WO2009036754A1

WO2009036754A1 - Inhibitoren des myelin assoziierten glykoproteins (mag)

Info

Publication number: WO2009036754A1
Application number: PCT/DE2008/001571
Authority: WO
Inventors: Svenja Scheid; Bernd Meyer; Sörge Kelm
Original assignee: Universität Hamburg
Priority date: 2007-09-21
Filing date: 2008-09-20
Publication date: 2009-03-26
Also published as: DE102007046388A1

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Verbindung als Inhibitor des Myelin assoziierten Glyhoproteins (MAG) mit der allgemeinen Struktur wobei R1 ein hydrophober Rest ist; R2 Wasserstoff (H), ein Kation oder ein Alkylester ist; R3 Wasserstoff (H) oder eine Gruppe ist, die unter physiologischen Bedingungen in die Hydroxygruppe überführbar ist; R4 ein hydrophober Rest ist; R5 Wasserstoff (H) oder ein Alkylrest, ein Aminosäurerest oder ein Peptidylrest ist; R6 Wasserstoff (H), ein Kation, ein hydrolysierbarer Rest, ein Aminosäurerest oder ein Peptidrest ist; und X ein Sauerstoffatom (0) oder eine NH-Gruppe ist. Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung dieser Verbindung.

Description

Inhibitoren des Myelin Assoziierten Glykoproteins (MAG)

Die Erfindung betrifft neue Inhibitoren des Myelin-assoziierten Glycoprotein (MAG) und deren Verwendung zur Behandlung von Verletzungen des zentralen Nervensystems.

Kommt es durch Unfälle oder Erkrankungen zu Verletzungen des adulten zentralen Nervensystems, so sind die betroffenen Körperfunktionen im Allgemeinen dauerhaft eingeschränkt oder verloren. Aufgrund der fehlenden Regenerationsfähigkeit der zentralen Nervenbahnen und des Gehirns ist dies in fast allen Fällen irreversibel.

Im Gegensatz zum zentralen Nervensystem (ZNS) ist das periphere Nervensystem (PNS) zur Regeneration nach Verletzungen fähig. Die nervösen Verknüpfungen können hier unter Rückerhalt der Funktionen meist vollständig wiederhergestellt werden. Diese Tatsache kann zur Erforschung genutzt werden, welche Unterschiede des PNS zum ZNS diese Regeneration ermöglichen. Es könnten so Möglichkeiten gefunden werden, Querschnittslähmungen erfolgreich zu behandeln.

Neuronen des ZNS sind durchaus zur Regeneration fähig In der zellulären Umgebung des PNS können ZNS-Neuronen wachsen.. Hierdurch wurde klar, dass im ZNS eine aktive Inhibierung der Regeneration von Neuronen auftreten muss. Kann diese aktive Inhibierung aufgehoben werden, so würde eine Überwindung von Querschnittslähmungen möglich.

Im adulten ZNS übt das Myelin-assoziierten Glycoprotein (MAG) eine inhibierende Wirkung auf die Axonregeneration aus. Um die Wirkung des MAG zu unterdrücken und eine Regeneration der zerstörten Axone zu ermöglichen, blockierten DeBellard el al. das MAG mit Sialinsäure und Sialyllactose. Hierfür verwendeten sie einen Neuritenwachstumsassay, bei dem die Länge der Neuriten in Gegenwart von MAG mit unterschiedlichen Saccharidkonzentrationen gemessen wurden. Dabei war eine Abhängigkeit der Neuritenlänge von der Konzentration der Saccharide zu erkennen. So zeigten Neuriten z. B. ein Wachstum von 64 % bei einer Zugabe von 20 mM Sialinsäure. [DeBellard, M. E., Tang, S., Mukhopadhyay, G., Shen, Y. J. and Filbin, M. T., Myelin-associated glycoprotein inhibits axonal regeneration from a variety of neurons via interaction with a sialoglycoprotein, Mol Cell Neurosci, 1996, 7, 89-101]. Ausgehend von der Struktur der komplexen Ganglioside des Nervensystems wurden bisher mehrere Ansätze zur Entwicklung von Inhibitoren für das MAG durchgeführt.

Strenge et al. untersuchten die Glycanspezifität von MAG anhand verschiedener synthetischer Oligosaccharide. Dabei zeigte das MAG eine fünffach höhere Bindungsaffinität an α2,3- verknüpfte N-Acetylneuraminsäure (Neu5Ac) als an α2,6-verknüpfte Neu5Ac. Außerdem ergab sich, dass MAG bestimmten Veränderungen der Neu5Ac gegenüber nicht tolerant war. So nahm die Bindungsaffinität stark ab, wenn die Hydroxylgruppen an der 8- oder 9-Position entfernt wurden. Auch die Carboxylgruppe und die VV-Acetylgruppe zeigten sich in dieser Analyse als wichtige funktionelle Gruppen für die Bindung von Neu5Ac an das MAG.[ Strenge, K., Schauer, R., Bovin, N., Hasegawa, A., Ishida, H., Kiso, M. and Keim, S., Glycan specificity of myelin-associated glycoprotein and sialoadhesin deduced from interactions with synthetic Oligosaccharides, EMr J Biochem, 1998, 258, 677-85] Allerdings zeigte MAG eine höhere Bindungsaffinität zu Neu5Ac-Derivaten mit halogenierter N-Acetylgruppe. Als weiterhin positiv für die Bindungsaffinität wurden Veränderungen der 9-Position gefunden. So zeigten Derivate der Neu5Ac mit Alkylsubstituenten oder aromatischen Substituenten an der 9-Position eine stark erhöhte Bindung an das MAG.

Die bisher erfolgreichsten Inhibitoren für das MAG sind zweifach aromatisch substituierte Neuraminoside, zu denen auch 9-(p-Chlorbenzylamid)-2-O-benzyl-iV-acetylneuraminsäure (SH-81) gehört.

Diese zeigten im Hapten-Inhibitionsassay eine um mehr als den Faktor >700 erhöhte Bindungsaffϊnität an das MAG verglichen mit den Trisaccharid Neu5Ac-α2,3-Gal-ßl,3- GaINAc-OSE. Hierbei wies SH-81 als am Benzamidsubstituenten der 9-Position einfach chlorierte Verbindung das höchste Inhibitionspotential mit 1074 verglichen mit dem Trisaccharid auf. Weitere Halogenierungen ließen das Inhibitionspotential sinken. [ Shelke, S. V., Gao, G. P., Mesch, S., Gathje, H., Keim, S., Schwardt, O. and Ernst, B., Synthesis of sialic acid derivatives as ligands for the myelin-associated glycoprotein (MAG), Bioorg Med Chem, 2007, 15, 4951-65].

Aufgabe der Erfindung ist es, weitere Inhibitoren zur Verfügung zu stellen.

Die Aufgabe wird gelöst durch die Verbindung mit den Merkmalen von Anspruch 1. Die Unteransprüche geben vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung wieder.

Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung besteht in neuen Aminosäure-Neuraminsäure-Derivaten sowie deren Herstellung.

Die erfindungsgemäße Subtanz hat die Strukturformel

wobei

Rl ein hydrophober Rest ist, der Alkylgruppen und aromatische Verbindungen enthalten kann;

R2 ein Rest ist, der Wasserstoff (H), ein Kation oder ein hydrolysierbarer

Alkylester ist; R3 ein Rest ist, der Wasserstoff (H) ist oder unter physiologischen

Bedingungen in die Hydroxygruppe überführbar ist, wie z.B. Acetylester; R4 Wasserstoff oder ein vorwiegend hydrophober Rest ist, der aromatischer oder aliphatischer Natur ist sowie einzelne hydrophile Gruppen enthalten kann;

R5 Wasserstoff (H) oder ein Alkylrest oder eine weitere Aminosäure ist, wobei die Aminosäure auch Teil eines Oligopeptids sein kann;

R6 entweder Wasserstoff (H), ein Kation, ein hydrolysierbarer Rest, der unter physiologischen Bedingungen ganz oder teilweise abgespalten wird, oder eine weitere Aminosäure ist, die alternativ auch Teil eines Peptids sein kann; und

X ein Sauerstoffatom (O) oder eine NH-Gruppe ist. n sind fünf der Inhibitoren des MAG mit ihrer chemischem Formel gezeigt.

Zur Übeφriifung der Bindungsaffinität an das MAG werden die mittels Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) gemessenen Dissoziationskonstanten K_D herangezogen. Tabelle 1 zeigt die ermittelten K_D- Werte für die erfindungsgemäßen Inhibitoren sowie die der Vergleichssubstanzen SH-81 und Neu5Ac

Tabelle 1

In Fig. 1 bis 4 sind die zugehörigen Bindungskurven SPR- Analyse zu sehen.

Fig. 1 zeigt die SPR-Messung der Standardsubstanz N-Acetylneuraminsäure: Die Auftragung der RUmax- Werte gegen die Konzentrationen der Neu5Ac von 100 μM bis 2500 μM lässt sich mit Hilfe des one site binding-Modells fitten. Dabei wird eine Dissoziationskonstante von KD = 1.5 ± 0.3 mM für die Bindung von Neu5Ac an das MAG erhalten. Fig. 2 zeigt die Bindungskurve der Referenzsubstanz SH-81. Es werden Konzentrationen von 1.52 μM bis 50 μM vermessen. Der Fit mit Hilfe des one site binding-Modells führte zu einer Dissoziationskonstanten von KD = 2.4 ± 0.9 μM.

Fig. 3 zeigt die Bindungskurven der Aminosäurekonjugate der einfachtrunkierten Neu5Ac (8er-Spezies) und die KD- Werte der SPR- Analyse. Es werden Konzentrationen von 1.52 μM bis 500 μM vermessen. Der Fit mit Hilfe des one site binding-Modells ergab für den Phenylalaninliganden SV-8 einen KD- Wert von 14 ± 2 μM, für den Tryptophanliganden einen KD- Wert von 11 ± 1 μM und für den Tyrosinliganden einen KD- Wert von 11 ± 5 μM.

Fig. 4 zeigt den Vergleich der SPR-Ergebnisse der 8er-Spezies und der 7er-Spezies der Aminosäure-Neu5Ac-Derivate anhand der Tyrosin-Neu5Ac-Derivate SV- 14 und SV- 18. Es werden Konzentrationen von 1.52 μM bis 500 μM vermessen. Der Fit nach dem one site binding-Modell ergab einen KD- Wert von 11 ± 5 μM für das Tyrosinkonjugat der einfachtrunkierten Neu5Ac und einen KD-Wert von 185 ± 54 μM für das Tyrosinkonjugat der zweifachtrunkierten Neu5 Ac.

Der Fit unter Verwendung des one site binding-Modells ergab für den Phenylalaninliganden SV-8 einen KD-Wert von 14 ± 2 μM. Für den Tyrosinliganden SV- 14 wird eine Bindungskonstante von l l ± 5 μM ermittelt. Der Tryptophanligand SV-10 dagegen zeigte eine Bindungskostante von 11 ± 1 μM. Die geringere Bindungsaffinität dieses Liganden könnte mit dem größeren Raumbedarf des Tryptophansubstituenten erklärt werden.

Alle Aminosäurekonjugate der einfachtrunkierten Neu5Ac zeigten somit in der SPR-Analyse hohe Bindungsaffinitäten. Die zweite Carboxylgruppe, die durch den Aminosäuresubstituenten in das Molekül eingeführt wurde, trug vermutlich durch Salz- oder Wasserstoffbrückenbindung zu dieser hohen Bindungsaffinität bei. Allerdings wird die positive Wirkung der zweiten Carboxylgruppe im Tryptophanliganden durch die Größe des aromatischen Restes anscheinend aufgehoben.

Während das entsprechende Tyrosin-einfachtrunkierte Neu5Ac-Derivat SV- 14 mit einem K_D- Wert von 11 ± 5 μM die höchste Bindungsaffinität von allen Derivaten zeigte, nahm diese beim Tyrosin-zweifachtrunkierte Neu5Ac-Derivat SV- 18 um den Faktor 17 auf 185 ± 54 μM ab. Das Fehlen der Hydroxylgruppe an der 7-Position und die verkürzte Molekülstruktur bewirken eine starke Abnahme der Bindungsaffinität an MAG.

Für den Histidinliganden SV- 16, der ebenfalls das um zwei Methylengruppe verkürzte Neu5Ac-Grundgerüst besitzt, konnte in der SPR-Analyse keine Bindung an das MAG gezeigt werden. Der Grund hierfür könnte in den unterschiedlichen Ladungen des Histidins im

Gegensatz zu den anderen Liganden liegen. Histidin liegt bei dem pH- Wert des Laufpuffers protoniert vor und ist somit positiv geladen. Tyrosin dagegen besitzt einen Aromaten mit

Elektronenüberschuss. Dies scheint die Wechselwirkung mit MAG zu erleichtern, während Histidin sich mit seiner positiven Ladung als ungeeignet erweist.

Um eine genauere Analyse der Bindungsspezifitäten der Aminosäurekonjugate der trunkierten Neu5Ac zu erhalten, wurden diese mittels STD NMR-Spektroskopie untersucht. Für alle Verbindungen der einfachtrunkierten Neu5Ac wurden STD-Titrationen durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Titrationen sind in Fig. 5 gezeigt.

Fig. 5 zeigt den Auftragung der STD-Amplifikationsfaktoren gegen die Konzentrationen in μM: Ergebnisse der KD-Titrationen mittels STD NMR für die Aminosäurekonjugate der einfachtrunkierten Neu5 Ac [SV-8: (c(FcMAGdl-3) = 13.9 μM, c(SV-8) = 13.9 bis 166.8 μM, 700 MHz, T = 285 K, shaped pulse spl = 45 dB, Sättigungsdauer = 2.04 s, Einstrahlfrequenz on resonance-Spektrum = -0.5 ppm)]. [SV-10: (c(FcMAGdl-3) = 11.1 μM, c(SV-10) = 11.2 bis 166.8 μM, 700 MHz, T = 285 K, shaped pulse spl = 45 dB, Sättigungsdauer = 2.04 s, Einstrahlfrequenz on resonance-Spektrum = -0.5 ppm)]. [SV-14: (c(FcMAGdl-3) = 11.1 μM, c(SV-14) = 11.1 bis 166.8 μM, 700 MHz, T = 285 K, shaped pulse spl = 45 dB, Sättigungsdauer = 2.04 s, Einstrahlfrequenz on resonance-Spektrum = -1.0 ppm)].

Der Phenylalanin-Ligand SV-8 zeigte in der STD-Titration eine Bindungskonstante von 8 ± 3 μM. Diese zeigt eine gute Übereinstimmung mit der Bindungskonstante von 14 ± 2 μM, die die SPR-Analyse für diese Verbindung ergab. Für das Tryptophan-Derivat SV-10 wird hier ein KQ- Wert von 15 ± 6 μM erhalten. Dieser liegt deutlich unter dem K_D- Wert von 77 μM, den diese Verbindung in der SPR-Analyse gezeigt hat. Allerdings ist auch hier die Tendenz zur geringeren Bindungsaffinität im Vergleich zu den Phenylalanin- und Tyrosin- Liganden zu erkennen. Der Tyrosin-Ligand SV-14 zeigte auch in diesem Analyseverfahren die höchste Bindungaffinität mit einem KQ- Wert von 4 ± 5 μM. Die Bindungskonstanten der SPR-Analyse werden durch die Ergebnisse der STD-Titrationen gestützt. Hier wurden die gleichen Abhängigkeiten der Bindungsaffinität gefunden.

Die höchste Bindungsaffinität zum MAG zeigte das Tyrosin-Konjugat der einfachtrunkierten Neu5Ac SV- 14 mit einem K_D = 11 ± 5 μM in der SPR- Affinitätsanalyse sowie einem K_D = 4 ± 5 μM in der STD NMR Analyse. Das Phenylalanin-Konjugat der einfachtrunkierten Neu5Ac SV-8 zeigte mit einem K_D = 14 ± 2 μM in der SPR-Affinitätsanalyse und einem K_D = 8 ± 3 μM in der STD NMR Analyse eine nur geringfügig schwächere Bindungsaffinität zum MAG. Das Tryptophan-Konjugat der einfachtrunkierten Neu5Ac SV-IO zeigte dagegen weniger gute Bindungsaffinitäten zum MAG als die anderen beiden Konjugate. In der SPR- Affinitätsanalyse wird ein K_D = 77 ± 7 μM erhalten. Die STD NMR Analyse zeigte einem K_D = 15 ± 6 μM, der zwar niedriger liegt als die mittels SPR bestimmten Dissoziationskonstanten, aber immer noch um der Faktor 3.8 bzw. 2 schlechter ist als die mittels STD NMR bestimmten Dissoziationskonstanten für die anderen Konjugate. Das Tyrosin-Konjugat der zweifachtrunkierten Neu5Ac SV- 18 zeigte in der SPR-Affinitätsanalyse einen K_D = 185 ± 54 μM. Aufgrund der schwächeren Bindungsaffinität ist keine STD NMR Analyse durchgeführt worden. Der Vergleich mit der Dissoziationskonstante des Tyrosin- Konjugats der einfachtrunkierten Neu5Ac zeigte eine um den Faktor 17 bzw. 7 schwächere Bindungsaffinität zu MAG. Die zweifache Verkürzung der Neu5Ac führt vermutlich durch das Fehlen der Hydroxylgruppe an der 7-Position und durch eine ungünstigere Lage in der Bindungstasche zu einer geringeren Bindungsaffinität zum MAG.

Unter Einbezug der unterschiedlichen Bedingungen dieser zwei Analysemethoden stimmen die für die einzelnen Liganden erhaltenen K_D- Werte in guter Näherung überein.

Die Fig. 6, Fig. 7 und Fig. 8 zeigen den Syntheseweg der erfindungsgemäßen Aminosäure- trunkierten Neu5Ac-Derivate, wobei auch das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen beansprucht wird.

Die Synthese erfolgt in acht Synthesestufen. Im ersten Schritt wird die Carboxylgruppe der Neu5Ac als Methylester geschützt. Hier dient der saure Ionenaustauscher Dowex 50X8(H⁺) als Katalysator. Die freien Hydroxylgruppen werden nach Standardmethode als Acetylgruppen geschützt. Die Hydroxylgruppe in 2-Position zeigt aufgrund des -I-Effektes der benachbarten Carboxylgruppe eine schwächere Reaktivität als die anderen Hydroxylgruppen. Daher entstand ein Produktgemisch aus Penta- und Hexaacetat. Für die weiteren Syntheseschritte spielt dies keine Rolle, so dass das Produktgemisch unaufgereinigt weiter eingesetzt werden kann.

Fig. 6: Syntheseweg der Aminosäurekonjugate der trunkierten Neu5Ac ausgehend von Neu5Ac bis zur um eine Methylengruppe kürzeren Neu5Ac-Spezies nach der Periodatspaltung (Stufe 6).

Zur Aktivierung der 2-Position für die Substitution mit Benzylalkohol wird diese Position chloriert. Hierfür wird Acetylchlorid mit Methanol versetzt, wobei in situ HCl entstand. Diese reagierte dann in einer nucleophilen Substitution mit der acetylierten Neu5Ac zum ß-Sialylchlorid. Aufgrund der thermodynamischen Kontrolle, der diese Reaktion unterliegt, entsteht das ß-Sialylchlorid in guter Ausbeute anomerenrein. In der nächsten Stufe wird das ß-Sialylchlorid mit Benzylalkohol und Silbercarbonat umgesetzt, wobei der Benzylalkohol an die 2-Position gekuppelt wird. Anschließend werden die Acetylschutzgruppen durch die Deacetylierung nach Zemplen abgespalten. Die Bindung zwischen der 8- und der 9-Position wird mittels Periodatspaltung gespalten. Zur Minimierung der möglichen Nebenreaktion zur zweifachtrunkierten Neu5Ac wird das Periodat in äquimolaren Mengen eingesetzt.

Die Aminosäure wird in Form ihres Methylesters über eine reduktive Aminierung mit NaCNBH₃ an die bei der Periodatspaltung entstandene Aldehydfunktion an Position 8 geknüpft. Im Anschluss werden die Methylester an den beiden Carboxylfunktionen mit 0.1 N Natronlauge verseift. Die Produkte werden mittels Biogel-P2-Säule und RP-HPLC mit Acetonitril/Wasser-Gradienten aufgereinigt (Fig. 7).

Fig. 7: Die reduktive Aminierung mit NaCNBH3 und anschließende Kupplung der Aminosäure an die um eine Methylengruppe verkürzte Neu5Ac führte zu den Liganden SV-8, SV-10 und SV- 14.

Bei der Periodatspaltung entsteht auch das um zwei Methylengruppen verkürzte iV-Acetyl- neuraminsäurederivat (Fig. 8). Die Nachbarschaft der Aldehydgruppe zur 7-Position der gewünschten Spezies erlaubt keine säulenchromatographische Aufreinigung mittels Kieselgel, da sonst die Gefahr einer Epimerisierung des asymmetrischen Zentrums an der 7-Position besteht. So entstehen bei der nachfolgenden Kupplung der Aminosäure zwei Spezies der Aminosäure-Neu5Ac-Derivate mit unterschiedlich langen Glycerolseitenketten.

Fig. 8: Die reduktive Aminierung mit NaCNBH3 und anschließende Kupplung der Aminosäure an die um zwei Methylengruppen verkürzte Neu5Ac rührte zu den Liganden SV- 16 und SV-18.

Material und Methoden

Oberflächenplasmonenresonanz - SPR

Die Methode besitzt eine hohe Empfindlichkeit und so sind zur Analyse nur geringe Substanzmengen notwendig. Es ist notwendig, einen der Interaktionspartner auf dem Sensorchip zu immobilisieren.

Die Methode beruht auf der Totalreflexion von linear polarisiertem Licht an einer reflektierenden Schicht wodurch eine evaneszierende Welle hinter dieser Schicht entsteht. Durch Wechselwirkung mit einer Metallschicht kommt es zur Feldverstärkung und zur Resonanz mit den Oberfiächenplasmonen der Metallschicht. Diese Wechselwirkung ist abhängig vom Reflexionswinkel, der vom Brechungsindex jenseits der Reflexionsebene abhängt. Die Resonanz fuhrt zu einer Intensitätsverringerung des reflektierten Lichts.

An dem Sensorchip wird einer der Bindungspartner immobilisiert, während der andere in Lösung am Sensorchip vorbeigeleitet wird. Kommt es in der Messzelle zu einem Bindungsereignis führt dies zu einer Massenzunahme. Daraus resultiert eine Änderung des Brechungsindexes der Lösung an der Oberfläche. Diese Brechungsindexänderung führt zu einer Wechselwirkung mit der evaneszierenden Welle. Dadurch wird die Lichtintensität bei einem bestimmten Winkel abgeschwächt. Die Änderung dieses Winkels wird in Form von resonance units (RU) von der optischen Einheit des Messgerätes detektiert.

Die Empfindlichkeit der Methode erlaubt die Detektion von Massenänderungen von wenigen Pikogramm (1 pg entspricht ca. 1 RU). Das entspricht Winkeländerungen von ca. 0.0001 °. So lassen sich Verbindungen mit Molmassen unter 1000 Da selbst mit Dissoziationskonstanten im mM-Bereich untersuchen. Je nach Applikation können unterschiedliche Verfahren zur Immobilisierung genutzt werden. Am häufigsten wird der so genannte CM5 -Messchip genutzt. Er besteht aus einer Glasschicht mit aufgedampfter Goldschicht. Auf der Goldschicht befindet sich eine über Linker fixierte carboxymethylierte Dextranschicht. Die Aktivierung der Carboxylfunktionen der Dextranschicht geschieht durch Zugabe von iV-Hydroxysuccinimid (NHS) und iV-Ethyl-N^l-(3- dimethylaminopropyl)-carbodiimid Hydrochlorid (EDC) als Aktivester. Dies ermöglicht die kovalente Bindung des zu immobilisierenden Bindungspartners unter Ausbildung einer Amidbindung. Alle nicht belegten aber aktivierten Carboxylfunktionen werden danach durch Umsetzung mit Ethanolamin inaktiviert (Cappen).

Aus den erhaltenen Sensorgrammen können kinetische und thermodynamische Daten zu den untersuchten Bindungsereignissen gewonnen werden. Durch Anpassen des Sensorgramms an die Langmuir-Funktion lassen sich die Geschwindigkeitskonstanten der Assoziation k_on und der Dissoziation k_off ermitteln. Vorraussetzung hierfür ist, dass es sich um eine spezifische Wechselwirkung handelt und so eine Sättigung erreicht wird. Die Auftragung der Sättigungswerte gegen die untersuchten Ligandkonzentrationen führt zu einer Kurve, die bei Annahme eines one site binding-WloάeWs an die Formel 1 angepasst werden kann. Hier stellt [L] die Ligandkonzentration in Lösung und RU_max den theoretischen Gleichgewichtswert bei unendlich hoher Ligandkonzentration dar. Aus der gefϊtteten Kurve kann bei RU_max/2 die Dissoziationskonstante K_D erhalten werden.

Probleme bei der Bestimmung dieser Bindungsparameter treten z. B. bei Rückbindungseffekten auf, die die beobachtete Dissoziationsrate verringern. Ebenfalls problematisch ist die Untersuchung sehr schneller Kinetiken, da die Datenaufnahmerate der Geräte von 10 Hz für deren Erfassung nicht ausreicht.

K_D + [L]

Formel 1

Anhand der Formel 2 kann die maximal zu erwartende RU-Antwort bei der erreichten Belegung errechnet werden. Dabei ist MW_A das Molekulargewicht des Liganden, MWp das Molekulargewicht des Proteins, RUp die RU-Antwort der Belegung des Chips mit Protein und s die Stöchiometrie der Reaktion. RU. - .M,, ..

MW_p ^P Formel 2

Durchführung der SPR-Analysen Für die SPR-Messungen stand ein Biacore TlOO der Firma Biacore AB, Uppsala, Schweden, zur Verfügung. Es wurden CM5-Chips (Biacore AB) verwendet, und die Immobilisierung des Proteins geschah nach der Standard- Amin-Kupplungsmethode. Alle Messungen werden bei einer Temperatur von 25 °C durchgeführt. Es werden jeweils zwei Flusszellen (Mess- und Referenzflusszelle) 10 min mit einem EDC/NHS-Gemisch (1:1) bei einer Flussrate von 10 μL/min aktiviert. Wird eine niedrigere RU- Antwort als 300 RU erhalten, wird die Aktivierung unter gleichen Bedingungen für 5 min wiederholt. Anschließend wird die Belegung der Messzelle mit dem Protein durchgeführt.

Direkt vor der Belegung wird zu der FcMAGd 1-3 -Lösung in Acetat-Puffer pH 4.0 (c = 20.9 μM) ein 50facher Überschuss des Liganden SV-8 (K_D (STD) = 8 ± 3 μM) hinzugegeben und gut durchmischt Die Belegung wird für 20 min bei einer Flussrate von 10 μL/min durchgeführt. Dabei wird eine RU- Antwort von 8100 RU erhalten. Das entsprach einer

Belegung von 54 fmol FcMAGdl-3. D. h. die maximal zu erwartende RU-Antwort lag für die zu untersuchenden Liganden bei ca. 56 RU.

Danach werden beide Flusszellen mit Ethanolamin-Lösung (1 M, pH 8.5) bei einer Flussrate von 10 μL/min für 10 min abgesättigt {Capperi).

Um nicht-kovalent gebundenes MAG vom Chip zu waschen, werden mehrere saure Impulse (Glycin, pH 3.0) über die Messzellen geleitet. Nachdem die Basislinie durch diese Impulse nicht weiter abnahm, wird der Chip für zwei Stunden im Standby Flow equüibriert. Mittels einer Probemessung mit reiner Neu5Ac als Standardsubstanz wird die Funktionalität des MAG nachgewiesen.

Die zu untersuchenden Liganden werden bei einer Flow Rate von 30 μL/min vermessen. Die Injektionszeit betrug genauso wie die Dissoziationsphase 480 s. Eine Regeneration war nicht notwendig. Innerhalb der Dissoziationsphase wird die Basislinie wieder erreicht. Die erhaltenen Sensorgramme werden mit Hilfe der Biacore TlOO Evaluation Software 1.1 und des one site binding-Modells der Software Origin 7.5 ausgewertet. Da die Blank- Messungen aufgrund nicht erklärbar hoher RU-Antworten nicht zur Auswertung verwendet werden konnten, wird der Nullpunkt aus den zwei niedrigsten Konzentrationen rückextrapoliert und in den Fit miteinbezogen.

Die kinetische Auswertung der erhaltenen Sensorgramme wird mit der Biacore T100

Evaluation Software 1.1 unter Verwendung der Kinetics/Affinity-Ευnkύon (l:l-Binding

Modell) durchgeführt.

Pufferlösungen

PBS-H₂O Puffer für Oberflächenplasmonenresonanz

14O mM NaCl

3 mM KCl 8 mM Na₂HPO₄

2 mM NaH₂PO₄ in H₂O gelöst pH 7.4

Alle weiteren verwendeten Puffer und Reagenzlösungen werden in Form von fertigen Lösungen von der Firma Biacore AB, Uppsala, Schweden, eingesetzt. Alle Puffer und Lösungen werden vor dem Einsatz sterilfiltriert.

Saturation Transfer Difference NMR-Spektroskopie

Das Saturation Transfer Difference (STD) NMR-Verfahren kann zum Screening von Substanzbibliotheken, zur Bestimmung von Dissoziationskonstanten und zur Bestimmung von Bindungsepitopen genutzt werden.

Das Prinzip der STD NMR-Spektroskopie beruht auf zwei Spektren (on resonance-Spektτum und off resonance-Spektrum), deren Differenz das STD NMR-Spektrum ergibt. Im on resOMαnce-Spektrum werden die Resonanzen des Proteins selektiv gesättigt. Diese selektive Sättigung ist bei Proteinen, die größer als 10 kDa sind, aufgrund der Spindiffusion möglich. Diese Sättigung kann durch Einstrahlung außerhalb der Ligandsignale erhalten werden, da es bei Makromolekülen zu starken Linienverbreiterungen kommt. Zusätzlich führen Anisotropieeffekte in geordneten Bereichen zu extremen chemischen Verschiebungen. Das führt dazu, dass man z. B. mit einem selektiven Gauss-Puls bei -1 ppm Resonanzen des Proteins selektiv sättigen kann, während die scharfen Resonanzen niedermolekularer Verbindungen unbeeinflusst bleiben. Da ab einer Proteingröße von ca. 10 kDa die Spindiffusion, d. h. der Magnetisierungstransfer über das gesamte Molekül innerhalb weniger 100 ms geschieht, kann man durch die so durchgeführte selektive Sättigung einzelner Resonanzen sämtliche Signale eines Proteins sättigen.

Im off resonance-Spektrum werden die gleichen Sättigungspulse außerhalb der Proteinresonanzen z.B. bei 40 ppm eingestrahlt. Es werden keine Proteinresonanzen gesättigt und das Spektrum unterscheidet sich nicht von einem Spektrum ohne Sättigungspulse. Die Einstrahlung ist notwendig, um eine unterschiedliche Probenerwärmung in beiden Experimenten zu verhindern. Temperaturschwankungen können sich bei der anschließenden Subtraktion als Artefakte auswirken.

Nun hängt es davon ab, ob ein Molekül mit dem gesättigten Protein wechselwirkt und so Sättigung übernimmt. Wechselwirkt ein Molekül nicht, so finden sich in beiden Spektren die gleichen Signale und Signalintensitäten. Die Differenzbildung führt nicht zu Signalen im STD NMR Spektrum. Im Falle einer Wechselwirkung trägt der Ligand die Sättigung bei Dissoziation vom Protein in die Lösung, wo sie detektiert werden kann und im Differenzspektrum zu Signalen führt. Hier sind die Signalintensitäten der einzelnen Protonen höher, je enger sie im Kontakt zum Protein standen, da sie im on rasOnαHce-Spektrum einem stärkeren, intermolekularen Sättigungstransfer ausgesetzt waren. Der intermolekulare Sättigungstransfer ist in der sechsten Potenz umgekehrt proportional zum Abstand der an der Kreuzrelaxation beteiligten Protonen.

Zur Unterdrückung der störenden Proteinsignale wird ein T_lp-Filter (Spinlock-Filter) eingesetzt. Dabei wird die Magnetisierung nach dem ersten 90 °-Puls eine Zeit lang in der xy- Ebene gehalten. Durch die erheblich kürzeren T₂-Relaxationszeiten der Makromoleküle klingt ihre Magnetisierung im Vergleich zu der der Liganden sehr schnell ab. Die Dauer des Spinlock-Filters liegt im Bereich von 10 bis 50 ms. Das HDO-Signal wird mittels einer WATERGATE-Puls-Sequenz {Water Suppression by Gradient Taylor ed Excitatiori) unterdrückt. Dabei wird durch eine Folge von Gradientenpulsen ein Anregungsprofil erzeugt, welches die Region des Wassersignals ausspart. Außer dem Sättigungstransfer haben noch andere Parameter direkten Einfluss auf die Signalintensitäten: z. B. die Probenzusammensetzung und Aufnahmebedingungen, die kinetischen und thermodynamischen Eigenschaften der beobachteten Interaktion und die T₁- Relaxationszeiten der beteiligten Protonen.. Daher ist bei Systemen, die lange Sättigungszeiten zur Beobachtung eines STD-Effekts erfordern, eine Abschätzung oder Bestimmungen der Ti-Relaxationszeiten wichtig.

Die Formel 3 zeigt die Dissoziations- und Assoziationsreaktion. Daraus ergibt sich nach dem Massenwirkungsgesetz die Formel 4, welche die Dissoziationskonstante K_D als Quotient aus den Geschwindigkeitskonstanten k_off und Ic_0n liefert.

k_off [PL] ^-^ [P]₊[L] k_o„ Formel 3

₌ PP] ^X [L] ₌ k_st ° [PL] k_on

Formel 4

Kleine offrates bewirken, dass innerhalb der Sättigungszeit nicht genügend Moleküle in die Bindungstasche gelangen und Sättigung aufnehmen. Bei sehr großen on und offrates dagegen reicht die Verweildauer in der Bindungstasche nicht aus, um Sättigung auf den Liganden zu übertragen.

Zur Bestimmung des Bindungsepitops wird der Quotient aus dem Integral eines Protonensignals im STD NMR-Spektrum (Io-I_Sat) und im off resonance-Spektrυm (I₀) gebildeten (Formel 5). Dies wird für alle detektierten Protonensignale (absolute STD- Prozente) durchgeführt. Zur Vereinfachung kann das Signal mit dem stärksten STD-Effekt auf 100 % normiert und alle anderen STD-Effekte hierzu ins Verhältnis gesetzt werden (relative STD-Prozente). STD [%] = ^{Io ~ Isat} x lOO

*o

Formel 5

Zur Charakterisierung der Kinetik des untersuchten Systems werden mehrere STD NMR- Spektren mit unterschiedlichen Ligandenüberschüssen aufgenommen. Aus den absoluten STD-Prozenten eines ausgewählten Signals berechnet man die STD-Amplifikationsfaktoren (Formel 6). Diese trägt man gegen die Ligandenkonzentration [L] auf. Handelt es sich um ein System, welches sich durch das one site binding-Modell beschreiben lässt (Formel 7), kann aus der erhaltenen Bindungskurve die Dissoziationskonstante K_D bestimmt werden.

STD - Ampl.fakt. = -5 ^- x Überschuss

Io

Formel 6

STD - Ampl.fakt._max x [L]

STD - Ampl.fakt. =

K_D + [L]

Formel 7

Mit dieser Analysemethode erhält man Dissoziationskonstanten, die höher liegen als die tatsächlichen. Dies ist darauf zurückzuführen, dass der STD-Amplifikationsfaktor bei Erhöhung der Ligandkonzentration trotz fast vollständiger Rezeptorbelegung noch weiter ansteigt. Die Gründe hierfür sind bei schneller Dissoziation der hohe Durchsatz an Liganden und die lange Lebensdauer der Sättigung im Liganden nach Verlassen der Bindungstasche. Dadurch kann es vorkommen, dass man höhere Konzentrationen der gebundenen Spezies erhält als Bindungsstellen vorhanden sind. Dies führt bei Auftragung der Messwerte nach Formel 7 im Vergleich zu anderen Assays zum späteren Erreichen des Gleichgewichtplateaus und so zu höheren K_D- Werten.

Das STD NMR- Verfahren lässt Untersuchungen von Bindungen in einem K_D- Wertebereich von pM bis mM zu und kann mit einer Vielzahl von Pulsprogrammen kombiniert werden. Die Methode ist nicht nur auf Messungen mit gelöstem Protein beschränkt.

Durchführung der STD NMR-Messungen Die FcMAGdI -3-NMR-Proben werden in 600 μL D₂O (99.9 %)-PBS-Puffer angesetzt. Dafür wird das Protein in Ultrazentrirugationseinheiten umgepuffert. Alle Messungen mit Protein- haltigen Proben werden bei 285 K durchgeführt. Die Konzentrationen des Proteins in den NMR-Proben lagen zwischen 6 und 12 μM. Titrationsserien werden bis zum Erreichen der Sättigung durchgeführt, daher variierten die eingesetzten Ligandkonzentrationen.

Um Proteinhintergrundsignale zu eliminieren, werden alle Spektren mit einem spinlock Puls aufgenommen. Die Dauer des spinlock Pulses lag am 500 MHz NMR bei 10 ms und am 700 MHz NMR bei 30 ms.

Das Protein wird mit Hilfe einer Serie von 50 Gauss-shaped Pulsen von je 50 ms Länge und je einem Delay von 1 ms gesättigt. Die Gesamtsättigungsdauer lag bei 2.04 s. Am 500 MHz NMR werden Pulsleistungen von 45 und 55 dB verwendet, am 700 MHz NMR entsprach dies 39 und 49 dB. Die on re50«α«ce-Einstrahlfrequenz variierte bei den verschiedenen Liganden, die off resoHαwce-Einstrahlungsfrequenz lag immer bei 40 ppm. Zur Aufnahme der STD Spektren werden pseudo-2D STD NMR Spektren (stdw5slsp2d.bc mit Spinlock und stdw5sp2d.bc ohne Spinlock) gewählt. Bei diesen Pulsprogrammen werden die on und off resonance-Spektτen abwechselnd aufgenommen.

Im Allgemeinen lag die Anzahl der Scans bei 2048 (1024 Scans für das on resonance- und 1024 Scans für das off resonance-Spektium) mit 16 dummy Scans und einer sweep width von 10 ppm.

Alle Spektren werden vor der Prozessierung mit einer exponentiellen line broadening- Funktion von 0.5 bis 1.0 Hz multipliziert. Nach Trennen des Datensatzes in on und off rasOH-ϊHce-Spektrum werden diese übereinander gelegt und das off resonance- auf das on resonance-Spektτum skaliert. Der erhaltene Skalierungsfaktor entsprach dem absoluten STD- Wert, der in die absoluten STD-Prozente und in den STD-Amplifikationsfaktor umgerechnet werden konnte.

Titrationen Für die Titrationen werden von allen Liganden Stammlösungen mit der Konzentration lO mg/mL angesetzt. Durch die Wahl dieser hohen Konzentration konnten Verdünnungseffekte beim Hinzutitrieren der Stammlösung vernachlässigbar klein gehalten werden. Nach Zugabe der entsprechenden Stammlösungsmenge wird ein pseudo-2D-STD NMR-Spektrum aufgenommen. Ausgewertet werden die Titrationen anhand des N- Acetylsignals der Neu5Ac bei ca. 1.8 ppm.

Um die Titrationskurven zu erhalten, werden die STD-Amplifikationsfaktoren anschließend gegen die Konzentrationen aufgetragen. Diese werden mit dem one site binding-Modell der Software Origin 7.5 gefittet und die entsprechende Bindungskonstante für den Liganden erhalten.

Pufferlösungen

PBS-D₂O (99.9 %)-Puffer für STD NMR Messungen 14O mM NaCl

3 mM KCl

8 mM Na₂HPO₄

2 mM NaH₂PO₄

6 mM Natriumazid in D₂O (99.9 %) gelöst pH 7.4 (nicht für D₂O korrigiert)

Synthese und Charakterisierung

Methyl-5-acetamido-3,5-didesoxy-D-^(v^cero"ß^-D"^^Λ'^αc'^ö-2-nonulopyranosonat (1)

C₁₂H₂₁NO₉

= 0.48

2.00 g (6.46 mmol) iV-Acetylneuraminsäure und 2.00 g Dowex 50W-8X (H⁺) werden mit 90.0 mL absolutem Methanol versetzt. Das Reaktionsgemisch wird für 20 h bei RT gerührt und die Reaktion dünnschichtchromatographisch verfolgt. Anschließend wird der Ionenaustauscher abfiltriert und mehrmals mit Methanol gewaschen. Das Lösungsmittel wird im Vakuum destillativ entfernt. Das erhaltene Produkt wird über Nacht am Ölpumpenvakuum getrocknet. Als Produkt wird ein beige-weißer Feststoff in einer Auswaage von 1.08 g (5.57 mmol) erhalten. Das entspricht einer Ausbeute von 86 % bezogen auf die eingesetzte Menge iV-Acetylneuraminsäure.

¹H-NMR (400 MHz, MeOD): δ [ppm] = 4.03 (ddd, IH, ³J_33-4 = 4.9 Hz, ³J_3b-4 =11.4 Hz, ³J_4-5 = 1.2 Hz, H-4), 3.99 (dd, IH, ³J_5-6 = 10.5 Hz, ³J_6-7 = 1.4 Hz, H-6), 3.83-3.78 (m, IH, H-9a), 3.77 (s, 3H, OCH₃), 3.85-3.79 (m, IH, H-5), 3.73-3.66 (m, IH, H-8), 3.58 (dd, IH, H-9b), 3.47 (dd, IH, ³J_6-7 = 1.4 Hz, H-7), 2.21 (dd, IH, ²J_3a-_3b =12.9 Hz, ³J_3b-4 =11.4 Hz, H-3b), 1.80 (NHCOCH₃), 1.88 (dd, IH, ²J_3a._3b =12.9 Hz, ³J_33-4 = 4.9 Hz, H-3a).

¹³C-NMR (100.6 MHz, MeOD): δ [ppm] = 174.5 (NHCOCH₃), 171.5 (C-I), 96.8 (C-2), 71.8 (C-6), 71.6 (C-5), 71.3 (C-8), 69.9 (C-7), 67.4 (C-4), 64.5 (C-9), 52.9 (COOCH₃), 40.3 (C-3), 22.2 (NHCOCH₃).

Methyl-5-acetamido-2,4,7,8,9-penta-O-acetyl-3,5-didesoxy-D-^/);cero-ß-D-gα/αcto-2- nonulopyranosonat (2)

10/1) = 0.87

833 mg (2.58 mmol) 1 werden in 13 mL absolutem Pyridin gelöst. Das Reaktionsgemisch wird bei 0 °C tropfenweise mit 8.4 mL Essigsäureanhydrid versetzt und 16 h bei RT gerührt.

Nachdem dünnschichtchromatographisch der Umsatz der Produkte nachgewiesen worden ist, wird das Pyridin codestillativ mit Toluol entfernt und das Produkt im Ölpumpenvakuum getrocknet. Es werden 3.85 g eines beigen Schaums erhalten. Als Nebenprodukt trit die in 2-

Position nicht acylierte Spezies auf.

Das erhaltene Produktgemisch wird ohne weitere Aufarbeitung in der nachfolgenden

Reaktion umgesetzt.

¹H-NMR (400 MHz, MeOD): δ [ppm] = 5.39 (dd, IH, ³J_6-7 = 2.3 Hz, ³J_7-8 = 6.5 Hz, H-7), 5.18 (ddd, IH, ³J_36-4 = 5.0 Hz, H-4), 5.07 (ddd, IH, ³J_7-8 = 6.5 Hz, ³J_8-93 = 10.6 Hz, H-8), 4.45 (dd, IH, ³J_8-98 = 10.6 Hz, H-9a), 4.18 (dd, IH, ³J_6-7 = 2.3 Hz, H-6), 4.10-4.00 (m, 2H, H-9b, H-5), 3.75 (s, 3H, COOCH₃), 2.52 (dd, IH, ³J_36-4 = 5.0 Hz, H-3e), 2.14-1.92 (m, 19H, H-3a, 5*COCH₃, NHCOCH₃).

¹³C-NMR (100.6 MHz, MeOD): δ [ppm] = 197.9 (C-I), 175.0 (COCH₃), 171.4 (COOCH₃), 98.4 (C-2), 73.0 (C-6), 71.5 (C-8), 69.8 (C-4), 68.5 (C-7), 62.8 (C-9), 53.3 (COOCH₃) 49.6 (C-5), 40.9 (NHCOCH₃), 37.0 (C-3), 22.2 (NHCOCH₃).

Methyl-(5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-3,5-didesoxy-D-g/jcero-ß-D-gα/αc/o-2- nonulopyranosyl)onat-Chlorid (3)

= 3/2) = 0.41 = 1 in CHCl₃)

3.85 g des Produktgemisches aus 2 werden bei 0 °C in 18.O mL Acetylchlorid gelöst und langsam mit 282 μL MeOH versetzt. Anschließend wird das Reaktionsgefäß zügig dicht verschlossen und das Reaktionsgemisch 40 h bei RT gerührt. Das Ende der Reaktion wird dünnschichtchromatographisch detektiert. Nachdem das Lösungsmittel im Vakuum destillativ entfernt worden ist, wird das erhaltene Rohprodukt dreimal mit Toluol codestilliert und danach für mehrere Stunden im Ölpumpenvakuum getrocknet. Als Produkt werden 1.17 g (2.29 mmol) eines weißen Schaums erhalten. Als Ausbeute werden 31 % des ß-Sialylchlorids bezogen auf die eingesetzte Menge des Zweiproduktgemisches erhalten.

¹H-NMR (400 MHz, MeOD): δ [ppm] = 5.40 (dd, IH, ³J_6-7 = 2.3 Hz, ³J_7-8 = 7.0 Hz, H-7), 5.35 (dd, IH, ³J_33-4 =11.3 Hz, ³J_36-4 = 4.6 Hz, ³J_4-5 = 10.6 Hz, H-4), 5.11 (ddd, IH, ³J_7-8 = 7.0 Hz, ³J_8-92 = 2.7 Hz, ³J_8-9b = 7.0 Hz, H-8), 4.35 (dd, IH, ³J_8-93 = 2.7 Hz, ²J_93-Q_b = 12.6 Hz, H- 9a), 4.29 (dd, IH, ³J_5-6 = 10.7 Hz, ³J_6-7 = 2.3 Hz, H-6), 4.14 (dd, IH, ³J_4-5 = 10.6 Hz, ³J_5-6 = 10.7 Hz, H-5), 4.00 (dd, IH, ³J_8-91, = 7.0 Hz, ²J_9a._9b = 12.6 Hz, H-9b), 3.81 (s, 3H, COOCH₃), 2.72 (dd, IH, ³J_36-4 = 4.6 Hz, ²J_33-36 = 13.9 Hz, H-3e), 2.15-1.84 (m, 15H, 4*COCH₃, NHCOCH₃), 1.79 (dd, IH, ³J_3a-4 =11.3 Hz, ²J_33-36 = 13.9 Hz, H-3a). ¹³C-NMR (100.6 MHz, MeOD): δ [ppm] = 169.1 (C-I), 99.3 (C-2), 74.3 (C-6), 70.2 (C-8), 69.1 (C-4), 67.2 (C-7), 62.5 (C-9), 54.2 (COOCH₃), 49.3 (C-5), 41.0 (C-3), 21.4 (NHCOCH₃).

Methyl-(benzyl-5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetyI-3,5-didesoxy-D-^/jcerö-α-D-gα/αcto-2- nonulopyranosid)onat (4)

0.4 in MeOH)

Die folgende Reaktion wird in drei gleichen Ansätzen durchgeführt. Das ß-Sialylchlorid 3 wird als Edukt (389 mg, 78 μmol) in 24.0 mL DCM gelöst. In einem weiteren Kolben wird unter Licht- und Feuchtigkeitsausschluss eine Lösung von 3.7 mL Benzylalkohol (39 mmol),

950 mg Silbercarbonat (3.45 mmol) und 3.0 g Molekularsieb 4Ä in 30.O mL CH₂Cl₂ bereitgestellt. Die Lösung des Eduktes wird zu der zweiten Lösung hinzugegeben und das Reaktionsgemisch für 48 h bei RT gerührt. Die Reaktion wird dünnschichtchromatographisch verfolgt. Danach wird das Reaktionsgemisch filtriert, mit je 2O mL I M Natriumthiosulfatlösung und bidestilliertem Wasser gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum destillativ entfernt. Die drei Ansätze werden vereinigt. Der zurückbleibende Benzylalkohol wird mittels Säulenfϊltration (Elutionsmittel: Toluol) abgetrennt. Nachdem der Benzylalkohol dünnschichtchromatographisch nicht mehr nachzuweisen ist, wird das Produkt mittels Ethylacetat von der Säule eluiert. Es werden 1.16 g (1.99 mmol) eines weißen Schaums erhalten. Das entspricht einer Ausbeute von 87 % bezogen auf die eingesetzte Menge Produkt 3.

¹H-NMR (400 MHz, MeOD): δ [ppm] = 7.35-7.25 (m, 5H, Ar-H), 5.47 (ddd, IH, ³J_7-8 = 8.7 Hz, ³J_8-93 = 2.7 Hz, ³J_8-90 = 5.9 Hz, H-8), 5.35 (dd, IH, ³J_6-7 = 2.2 Hz, ³J_7-8 = 8.7 Hz, H-7), 4.84 (ddd, IH, H-4), 4.78 (d, IH, ²J_A1-_CH2= 11.9 Hz, Ar-CH₂a), 4.43 (d, IH, ²JAr-CH₂= 11.9 Hz, Ar-CH₂b), 4.34 (dd, IH, ³J_8-93 = 2.7 Hz, ²J_9a-9b = 12.4 Hz, H-9a), 4.21 (dd, IH, ³J_5-6 = 10.5 Hz, ³J_6-7 = 2.2 Hz, H-6), 4.07 (dd, IH, ³J_8-9b = 5.9 Hz, ²J_93-91, = 12.4 Hz, H-9b), 4.00 (dd, IH, ³J_5-6 = 10.5 Hz, H-5), 3.70 (s, 3H, COOCH₃), 2.69 (dd, IH, ³J_36-4 = 4.6 Hz, ²J_33-36 = 12.7 Hz, H-3e), 2.15-1.84 (m, 15H, 4*COCH₃, NHCOCH₃), 1.88 (dd, IH, ³J_33-4 = 12.0 Hz, ²J_3a-3e = 12.7 Hz, H-3a).

¹³C-NMR (100.6 MHz, MeOD): δ [ppm] = 171.1 (4x COCH₃, NHCOCH₃), 169.1 (C-I), 128.1 (Ar-C), 138.1 (Ar-C), 99.3 (C-2), 73.0 (C-6), 70.6 (C-4), 69.2 (C-8), 68.4 (C-7), 67.4 (Ar-CH₂), 63.0 (C-9), 53.1 (COOCH₃), 49.8 (C-5), 38.7 (C-3), 22.2 (NHCOCH₃).

Methyl-(benzyl-5-acetamido-3,5-didesoxy-D-g(vcero-α-D-^fl/αc/o-2-nonulopyranosid)onat

(5)

MeOH)

104 mg (18 μmol) Edukt 4 werden in 9.7 mL absolutem MeOH gelöst, eine Spatelspitze Molsieb 4Ä hinzugegeben und die Reaktionslösung durch Zugabe von NaOMe auf pH 8 eingestellt. Nach 1 h wird der Reaktionsverlauf dünnschichtchromatographisch überprüft. Der pH- Wert wird während der Reaktion alle 15 min kontrolliert.

Nach 2 h wird das Reaktionsgemisch durch Zugabe eines kleinen Stückes Trockeneis neutralisiert (pH ca. 5.5). Dann wird das Lösungsmittel im Vakuum destillativ entfernt. Es wird ein weißer Feststoff in einer Auswaage von 65.7 mg (16 μmol) erhalten. Das entspricht 89 % Ausbeute bezogen auf die eingesetzte Menge 4.

¹H-NMR (400 MHz, MeOD): δ [ppm] = 7.39-7.23 (m, 5H, Ar-H), 4.81 (d, IH, ²J_AΓ-_CH2= 11.6 Hz, Ar-CH₂a), 4.51 (d, IH, ²J_AΓ-_CH2= 1 1.6 HZ, Ar-CH₂b), 3.91-3.88 (m, IH, ³J_7-8 = 10.3 Hz, H-7), 3.87 (dd, IH, ³J_8-9b = 4.8 Hz, H-9b), 3.84-3.82 (m, IH, H-5), 3.76 (s, 3H, COOCH₃), 3.70-3.60 (m, 4H, H-9a, H-6, H-5, H-4), 3.53 (ddd, IH, ³J_7-8 = 10.3 Hz, ³J_8-9b = 4.8 Hz, H-8), 2.73 (dd, IH, ²J_3a-3e = 12.8 Hz, H-3e), 1.99 (s, 3H, NHCOCH₃), 1.81 (dd, IH, ²J_3a-3e = 12.8 Hz, H-3a).

13 C-NMR (100.6 MHz, MeOD): δ [ppm] = 173.5 (NHCOCH3), 169.7 (C-I), 128.8 (Ar-C), 99.3 (C-2), 74.9 (C-6), 72.1 (C-T), 70.2 (C-8), 68.2 (C-4), 67.0 (Ar-CH₂), 64.7 (C-9), 53.5 (C- 5), 53.0 (COOCH₃), 41.5 (C-3), 22.5 (NHCOCH₃).

Methyl-φenzyl-S-acetamido-S^-didesoxy-S-formyl-D-^fycerö-α-D-^α/αciO-I- octulopyranosid)onat (6)

C₁₈H₂₃NO₈

38 mg 5 (92 μmol) werden in 4 mL bidest. H₂O gelöst und langsam (ca. 2 min) tropfenweise unter starkem Rühren mit einer Lösung von 20 mg NaIO₄ (92 μmol), gelöst in 1 mL bidest. H₂O, versetzt. Der pH- Wert wird während der Reaktion überprüft und auf pH 6 korrigiert.

Das Reaktionsgemisch wird 30 min gerührt. Die Reaktion wird dünnschichtchromatographisch (EE/MeOH = 4/1) kontrolliert. Nach Reaktionsende wird die Lösung durch Zugabe von gesättigter Na₂CO₃-LoSiUIg neutralisiert. Das während der Reaktion entstehende Iodat wird durch Zugabe einiger Spatelspitzen Amberlite MB-3 Mixbedionenaustauscher entfernt, der Ionenaustauscher wird nach Ende der Reaktion abfiltriert und das Produkt lyophillisiert. Es werden 36 mg Rohprodukt erhalten. Im Rohprodukt ist als Nebenprodukt auch die um zwei Methylengruppen verkürzte Neu5Ac- Spezies 6a entstanden. Das Rohprodukt wird unaufgereinigt direkt in der nächsten Reaktion eingesetzt. Aufgrund des Vorliegens mehrer Spezies nebeneinander werden in der NMR- Auswertung nur die eindeutig zu identifizierenden Signale erwähnt.

¹H-NMR (400 MHz, MeOD): δ [ppm] = 7.42-7.31 (m, 5H, Ar), 4.76 (d, IH, Ar-CH₂a), 4.55 (d, IH, Ar-CH₂b), 3.84 (dd, IH, H-6), 3.69 (ddd, IH, H-4), 3.52 (dd, IH, H-5), 2.68 (dd, IH,

¹J_36-4 = 11.9 Hz, ^zJ_3a-3e = 12.7 Hz,H-3e), 2.00 (s, 3H, NHCOCH₃), 1.79 (dd, IH, 3 %i _a-4 = 11.3 Hz, ²J_3a-3e = 12.7 Hz, H-3a).

¹³C-NMR (100.6 MHz, MeOD): δ [ppm] = 131.9 (Ar-C), 130.1 (Ar-C), 74.5 (C-6), 69.7 (C- 5), 68.5 (C-4), 69.3 (Ar-CH₂), 40.8 (C-3), 22.4 (NHCOCH₃). Methyl-iV-{[methyl-(benzyl-5-acetamido-3,5,8-tridesoxy-4,7-dihydroxy-α-D-^α/αcto-2- octulopyranosid)onat]-8-yl}-L-phenylalaninat (7)

MALDI-TOF-MS: m/z = 545.1 [M+H]⁺ m/z = 567.1 [M+Na]⁺

50.0 mg 6 (0.13 mmol) werden in 6 mL H₂O gelöst. Dazu werden 28.0 mg L-Phenylalaninmethylester (130 μmol) gegeben. Der pH-Wert des Reaktionsgemisches wird auf pH 6 eingestellt.

4.0 mg NaCNBH₃ (70 μmol) werden in 1.5 mL H₂O gelöst und zur Reaktionslösung hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei RT über Nacht gerührt.

Nachdem der Umsatz der Produkte dünnschichtchromatographisch nachgewiesen worden ist, wird das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und das Rohprodukt säulenchromatographisch (Laufmittel: DCM/MeOH = 9/1) aufgereinigt. Es werden 30.3 mg (60 μmol) eines farblosen Sirups erhalten. Das entspricht 75 % Ausbeute bezogen auf das eingesetzte Produkt 6.

¹H-NMR (500 MHz, D₂O): δ [ppm] = 7.23-7.14 (m, 5H, Ar-H), 7.13-7.01 (m, 5H, Phe-Hδ, Phe-Hδ', Phe-Hε, Phe-Hε', Phe-Hζ), 4.46 (d, IH, ²J_AΓ-_CH2= 10.8 Hz, Ar-CH₂a), 4.24 (d, IH, ²J_AΓ-_CH2= 10.8 HZ, Ar-CH₂b), 3.82 (s, 3H, COOCH₃), 3.80 (ddd, IH, ³J_6-7 = 10.4 Hz, H-7), 3.71 (dd, IH, Phe-Hα), 3.58 (s, 3H, Phe-COOCH₃), 3.57 (dd, IH, ³J_4-5 = 10.1 Hz, ³J_5-6= 10.3 Hz, H-5), 3.47 (ddd, IH, ³J_33-4 = 11.9Hz, ³J_36-4 = 4.7 Hz, ³J_4-5 = 10.1 Hz, H-4), 3.41 (dd, IH, ³J_5-6= 10.3 Hz, ³J_6-7 = 10.4 Hz, H-6), 3.10-2.98 (m, 4H, H-8a, H-8b, Phe-Hßa, Phe-Hßb), 2.52 (dd, IH, ³J_36-4 = 4.7 Hz, ²J_3a-3e = 12.2 Hz, H-3e), 1.80 (s, 3H, NHCOCH₃), 1.45 (dd, IH, ³J_33-4 = 11.9Hz, ²J_3a._3e = 12.2 Hz, H-3a). ¹³C-NMR (100.6 MHz, D₂O): δ [ppm] = 171.8 (Phe-COOCH₃), 175.3 (NHCOCH₃), 173.6 (C-I), 129.0 (Ar-C), 128.5 (Phe-Ar-C), 102.0 (C-2), 73.9 (C-6), 67.6 (C-4), 66.9 (Ar-CH₂), 64.3 (C-T), 63.8 (Phe-Cα), 53.0 (Phe-COOCH₃), 52.5 (COOCH₃), 52.0 (C-5), 50.0 (C-8), 40.0 (C-3), 35.4 (Phe-Cß), 21.9 (NHCOCH₃).

7V-[(Benzyl-5-acetamido-3,5,8-tridesoxy-4,7-dihydroxy-α-D-^α/αcto-2-octuIopyranosid)- 8-vl|-L-phcnyialanin SV-8 (8)

ESI-MS: m/z = 515 [M-H]-

30.3 mg 7 (60 μmol) werden in 5.6 mL 0.1 M NaOH gelöst und bei RT gerührt. Die Reaktion wird dünnschichtchromatographisch verfolgt und nach 15 min durch Neutralisation mit Amberlite IR 120 (H⁺) abgebrochen. Nachdem der pH- Wert 7 erreicht war, wird der Ionenaustauscher zügig abfiltriert und mehrmals mit Wasser gewaschen. Das erhaltene Rohprodukt wird an der Lyophylle gefriergetrocknet.

Es wird ein beiger Feststoff in einer Auswaage von 29.9 mg (60 μmol) erhalten. Das entspricht einer Ausbeute von 100 % bezogen auf die eingesetzte Menge 7.

¹H-NMR (500 MHz, D₂O): δ [ppm] = 7.23-7.14 (m, 5H, Ar-H), 7.13-7.01 (m, 5H, Phe-Hδ, Phe-Hδ', Phe-Hε, Phe-Hε', Phe-Hζ), 4.46 (d, IH, ²J_AΓ-_CH2= 10.8 Hz, Ar-CH₂a), 4.24 (d, IH,

²J_AΓ-_CH2= 10.8 HZ, Ar-CH₂b), 3.80 (ddd, IH, ³J_6-7 = 10.4 Hz, U-T), 3.71 (dd, IH, Phe-Hα),

3.57 (dd, IH, ³J_4-5 = 10.1 Hz, ³J_5-6= 10.3 Hz, H-5), 3.47 (ddd, IH, ³J_33-4 = 11.9 Hz, ³J_36-4 =

4.7 Hz, ³J_4-5 = 10.1 Hz, H-4), 3.41 (dd, IH, ³J_5-6= 10.3 Hz, ³J_6-7 = 10.4 Hz, H-6), 3.10-2.98 (m,

4H, H-8a, H-8b, Phe-Hß, Phe-Hß'), 2.52 (dd, IH, ³J_36-4 = 4.7 Hz, ²J_3a-3e = 12.2 Hz, H-3e), 1.80 (s, 3H, NHCOCH₃), 1.45 (dd, IH, ³J_3a-4 = 11.9 Hz, ²J_3a-3e = 12.2 Hz, H-3a). ¹³C-NMR (100.6 MHz, D₂O): δ [ppm] = 171.8 (Phe-COOH), 175.3 (NHCOCH₃), 173.6 (C- 1), 129.0 (Ar-C), 128.5 (Phe-Ar-C), 102.0 (C-2), 73.9 (C-6), 67.6 (C-4), 66.9 (Ar-CH₂), 64.3 (C-7), 63.8 (Phe-Cα), 52.0 (C-5), 50.0 (C-8), 40.0 (C-3), 35.4 (Phe-Cß), 21.9 (NHCOCH₃).

Methyl-N- { [methyl-(benzyl-5-acetamido-3,5,8-tridesoxy-4,7-dihydroxy-α-D-^β/αcι'ö-2- octu!opyranosid)onat]-8-yI}-L-tryptophanat (9)

m/z = 606.4 [M+Na]⁺

20.0 mg 6 (50 μmol) werden in 5 mL H₂O gelöst. Dazu werden 12.7 mg L- Tryptophanmethylester (50 μmol) gegeben. Der pH- Wert des Reaktionsgemisches wird auf pH 6 eingestellt und das Reaktionsgemisch 20 min bei 60 °C unter Rückfluss erhitzt. Nach dem Abkühlen werden 1.6 mg NaCNBH₃ (25 μmol), gelöst in 1 mL H₂O, zur Reaktionslösung hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei RT über Nacht gerührt.

Nachdem dünnschichtchromatographisch keine Edukte mehr nachzuweisen sind, wird das Lösungsmittel im Vakuum destillativ entfernt und das Rohprodukt säulenchromatographisch (Laufmittel DCM/MeOH = 15:1) aufgereinigt. Es werden 6.5 mg (10 μmol) eines weißen Feststoffes erhalten. Das entspricht einer Ausbeute von 20 % bezogen auf die eingesetzte Menge 6. Das NMR-Spektrum zeigt geringe Verunreinigungen, so dass auf eine Bestimmung des optischen Drehwertes verzichtet wird. Das Produkt wird ohne weitere Aufreinigung in der nächsten Reaktion eingesetzt.

¹H-NMR (500 MHz, D₂O): δ [ppm] = 7.36-7.28 (m, 5H, Ar-H), 7.28-7.24 (m, 3H, Indol-H-2, Indol-H-4, Indol-H-7), 7.05-7.15 (m, 2H, Indol-H-5, Indol-H-6), 4.43 (d, IH, ²J_AΓ-_CH2= 10.7 Hz, Ar-CH₂a), 4.22 (d, IH, ²J_AΓ-_CH2= 10.7 Hz, Ar-CH₂b), 3.99 (dd, IH, Trp-Hα), 3.95 (s, 3H, COOCH₃), 3.92 (ddd, IH, ³J_6-7 = 10.4 Hz, H-7), 3.71 (s, 3H, Phe-COOCH₃), 3.70 (dd, IH, H-5), 3.58 (ddd, IH, ³J_33-4 = 12.6 Hz, ³J_36-4 = 4.7 Hz, ³J_4-5 = 10.0 Hz, H-4), 3.54 (dd, IH, ³J_5-6 = 10.2 Hz, ³J_6-7 = 10.4 Hz, H-6), 3.50-3.35 (m, 2H, Trp-Hß, Trp-Hß'), 3.27-3.14 (m, 2H, H-8a, H-8b), 2.65 (dd, IH, ³J_36-4 = 4.7 Hz, ²J_3a-3e = 12.4 Hz, H-3e), 1.94 (s, 3H, NHCOCH₃), 1.58 (dd, IH, ³J_33-4 = 12.6 Hz, ²J_3a-3e = 12.4 Hz, H-3a).

¹³C-NMR (100.6 MHz, D₂O): δ [ppm] = 174.7 (TrP-COOCH₃), 174.7 (NHCOCH₃), 172.8 (C-I), 128.2 (Trp-Ar-C-3), 128.0 (Ar-C), 124.1 (Trp-Ar-C-4), 121.6 (Trp-Ar-C-5), 119.0 (Trp-Ar-C-6), 111.4 (Trp-Ar-C-7), 101.1 (C-2), 73.7 (C-6), 67.2 (C-4), 66.3 (Ar-CH₂), 63.9 (C-7), 62.8 (Tφ-Cα), 53.7 (Trp-COOCH₃), 52.2 (COOCH₃), 51.6 (C-5), 49.6 (C-8), 39.7 (C- 3), 25.0 (Trp-Cß), 21.6 (NHCOCH₃).

iV-[(Benzyl-5-acetamido-3,5,8-tridesoxy-4,7-dihydroxy-α-D-^fl/αcto-2-octulopyranosid)- 8-yl]-L-tryptophan SV-IO (10)

MALDI-TOF-MS: m/z = 556.6 [M+H]⁺ m/z = 578.6 [M+Na]⁺

28.0 mg des Tryptophanderivates 9 (50 μmol) werden in 3 mL 0.1 M NaOH gelöst und bei RT gerührt. Die Reaktion wird dünnschichtchromatographisch verfolgt und nach 15 min durch Neutralisation mit Amberlite IR 120 (H⁺) abgebrochen. Nachdem der pH-Wert 6-7 erreicht ist, wird der Ionenaustauscher zügig abfiltriert und mehrmals mit bidestilliertem Wasser gewaschen. Die erhaltene Lösung wird gefriergetrocknet. Die erhaltenen 6.5 mg Rohprodukt werden mittels einer Biogel-P2-Säule aufgereinigt. Es wird ein weißer Feststoff in einer Auswaage von 3.3 mg (6 μmol) erhalten. Das entspricht einer Ausbeute von 12 % bezogen auf die eingesetzte Menge 9.

¹H-NMR (500 MHz, D₂O): δ [ppm] = 7.36-7.28 (m, 5H, Ar-H), 7.28-7.24 (m, 3H, Indol-H-2, Indol-H-4, Indol-H-7), 7.05-7.15 (m, 2H, Indol-H-5, Indol-H-6), 4.43 (d, IH, ²J_AΓ-_CH2= 10.7 Hz, Ar-CH₂a), 4.22 (d, 1 H, ²J_Ar-_Cm= 10.7 Hz, Ar-CH₂b), 3.99 (dd, IH, Trp-Hα), 3.92 (ddd, IH, ³J_6-7 = 10.4 Hz, H-7), 3.70 (dd, IH, ³J_4-5 = 10.0 Hz, ³J_5-6 = 10.2 Hz, H-5), 3.58 (ddd, IH, ³J_33-4 = 12.6 Hz, ³J_36-4 = 4.7 Hz, ³J_4-5 = 10.0 Hz, H-4), 3.54 (dd, IH, ³J_5-6 = 10.2 Hz, ³J_6-7 = 10.4 Hz, H-6), 3.50-3.35 (m, 2H, Trp-Hß, Try-Hß'), 3.27-3.14 (m, 2H, H-8a, H-8b), 2.65 (dd, IH, ³J_36-4 = 4.7 Hz, ²J_3a-3e = 12.4 Hz, H-3e), 1.94 (s, 3H, NHCOCH₃), 1.58 (dd, IH, ³J_3a-4 = 12.6 Hz, ²J_3a-3e = 12.4 Hz, H-3a).

¹³C-NMR (100.6 MHz, D₂O): δ [ppm] = 174.6 (Trp-COOH), 174.7 (NHCOCH₃), 172.8 (C- 1), 128.2 (Trp-Ar-C-3), 128.0 (Ar-C), 124.1 (Trp-Ar-C-4), 121.6 (Trp-Ar-C-5), 119.0 (Trp- Ar-C-6), 111.4 (Trp-Ar-C-7), 101.1 (C-2), 73.7 (C-6), 67.2 (C-4), 66.3 (Ar-CH₂), 63.9 (C-7),

62.8 (Tφ-Cα), 51.6 (C-5), 49.6 (C-8), 39.7 (C-3), 25.0 (Trp-Cß), 21.6 (NHCOCH₃).

Methyl-Λ'-{[methyl-(beiizyl-5-acetamido-3,5,8-tridesoxy-4,7-dihydroxy-α-D-gα/αciO-2- octulopyranosid)onat] -8-yI}-L-ty rosinat (13)

40.0 mg 6 (100 μmol) werden in 6 mL H₂O gelöst. Dazu werden 19.5 mg L-Tyrosinmethylester (100 μmol) gegeben. Der pH- Wert des Reaktionsgemisches wird geprüft und auf pH 6 korrigiert. Das Reaktionsgemisch wird für 20 min bei 60 °C unter Rückfluss erhitzt. Nach dem Abkühlen werden 3.1 mg NaCNBH₃ (50 μmol), in 1 mL H₂O gelöst, zur Reaktionslösung hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei RT über Nacht gerührt.

Nachdem die vollständige Umsetzung der Edukte dünnschichtchromatographisch nachgewiesen worden ist, wird das Lösungsmittel im Vakuum destillativ entfernt und das

Rohprodukt säulenchromatographisch (Laufmittel DCM/MeOH = 8:2) aufgereinigt. Es werden 8.9 mg (20 μmol) eines weißen Feststoffes erhalten. Das entspricht einer Ausbeute von 20 % bezogen auf die eingesetzte Menge 6. Das NMR-Spektrum zeigt eine geringe Verunreinigung, so dass auf eine Bestimmung der optischen Drehung verzichtet wird. Das Produkt wird ohne weitere Aufreinigung in der nächsten Stufe eingesetzt.

¹H-NMR (500 MHz, D₂O): δ [ppm] = 7.40-7.31 (m, 5H, Ar-H), 7.12 (d, 2H, Tyr-Hε, Tyr-Hε'), 6.73 (d, 2H, Tyr-Hδ, Tyr-Hδ'), 4.60 (d, IH, ²J_AΓ-_CH2= 11.2 Hz, Ar-CH₂a), 4.39 (d, IH, ²J_AΓ-_CH2= 11.2 Hz, Ar-CH₂b), 3.97 (ddd, IH, ³J_6-7 = 10.7 Hz, H-7), 3.93 (dd, IH, Tyr-Hα), 3.74 (dd, IH, ³J_4-5 = 10.0 Hz, ³J_5-6 = 10.2 Hz, H-5), 3.65 (s, 3H, COOCH₃), 3.64 (ddd, IH, ³J_3a-4 = 11.9 Hz, ³J_36-4 = 4.6 Hz, ³J_4-5 = 10.0 Hz, H-4), 3.58 (dd, IH, ³J_5-6 = 10.2 Hz, ³J_6-7 = 10.7 Hz, H-6), 3.25 (s, 3H, Tyr-COOCH₃), 3.22 (dd, 2H, H-8a, H-8b), 3.15 (m, 2H, Tyr-Hß, Tyr-Hß'), 2.68 (dd, IH, ³J_3e-4 = 4.6 Hz, ²J_3a-3e = 12.5 Hz, H-3e), 1.98 (s, 3H, NHCOCH₃), 1.65 (dd, IH, ³J_38-4 = 11.9 Hz, ²J_3a-3e = 12.5 Hz, H-3a).

¹³C-NMR (100.6 MHz, D₂O): δ [ppm] = 175.1 (NHCOCH₃), 172.3 (C-I), 171.8 (Tyr- COOH), 130.2 (Tyr-Cε, Tyr-Cε'), 128.1 (Ar-C), 115.2 (Tyr-Cδ, Tyr-C δ'), 100.6 (C-2), 73.7 (C-6), 67.2 (C-4), 66.9 (Ar-CH₂), 64.0 (C-7), 63.4 (Tyr-Cα), 52.8 (Tyr-COOCH₃), 52.2 (COOCH₃), 51.6 (C-5), 49.5 (C-8), 39.8 (C-3), 34.2 (Tyr-Cß), 21.7 (NHCOCH₃).

iV-[(Beii^l-5-acetamido-3,5,8-tridesoxy-4,7-dihydroxy-α-D-^α/αcιO-2-octulopyranosid)- 8-yl]-L-tyrosin SV-14 (14)

MALDI-TOF-MS: m/z = 533.6 [M+H]⁺

8.9 mg des Tyrosin-Derivates 13 (56 μmol) werden in 3 mL 0.1 M NaOH gelöst und bei RT gerührt. Die Reaktion wird mittels Dünnschichtchromatographie untersucht und nach 15 min durch Neutralisation mit Amberlite IR HO (H⁺) abgebrochen. Nachdem der pH- Wert 6-7 erreicht ist, wird der Ionenaustauscher zügig abfiltriert und mehrmals mit Wasser gewaschen. Das erhaltene Produkt wird gefriergetrocknet. Nach Aufreinigung mit Hilfe der Biogel-P-2- Säule werden 2.5 mg des Rohproduktes erhalten. Die Aufreinigung erfolgt mittels HPLC (AVV5). Es wird ein weißer Feststoff in einer Auswaage von 0.6 mg (1 μmol) erhalten. Das entspricht einer Ausbeute von 2 % bezogen auf die eingesetzte Menge 13.

¹H-NMR (500 MHz, D₂O): δ [ppm] = 7.40-7.31 (m, 5H, Ar-H), 7.12 (d, 2H, Tyr-Hε, Tyr- Hε'), 6.73 (d, 2H, Tyr-Hδ, Tyr-Hδ'), 4.60 (d, IH, ²J_AΓ-_CH2= 11.2 Hz, Ar-CH₂a), 4.39 (d, IH, ²J_Ar-CHi= 11.2 Hz, Ar-CH₂b), 3.97 (ddd, IH, ³J_6-7 = 9.0 Hz, H-7), 3.93 (dd, IH, Tyr-Hα), 3.74 (dd, IH, ³J_4-5 = 10.0 Hz, ³J_5-6 = 10.2 Hz, H-5), 3.64 (ddd, IH, ³J_33-4 = 11.9 Hz, ³J_36-4 = 4.6 Hz, ³J_4-5 = 10.0 Hz, H-4), 3.58 (dd, IH, ³J_5-6 = 10.2 Hz, ³J_6-7 = 9.0 Hz, H-6), 3.24-3.20 (m, 2H, H- 8a, H-8b), 3.14-3.09 (m, 2H, Tyr-Hß, Tyr-Hß'), 2.68 (dd, IH, ³J_36-4 = 4.6 Hz, ²J_33-36 = 12.5 Hz, H-3e), 1.98 (s, 3H, NHCOCH₃), 1.65 (dd, IH, ³J_33-4 = 11.9 Hz, ²J_3a-3e = 12.5 Hz, H- 3a).

¹³C-NMR (100.6 MHz, D₂O): δ [ppm] = 175.1 (NHCOCH₃), 172.3 (C-I), 171.8 (Tyr- COOH), 130.2 (Tyr-Cε, Tyr-Cε'), 128.1 (Ar-C), 115.2 (Tyr-Cδ, Tyr-Cδ'), 100.6 (C-2), 73.7 (C-6), 67.2 (C-4), 66.9 (Ar-CH₂), 64.0 (C-7), 63.4 (Tyr-Cα), 51.6 (C-5), 49.5 (C-8), 39.8 (C- 3), 34.2 (Tyr-Cß), 21.7 (NHCOCH₃).

Methyl-iV-{[methyl-(ben-ϊyl-5-acetamido-3,5,8-tridesoxy-4,7-dihydroxy-α-L-αrflÄιιιo-2- heptulopyranosid)onat)-7-yl]-L-histidinat (15)

in

m/z = 505.5 [M+H]⁺ m/z = 527.5 [M+Na]⁺ Bei der Periodatspaltung zu Produkt 6 wird als Nebenprodukt auch das zwischen Position 8 und 7 oxidativ gespaltene iV-Acetylneuraminsäurederivat 6a erhalten. Da eine säulenchromatographische Aufreinigung nicht möglich ist, werden 15.0 mg Rohprodukt 6 und 6a (40 μmol) in 4 mL H₂O gelöst. Dazu werden 9.7 mg L-Histidinmethylester (40 μmol) gegeben. Der pH- Wert des Reaktionsgemisches wird auf pH 6 eingestellt. Das Reaktionsgemisch wird für 20 min bei 60 ⁰C unter Rückfluss erhitzt. Nach dem Abkühlen werden 0.5 mg NaCNBH₃ (7 μmol), in 1 mL H₂O gelöst, zur Reaktionslösung hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei RT über Nacht gerührt.

Nach Reaktionsende (DC-Kontrolle) wird das Lösungsmittel im Vakuum destillativ entfernt und das Rohprodukt säulenchromatographisch (Laufmittel DCM/MeOH = 4/1) und anschließend nochmals mittels Biogel-P2-Säule aufgereinigt. Es werden 2.6 mg (5 μmol) eines weißen Feststoffes erhalten. Das entspricht einer Ausbeute von 13 % bezogen auf die eingesetzte Menge Rohprodukt 6 und 6a.

¹H-NMR (500 MHz, D₂O): δ [ppm] = 7.56 (s, IH, Imidazol-H-2), 7.34-7.14 (m, 5H, Ar-H), 6.89 (s, IH, Imidazol-H-5), 4.49 (d, IH, ²JAΓ-CH2= 10.4 Hz, Ar-CH₂a), 4.22 (d, IH, ²J_AΓ-_CH2= 10.4 Hz, Ar-CH₂b), 3.89-3.81 (m, 2H, His-Hα, H-6), 3.60 (COOCH₃), 3.49 (HiS-COOCH₃), 3.49-3.41 (ddd, IH, ³J_33-4 = 12.5 Hz, ³J_36-4 = 4.4 Hz, ³J_4-5 = 10.3 Hz, H-4), 3.34 (dd, IH, ³J_4-5 = 10.3 Hz, H-5), 3.08-2.93 (m, 4H, H-7a, H-7b, His-Hß, His-Hß'), 2.49 (dd, IH, ³J_36-4 = 4.4 Hz, ²J_3a-3e = 12.1 Hz, H-3e), 1.80 (s, 3H, NHCOCH₃), 1.47 (dd, IH, ³J_33-4 = 12.5 Hz, ²J_3a-3e = 12.1 Hz, H-3a).

¹³C-NMR (100.6 MHz, D₂O): δ [ppm] = 174.9 (NHCOCH₃), 173.3 (C-I), 173.2 (His- COOH), 131.8 (Imidazol-C-2), 135.9 (Imidazol-C-5), 128.0 (Ar-C), 101.0 (C-2), 70.0 (C-6), 67.2 (C-4), 66.4 (Ar-CH₂), 61.0 (His-Cα), 53.2 (COOCH₃), 53.1 (HiS-COOCH₃), 52.8 (C-5), 46.9 (C-7), 40.0 (C-3), 26.3 (His-Cß), 21.1 (NHCOCH₃). Λ'-[(Benzyl-5-acetamido-3,5,8-tridesoxy-4,7-dihydroxy-α-L-αrαÄiιio-2- heptuIopyranosid)-7-yl]-L-histidinat SV- 16 (16)

/1)

m/z = 477.5 [M+H]⁺

2.6 mg des Histidin-Derivates 15 (5 μmol) werden in 2 mL 0.1 M NaOH gelöst und bei RT gerührt. Die Reaktion wird dünnschichtchromatographisch verfolgt und nach 15 min durch Neutralisation mit Amberlite IR 120 (H⁺) abgebrochen. Nachdem der pH 6-7 erreicht ist, wird der Ionenaustauscher zügig abfiltriert und mehrmals mit Wasser gewaschen. Das erhaltene Produkt wird an der Lyophylle gefriergetrocknet.

Es wird ein weißer Feststoff in einer Auswaage von 2.4 mg (0.005 mmol) erhalten. Das entspricht einer Ausbeute von 100 % bezogen auf die eingesetzte Menge 15.

¹H-NMR (500 MHz, D₂O): δ [ppm] = 7.56 (s, IH, Imidazol-H-2), 7.34-7.14 (m, 5H, Ar-H), 6.89 (s, IH, Imidazol-H-5), 4.49 (d, IH, ²J_AΓ-_CH2= 10.4 HZ, Ar-CH₂a), 4.22 (d, IH,

10.4 Hz, Ar-CH₂b), 3.89-3.81 (m, 2H, His-Hα, H-6), 3.49-3.41 (ddd, IH, ³J_33-4 = 12.5 Hz,

^JJ_3e-4 = 4.4 Hz, 3 %τ .₅ - = 10.3 Hz, H-4), 3.34 (dd, IH, 3 ^JJτ_4-5. = = 10.3 Hz, H-5), 3.08-2.93 (m, 4H, H- 7a, H-7b, His-Hß, His-Hß'), 2.49 (dd, IH, ³J_3e-4 = 4.4 Hz, ²J_3a-3e = 12.1 Hz, H-3e), 1.80 (s, 3H, NHCOCH₃), 1.47 (dd, IH, ³J_33-4 = 12.5 Hz, ²J_3a-3e = 12.1 Hz, H-3a).

¹³C-NMR (100.6 MHz, D₂O): δ [ppm] = 174.9 (NHCOCH₃), 173.3 (C-I), 173.2 (His- COOH), 135.9 (Imidazol-C-2), 131.8 (Imidazol-C-5), 128.0 (Ar-C), 101.0 (C-2), 70.0 (C-6), 67.2 (C-4), 66.4 (Ar-CH₂), 61.0 (His-Cα), 52.8 (C-5), 46.9 (C-7), 40.0 (C-3), 26.3 (His-Cß), 21.1 (NHCOCH₃). iV-[(BenzyI-5-acetamido-3,5,8-tridesoxy-4,7-dihydroxy-α-L-αrα6ι/io-2- heptulopyranosid)-7-yl]-L-tyrosin SV-18 (18)

Bei der Aufreinigung der Zielverbindung 14 mittels HPLC (AVV5) konnten 0.7 mg (lμmol) der Verbindung 18 als weißer Feststoff isoliert werden. Dies entspricht einer Ausbeute von 1 % bezogen auf die eingesetzte Menge 6.

¹H-NMR (500 MHz, D₂O): δ [ppm] = 7.41-7.27 (m, 5H, Ar-H), 7.17 (d, 2H, Tyr-Hε, Tyr- Hε'), 6.74 (d, 2H, Tyr-Hδ, Tyr-Hδ'), 4.40 (d, IH, ²J_AΓ-_CH2= 1 1.2 HZ, Ar-CH₂a), 4.27 (d, IH, ²JAr-CH₂= 11.2 Hz, Ar-CH₂b), 4.16 (dd, IH, ³J_Tyr-α-ßa= 6.0 Hz, ³J_Tyr-α-ßb= 6.7 Hz, Tyr-Hα), 4.02 (ddd, IH, ³J_5-6 = 10.2 Hz, ³J_6-73 = 10.0 Hz, H-6), 3.57 (ddd, IH, ³J_33-4 = 11.9 Hz, ³J_36-4 = 4.6 Hz, ³J_4-5 = 10.0 Hz, H-4), 3.40 (dd, IH, ³J_4-5 = 10.0 Hz, ³J_5-6 = 10.2 Hz, H-5), 3.25 (dd, IH, ³J_Tyr-α-p = 6.0 Hz, ²J_Tyr-ß-ß' = 8.5 Hz, Tyr-Hß), 3.14 (dd, IH, ³J_6-73 = 10.0 Hz, ²J_7a-7b= 12.7 Hz, H-7a), 3.10 (dd, IH, ³J_6-7b= 11.0 Hz, ²J_7a-7b= 12.7 Hz, H-7b), 3.01 (dd, IH, ³J_Tyr-_α-ß = 6.7 Hz,

²J_33-36 = 12.5 Hz, H-3e), 1.95 (s, 3H, NHCOCH₃), 1.56 (dd, IH, ³J_33-4 = 11.9 Hz, ²J_33-36 = 12.5 Hz, H-3a).

¹³C-NMR (100.6 MHz, D₂O): δ [ppm] = 130.3 (Tyr-Ar-C-3, Tyr-Ar-C-5), 128.3 (Ar-C), 115.4 (Tyr-Ar-C-2, Tyr-Ar-C-6), 69.2 (C-6), 66.5 (Ar-CH₂), 65.9 (C-4), 62.5 (Tyr-C-1), 53.4 (C-5), 47.4 (C-7), 39.2 (C-3), 34.1 (Tyr-CH₂), 21.5 (NHCOCH₃).

Claims

ANSPRUCHE

1. Verbindung mit der allgemeinen Struktur

wobei

Rl ein hydrophober Rest ist;

R2 Wasserstoff (H), ein Kation oder ein Alkylester ist;

R3 Wasserstoff (H) oder eine Gruppe ist, die unter physiologischen

Bedingungen in die Hydroxygruppe überführbar ist; R4 ein hydrophober Rest ist;

R5 Wasserstoff (H) oder ein Alkylrest, ein Aminosäurerest oder ein

Peptidylrest ist; R6 Wasserstoff (H), ein Kation, ein hydrolysierbarer Rest, ein

Aminosäurerest oder ein Peptidrest ist; und X ein Sauerstoffatom (O) oder eine NH-Gruppe ist.

2. Verbindung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass

Rl eine Alkylgruppe oder ein aromatischer Rest ist; und/oder

R2 ein hydrolisierbarer Alkylester ist; und/oder

R3 ein Acetylester ist; und/oder

R4 Wasserstoff, ein aromatischer oder aliphatischer Rest ist.

3. Verbindung nach Anspruch 1 mit einer der folgenden Strukturformeln SV-8, SV- 14, SV- 18, SV-IO oder SV- 16:

4. Verwendung einer der Verbindungen nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prävention und/oder Behandlung degenerativer neuronaler Erkrankungen.

5. Verwendung einer der Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur

Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Verletzungen des zentralen Nervensystems .

6. Verwendung einer der Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Querschnittslähmung.

7. Verfahren zur Herstellung einer der Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 4, gekennzeichnet durch die Schritte:

- Schützen der Carboylgruppen von Neuraminsäurederivaten als Alkylester; - Schützen der Hydroxylgruppen als Acetylgruppen;

- Chlorieren der 2-Position unter Entstehen eines ß-Sialylchlorids;

- Anfügen eines aromatischen Alkohols durch Umsatz mit Benzylalkohol und Silbercarbonat;

- Abspalten der Acetylschutzgruppen, - Spalten der Bindung zwischen der 8-Position und der 9-Position unter

Entstehen einer Aldehydgruppe;

- Anknüpfen einer Aminosäure an die Aldehydgruppe durch reduktive Aminierung; und

- Umsetzen der Methylester zu einer Carbonsäure.