WO2009027550A1 - Inmunoensayo de doble reconocimiento para la detección de anticuerpos - Google Patents

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WO2009027550A1
WO2009027550A1 PCT/ES2008/000524 ES2008000524W WO2009027550A1 WO 2009027550 A1 WO2009027550 A1 WO 2009027550A1 ES 2008000524 W ES2008000524 W ES 2008000524W WO 2009027550 A1 WO2009027550 A1 WO 2009027550A1
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immunoassay
btv
virus
prrsv
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Carmen Vela Olmo
Angel Antonio Venteo Moreno
Antonio José SANZ FERNÁNDEZ
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Inmunología Y Genética Aplicada, S.A.
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    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances

Definitions

  • the invention relates, in general, to a double recognition immunoassay for the detection of antibodies in a sample, of high specificity and sensitivity.
  • the invention also relates to a kit comprising the components necessary to carry out said immunoassay.
  • An immunoassay is an assay based on the specificity of the antigen-antibody binding that allows to detect, and, optionally, quantify, antigens or antibodies.
  • Immunoassays can be classified into immunoassays that use unlabeled reagents (antigens or antibodies) and immunoassays that use labeled reagents in which the reagent (antigen or antibody) is labeled with a label, such as a radioactive isotope, an enzyme, a fluorophore or a substance involved in a luminescent (chemo) reaction, giving rise to so-called radioimmunoassays (eg, RIA, IRMA), enzymatic immunoassays (eg, EMIT, CED ⁇ A, ELISA), fluoroimmunoassays (eg, FPIA, SLFIA, FETI, DELFIA ) or luminoimmunoassays, respectively.
  • a label such as
  • immunoassays that use labeled reagents are homogeneous immunoassays and heterogeneous immunoassays; the latter comprise the realization of one or more separation stages of the antigen or antibody not bound to the other member of the binding pair (antibody or antigen) which, in general, will be bound to a solid phase or support, for example, microplates, magnetic particles, nitrocellulose membranes, etc.
  • heterogeneous immunoassays may be competitive or non-competitive, depending on whether the labeled reagent (antigen or antibody) is added in a limited amount or in excess, respectively.
  • Immunoassays allow the identification of antigens (direct techniques) or antibodies against an antigen (indirect techniques).
  • indirect techniques include indirect immunoassays and blocking or immunoassays. competition.
  • Indirect immunoassays despite having a high sensitivity, present specificity problems due to false positives obtained, usually due to nonspecific background problems.
  • they do not allow IgMs to be detected because anti-IgG antibodies are normally used, so they do not detect positive animals until 2-3 weeks post-infection or post-vaccination.
  • Blocking or competition immunoassays in general, are more specific than indirect but less sensitive immunoassays.
  • immunoassays Due to the specificity and sensitivity of immunoassays, numerous immunoassays have been developed for various applications, both for use in the analysis of environmental or food samples and for diagnostic purposes.
  • infections caused by animal viruses that can be diagnosed by immunoassays are, by way of example, Bluetongue and Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome (PRRS).
  • PRRS Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome
  • the Bluetongue is a disease caused by the Bluetongue virus (BTV), an arbovirus (virus transmitted by arthropods), which naturally infects domestic and wild ruminants, camelids and some other herbivores, such as elephants, although the disease affects sheep almost exclusively, causing acute or subacute clinical courses. In cows and goats, clinical disease is rare, and, when it occurs, it is much milder than in sheep. The affected sheep may die after an acute or chronic illness, or it may recover with weight loss and / or wool breakage.
  • BTV is the prototype virus of the genus Orbivirus (Reoviridaé family).
  • the BTV genome includes 10 distinct segments of double-band RNA (dsRNA) encoding 7 structural proteins (VP1 to VP7) and 4 non-structural proteins (NS1, NS2, NS3 and NS3a).
  • the inner core of BTV is composed of 2 major proteins (VP3 and VP7) and 3 minor proteins (VP1, VP4 and VP6) and is surrounded by an external capsid consisting of VP2 and VP5 (WP 2008/030282).
  • VP3 and VP7 2 major proteins
  • VP1, VP4 and VP6 3 minor proteins
  • WP 2008/030282 There are currently 24 recognized BTV serotypes.
  • Recommended tests for the detection of antibodies and specific serogroups of BTV include agar gel immunodiffusion and a competitive ELISA, preferably the latter due to its greater accuracy and adaptation to rapid conventional laboratory tests and reading technology.
  • the recommended test to detect antibodies to BTV-specific serotypes is the neutralization test.
  • the virus that causes porcine reproductive and respiratory syndrome is an arterivirus that causes porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS). Said virus can cause major reproductive problems in adult sows that can end in abortions as well as respiratory problems, among others, in neonatal pigs or in developing pigs.
  • European patent EP 952219 Bl describes a method for the diagnosis of
  • PRRSV which comprises contacting a biological sample of an animal with a recombinant fusion protein comprising the amino acid sequence of the nucleocapsid (N) protein of PRRSV fused to a fragment of the T10 phage gene 10 protein.
  • the immunoassay provided by this invention has been termed "double recognition immunoassay” as it comprises the recognition and binding of two units of the target antigen to the specific antibody of said target antigen, one of which forms part of a conjugate comprising said target antigen and a marker.
  • Said immunoassay has been validated in reference sera for the 24 recognized bluetongue virus (BTV) serotypes (Example 1) as well as in the detection of specific antibodies of the porcine respiratory and reproductive syndrome virus (PRRSV) (Example 3) and It has a high specificity and sensitivity, as shown in Example 2.
  • BTV bluetongue virus
  • PRRSV porcine respiratory and reproductive syndrome virus
  • Said double recognition immunoassay can be used to detect and, if desired, quantify, antigen specific antibodies of pathogenic organisms in a test sample of a subject, and, thus, diagnose the infection caused by an organism, such as a pathogenic organism in a subject susceptible to being infected by said organism, as well as to detect and, if desired, quantify, specific antibodies of tumor antigens in a test sample of a subject, and, thus, diagnose the existence of a tumor or cancer in a subject, preferably, in a human being, or to detect and, if desired, quantify, allergen-specific antibodies in a test sample of a subject, and, thus, diagnose the existence of an allergic reaction against said allergen in said subject, preferably, in a human being.
  • the invention relates to an immunoassay for detecting a specific antibody of a target antigen in a sample comprising contacting said target antigen with a sample suspected of containing said specific antibody of said target antigen under conditions that allow the formation of an antigen-antibody complex, add a conjugate comprising said target antigen and a marker under conditions that allow the formation of an antigen-antibody-antigen / marker complex, and detect said antigen-antibody-antigen / marker complex.
  • said antibody is a BTV specific antibody, while, in another particular embodiment, said antibody is a PRRSV specific antibody.
  • the invention in another aspect, relates to a kit comprising a support comprising a target antigen and a conjugate comprising said target antigen and a label.
  • said target antigen is a BTV antigen
  • said target antigen is a PRRSV antigen.
  • the invention relates to an immunoassay, hereinafter immunoassay of the invention, to detect a specific antibody of a target antigen in a sample comprising: a) contacting said target antigen with a sample suspected of containing said antibody specific for said target antigen under conditions that allow the formation of an antigen-antibody complex; b) adding a conjugate comprising said target antigen and a label under conditions that allow the formation of an antigen-antibody-antigen / label complex; and c) detecting said antigen-antibody-antigen / marker complex.
  • the immunoassay of the invention allows to detect specific antibodies of target antigens in a test sample.
  • An antibody is an immunoglobulin produced by cells of the B lymphocyte series and secreted by plasma cells in response to stimulation by an antigen, which specifically recognizes said antigen and is capable of selectively binding to said antigen.
  • antigen refers in general to any substance capable of specifically binding an antibody, or inducing an immune response or inducing antibody formation, and includes cells (eg, cells tumor, etc.), organisms (eg, viruses, bacteria, fungi, protozoa, nematodes, etc.), both whole and parts or components thereof (eg, proteins, peptides, lipopolysaccharides, carbohydrates, etc.), of origin native, synthetic or recombinant, identical or similar (that is, capable of being recognized by specific antibodies of native antigens) to the native antigens of an organism or a cell, allergens, etc. Virtually any antigen can be used in the implementation of the immunoassay of the invention to detect antibodies specific to said antigen (target antigen).
  • viral antigens include infectious virus antigens and / or animal pathogens, including humans, such as viruses of the families: Adenoviridae, Arenaviridae, Arteriviridae, Birnaviridae, Bungaviridae, Caliciviridae, Coronoviridae, Filoviridae, Flavirviridae, Flavirviridae, Flavirviridae Hepadnaviridae, Herpesviridae, Iridoviridae, Orthomyxoviridae, Papovaviridae, Paramyxoviridae, Parvoviridae, Picornaviridae, Poxviridae, Reoviridae, Retroviridae, Rhabdoviridae, Togaviridae, etc., which include arbovirus, virus, calvovirus, arterivirus, parvovirus, calvovirus virus pestivirus, poliovirus, retrovirus, rhinovirus, rot
  • Such viruses include porcine cattle pathogenic viruses, for example, porcine parvovirus (PPV), porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), Aujesky's disease virus (ADV), foot-and-mouth disease virus (FDMV), transmissible swine gastroenteritis virus (TGEV), porcine circovirus, etc .; Cattle pathogens, such as bovine viral diarrhea virus (BVDV), bovine rhinotracheitis virus (IBRV), bluetongue virus (BTV), etc .; rabbit pathogens, such as rabbit hemorrhagic disease virus (RHDV), etc .; bird pathogens, by For example, Gumboro disease virus (IBDV), avian pneumovirus, etc. In a particular embodiment, said virus is the bluetongue virus (BTV) or the porcine respiratory and reproductive syndrome virus (PRRSV).
  • porcine cattle pathogenic viruses for example, porcine parvovirus (PPV), porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), Aujesky's disease virus (ADV
  • bacterial antigens include antigens of animal pathogenic bacteria, including humans, both Gram positive and Gram negative.
  • pathogenic bacteria include: Actinornyces israelli, Bacillus aratracis, Bacteroides sp., Bordetella sp., Borelia burgdorferi, Brucella sp., Campylobacter sp. (e.g., C. jejun ⁇ ), Clostridium sp. (e.g., C. perfringers, C. tetani), Corynebacterium sp. (e.g., C.
  • Enterobacter aerogenes Enterococcus sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Escherichia coli, Fusobacterium nucleatum, Helicobacter pylori, Haemophilus influenzae, Klebsiella sp. (e.g., K. pyzeunaoniaé), Legionella pneumoplailia, Listeria monocytogenes, Leptospira, Moraxella catarrhalis, Mycobacteria sp. (e.g., M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansaii, M.
  • Neisseria sp. e.g., N. gonorrhoeae, N. meningitidis
  • Pasteurella sp. e.g., P. multocid ⁇
  • Pseudomonas sp. Rickettsia sp.
  • Salmonella sp. Staphylococcus sp.
  • S. aureus Streptobacillus moniliformis
  • Streptococcus sp. [eg, S. pyogefaes (Group A of Streptococcus), S. agalactiae (Group B of Streptococcus), S. group viridans, S.
  • fungal antigens include animal pathogenic fungal antigens, including humans, such as Blastomyces dermatitidis, Candida albicans, Chlamydia trachomatis, Coccidioides immitis, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, etc.
  • protozoan and nematode antigens include protozoan antigens and pathogenic nematodes of animals, including humans, such as Anaplasma marg ⁇ nale, Dirofilaria immitis, Leishmania sp. (leishmaniasis), Plasmodium sp. (malaria) [e.g., P. falciparum, P. malariae, P. ovale, P. vivax], Schistosoma sp., Toxoplasma sp. (e.g., T. gondii), etc.
  • Anaplasma marg ⁇ nale Dirofilaria immitis
  • Leishmania sp. leishmaniasis
  • Plasmodium sp. (malaria) e.g., P. falciparum, P. malariae, P. ovale, P. vivax
  • Schistosoma sp. e.g., T. gondii
  • Toxoplasma sp.
  • tumor antigens include molecules associated with a tumor or cancerous process capable of eliciting an immune response when presented in the context of an MHC molecule.
  • the selection of tumor antigens can be performed by a person skilled in the art in view of the state of the technique [Renkvist et al., Immunol Cancer. Immunother 50: 3-15 (2001)].
  • tumor antigens include: GD2 (neuroblastoma); EGF-R (malignant glioblastoma); CD52 (leukemia); human melanoma gplOO protein; melanoma-A / MART-1 human melanoma protein; tyrosinase; NA17-A nt protein; MAGE-3 protein; p53 protein; HPV16E7 protein; (CDl Ic) - TRP2; WTl (leukemia and solid tumors); HMl.24 (multiple myeloma); prostate mucin (prostate adenocarcinoma); prostate specific antigen (PSA); SF-25 antigen (colon adenocarcinoma); antigens associated with bladder tumors; MART-I (melanoma); tumor antigens associated with breast cancer [eg, Her2, maglobin, CA 15.3, CA 27.9, MCA (breast cancer antigen), MSA (st cancer antigen), MSA
  • Tumor antigens can be prepared from tumor or cancerous cells by preparing crude extracts of said cells, for example, as described by Cohen, et al., In Cancer Research, 54: 1055 (1994), partially purifying the antigens, by recombinant technology. or by de novo synthesis of known antigens.
  • said antigen is an allergen, that is, a substance to which a subject is sensitive and causes an immune reaction, for example, allergenic extracts of pollens, allergenic extracts of insects, allergenic extracts of food or food products. , components present in saliva, tweezers or stingers of insects that induce a sensitivity reaction in a subject, components present in plants that induce a sensitivity reaction in a subject, etc.
  • allergens include extracts allergens of grasses, arizonic, plantain, olive, etc.
  • allergenic insect extracts eg, dust mites, etc.
  • allergenic extracts from food or food products eg, gliadins, gluten, fish, shellfish, fruits, etc.
  • any allergen can be used in the implementation of the immunoassay of the invention to detect specific antibodies of said allergen (target antigen).
  • the immunoassay of the invention can be used to detect specific antibodies of target antigens in a sample suspected of containing said antibodies (test sample), such as a biological sample, an environmental sample, a laboratory sample, etc.
  • test sample such as a biological sample, an environmental sample, a laboratory sample, etc.
  • biological samples include both tissue and body fluid samples that may contain antibodies specific to said target antigen (eg, blood, serum, plasma, milk, saliva, sputum, cerebrospinal fluid, etc.) .
  • the test sample may be a sample of animal origin suspected of containing specific antibodies to target antigens.
  • said test sample is a sample of cattle, dogs, goats, horses, cats, dogs, sheep, pigs, etc., or a sample of a human being.
  • test sample Before contacting the target antigen, the test sample may be subjected (or not) to a prior treatment, precipitated, fractionated, separated, diluted, concentrated, or purified.
  • test sample will be obtained by conventional methods, known to those skilled in the art, depending on the nature of the sample.
  • said test sample is a biological sample, such as a blood, serum or plasma sample, which can be obtained by any conventional method, for example, by a blood collection, or a saliva sample, which can be Obtained through the use of swabs, etc.
  • the target antigen is contacted with said sample suspected of containing antibodies specific to said target antigen (ie, capable of specifically recognizing or selectively binding to said target antigen) under conditions that allow formation of an antigen-antibody complex [step a)]. If the test sample contains antibodies specific to said target antigen, then said complex will be formed antigen-antibody; otherwise, said complex will not be formed. Therefore, according to the invention, said target antigen acts as a capture reagent for antibodies specific to said target antigen. Suitable conditions for the formation of the antigen-antibody complex to occur are known to those skilled in the art.
  • a conjugate comprising said target antigen and a marker is added under conditions that allow the formation of an antigen-antibody-antigen / marker complex [step b)] and said antigen-antibody-antigen / marker complex [stage] is detected. C)].
  • an antigen-antibody complex will have been previously formed, whereby, when said antigen-antibody complex is contacted with said conjugate comprising the target antigen and the label, in under suitable conditions, the antigen-antibody-antigen / marker complex is formed, which will be visualized by the appropriate technique depending on the marker used, as mentioned below; whereas, otherwise, that is, when the test sample does not contain antibodies specific to said target antigen, then said antigen-antibody-antigen / marker complex will not be formed. Suitable conditions for the formation of the antigen-antibody-antigen / marker complex are known to those skilled in the art.
  • marker refers to an indicator reagent that allows the detection of the antigen-antibody-antigen / marker complex, such as an enzyme that catalyzes a detectable reaction, a compound that generates a signal when it is part of the antigen-antibody-antigen / marker complex, etc.
  • said marker can be an enzyme (eg, peroxidase, glycosidase, alkaline phosphatase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, ⁇ -galactosidase, ⁇ -glucosidase, ⁇ -glucuronidase, etc.), a fluorescent compound or fluorophore (eg, fiuorescein, rhodamine, etc.), a luminescent compound (chemo) (eg, dioxetans, acridiniums, phenanthridines, ruthenium, luminol, etc.), radioactive elements (sulfur, iodine, etc.), etc.
  • an enzyme eg, peroxidase, glycosidase, alkaline phosphatase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, ⁇ -galactosidase, ⁇ -glucosidase, ⁇ -glucuronidase, etc.
  • said marker is a peroxidase.
  • the selection of a particular marker is not critical, as long as it is capable of producing a signal by itself or in conjunction with one or more additional substances.
  • the conjugate comprising said target antigen and said label can be obtained by conventional methods known to those skilled in the art.
  • the antigen-antibody-antigen / marker complex formed can be detected or visualized by any appropriate technique, depending on the chosen marker, known to those skilled in the art, using the appropriate devices, for example, by techniques based on colorimetric, fluorimetric methods, (chemo) luminescent, radioactive, etc., all known to those skilled in the art.
  • the detection of the antigen-antibody-antigen / label complex can be carried out by contacting said complex with an appropriate substrate and, optionally, with the activators and / or enzymatic amplifying agents appropriate.
  • substrates include: • For alkaline phosphatase: Chromogenic: substrates based on p-nitrophenyl phosphate (p-NPP), 5- bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate / nitroblue tetrazolium (BCIP / NPT), etc. .
  • Chromogenic substrates based on 2,2-azinobis (3- ethylbenzothiazolin-6-sulfonic acid) (ABTS), o-phenylenediamine (OPT), 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB), o-dianisidine, 5-aminosalicylic acid, 3-dimethylaminobenzoic acid (DMAB) and 3-methyl-2-benzothiazolinhydrazone (MBTH), 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC) and 3,3'-diaminobenzidine tetrachloride (DAB), etc.
  • ABTS 2,2-azinobis (3- ethylbenzothiazolin-6-sulfonic acid)
  • OPT o-phenylenediamine
  • TMB 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine
  • DMAB 3-dimethylaminobenzoic acid
  • MBTH 2--benzothiazol
  • Fluorogenic 4-hydroxy-3-methoxyphenylacetic acid, reduced phenoxazines and reduced benzothiazines, including the Amplex ® Red reagent, Amplex UltraRed, reduced dihydroxanthenes, etc. •
  • Chromogenic substrates based on o-nitrophenyl- ⁇ -D-galactoside (o-NPG), p-nitrophenyl- ⁇ -D-galactoside and 4-methylumbelliphenyl- ⁇ -D-galactoside (MUG) for ⁇ -D-galactosidase, etc. .
  • Fluorogenic resorufin ⁇ -D-galactopyranoside, fluorescein digalactoside (FDG), fluorescein diglucuronide, 4-methylumbelliferyl beta-D-galactopyranoside, carboxybumbiferifer beta-D-galactopyranoside, coumarin beta-D-galactopyranoside, etc.
  • said marker is a peroxidase, such as horseradish peroxidase
  • the chromogenic substrate is TMB.
  • the immunoassay of the invention can also be used to determine the amount (quantify) of specific antibodies of a target antigen in a test sample since, with many markers, eg enzymes, the amount of antibody present in the test sample is proportional to the generated signal.
  • the immunoassay of the invention is an immunoassay that uses labeled antigens to detect antibodies, homogeneous or heterogeneous.
  • said immunoassay is an immunoassay that uses labeled, heterogeneous antigens;
  • Illustrative, non-limiting examples of such immunoassays include, depending on the label used, enzyme immunoassays, such as ELISA.
  • said immunoassay is an ELISA.
  • the target antigen is immobilized, directly or indirectly, on a support, such as a well of a microtiter plate, magnetic beads, non-magnetic beads, columns, matrices, membranes, etc.
  • a support such as a well of a microtiter plate, magnetic beads, non-magnetic beads, columns, matrices, membranes, etc.
  • These materials can be used in convenient forms, such as films, sheets, plates, etc., or can be used to coat inert carriers.
  • Immobilization of the target antigen on said support includes ionic, hydrophobic, covalent and / or similar interactions.
  • the target antigen is immobilized, directly or indirectly, on a support, such as a well of a microtiter plate.
  • the test sample suspected of containing antibodies specific to said target antigen is incubated with said target antigen for a period of time and under appropriate conditions for antigen-antibody complexes to form.
  • a conjugate comprising said target antigen attached to a label is added and allowed to incubate for a period of time and under appropriate conditions for antigen-antibody-antigen complexes to form /marker. After washing to remove unbound reagents, the formation of said antigen-antibody-antigen / label complexes is revealed. The detection of said antigen-antibody-antigen / marker complexes is indicative of the presence of antibodies specific to said target antigen in the test sample. This type of assay also allows, if desired, to quantify the amount of specific antibodies of the target antigen in the test sample.
  • the immunoassay of the invention can be used to diagnose infection caused by an organism, such as a pathogenic organism (eg, virus, bacteria, fungus, protozoan, nematode, etc.), in a subject susceptible to being infected by said organism.
  • a pathogenic organism eg, virus, bacteria, fungus, protozoan, nematode, etc.
  • subject includes any animal, including humans, in particular, vertebrate animals, preferably mammals, such as horses, pigs, rabbits, cats, sheep, dogs, cows, humans, etc.
  • the immunoassay of the invention can be used to diagnose infection caused by BTV in animals susceptible to being infected regardless of whether or not they develop clinical symptoms (which can act as reservoirs), eg, sheep, cattle, goat, feline, etc.
  • the immunoassay of the invention allows to detect and, if desired, quantify, specific antibodies against BTV in test samples from animals susceptible to being infected by BTV by means of an ELISA (Example 1) comprising contacting an immobilized BTV antigen on a support with a test sample suspected of containing BTV specific antibodies; if said test sample has said antibodies, they will bind to the BTV antigen.
  • the same conjugated BTV antigen is again added to a marker [conjugate antigen / marker], and, in case the test sample contains antibodies against said antigen of BTV, said antibodies could capture the BTV antigen conjugated to the label despite being bound to the BTV antigen immobilized on the well.
  • the antigen-antibody-antigen / marker complex is detected after the addition of a suitable substrate.
  • any BTV antigen can be used in the implementation of the immunoassay previously described; however, by way of illustration, not limitation, in a particular embodiment, said BTV antigen is a structural BTV protein such as VP1, VP2, VP3, VP4, VP5, VP6, VP7, or a combination of two or more of said structural proteins; or a non-structural BTV protein such as NSl, NS2, NS3, NS3a, or a combination of two or more of said non-structural proteins; or, alternatively, a mixture of one or more structural proteins of BTV with one or more non-structural proteins of BTV.
  • structural BTV protein such as VP1, VP2, VP3, VP4, VP5, VP6, VP7, or a combination of two or more of said structural proteins
  • a non-structural BTV protein such as NSl, NS2, NS3, NS3a, or a combination of two or more of said non-structural proteins
  • antigenic fragments of said proteins can be used instead of the complete proteins, as long as said fragments are capable of binding antibodies against BTV, or fusion proteins comprising at least one of said proteins or one of said proteins. antigenic fragments thereof.
  • said proteins (and antigenic fragments) can be both native and synthetic or recombinant in origin.
  • said BTV antigen is a recombinant VP7 BTV protein (Example 1).
  • said support on which a BTV antigen is immobilized is a well of a microtiter plate.
  • any of the markers referred to previously in this description, conjugated to a BTV antigen can be used for the implementation of the previously described immunoassay; however, by way of illustration, not limitation, in a particular embodiment, said marker it is an enzyme, such as a peroxidase) [BTV / peroxidase antigen conjugate], in which case, the detection of the BTV-antibody-BTV / peroxidase antigen complex is performed after the addition of a suitable substrate that develops color in the presence of peroxidase (eg, TMB).
  • the immunoassay of the invention can be used to diagnose infection caused by PRRSV in animals susceptible to being infected by PRRSV regardless of whether or not they develop clinical symptoms (reservoirs), eg, pigs, etc.
  • the immunoassay of the invention allows to detect and, if desired, quantify, specific antibodies against PRRSV in test samples from animals susceptible to be infected by BTV by an ELISA (Example 3) comprising contacting an immobilized PRRSV antigen on a support with a test sample suspected of containing PRRSV specific antibodies; if said test sample has said antibodies, they will bind to the PRRSV antigen.
  • the same conjugated PRRSV antigen is again added to a marker [conjugate antigen / marker], and, in case the test sample contained antibodies against said antigen of PRRSV, said antibodies could capture the PRRSV antigen conjugated to the label despite being bound to the PRRSV antigen immobilized on the well.
  • the antigen-antibody-antigen / marker complex is detected after the addition of a suitable substrate.
  • PRRSV antigen can be used in the implementation of the immunoassay previously described; however, by way of illustration, not limitation, in a particular embodiment, said PRRSV antigen is a structural or non-structural protein of PRRSV, or a combination of two or more of said structural proteins, or a combination of two or more of said non-structural proteins, or, alternatively, a mixture of one or more PRRSV structural proteins with one or more non-structural PRRSV proteins.
  • antigenic fragments of said proteins can be used instead of whole proteins, as long as said fragments are capable of binding antibodies to PRRSV, or fusion proteins comprising at least one of said proteins or one of said proteins. antigenic fragments thereof.
  • said Proteins (and antigenic fragments) can be both native and synthetic or recombinant in origin.
  • said PRRSV antigen is a fusion protein comprising the PRRSV nucleocapsid (N) protein (Example 3).
  • N PRRSV nucleocapsid
  • said support on which a PRRSV antigen is immobilized is a well of a microtiter plate.
  • said marker is an enzyme, such as a peroxidase) [PRRSV / peroxidase antigen conjugate], in which case, the detection of the PRRSV-antibody-antigen antigen complex PRRSV / peroxidase is performed after the addition of a suitable substrate that develops color in the presence of peroxidase (eg, TMB).
  • a peroxidase e.g, TMB
  • the immunoassay of the invention can be used to detect and, if desired, quantify, specific antibodies of tumor antigens in a test sample of a subject, and, thus, diagnose the existence of a tumor or a cancer. in a subject, preferably, in a human being.
  • the immunoassay of the invention can be used to detect and, if desired, quantify, allergen-specific antibodies in a test sample of a subject, and, thus, diagnose the existence of an allergic reaction against said allergen. in said subject, preferably, in a human being.
  • positive and negative controls can also be used.
  • the immunoassay of the invention has been termed "double recognition immunoassay" since it comprises the recognition and binding of two units of the target antigen to the specific antibody of said target antigen, one of which is part of a conjugate comprising said target antigen and a marker.
  • the immunoassay of the invention has a high specificity and sensitivity as shown in Example 2, where it can be seen that the specificity of the immunoassay of the invention applied to the detection of BTV specific antibodies is 99.8% and 100% sensitivity.
  • the high specificity of the immunoassay of the invention seems to be due to the fact that the target antigen must be recognized twice by the same antibody, the first time, when it contacts the immobilized target antigen on the solid phase or support used, and, the second time, when it comes into contact with the labeled target antigen (labeled bound target antigen conjugate), usually in solution or without immobilization.
  • positive and negative controls can also be used, if desired.
  • kit of the invention comprising: i) a support comprising a target antigen; and ii) a conjugate comprising said target antigen and a label.
  • the kit of the invention comprises, in addition to said support (i) and conjugate (ii), means for revealing said marker.
  • Said kit of the invention is particularly useful for practicing the immunoassay of the invention.
  • Said target antigen is capable of being recognized by a specific antibody thereof. Therefore, the kit of the invention can be used to detect, and if desired, quantify antibodies specific to said target antigen in a sample suspected of containing said antibodies.
  • the kit of the invention can be used to diagnose the infection caused by BTV in animals susceptible to being infected by said virus (eg, sheep, cattle, goats, felines, etc.) regardless of whether they present or not clinical symptomatology (in fact, a very interesting application of the kit and immunoassay of the invention consists in its use to identify reservoirs of pathogenic organisms), and comprises a support comprising a BTV antigen and a conjugate comprising said BTV antigen conjugated to a marker, and, optionally, means to reveal the presence of BTV-antibody-BTV antigen / marker complex.
  • said virus eg, sheep, cattle, goats, felines, etc.
  • a very interesting application of the kit and immunoassay of the invention consists in its use to identify reservoirs of pathogenic organisms
  • a support comprising a BTV antigen and a conjugate comprising said BTV antigen conjugated to a marker, and, optionally, means to reveal the presence of BTV-antibody-BTV antigen
  • said BTV antigen is a structural BTV protein such as VP1, VP2, VP3, VP4, VP5, VP6, VP7, or a combination of two or more of said structural proteins; or a non-structural BTV protein such as NSl, NS2, NS3, NS3a, or a combination of two or more of said non-structural proteins; or, alternatively, a mixture of one or more structural proteins of BTV with one or more non-structural proteins of BTV.
  • structural BTV protein such as VP1, VP2, VP3, VP4, VP5, VP6, VP7, or a combination of two or more of said structural proteins
  • a non-structural BTV protein such as NSl, NS2, NS3, NS3a, or a combination of two or more of said non-structural proteins
  • a mixture of one or more structural proteins of BTV with one or more non-structural proteins of BTV is a structural BTV protein such as VP1, VP2, VP3, VP4,
  • antigenic fragments of said proteins can be used instead of the complete proteins, as long as said fragments are capable of binding antibodies against BTV, or fusion proteins comprising at least one of said proteins or one of said proteins. antigenic fragments thereof.
  • said proteins (and antigenic fragments) can be both native and synthetic or recombinant in origin.
  • said BTV antigen is a recombinant VP7 BTV protein (Example 1).
  • the support present in said kit can be practically any of the supports referred to previously in this description; however, by way of illustration, not limitation, in a particular embodiment, said support on which a BTV antigen is immobilized is a microtiter plate.
  • said marker is an enzyme, such as a peroxidase) [BTV / peroxidase antigen conjugate]
  • said kit may contain, if desired, means to reveal the presence of BTV-antibody-BTV antigen / marker complex (eg, TMB when the marker is a peroxidase).
  • the kit of the invention can be used to diagnose infection caused by PRRSV in animals susceptible to being infected by said virus (eg, pigs, etc.) regardless of whether or not they present clinical symptoms, and comprise a support comprising a PRRSV antigen and a conjugate comprising said PRRSV antigen conjugated to a label, and, optionally, means for revealing the presence of PRRSV-antibody-PRRSV antigen / marker antigen complex.
  • PRRSV antigen any PRRSV antigen can be used in said kit; however, by way of illustration, not limitation, in a particular embodiment, said PRRSV antigen is a structural or non-structural protein of PRRSV, or a combination of two or more of said structural proteins, or a combination of two or more of said non-structural proteins, or, alternatively, a mixture of one or more PRRSV structural proteins with one or more non-structural PRRSV proteins.
  • antigenic fragments of said proteins can be used instead of whole proteins, as long as said fragments are capable of binding antibodies to PRRSV, or fusion proteins comprising at least one of said proteins or one of said proteins. antigenic fragments thereof.
  • said proteins (and antigenic fragments) can be both native and synthetic or recombinant in origin.
  • said PRRSV antigen is a fusion protein comprising the PRRSV nucleocapsid (N) protein (Example 3).
  • the support present in said kit can be practically any of the supports referred to previously in this description; however, to illustrative, non-limiting way, in a particular embodiment, said support on which a PRRSV antigen is immobilized is a microtiter plate.
  • said conjugate comprising a PRRSV antigen and a marker; however, by way of illustration, not limitation, in a particular embodiment, said marker is an enzyme, such as a peroxidase) [PRRSV / peroxidase antigen conjugate], in which case, said kit may contain, if desired, means to reveal the presence of PRRSV-antibody-PRRSV antigen / label complex (eg, TMB when the label is a peroxidase).
  • a peroxidase an enzyme, such as a peroxidase
  • said kit may contain, if desired, means to reveal the presence of PRRSV-antibody-PRRSV antigen / label complex (eg, TMB when the label is a peroxidase).
  • the kit of the invention can be used to detect and, if desired, quantify, specific antibodies of tumor antigens in a test sample of a subject, and, thus, diagnose the existence of a tumor or a cancer. in a subject, preferably, in a human being.
  • the following examples illustrate the invention and should not be considered as limiting its scope.
  • BTV recombinant protein VP7 (rVP7) was used as BTV antigen
  • Said protein was obtained by infecting Spodoptera frugiperda Sf-9 cells with a recombinant baculovirus containing the sequence encoding the VP7 protein of BTV and collecting the culture with high cytopathic effect; after using the cells by Osmotic shock, the supernatant obtained after centrifugation was purified by ion exchange in FPLC ("Fast Protein Liquid Chromatography") and fractions containing the protein were identified and evaluated by electrophoresis in polyacrylamide gel with sodium dodecyl sulfate (SDS-PAGE ) to 11% acrylamide.
  • BTV rVP7 protein thus obtained and purified was used in the upholstery of the polystyrene plate at a concentration determined by ELISA in the range 0.1-1 ⁇ g / ml.
  • rVP7 protein was dialyzed against 0.1 M bicarbonate buffer (pH 8.5) and conjugated to peroxidase (HRPO) (Horse Radish peroxidase, ROCHE) according to the method described by Nakane & Kawaoi [Nakane , PK & Kawaoi, A. (1974). Peroxidase-labeled antibody: A new method of conjugation. J. Histochem. Cytochem 22: 1084-1091] modified. Each marking process generated a batch of conjugate production. Each of the production batches was stored diluted in phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 and 50% (v / v) Surmodics-TM preservative solution (Diarect AG) and stored at + 4 ° C until utilization.
  • PBS phosphate buffered saline
  • Surmodics-TM preservative solution Diarect AG
  • LRES Spanish Reference Laboratory
  • OIE International Office of Epizootics
  • 96-well polystyrene plates are incubated with BTV rVP7 protein for 18 hours at 4 ° C in carbonate-BSA buffer (bovine serum albumin), pH 9.6, in order to upholster them with the BTV antigen (rVP7 protein) . Then the plates are washed with PBS containing 0.05% Tween® 20, pH 7.4, stabilized for 1 hour at room temperature (20-25 0 C) solution stabilizer Surmodics- TM (Diarect AG) and they dry. Plates that are not to be used immediately, are packaged individually, and stored at 4 0 C.
  • BTV rVP7 protein BTV antigen
  • DR ELISA double recognition immunoenzymatic assay
  • This double recognition immunoenzymatic assay was performed to detect specific PRRSV antibodies and compare the results obtained with those of other existing assays (indirect ELISA and blocking ELISA) for the detection of PRRSV specific antibodies.
  • PlO-N PRRSV antigen
  • the recombinant fusion protein identified as P10-N was used, which comprises the amino acid sequence of the PRRSV nucleocapsid, isolated from Europe, fused to amino acid sequence 1-259 of the 10 gene protein of phage T7, which is described in Example 3 of European Patent EP 952219 Bl.
  • P10-NVHRPO peroxidase
  • HRPO peroxidase
  • Peroxidase-labeled antibody A new method of conjugation. J. Histochem. Cytochem 22: 1084-1091] modified.
  • HRPO peroxidase
  • Each marking process generated a batch of conjugate production.
  • Each of the production batches was stored diluted in PBS pH 7.4 and preservative solution (Surmodics-TM, Diarect AG) 50% (v / v) and stored at + 4 ° C until use.
  • Serums 36 field sera from pigs from different geographic areas that tested positive or negative in other assays (indirect ELISA and blocking ELISA) for the detection of PRRSV-specific antibodies were analyzed (Table 2).
  • the plate is washed 5 times with PBS containing 0.05% Tween® 20, 100 ⁇ l of ABTS substrate (2,2'-azino-bis (3- ethylbenzothiazolin-6-sulfonic acid) in each well is added and the reaction is maintained for 15 minutes at room temperature Finally, 100 ⁇ l of 2% sodium dodecyl sulfate (SDS) is added to stop the reaction and the absorbance is read at 405 nm in an ELISA reader.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • Blocking ELISA using the INGEZIM® PRRS COMPAC 1.1.PRS K3 (INGENASA) kit The problem sera are added to a Vi dilution in the wells and incubated for 1 h at 37 0 C. Then, the plate is washed 4 times with PBS containing 0.05% Tween® 20. Next, 100 ⁇ l of monoclonal antibody is added specific for the nucleocapsid (N) protein of PRRSV conjugated with peroxidase at a predetermined dilution and incubated for 20 minutes at 37 ° C.
  • N nucleocapsid
  • the plate is washed 5 times with PBS containing 0.05% Tween® 20, 100 ⁇ l of ABTS substrate is added in each well and the reaction is maintained for 15 minutes at room temperature. Finally, 100 ⁇ l of 2% SDS is added to stop the reaction and the absorbance is read at 405 nm in an ELISA reader.
  • 96-well polystyrene plates are incubated with P10-N fusion protein (PRRSV antigen) for 18 hours at 4 ° C in carbonate buffer pH 9.6 -BSA (bovine serum albumin) in order to upholster them with the antigen of PRRSV (PlO-N fusion protein).
  • PRRSV antigen P10-N fusion protein
  • the plates are then washed with PBS containing 0.05% Tween® 20 pH7.4, stabilized for 1 hour at room temperature in stabilizing solution (Surmodics-TM, Diarect AG) and dried. Plates that are not to be used immediately, are packaged individually, and stored at 4 ° C.
  • the sera to be analyzed are added at a 1/5 dilution in PBS containing 0.05% Tween® 20 in a volume of 50 ⁇ l and incubated for 1 hour at 37 ° C.
  • the plates are incubated with a conjugate (PlO-N) -HRPO at a predetermined dilution and set on a case-by-case basis for 30 minutes at room temperature (20 -25 0 C).
  • the plates are washed with PBS containing 0.05% Tween® 20 and the reaction is revealed for 15 minutes after the addition of the TMB substrate.
  • the absorbance reading at 450 nm is performed on an ELISA plate reader.
  • Cut off Cut off: Cut off: 0.3568 0.256725 0.8655

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Abstract

El inmunoensayo de doble reconocimiento para la detección de anticuerpos específicos de un antígeno diana en una muestra comprende poner en contacto dicho antígeno diana con una muestra sospechosa de contener dichos anticuerpos específicos de dicho antígeno diana bajo condiciones que permiten la formación de un complejo antígeno-anticuerpo; añadir un conjugado que comprende dicho antígeno diana y un marcador bajo condiciones que permiten la formación de un complejo antígeno-anticuerpo-antígeno/marcador; y detectar dicho complejo antígeno-anticuerpo-antígeno/marcador. El inmunoensayo puede utilizarse, entre otras aplicaciones, en el diagnóstico de infecciones causadas por organismos patógenos con elevada sensibilidad y especificidad.

Description

INMUNOENSAYO DE DOBLE RECONOCIMIENTO PARA LA DETECCIÓN
DE ANTICUERPOS
CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona, en general, con un inmunoensayo de doble reconocimiento para la detección de anticuerpos en una muestra, de elevada especificidad y sensibilidad. La invención también se relaciona con un kit que comprende los componentes necesarios para llevar a cabo dicho inmunoensayo.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Un inmunoensayo es un ensayo basado en la especificidad de la unión antígeno- anticuerpo que permite detectar, y, opcionalmente, cuantificar, antígenos o anticuerpos. Los inmunoensayos pueden clasificarse en inmunoensayos que utilizan reactivos (antígenos o anticuerpos) no-marcados y los inmunoensayos que utilizan reactivos marcados en los cuales el reactivo (antígeno o anticuerpo) está marcado con un marcador, tal como un isótopo radiactivo, una enzima, un fluoróforo o una sustancia implicada en una reacción (quimio)luminiscente, dando lugar a los denominados radioinmunoensayos (e.g., RIA, IRMA), inmunoensayos enzimáticos (e.g., EMIT, CEDÍA, ELISA), fluoroinmunoensayos (e.g., FPIA, SLFIA, FETI, DELFIA) o luminoinmunoensayos, respectivamente.
Entre los inmunoensayos que utilizan reactivos marcados se encuentran los inmunoensayos homogéneos y los inmunoensayos heterogéneos; estos últimos comprenden la realización de una o más etapas de separación del antígeno o anticuerpo no unido al otro miembro del par de unión (anticuerpo o antígeno) el cual, en general, estará unido a una fase sólida o soporte, por ejemplo, microplacas, partículas magnéticas, membranas de nitrocelulosa, etc. Asimismo, dependiendo del diseño del ensayo, los inmunoensayos heterogéneos pueden ser competitivos o no competitivos, dependiendo de si el reactivo (antígeno o anticuerpo) marcado se añade en cantidad limitada o en exceso, respectivamente. Los inmunoensayos permiten identificar antígenos (técnicas directas) o bien anticuerpos frente a un antígeno (técnicas indirectas). Entre estas técnicas indirectas se encuentran los inmunoensayos indirectos y los inmunoensayos de bloqueo o competición. Los inmunoensayos indirectos, a pesar de tener una elevada sensibilidad, presentan problemas de especificidad por los falsos positivos obtenidos, normalmente por los problemas de fondo inespecífico. Además, no permiten detectar IgMs porque normalmente se usan anticuerpos anti-IgGs, por lo que no detectan a los animales positivos hasta las 2-3 semanas post-infección o post-vacunación. Los inmunoensayos de bloqueo o competición, en general, son más específicos que los inmunoensayos indirectos pero menos sensibles.
Debido a la especificidad y sensibilidad de los inmunoensayos, se han desarrollado numerosos inmunoensayos para diversas aplicaciones, tanto para su empleo en el análisis de muestras medioambientales o de alimentos como con fines de diagnóstico. Entre las infecciones causadas por virus animales que pueden ser diagnosticadas mediante inmunoensayos se encuentran, a modo ilustrativo, la Lengua Azul y el Síndrome Respiratorio y Reproductivo Porcino (PRRS).
La Lengua Azul es una enfermedad causada por el virus de la Lengua Azul (BTV, del inglés "B lúe Tongue Virus"), un arbovirus (virus transmitido por artrópodos), que infecta de forma natural a rumiantes domésticos y salvajes, camélidos y algunos otros herbívoros, tales como elefantes, aunque la enfermedad afecta casi exclusivamente a las ovejas, originando cursos clínicos agudos o subagudos. En vacas y cabras, la enfermedad clínica es rara, y, cuando se presenta, es mucho más suave que en ovejas. La oveja afectada puede morir después de una enfermedad aguda o crónica, o puede recuperarse con pérdida de peso y/o roturas de lana. El BTV es el virus prototipo del género Orbivirus (familia Reoviridaé). El genoma de BTV incluye 10 segmentos distintos de RNA de doble banda (dsRNA) que codifican 7 proteínas estructurales (VPl a VP7) y 4 proteínas no estructurales (NSl, NS2, NS3 y NS3a). El núcleo (core) interno de BTV está compuesto por 2 proteínas mayoritarias (VP3 y VP7) y por 3 proteínas minoritarias (VPl, VP4 y VP6) y está rodeado por una cápsida externa constituida por VP2 y VP5 (WP 2008/030282). Actualmente existen 24 serotipos de BTV reconocidos. Las pruebas recomendadas para la detección de anticuerpos y serogrupos específicos de BTV incluyen la inmunodifusión en gel de agar y un ELISA competitivo, preferentemente éste último debido a su mayor exactitud y adaptación a rápidas pruebas convencionales de laboratorio y tecnología de lectura. La prueba recomendada para detectar anticuerpos de serotipos específicos del BTV es el test de neutralización. El virus causante del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV, del inglés "Porcine Reproductive and Respiratory Virus") es un arterivirus que causa el síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS). Dicho virus puede causar problemas reproductivos importantes en cerdas adultas que pueden terminar en abortos así como problemas respiratorios, entre otros, en cerdos neonatos o en cerdos en desarrollo. La patente europea EP 952219 Bl describe un método para el diagnóstico de
PRRSV que comprende poner en contacto una muestra biológica de un animal con una proteína de fusión recombinante que comprende la secuencia de aminoácidos de la proteína de la nucleocápsida (N) de PRRSV fusionada a un fragmento de la proteína del gen 10 del fago T7.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
Ahora se ha observado, sorprendentemente, que la adición de un conjugado que comprende un antígeno y un marcador a un complejo antígeno-anticuerpo aumenta la especificidad y sensibilidad de un inmunoensayo para la detección de anticuerpos específicos de dicho antígeno.
El inmunoensayo proporcionado por esta invención ha sido denominado "inmunoensayo de doble reconocimiento" ya que comprende el reconocimiento y unión de dos unidades del antígeno diana al anticuerpo específico de dicho antígeno diana, uno de ellos formando parte de un conjugado que comprende dicho antígeno diana y un marcador. Dicho inmunoensayo ha sido validado en sueros de referencia para los 24 serotipos de virus de lengua azul (BTV) reconocidos (Ejemplo 1) así como en la detección de anticuerpos específicos del virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRSV) (Ejemplo 3) y posee una elevada especificidad y sensibilidad, tal como se pone de manifiesto en el Ejemplo 2.
Dicho inmunoensayo de doble reconocimiento se puede utilizar para detectar y, si se desea, cuantificar, anticuerpos específicos de antígenos de organismos patógenos en una muestra de ensayo de un sujeto, y, de este modo, diagnosticar la infección causada por un organismo, tal como un organismo patógeno en un sujeto susceptible de ser infectado por dicho organismo, así como para detectar y, si se desea, cuantificar, anticuerpos específicos de antígenos tumorales en una muestra de ensayo de un sujeto, y, de este modo, diagnosticar la existencia de un tumor o de un cáncer en un sujeto, preferentemente, en un ser humano, o para detectar y, si se desea, cuantificar, anticuerpos específicos de alérgenos en una muestra de ensayo de un sujeto, y, de este modo, diagnosticar la existencia de una reacción alérgica frente a dicho alérgeno en dicho sujeto, preferentemente, en un ser humano. Por tanto, en un aspecto, la invención se relaciona con un inmunoensayo para detectar un anticuerpo específico de un antígeno diana en una muestra que comprende poner en contacto dicho antígeno diana con una muestra sospechosa de contener dicho anticuerpo específico de dicho antígeno diana bajo condiciones que permiten la formación de un complejo antígeno-anticuerpo, añadir un conjugado que comprende dicho antígeno diana y un marcador bajo condiciones que permiten la formación de un complejo antígeno-anticuerpo-antígeno/marcador, y detectar dicho complejo antígeno- anticuerpo-antígeno/marcador. En una realización particular, dicho anticuerpo es un anticuerpo específico de BTV, mientras que, en otra realización particular, dicho anticuerpo es un anticuerpo específico de PRRSV. En otro aspecto, la invención se relaciona con un kit que comprende un soporte que comprende un antígeno diana y un conjugado que comprende dicho antígeno diana y un marcador. En una realización particular, dicho antígeno diana es un antígeno de BTV, mientras que, en otra realización particular, dicho antígeno diana es un antígeno de PRRSV.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
En un aspecto, la invención se relaciona con un inmunoensayo, en adelante inmunoensayo de la invención, para detectar un anticuerpo específico de un antígeno diana en una muestra que comprende: a) poner en contacto dicho antígeno diana con una muestra sospechosa de contener dicho anticuerpo específico de dicho antígeno diana bajo condiciones que permiten la formación de un complejo antígeno-anticuerpo; b) añadir un conjugado que comprende dicho antígeno diana y un marcador bajo condiciones que permiten la formación de un complejo antígeno- anticuerpo-antígeno/marcador; y c) detectar dicho complejo antígeno-anticuerpo-antí geno/marcador. El inmunoensayo de la invención permite detectar anticuerpos específicos de antígenos diana en una muestra de ensayo. Un anticuerpo es una inmunoglobulina producida por células de la serie de los linfocitos B y secretadas por células plasmáticas en respuesta a una estimulación por un antígeno, que reconoce específicamente dicho antígeno y es capaz de unirse selectivamente a dicho antígeno.
El término "antígeno", tal como aquí se utiliza, se refiere, en general, a cualquier sustancia capaz de unirse específicamente a un anticuerpo, o de inducir una respuesta inmunitaria o de inducir la formación de anticuerpos, e incluye células (e.g., células tumorales, etc.), organismos (e.g., virus, bacterias, hongos, protozoos, nematodos, etc.), tanto enteros como partes o componentes de los mismos (e.g., proteínas, péptidos, lipopolisacáridos, carbohidratos, etc.), de origen nativo, sintético o recombinante, idénticos o similares (es decir, capaces de ser reconocidos por anticuerpos específicos de antígenos nativos) a los antígenos nativos de un organismo o de una célula, alérgenos, etc. Prácticamente cualquier antígeno puede ser utilizado en la puesta en práctica del inmunoensayo de la invención para detectar anticuerpos específicos de dicho antígeno (antígeno diana).
Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de antígenos virales incluyen antígenos de virus infecciosos y/o patógenos de animales, incluyendo seres humanos, tales como virus de las familias: Adenoviridae, Arenaviridae, Arteriviridae, Birnaviridae, Bungaviridae, Caliciviridae, Coronoviridae, Filoviridae, Flaviridae, Hepadnaviridae, Herpesviridae, Iridoviridae, Orthomyxoviridae, Papovaviridae, Paramyxoviridae, Parvoviridae, Picornaviridae, Poxviridae, Reoviridae, Retroviridae, Rhabdoviridae, Togaviridae, etc., que incluyen arbovirus, arterivirus, birnavirus, calici virus, citomegalovirus, herpesvirus, orbivirus, papilomavirus, parvovirus, pestivirus, poliovirus, retrovirus, rhinovirus, rotavirus, etc. Entre dichos virus se encuentran virus patógenos de ganado porcino, por ejemplo, parvovirus porcino (PPV), el virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV), el virus de la enfermedad de Aujesky (ADV), el virus de la fiebre aftosa (FDMV), el virus de la gastroenteritis porcina transmisible (TGEV), el circovirus porcino, etc.; patógenos de ganado bovino, tales como el virus de la diarrea viral bovina (BVDV), el virus de la rinotraqueitis bovina (IBRV), el virus de la lengua azul (BTV), etc.; patógenos de conejos, tales como el virus de la enfermedad hemorrágica del conejo (RHDV), etc.; patógenos de aves, por ejemplo, el virus de la enfermedad de Gumboro (IBDV), el pneumovirus aviar, etc. En una realización particular, dicho virus es el virus de la lengua azul (BTV) o el virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRSV).
Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de antígenos bacterianos incluyen antígenos de bacterias patógenas de animales, incluyendo seres humanos, tanto Gram positivas como Gram negativas. Ejemplos específicos de bacterias patógenas incluyen: Actinornyces israelli, Bacillus aratracis, Bacteroides sp., Bordetella sp., Borelia burgdorferi, Brucella sp., Campylobacter sp. (e.g., C. jejunϊ), Clostridium sp. (e.g., C. perfringers, C. tetani), Corynebacterium sp. (e.g., C. diphtlzeriaé), Enterobacter aerogenes, Enterococcus sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Escherichia coli, Fusobacterium nucleatum, Helicobacter pylori, Haemophilus influenzae, Klebsiella sp. (e.g., K. pyzeunaoniaé), Legionella pneumoplailia, Listeria monocytogenes, Leptospira, Moraxella catarrhalis, Mycobacteria sp. (e.g., M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansaii, M. gordonaé), Neisseria sp. (e.g., N. gonorrhoeae, N. meningitidis), Pasteurella sp. (e.g., P. multocidά), Pseudomonas sp., Rickettsia sp., Salmonella sp., Staphylococcus sp. (e.g., S. aureus), Streptobacillus moniliformis, Streptococcus sp. [e.g., S. pyogefaes (Grupo A de Streptococcus), S. agalactiae (Grupo B de Streptococcus), S. grupo viridans, S. faecalis, S. bovis, Streptococcus (sp. anaerόbicas), S. pneumoniae], Treponema sp. (e.g., T. pallidium, T. pertenue), etc. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de antígenos de hongos incluyen antígenos de hongos patógenos de animales, incluyendo seres humanos, tales como Blastomyces dermatitidis, Candida albicans, Chlamydia trachomatis, Coccidioides immitis, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, etc.
Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de antígenos de protozoos y nematodos incluyen antígenos de protozoos y nematodos patógenos de animales, incluyendo seres humanos, tales como Anaplasma margínale, Dirofilaria immitis, Leishmania sp. (leishmaniasis), Plasmodium sp. (malaria) [e.g., P. falciparum, P. malariae, P. ovale, P. vivax], Schistosoma sp., Toxoplasma sp. (e.g., T. gondii), etc.
Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de antígenos tumorales incluyen moléculas asociadas a un proceso tumoral o canceroso capaces de provocar una respuesta immune cuando son presentadas en el contexto de una molécula del MHC. La selección de antígenos tumorales puede ser realizada por un técnico en la materia a la vista del estado de la técnica [Renkvist et al., Cáncer Immunol. Immunother. 50:3-15 (2001)]. Ejemplos representativos, no limitativos, de dichos antígenos tumorales incluyen: GD2 (neuroblastoma); EGF-R (glioblastoma maligno); CD52 (leucemia); proteína gplOO de melanoma humano; proteína melan-A/MART-1 de melanoma humano; tirosinasa; proteína NA17-A nt; proteína MAGE-3; proteína p53; proteína HPV16E7; (CDl Ic)- TRP2; WTl (leucemia y tumores sólidos); HMl.24 (mieloma múltiple); mucina prostática (adenocarcinoma prostático); antígeno específico de próstata (PSA); antígeno SF-25 (adenocarcinoma de colon); antígenos asociados con tumores de vejiga; MART-I (melanoma); antígenos tumorales asociados al cáncer de mama [e.g., Her2, mamaglobina, CA 15.3, CA 27.9, MCA (antígeno cáncer de mama), MSA (antígeno sérico mama), BMA (antígeno mucínico), cerbB2, MUCl, áncer de tiroide medular), etc.]; antígenos tumorales asociados al cáncer de ovario [e.g., CA125, SCC (teratoma inmaduro), BHCG (coriocarcinoma), Her-2/neu, p21, etc]; antígenos tumorales asociados al cáncer de pulmón [e.g., CD40, gpl60, Cyfra-21.1, MAGE -A3, MUT-I, MUT-2, TPA, LAM8, SWA20, SCC (antígeno células escamosas), etc.]; antígenos tumorales asociados al cáncer de piel [e.g., p97, gp75, EMA, MTA, MAGE-Al, MAGE-A3, etc.]; antígenos tumorales asociados al cáncer de colon [e.g., COA-I, CA 19.9, ND-4, CEA, TAG-72, CA72-4; antígenos tumorales asociados a tumores linfoides de células B [e.g., CD 19, CD20, etc.]; antígenos tumorales asociados a leucemia mieloide [e.g., CD33, etc.], antígenos tumorales asociados a linfomas [e.g., CD 30, HSP70, etc.], etc., y fragmentos antigénicos de dichos antígenos. Los antígenos tumorales pueden ser preparados a partir de células tumorales o cancerosas preparando extractos crudos de dichas células, por ejemplo, como describe Cohén, et al., en Cáncer Research, 54:1055 (1994), purificando parcialmente los antígenos, mediante tecnología recombinante o mediante síntesis de novo de antígenos conocidos.
En una realización particular, dicho antígeno es un alérgeno, es decir, una sustancia a la que un sujeto es sensible y provoca una reacción inmunitaria, por ejemplo, extractos alergénicos de pólenes, extractos alergénicos de insectos, extractos alergénicos de alimentos o de productos alimenticios, componentes presentes en saliva, pinzas o aguijones de insectos que inducen una reacción de sensibilidad en un sujeto, componentes presentes en plantas que inducen una reacción de sensibilidad en un sujeto, etc. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichos alérgenos incluyen extractos alergénicos de gramíneas, arizónicas, platanáceas, olivo, etc. (incluyendo de sus pólenes), extractos alergénicos de insectos (e.g., ácaros del polvo, etc.), extractos alergénicos de alimentos o productos alimenticios (e.g., gliadinas, gluten, pescado, marisco, frutas, etc.). Prácticamente cualquier alérgeno puede ser utilizado en la puesta en práctica del inmunoensayo de la invención para detectar anticuerpos específicos de dicho alérgeno (antígeno diana).
El inmunoensayo de la invención puede utilizarse para detectar anticuerpos específicos de antígenos diana en una muestra sospechosa de contener dichos anticuerpos (muestra de ensayo), tal como una muestra biológica, una muestra ambiental, una muestra de laboratorio, etc. Ejemplos ilustrativos, no limitativos de muestras biológicas incluyen tanto muestras de tejidos como de fluidos corporales susceptibles de contener anticuerpos específicos de dicho antígeno diana (e.g., sangre, suero, plasma, leche, saliva, esputo, líquido cefalorraquídeo, exudados titulares, etc.).
La muestra de ensayo puede ser una muestra de origen animal sospechosa de contener anticuerpos específicos de antígenos diana. En una realización particular, dicha muestra de ensayo es una muestra de ganado bovino, canino, caprino, equino, felino, leporino, ovino, porcino, etc., o una muestra de un ser humano.
Antes de ponerse en contacto con el antígeno diana, la muestra de ensayo puede ser sometida (o no) a un tratamiento previo, precipitada, fraccionada, separada, diluida, concentrada, o purificada.
En general, la muestra de ensayo se obtendrá por métodos convencionales, conocidos por los técnicos en la materia, dependiendo de la naturaleza de la muestra. En una realización particular, dicha muestra de ensayo es una muestra biológica, tal como una muestra de sangre, suero o plasma, que puede obtenerse por cualquier método convencional, por ejemplo, mediante una extracción de sangre, o una muestra de saliva, que puede obtenerse mediante el empleo de torundas, etc.
De acuerdo con el inmunoensayo de la invención, el antígeno diana se pone en contacto con dicha muestra sospechosa de contener anticuerpos específicos de dicho antígeno diana (es decir, capaces de reconocer específicamente o de unirse selectivamente a dicho antígeno diana) bajo condiciones que permiten la formación de un complejo antí geno-anticuerpo [etapa a)]. Si la muestra de ensayo contiene anticuerpos específicos de dicho antígeno diana, entonces se formará dicho complejo antígeno-anticuerpo; en caso contrario, no se formará dicho complejo. Por tanto, según la invención, dicho antígeno diana actúa como reactivo de captura de anticuerpos específicos de dicho antígeno diana. Las condiciones adecuadas para que tenga lugar la formación del complejo antígeno-anticuerpo son conocidas por los expertos en la materia.
Posteriormente, se añade un conjugado que comprende dicho antígeno diana y un marcador bajo condiciones que permiten la formación de un complejo antígeno- anticuerpo-antígeno/marcador [etapa b)] y se detecta dicho complejo antígeno- anticuerpo-antí geno/marcador [etapa c)]. Si la muestra de ensayo contiene anticuerpos específicos de dicho antígeno diana, se habrá formado previamente un complejo antígeno-anticuerpo, con lo que, cuando se pone en contacto dicho complejo antígeno- anticuerpo con dicho conjugado que comprende el antígeno diana y el marcador, en las condiciones adecuadas, se forma el complejo antígeno-anticuerpo-antígeno/marcador, que será visualizado mediante la técnica apropiada dependiendo del marcador utilizado, tal como se menciona más adelante; mientras que, en caso contrario, es decir, cuando la muestra de ensayo no contiene anticuerpos específicos de dicho antígeno diana, entonces no se formará dicho complejo antígeno-anticuerpo-antígeno/marcador. Las condiciones adecuadas para que tenga lugar la formación del complejo antígeno- anticuerpo-antígeno/marcador son conocidas por los expertos en la materia. El término "marcador", tal como aquí se utiliza, se refiere a un reactivo indicador que permite detectar el complejo antígeno-anticuerpo-antígeno/marcador, tal como una enzima que cataliza una reacción detectable, un compuesto que genera una señal cuando forma parte del complejo antígeno-anticuerpo-antígeno/marcador, etc. A modo ilustrativo, no limitativo, dicho marcador puede ser una enzima (e.g., peroxidasa, glicosidasa, fosfatasa alcalina, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, β-galactosidasa, β- glucosidasa, β-glucuronidasa, etc.), un compuesto fluorescente o fluoróforo (e.g., fiuoresceína, rhodamina, etc.), un compuesto (quimio)luminiscente (e.g., dioxetanos, acridinios, fenantridinios, rutenio, luminol, etc.), elementos radiactivos (azufre, iodo, etc.), etc. En una realización particular, dicho marcador es una peroxidasa. La selección de un marcador particular no es crítica, siempre y cuando sea capaz de producir una señal por sí mismo o conjuntamente con unas o más sustancias adicionales. El conjugado que comprende dicho antígeno diana y dicho marcador puede obtenerse por métodos convencionales conocidos por los técnicos en la materia.
El complejo antígeno-anticuerpo-antígeno/marcador formado puede ser detectado o visualizado por cualquier técnica apropiada, dependiendo del marcador elegido, conocida por los técnicos en la materia, utilizando los dispositivos apropiados, por ejemplo, mediante técnicas basadas en métodos colorimétricos, fluorimétricos, (quimio)luminiscentes, radiactivos, etc., todas ellas conocidas por los técnicos en la materia.
A modo ilustrativo, cuando el marcador es una enzima, la detección del complejo antígeno-anticuerpo-antí geno/marcador puede llevarse a cabo poniendo en contacto dicho complejo con un sustrato apropiado y, opcionalmente, con los activadores y/o agentes de amplificación enzimáticos apropiados. Ejemplos ilustrativos de dichos sustratos incluyen: • Para la fosfatasa alcalina: Cromogénico: sustratos basados en p-nitrofenil fosfato (p-NPP), 5- bromo-4-cloro-3-indolil fosfato/nitroblue tetrazolium (BCIP/NPT), etc. Fluorogénico: fosfato de 4-metilumbelifenilo (4-MUP), 2-(5'-cloro-2'- fosforiloxifenil)-6-cloro-4-(3H)-quinazolinona (CPPCQ), 3,6- fluoresceín-difosfato (3,6-FDP), etc. • Para peroxidasas:
Cromogénico: sustratos basados en ácido 2,2-azinobis(3- etilbenzotiazolin-6-sulfónico) (ABTS), o-fenilendiamina (OPT), 3,3',5,5'- tetrametilbenzidina (TMB), o-dianisidina, ácido 5-aminosalicílico, ácido 3-dimetilaminobenzoico (DMAB) y 3-metil-2-benzotiazolinhidrazone (MBTH), 3-amino-9-etilcarbazol (AEC) y tetracloruro de 3,3'- diaminobenzidina (DAB), etc.
Fluorogénico: ácido 4-hidroxi-3-metoxifenilacético, fenoxazinas reducidas y benzotiazinas reducidas, incluyendo el reactivo Amplex® Red, Amplex UltraRed, dihidroxantenos reducidos, etc. • Para glicosidasas: Cromogénico: sustratos basados en o-nitrofenil-β-D-galactósido (o- NPG), p-nitrofenil-β-D-galactósido y 4-metilumbelifenil-β-D-galactósido (MUG) para β-D-galactosidasa, etc.
Fluorogénico: resorufin β-D-galactopiranósido, fluoresceín digalactósido (FDG), fluoresceín diglucurónido, 4-metilumbeliferyl beta-D- galactopiranósido, carboxiumbeliferil beta-D-galactopiranósido, cumarin beta-D- galactopiranósidos fluorados, etc.
En una realización particular, dicho marcador es una peroxidasa, tal como la peroxidasa de rábano picante, y el sustrato cromogénico es TMB. El inmunoensayo de la invención también puede ser utilizado para determinar la cantidad (cuantificar) de anticuerpos específicos de un antígeno diana en una muestra de ensayo ya que, con muchos marcadores, e.g., enzimas, la cantidad de anticuerpo presente en la muestra de ensayo es proporcional a la señal generada.
El inmunoensayo de la invención es un inmunoensayo que utiliza antígenos marcados para detectar anticuerpos, homogéneo o heterogéneo. En una realización particular, dicho inmunoensayo es un inmunoensayo que utiliza antígenos marcados, heterogéneo; ejemplos ilustrativos, no limitativos, de tales inmunoensayos incluyen, dependiendo del marcador utilizado, inmunoensayos enzimáticos, tales como ELISA
(ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima), fluoroinmunoensayos, tales como DELFIA (fluoroinmunoensayo de disociación aumentada por lantánidos), luminoinmunoensayos, radioinmunoensayos tales como RIA (radioinmunoensayo heterogéneo y competitivo), IRMA (radioinmunoensayo heterogéneo y no competitivo), etc. En una realización particular, dicho inmunoensayo es un ELISA.
Para realizar dichos inmunoensayos heterogéneos, el antígeno diana se inmoviliza, directa o indirectamente, sobre un soporte, tal como un pocilio de una placa de microtitulación, perlas magnéticas, perlas no magnéticas, columnas, matrices, membranas, etc. Estos materiales se pueden utilizar en las formas convenientes, tales como películas, hojas, placas, etc., o pueden utilizarse para recubrir portadores inertes
(e.g., papel, cristal, películas de plástico, etc.). La inmovilización del antígeno diana sobre dicho soporte incluye interacciones iónicas, hidrofóbicas, covalentes y/o similares. En una realización particular, el antígeno diana se inmoviliza, directa o indirectamente, sobre un soporte, tal como un pocilio de una placa de microtitulación. La muestra de ensayo sospechosa de contener anticuerpos específicos de dicho antígeno diana se incuba con dicho antígeno diana durante un periodo de tiempo y bajo condiciones apropiadas para que se formen complejos antígeno-anticuerpo. Después de lavar el pocilio para retirar los reactivos no unidos al antígeno, se añade un conjugado que comprende dicho antígeno diana unido a un marcador y se deja incubar durante un periodo de tiempo y bajo condiciones apropiadas para que se formen complejos antígeno-anticuerpo-antígeno/marcador. Tras lavar para retirar los reactivos no unidos, se procede a revelar la formación de dichos complejos antígeno-anticuerpo- antígeno/marcador. La detección de dichos complejos antígeno-anticuerpo- antígeno/marcador es indicativa de la presencia de anticuerpos específicos de dicho antígeno diana en la muestra de ensayo. Este tipo de ensayo permite, además, si se desea, cuantificar la cantidad de anticuerpos específicos del antígeno diana en la muestra de ensayo.
La formación del complejo antígeno-anticuerpo-antígeno/marcador es indicativa de la presencia de anticuerpos específicos del antígeno diana en la muestra de ensayo. Por tanto, el inmunoensayo de la invención se puede utilizar para diagnosticar la infección causada por un organismo, tal como un organismo patógeno (e.g., virus, bacteria, hongo, protozoo, nematodo, etc.), en un sujeto susceptible de ser infectado por dicho organismo. Tal como aquí se utiliza, "sujeto" se incluye a cualquier animal, incluido el ser humano, en particular, animales vertebrados, preferentemente mamíferos, tales como caballos, cerdos, conejos, gatos, ovejas, perros, vacas, seres humanos, etc.
En una realización particular, el inmunoensayo de la invención puede ser utilizado para diagnosticar la infección causada por BTV en animales susceptibles de ser infectados independientemente de que desarrollen o no sintomatología clínica (los cuales pueden actuar como reservorios), e.g., ganado ovino, bovino, caprino, felino, etc.
Por tanto, en una realización concreta, el inmunoensayo de la invención permite detectar y, si se desea, cuantificar, anticuerpos específicos frente a BTV en muestras de ensayo procedentes de animales susceptibles de ser infectados por BTV mediante un ELISA (Ejemplo 1) que comprende poner en contacto un antígeno de BTV inmovilizado sobre un soporte con una muestra de ensayo sospechosa de contener anticuerpos específicos de BTV; en caso de que dicha muestra de ensayo tenga dichos anticuerpos, estos se unirán al antígeno de BTV. A continuación, tras eliminar el material no unido mediante lavados, se añade de nuevo el mismo antígeno de BTV conjugado a un marcador [conjugado antí geno/marcador], y, en caso de que la muestra de ensayo contuviera anticuerpos frente a dicho antígeno de BTV, dichos anticuerpos podrían capturar el antígeno de BTV conjugado al marcador a pesar de estar unidos al antígeno de BTV inmovilizado sobre el pocilio. El complejo antígeno-anticuerpo- antígeno/marcador se detecta tras adición de un sustrato adecuado.
Prácticamente cualquier antígeno de BTV puede ser utilizado en la puesta en práctica del inmunoensayo previamente descrito; no obstante, a modo ilustrativo, no limitativo, en una realización particular, dicho antígeno de BTV es una proteína estructural de BTV tal como VPl, VP2, VP3, VP4, VP5, VP6, VP7, o una combinación de dos o más de dichas proteínas estructurales; o bien una proteína no estructural de BTV tal como NSl, NS2, NS3, NS3a, o una combinación de dos o más de dichas proteínas no estructurales; o bien, alternativamente, una mezcla de una o más proteínas estructurales de BTV con una o más proteínas no estructurales de BTV. Alternativamente, pueden utilizarse fragmentos antigénicos de dichas proteínas en lugar de las proteínas completas, siempre y cuando dichos fragmentos sean capaces de unirse a anticuerpos frente a BTV, o bien proteínas de fusión que comprenden, al menos, una de dichas proteínas o uno de dichos fragmentos antigénicos de las mismas. Asimismo, dichas proteínas (y los fragmentos antigénicos) pueden ser tanto de origen nativo como sintético o recombinante. En una realización concreta, no limitativa, dicho antígeno de BTV es una proteína VP7 recombinante de BTV (Ejemplo 1).
Como soporte para la puesta en práctica del inmunoensayo previamente descrito puede utilizarse prácticamente cualquiera de los soportes a los que se ha hecho referencia previamente en esta descripción; no obstante, a modo ilustrativo, no limitativo, en una realización particular, dicho soporte sobre el que se inmoviliza un antígeno de BTV es un pocilio de una placa de microtitulación.
Asimismo, para la puesta en práctica del inmunoensayo previamente descrito puede utilizarse prácticamente cualquiera de los marcadores a los que se ha hecho referencia previamente en esta descripción, conjugado a un antígeno de BTV; no obstante, a modo ilustrativo, no limitativo, en una realización particular, dicho marcador es una enzima, tal como una peroxidasa) [conjugado antígeno de BTV/peroxidasa], en cuyo caso, la detección del complejo antígeno de BTV-anticuerpo-antígeno de BTV/peroxidasa se realiza tras adición de un sustrato adecuado que desarrolla color en presencia de la peroxidasa (e.g., TMB). En otra realización particular, el inmunoensayo de la invención puede ser utilizado para diagnosticar la infección causada por PRRSV en animales susceptibles de ser infectados por PRRSV independientemente de que desarrollen o no sintomatología clínica (reservorios), e.g., ganado porcino, etc.
Por tanto, en una realización concreta, el inmunoensayo de la invención permite detectar y, si se desea, cuantificar, anticuerpos específicos frente a PRRSV en muestras de ensayo procedentes de animales susceptibles de ser infectados por BTV mediante un ELISA (Ejemplo 3) que comprende poner en contacto un antígeno de PRRSV inmovilizado sobre un soporte con una muestra de ensayo sospechosa de contener anticuerpos específicos de PRRSV; en caso de que dicha muestra de ensayo tenga dichos anticuerpos, estos se unirán al antígeno de PRRSV. A continuación, tras eliminar el material no unido mediante lavados, se añade de nuevo el mismo antígeno de PRRSV conjugado a un marcador [conjugado antí geno/marcador], y, en caso de que la muestra de ensayo contuviera anticuerpos frente a dicho antígeno de PRRSV, dichos anticuerpos podrían capturar el antígeno de PRRSV conjugado al marcador a pesar de estar unidos al antígeno de PRRSV inmovilizado sobre el pocilio. El complejo antígeno-anticuerpo- antígeno/marcador se detecta tras adición de un sustrato adecuado.
Prácticamente cualquier antígeno de PRRSV puede ser utilizado en la puesta en práctica del inmunoensayo previamente descrito; no obstante, a modo ilustrativo, no limitativo, en una realización particular, dicho antígeno de PRRSV es una proteína estructural o no estructural de PRRSV, o una combinación de dos o más de dichas proteínas estructurales, o bien una combinación de dos o más de dichas proteínas no estructurales, o bien, alternativamente, una mezcla de una o más proteínas estructurales de PRRSV con una o más proteínas no estructurales de PRRSV. Alternativamente, pueden utilizarse fragmentos antigénicos de dichas proteínas en lugar de las proteínas completas, siempre y cuando dichos fragmentos sean capaces de unirse a anticuerpos frente a PRRSV, o bien proteínas de fusión que comprenden, al menos, una de dichas proteínas o uno de dichos fragmentos antigénicos de las mismas. Asimismo, dichas proteínas (y los fragmentos antigénicos) pueden ser tanto de origen nativo como sintético o recombinante. En una realización concreta, no limitativa, dicho antígeno de PRRSV es una proteína de fusión que comprende la proteína de la nucleocápsida (N) de PRRSV (Ejemplo 3). Como soporte para la puesta en práctica del inmunoensayo previamente descrito puede utilizarse prácticamente cualquiera de los soportes a los que se ha hecho referencia previamente en esta descripción; no obstante, a modo ilustrativo, no limitativo, en una realización particular, dicho soporte sobre el que se inmoviliza un antígeno de PRRSV es un pocilio de una placa de microtitulación. Asimismo, para la puesta en práctica del inmunoensayo previamente descrito puede utilizarse prácticamente cualquiera de los marcadores a los que se ha hecho referencia previamente en esta descripción, conjugado a un antígeno de PRRSV; no obstante, a modo ilustrativo, no limitativo, en una realización particular, dicho marcador es una enzima, tal como una peroxidasa) [conjugado antígeno de PRRSV/peroxidasa], en cuyo caso, la detección del complejo antígeno de PRRSV-anticuerpo-antígeno de PRRSV/peroxidasa se realiza tras adición de un sustrato adecuado que desarrolla color en presencia de la peroxidasa (e.g., TMB).
Asimismo, el inmunoensayo de la invención se puede utilizar para detectar y, si se desea, cuantificar, anticuerpos específicos de antígenos tumorales en una muestra de ensayo de un sujeto, y, de este modo, diagnosticar la existencia de un tumor o de un cáncer en un sujeto, preferentemente, en un ser humano.
Además, el inmunoensayo de la invención se puede utilizar para detectar y, si se desea, cuantificar, anticuerpos específicos de alérgenos en una muestra de ensayo de un sujeto, y, de este modo, diagnosticar la existencia de una reacción alérgica frente a dicho alérgeno en dicho sujeto, preferentemente, en un ser humano.
Si se desea, para la puesta en práctica del inmunoensayo de la invención, se pueden utilizar, además, controles positivos y negativos.
El inmunoensayo de la invención ha sido denominado "inmunoensayo de doble reconocimiento" ya que comprende el reconocimiento y unión de dos unidades del antígeno diana al anticuerpo específico de dicho antígeno diana, uno de ellos formando parte de un conjugado que comprende dicho antígeno diana y un marcador. El inmunoensayo de la invención presenta una elevada especificidad y sensibilidad tal como se pone de manifiesto en el Ejemplo 2, en donde puede observarse que la especificidad del inmunoensayo de la invención aplicado a la detección de anticuerpos específicos de BTV es del 99,8% y la sensibilidad del 100%. Esta elevada sensibilidad parece ser debida a que el inmunoensayo de doble reconocimiento de la invención auna las dos principales ventajas de los inmunoensayos indirectos y de competición ya que, por un lado, al igual que los inmunoensayos indirectos es capaz de detectar todo tipo de anticuerpo que se una a un antígeno diana (y no solo los anticuerpos que se unen a un epítopo determinado, como en los ensayos de competición), y, por otro lado, al igual que en los ensayos de competición (o bloqueo) se pueden usar elevadas cantidades de muestra en el ensayo (sin diluir o poco diluidas), lo que favorece la detección de positivos débiles (en los ensayos indirectos es muy raro que se utilicen diluciones de la muestra inferiores a 1/100). Asimismo, la elevada especificidad del inmunoensayo de la invención parece ser debida a que el antígeno diana debe ser reconocido dos veces por el mismo anticuerpo, la primera vez, cuando se pone en contacto con el antígeno diana inmovilizado sobre la fase sólida o soporte utilizado, y, la segunda vez, cuando se pone en contacto con el antígeno diana marcado (conjugado antígeno diana unido a marcador), normalmente en solución o sin inmovilizar. Para la puesta en práctica del inmunoensayo de la invención se pueden utilizar, además, si se desea, controles positivos y negativos.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un kit, en adelante kit de la invención, que comprende: i) un soporte que comprende un antígeno diana; y ii) un conjugado que comprende dicho antígeno diana y un marcador.
Las características de dicho soporte (i) y del antígeno diana inmovilizado sobre el mismo, así como las de dicho conjugado (ii) han sido mencionadas previamente.
En una realización particular, el kit de la invención comprende, además de dicho soporte (i) y conjugado (ii), unos medios para revelar dicho marcador. Dicho kit de la invención es particularmente útil para poner en práctica el inmunoensayo de la invención. Dicho antígeno diana es susceptible de ser reconocido por un anticuerpo específico del mismo. Por tanto, el kit de la invención puede ser utilizado para detectar, y si se desea cuantificar anticuerpos específicos de dicho antígeno diana en una muestra sospechosa de contener dichos anticuerpos. En una realización particular, el kit de la invención puede ser utilizado para diagnosticar la infección causada por BTV en animales susceptibles de ser infectados por dicho virus (e.g., ganado ovino, bovino, caprino, felino, etc.) independientemente de que presenten o no sintomatología clínica (de hecho, una aplicación muy interesante del kit e inmunoensayo de la invención consiste en su empleo para identificar reservónos de organismos patógenos), y comprende un soporte que comprende un antígeno de BTV y un conjugado que comprende dicho antígeno de BTV conjugado a un marcador, y, opcionalmente, medios para revelar la presencia de complejo antígeno de BTV- anticuerpo-antígeno de BTV/marcador.
Prácticamente cualquier antígeno de BTV puede ser utilizado en dicho kit; no obstante, a modo ilustrativo, no limitativo, en una realización particular, dicho antígeno de BTV es una proteína estructural de BTV tal como VPl, VP2, VP3, VP4, VP5, VP6, VP7, o una combinación de dos o más de dichas proteínas estructurales; o bien una proteína no estructural de BTV tal como NSl, NS2, NS3, NS3a, o una combinación de dos o más de dichas proteínas no estructurales; o bien, alternativamente, una mezcla de una o más proteínas estructurales de BTV con una o más proteínas no estructurales de BTV. Alternativamente, pueden utilizarse fragmentos antigénicos de dichas proteínas en lugar de las proteínas completas, siempre y cuando dichos fragmentos sean capaces de unirse a anticuerpos frente a BTV, o bien proteínas de fusión que comprenden, al menos, una de dichas proteínas o uno de dichos fragmentos antigénicos de las mismas. Asimismo, dichas proteínas (y los fragmentos antigénicos) pueden ser tanto de origen nativo como sintético o recombinante. En una realización concreta, no limitativa, dicho antígeno de BTV es una proteína VP7 recombinante de BTV (Ejemplo 1).
El soporte presente en dicho kit puede ser prácticamente cualquiera de los soportes a los que se ha hecho referencia previamente en esta descripción; no obstante, a modo ilustrativo, no limitativo, en una realización particular, dicho soporte sobre el que se inmoviliza un antígeno de BTV es una placa de microtitulación. Asimismo, prácticamente cualquiera de los marcadores a los que se ha hecho referencia previamente en esta descripción puede ser utilizado en dicho conjugado que comprende un antígeno de BTV y un marcador; no obstante, a modo ilustrativo, no limitativo, en una realización particular, dicho marcador es una enzima, tal como una peroxidasa) [conjugado antígeno de BTV/peroxidasa], en cuyo caso, dicho kit puede contener, si se desea, unos medios para revelar la presencia de complejo antígeno de BTV-anticuerpo-antígeno de BTV/marcador (e.g., TMB cuando el marcador es una peroxidasa).
En otra realización particular, el kit de la invención puede ser utilizado para diagnosticar la infección causada por PRRSV en animales susceptibles de ser infectados por dicho virus (e.g., ganado porcino, etc.) independientemente de que presenten o no sintomatología clínica, y comprende un soporte que comprende un antígeno de PRRSV y un conjugado que comprende dicho antígeno de PRRSV conjugado a un marcador, y, opcionalmente, medios para revelar la presencia de complejo antígeno de PRRSV- anticuerpo-antígeno de PRRSV/marcador.
Prácticamente cualquier antígeno de PRRSV puede ser utilizado en dicho kit; no obstante, a modo ilustrativo, no limitativo, en una realización particular, dicho antígeno de PRRSV es una proteína estructural o no estructural de PRRSV, o una combinación de dos o más de dichas proteínas estructurales, o bien una combinación de dos o más de dichas proteínas no estructurales, o bien, alternativamente, una mezcla de una o más proteínas estructurales de PRRSV con una o más proteínas no estructurales de PRRSV. Alternativamente, pueden utilizarse fragmentos antigénicos de dichas proteínas en lugar de las proteínas completas, siempre y cuando dichos fragmentos sean capaces de unirse a anticuerpos frente a PRRSV, o bien proteínas de fusión que comprenden, al menos, una de dichas proteínas o uno de dichos fragmentos antigénicos de las mismas. Asimismo, dichas proteínas (y los fragmentos antigénicos) pueden ser tanto de origen nativo como sintético o recombinante. En una realización concreta, no limitativa, dicho antígeno de PRRSV es una proteína de fusión que comprende la proteína de la nucleocápsida (N) de PRRSV (Ejemplo 3). El soporte presente en dicho kit puede ser prácticamente cualquiera de los soportes a los que se ha hecho referencia previamente en esta descripción; no obstante, a modo ilustrativo, no limitativo, en una realización particular, dicho soporte sobre el que se inmoviliza un antígeno de PRRSV es una placa de microtitulación.
Asimismo, prácticamente cualquiera de los marcadores a los que se ha hecho referencia previamente en esta descripción puede ser utilizado en dicho conjugado que comprende un antígeno de PRRSV y un marcador; no obstante, a modo ilustrativo, no limitativo, en una realización particular, dicho marcador es una enzima, tal como una peroxidasa) [conjugado antígeno de PRRSV/peroxidasa], en cuyo caso, dicho kit puede contener, si se desea, unos medios para revelar la presencia de complejo antígeno de PRRSV-anticuerpo-antígeno de PRRSV/marcador (e.g., TMB cuando el marcador es una peroxidasa).
Asimismo, el kit de la invención se puede utilizar para detectar y, si se desea, cuantificar, anticuerpos específicos de antígenos tumorales en una muestra de ensayo de un sujeto, y, de este modo, diagnosticar la existencia de un tumor o de un cáncer en un sujeto, preferentemente, en un ser humano. Los siguientes ejemplos ilustran la invención y no deben ser considerados limitativos del alcance de la misma.
EJEMPLO 1
Ensayo inmunoenzimático de doble reconocimiento para la detección de anticuerpos frente al virus de la Lengua Azul (BTV)
Con el objetivo de validar este ensayo inmunoenzimático de doble reconocimiento (ELISA DR) para detectar anticuerpos específicos frente a BTV se analizaron sueros de referencia para los 24 serotipos de BTV procedentes de diferentes orígenes.
Materiales y métodos rVP7de BTV (antígeno de BTV)
Como antígeno de BTV se utilizó la proteína recombinante VP7 (rVP7) de BTV
(Basak, A.K., Stuart D.I. and Roy P. 1992. J. Mol. Bio. 228:687-689). Dicha proteína se obtuvo infectando células de Spodoptera frugiperda Sf-9 con un baculovirus recombinante que contenía la secuencia que codificaba la proteína VP7 de BTV y recogiendo el cultivo con elevado efecto citopático; tras Usar las células mediante choque osmótico, el sobrenadante obtenido tras la centrifugación se purificó por intercambio iónico en FPLC (del inglés "Fast Protein Liquid Chromatography") y las fracciones que contenían la proteína se identificaron y valoraron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) al 11% de acrilamida. La proteína rVP7 de BTV así obtenida y purificada se utilizó en el tapizado de la placa de poliestireno a una concentración determinada por ELISA en el rango 0,1-1 μg/ml.
Conjugado rVP7-HRPO
Para su uso como conjugado, la proteína rVP7 se dializó frente a tampón bicarbonato 0,1 M (pH 8,5) y se conjugó con peroxidasa (HRPO) (Horse Radish peroxidase, ROCHE) según el método descrito por Nakane & Kawaoi [Nakane, P.K. & Kawaoi, A. (1974). Peroxidase- labeled antibody: A new method of conjugation. J. Histochem. Cytochem. 22: 1084-1091] modificado. Cada proceso de mareaje generó un lote de producción de conjugado. Cada uno de los lotes de producción se almacenó diluido en solución salina tamponada de fosfato (PBS) pH 7,4 y solución preservante 50% (v/v) Surmodics-TM (Diarect AG) y se almacenó a +4°C hasta su utilización.
Sueros
Con el fin de validar este ensayo, se analizaron sueros de referencia para los 24 serotipos de BTV procedentes de diferentes orígenes:
Laboratorio de Referencia Español (LRES) [Laboratorio Central de Veterinaria de Algete]: sueros de los serotipos 3, 10 y 19 de BTV; - Laboratorio de Referencia de la Oficina Internacional de Epizootias (OIE)
[Pirbright]: sueros de los 24 serotipos de BTV; y - Laboratorio de Referencia del Departamento de Agricultura de los Estados
Unidos [USDA]: sueros de los serotipos 5, 10, 19 y 20 de BTV.
Controles
Como controles, se utilizaron sueros de control positivo para BTV y sueros de control negativo para BTV, procedentes de animales inmunizados o no con VP7 de BTV, respectivamente. ELISA de doble reconocimiento (ELISA DR)
Se incuban placas de poliestireno de 96 pocilios con proteína rVP7 de BTV durante 18 horas a 4°C en tampón carbonato-BSA (seroalbúmina bovina), pH 9,6, con el fin de tapizar dichas con el antígeno de BTV (proteína rVP7). A continuación, las placas se lavan con PBS conteniendo 0,05% de Tween® 20, pH 7,4, se estabilizan durante 1 hora a temperatura ambiente (20-250C) en solución estabilizante Surmodics- TM (Diarect AG) y se secan. Las placas que no se van a utilizar inmediatamente, se envasan de forma individual, y se almacenan a 40C.
A continuación, sobre las placas tapizadas con el antígeno de BTV se añaden los sueros a analizar a una dilución 1A en PBS conteniendo 0,05% de Tween® 20 y se incuban durante 1 hora a 37°C. Tras lavar el material no adherido con PBS conteniendo 0,05% de Tween® 20, las placas se incuban con un conjugado rVP7-HRPO a una dilución predeterminada y valorada caso por caso, durante 1 hora a 37°C. Finalizado ese periodo de tiempo, las placas se lavan con PBS conteniendo 0,05% de Tween® 20 y la reacción se revela durante 15 minutos tras adición del sustrato TMB (trimetilbencidina). Tras parar la reacción con ácido sulfúrico 0,5 M se realiza la lectura de la absorbancia a 450 nm en un lector de placas de ELISA.
Resultados Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 1, en donde puede apreciarse que el ensayo proporcionado por esta invención (ELISA DR) es capaz de reconocer todos los serotipos de BTV para los que existen sueros de referencia en distintos Laboratorios de Referencia (véanse el apartado relativo a Sueros). Asimismo, dichos resultados ponen de manifiesto que dicho ELISA DR es lo suficientemente específico y sensible como para reconocer todos los serotipos de BTV, independientemente del tipo que sean y/o del título que tengan. Tabla 1 Análisis de sueros de referencia de 24 serotipos de BTV diferentes
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[+: detección positiva]
EJEMPLO 2
Especificidad y sensibilidad del ensayo inmunoenzimático de doble reconocimiento para la detección de anticuerpos frente a BTV utilizando sueros de campo
2.1 Especificidad utilizando sueros de campo
Para determinar la especificidad del ensayo inmunoenzimático de doble reconocimiento (ELISA DR) para la detección de anticuerpos frente a BTV, se realizaron estudios de campo con 758 sueros procedentes de granjas libres de BTV. Se analizaron sueros de vaca y de oveja. El protocolo seguido fue el descrito en el Ejemplo 1 (ELISA DR). Los resultados obtenidos mostraron una única muestra positiva con valores de densidad óptica (DO) cercanos al punto de corte (establecido tras determinar la señal de fondo de los sueros negativos de campo y observar la diferencia con la señal obtenida por un suero positivo límite preparado en el laboratorio, ajustando el ensayo para que dicha diferencia sea al menos de 0,3 puntos de absorbancia) indicando una especificidad del 99,8%.
2.2 Sensibilidad utilizando sueros de campo
Para determinar la sensibilidad del ensayo inmunoenzimático de doble reconocimiento (ELISA DR) para la detección de anticuerpos frente a BTV, se realizaron estudios de campo con 758 sueros procedentes de granjas libres de BTV. Siguiendo el protocolo descrito en el Ejemplo 1 (ELISA DR) se analizaron un total de 288 sueros de vaca y de oveja previamente caracterizados como positivos por otras técnicas tales como seroneutralización y otros ensayos ELISA. Todos ellos resultaron positivos indicando una sensibilidad del 100%.
EJEMPLO 3
Ensayo inmunoenzimático de doble reconocimiento para la detección de anticuerpos frente al virus respiratorio y reproductivo porcino (PRRSV)
Se realizó este ensayo inmunoenzimático de doble reconocimiento (ELISA DR) para detectar anticuerpos específicos de PRRSV y comparar los resultados obtenidos con los de otros ensayos ya existentes (ELISA indirecto y ELISA de bloqueo) para la detección de anticuerpos específicos de PRRSV.
Materiales y métodos
PlO-N (antígeno de PRRSV) Como antígeno de PRRSV se utilizó la proteína de fusión recombinante identificada como P10-N, que comprende la secuencia de aminoácidos de la nucleocápsida de PRRSV, aislado europeo, fusionada a la secuencia de aminoácidos 1- 259 de la proteína del gen 10 del fago T7, cuya obtención se describe en el Ejemplo 3 de la patente europea EP 952219 Bl.
Conjugado (P10-NVHRPO Para su uso como conjugado, la proteína de fusión P10-N se conjugó con peroxidasa (HRPO) según el método descrito por Nakane & Kawaoi [Nakane, P.K. & Kawaoi, A. (1974). Peroxidase-labeled antibody: A new method of conjugation. J. Histochem. Cytochem. 22: 1084-1091] modificado. Cada proceso de mareaje generó un lote de producción de conjugado. Cada uno de los lotes de producción se almacenó diluido en PBS pH 7,4 y solución preservante (Surmodics-TM, Diarect AG) 50% (v/v) y se almacenó a +4°C hasta su utilización.
Sueros Se analizaron 36 sueros de campo procedentes de cerdos de áreas geográficas diferentes que dieron positivo o negativo en otros ensayos (ELISA indirecto y ELISA de bloqueo) para la detección de anticuerpos específicos de PRRSV (Tabla 2).
ELISA indirecto utilizando el kit INGEZIM® PRRS EUROPA 1.1.PRS Kl (INGENASA)
Se añaden 100 μl de cada uno de los sueros problema a la dilución 1/100 en los pocilios y se incuba durante 1 h a 37°C. A continuación, la placa se lava 4 veces con PBS conteniendo 0,05% de Tween® 20. Seguidamente se añaden 100 μl de anticuerpo específico de IgG de cerdo conjugado con peroxidasa a una dilución predeterminada a cada pocilio, se tapa la placa y se incuba durante 45 minutos a temperatura ambiente (20-250C). Posteriormente, se lava la placa 5 veces con PBS conteniendo 0,05% de Tween® 20, se añaden 100 μl de sustrato ABTS (ácido 2,2'-azino-bis(3- etilbenzotiazolin-6-sulfónico) en cada pocilio y la reacción se mantiene durante 15 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, se añaden 100 μl de dodecilsulfato sódico (SDS) al 2% para parar la reacción y se lee la absorbancia a 405 nm en un lector de ELISA.
ELISA de bloqueo utilizando el kit INGEZIM® PRRS COMPAC 1.1.PRS K3 (INGENASA) Se añaden los sueros problemas a una dilución Vi en los pocilios y se incuba durante 1 h a 370C. A continuación, la placa se lava 4 veces con PBS conteniendo 0,05% de Tween® 20. Seguidamente se añaden 100 μl de anticuerpo monoclonal específico de la proteína de Ia nucleocápsida (N) de PRRSV conjugado con peroxidasa a una dilución predeterminada y se incuba durante 20 minutos a 37°C. Posteriormente, se lava la placa 5 veces con PBS conteniendo 0,05% de Tween® 20, se añaden 100 μl de sustrato ABTS en cada pocilio y la reacción se mantiene durante 15 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, se añaden 100 μl de SDS al 2% para parar la reacción y se lee la absorbancia a 405 nm en un lector de ELISA.
Ensayo inmunoenzimático de doble reconocimiento (ELISA DR")
Se incuban placas de poliestireno de 96 pocilios con proteína de fusión P10-N (antígeno de PRRSV) durante 18 horas a 4°C en tampón carbonato pH 9,6 -BSA (seroalbúmina bovina) con el fin de tapizar dichas con el antígeno de PRRSV (proteína de fusión PlO-N). A continuación, las placas se lavan con PBS conteniendo 0,05% de Tween® 20 pH7,4 se estabilizan durante 1 hora a temperatura ambiente en solución estabilizante (Surmodics-TM, Diarect AG) y se secan. Las placas que no se van a utilizar inmediatamente, se envasan de forma individual, y se almacenan a 4°C.
A continuación, sobre las placas tapizadas con el antígeno de PRRSV se añaden los sueros a analizar a una dilución 1/5 en PBS conteniendo 0,05% de Tween® 20 en un volumen de 50 μl y se incuban durante 1 hora a 37°C. Tras lavar el material no adherido con PBS conteniendo 0,05% de Tween® 20, las placas se incuban con un conjugado (PlO-N)-HRPO a una dilución predeterminada y fijada caso por caso, durante 30 minutos a temperatura ambiente (20-250C). Finalizado ese periodo de tiempo, las placas se lavan con PBS conteniendo 0,05% de Tween® 20 y la reacción se revela durante 15 minutos tras adición del sustrato TMB. Tras parar la reacción con ácido sulfúrico 0,5 M se realiza la lectura de la absorbancia a 450 nm en un lector de placas de ELISA.
Resultados
Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 2, en donde puede apreciarse que el ensayo proporcionado por esta invención (ELISA DR) es capaz de detectar anticuerpos específicos de PRRSV y que, además, dicho ensayo ELISA DR discrimina entre sueros positivos y negativos, comparándolo con los inmunoensayos ya existentes de competición e indirectos. Tabla 2
Comparación de los resultados obtenidos utilizando el ensayo ELISA DR con los resultados obtenidos utilizando un ELISA indirecto y un ELISA de bloqueo para la detección de anticuer os es ecíficos de PRRSV
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Cut off: Cut off: Cut off: 0,3568 0,256725 0,8655
* Valores de absorbancia obtenidos sobre una colección de 36 sueros de campo.
En sombreado, negrilla y cursiva, se indican los sueros considerados positivos por cada uno de los ensayos.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un inmunoensayo para detectar un anticuerpo específico de un antígeno diana en una muestra que comprende: a) poner en contacto dicho antígeno diana con una muestra sospechosa de contener dicho anticuerpo específico de dicho antígeno diana bajo condiciones que permiten la formación de un complejo antígeno-anticuerpo; b) añadir un conjugado que comprende dicho antígeno diana y un marcador bajo condiciones que permiten la formación de un complejo antígeno- anticuerpo-antí geno/marcador; y c) detectar dicho complejo antígeno-anticuerpo-antígeno/marcador.
2. Inmunoensayo según la reivindicación 1, en el que dicho antígeno diana es un antígeno de un organismo, un antígeno de una célula o un alérgeno.
3. Inmunoensayo según la reivindicación 2, en el que dicho antígeno diana es un antígeno de un virus, un antígeno de una bacteria, un antígeno de un hongo, un antígeno de un protozoo, un antígeno de un nematodo, un antígeno de una célula tumoral o un alérgeno.
4. Inmunoensayo según la reivindicación 3, en el que dicho antígeno es un antígeno de un virus patógeno de animales, incluyendo seres humanos.
5. Inmunoensayo según la reivindicación 4, en el que dicho virus patógeno es un virus perteneciente a la familia Adenoviridae, Arenaviridae, Arteriviridae, Birnaviridae,
Bungaviridae, Caliciviridae, Coronoviridae, Filoviridae, Flaviridae, Hepadnaviridae, Herpesviήdae, Iήdoviridae, Orthomyxoviridae, Papovaviridae, Paramyxoviridae, Parvoviridae, Picornaviridae, Poxviridae, Reoviridae, Retroviridae, Rhabdoviridae, o Togaviridae.
6. Inmunoensayo según la reivindicación 5, en el que dicho virus patógeno es un arbovirus, un arterivirus, un birnavirus, un calicivirus, un citomegalovirus, un herpesvirus, un orbivirus, un papilomavirus, un parvovirus, un pestivirus, un poliovirus, un retrovirus, un rhinovirus, o un rotavirus.
7. Inmunoensayo según la reivindicación 5, en el que dicho virus es el parvovirus porcino (PPV), el virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino
(PRRSV), el virus de la enfermedad de Aujesky (ADV), el virus de la fiebre añosa (FDMV), el virus de la gastroenteritis porcina transmisible (TGEV), el circovirus porcino, el virus de la diarrea viral bovina (BVDV), el virus de la rinotraqueitis bovina (IBRV), el virus de la lengua azul (BTV), el virus de la enfermedad hemorrágica del conejo (RHDV), el virus de la enfermedad de Gumboro (IBDV), o el pneumovirus aviar.
8. Inmunoensayo según la reivindicación 3, en el que dicho antígeno es un antígeno de una bacteria patógena de animales, incluyendo seres humanos.
9. Inmunoensayo según la reivindicación 8, en el que dicha bacteria patógena es Actinornyces israelli, Bacillus ar atraéis, Bacteroides sp., Bordetella sp., Borelia burgdorferi, Brucella sp., Campylobacter sp., Clostridium sp., Corynebacterium sp., Enterobacter aerogenes, Enterococcus sp., Erγsipelothrix rhusiopathiae, Escherichia coli, Fusobacterium nucleatum, Helicobacter pylori, Haemophilus influenzae, Klebsiella sp., Legionella pneumoplailia, Listeria monocytogenes, Leptospira sp., Moraxella catarrhalis, Mycobacteria sp., Neisseria sp., Pasteurella sp., Pseudomonas sp., Rickettsia sp., Salmonella sp., Staphylococcus sp., Streptobacillus moniliformis, Streptococcus sp., o Treponema sp.
10. Inmunoensayo según la reivindicación 3, en el que dicho antígeno es un antígeno de un hongo patógeno de animales, incluyendo seres humanos.
11. Inmunoensayo según la reivindicación 10, en el que dicho hongo patógeno es Blastomyces dermatitidis, Candida albicans, Chlamydia trachomatis, Coccidioides immitis, Cryptococcus neoformans, o Histoplasma capsulatum.
12. Inmunoensayo según la reivindicación 3, en el que dicho antígeno es un antígeno de un protozoo o de un nematodo patógeno de animales, incluyendo seres humanos.
13. Inmunoensayo según la reivindicación 10, en el que dicho protozoo o nematodo es Anaplasma margínale, Dirofilaria immitis, Leishmania sp., Plasmodium sp., Schistosoma sp:,~o Toxoplasmá sp.
14. Inmunoensayo según la reivindicación 3, en el que dicho antígeno es un antígeno tumoral.
15. Inmunoensayo según la reivindicación 14, en el que dicho antígeno tumoral comprende GD2, EGF-R, CD52, gplOO de melanoma humano, melan-A/MART-1 de melanoma humano, tirosinasa, NA 17- A nt, MAGE-3, p53, HPV16E7, (CDl lc)-TRP2, WTl, HMl.24, mucina prostática, antígeno específico de próstata (PSA), antígeno SF- 25, un antígeno tumoral asociado con un tumor de vejiga, un antígeno tumoral asociado al cáncer de mama, un antígeno tumoral asociado al cáncer de ovario, un antígeno tumoral asociado al cáncer de pulmón, un antígeno tumoral asociado al cáncer de piel, un antígeno tumoral asociado al cáncer de colon, un antígeno tumoral asociado a tumores linfoides de células B, un antígeno tumoral asociado a leucemia mieloide, un antígeno tumoral asociado a linfomas, o un fragmento antigénico de dichos antígenos.
16. Inmunoensayo según la reivindicación 3, en el que dicho antígeno es un alérgeno.
17. Inmunoensayo según la reivindicación 16, en el que dicho alérgeno es un extracto alergénico de un polen, un extracto alergénico de un insecto, un extracto alergénico de un alimento o de un producto alimenticio, un componente presente en saliva, pinzas o aguijones de un insecto que induce una reacción de sensibilidad en un sujeto, o un componente presente en una planta que induce una reacción de sensibilidad en un sujeto.
18. Inmunoensayo según la reivindicación 1, en el que dicha muestra sospechosa de contener anticuerpos específicos de dicho antígeno diana es una muestra biológica.
19. Inmunoensayo según la reivindicación 1, en el que dicho marcador es una enzima, un compuesto fluorescente o fluoróforo, un compuesto (quimio)luminiscente o un elemento radiactivo.
20. Inmunoensayo según la reivindicación 19, en el que dicho marcador es una peroxidasa.
21. Inmunoensayo según la reivindicación 1, en el que dicho inmunoensayo es un inmunoensayo enzimático, un fluoroinmunoensayo, un luminoinmunoensayo o un radioinmunoensayo.
22. Inmunoensayo según la reivindicación 21, en el que dicho inmunoensayo es un ELISA.
23. Inmunoensayo según la reivindicación 1, en el que dicho antígeno diana está inmovilizado sobre un soporte.
24. Inmunoensayo según la reivindicación 1, que comprende, además, cuantificar la cantidad de anticuerpos específicos de dicho antígeno diana presentes en dicha muestra sospechosa de contener dichos anticuerpos.
25. Un kit que comprende:
(i) un soporte que comprende un antígeno diana; y
(ii) un conjugado que comprende dicho antígeno diana y un marcador.
26. Kit según la reivindicación 25, que comprende, además, unos medios para revelar dicho marcador.
27. Kit según la reivindicación 25, para detectar, y si se desea, cuantificar anticuerpos específicos de dicho antígeno diana en una muestra sospechosa de contener dichos anticuerpos.
28. Kit según la reivindicación 25, para diagnosticar la infección causada por virus de la lengua azul (BTV), que comprende un soporte que comprende un antígeno de BTV y un conjugado que comprende dicho antígeno de BTV conjugado a un marcador, y, opcionalmente, medios para revelar la presencia de complejo antígeno de BTV-anticuerpo-antígeno de BTV/marcador.
29. Kit según la reivindicación 28, en el que dicho antígeno de BTV es una proteína VP7 recombinante de BTV (rVP7) y dicho conjugado comprende dicha proteína rVP7 de BTV conjugada a una peroxidasa, y comprende, además, 3,3',5,5'- tetrametilbenzidina (TMB).
30. Kit según la reivindicación 25, para diagnosticar la infección causada por el virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRSV) que comprende un soporte que comprende un antígeno de PRRSV y un conjugado que comprende dicho antígeno de PRRSV conjugado a un marcador, y, opcionalmente, medios para revelar la presencia de complejo antígeno de PRRSV-anticuerpo-antígeno de PRRSV/marcador.
31. Kit según la reivindicación 30, en el que dicho antígeno de PRRSV es una proteína de fusión que comprende la proteína de la nucleocápsida (N) de PRRSV y dicho conjugado comprende dicha proteína de fusión que comprende la proteína N de PRRSV conjugada a una peroxidasa, y comprende, además, 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB).
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