокиназой, трипсином и карбоксипептидазой В.
В 10 мл раствора очищенного гибридного белка (1,25 мг/мл) раствора вносят рекомбинантную энтерокиназу (Nоvаgеп) из расчета 4 Ед на 1 мг гибридного белка. Затем добавляют бычий панкреатический трипсин, обработанный тазилфенилаланилхлорметилкетоном (трипсин-ТФХК, Sigmа), и свиную панкреатическую карбоксипептидазу В в массовом соотношении гибридный белок : трипсин : карбоксипептидаза В, равном 5000:1:1,3, и проводят гидролиз при постоянном перемешивании в течение 8 часов при рН 8,0 и температуре 24°C. Реакцию останавливают, подкисляя гидролизат 10%-ным раствором соляной кислоты до рН 3,6±0,3.
На фиг.5 представлен анализ ВЭЖХ продуктов расщепления гибридного белка (HINS21) энтерокиназой, трипсином и карбоксипептидазой В после 8 час инкубации.
Полученный гидролизат наносят на хроматографическую колонку объемом 5 мл, заполненную SР-сефарозой FF, предварительно уравновешенную буфером: 2 M мочевина, 0,1 M аммоний ацетат, рН 3,6. Промывку колонки проводят тем же буфером. Элюцию сорбированного инсулина проводят линейным градиентом концентрации хлористого калия от 0 до 0,5 M в уравновешивающем буфере. Объединяют фракции, содержащие 3,2 мг инсулина с чистотой не менее 85% (контроль методом ОФ ВЭЖХ). Пример 7
Реакцию ферментативного гидролиза проводят как описано в примере 6, только к раствору очищенного гибридного белка добавляют CaCl2 до концентрации 1 мМ. Пример 8
Очищенный гибридный белок получают, как описано в примере 4 (этап 2), и подвергают совместному гидролизу энтерокиназой, трипсином и карбоксипептидазой В.
В 10 мл раствора очищенного гибридного белка (1,2 мг/мл) добавляют CaCl2 до концентрации 1 мМ и вносят рекомбинантную энтерокиназу (Nоvаgеп) из расчета 2 Ед на 1 мг гибридного белка, и проводят гидролиз при постоянном перемешивании в течение 2 часов при рН 8,0 и температуре 24°C.
Затем добавляют бычий панкреатический трипсин, обработанный тазилфенилаланилхлорметилкетоном (трипсин-ТФХК, Sigmа), и свиную панкреатическую карбоксипептидазу В в массовом соотношении гибридный белок : трипсин : карбоксипептидаза В, равном 4000:1 :1,3, и проводят дальнейший гидролиз в течение 5 часов. Реакцию останавливают, подкисляя гидролизат 10%-ным раствором соляной кислоты до рН 3,6±0,3.
Пример 9. Совместный гидролиз гибридного белка из штамма Е.соli JM109/pHINS21 энтерокиназой, трипсином и карбоксипептидазой В
Условия проведения совместного гидролиза гибридного белка (ГБ) энтерокиназой, трипсином и карбоксипептидазой В приведены в таблице 1.
Таблица 1
Figure imgf000024_0001
Figure imgf000025_0001
Пример 10. Конструирование плазмиды pHINS35
Плазмиду pHINS35, кодирующую укороченную лидерную последовательность гибридного белка с проинсулином человека, конструируют на основе плазмиды pHINS21. Для получения фрагмента ДНК, кодирующего укороченную лидерную последовательность гибридного белка, проводят полимеразную цепную реакцию на плазмиде pHINS21 с использованием олигонуклеотидных праймеров: прямого, представленного в последовательности SEQ ID NO: 10, и обратного, представленного в последовательности SEQ ID NO: 11. ПЦР проводят на матрице 5-10 нг плазмидной ДНК pHINS21 в присутствии 20 пмоль каждого из праймеров в 50 мкл буфера для амплификации и 2,5 Ед термостабильной ДНК полимеразы, в следующем режиме: денатурация - 95°C, 20 сек; отжиг - 660C, 20 сек; полимеризация - 72°C, 20 сек; 30 циклов амплификации. Далее продукт амплификации депротеинизируют фенолом, смесью фенол с хлороформом (1 :1), хлороформом, осаждают этиловым спиртом, растворяют в 30 мкл воды. Амплифицированную ДНК гидролизуют рестриктазой ЕсоRI в буфере, содержащем 33 мМ Трис-ацетата, рН 7,9, 66 мМ К-асетата, 10 мМ Мg-ацетата и 0,1 мг/мл БСА 3,0 ч при 37°C. Далее смесь прогревают 10 мин при 70°C для инактивации фермента, и ДНК осаждают этиловым спиртом.
В результате получают фрагмент ДНК размером около 120 п. о. с выступающим липким концом, образованным рестриктазой ЕсоRI. Полученный фрагмент вставляют в плазмиду pHINS21 между сайтом рестриктазы ЕсоRI и сайтом рестриктазы Smаl, расположенным на расстоянии 138 п.о. вправо от сайта ЕсоRI.
Для этого плазмидную ДНК pHINS21 подвергают полному гидролизу рестриктазами ЕсоRI и Smаl. 5 мкг плазмидной ДНК pHINS21 в 20 мкл буфера, содержащего 33 мМ трис-ацетата, рН 7,9, 66 мМ К-ацетата, 10 мМ Мg-ацетата и 0,1 мг/мл БСА (буфер 1) и 10 Ед рестриктазы ЕсоRI и Smаl, инкубируют 1,0 час при 370C. Из полученного гидролизата выделяют фрагмент ЕсоRI-SmаΙ плазмиды pHГNS21 размером около 3,5 т.п. о. при помощи электрофореза в 0,8% геле легкоплавкой агарозы. Далее ДНК депротеинизируют фенолом, смесью фенола с хлороформом (1 :1), хлороформом, осаждают этиловым спиртом, растворяют в 20 мкл воды. Полученный фрагмент ЕсоRI-SmаΙ плазмиды pHINS21, лигируют с ранее амплифицированным фрагментом ДНК с выступающим липким концом рестриктазы ЕсоRI. Компетентные клетки штамма Е.соli JM 109 трансформируют лигированной смесью и высевают на LВ-агар, содержащий 100 мкг/мл ампициллина. Отбирают бактериальные клоны, несущие плазмидную ДНК размером 3,6 т.п. о. Выделенные плазмиды подвергают рестрикционному анализу и секвенируют по методу Сенгера. В результате получают плазмиду pHINS35. Пример 1 1. Получение штамма Е.соli JM109/pHГNS35
Плазмидой pHINS35 трансформируют компетентные клетки штамма Е.соli JM 109 и высевают на LВ-агар, содержащий 100 мкг/мл ампициллина. Отдельно локализованную колонию трижды пересевают на чашки с LВ-агаром, содержащим 100 мкг/мл ампициллина. Полученной моноклональной культурой инокулируют 5 мл жидкой среды LB с ампициллином, и инкубируют в течение ночи при интенсивном встряхивании, при 37°C.
Полученный штамм-продуцент Е.соli JM109/pHINS35 хранят в 20% глицерине при минус 4O0C.
Определение продуктивности штамма Е.соli BL21/pHINS35 проводят таким же методом, как и для штамма Е.соli JM109/pHINS21, описанным в примере 2. По данным денситометрии содержание гибридного белка в индуцированных клетках полученного штамма составляет не менее 30% от общего белка клетки.
Пример 12. Получение проинсулина человека при использовании штамма-продуцента Е.соli JM109/pHINS35
Этап 1. Выделение телец включения, содержащих гибридный белок с проинсулином человека
Выращивают культуру штамма Е.соli JM109/pHINS35 на питательной среде на основе гидролизата казеина и экстракта пекарских дрожжей. Индукцию биосинтеза гибридного белка проводят внесением индуктора ИПТГ в середине логарифмической фазы роста культуры. Культивирование продолжают до образования внутриклеточных включений гибридного белка. После завершения выращивания культуру осаждают и используют для выделения телец включения, содержащих гибридный белок проинсулина.
Клетки суспендируют в буфере А, содержащем 50 мМ натрия фосфорнокислого двузамещенного, 1 мМ ЭДТА, 0,2 M хлорида натрия из расчета на 1 г биомассы 5-10 мл буфера, и разрушают на дезинтеграторе
Гаулина. Разрушенные клетки центрифугируют в течение 20 мин на Beckman J-
301 при 8000 об./мин. Полученный осадок ресуспендируют в буфере А, содержащем 1% Тгitоп X-100, инкубируют в течение 1 час, и суспензию центрифугируют в течение 20 мин на Beckman J-ЗОI при 8000 об/мин. Осадок повторно ресуспендируют в буфере А и осаждают на центрифуге. Отмытый осадок телец включения (паста), содержащий около 5% гибридного белка проинсулина, фасуют, замораживают и хранят при минус 4O0C.
Этап 2. Ренатурация и выделение гибридного белка
Размороженную пасту телец включения (5 г) растворяют в 100 мл буферного раствора, содержащего 0,1 M трис-НСl, рН 8,0, 10 мМ дитиотреитол и
8 M мочевину, и инкубируют при перемешивании в течение 18 часов при 140C.
Раствор центрифугируют в течение 20 мин на Beckman J-ЗОI при скорости 8000 об./мин при 140C. Ренатурацию гибридного белка; ~ содержащегося в супернатанте, проводят 10-кратным разбавлением в 0,1 M глициновом буфере, рН 9-11. Раствор гибридного белка инкубируют в течение 24 час, перемешивая и поддерживая температуру 10-140C. Процесс ренатурации гибридного белка контролируют методом ОФ ВЭЖХ. После образования правильно замкнутых S-S связей у 50-70% молекул гибридного белка раствор подкисляют 2 н соляной кислотой до рН 7,0-7,2, а образующийся осадок отделяют центрифугированием.
Содержание ренатурированного гибридного белка в супернатанте составляет 97 мг. Раствор гибридного белка наносят на колонку объемом 100 мл, заполненную Q-сефарозой FF, предварительно уравновешенную 0,01 M трис- HCl буфером, рН 8,0 и колонку промывают уравновешивающим буфером. Сорбированный белок элюируют линейным градиентом от 0 до 0,5 M хлорида натрия в уравновешивающем буфере. Содержание гибридного белка анализируют методом ОФ ВЭЖХ (фигура 6). Фракции, содержащие гибридный белок с чистотой не менее 50% объединяют. В результате получают 81 мг очищенного гибридного белка, концентрация которого составляет 1,27 мг на 1 мл раствора.
Соответствие полученного гибридного белка с проинсулином человека подтверждали методом масс-спектрометрии по совпадению с расчетной молекулярной массой указанного белка.
Этап 3. Ферментативное расщепление гибридного белка
Реакцию ферментативного гидролиза проводят при температуре 250C при постоянном перемешивании. К раствору очищенного гибридного белка добавляют CaCl2 до концентрации 1 мМ. Затем в реакционную смесь вносят раствор рекомбинантной энтерокиназы (Nоvаgеп) из расчета 4 Ед на 1 мг белка и инкубируют в течение 20 час. Продукты гидролиза гибридного белка анализируют методом ОФ ВЭЖХ. На фиг.7 представлен анализ ВЭЖХ продуктов расщепления гибридного белка энтерокиназой после 20 час инкубации. Реакцию расщепления останавливают, подкисляя материал 2 н соляной кислотой до рН 4,0-5,0. Образовавшийся осадок примесных белков отделяют центрифугированием.
Этап 4. Очистка проинсулина человека
Осветленный раствор, содержащий проинсулин, наносят на хроматографическую колонку объемом 50 мл, заполненную SР-сефарозой FF, предварительно уравновешенную 0,03 M аммоний-ацетатным буфером, рН 5,0, с
2 M мочевиной. Колонку промывают уравновешивающим буфером до достижения базовой линии контрольного проточного денситометра. Элюцию сорбированного проинсулина проводят линейным градиентом хлористого калия от 0 до 0,5 M в уравновешивающем буфере. Содержание и чистоту проинсулина человека в собираемых фракциях определяют методом ОФ ВЭЖХ. Объединенные фракции содержат 47 мг проинсулина человека с чистотой не менее 85%.
Дальнейшую очистку проинсулина проводят методом ОФ ВЭЖХ, как описано в примере 4 (этап 4). После очистки получают 39 мг высокоочищенного проинсулина человека с содержанием основного вещества 94%. Пример 13. Получение инсулина человека при использовании штамма- продуцента Е.соli JM109/pHINS35
Полученный в примере 12 (этап 2) гибридный белок с проинсулином человека подвергали гидролизу энтерокиназой, трипсином и карбоксипептидазой В одновременно. В 10 мл раствора очищенного гибридного белка (1,16 мг/мл) раствора вносят рекомбинантную энтерокиназу (Nоvаgеп) из расчета 4 Ед на 1 мг гибридного белка. Затем добавляют бычий панкреатический трипсин, обработанный тазилфенилаланилхлорметилкетоном (трипсин-ТФХК, Sigmа), и свиную панкреатическую карбоксипептидазу В в массовом соотношении гибридный белок : трипсин : карбоксипептидаза В, равном 5000:1 :1,5, и проводят гидролиз при постоянном перемешивании в течение 8 часов при рН 8,0 и температуре 24°C. Реакцию останавливают, подкисляя гидролизат 10%-ным раствором соляной кислоты до рН 3,6±0,3.
На фиг.8 представлен анализ ВЭЖХ продуктов расщепления гибридного белка энтерокиназой, трипсином и карбоксипептидазой В после 8 час инкубации.
Полученный гидролизат наносят на хроматографическую колонку объемом 5 мл, заполненную SР-сефарозой FF, предварительно уравновешенную буфером: 2 M мочевина, 0,1 M аммоний ацетат, рН 3,6. Промывку колонки проводят тем же буфером. Элюцию сорбированного инсулина проводят линейным градиентом концентрации хлористого калия от 0 до 0,5 M в уравновешивающем буфере. Объединяют фракции, содержащие 2,6 мг инсулина с чистотой не менее 85% (контроль методом ОФ ВЭЖХ). СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Патент РФ 2203949. Способ получения проинсулина человека.
2. Патент США 5952461. Ргосеss fог рrерагiпg humап ргоiпsuliп.
3. Европейский патент EP 1042479. А ргосеss fог рrерагiпg humап ргоiпsuliп.
4. Wеi G., Hu M. H., Тапg L. G. // Вiосhеm. MoI. Вiоl. Iпt, 1995, v.35, p.37- 46.
5. Nilsоп J., Jопаssоп Р., Sаmuеlssоп E., Stаhl S., Uhlеп M. // Jоumаl оf biоtесhпоlоgу, 1996, v.48, p.241-250. 6. Патент РФ RU 2208637 Cl, 20.07.2003.
7. Тапg J., Хuе Y., Fап X., Fu Y. // Сliп. J. Вiоtесhпоl., 1993, v.9, p.71-78.
8. Веrg H., Wаltег M., Маuсh L., Sеisslег J., Nоrthеmапп W. J. // Immuпоl. Меthоds, 1993, v.164, p.221-231.
9. Патент РФ 2263147 Cl, 27.10.2005. Бюлл. JN° 30. 10. Тwigg AJ. апd Shеrrаt D.//Natuгe, 1980, v.283, p.216-218.
1 1. Вrоsius J., DuIl T.J., Slееtег D.D., Nоllег H.F.//J. MoI. Вiоl., 1981, v.148, p.107-127.
12. Lаеmmli U.K.//Natuгe, 1970, v.227, p.680-687.
13. Патент США tt°5258698

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Гибридный белок, предшественник проинсулина человека, общей формулы:
[лидер] - [линкер] - [энтерокиназный сайт] - [проинсулин] , где лидер представляет собой гамма-интерферон человека, N-концевой фрагмент гамма-интерферона человека, иммуноглобулин-связывающий домен белка А Stарhуlососсus аurеus, бычий протимозин, глутатион-S-трансферазу, лидерную последовательность, кодируемую вектором pET23 МеtАlаSегМеtТhгGlуGlуGlпGlпМеtGlуАгgΙlеАгgΙlе; искусственные последовательности МеtАsрНisРrо и МеtАsрНisGlу; линкер представляет собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:6; His6GlySer; His4GlySer; и пептидов, предпочтительно содержащих глицин и серии длиной приблизительно 10-15 аминокислотных остатков; энтерокиназный сайт имеет последовательность (Asp)4Lys; проинсулин представляет собой последовательность SEQ ID NO:3.
2. Гибридный белок по п.l, в котором лидер представляет собой N- концевой фрагмент гамма-интерферона человека (SEQ ID NO: 1); пептидный линкер представляет собой линкер, представленный как SEQ ID NO:2, содержащий сайт расщепления энтерокиназы; и проинсулин человека представлен последовательностью SEQ ID NO:3.
3. Гибридный белок по п.l, в котором лидер представляет собой N- концевой фрагмент гамма-интерферона человека (SEQ ID NO:5); пептидный линкер представляет собой линкер, представленный как SEQ ID NO: 6, содержащий сайт расщепления энтерокиназы; и проинсулин человека представлен последовательностью SEQ ID NO:3.
4. ДНК, кодирующая гибридный белок по любому из пп.1-3.
3. Рекомбинантная плазмида, содержащая ДНК по п.4 и регуляторные элементы.
4. Рекомбинантная плазмида по п.З, содержащая ДНК, кодирующая гибридный белок по п.2, и регуляторные элементы.
5. Рекомбинантная плазмида по п.З, содержащая ДНК, кодирующая гибридный белок по п.З, и регуляторные элементы.
6. Рекомбинанатная плазмида по любому из пп.3-5, где регуляторный элемент выбран из группы, состоящей из промоторной и терминаторной области, участка инициации репликации (огi) плазмиды и генетического маркера, определяющего устойчивость к антибиотику.
7. Рекомбинантная плазмида pHINS21, представленная на фиг.l, содержащая ДНК, кодирующую гибридный белок по п.2, при этом указанная плазмида включает уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции, расположенные на следующем расстоянии вправо от сайта ЕсоRI: ВаmНI - 159 п.о., Нраl - 185 п.о., НiпdΙII - 442 п.о., Рvul - 1382 п.о.
8. Рекомбинантная плазмида pHГNS35, представленная на фиг.2, содержащая ДНК, кодирующую гибридный белок по п.З, при этом указанная плазмида включает уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции, расположенные на следующем расстоянии вправо от сайта ЕсоRI: Sасl - 121 п.о., ВаmНI - 144 п.о., Нраl - 170 п.о., НiпdΙИ - 427 п.о., Рvul - 1367 п.о.
9. Трансформированная клетка Еsсhеriсhiа соli, содержащая рекомбинантную плазмидную ДНК pHINS21 по любому из п.6-8.
10. Штамм бактерий Еsсhеriсhiа соli JM109/pHINS21, зарегистрированный под номером B-6429 в Коллекции микроорганизмов Государственного Научного Центра Прикладной Микробиологии и Биотехнологии.
11. Штамм бактерий Еsсhеriсhiа соli JM109/pHINS35, зарегистрированный под номером B-6430 в Коллекции микроорганизмов Государственного Научного Центра Прикладной Микробиологии и Биотехнологии.
12. Способ получения проинсулина человека, включающий культивирование трансформированных клеток по п.9 или штаммов бактерий E. соli по п.10 или 11, разрушение бактериальных клеток, выделение телец включения, их растворение в буфере, содержащем мочевину и дитиотреитол, ренатурацию и очистку ренатурированного гибридного белка с проинсулином человека, расщепление гибридного белка высокоспецифичной протеиназой, очистку и получение целевого продукта.
13. Способ по п.12, отличающийся тем, что в качестве штамма-продуцента используется штамм Е.соli
JM109/pHINS21.
14. Способ по п.12, отличающийся тем, что в качестве штамма-продуцента используется штамм Е.соli JM109/pHINS35.
15. Способ по любому из пп.12-14, отличающийся тем, что расщепление гибридного белка с проинсулином человека проводят энтерокиназой (или ее каталитической субъединицей), полученный после ферментативного расщепления проинсулин очищают ионообменной хроматографией на сорбентах с сульфопропильными группами.
16. Способ по любому из пп.12-15, отличающийся тем, что после ферментативного расщепления гибридного белка очистку проинсулина проводят хроматографией на SР-сефарозе FF в 0,05-0,2 M аммоний- ацетатном буфере, рН 3,0-6,0, содержащем 1-2 M мочевину, а сорбированный белок элюируют линейным градиентом хлористого калия от 0 до 0,5 M в уравновешивающем буфере.
17. Способ получения инсулина человека, включающий культивирование трансформированных клеток по п.9 или штаммов бактерий Е.соli по п.10 или 11, разрушение бактериальных клеток, выделение телец включения, их растворение в буфере, содержащем мочевину и дитиотреитол, ренатурацию и очистку ренатурированного гибридного белка с проинсулином человека, расщепление гибридного белка высокоспецифичной протеиназой, трипсином и карбоксипептидазой В, очистку и получение целевого продукта.
18. Способ по п.17, отличающийся тем, что в качестве штамма-продуцента используется штамм Е.соli JM109/pHINS21.
19. Способ по п.17, отличающийся тем, что в качестве штамма-продуцента используется штамм Е.соli JM109/pHINS35.
20. Способ по любому из пп.17-19, отличающийся тем, что расщепление гибридного белка с проинсулином человека проводят совместным гидролизом энтерокиназой, трипсином и карбоксипептидазой В, полученный после ферментативного расщепления инсулин очищают ионообменной хроматографией на сорбентах с сульфопропильными группами.
PCT/RU2008/000658 2007-10-22 2008-10-21 Plasmide recombinant phins21 codant une protéine hybride avec la proinsuline humaine, souche de bactéries escherichia coli jm109/ phins21 productrice de la protéine hybride avec la proinsuline humaine et procédé de fabrication de proinsuline humaine WO2009054754A1 (fr)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EA201070461A EA201070461A1 (ru) 2007-10-22 2008-10-21 РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pPHINS21, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК С ПРОИНСУЛИНОМ ЧЕЛОВЕКА, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI JM109/PHINS21 - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА С ПРОИНСУЛИНОМ ЧЕЛОВЕКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2007139262 2007-10-22
RU2007139262/13A RU2376368C2 (ru) 2007-10-22 2007-10-22 ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli JM109/pHINS21 - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА С ПРОИНСУЛИНОМ ЧЕЛОВЕКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2009054754A1 true WO2009054754A1 (fr) 2009-04-30

Family

ID=40579744

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2008/000658 WO2009054754A1 (fr) 2007-10-22 2008-10-21 Plasmide recombinant phins21 codant une protéine hybride avec la proinsuline humaine, souche de bactéries escherichia coli jm109/ phins21 productrice de la protéine hybride avec la proinsuline humaine et procédé de fabrication de proinsuline humaine

Country Status (3)

Country Link
EA (1) EA201070461A1 (ru)
RU (1) RU2376368C2 (ru)
WO (1) WO2009054754A1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013015697A1 (en) * 2011-07-28 2013-01-31 Mabion S.A. A recombinant protein, a polynucleotide encoding it as well as a method of obtaining insulin or its an analogue

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2728611C1 (ru) * 2019-05-24 2020-07-30 Закрытое акционерное общество "ФАРМ-ХОЛДИНГ" РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pF265, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ ПОЛИПЕПТИД, СОДЕРЖАЩИЙ ПРОИНСУЛИН ЧЕЛОВЕКА, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО ПОЛИПЕПТИДА, СОДЕРЖАЩЕГО ПРОИНСУЛИН ЧЕЛОВЕКА

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4751180A (en) * 1985-03-28 1988-06-14 Chiron Corporation Expression using fused genes providing for protein product
RU2208637C1 (ru) * 2002-04-16 2003-07-20 Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН Способ получения генно-инженерного инсулина человека
RU2263147C1 (ru) * 2004-02-16 2005-10-27 Открытое акционерное общество "Национальные биотехнологии" РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pHINS05, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ ПОЛИПЕПТИД, СОДЕРЖАЩИЙ ПРОИНСУЛИН ЧЕЛОВЕКА, КЛЕТКА ESCHERICHIA COLI, ТРАНСФОРМИРОВАННАЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК pHINS05, И ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI JM109/pHINS05 - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО ПОЛИПЕПТИДА, СОДЕРЖАЩЕГО ПРОИНСУЛИН ЧЕЛОВЕКА

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4751180A (en) * 1985-03-28 1988-06-14 Chiron Corporation Expression using fused genes providing for protein product
RU2208637C1 (ru) * 2002-04-16 2003-07-20 Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН Способ получения генно-инженерного инсулина человека
RU2263147C1 (ru) * 2004-02-16 2005-10-27 Открытое акционерное общество "Национальные биотехнологии" РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pHINS05, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ ПОЛИПЕПТИД, СОДЕРЖАЩИЙ ПРОИНСУЛИН ЧЕЛОВЕКА, КЛЕТКА ESCHERICHIA COLI, ТРАНСФОРМИРОВАННАЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК pHINS05, И ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI JM109/pHINS05 - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО ПОЛИПЕПТИДА, СОДЕРЖАЩЕГО ПРОИНСУЛИН ЧЕЛОВЕКА

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AKIYOSHI-SHIBATA ET AL.: "Further oxidation of hydroxycalcidiol by calcidiol 24-hydroxylase", EUR. J. BIOCHEM., vol. 224, 1994, pages 335 - 343 *
JONASSON PER ET AL.: "Single-step trypsin cleavage of a fusion protein to obtain human insulin and its C peptide.", EUR. J. BIOCHEM., vol. 236, 1996, pages 656 - 661 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013015697A1 (en) * 2011-07-28 2013-01-31 Mabion S.A. A recombinant protein, a polynucleotide encoding it as well as a method of obtaining insulin or its an analogue

Also Published As

Publication number Publication date
RU2376368C2 (ru) 2009-12-20
EA201070461A1 (ru) 2010-10-29
RU2007139262A (ru) 2009-04-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2521413B2 (ja) シグナル配列をコ―ドしているｄｎａと直接結合しているヒト成長ホルモンをコ―ドしているｄｎａ
DK166784B1 (da) Rekombinant dna-sekvens, en mikroorganisme indeholdende sekvensen og en fremgangsmaade til fremstilling af et eucaryot protein
EP0198015B1 (en) Production of streptavidin-like polypeptides
CA2605140C (en) Production of recombinant proteins by autoproteolytic cleavage of a fusion protein
KR960016560B1 (ko) 인체 과립구 콜로니 자극인자 폴리펩타이드 유도체, 이를 코드화하는 dna, dna를 함유하는 재조합 플라스미드, 플라스미드를 함유하는 미생물 및 폴리펩타이드를 제조하는 방법
KR100566136B1 (ko) 효소적으로 활성인 재조합 카르복시펩티다제 b의 생산
JPH07278195A (ja) 組み換えｇ−ｃｓｆ
NZ207414A (en) Expression of prorennin (prochymosin) using recombinant plasmids in an e. coli host
JPH11504217A (ja) 抗肥満タンパク質を製造する方法
JPH01502638A (ja) グラム陽性及びグラム陰性菌に対する活性を有するポリペプチド類
WO2010062279A1 (ru) Способ получения рекомбинантного инсулина человека
RU2354702C2 (ru) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pHINS11, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК-ПРЕДШЕСТВЕННИК ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА, КЛЕТКА Escherichia coli, ТРАНСФОРМИРОВАННАЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК pHINS11, ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli JM109/pHINS11 - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА-ПРЕДШЕСТВЕННИКА ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА
US5272254A (en) Production of streptavidin-like polypeptides
WO2007049829A1 (en) Method for preparing soluble and active recombinant proteins using pdi as a fusion partner
US4828988A (en) Hybrid polypeptides comprising somatocrinine and alpha1 -antitrypsin, method for their production from bacterial clones and use thereof for the production of somatocrinine
US5334532A (en) PDGF-B fusion protein, vectors, and host cells for use in production thereof
RU2144957C1 (ru) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pPINS07, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ ПОЛИПЕПТИД, СОДЕРЖАЩИЙ ПРОИНСУЛИН ЧЕЛОВЕКА, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО ПОЛИПЕПТИДА, СОДЕРЖАЩЕГО ПРОИНСУЛИН ЧЕЛОВЕКА
WO2009054754A1 (fr) Plasmide recombinant phins21 codant une protéine hybride avec la proinsuline humaine, souche de bactéries escherichia coli jm109/ phins21 productrice de la protéine hybride avec la proinsuline humaine et procédé de fabrication de proinsuline humaine
CN104119445A (zh) 含有富含亮氨酸重复序列的融合蛋白及其制法和应用
JPH06508036A (ja) 組換えニューロトロフィンの生産および回収
CN101955969A (zh) 一种通用型原核高效可溶性融合表达载体的构建及其应用
RU2143492C1 (ru) Рекомбинантная плазмида, кодирующая гибридный белок - предшественник инсулина человека (варианты), штамм бактерий e.coli - продуцент гибридного белка - предшественника инсулина человека (варианты), способ получения инсулина человека
RU2144082C1 (ru) Рекомбинантная плазмида, кодирующая гибридный белок-предшественник инсулина человека (варианты), штамм бактерий e.coli - продуцент гибридного белка-предшественника инсулина человека (варианты) и способ получения инсулина человека
CN113025599A (zh) 一种重组溶组织梭菌i型胶原酶及其制备方法和应用
KR910001811B1 (ko) 배지의 당분농도제어에 의한 외래유전자 발현제어방법 및 그에 따른 외래유전자 산물의 생산방법

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 08842350

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

DPE1 Request for preliminary examination filed after expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 201000499

Country of ref document: EA

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 201070461

Country of ref document: EA

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 08842350

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1