WO2009022939A1 - Procédé d'identification du génotype et du sous-type du virus de l'hépatite c sur une biopuce - Google Patents

Description

СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ГЕНОТИПА И ПОДТИПА ВИРУСА ГЕПАТИТА С НА БИОЛОГИЧЕСКОМ МИКРОЧИПЕ.

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области молекулярной биологии, вирусологии и медицины и касается способа идентификации генотипа и подтипа вируса гепатита С (В ГС) на основе анализа области NS 5b генома ВГС с использованием дифференцирующего биочипа.

Уровень техники

ВГС относится к семейству РНК-содержащих вирусов Flаviviridае и вызывает у людей инфекционный процесс, наиболее часто встречаемым осложнением которого является гепатит, перерастающий в цирроз печени и гепатокарциному (Survеillапсе. Нераtitis. CDC Rероrt N26I; Younossi Z, Kallman J, Kincaid J. Тhе еffесts оf HCV iпfесtiоп апd mапаgеmепt on hеаlth-геlаtеd quаlitу оf lifе. Нераtоlоgу. 2007 Maг;45(3):806-16). Этим заболеванием поражено более чем 170 миллионов человек на Земле, и число инфицированных продолжается увеличиваться. По всему миру насчитывается порядка 1,5 млн. случаев гепатокарциномы, вызванной инфекцией ВГС. Потери, связанные с этим заболеванием только в Соединенных Штатах, оцениваются в 200 миллионов долларов ежегодно.

Распространённой современной тенденцией в лечении ВГС является применение комплексной терапии, включающей совместное введение мегадоз интерферона с коктейлем, содержащим как общие противовирусные препараты, так и один или два ингибитора размножения ВГС (ингибиторы специфической протеазы - геликазы или(и) РНК-полимеразы) (Топiuttо P, Fаbris С, Вitеttо D, Fornasiere E, Rареtti R, Рirisi M. Vаlорiсitаbiпе dihydrochloride:a sресifiс роlуmеrаsе iпhibitоr оf hераtitis С virus. Сшт Орiп Iпvеstig Drugs. 2007 Feb;8(2):150-8; Jоhпsоп CL, Оwеп DM, GaIe M Jr. Fιшсtiопаl апd thеrареutiс апаlуsis оf hераtitis С viгаs NS3.4A рrоtеаsе сопtrоl оf апtivirаl immuпе dеfепsе. J Вiоl Сhеm. 2007 Арr; 282(14): 10792-803). Подобные коктейли повышают процент излечения, однако неминуемо ведут к селекции адаптивных мутантов ВГС, устойчивых к данным ингибиторам.

Идентификация генотипа и подтипа исследуемого образца ВГС имеет важное значение для целей выявления лекарственной чувствительности, оценки длительности и эффективности противовирусной терапии, установления пути распространения вируса.

Для определения генотипов и подтипов вируса гепатита С в настоящее время применяются следующие методы:

I. Прямое определение нуклеоτидной последовательности (Секвенирование) 5'-нeкoдиpyющeй области генома вируса гепатита С с последующим анализом полученной последовательности путем сравнения с существующей базой данных, на основании которого делается заключение о принадлежности данного образца к определенному генотипу и подтипу (набор 'TRUGENE HCV 5 "NC (Вауег НеаlthСаrе LLC, США)):

Jеffrеу J. Gегmеr, Dаvid W. Маjеwski, Мiсhаеl Rоssеr, Аmbеr Тhоmрsоп, P. Shаwп Мitсhеll, Тhоmаs F. Smith, Slаvа Еlаgiп, апd Jоsерh D. С. Yао. 2003. Еvаluаtiоп оf thе TRUGENE HCV 5'NC Gепоtурiпg Кit with thе Nеw GепеLibrаriап Моdulе 3.1.2 fоr Gепоtурiпg оf Нераtitis С Viгаs frоm Сliпiсаl Sресimепs. J Сliп Мiсrоbiоl., VoI. 41, No. 10, р. 4855-4857;

П. Метод зондов (Liпе Ргоbе аssау (LiPA)):

Zheng X, Pang M, Сhап А, Rоbеrtо А, Wаrпеr D, Yеп-Liеbеrmап В. 2003. Dirесt соmраrisоп оf hераtitis С virus genotypes tested by INNO-LiPA HCV П апd TRUGENE HCV gепоtурiпg mеthоds. J Сliп Viгоl. Oct;28(2):214-6;

Vегbеесk J, Маеs P, Wоllапts E, Vап dег Меrwе S, Sопg E, Nеvепs F, Vап Rапst M. 2005. Usе оf а соmmеrсiаllу аvаilаblе liпе ргоbе аssау fоr gепоtурiпg оf hераtitis С virus 5а strаiпs. J Сliп Мiсrоbiоl. Dec;43(12):6117-9;

III. Метод экстенции генотип-специфического праймера (Рrimеr-sресifiс ехtепsiоп апаlуsis):

Antonishyn NA, Аst VM, McDonald RR, Сhаudhаrу RK, Lin L, Апdопоv AP, Horsman GB. 2005. Rарid gепоtурiпg оf hераtitis С virus bу рrimеr-sресifiс ехtепsiоп апаlуsis. J CHn Мiсrоbiоl. Oct;43(10):5158-63.

ГV. Масс-спектрометрические методы (Маtriх-аssistеd lаsеr dеsоrрtiоп iопizаtiоп-timе оf flight (mаss sресtrоmеtrу)):

Ilina EN, Маlаkhоvа MV, Gепеrоzоv EV, Nikоlаеv EN, Gоvоruп VM. 2005. Маtriх-аssistеd lаsеr dеsоrрtiоп iопizаtiоп-timе оf flight (mаss sресtrоmеtrу) fоr hераtitis С virus gепоtурiпg. J Сliп Мiсrоbiоl. Juп;43(6):2810-5.

V. Методы иммуноферментного анализа (Sеrоtурiпg оf hераtitis С virus): Еlsаwу EM, Sоbh MA, Еl-Сhепаwi FA, Hassan IM, Shеhаb Еl-Diп AB, Ghопеim MA 2005. Sеrоtурiпg оf hераtitis С viшs iп hеmоdiаlуsis раtiепts: соmрагisоп with а stапdагdizеd gепоtурiпg аssау Diаgп Мiсrоbiоl Iпfесt Dis. Feb;51(2):91-4.

VI. Гетеродуплексный анализ с применением капиллярного электрофореза (hеtеrоduрlех mоbilitу апаlуsis usiпg tеmреrаturе gгаdiепt сарillаrу еlесtrорhоrеsis) :

Маrgrаf RL, Еrаli M, Liеw M, Wittwеr CT. 2004. Gепоtурiпg hераtitis С virus bу hеtеrоduрlех mоbilitу апаlуsis usiпg tеmреrаturе gгаdiепt сарillаrу еlесtrорhоrеsisю J Сliп Мiсrоbiоl. 2004 Oct;42(10):4545-51.

VII. Метод инвазивных зондов (Ьivаdеr Аssау):

Gеrmеr JJ, Маjеwski DW, Yuпg В, Мitсhеll PS, Yао JD. 2006. Еvаluаtiоп оf thе iпvаdеr аssау fоr gепоtурiпg hераtitis С virus. J Сliп Мiсrоbiоl. Feb;44(2):318-23.

VIII. Метод гнездовой ПЦР с последующим структурно-специфичным расщеплением (Nеstеd rеstriсtiоп sitе-sресifiс PCR):

Кrеkulоvа L, Rеhаk V, Wаkil AE, Наrris E, Rilеу LW. 2001. Nеstеd rеstriсtiоп sitе-sресifiс PCR tо dеtесt апd tуре hераtitis С virus (HCV): а rарid mеthоd tо distiпguish HCV subtуре Ib fiоm оthеr gепоtуреs. J Сliп Мiсrоbiоl. May;39(5): 1774-80.

IX. Высокоэффективная жидкостная хроматография (dепаruriпg high- реrfоrmапсе liquid сhrоmаtоgrарhу):

Liеw M, Еrаli M, Раgе S, Нillуаrd D, Wittwеr С. 2004 Hераtitis С gепоtурiпg bу dепаruriпg high-реrfоrmапсе liquid сhrоmаtоgrарhу. J CHn Мiсrоbiоl. Jaп;42(l): 158-63.

X. Транскрипционно-опосредованная амплификация в сочетании с методом зондов (trапsсriрtiоп-mеdiаtеd аmрlifiсаtiоп iп сопjuпсtiоп with thе liпе рrоbе аssау):

Соmапоr L, Еlkiп С, Lеuпg К, Кrаjdеп M, Кrопquist К, Niсоlаs К, Ноrапskу E, dеМеdiпа M, Кittiсhаi P, Sаblоп E, Ziеrmапп R, Shеrlосk С. 2003 Suссеssful HCV gепоtурiпg оf рrеviоuslу fаilеd апd lоw virаl lоаd sресimепs usiпg ап HCV RNA quаlitаtivе аssау bаsеd оп trапsсriрtiоп-mеdiаtеd аmрlifiсаtiоп iп сопjuпсtiоп with thе liпе рrоbе аssау. J Сliп Virоl. Sep;28(l): 14-26.

XI. Метод ПЦР с детекцией в режиме реального времени с последующим анализом кривых плавления (Меltiпg сurvе апаlуsis): Doris M. Наvеrstiск, Grапt С. Вullоск, апd Dаvid E. Вгuпs. 2004. Gепоtурiпg оf Нераtitis С Viгаs bу Меltiпg Сurvе Апаlуsis: Апаlуtiсаl Сhаrасtеristiсs апd Реrfоrmапсе. Сliпiсаl Сhеmistrу 50, No. 12, р 2405-2407.

XII. Прямое определение нуклеотидной последовательности (Секвенирование) области NS5B вируса гепатита С с последующим анализом полученной последовательности путем построения филогенетического дерева и определения генотипа и подтипа исследуемого образца на основании локализации анализируемой последовательности в одном из кластеров данного дерева (NS5B sеquепсiпg fоllоwеd bу рhуlоgепеtiс апаlуsis):

К. Sапdrеs-Sаuпе, P. Dепу, С. Раsquiег, V. Тhibаut, G. Duvеrliе, J. Izореt. 2003. Dеtегmiпiпg hераtitis С gепоtуре bу апаlуziпg thе sеquепсе оf thе NS5b rеgiоп. Jоurпаl оf Virоlоgiсаl Меthоds VoI. 109 рр 187-193;

Lарегсhе S, Luпеl F, Izореt J, Аlаiп S, Dепу P, Duvегliе G, Gаudу С, Раwlоtskу JM, Рlапtiег JC, Роzzеttо В, Тhibаult V, Тоsеtti F, Lеfrеrе JJ. 2005. Соmраrisоп оf hераtitis С virus NS5b апd 5' попсоdiпg gепе sеquепсiпg mеthоds iп а multiсепtеr studу. J Сliп Мiсrоbiоl. Feb;43(2):733-9;

Нпаtуszуп, J., BeId M., Guаlbеrtus Нubегtus M., Guеttоuсhе Т., Gоuw R., Vап Dег Мееr, С, Веаtrijs Мала. (Вауеr Неаlthсаrе LLC). Меthоds апd rеаgепts fоr gепоtурiпg HCV. WO/2007/076493. Iпtеmаtiопаl Аррliсаtiоп No. PCTУUS2006/062582. Рubliсаtiоп Dаtе: 05.07.2007.

Методы (I-ГV, VI-XI) основаны на анализе генотип- и подтип-специфических последовательностей 5'-нeкoдиpyющeй области генома ВГС (5'NC). Анализ последовательностей 5 'NC области дает возможность однозначно идентифицировать все 6 генотипов ВГС, однако обладает низкой эффективностью (менее 70%) в отношении дифференциации подтипов генотипа 1, в частности подтипа Ib, являющегося наиболее вирулентным и устойчивым к терапии рибавирином и интерфероном (К. Sапdrеs-Sаuпе, P. Dепу, С. Раsquiег, V. Тhibаut, G. Duvегliе, J. Izореt. 2003. Dеtегmiпiпg hераtitis С gепоtуре bу апаlуziпg thе sеquепсе оf thе NS5b rеgiоп. Jоurпаl оf Virоlоgiсаl Меthоds VoI. 109 ppl87-193; Lарегсhе S, Luпеl F, Izореt J, Аlаiп S, Dепу P, Duvеrliе G, Gаudу С, Раwlоtskу JM, Рlапtiег JC, Роzzеttо В, Тhibаult V, Тоsеtti F, Lеfrеrе JJ. 2005. Соmраrisоп оf hераtitis С virus NS5b апd 5' попсоdiпg gепе sеquепсiпg mеthоds iп а multiсепtеr studу. J CHn Microbiol.¥eЪ;43(2):733-9; Сапtаlоubе JF, Laperche S, Gallian P, Bouchardeau F, dе Lаmbаllеriе X, dе Мiссо P. Апаlуsis оf thе 5' noncoding rеgiоп vеrsus thе NS5b rеgiоп iп gепоtурiпg hераtitis С viгus isоlаtеs frоm blооd dопоrs iп Fгапсе. J CHn Мiсrоbiоl. 2006 Juп;44(6):2051-6; Мurрhу DG, Willеms В, Dеsсhепеs M, Нilzепгаt N, Моussеаu R, Sаbbаh S.2007. Usе оf Sеquепсе Апаlуsis оf thе NS5B Rеgiоп fоr Rоutiпе Gепоtурiпg оf Hераtitis С Viшs with Rеfеrепсе tо С/Еl апd 5'UTR Sеquепсеs. J Сliп Мiсrоbiоl. Fеb 7).

В настоящее время только анализ области NS 5b позволяет идентифицировать подтип Ib со специфичностью, близкой к 100%. Более того, исследование последовательностей данной области дает возможность выявить значительно большее число подтипов, чем при анализе последовательностей 5 'NC (Тhоmаs F, Niсоt F, Sапdrеs-Sаuпе К, Dubоis M, Lеgrапd-Аbгаvапеl F, Аlriс L, Peron JM, Раsquiеr С, Izореt J. 2007. Gепеtiс divеrsitу оf HCV gепоtуре 2 strаiпs iп sоuth wеstеrп Fraпce.J Меd Virоl. Jaп;79(l):26-34; Niсоt F, Lеgгапd-Аbrаvапеl F, Sапdrеs-Sаuпе К, Воulеstiп А, Dubоis M, Аlriс L, Viпеl JP, Раsquiеr С, Izореt J. 2005. Неtеrоgепеitу оf hераtitis С viшs gепоtуре 4 strаiпs сirсulаtiпg iп sоuth-wеstеrп Fraпce.JGeи Virоl Jaп;86(Pt l):107-14).

Таким образом, проведение анализа последовательности области NS 5b в настоящее время является необходимым для идентификации генотипа и подтипа исследуемого образца ВГС с целью выявления лекарственной чувствительности, оценки длительности и эффективности противовирусной терапии, установления пути заражения (Lареrсhе S, Saune K, Deny P, Duvеrliе G, Alain S, Сhаiх ML, Gаudу С, Lunel F, Раwlоtskу JM, Рауап С, Роzzеttо В, Таmаlеt С, Тhibаult V, Vаllеt S, Bouchardeau F, Izореt J, Lеfrеrе JJ. 2006. Uпiquе NS5b hераtitis С virus gепе sеquепсе сопsепsus dаtаbаsе is еssепtiаl fоr stапdаrdizаtiоп оf gепоtуре dеtеrmiпаtiопs iп multiсепtеr ерidеmiоlоgiсаl studiеs. J CHn Мiсrоbiоl Feb;44(2):614-6; Кuikеп С, Yusim К, Воуkiп L, Riсhаrdsоп R. 2005. Thе Lоs Аlаmоs hераtitis С sеquепсе dаtаbаsе. Вiоiпfоrтаtiсs Fеb l;21(3):379-84).

Метод секвенирования последовательности области NS 5b ВГС с последующим филогенетическим анализом (XII) требует постановки реакций амплификации и секвенирования, проведения дополнительной очистки продуктов реакций после каждой из вышеперечисленных стадий и последующего анализа на автоматическом секвенаторе. Более того, последующий анализ хроматограмм, конструирование множественного выравнивания и построение филогенетических деревьев предъявляют повышенные требования к квалификации персонала, что препятствует широкому использованию данного подхода для анализа потока клинических образцов в условиях ординарной диагностической лаборатории.

Метод выявления серотипов с помощью вариантов иммуноферментного анализа (V) позволяет выявлять лишь ограниченный набор генотипов и подтипов (Ia, Ib, 2а, 2b, За, и 4а) и требует наличия высокоочищенных моноклональных антител для каждого серотипа.

Также, для перечисленных выше методов идентификации генотипов и подтипов отмечены следующие недостатки:

- Коммерческий набор ШNО-LiРА (II) и его применение в сочетании с транскрипционно-опосредованной амплификацией (X) отличается высокой себестоимостью и идентифицирует ограниченное количество подтипов;

- Метод с использованием генотип-специфических праймеров в пробирке (Ш) требует постановки независимых реакций по количеству генотипов (т.е. не менее 6) для выявления одного только генотипа;

- ПЦР-гетеродуплексный анализ с применением капиллярного электрофореза (VI) и метод гнездовой ПЦР с последующим структурно-специфичным расщеплением (VПI) трудоемки, занимают большое количество времени и требуют типовых стандартов на каждый определяемый генотип и/или подтип;

- Метод инвазивных зондов (VП) идентифицирует только генотип и не позволяет сделать заключение о подтипе, что является серьезным ограничением для его применения в клинической практике, где необходимо выявление лекарственно- устойчивых разновидностей ВГС (по крайней мере, Ib и 4d) для оценки эффективности и длительности терапии;

- Методы масс-спектрометрии (IV) и ВЭЖХ (IX) требуют наличия дорогостоящего оборудования, дополнительных стадий подготовки образца для анализа и идентифицируют ограниченное число подтипов;

- ПЦР с детекцией в режиме реального времени (XI) выявляет наличие только самых распространенных генотипов и подтипов и при этом весьма дорог для рутинного анализа.

Таким образом, в данной области существует острая потребность в разработке способа идентификации генотипа и подтипа вируса гепатита С, который бы выгодно отличался от известных из уровня техники решений простотой проведения анализа, высокими специфичностью и информативностью в отношении числа идентифицируемых генотипов и подтипов, а также невысокой стоимостью.

Раскрытие изобретения

В результате проведенных обширных научных исследований авторы настоящего изобретения обнаружили, что задача разработки способа идентификации генотипа и подтипа вируса гепатита С может быть успешно решена путем использования биологических чипов (микрочипов) для анализа области NS 5b генома ВГС.

Способ идентификации генотипа и подтипа вируса гепатита С (ВГС) на основе анализа области NS5b генома ВГС на биочипах выгодно отличается от известных из уровня техники методов возможностью выявления всех шести генотипов (1-6) и 36 подтипов ВГС (Ia-Ie, 2а, 2b, 2с, 2d, 2i, 2j, 2k, 21, 2m, За, Зb,3k, 4а, 4с, 4d, 4f, 4h, 4i, 4k, 4n, 4o, 4p, 4r, 4t, 5а, 6а, 6b, 6d, 6g, 6h, 6k) в клинических образцах со специфичностью, близкой к 100%, за счет анализа последовательности области NS5b; а также низкой себестоимостью, малым временем, необходимым для получения результата. Метод не требует дорогостоящего оборудования и высококвалифицированного персонала. Данные, полученные с помощью метода гибридизации на биочипах, могут быть использованы для оценки и прогнозирования тяжести протекания заболевания (острый/хронический цирроз, вероятность развития рака печени), определения терапевтической дозы лекарственных препаратов и длительности курса терапии, а также для эпидемиологического генотипирования.

В своем первом аспекте данное изобретение обеспечивает способ идентификации генотипа и подтипа ВГС на основе анализа области NS5b генома ВГС с использованием олигонуклеотидного биочипа. Способ настоящего изобретения основан на двухстадийной ПЦР с получением флуоресцентно меченого преимущественно одноцепочечного фрагмента области NS5b с последующей гибридизацией этого фрагмента на биочипе, содержащем набор специфичных дискриминирующих олигонуклеотидов, комплементарных вариантам последовательностей области NS5b, специфичных в отношении генотипов и подтипов. Способ предусматривает следующие стадии: (а) - обратную транскрипцию, совмещенную с ПЦР (ОТ-ПЦР), с использованием вирусной РНК в качестве матрицы и первой пары праймеров, специфичных к фрагменту области NS5b;

(б) - асимметричную амплификацию фрагмента области NS 5b с использованием в качестве матрицы продукта ОТ-ПЦР, полученного на стадии (а), второй пары специфичных праймеров и смеси четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов, в которой один из четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов является флуоресцентно меченым, в качестве субстрата, с получением преимущественно одноцепочечного флуоресцентно меченого фрагмента;

(в) - обеспечение биочипа для идентификации генотипа и подтипа ВГС, представляющего собой подложку, содержащую множество дискретных элементов, в каждом из которых иммобилизован уникальный олигонуклеотидный зонд, имеющий последовательность, комплементарную последовательности одноцепочечного фрагмента, полученного на стадии (б), и выбранную из группы, включающей: а) соответствующие специфичные для каждого из генотипов ВГС (генотип- специфичные) последовательности фрагмента области NS5b; и б) соответствующие специфичные для каждого из подтипов ВГС (подтип-специфичные) последовательности фрагмента области NS5b;

(г) - гибридизацию амплифицированного меченого продукта, полученного на стадии (б), на биочипе с образованием дуплексов с иммобилизованными зондами в условиях, обеспечивающих разрешение в один нуклеотид между образующимися в результате гибридизации совершенными и несовершенными дуплексами;

(д) - регистрацию и интерпретацию результатов гибридизации.

В одном из своих воплощений способ характеризуется тем, что на стадии (а) используют первую пару специфичных праймеров, последовательности которых представлены SEQ ID NO: 121 и 122.

В еще одном из воплощений способ характеризуется тем, что на стадии (б) используют вторую пару специфичных праймеров, последовательности которых представлены SEQ ID NO: 121 и 123.

В своем следующем воплощении способ характеризуется тем, что на стадии (б) один из праймеров второй пары используют, по меньшей мере, в десятикратном молярном избытке по отношению ко второму праймеру. В своем следующем воплощении способ характеризуется тем, что на стадии (б) в качестве флуоресцентно меченого дезоксинуклеозидтрифосфата используют флуоресцентно меченый дезоксиуридинтрифосфат.

В еще одном из воплощений способ характеризуется тем, что биочип представляет собой биочип на основе гидрогелевых ячеек, полученный способом химически или фото-индуцируемой сополимеризации.

В своем следующем воплощении способ характеризуется тем, что биочип содержит набор иммобилизованных олигонуклеотидов, последовательности которых представлены SEQ ID NO: 1-120.

В следующем воплощении способ характеризуется тем, что регистрацию результатов на стадии (д) проводят с помощью портативного анализатора флуоресценции и программного обеспечения, что позволяет использовать программную обработку интенсивностей сигналов с последующей интерпретацией результатов.

В следующем воплощении способ характеризуется тем, что интерпретацию зарегистрированных результатов на стадии (д) проводят в два этапа: на первом этапе анализируют сигналы в элементах биочипа, содержащих олигонуклеотидные зонды, специфичные к генотипам ВГС, тем самым идентифицируя генотип исследуемого образца; в случае идентификации генотипа на втором этапе анализируют только элементы биочипа, содержащие олигонуклеотидные зонды, специфичные к подтипам идентифицированного генотипа, независимо от наличия сигналов в элементах, содержащих зонды, специфичные к подтипам других генотипов.

Наконец, в еще одном своем воплощении способ дополнительно включает оценку и прогнозирование тяжести протекания заболевания (острый/хронический цирроз, вероятность развития рака печени), определение терапевтической дозы лекарственных препаратов и длительности курса терапии, и/или эпидемиологическое генотипирование на основе проведенной интерпретации результатов гибридизации.

В своем следующем аспекте данное изобретение относится к биочипу для идентификации генотипа и подтипа ВГС на основе анализа области NS 5b, представляющему собой подложку, содержащую множество дискретных элементов, в каждом из которых иммобилизован уникальный олигонуклеотидный зонд, причем последовательности зондов представлены SEQ Ш NO: 1-120. В следующем воплощении данного аспекта настоящего изобретения биочип характеризуется тем, что он представляет собой биочип .на основе гидрогелевых ячеек, полученный способом химически или фото-индуцируемой сополимеризации.

Следующим аспектом данного изобретения является набор олигонуклеотидных зондов для получения биочипа для идентификации генотипа и подтипа ВГС на основе анализа области NS5b, имеющих последовательности SEQ ID NO: 1-120.

Наконец, еще одним аспектом данного изобретения является способ конструирования набора олигонуклеотидных зондов, используемых для получения биочипа для идентификации генотипа и подтипа ВГС на основе анализа области NS 5b, предусматривающий раздельный выбор нескольких дискриминирующих зондов для каждого из генотипов и подтипов, последовательности которых комплементарны последовательностям различных участков исследуемого фрагмента области NS 5b.

Другие аспекты настоящего изобретения будут ясны из прилагаемых фигур, подробного описания и формулы изобретения.

Краткий перечень фигур

Для более ясного понимания сущности заявленного изобретения, а также для демонстрации его характерных черт и преимуществ далее приводится подробное описание изобретения со ссылками на фигуры чертежей, на которых:

Фиг. 1 представляет принципиальную схему проведения анализа области NS5b ВГС с целью идентификации генотипа и подтипа ВГС на биологическом микрочипе.

Фиг. 2 представляет схему выбора олигонуклеотидов для идентификации генотипов и подтипов на основе анализа фрагмента области NS5b генома ВГС.

Фиг. 3 представляет схему размещения дискриминирующих олигонуклеотидов на биочипе.

Фиг. 4A представляет флуоресцентную картину гибридизации, полученную на биочипе в результате анализа образца ВГС, имеющего генотип 1, подтип Ia.

Фиг. 4Б представляет распределение нормированных сигналов ячеек биочипа, полученное в результате анализа образца ВГС, имеющего генотип 1, подтип Ia. Фиг. 5A представляет флуоресцентную картину гибридизации, полученную на биочипе в результате анализа образца ВГС, имеющего генотип 1, подтип Ib.

Фиг. 5 Б представляет распределение нормированных сигналов ячеек биочипа, полученное в результате анализа образца ВГС, имеющего генотип 1, подтип Ib.

Фиг. 6A представляет флуоресцентную картину гибридизации, полученную на биочипе в результате анализа образца ВГС, имеющего генотип 1, подтип Ie.

Фиг. 6Б представляет распределение нормированных сигналов ячеек биочипа, полученное в результате анализа образца ВГС, имеющего генотип 1 , подтип 1 е.

Фиг. 7A представляет флуоресцентную картину гибридизации, полученную на биочипе в результате анализа образца ВГС, имеющего генотип 2, подтип 2а.

Фиг. 7Б представляет распределение нормированных сигналов ячеек биочипа, полученное в результате анализа образца ВГС, имеющего генотип 2, подтип 2а.

Фиг. 8A представляет флуоресцентную картину гибридизации, полученную на биочипе в результате анализа образца ВГС, имеющего генотип 2, подтип 2i.

Фиг. 8Б представляет распределение нормированных сигналов ячеек биочипа, полученное в результате анализа образца ВГС, имеющего генотип 2, подтип 2i.

Фиг. 9A представляет флуоресцентную картину гибридизации, полученную на биочипе в результате анализа образца ВГС, имеющего генотип 3, подтип За.

Фиг. 9Б представляет распределение нормированных сигналов ячеек биочипа, полученное в результате анализа образца ВГС, имеющего генотип 3, подтип За.

Фиг. 1OA представляет флуоресцентную картину гибридизации, полученную на биочипе в результате анализа образца ВГС, имеющего генотип 4, подтип 4а.

Фиг. 10Б представляет распределение нормированных сигналов ячеек биочипа, полученное в результате анализа образца ВГС, имеющего генотип 4, подтип 4а.

Фиг. НА представляет флуоресцентную картину гибридизации, полученную на биочипе в результате анализа образца ВГС, имеющего генотип 4, подтип 4d.

Фиг. 11Б представляет распределение нормированных сигналов ячеек биочипа, полученное в результате анализа образца ВГС, имеющего генотип 4, подтип 4d.

Фиг. 12A представляет флуоресцентную картину гибридизации, полученную на биочипе в результате анализа образца ВГС, имеющего генотип 5, подтип 5а. Фиг. 12Б представляет распределение нормированных сигналов ячеек биочипа, полученное в результате анализа образца ВГС, имеющего генотип 5, подтип 5а.

Фиг. 13 А представляет флуоресцентную картину гибридизации, полученную на биочипе в результате анализа образца ВГС, имеющего генотип 6.

Фиг. 13Б представляет распределение нормированных сигналов ячеек биочипа, полученное в результате анализа образца ВГС, имеющего генотип 6.

Осуществление изобретения

Задача настоящего изобретения состоит в создании способа идентификации генотипа и подтипа вируса гепатита С на основе анализа области NS 5b с помощью биологического микрочипа.

В заявленном способе предложено использование: процедуры обратной транскрипции, совмещенной с полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР), для амплификации последовательности фрагмента области NS 5b; получение с наработанного продукта одноцепочечного флуоресцентно меченого фрагмента NS 5b, при этом в качестве исходного образца может быть использована вирусная РНК, выделенная из клинического материала, такого как, например, кровь, плазма или биоптат печени. Заявленный способ также предусматривает использование оригинального олигонуклеотидного биочипа с иммобилизованными специфическими зондами, процедуры гибридизации, регистрации и интерпретации результатов.

Принципиальная схема идентификации генотипа и подтипа исследуемого образца ВГС на биочипе.

Схема анализа последовательности фрагмента области NS 5b ВГС для идентификации генотипа и подтипа с помощью биочипа представлена на Фиг. 1.

Выделение РНК ВГС из клинического образца осуществляют с помощью известных в данной области способов (например, Ноurfаr MK, Michelsen U, Sсhmidt M, Веrgеr А, Sеifriеd E, Rоth WK. Нigh-thrоughрut рurifϊсаtiоп оf virаl RNA bаsеd on поvеl аquеоus сhеmistrу fог пuсlеiс асid isоlаtiоп. CIm Сhеm. 2005 Jul;51(7): 1217-22), или любого специализированного коммерчески доступного набора реагентов для выделения РНК из крови, плазмы или биоптата печени, например QIАаmр DSP Virus Кit (Кат Jfe 60704, Qiаgеп, Германия), МаgМАХ™ АI/ND Viгаl RNA Isоlаtiоп Кits (Кат N° AM1939, Аmbiоп, США) или «Koмπлeкт реагентов для выделения PHK» (Кат N° 05-013, ЗАО «HПФ ДHK-тexнoлoгия», Россия). Амплификацию фрагмента области NS 5b генома ВГС на первом этапе выполняют с помощью реакции обратной транскрипции, совмещенной с ПЦР (OT- ПЦР). Для проведения ОТ-ПЦР могут быть использованы как различные системы, описанные, например, в Casabianca A., Orlandi C, Frаtеmаlе A., Magnani M. А пеw опе-stер RT-PCR mеthоd fог virus quапtitаtiоп iп muriпе АШS. 2003 Jоumаl оf Virоlоgiсаl Меthоds VoI 110(1) , рр. 81-90, так и коммерчески производимые наборы, например, OneStep RT-PCR Кit (Кат Xe 210210, Qiаgеп, Германия), Ассusсriрt® Нigh- Fidеlitу RT-PCR Кit (Кат. Ns 600180, Strаtаgепе, США) и др.

Праймеры для проведения первой стадии амплификации выбирают таким образом, чтобы они фланкировали наиболее полиморфный сегмент области NS5b, позволяющий дифференцировать существующие генотипы и подтипы ВГС. Предпочтительно, чтобы сегмент области NS5b, подлежащий амплификации, включал положения с 8256 по 8645 генома ВГС согласно Сhоо, Q. L., К. H. Riсhmап, J. H. Нап, К. Веrgеr, С. Lее, С. Dопg, С. Gаllеgоs, D. Соit, R. Меdiпа-Sеlbу, P. J. Ватт, еt аl. 1991. Gепеtiс оrgапizаtiоп апd divеrsitу оf thе hераtitis С virus. Рrос. Nаtl. Асаd. Sсi. USA 88: 2451-2455.

Последовательности праймеров выбирают таким образом, чтобы проводить эффективную амплификацию РНК исследуемого сегмента области NS5b любого генотипа и, соответственно, подтипа ВГС. Для этого, например, может быть сконструировано множественное выравнивание всех доступных в базах данных нуклеотидных последовательностей области NS5B, находящихся по адресам http://www.ncbi.nlm.шh.gov/Genbank/index.html и http://hcv.lanl. gov/content/hcv-db. Затем находят наиболее консервативные для всех генотипов ВГС участки области NS5b и выбирают праймеры, специфичные к данным участкам. Используя специализированное программное обеспечение, например Оligо v. 6.3 (Моlесulаг Вiоlоgу Iпsights Iпс, США) или Fаst PCR

(http://www.biocenter.helsinki.fi/bi/Programs/fastpcг.b.tm) или другие коммерчески доступные программы, или программы, свободно доступные в сети Iпtеrпеt, рассчитывают температуры плавления праймеров и, варьируя их длину, добиваются того, чтобы разброс температур отжига праймеров внутри пары не превышал 3-4°C. При подборе праймеров избегают таких последовательностей, которые способны формировать вторичные структуры типа шпильки с высокими температурами плавления. Каждый выбранный праймер должен обладать уникальной специфичностью в отношении анализируемого участка области NS5b. Специфичность праймеров проверяется с помощью программного обеспечения, использующего поиск в базах нуклеотидных последовательностей по алгоритму BLAST (например, www.псbi.пlm.пih.gоv/ВLАSТ). В частности необходимо избегать таких последовательностей, которые способны продуктивно гибридизоваться (отжигаться) с последовательностями генома человека.

На втором этапе получают преимущественно одноцепочечный флуоресцентно меченый продукт методом асимметричной ПЦР с использованием в качестве субстрата для построения цепи dе поvо смеси дезоксинуклеозидтрифосфатов, в которой один из дезоксинуклеозидтрифосфатов является флуоресцентно меченым. Как известно специалистам в данной области, смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов для проведения ПЦР содержит dАТР, dGТР, dСТР и dТТР, причем вместо dТТР может использоваться dUТР или смесь dТТР/dUТР в любой молярной пропорции. Любой из указанных дезоксинуклеозидтрифосфатов может нести флуоресцентную метку. Наиболее предпочтительно использование флуоресцентно меченого дезоксиуридинтрифосфата, что, с одной стороны, обусловливает эффективное включение данного субстрата во вновь синтезированную цепь ДНК в процессе ПЦР, с другой - обеспечивает возможность предотвращать получение ложных результатов за счет перекрестной кросс-контаминации ампликонами путем использования на первой стадии фермента урацил-ДНК-гликозилазы. Это имеет критическое значение при проведении массовых анализов в условиях специализированной лаборатории.

В качестве флуоресцентного красителя может быть использован любой флуоресцентный краситель, который может быть химически включен в молекулу дезоксинуклеозидтрифосфата таким образом, чтобы не препятствовать в существенной степени прохождению полимеразной цепной реакции и последующей гибридизации полинуклеотидной молекулы, содержащей такие флуоресцентно меченые нуклеотидные остатки, с иммобилизованными олигонуклеотидными зондами. В случае флуоресцентно меченого дезоксиуридинтрифосфата, например, флуоресцентный краситель может быть присоединен к 5'-кoнцy аминоаллилъного производного dUТР. Примеры таких красителей хорошо известны специалисту в данной области техники и включают красители флуоресцеинового (ТАМRА^®, RОХ^®, JОЕ^®), родаминового (Техаs Rеd^®), полиметинового (СуЗ^®, Cy5^®, Cy5.5^®, Cy7^®) рядов (Rапаsiпghе R. апd Вrоwп T). Fluоrеsсепсе bаsеd strаtеgiеs fоr gепеtiс апаlуsis. Сhет. Соттип., 2005, 5487-5502). Флуоресцентные красители коммерчески доступны, в частности от фирмы Моlесulаr Ргоbеs, США. Наиболее предпочтительными являются красители, спектр возбуждения которых лежит в длинноволновой (красной) области спектра, что позволяет использовать для возбуждения флуоресценции недорогие источники возбуждающего излучения типа полупроводниковых лазеров.

Флуоресцентно меченые дезоксинуклеозидтрифосфаты могут быть получены как в лабораторных условиях с использованием таких известных способов, как, например (Кuwаhаrа M, Nаgаshimа J, Наsеgаwа M, Таmurа T, Кitаgаtа R, Напаwа К, Ноsоshimа S, Каsаmаtsu T, Оzаki H, Sаwаi H. Sуstеmаtiс сhаrасtеrizаtiоп оf T- dеохупuсlеоsidе- 5'-triphosphate апаlоgs аs substrаtеs fог DNA роlуmегаsеs bу роlуmегаsе сhаiп геасtiоп апd kiпеtiс studiеs on епzуmаtiс рrоduсtiоп оf mоdifϊеd DNA. Nuсlеiс Асids Rеs. 2006 34(19):5383-94), так и являются коммерчески доступными, например СуDуе Fluоrеsсепt Nuсlеоtidеs (Кат. JN° PA55021, PA55032, PA55026, GE Неаlthсаrе, США).

Праймеры для проведения второй стадии амплификации выбирают с учетом требований, изложенных выше, с тем отличием, что по меньшей мере один из праймеров выбирается внутри ПЦР-фрагмента, получаемого на первой стадии, что повышает специфичность реакции. Таким образом, получаемый продукт в конечном счете будет являться продуктом полу-гнездовой или гнездовой реакции амплификации. Размер амплифицируемого на второй стадии фрагмента специально не ограничивается до тех пор, пока это обеспечивает эффективную гибридизацию фрагмента с иммобилизованными на биочипе зондами. В том случае, когда биочип представляет собой биочип на основе гидрогелевых элементов, праймеры для проведения второй стадии амплификации выбирают так, чтобы размер амплифицируемого фрагмента составлял 100-800 п.о. Большая длина ПЦР-продукта, получаемого на второй стадии, затрудняет эффективную диффузию анализируемого фрагмента генома в гелевых элементах биочипа при гибридизации, что в конечном итоге может привести к уменьшению количества образовавшихся гибридизационных дуплексов и, как следствие, падению флуоресцентного сигнала в ячейках. При подборе праймеров следует учитывать тот факт, что на выходе реакции получают преимущественно одноцепочечные флуоресцентно меченые продукты, которые должны быть комплементарны олигонуклеотидам, иммобилизованным на биочипе. Поэтому в каждой паре праймер, добавляемый в избытке («вeдyщий пpaймep»), выбирается из той цепи, последовательность которой комплементарна последовательностям иммобилизованных на биочипе олигонуклеотидов. Т.е. в случае, если олигонуклеотиды для иммобилизации выбраны из смысловой цепи, для формирования гибридизационных дуплексов в ячейках биочипа необходима преимущественная амплификация антисмысловой цепи, тем самым «вeдyщий пpaймep» выбирается из цепи, комплементарной последовательности гена (антисмысловая цепь), и наоборот.

Для получения преимущественно одноцепочечного флуоресцентно меченого продукта ведущий праймер добавляют в молярном избытке по отношению ко второму праймеру. Предпочтительно молярный избыток является по меньшей мере десятикратным .

При выборе дискриминирующих олигонуклеотидов для иммобилизации на биочипе с учетом размера и сложности анализируемой последовательности и, в частности, наличия повторов и протяженных гомополимерных последовательностей определяют длину дискриминирующих олигонуклеотидов, обеспечивающую их специфичность в отношении анализируемой последовательности.

Выбор дискриминирующих олигонуклеотидов для генотипов и подтипов осуществляют следующим образом. В сконструированном множественном выравнивании последовательностей области NS 5b для каждого генотипа создается консенсусная последовательность данного региона, на основании которой выбираются уникальные зонды, позволяющие однозначно идентифицировать каждый генотип. При этом в силу высокой вариабельности генома ВГС для повышения надежности способа по возможности выбирают несколько дискриминирующих зондов для каждого из генотипов, комплементарных различным участкам исследуемого фрагмента области NS 5b. Для каждого из подтипов также создают консенсусную последовательность, а затем выбирают участки фрагмента исследуемой области NS5b, позволяющие дифференцировать максимальное количество подтипов внутри одного генотипа. Количество таких участков должно быть достаточно для обеспечения надежной идентификации каждого из подтипов. На основании последовательностей выбранных участков конструируют зонды для идентификации подтипов, при этом последовательность одного зонда может соответствовать сразу двум и более подтипам в отдельном дифференцирующем участке исследуемого фрагмента области NS 5b. Стратегия выбора зондов для иммобилизации на биочипе схематично представлена на Фиг. 2.

Используя программное обеспечение, например Оligо v. 6.3 (Моlесulаr Вiоlоgу Iпsights Iпс, США), рассчитывают температуры плавления олигонуклеотидов и, варьируя их длину, добиваются того, чтобы разброс температур плавления олигонуклеотидов составлял не более 2-3°C. Избегают таких олигонуклеотидов, которые способны формировать вторичные структуры типа шпильки с высокими температурами плавления.

Дискриминирующие олигонуклеотиды иммобилизуют на подложке биочипа. В качестве подходящих подложек для изготовления биочипа могут использоваться активированная, например аминированная поверхность предметных стекол (Аdеssi С, Matton G., Ауаlа G., Тurсаtti G., Меrmоd J., Мауеr Р., Каwаshimа E. Sоlid рhаsе DNA аmрlifϊсаtiоп: сhаrасtеrisаtiоп оf рrimеr аttасhmепt апd аmрlifiсаtiоп mесhапisms Nuсlеiс Асids Rеsеаrсh. 2000. V. 51. 28(20). :E87), пластиковые носители (Nikifоrоv Т., Rendle R, Gоеlеt Р., Rоgеrs Y., Коtеwiсz M., Anderson S., Тrаiпог G., Knapp Michael R. Gепеtiс Вit Апаlуsis: а sоlid рhаsе mеthоd fоr tурiпg siпglе пuсlеоtidе роlуmогрhisms. Nuсlеiс Асids Rеsеаrсh. 1994. 22(20):4167-75), подложки с полимерными макропористыми носителями, такими как акриламид (Тimоfееv E., Косhеtkоvа S., Мiгzаbеkоv А., Flоrепtiеv V. Rеgiоsеlесtivе immоbilizаtiоп оf shоrt оligопuсlеоtidеs tо асгуliс сороlуmеr gеls. Nuсlеiс Асids Rеs. 1996 24(16):3142-8), сефароза (Маrguliеs M, Еghоlm M, Аltmап WE с соавт, Gепоmе sеquепсiпg iп miсгоfаbriсаtеd high-dепsitу рiсоlitrе rеасtогs. Nаturе. 2005 437(7057):376-80) и др. Способы иммобилизации олигонуклеотидов на подложках хорошо известны в данной области и включают:

- хемосорбцию олигонуклеотидов и ДНК, содержащих тиоловую группу, на металлах (Мirkiп C.A., Lеtsiпgег R.L., Мuсiс R.C. апd Stоrhоff JJ. А DNА-bаsеd mеthоd fоr rаtiопаllу аssеmbliпg папораrtiсlеs iпtо mасrоsсорiс mаtеriаls. Nаturе. 1996 Аug 15;382(6592):607-9); ковалентное связывание модифицированных олигонуклеотидов с функциональными группами поверхности, основанное на реакциях образования амидной (Неаlеу BG, Matson RS, WaIt DR. Fibеrорtiс DNA sепsоr аrrау сараblе оf dеtесtiпg роiпt mutаtiопs. Алаl Вiосhеm. 1997 251(2):270-9), сложноэфирной (Ghоsh SS, Мussо GF. Соvаlепt аttасhmепt оf оligопuсlеоtidеs tо sоlid suрроrts. Nuсlеiс Асids Rеs. 1987 15(13):5353-72), карбимидоильной (Маtsоп RS, Rаmраl J, Репtопеу SL, Anderson PD, Coassin P. Вiороlуmеr sупthеsis on роlурrоруlепе suррогts: оligопuсlеоtidе аrгауs. Апаl Вiосhеm. 1995 Jап 1;224(1): 110-6) связей и т.д. фотохимически, химически и электрохимически индуцируемую сополимеризацию олигонуклеотидов, несущих непредельную группу, с мономерами, составляющими основу формируемой твердой фазы (Vаsiliskоv А. V., Тimоfееv E.N., Surzhikоv S.A., Drоbуshеv A.L., Shiсk V.V. апd Мirzаbеkоv A.D., Fаbriсаtiоп оf miсгоаrrау оf gеl-immоbilizеd соmроuпds on а сhiр bу сороlуmеrizаtiоп. Вiоtесhлiquеs, 1999, 27, 592-606)

В предпочтительном воплощении настоящего изобретения используют биочип на основе гидрогелевых элементов. Способы получения таких биочипов включают полимеризацию амино-модифицированных олигонуклеотидов с образованием ковалентной связи с мономерами гидрогеля при соответствующих условиях (рН, температура, состав полимеризационной смеси и др.) (Rubiпа AY, Рап'kоv SV, Dеmепtiеvа EI еt аl. Нуdrоgеl drор miсrосhiрs with immоbilizеd DNA: ргореrtiеs апd mеthоds fог lаrgе-sсаlе рrоduсtiоп. Апаl Вiосhеm 2004; 325: 92-106). Наиболее предпочтительным является использование биочипов, содержащих гелевые элементы, которые наносятся на матрицу в виде капель диаметром от 80 до 300 мкм с периодом 150-500 мкм, без использования специальных приспособлений, например, кварцевых масок. В качестве матрицы может использоваться как стеклянная подложка (предметное или покровное стекло), так и более доступные материалы, такие как пластик. Для иммобилизации олигонуклеотидов в гелевых элементах биочипа используется их совместная полимеризация с основными компонентами геля. В результате этой одностадийной реакции иммобилизуемые молекулы необратимо, ковалентно присоединяются к тем или иным мономерам растущей полимерной цепи и равномерно распределяются во всем объеме геля с высоким выходом (порядка 50% для олигонуклеотидов) (Rubiпа AY, Рап'kоv SV, Dеmепtiеvа EI еt аl. Нуdrоgеl drор miсrосhiрs with immоbilizеd DNA: ргореrtiеs апd mеthоds fог lаrgе-sсаlе рrоduсtiоп. Апаl Вiосhеm 2004; 325: 92-106). Концентрация иммобилизованных олигонуклеотидных зондов может быть оценена прокрашиванием гелевых элементов биочипа красителем с низкой специфичностью к нуклеотидной последовательности ДНК (A. JI. Михейкин, А. В. Чудинов, А. И. Ярощук, А. Ю. Рубина, С. В. Паньков, А. С. Крылов, А. С. Заседателев, А.Д. Мирзабеков. Краситель с низкой специфичностью к нуклеотидной последовательности ДНК: применение для оценки количества олигонуклеотидов, иммобилизованных в ячейках биологических микрочипов. Молекулярная биология 2003; 37(6): 1061-70).

ПЦР-продукты, полученные на второй стадии амплификации, гибридизуют на биочипе с иммобилизованными дифференцирующими олигонуклеотидами, комплементарными участкам консенсусных последовательностей генотипов и подтипов фрагмента области NS 5b. Гибридизацию проводят в растворе, содержащем буферный компонент для поддержания рН, соль для создания ионной силы и хаотропный (дестабилизирующий водородные связи) агент, в герметичной гибридизационной камере при температуре, зависящей от температуры плавления иммобилизованных на микрочипе дискриминирующих олигонуклеотидов. В качестве дестабилизирующего водородные связи агента могут быть использованы, например, гуанидин тиоцианат, мочевина или формамид. Выбор оптимальной температуры гибридизации проводят с учетом удобства практического применения системы. Дискриминирующие олигонуклеотиды, заявленные в настоящем изобретении, имеют температуру плавления в интервале от 42 до 44⁰C, что позволяет проводить гибридизацию при 37°C с использованием хаотропного агента. Температура 37°C удобна тем, что большинство клинических лабораторий оснащены термостатами, поддерживающими эту температуру.

Изучаемый фрагмент ДНК образует совершенные гибридизационные дуплексы только с соответствующими (полностью комплементарными) олигонуклеотидами. Со всеми остальными олигонуклеотидами изучаемый фрагмент ДНК дает несовершенный дуплекс. Дискриминацию совершенных и несовершенных дуплексов выполняют путем сравнения интенсивностей флуоресценции ячеек, в которых образовались дуплексы. Интенсивность сигнала в ячейке, в которой образовался совершенный гибридизационный дуплекс (I_coв)₅ выше, чем в таковой, где образовался несовершенный дуплекс (I_Hecoв)- Проведение гибридизации при оптимальных условиях (температура, подобранная концентрация хаотропного агента и ионная сила гибридизационного буфера) позволяет добиться соотношения I_coв/I_нeCoв ≥ 1,5 между двумя ячейками, содержащими зонды, принадлежащие одной группе, и различающиеся на один нуклеотид. Регистрация результатов гибридизации на биочипах может быть осуществлена с помощью коммерческих сканирующих устройств - анализаторов флуоресценции биочипов, например GепеРiх 4000B (Ахоп Iпstгumепts, США), оснащенных соответствующим программным обеспечением для вычисления интенсивности флуоресцентных сигналов дискретных элементов биочипа и их последующей нормировки на фоновое значение, например 'GепеРiх Рrо', 'Асuitу' (Ахоп Iпstrumепts, США).

Интерпретация результатов гибридизации может быть осуществлена визуально соотнесением фиксированной флуоресцентной картины биочипа и/или полученного распределения интенсивностей сигналов элементов биочипа к расположению специфичных дискриминирующих зондов в элементах биочипа (см. Фиг. 3). Обладая распределением интенсивности сигналов в ячейках биочипа, выделяют максимальный сигнал среди элементов, содержащих генотип- специфичные олигонуклеотиды. Идентификация генотипа может быть осуществлена путем установления элемента биочипа, обладающего наибольшей интенсивностью флуоресценции, среди ячеек, содержащих зонды для определения генотипа ВГС. Идентификация подтипа исследуемого образца ВГС может быть осуществлена путем определения наибольших сигналов в ячейках, содержащих подтип-специфичные олигонуклеотиды, соответствующие установленному генотипу, в случае, если максимальные сигналы зарегистрированы по меньшей мере в двух различных ячейках, содержащих уникальные олигонуклеотиды, специфичные в отношении отдельного подтипа.

Предпочтительно интерпретацию результатов гибридизации на биочипах осуществляют следующим образом. На первом этапе проводят выделение достоверных сигналов, т.е. сигналов в ячейках, где возможно образование совершенных дуплексов. Для этого нормированные сигналы интенсивности флуоресценции всех ячеек биочипа сортируются по возрастанию и сравниваются с усредненным сигналом (I_ref) в ячейках, не содержащих олигонуклеотидов. Достоверными сигналами считают такие, которые превосходят I_гef, по меньшей мере, в 1,5 раза. Второй этап начинают с анализа отфильтрованных достоверных сигналов Gj в группах ячеек, содержащих олигонуклеотиды, специфичные к различным генотипам (i-номер генотипа). Выделяют максимальный сигнал внутри каждой группы ячеек G{_max и сравнивают между собой. Если сигнал Gi_max в одной группе превосходит максимальные сигналы в остальных группах более, чем в 1,5 раза (пороговое значение), то делается заключение о принадлежности исследуемого образца к данному генотипу. В случае, если отношение сигналов среди G;_max не превышает порогового значения, то делается заключение о невозможности однозначной идентификации генотипа и о возможном присутствии в анализируемом образце смеси двух и более вариантов ВГС с различными генотипами. В случае, если сигналы в группах, содержащих генотип-специфичные олигонуклеотиды, не проходят первичную фильтрацию относительно I_ref, то делается заключение о низкой интенсивности сигналов и возможном отсутствии РНК ВГС в исследуемом образце. При этом идентификация подтипа не проводится.

Таким образом, в случае, если определен генотип на основании значения сигнала Gi_max, то далее рассматриваются только группы ячеек, содержащих олигонуклеотиды, специфичные к подтипам, относящимся к идентифицированному генотипу. В соответствии с предложенной стратегий выбора зондов для идентификации подтипа, олигонуклеотиды объединены в группы, соответствующие выбранным участкам исследуемого фрагмента NS5b, позволяющим дифференцировать максимальное число подтипов. При этом количество групп варьирует от 1 до 4 в зависимости от степени гомологии консенсусных последовательностей фрагмента NS5b различных подтипов, и диктуется необходимостью надежной дифференциации подтипов внутри генотипа. При идентификации подтипа сначала выбирают сигналы внутри каждой группы ячеек, превосходящие остальные сигналы в этой группе, по меньшей мере, в 1,5 раза, такой сигнал обозначается как Sj_xj (при этом i- номер генотипа, 'х' - символьное обозначение подтипа, в соответствии с принятой классификации подтипов ВГС, j - номер группы). В случае, если в группе две и более ячейки имеют сигналы, различающиеся между собой менее, чем в 1,5 раза, то выбирают все такие сигналы

Sj_xj, Sjуj, и т.д. В результате получают набор ячеек из разных групп iхl, iуl, ix2, iz2, iхЗ и т.д., сигналы в которых превосходят остальные сигналы в своих группах не менее, чем в 1,5 раза. При этом, если в полученном наборе присутствуют по меньшей мере 2 ячейки из разных групп, соответствующие одному подтипу, например iхl и iхЗ или iхl и ixy2, то выдают заключение о принадлежности исследуемого образца к подтипу 'х' генотипа T. В случае, если в полученном наборе ячейки из разных групп соответствуют разным генотипам, например iхl, iy2, izЗ или iхl, iуzЗ, тогда интенсивности сигналов данных ячеек сравнивают между собой. Если сигнал ячейки, соответствующей подтипу V одной группы превосходит сигналы ячеек других групп в 3 и более раза, то делают заключение о принадлежности исследуемого образца к подтипу 'х'. В случае, если отношение сигналов Sj_xi/Siy2 не превышает трех, выдают заключение о том, что подтип не установлен и возможна принадлежность к подтипу 'х' или подтипу 'у'- Такое же заключение выдается в случае, если максимальный сигнал в группе имеет ячейка, содержащая олигонуклеотид, специфичный к двум подтипам, например iхуl, при отсутствии достоверных сигналов в других группах ячеек. В случае, если сигналы в группах, содержащих подтип-специфичные олигонуклеотиды, не проходят первичную фильтрацию относительно I_ref, то считают, что подтип исследуемого образца не определен.

Оценка длительности противовирусной терапии и прогноз течения заболевания могут быть сделаны на основании данных идентификации генотипа и подтипа. Так, в случае установления генотипа 1, приводящего к циррозу, хроническому гепатиту и гепатоцеллюлярной карциноме, длительность терапии пегилированным интерфероном и рибавирином должна составлять не менее 24 недель для подтипов Ia, Ic, Id, Ie, а в случае обнаружения подтипа Ib, устойчивого к интерферону - не менее 48 недель (Wесk К. Моlесulаг mеthоds оf hераtitis С gепоtурiпg. Ехреrt Rеv MoI Diаgп. 2005 Jul;5(4):507-20).

Инфекция, вызванная ВГС с генотипом 4, дает клиническую картину, схожую с заражением вирусом, имеющим генотип 1 (Lеgгапd-Аbrаvапеl F, Niсоt F, Воulеstiп А, Sапdrеs-Sаuпе К, Vinel JP, Аlriс L, Izореt J. Реgуlаtеd iпtеrfеrоп апd ribаviriп thеrару fог сhгопiс hераtitis С virus gепоtуре 4 iпfесtiоп. J Меd Virоl. 2005 Sep;77(l):66-9). При этом, в отличие от генотипа 1, для генотипа 4 характерно расщепление на значительно большее число подтипов (Niсоt F, Lеgrапd-Аbrаvапеl F, Sапdгеs-Sашiе К, Воulеstiп А, Dubоis M, Аlriс L, Vinel JP, Раsquiеr С, Izореt J. 2005. Неtеrоgепеitу оf hераtitis С virus gепоtуре 4 stгаiпs сirсulаtiпg iп sоuth-wеstеrп Frапсе.J Gеп Virоl Jaп;86(Pt 1): 107-14). Клиническая значимость ряда из них, например, 4а и 4d, уже установлена - 4d является устойчивым к интерферону и требует пролонгированного курса лечения (не менее 48 недель) (Rоulоt D, Воurсiег V, Grando V с соавт. Epidemiological characteristics and response to peginterferon рlus ribаviriп trеаtmепt оf hераtitis С virus gепоtуре 4 iпfесtiоп. J Virаl Нераt. 2007 Jul;14(7):460-7).

Подтипы генотипов 2 и 3 ВГС являются чувствительными к терапии лекарственными препаратами и значительно реже приводят к хронизации процесса. Длительность курса терапии рибавирином и интерфероном для больных, инфицированных ВГС с данными генотипами, составляет от 6 до 12 недель.

Помимо прогностических целей и оценки длительности терапии определение генотипа и подтипа дает информацию в плане этиологии инфекции. Субтипы Ia, За, 4а, 4d чаще ассоциируются с «шпpицeвым» гепатитом у лиц, употребляющих парэнтеральные наркотики, в то время как генотип 2 и субтип Ib связан с гемотрансфузионным путем передачи (Simmопds P, Вukh J, Соmbеt С с соавт. Сопsепsus рrороsаls fоr а uпifiеd sуstеm оf поmепсlаturе оf hераtitis С viгus gепоtуреs. Нераtоlоgу. 2005 Oct;42(4):962-73).

Наконец, результаты, полученные с помощью способа настоящего изобретения, могут быть использованы для эпидемиологического генотипирования. Распределение генотипов и подтипов ВГС варьирует в различных географических регионах (Zеiп NN. Сliпiсаl sigпifiсапсе оf hераtitis С virus gепоtуреs. CHn Мiсгоbiоl Rеv. 2000 13(2):223-35). Некоторые из подтипов являются универсальными, другие циркулируют лишь в пределах ограниченных географических зон. Подтип Ib превалирует на юге Европы, в Китае, Японии, России (50-80%). В США и странах Южной Америки, на севере Западной Европе чаще встречаются генотипы Ia и Ib, за ним следуют генотипы 2 и 3. Генотип 4 превалирует в Северной и Центральной Африке, в то время как на юге континента основным является генотип 5. Генотип 3 встречается почти всюду и является основным в Австралии и Юго-Восточной Азии. Генотип 6 также распространен в Юго-Восточной Азии и является основным типом во Вьетнаме, одним из основных в Таиланде, Индонезии.

Далее изобретение будет проиллюстрировано примерами, которые предназначены для обеспечения лучшего понимания сущности заявленного изобретения, но не должны рассматриваться как ограничивающие данное изобретение.

Примеры

Пример 1. Биочип для идентификации генотипа и подтипа ВГС на основе анализа области NS5b . 1. Олигонуклеотиды для иммобилизации на биочипе и праймеры для амплификации были синтезированы на автоматическом синтезаторе 394 DNА/RNА sупthеsizеr (Аррliеd Вiоsуstеms, США) и содержали спейсер со свободной аминогруппой З'-Аmiпо-Моdifiеr C7 CPG 500 (Glеп Rеsеаrсh, США) для последующей иммобилизации в гель. Изготовление биочипов производили по процедуре, описанной ранее (Rubiпа AY, Рап'kоv SV, Dеmепtiеvа EI еt аl. Нуdrоgеl drор miсгосhiрs with immоbilizеd DNA: ргорегtiеs апd mеthоds fог lаrgе-sсаlе рrоduсtiоп. Апаl Вiосhет 2004; 325: 92-106). Биочипы содержали полусферические ячейки диаметром 100 мкм и отстоящие друг от друга на расстояние 300 мкм. Равномерность нанесения ячеек и их диаметр оценивали с помощью программного обеспечения 'Тест-чип' (Биочип-ИМБ, Россия). Контроль качества микрочипов выполняли измерением концентраций иммобилизованных олигонуклеотидов. Биочипы окрашивали флуоресцентным красителем ImD-310 (Биочип-ИМБ), концентрацию иммобилизованных зондов оценивали, как было описано ранее (А. Л. Михейкин, А. В. Чудинов, А. И. Ярощук, А. Ю. Рубина, С. В. Паньков, А. С. Крылов, А. С. Заседателев, А.Д. Мирзабеков. Краситель с низкой специфичностью к нуклеотидной последовательности ДНК: применение для оценки количества олигонуклеотидов, иммобилизованных в ячейках биологических микрочипов. Молекулярная биология 2003; 37(6): 1061-70)

Структура биочипа

Биочип содержит ПО иммобилизованных олигонуклеотидов, список которых представлен в таблице 1, четыре маркерные точки (M) для правильного позиционирования (захвата изображения), выполняемого компьютерной программой, и 4 ячейки пустого геля (0), необходимые для вычисления референсного (фонового) значения интенсивности флуоресценции I_ref. Расположение иммобилизованных на микрочипе олигонуклеотидов показано на Фиг. 3.

В двух верхних строках иммобилизованы олигонуклеотиды с индексом 'G', позволяющие идентифицировать генотип ВГС. Биочип идентифицирует все шесть генотипов ВГС.

Ниже иммобилизованы олигонуклеотиды, позволяющие идентифицировать подтипы: - внутри генотипа 1: Ia, Ib, Ic, Id, Ie. Для надежной идентификации каждого из подтипов генотипа 1 сконструировано 4 группы олигонуклеотидов. Каждая группа соответствует отдельному участку внутри исследуемого фрагмента области NS 5b;

- внутри генотипа 2: 2а, 2b, 2с, 2d, 2i, 2j, 2k, 21, 2m. Для надежной идентификации каждого из подтипов генотипа 2 сконструировано 3 группы олигонуклеотидов. Каждая группа соответствует отдельному участку внутри исследуемого фрагмента области NS 5b;

- внутри генотипа 3: За, Зb, Зk. Для надежной идентификации каждого из подтипов генотипа 3 сконструировано 3 группы олигонуклеотидов. Каждая группа соответствует отдельному участку внутри исследуемого фрагмента области NS 5b;

- внутри генотипа 4: 4а, 4с, 4d, 4f, 4h, 4i, 4k, 4n, 4o, 4p, 4r, 4t. Для надежной идентификации каждого из подтипов генотипа 4 сконструировано 4 группы олигонуклеотидов. Каждая группа соответствует отдельному участку внутри исследуемого фрагмента области NS 5b;

- внутри генотипа 5: 5а. Генотип 5 представляет собой единственный подтип 5а, тем самым зонды, идентифицирующие генотип, выявляют и подтип 5а;

- внутри генотипа 6: 6а, 6b, 6d, 6g, 6h, 6k. Для надежной идентификации каждого из подтипов генотипа 6 сконструировано 2 группы олигонуклеотидов. Каждая группа соответствует отдельному участку внутри исследуемого фрагмента области NS 5b.

Таблица 1. Перечень последовательностей олигонуклеотидов, иммобилизованных на биочипе.

SEQ Олиго- Генотип Подтип Группа Последовательность 5'->3 !** Положение ID NO: нук- олигонуклеотида в леотид последовательности области NS5b (Асс.Nо

M62321)

1 Gl-I 1 Gl GCC TGT CGA GCY GC 904-917

2 Gl -2 1 Gl GCC TGT CGA GCY GCR 904-918

3 Gl -3 1 Gl GCC TGT MGA GCY GCR 904-918

4 Gl -4 1 Gl GGC TTT AYR TCG GGG G 776-791

5 G2-1 2 G2 TAC AGG CGY TGY CGC 826-840

6 G2-2 2 G2 CTG CGG NTA CAG GCG TTG 819-836

7 G2-3 2 G2 CTG CGG NTA CAG GCG YTG 819-836

8 GЗ-1 3 GЗ YCT TGT CTG CGG AGA Y 939-954

9 GЗ-2 3 GЗ GGC TTT ACT GCG GGG G 776-791

10 G4-1 4 G4 CGA GGA RGA GGT СТА YCA GTG 705-725

11 G4-2 4 G4 CGA GGA RGA GGT MTA YCA GTG 705-725

12 G4-3 4 G4 GTG ACC TRG AGC CCG А 728-743

13 G5-1 5 G5 GTG ACT TRC AGC CCG А 728-743

14 G5-2 5 G5 GCA CGC TCC TGG TGT G 932-947

15 G6 6 - G6 TGA CAT GTT GGT CTG CG 933-949

16 lall 1 Ia 1 CAC TGA GAG CGA CAT CC 684-700

17 lcel 1 lс/lе 1 CAC TGA GGC TGA TAT CCG 684-701

18 Ial2 1 Ia 1 YAT CCG TAC GGA GGA GG 696-712

19 Ibdl2 1 lb/ld 1 YAT CCG TGT TGA GGA GTC 696-713

20 Ia2 1 Ia 2 CAT CAA GTC CCT CAC YGA 756-773

21 1Ь2 1 Ib 2 ATA ARG TCG CTC АСА GAG 757-774

22 Ic2 1 Ic 2 CCA TAA GGT CTC TCA CAG А 755-773

23 Id2 1 Id 2 ATA AAG TCG CTC ACC G 757-772

24 Ie2 1 Ie 3 АТС AAG TCY TTG ACT GAA AG 758-776

25 lаЗl 1 Ia 3 AGG CCC GRG CAG С 893-905

26 Ia32 1 Ia 3 AGG CCC ARG CAG С 893-905

27 lbЗ 1 Ib 3 GCC WCT GCR GCC TGT 895-909

28 lbdЗ 1 lb/ld 3 CCW CTG CGG CCT GT 896-909

29 lсЗ 1 Ic 3 GCC AGT GCA GCC TGT 895-909

30 lеЗ 1 Ie 3 CAA GGC CCT AGC AGC 891-905

31 ldЗ 1 Id 3 GCC ATR GCR GCC TG 895-908

32 Ia4 1 Ia 4 СТА YCG CAG GTG CCG 825-839

33 1Ь4 1 Ib 4 GTT АТС GCC GGT GC 824-837

34 Ic4 1 Ic 4 GCT АТС GGC GAT GC 824-837

35 Id4 1 Id 4 GCT ACC GTC GGT GC 824-837

36 Ie4 1 Ie 4 TAT CGC AGA TGC CGT 826-840

37 2adl 2 2a/2d 1 CAG AAH TGA GGA GTC CAT А 699-717

38 2Ы 1 2 2b 1 ACG GAG AGG GAC ATA AG 685-701

39 2Ы2 2 2b 1 CAT AAG AAC AGA AGA АТС CA 696-715

40 2il 2 2i 1 TCA CYG AAA GRG АСА TCA G 683-701

41 2cjl 2 2c/2j 1 YAG AAC CGA GGA GTC С 699-714

42 2kl 2 2k 1 ACG GAG AGR GAT АТС AGG 685-702

43 211 2 21 1 ATA CGG АСА GAA GAA TCC 697-714

44 2ml 2 2т 1 GGG АСА TYC GAR TCG А 692-707

OO

45 2a2 2 2а 2 TAC ACT CGC TGA CTG AGA 758-775

46 2Ь2 2 2b 2 TAC ACT CGC TCA CTG AGA 758-775

47 2c2 2 2с 2 ATA CAC TCA CTG ACT GAG AG 757-776

48 2d2 2 2d 2 CTC ACT GAC TGA GAG GCT 762-779

49 2kc2 2 2k/2c 2 АСА CTC ACT NAC TGA GAG ACT 759-779

50 2i2 2 2i 2 TAC ACT CAC TRA CTG AGA GG 758-777

- 51 2j2 2 2j 2 CAT АСА TTC ACT CAC TGA GA 756-775

52 212 2 21 2 ATY AAA TCA CTG АСА GAG AG 757-776

53 2m2 2 2т 2 ATA CAC TCA YTG ACC GAG А 757-775

54 2a31 2 2а 3 AAA GCY СТА GCG GC 891-905

55 2a32 2 2а 3 CYC TAG CGG CTT GYA 896-910

56 2Ь31 2 2b 3 AAA GCC CTT GCR GC 892-905

57 2Ь32 2 2b 3 AAG CCC TCG CRG С 892-905

58 2cЗ 2 2с 3 AAG CCA GRG CGG С 893-905

59 2dЗ 2 2d 3 СNR RRG САG ССТ G 896-908

60 2iЗ 2 2i 3 GCY CAA GCG GCC T 895-907

61 2kЗ 2 2k 3 AGG CCC TGG CGG 893-904

62 2mЗ 2 2т 3 AAG CCC AAG CAG CC 893-916

63 Заl 3 За 1 АСА TCA GGG TGG AAG AG 695-711

64 Зbl 3 Зb 1 CAT CAG GAC GGA GGA G 696-711 го

VD

65 ЗаЗ 3 За 3 AAG GCC ACR GCG G 892-904

66 ЗbЗ 3 Зb 3 AAG GCC ACT GCV GC 894-905

67 ЗкЗ 3 Зк 3 AAG CAA AGG CAG CC 893-906

68 Зa2 3 За 2 АТС TCC TCC CTC ACG G 757-772

69 ЗЬ2 3 Зb 2 АТС AGC GCT CTC ACR G 757-772

70 Зk2 3 Зк 2 TGA TAA CTT CAC TCA CGG 755-772

71 4acl 4 4a/4c 1 AAC CGA AAA GGA CAT CA 684-700

72 4dfl 4 4d/4f 1 TRA CYG AAA GAG АСА TCA 683-700

73 4hkl 4 4bУ4k 1 TGA CTG AAA GGG АСА TCA 683-700

74 4il 4 4i 1 CGT GAC GGA GAG AGA CA 681-697

75 4nl 4 4n 1 ACT GTG ACT GAG AAA GAC А 679-697

76 4pl 4 4p 1 CCG TGA CTG AGA AGG AC 680-697

77 4гl 4 4r 1 GTC ACC GAA ARR GAC AT 682-692

78 4a21 4 4а 2 GTT ATT GCY GCC CTC А 754-769

79 4dp2 4 4d/4p 2 GGT GAT АТС CGC CCT 753-767

80 4a22 4 4а 2 GCA AAG TCA TCA CCG CC 749-765

81 4c2 4 4с 2 ACY GCC СТА АСА GAG AG 760-776

82 4f2 4 4f 2 AGG TRA TAT CCG CCC T 752-767

83 4i2 4 4i 2 AGG TCA TCA AMG CCC 752-766

84 4k2 4 4k 2 ARA CCR ATA TCC GCC CT 751-767 OJ о

85 4n2 4 4n 2 GYY ATA ACC GCC CTC А 754-769

86 4o2 4 4o 2 CGC CCT TAC RGA GAG 762-776

87 4r2 4 4r 2 AAG GCC ATA ACC GC 751-764

88 4t2 4 4t 2 GGT RAT AYC AGC CCT CA 753-769

89 4aЗ 4 4а 3 CAA AGC CAC AGC CGC 891-905

90 4cЗ 4 4с 3 AAA GCC TMA GCC GC 892-905

91 4dЗ 4 4d 3 TAA GGC CAG CGC AGC 891-905

92 4Б 4 4f 3 YAA GGC YAC MGC GGC 891-905

93 4hЗ 4 4h 3 ARG CCA CRG CAR CCA 893-907

94 4kЗ 4 4k 3 TTA AGG CYG YCG CAG 890-904

95 4onЗ 4 4o/4n 3 AAG ACC ACR GCC GCC 892-907

96 4iЗ 4 4i 3 CCT CAA RGC CAC AGC 891-906

97 4pЗ 4 4p 3 YAA GGC AAC AGC AGC 891-906

98 4гЗ 4 4r 3 AAA ACC ACG GCR GCC А 892-907

99 4a4 4 4а 4 TGT GGG TAT CGG AGA TG 820-836

100 4c4 4 4с 4 CGG GTA TCG CAG ATG 822-836

101 4d4 4 4d 4 CGG RAC TCG ACG GTG 822-836

102 4f4 4 4f 4 YGG GTA CCG TAG ATG С 822-837

103 4h4 4 4h 4 CGG GHT TCG GAG GT 822-835

104 4i4 4 4i 4 GTG GCA TCC GTA GAT G 821-836

U)

105 4k4 4 4k 4 GCG GGT АТС GVA GGT G 821-836

106 4o4 4 4o 4 GCC AGC GGA GAT GC 824-837

107 4pt4 4 4p/4t 4 CGG TGT BCG YAG GTG С 822-837

108 4r4 4 4r 4 CGG TTA TCG GAG ATG С 822-837

109 5а 5 5а 1 GYR ATA CGG TCA CTC AC 754-770

ПО баl 6 6а 1 CGG ACT GAG AAC GAC AT 700-716

111 бbl 6 6b 1 CGA ACT GAA GAG GAC АТС 700-717

112 бdl 6 6d 1 CGG ACT GAG GAG GAC AT 700-716

113 бgl 6 6g 1 CGG АСА GAG GAG TCY AT 700-716

114 бhl 6 6h 1 CGC АСА GAA CAA GAC AT 700-716

115 бкl 6 6k 1 ACT GAG CGG GAT GTC T 703-718

116 6aЗ 6 6а 3 GCA CAG GCC GCC T 895-907

117 6bЗ 6 6b 3 GCA CAG GCG GCG T 895-906

118 6dЗ 6 6d 3 AGG CGC AAG CAG С 893-905

119 6gЗ 6 6g 3 AGG CCA YGG CGG 893-904

120 бhЗ 6 6h 3 GCA ACC GCC GCT 895-906

• * Названия олигонуклеотидов приведены в соответствии с их положением на Фиг.3.

• ** Расшифровка однобуквенных обозначений нуклеотидов в последовательностях вырожденных олигонуклеотидов:

R-A₅G

Y-C₅T

M - А, С w

K-G₅T

S-C₅G

W-A₅T

H - A₅ C₅ T

В - C₅ G₅ T

V - A₅ C₅ G

D - A₅ G₅ T

N - А, С, G, T

Пример 2. Обратная транскрипция, совмещенная с амплификацией (OT- IЩР) фрагмента области NS5b; получение одноцепочечных флуоресцентно меченых фрагментов методом асимметричной ПЦР.

На первой стадии проводили обратную транскрипцию, совмещенную с амплификацией (ОТ-ПЦР) фрагмента области NS 5b длиной 418 п. о.

В 40 мкл смеси для ОТ-ПЦР вносили 10 мкл выделенного препарата РНК (конечный объем 50 мкл).

Состав ПЦР-смеси:

• IX ОТ-ПЦР-буфер: 70 мМ Трис-НСl, рН 8,3, 16,6 мМ (NH₄)₂SO₄, 7,5 мМ MgCl₂;

• 200 мкМ каждого dАТР, dСТР, dGТР, dUТР (Силекс, Россия);

• Смесь праймеров (последовательности представлены в Таблице 2) PrЗ_f/ Pr2_r в концентрации 200 нМ каждый;

• 10 ед. термостабильной SТ-полимеразы (Силекс, Россия);

• 1 ед. урацил-ДНК-гликозилазы (Силекс, Россия);

• 10 ед. ингибитора РНКазы (Fеrmепtаs, Литва).

Амплификацию проводили на термоциклере PTC-200 Dуаd (MJ Rеsеаrсh, США) со следующим режимом: обратная транскрипция при 50°C - 30 минут, затем 50 циклов ПЦР: 95°C - 30 с, 63°C - 30 с, 72⁰C - 30 с; финальная элонгация при 72°C - 10 минут.

1 мкл реакционной смеси, полученной после первой стадии ПЦР, использовали в качестве матрицы при проведении второй стадии.

Вторую стадию ПЦР проводили в полугнездовом варианте, с праймерами PЗ_f7Pr5_r, фланкирующими район области NS5b длиной 382 п. о. Последовательности праймеров приведены в таблице 2.

Состав ПЦР-смеси (25 мкл):

• IX ПЦР-буфер: 10 мМ KCl, 10 мМ Трис-НСl (рН 8,3) (Силекс, Россия);

• 1,5 MM MgCl₂;

• 200 мкМ каждого dNТР (Силекс, Россия);

• 10 мкМ флуоресцентно меченого dUТР («Биoчип-ИMБ», Россия);

• Смесь праймеров PЗ_f7Pr5_r в концентрации 20 нм/100 нМ, соответственно;

• 10 ед. термостабильной Таq ДНК-полимеразы (Силекс, Россия). Амплификацию проводили на термоциклере PTC-200 Dуаd (MJ Rеsеаrсh, США) со следующим режимом: 95⁰C - 2 мин, затем 36 циклов: 95°C - 20 с, 60⁰C - 20 с, 72°C - 30 с, заключительная элонгация 72⁰C - 5 минут. 12 мкл полученного продукта использовались в гибридизации на биочипе.

Таблица 2. Перечень последовательностей праймеров, используемых в двухстадийной ПЦР для амплификации фрагмента области NS5b.

SEQ НазваПоследовательность 5'->3'* Положение

ID ние праймера в

NO: последовательности фрагмента NS5b

(Асс.Nо M62321)

121 PrЗ_f ТАТGАYАСССGСТGYТТТGАСТС 655-677

122 Pr2_г GGСGGААТТССТGGТСАТАGССТССG 1015-1044 TGAA

123 Pr5_r GСТАGТСАТАGССТССGТ 1018-1035

• *oднoбyквeннoe обозначение нуклеотида в последовательности вырожденного праймера: Y = C₅ T

Пример 3. Гибридизация амплифицированного меченого продукта на биочипе.

К 12 мкл реакционной смеси, полученной после второй стадии ПЦР и содержавшей преимущественно одноцепочечные флуоресцентно меченые фрагменты ДНК, соответствующие исследуемому фрагменту области NS5b, добавляли концентрированный раствор гибридизационного буфера так, чтобы конечная концентрация гуанидина тиоцианата составляла 1 M, HEPES - 50 мМ, рН 7,5, ЭДТА - 5 мМ. Полученную смесь (32 мкл) помещали в гибридизационную камеру биочипа. Гибридизацию проводили при 37°C в течение 12-18 часов. По окончании гибридизации биочип трижды промывали дистиллированной водой при 37⁰C в течение 30 секунд и высушивали. Пример 4. Регистрация и интерпретация результатов гибридизации

Регистрация флуоресцентного изображения биочипа выполнялась на универсальном аппаратно-программном комплексе (У АПК) (ИМБ РАН, Россия) для анализа биочипов с использованием специализированного программного обеспечения 'ImаgеWаrе®' (Биочип-ИМБ, Россия).

Интерпретацию результатов проводили согласно приведенному выше алгоритму, реализованному в модуле программного обеспечения для анализа флуоресцентных изображений биочипов 'Ьпаgеwаrе®'.

Пример 5. Анализ области NS5b генома вируса гепатита С, имеющего подтип Ia, способом гибридизации на биочипе.

Образец крови, полученный от пациента, был подвергнут обработке набором для выделения вирусной РНК Qiаmр virаl RNA (Qiаgеп, Германия) согласно протоколу фирмы-производителя. Выделенный препарат РНК был использован в OT- ПЦР, как описано в примере 2. По окончании ОТ-ПЦР наличие амплифицированного фрагмента NS5b заданной длины (418 п.о.) было протестировано электрофорезом в агарозном геле, после чего продукт ОТ-ПЦР был разделен на 2 части, одна из которых была обработана и проанализирована в соответствии с методикой, описанной в Примерах 2-4 (вторая стадия ПЦР с последующей гибридизацией на биочипе, отмывкой, регистрацией и интерпретацией флуоресцентной картины биочипа). Вторую часть продукта первой стадии после дополнительной очистки использовали в реакции секвенирования с последующим разделением на автоматическом секвенаторе, получением и коррекцией хроматограммы, анализом обработанной последовательности фрагмента NS5b, конструированием множественного выравнивания и филогенетического дерева, на основании которых осуществляли установление генотипа и подтипа.

На фиг. 4A представлена гибридизационная картина биочипа. Фиг. 4Б демонстрирует распределение нормированных гибридизационных сигналов ячеек биочипа.

В соответствии с предложенным алгоритмом интерпретации результатов анализ начинается с вычисления усредненного сигнала (I_гef) в ячейках, не содержащих олигонуклеотидов. В данном случае значение I_ref составило 0,62. В соответствии с этой величиной и пороговым значением, равным 1,5, осуществляют фильтрацию сигналов в генотип и подтип-специфических ячейках. В результате было получено, что сигналы в ячейках группы Gl, содержащих зонды, специфичные в отношении генотипа 1, превосходят I_ref в 1,5 и более раза. Аналогичная ситуация с сигналом в ячейке G4-2 (1,37). Сигналы в других группах ячеек, содержащих генотип-специфичные зонды, были близки к фоновым. Далее, выбирается максимальный сигнал из группы Gl, Gl-2 (5,7). Сигнал в данной ячейке превосходит сигнал G4-1 более, чем в 1,5 раза. Следовательно, последовательность РНК анализируемого образца относится к генотипу 1.

Анализ в группах ячеек, содержащих зонды, специфичные для подтипов генотипа 1, выявляет следующее: В группе 1 максимальные (т.е. превосходящие пороговое значение 1,5 по отношению к другим ячейкам) сигналы имеют lаl l (17,0) и Ial2 (17,0). В группе 2 - Ia2 (16,4). В группе 3 - Ia32 (3,4). В группе 4 - Ia4 (3,1). Таким образом, во всех группах максимальный сигнал имеют ячейки, содержащие зонды, специфичные в отношении подтипа Ia. Следовательно, анализируемый образец относится к подтипу Ia.

Методом секвенирования с последующим филогенетическим анализом было показано, что исследуемая последовательность попадает в кластер последовательностей подтипа Ia.

Таким образом, установлено, что анализируемый образец РНК ВГС имеет генотип 1 и подтип Ia, что полностью совпадает с результатами секвенирования.

Пример 6. Анализ области NS5b генома вируса гепатита С, имеющего подтип Ib, способом гибридизации на биочипе.

Образец крови, полученный от пациента, был подвергнут обработке набором для выделения вирусной РНК Qiаmр virаl RNA (Qiаgеп, Германия) согласно протоколу фирмы-производителя. Выделенный препарат РНК был использован в OT- ПЦР, как описано в примере 2. По окончании ОТ-ПЦР наличие амплифицированного фрагмента NS5b заданной длины (418 п.о.) было протестировано электрофорезом в агарозном геле, после чего продукт ОТ-ПЦР был разделен на 2 части, одна из которых была обработана и проанализирована в соответствии с методикой, описанной в Примерах 2-4 (вторая стадия ПЦР с последующей гибридизацией на биочипе, отмывкой, регистрацией и интерпретацией флуоресцентной картины биочипа). Вторую часть продукта первой стадиипосле дополнительной очисткииспользовали в реакции секвенирования с последующим разделением на автоматическом секвенаторе, получением и коррекцией хроматограммы, анализом обработанной последовательности фрагмента NS5b, конструированием множественного выравнивания и филогенетического дерева, на основании которых осуществляли установление генотипа и подтипа.

На фиг. 5A представлена гибридизационная картина биочипа. Фиг. 5Б демонстрирует распределение нормированных гибридизационных сигналов ячеек биочипа.

В соответствии с предложенным алгоритмом интерпретации результатов анализ начинается с вычисления усредненного сигнала (I_ref) в ячейках, не содержащих олигонуклеотидов. В данном случае значение I_ref составило 0,67. В соответствии с этой величиной и пороговым значением, равным 1,5, осуществляют фильтрацию сигналов в генотип- и подтип-специфических ячейках. В результате было получено, что сигналы в ячейках группы Gl, содержащих зонды, специфичные в отношении генотипа 1, превосходят I_гef в 1,5 и более раза (максимальный сигнал имеет ячейка Gl -3 (5,69)). Сигналы в других группах ячеек, содержащих генотип- специфичные зонды, были близки к фоновым. Следовательно, последовательность РНК анализируемого образца относится к генотипу 1.

Анализ в группах ячеек, содержащих зонды, специфичные для подтипов генотипа 1, выявляет следующее: В группе 1 максимальный (т.е. превосходящий пороговое значение 1,5 по отношению к другим ячейкам) сигнал имеет lbdl (18,0). В группе 2 - 1Ь2 (16,3). В группе 4 - 1Ь4 (3,9). В группе 1 совершенный дуплекс с исследуемой ДНК формирует также олигонуклеотид, последовательность которого является универсальной для подтипов Ib и Id. Однако, максимальный сигнал зарегистрирован также в ячейках, содержащих зонды, специфичные только для подтипа Ib - 1Ь2 и 1Ь4. Следовательно, анализируемый образец относится к подтипу Ib.

Методом секвенирования с последующим филогенетическим анализом было показано, что исследуемая последовательность попадает в кластер последовательностей подтипа Ib.

Таким образом, установлено, что анализируемый образец РНК ВГС имеет генотип 1 и подтип Ib, что полностью совпадает с результатами секвенирования.

Пример 7. Анализ области NS5b генома вируса гепатита С, имеющего подтип Ie, способом гибридизации на биочипе. Образец крови, полученный от пациента, был подвергнут обработке набором для выделения вирусной РНК Qiаmр virаl RNA (Qiаgеп, Германия) согласно протоколу фирмы-производителя. Выделенный препарат РНК был использован в OT- ПЦР, как описано в примере 2. По окончании ОТ-ПЦР наличие амплифицированного фрагмента NS5b заданной длины (418 п. о.) было протестировано электрофорезом в агарозном геле, после чего продукт ОТ-ПЦР был разделен на 2 части, одна из которых была обработана и проанализирована в соответствии с методикой, описанной в Примерах 2-4 (вторая стадия ПЦР с последующей гибридизацией на биочипе, отмывкой, регистрацией и интерпретацией флуоресцентной картины биочипа). Вторую часть продукта первой стадии, после дополнительной очистки, использовали в реакции секвенирования с последующим разделением на автоматическом секвенаторе, получением и коррекцией хроматограммы, анализом обработанной последовательности фрагмента NS5b, конструированием множественного выравнивания и филогенетического дерева, на основании которых осуществляли установление генотипа и подтипа.

На фиг. 6A представлена гибридизационная картина биочипа. Фиг. 6Б демонстрирует распределение нормированных гибридизационных сигналов ячеек биочипа.

В соответствии с предложенным алгоритмом интерпретации результатов анализ начинается с вычисления усредненного сигнала (I_гef) в ячейках, не содержащих олигонуклеотидов. В данном случае значение I_ref составило 0,39. В соответствии с этой величиной и пороговым значением, равным 1,5, осуществляют фильтрацию сигналов в генотип- и подтип-специфических ячейках. В результате было получено, что сигналы в ячейках группы Gl, содержащих зонды, специфичные в отношении генотипа 1, превосходят I_гef в 1,5 и более раза. Сигналы в других группах ячеек, содержащих генотип-специфичные зонды, близки к фоновым. Максимальный сигнал в группе Gl имеет ячейка Gl -3 (4,82). Следовательно, последовательность РНК анализируемого образца относится к генотипу 1.

Анализ в группах ячеек, содержащих зонды, специфичные для подтипов генотипа 1, выявляет следующее: В группе 1 максимальный (т.е. превосходящий пороговое значение 1,5 по отношению к другим ячейкам) сигнал имеет lcel(18,0). В группе 2 - Ie2 (8,46). В группе 3 - lеЗ (3,52). В группе 4 - Ie4 (2,18). В группе 1 совершенные дуплексы с исследуемой ДНК формирует олигонуклеотид, последовательность которого является универсальной для подтипов Ic и Ie. Однако, максимальный сигнал зарегистрирован также в ячейках, содержащих зонды, специфичные только для подтипа Ie - Ie2, lеЗ и Ie4. Следовательно, анализируемый образец относится к подтипу Ie.

Методом секвенирования с последующим филогенетическим анализом было показано, что исследуемая последовательность попадает в кластер последовательностей подтипа Ie.

Таким образом, установлено, что анализируемый образец РНК ВГС имеет генотип 1 и подтип Ie, что полностью совпадает с результатами секвенирования.

Пример 8. Анализ области NS5b генома вируса гепатита С, имеющего подтип 2а, способом гибридизации на биочипе.

Образец крови, полученный от пациента, был подвергнут обработке набором для выделения вирусной РНК Qiаmр viгаl RNA (Qiаgеп, Германия) согласно протоколу фирмы-производителя. Выделенный препарат РНК был использован в OT- ПЦР, как описано в примере 2. По окончании ОТ-ПЦР наличие амплифицированного фрагмента NS5b заданной длины (418 п.о.) было протестировано электрофорезом в агарозном геле, после чего продукт ОТ-ПЦР был разделен на 2 части, одна из которых была обработана и проанализирована в соответствии с методикой, описанной в Примерах 2-4 (вторая стадия ПНР с последующей гибридизацией на биочипе, отмывкой, регистрацией и интерпретацией флуоресцентной картины биочипа). Вторую часть продукта первой стадии, после дополнительной очистки, использовали в реакции секвенирования с последующим разделением на автоматическом секвенаторе, получением и коррекцией хроматограммы, анализом обработанной последовательности фрагмента NS 5b, конструированием множественного выравнивания и филогенетического дерева, на основании которых осуществляли установление генотипа и подтипа.

На фиг. 7A представлена гибридизационная картина биочипа. Фиг. 7Б демонстрирует распределение нормированных гибридизационных сигналов ячеек биочипа.

В соответствии с предложенным алгоритмом интерпретации результатов анализ начинается с вычисления усредненного сигнала (I_ref) в ячейках, не содержащих олигонуклеотидов. В данном случае значение I_ref составило 0,25. В соответствии с этой величиной и пороговым значением, равным 1,5, осуществляют фильтрацию сигналов в генотип и подтип-специфических ячейках. В результате было получено, что сигналы в ячейках группы G2, содержащих зонды, специфичные в отношении генотипа 2, превосходят I_ref в 1,5 и более раза. Сигнал в ячейке G6 (2,01) также является достоверным относительно I_ref. Максимальный сигнал в группе G2 имеет ячейка G2-2 (15,6), превосходящая сигнал в ячейке G6 более, чем в 1,5 раза. Следовательно, последовательность РНК анализируемого образца относится к генотипу 2.

Анализ в группах ячеек, содержащих зонды, специфичные для подтипов генотипа 2, выявляет следующее: В группе 1 максимальный (т.е. превосходящий пороговое значение 1,5 по отношению к другим ячейкам) сигнал имеет 2adl (15,2). В группе 2 - 2a2 (6,62). В группе 3 - 2a31 (2,33). Во всех трех группах максимальный сигнал имеют ячейки, содержащие зонды, специфичные в отношении подтипа 2а. Следовательно, анализируемый образец относится к подтипу 2а.

Методом секвенирования с последующим филогенетическим анализом было показано, что исследуемая последовательность попадает в кластер последовательностей подтипа 2а.

Таким образом, установлено, что анализируемый образец РНК ВГС имеет генотип 2 и подтип 2а, что полностью совпадает с результатами секвенирования.

Пример 9. Анализ области NS5b генома вируса гепатита С, имеющего подтип 2i, способом гибридизации на биочипе.

Образец крови, полученный от пациента, был подвергнут обработке набором для выделения вирусной РНК Qiаmр virаl RNA (Qiаgеп, Германия) согласно протоколу фирмы-производителя. Выделенный препарат РНК был использован в OT- ПЦР, как описано в примере 2. По окончании ОТ-ПЦР наличие амплифицированного фрагмента NS5b заданной длины (418 п.о.) было протестировано электрофорезом в агарозном геле, после чего продукт ОТ-ПЦР был разделен на 2 части, одна из которых была обработана и проанализирована в соответствии с методикой, описанной в Примерах 2-4 (вторая стадия ПЦР с последующей гибридизацией на биочипе, отмывкой, регистрацией и интерпретацией флуоресцентной картины биочипа). Вторую часть продукта первой стадии после дополнительной очистки использовали в реакции секвенирования с последующим разделением на автоматическом секвенаторе, получением и коррекцией хроматограммы, анализом обработанной последовательности фрагмента NS5b, конструированием множественного выравнивания и филогенетического дерева, на основании которых осуществляли установление генотипа и подтипа.

На фиг. 8A представлена гибридизационная картина биочипа. Фиг. 8Б демонстрирует распределение нормированных гибридизационных сигналов ячеек биочипа.

В соответствии с предложенным алгоритмом интерпретации результатов анализ начинается с вычисления усредненного сигнала (I_ref) в ячейках, не содержащих олигонуклеотидов. В данном случае значение I_гef составило 0,44. В соответствии с этой величиной и пороговым значением, равным 1,5, осуществляют фильтрацию сигналов в генотип- и подтип-специфических ячейках. В результате было получено, что только сигналы в ячейках группы G2, содержащих зонды, специфичные в отношении генотипа 2, превосходят I_ref в 1,5 и более раза.

Максимальный сигнал в группе G2 имеет ячейка G2-3 (15,9). Следовательно, последовательность РНК анализируемого образца относится к генотипу 2.

Анализ в группах ячеек, содержащих зонды, специфичные для подтипов генотипа 2, выявляет следующее: В группе 1 максимальный (т.е. превосходящий пороговое значение 1,5 по отношению к другим ячейкам) сигнал имеет 2il (2,3). В группе 2 -2kc2 (10,9). В группе 3 - 2iЗ (4,31). В группе 2 совершенные дуплексы с исследуемой ДНК формирует олигонуклеотид, последовательность которого является универсальной для подтипов 2с и 2k. Однако, в двух других группах максимальный сигнал принадлежит ячейкам, содержащим уникальные олигонуклеотиды, специфичные в отношении подтипа 2i. В соответствии с заявленным алгоритмом интерпретации анализируемый образец относится к подтипу 2i.

Методом секвенирования с последующим филогенетическим анализом было показано, что исследуемая последовательность попадает в кластер последовательностей подтипа 2i.

Таким образом, установлено, что анализируемый образец РНК ВГС имеет генотип 2 и подтип 2i, что полностью совпадает с результатами секвенирования.

Пример 10. Анализ области NS5b генома вируса гепатита С, имеющего подтип За, способом гибридизации на биочипе. Образец крови, полученный от пациента, был подвергнут обработке набором для выделения вирусной РНК Qiаmр virаl RNA (Qiаgеп, Германия) согласно протоколу фирмы-производителя. Выделенный препарат РНК был использован в OT- ПЦР, как описано в примере 2. По окончании ОТ-ПЦР наличие амплифицированного фрагмента NS5b заданной длины (418 п.о.) было протестировано электрофорезом в агарозном геле, после чего продукт ОТ-ПЦР был разделен на 2 части, одна из которых была обработана и проанализирована в соответствии с методикой, описанной в Примерах 2-4 (вторая стадия ПЦР с последующей гибридизацией на биочипе, отмывкой, регистрацией и интерпретацией флуоресцентной картины биочипа). Вторую часть продукта первой стадии после дополнительной очистки использовали в реакции секвенирования с последующим разделением на автоматическом секвенаторе, получением и коррекцией хроматограммы, анализом обработанной последовательности фрагмента NS5b, конструированием множественного выравнивания и филогенетического дерева, на основании которых осуществляли установление генотипа и подтипа.

На фиг. 9A представлена гибридизационная картина биочипа. Фиг. 9Б демонстрирует распределение нормированных гибридизационных сигналов ячеек биочипа.

В соответствии с предложенным алгоритмом интерпретации результатов анализ начинается с вычисления усредненного сигнала (I_ref) в ячейках, не содержащих олигонуклеотидов. В данном случае значение I_гef составило 0,52. В соответствии с этой величиной и пороговым значением, равным 1,5, осуществляют фильтрацию сигналов в генотип- и подтип-специфических ячейках. В результате было получено, что сигналы в ячейках группы GЗ, содержащих зонды, специфичные в отношении генотипа 3, превосходят I_ref в 1,5 и более раза. Сигнал в ячейке G4-2

(0,85) также превосходит I_ref в 1,5 раза. Сигналы в других группах ячеек, содержащих генотип-специфичные зонды, близки к фоновым. Максимальный сигнал в группе GЗ имеет ячейка GЗ-1 (15,4), сигнал в которой превосходит сигнал в G4-2 более, чем в 1,5 раза. Следовательно, последовательность РНК анализируемого образца относится к генотипу 3.

Анализ в группах ячеек, содержащих зонды, специфичные для подтипов генотипа 3, выявляет следующее: В группе 1 максимальный (т.е. превосходящий пороговое значение 1,5 по отношению к другим ячейкам) сигнал имеет ячейка Заl (16,2). В группе 2 - Зa2 (4,69). В группе 3 - ЗаЗ (1,74). Таким образом, во всех группах максимальный сигнал имеют ячейки, содержащие зонды, специфичные в отношении подтипа За. Следовательно, анализируемый образец относится к подтипу За.

Методом секвенирования с последующим филогенетическим анализом было показано, что исследуемая последовательность попадает в кластер последовательностей подтипа За.

Таким образом, установлено, что анализируемый образец РНК ВГС имеет генотип 3 и подтип За, что полностью совпадает с результатами секвенирования.

Пример 11. Анализ области NS5b генома вируса гепатита С, имеющего подтип 4а, способом гибридизации на биочипе.

Образец крови, полученный от пациента, был подвергнут обработке набором для выделения вирусной РНК Qiаmр virаl RNA (Qiаgеп, Германия) согласно протоколу фирмы-производителя. Выделенный препарат РНК был использован в OT- ПЦР, как описано в примере 2. По окончании ОТ-ПЦР наличие амплифицированного фрагмента NS5b заданной длины (418 п.о.) было протестировано электрофорезом в агарозном геле, после чего продукт ОТ-ПЦР был разделен на 2 части, одна из которых была обработана и проанализирована в соответствии с методикой, описанной в Примерах 2-4 (вторая стадия ПЦР с последующей гибридизацией на биочипе, отмывкой, регистрацией и интерпретацией флуоресцентной картины биочипа). Вторую часть продукта первой стадии после дополнительной очистки использовали в реакции секвенирования с последующим разделением на автоматическом секвенаторе, получением и коррекцией хроматограммы, анализом обработанной последовательности фрагмента NS5b, конструированием множественного выравнивания и филогенетического дерева, на основании которых осуществляли установление генотипа и подтипа.

На фиг. 1OA представлена гибридизационная картина биочипа. Фиг. 10Б демонстрирует распределение нормированных гибридизационных сигналов ячеек биочипа.

В соответствии с предложенным алгоритмом интерпретации результатов анализ начинается с вычисления усредненного сигнала (I_ref) в ячейках, не содержащих олигонуклеотидов. В данном случае значение I_ref составило 0,55. В соответствии с этой величиной и пороговым значением, равным 1,5, осуществляют фильтрацию сигналов в генотип- и подтип-специфических ячейках. В результате было получено, что только сигналы в ячейках группы G4, содержащих зонды, специфичные в отношении генотипа 4, превосходят I_ref в 1,5 и более раза. Сигналы в остальных ячейках, содержащих генотип-специфичные олигонуклеотиды, были близки к фоновым. Максимальный сигнал в группе G4 зарегистрирован в ячейке G4- 3 (17,9). Следовательно, последовательность РНК анализируемого образца относится к генотипу 4.

Анализ в группах ячеек, содержащих зонды, специфичные для подтипов генотипа 4, выявляет следующее: в трех группах зондов, специфичных к генотипу 4, максимальные сигналы имеют ячейки, содержащие зонды для выявления подтипа 4а: 4acl (16,3), 4a21 (1,08), 4a4 (14,1). В группе 3 максимальный сигнал имеет ячейка 4onЗ (1,21), однако, в соответствии с описанным алгоритмом, анализируемый образец относится к подтипу 4а.

Методом секвенирования с последующим филогенетическим анализом было показано, что исследуемая последовательность попадает в кластер последовательностей подтипа 4а.

Таким образом, установлено, что анализируемый образец РНК ВГС имеет генотип 4 и подтип 4а, что полностью совпадает с результатами секвенирования.

Пример 12. Анализ области NS5b генома вируса гепатита С, имеющего подтип 4d, способом гибридизации на биочипе.

Образец крови, полученный от пациента, был подвергнут обработке набором для выделения вирусной РНК Qiаmр viгаl RNA (Qiаgеп, Германия) согласно протоколу фирмы-производителя. Выделенный препарат РНК был использован в OT- ПЦР, как описано в примере 2. По окончании ОТ-ПЦР наличие амплифицированного фрагмента NS5b заданной длины (418 п.о.) было протестировано электрофорезом в агарозном геле, после чего продукт ОТ-ПЦР был разделен на 2 части, одна из которых была обработана и проанализирована в соответствии с методикой, описанной в Примерах 2-4 (вторая стадия ГЩР с последующей гибридизацией на биочипе, отмывкой, регистрацией и интерпретацией флуоресцентной картины биочипа). Вторую часть продукта первой стадии после дополнительной очистки использовали в реакции секвенирования с последующим разделением на автоматическом секвенаторе, получением и коррекцией хроматограммы, анализом обработанной последовательности фрагмента NS 5b, конструированием множественного выравнивания и филогенетического дерева, на основании которых осуществляли установление генотипа и подтипа.

На фиг. НА представлена гибридизационная картина биочипа. Фиг. 11Б демонстрирует распределение нормированных гибридизационных сигналов ячеек биочипа.

В соответствии с предложенным алгоритмом интерпретации результатов анализ начинается с вычисления усредненного сигнала (I_ref) в ячейках, не содержащих олигонуклеотидов. В данном случае значение I_ref составило 0,35. В соответствии с этой величиной и пороговым значением, равным 1,5, осуществляют фильтрацию сигналов в генотип- и подтип-специфических ячейках. В результате было получено, что сигналы в ячейках группы G4, содержащих зонды, специфичные в отношении генотипа 4, превосходят I_ref в 1,5 и более раза. Сигналы в остальных ячейках, содержащих генотип-специфичные олигонуклеотиды, были близки к фоновым. Максимальный сигнал в группе G4 имеет ячейка G4-1 (17,4). Следовательно, последовательность РНК анализируемого образца относится к генотипу 4.

Анализ в группах ячеек, содержащих зонды, специфичные для подтипов генотипа 4, выявляет следующее: в группе 1 максимальный сигнал имеет ячейка 4dfl (11,6), в группе 2 - ячейка 4dp2 (3,16), в группе 3 - ячейка 4dЗ (1,95), в группе 4 - 4d4 (7,35). Во всех группах максимальный сигнал имеют ячейки, содержащие зонды, специфичные к подтипу 4d. Следовательно, анализируемый образец относится к подтипу 4d.

Методом секвенирования с последующим филогенетическим анализом было показано, что исследуемая последовательность попадает в кластер последовательностей подтипа 4d.

Таким образом, установлено, что анализируемый образец РНК ВГС имеет генотип 4 и подтип 4d, что полностью совпадает с результатами секвенирования.

Пример 13. Анализ области NS5b генома вируса гепатита С, имеющего подтип 5а, способом гибридизации на биочипе.

Образец крови, полученный от пациента, был подвергнут обработке набором для выделения вирусной РНК Qiаmр virаl RNA (Qiаgеп, Германия) согласно протоколу фирмы-производителя. Выделенный препарат РНК был использован в OT- ПЦР, как описано в примере 2. По окончании ОТ-ПЦР наличие амплифицированного фрагмента NS5b заданной длины (418 п. о.) было протестировано электрофорезом в агарозном геле, после чего продукт ОТ-ПЦР был разделен на 2 части, одна из которых была обработана и проанализирована в соответствии с методикой, описанной в Примерах 2-4 (вторая стадия ПЦР с последующей гибридизацией на биочипе, отмывкой, регистрацией и интерпретацией флуоресцентной картины биочипа). Вторую часть продукта первой стадии после дополнительной очистки использовали в реакции секвенирования с последующим разделением на автоматическом секвенаторе, получением и коррекцией хроматограммы, анализом обработанной последовательности фрагмента NS5b, конструированием множественного выравнивания и филогенетического дерева, на основании которых осуществляли установление генотипа и подтипа.

На фиг. 12A представлена гибридизационная картина биочипа. Фиг. 12Б демонстрирует распределение нормированных гибридизационных сигналов ячеек биочипа.

В соответствии с предложенным алгоритмом интерпретации результатов анализ начинается с вычисления усредненного сигнала (I_гef) в ячейках, не содержащих олигонуклеотидов. В данном случае значение I_ref составило 0,28. В соответствии с этой величиной и пороговым значением, равным 1,5, осуществляют фильтрацию сигналов в генотип- и подтип-специфических ячейках. В результате получаем, что только сигналы в ячейках группы G5, содержащих зонды, специфичные в отношении генотипа 5, превосходят I_ref в 1,5 и более раза.

Максимальный сигнал в группе G5 имеет ячейка G5-1 (6,58). Следовательно, последовательность РНК анализируемого образца относится к генотипу 5. Поскольку генотип 5 имеет всего один подтип, 5а, и сигнал в ячейке 5a2, специфичной к данному подтипу, является достоверным, делается заключение, что исследуемый образец имеет подтип 5а.

Методом секвенирования с последующим филогенетическим анализом было показано, что исследуемая последовательность попадает в кластер последовательностей подтипа 5 а. Таким образом, установлено, что анализируемый образец РНК ВГС имеет генотип 5 и подтип 5а, что полностью совпадает с результатами секвенирования.

Пример 14. Анализ области NS5b генома вируса гепатита С, имеющего генотип 6, способом гибридизации на биочипе.

Образец крови, полученный от пациента, был подвергнут обработке набором для выделения вирусной РНК Qiаmр virаl RNA (Qiаgеп, Германия) согласно протоколу фирмы-производителя. Выделенный препарат РНК был использован в OT- ПЦР, как описано в примере 2. По окончании ОТ-ПЦР наличие амплифицированного фрагмента NS5b заданной длины (418 п.о.) было протестировано электрофорезом в агарозном геле, после чего продукт ОТ-ПЦР был разделен на 2 части, одна из которых была обработана и проанализирована в соответствии с методикой, описанной в Примерах 2-4 (вторая стадия ПЦР с последующей гибридизацией на биочипе, отмывкой, регистрацией и интерпретацией флуоресцентной картины биочипа). Вторую часть продукта первой стадии после дополнительной очистки использовали в реакции секвенирования с последующим разделением на автоматическом секвенаторе, получением и коррекцией хроматограммы, анализом обработанной последовательности фрагмента NS5b, конструированием множественного выравнивания и филогенетического дерева, на основании которых осуществляли установление генотипа и подтипа.

На фиг. 13A представлена гибридизационная картина биочипа. Фиг. 13Б демонстрирует распределение нормированных гибридизационных сигналов ячеек биочипа.

В соответствии с предложенным алгоритмом интерпретации результатов анализ начинается с вычисления усредненного сигнала (I_гef) в ячейках, не содержащих олигонуклеотидов. В данном случае значение I_ref составило 0,72. В соответствии с этой величиной и пороговым значением, равным 1,5, осуществляют фильтрацию сигналов в генотип и подтип-специфических ячейках. В результате получаем, что сигналы в ячейке группы G6 (18,6), содержащей зонд, специфичный в отношении генотипа 6, превосходят I_ref в 1,5 и более раза. Сигнал в ячейке GЗ-1 (5,2) также следует считать достоверным. Ячейка G6 превосходит сигнал в ячейке GЗ-1 более, чем в 1,5 раза, что означает принадлежность РНК анализируемого образца к генотипу 6. Из двух групп, содержащих зонды, специфичные к подтипам генотипа 6, ни в одной из ячеек сигнал не достигает порогового значения относительно I_ref. Следовательно, в данном образце подтип ВГС является неустановленным и классифицируется как 6x.

Методом секвенирования с последующим филогенетическим анализом было показано, что исследуемая последовательность не попадает ни в один из кластеров подтипов генотипа 6 и формирует отдельную ветвь филогенетического дерева, т.е. является неклассифицированной. Таким образом, результаты, полученные обоими методами, подтвердили невозможность однозначного установления подтипа данного образца.

Таким образом, представленное изобретение позволяет идентифицировать генотип и подтип вируса гепатита С на основе анализа области NS 5b с использованием биологического микрочипа. Способ позволяет идентифицировать все 6 генотипов и 36 подтипов вируса гепатита С, в том числе наиболее вирулентные и лекарственно устойчивые формы. Способ данного изобретения выгодно отличается от существующих в настоящее время аналогов высокой специфичностью в отношении идентификации подтипов генотипа 1, в частности подтипа Ib, а также простотой выполнения и низкой себестоимостью. Данные, полученные с помощью способа гибридизации на биочипах настоящего изобретения, могут быть использованы для прогнозирования и оценки тяжести протекания заболевания (острый/хронический цирроз, вероятность развития рака печени), определения терапевтической дозы лекарственных препаратов и длительности курса терапии, а также для эпидемиологического генотипирования.

Все патенты, публикации, научные статьи, и другие документы и материалы, цитируемые или упоминаемые здесь, включены в настоящее описание путем отсылки в такой степени, как если бы каждый из этих документов был включен путем отсылки индивидуально или приведен здесь в его полном виде.

Хотя предпочтительные воплощения настоящего изобретения и их преимущества были подробно описаны выше, специалист в данной области сможет внести различные изменения, дополнения, не выходя при этом за рамки данного изобретения, которые определяются прилагаемой ниже формулой изобретения.

Claims

Формула изобретения

1. Способ идентификации генотипа и подтипа вируса гепатита С на основе анализа области NS5b генома ВГС, включающий:

(а) — обратную транскрипцию, совмещенную с ПЦР (ОТ-ПЦР), с использованием вирусной РНК в качестве матрицы и первой пары праймеров, специфичных к фрагменту области NS 5b;

(б) - асимметричную амплификацию фрагмента области NS 5b с использованием в качестве матрицы продукта ОТ-ПЦР, полученного на стадии (а), второй пары специфичных праймеров и смеси четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов, в которой один из четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов является флуоресцентно меченым, в качестве субстрата, с получением преимущественно одноцепочечного флуоресцентно меченого фрагмента;

(в) - обеспечение биочипа для идентификации генотипа и подтипа ВГС, представляющего собой подложку, содержащую множество дискретных элементов, в каждом из которых иммобилизован уникальный олигонуклеотидный зонд, имеющий последовательность, комплементарную последовательности одноцепочечного фрагмента, полученного на стадии (б), и выбранную из группы, включающей: а) генотип-специфичные для каждого из генотипов ВГС последовательности фрагмента области NS5b; и б) подтип-специфичные для каждого из подтипов ВГС последовательности фрагмента области NS 5b;

(г) - гибридизацию амплифицированного меченого продукта, полученного на стадии (б), на биочипе с образованием дуплексов с иммобилизованными зондами в условиях, обеспечивающих разрешение в один нуклеотид между образующимися в результате гибридизации совершенными и несовершенными дуплексами;

(д) - регистрацию и интерпретацию результатов гибридизации.

2. Способ по п.l, характеризующийся тем, что на стадии (а) используют первую пару специфичных праймеров, последовательности которых представлены SEQ ID NO: 121 и 122.

3. Способ по п.l, характеризующийся тем, что на стадии (б) используют вторую пару специфичных праймеров, последовательности которых представлены SEQ ID NO: 121 и 123.

4. Способ по п.l, характеризующийся тем, что на стадии (б) один из праймеров второй пары используют, по меньшей мере, в десятикратном молярном избытке по отношению ко второму праймеру.

5. Способ по п.l, характеризующийся тем, что на стадии (б) в качестве флуоресцентно меченого дезоксинуклеозидтрифосфата используют флуоресцентно меченый дезоксиуридинтрифосфат.

6. Способ по п.l, характеризующийся тем, что биочип представляет собой биочип на основе гидрогелевых ячеек, полученный способом химически или фото- индуцируемой сополимеризации.

7. Способ по п.l, характеризующийся тем, что биочип содержит набор иммобилизованных олигонуклеотидов, последовательности которых представлены SEQ ГО NO: 1-120.

8. Способ по п.l, характеризующийся тем, что регистрацию результатов на стадии (д) проводят с помощью портативного анализатора флуоресценции и программного обеспечения, что позволяет использовать программную обработку интенсивностей сигналов с последующей интерпретацией результатов.

9. Способ по п.l, где интерпретацию зарегистрированных результатов на стадии (д) проводят в два этапа: на первом этапе анализируют сигналы в элементах биочипа, содержащих олигонуклеотидные зонды, специфичные к генотипам ВГС, тем самым идентифицируя генотип исследуемого образца; в случае идентификации генотипа на втором этапе анализируют только элементы биочипа, содержащие олигонуклеотидные зонды, специфичные к подтипам идентифицированного генотипа, независимо от наличия сигналов в элементах, содержащих зонды, специфичные к подтипам других генотипов.

10. Способ по п.l, дополнительно включающий оценку и прогнозирование тяжести протекания заболевания (острый/хронический цирроз, вероятность развития рака печени), определение терапевтической дозы лекарственных препаратов и длительности курса терапии, и/или эпидемиологическое генотипирование на основе проведенной интерпретации результатов гибридизации.

11. Биочип для идентификации генотипа и подтипа ВГС на основе анализа области NS 5b, представляющий собой подложку, содержащую множество дискретных элементов, в каждом из которых иммобилизован уникальный олигонуклеотидный зонд, причем последовательности зондов представлены SEQ ID NO: 1-120.

12. Биочип по п. 12, характеризующийся тем, что он представляет собой биочип на основе гидрогелевых ячеек, полученный способом химически или фото- индуцируемой сополимеризации.

13. Набор олигонуклеотидных зондов для получения биочипа для идентификации генотипа и подтипа ВГС на основе анализа области NS5b, имеющих последовательности SEQ ID NO: 1-120.

14. Способ конструирования набора олигонуклеотидных зондов, используемых для получения биочипа для идентификации генотипа и подтипа ВГС на основе анализа области NS5b, предусматривающий раздельный выбор нескольких дискриминирующих зондов для каждого из генотипов и подтипов, последовательности которых комплементарны последовательностям различных участков исследуемого фрагмента области NS5b.