WO2008155509A2 - Facteur vii/viia humain modifie et composition pharmaceutique contenant celui-ci - Google Patents

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WO2008155509A2
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Sami Chtourou
Nicolas Bihoreau
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    • C12N9/6437—Coagulation factor VIIa (3.4.21.21)
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    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21021—Coagulation factor VIIa (3.4.21.21)

Definitions

  • Modified human factor VII / VIIa and pharmaceutical composition containing same Modified human factor VII / VIIa and pharmaceutical composition containing same.
  • FVI 1 activated human activated FVIIa (FVIIa) agents useful as active ingredients of drugs.
  • the invention relates to modified Vll / VIIa factors having high stability, nucleic acids encoding such modified FVII / VIIa, and methods for their production.
  • FVII is a vitamin K-dependent glycoprotein that, in its activated form (FVIIa), participates in the coagulation process by activating factor X and factor IX in the presence of calcium and tissue factor.
  • FVII is secreted as a unique peptide chain of 406 amino acid residues, which has a molecular weight of about 50 kDa.
  • FVII comprises four distinct structural domains: the N-terminal ⁇ -carboxylic (GI) domain, two epidermal growth factor like (EGF-like) domains, and a serine protease domain.
  • Activation of FVII in FVIIa is characterized by cleavage of the Arg152-I153 linkage (Arginine 152-Isoleucine 153).
  • the FVIIa is therefore composed of a light chain of 152 amino acids with a molecular weight of approximately 20 kDa and a heavy chain of 254 amino acids with a molecular mass of approximately 30 kDa bound together by a single disulfide bridge (Cysteine 135-Cysteine 262).
  • FVII / Vlla is used in the treatment of hemophilia patients with factor VIII (haemophilia A) or factor IX (haemophilia B) deficiency, as well as patients with other factor deficiencies. coagulation, for example an inherited deficiency of FVII.
  • FVII / Vlla is also recommended for the treatment of stroke.
  • the oldest method of obtaining FVIIa concentrates was the purification of FVIIa from plasma proteins from fractionation.
  • the document EP 0 346 241 describes the preparation of a fraction enriched in FVIIa, obtained after absorption and elution of a by-product of the fractionation of plasma proteins containing FVII and FVIIa and other proteins such as proteins.
  • EP 0 547 932 describes a method of manufacturing a high purity FVIIa concentrate essentially free of vitamin K dependent factors and FVIII.
  • One of the major drawbacks of these methods of obtaining FVII / VIIa from blood plasma is that it allows only small amounts of product to be obtained.
  • a major disadvantage lies in the fragility of the products obtained which systematically have truncated forms and therefore less active and likely to cause undesirable side effects.
  • the supply of plasma collected from blood donors remains limited.
  • FVII / VIIa is a protein sensitive to proteolytic cleavage resulting in the formation of numerous degradation products devoid of coagulating activity (atypical cleavages). Atypical cleavages may occur at different stages of the production process but also during the storage of FVII / VIIa. Degradation products were observed for both plasma derived FVII / VIIa but also for genetically recombined FVII / VIIa. Atypical cleavages may occur prior to activation of FVII in FVIIa, for example during production and purification of FVII, during the activation step per se or during purification and / or storage of the activated product (FVIIa ).
  • EP 0 370 036 relates to a modified FVII / VIIa on residues lysine, arginine, isoleucine and / or tyrosine involved in the atypical cleavage of FVII / VIIa in order to reduce the atypical cleavages of FVII / VIIa and thus obtain an FVII / VIIa more stable.
  • this patent only partially solves the problem of obtaining a more stable FVII / VIIa since it does not address the problem of the alteration of the conformation of FVII / VIIa linked to the modification of the amino acids involved in atypical cleavage.
  • the invention relates to FVII / Vlla factors having a high stability, modified on at least two amino acid residues selected from lysine 38, arginine 290 and arginine 315, said amino acid residues being ( i) substituted with a distinct amino acid residue or (ii) deleted.
  • the subject of the invention is also nucleic acids encoding the factors
  • the invention also relates to a method for producing a factor
  • the invention also relates to the use of the FVII / VIIa factors modified above for the manufacture of medicaments, as well as to pharmaceutical compositions comprising said modified FVII / VIIa factors.
  • Figure 1 MALDI-TOF mass spectrum under native conditions showing the amino acid sequences resulting from the atypical cleavage of FVII.
  • Figure 2 MALDI-TOF mass spectrum under reducing conditions showing the amino acid sequences resulting from the atypical cleavage of FVII.
  • Figure 3 Molecular modeling representing the superposition of native human FVII structures containing lysine 38 (blank) and modified human FVII containing glutamine at position 38 (in black) using Sybyl 7.2 software (Tripos).
  • Figure 4 Molecular modeling depicting the superposition of native human FVII structures containing arginine 290 (blank) and modified human FVII containing glutamine at position 290 (black) using Sybyl 7.2 software (Tripos).
  • Figure 5 Molecular modeling representing the superposition of native human FVII structures containing arginine 315 (in white) and modified human FVII containing glutamine at position 315 (in black) using Sybyl 7.2 software (Tripos).
  • Novel modified FVII / VIIa factors are provided by the present invention, which have high stability both (i) during storage time and (ii) in vivo after administration to patients.
  • the Applicant has shown that, surprisingly, certain mutations of the amino acid residues lysine 38 (Lys 38, K38), arginine 290 (Arg290, R290) and arginine 315 (Arg315, R315) in the amino acid sequence of Natural human FVII / FVIIa do not alter or little the conformation of human FVII / Vlla thus modified, compared to a natural human FVII / Vlla.
  • a modified FVII / VIIa according to the invention whose three-dimensional conformation is very close to, and sometimes identical to, the three-dimensional conformation of natural human FVII / FVIIa, has improved properties, including a decreased atypical cleavage rate, improved production yields, decreased clearance, and increased stability compared to one of natural human FVII / VIIa, while maintaining a conformation similar to that of natural human FVII / VIIa.
  • atypical cleavages is meant any cleavage of peptide bonds, excluding cleavage of the activation site (cleavage of the ATg 152 -IIe I53 bond ), involved in the FVII or FVIIa molecule.
  • These atypical cuts relate in particular to the amino acids lysine 38 (Iysine38-leucine39 bond), arginine 290 (arginine290-glycine291 bond) and arginine 315 (arginine315-lysine316 bond) and cause structural modifications resulting in an alteration of the pharmacokinetic properties of the FVII / VIIa.
  • production yield is meant the amount of structurally consistent and active FVII / VIIa produced per volume of fermenter (or bio-reactor) or volume of milk from transgenic animals or mass of any biomass (animal cells, vegetable, bacterial or insect).
  • the cost of producing a mutated FVII / VIIa is therefore significantly lower than a FVII / VIIa whose primary sequence is identical to the native human FVII / VIIa sequence.
  • clearance denotes the fraction of a theoretical volume totally purified, that is to say no longer containing FVII / VIIa per unit of time.
  • the clearance of FVII / FVIIa represents a plasma clearance coefficient. This corresponds to the ability of an organ to completely eliminate FVII / FVIIa from a given volume of arterial plasma per unit of time.
  • the clearance of FVII / FVIIa is the apparent (virtual) volume of arterial plasma completely cleared of FVII / FVIIa given per unit of time.
  • stability is meant the ability of FVII / VIIa to maintain its chemical, physical, structural, conformational and / or biopharmaceutical properties throughout its validity.
  • conformation is meant the tertiary structure of a protein, that is to say the folding of the polypeptide chain in space.
  • 3D structure we also speak of three-dimensional structure, or 3D structure. The conformation of a protein is intimately related to its biological activity, so when this structure is altered the protein loses its biological activity, it is denatured. By alteration of the conformation, we designate therefore any modification of the three-dimensional structure of a protein resulting in a loss of the biological activity of said protein.
  • the biological activity of FVII / VIIa of the invention can be quantified by measuring the ability of FVII / VIIa to induce blood coagulation by means of FVII deficient plasma and thromboplastin, as for example described in US Pat. 5997864.
  • the biological activity is expressed by a reduction in coagulation time relative to the control sample, and is converted to "units of FVII / VIIa" by comparison with a human serum standard. containing 1 unit / ml of FVII / VIIa activity.
  • the FVII / VIIa of the invention has posttranslational modification characteristics similar to that of native human FVII / VIIa but may also have post-translational modifications different from those of native plasma human FVII / VIIa so as to enhance its properties. chemical, physical, structural, conformational and / or biopharmaceutical.
  • the invention relates to a human FVII / VIIa modified with respect to the peptide sequence of native human FVII / VIIa of which at least two amino acids selected from lysine 38, arginine 290 and arginine 315 are substituted or deleted, characterized in that
  • lysine 38 is substituted with an amino acid selected from glutamine, alanine, glutamic acid, glycine, isoleucine, leucine, methionine, histidine, phenylalanine, proline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine or valine, preferably glutamine, histidine or glutamic acid;
  • arginine 290 is substituted with an amino acid selected from glutamine, alanine, glutamic acid, asparagine, glycine, isoleucine, leucine, methionine, histidine, phenylalanine proline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine or valine, preferably glutamine, histidine, asparagine or glutamic acid, and / or
  • arginine 315 is substituted with an amino acid selected from glutamine, alanine, glutamic acid, asparagine, glycine, isoleucine, leucine, methionine, histidine, phenylalanine proline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine or valine, preferably glutamine, histidine, asparagine or glutamic acid.
  • FVII / VIIa contains at least two substitutions selected from glutamine substituted lysine 38, glutamine substituted arginine 290, and glutamine substituted arginine 315.
  • FVII / VIIa contains a mutation on lysine 38 and arginine 290.
  • FVII / VIIa contains a mutation on lysine 38 and arginine 315.
  • FVII / VIIa contains a mutation on arginine 290 and arginine 315.
  • FVII / VIIa contains a mutation on lysine 38, arginine 290 and arginine 315.
  • lysine 38 is substituted. by glutamine
  • arginine 290 is substituted by glutamine
  • arginine 315 is substituted by glutamine.
  • the FVII / VIIa of the present invention can be produced using recombinant DNA (or genetic recombination) technologies.
  • the nucleic acid sequence of a nucleic acid (DNA or RNA) encoding native human FVII / VIIa is modified to encode the desired protein, particularly a modified FVII / FVIIa according to the invention.
  • the nucleic acid thus modified can then be inserted into an expression vector, which expression vector is then used to transform or transfect a host cell.
  • a nucleic acid encoding a native or natural human FVII / VIIa is illustrated by the nucleic acid of sequence SEQ ID No. 1.
  • another object of the present invention relates to a nucleic acid encoding a modified human FVII / VIIa according to the present invention, as well as a nucleic acid of complementary sequence.
  • the invention may be produced or synthesized using any of the conventional techniques forming part of the general knowledge of those skilled in the art.
  • a nucleic acid encoding a modified human FVII / VIIa according to the invention may be made by genetic recombination from the nucleic acid encoding native human FVII / VIIa.
  • the nucleic acid encoding the modified human FVII / VIIa is obtained by site-directed mutagenesis from the nucleic acid encoding native human FVII / VIIa.
  • Site-directed mutagenesis techniques are well known to those skilled in the art and provide a DNA encoding the desired modified human FVII / VIIa.
  • site-directed mutagenesis techniques that are identical or derived from the site-directed mutagenesis technique described by Michael Smith in 1978 (Smith et al., "Mutagenesis at a Specified Position in a DNA Sequence"; J Biol Chem. (1978) Sep 25; 253 (18): 6551-60).
  • the FVII / VIIa of the invention is a polypeptide of which at least two amino acid residues selected from the amino acids lysine 38, arginine 290 and arginine 315 of native human FVII of sequence SEQ ID No. 2 are mutated by amino acids chosen by design, or are deleted.
  • the modified FVII / VIIa of the invention can be obtained from a variant of native human FVII / VIIa, since this variant is not more immunogenic than human FVII / VIIa. native.
  • the peptide sequence of this variant may have at least 70% identity, and advantageously at least 80% or 90%, and even more advantageously at least 99% identity.
  • amino acids with the peptide sequence of native human FVII and comprising at least two amino acid residues selected from the amino acids lysine 38, arginine 290 and arginine 315 are mutated by purposely selected amino acids, or are deleted.
  • Such a variant has essentially the same or better biological activity as native human FVII / VIIa.
  • nucleotide sequence may be used to denote either a polynucleotide or a nucleic acid.
  • nucleotide sequence encompasses the genetic material itself and is therefore not restricted to information about its sequence.
  • nucleic acid refers to natural nucleotides [Adenine (A), Thymine (T), Guanine (G), Cytosine (C) and Uracil (U)].
  • a first polynucleotide is considered to be "complementary" to a second polynucleotide when each base of the first nucleotide is paired with the complementary base of the second polynucleotide whose orientation is reversed.
  • the complementary “bases” are A with T (or A with U), and C with G.
  • a first nucleic acid having at least 90% identity with a second reference nucleic acid will have at least 90%, preferably at least 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 97.5%, 98%, 98.3% 98.6%, 99%, 99.6% nucleotide identity with said second reference nucleic acid.
  • a first polypeptide having at least 90% identity with a second reference polypeptide will have at least 90%, preferably at least 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96% 97%, 97.5%, 98%, 98.3% 98.6%, 99%, 99.6% amino acid identity with said second reference polypeptide.
  • the "percentage identity" between two nucleic acid sequences, or between two amino acid sequences, within the meaning of the present invention is determined by comparing the two optimally aligned sequences, through a comparison window.
  • the part of the nucleotide sequence, or of the amino acid sequence, in the comparison window may thus comprise additions or deletions (for example "gaps") with respect to the reference sequence (which does not include these additions or deletions) so as to obtain an optimal alignment between the two sequences.
  • the percent identity is calculated by determining the number of positions at which an identical nucleotide base, or an identical amino acid, is observed for the two sequences compared, then dividing the number of positions at which there is identity between the two nucleic bases, or between the two amino acids, by the total number of positions in the comparison window, then multiplying the result by one hundred in order to obtain the percentage of identity in nucleotides, or in amino acids, of the two sequences between them.
  • the optimal alignment of the sequences for the comparison can be performed in a computer manner using known algorithms.
  • the present invention also relates to an expression vector in which has been inserted a nucleic acid encoding a modified human FVII / VIIa according to the present invention.
  • the expression vector used in the present invention may contain a promoter capable of directing transcription of the nucleic acid encoding FVII / VIIa of the invention. Promoters widely used in mammalian cell cultures include viral promoters and cell promoters well known in the art.
  • the expression vector may also contain splice sites located downstream of the promoter and upstream of the insertion site of the FVII / VIIa-encoding DNA sequence of the present invention.
  • the expression vector may also contain a polyadenylation sequence located downstream of the insertion site of the DNA sequence encoding FVII / VIIa of the present invention.
  • the expression vector may also contain any type of DNA sequence useful for the expression, selection and / or insertion of FVII / VIIa, the DNA sequence encoding FVII / VIIa of the present invention and / or expression vector containing the DNA sequence encoding FVII / VIIa of the present invention.
  • a further object of the present invention is a cell transformed to produce a modified human FVII / VIIa according to the present invention.
  • These transformed cells are made by transferring a nucleic acid encoding a modified human FVII / VIIa according to the present invention into the genome of a host cell, preferably to express that DNA sequence by the thus transformed cell.
  • Suitable techniques for cell transformation are well known to those skilled in the art. These techniques include, but are not limited to the use of liposomes, the use of polyethylene glycol (PEG), the use of DEAE-dextran, the use of calcium phosphate, the use of viruses (mainly retroviruses), the use of a cannon DNA, cell fusion, microinjection, electroporation etc.
  • the invention therefore also relates to a cell transformed with a nucleic acid encoding a modified human FVII / VIIa defined above and expressing said modified human factor VII / VIIa.
  • said transformed cell consists of a mammalian transformed cell, and in particular a transformed rodent, a bovine, a goat, a porcine, a non-human primate or a non-human primate cell. human cell.
  • the modified human FVII / VIIa according to the present invention can be obtained from a transformed cell according to the present invention and cultured.
  • BHK Baby Hamster Kidney
  • BHK tk BHK tk " ts13 (CRL 10314, Waechter and Baserga, Proc Natl Acad Sci USA 79: 1 106-1 110, 1982
  • CHO ATCC CCL 61
  • COS-1 ATCC CRL 1650
  • HEK293 ATCC CRL 1573, Graham et al., J. Gen.
  • the present invention also relates to an organism genetically modified to produce a modified human factor VII / VIIa according to the present invention.
  • a genetically modified organism is an organism (with the exception of human beings) whose genetic material has been modified in a way that can not be carried out naturally by multiplication and / or by recombination.
  • a genetically modified organism incorporates the FVII / VIIa-encoding DNA sequence of the present invention and expresses said modified human FVII DNA sequence to produce said modified human FVII / VIIa of the present invention.
  • the genetically modified organism is a microorganism, an animal or a plant.
  • the invention therefore also relates to a genetically modified organism comprising in its genome a nucleic acid encoding a modified human factor VII / VIIa as defined in the present description, and expressing said modified human factor VII / VIIa.
  • a microorganism is a microscopic organism, it can be a bacterium, a yeast or a virus.
  • the bacterium may be, for example, Bacillus subtilis (Palva et al (1982) Proc Natl Acad Sci USA 79: 5582, EP 0 036 259 and EP 0 063 953, WO 84/04541); Escherichia coli (Shimatake et al (1981) Nature 292: 128, Amann et al (1985) Gene 40: 183, Studier et al (1986) J.
  • Yeast can be, for example, Candida (Kurtz et al (1986) Mol., CeII, Biol., 6: 142, Kunze et al (1985) J.
  • the virus used may be, for example, a retrovirus such as Avian Leukosis Virus, Bovine Leukemia Virus, Murine Leukemia Virus, Mink-Cell Focus-Inducing Virus, Murine Sarcoma Virus, Reticuloendotheliosis Virus and Rous Sarcoma Virus.
  • An animal according to the present invention is a multicellular living organism, eukaryotic, free of chloroplasts and non-human.
  • the genetically modified organism used in the present invention is a mammal, preferably a rabbit.
  • the modified human FVII / VIIa of the present invention can be produced in the mammary glands of a mammal, preferably a rabbit, under the control of a specific promoter allowing the expression of said FVII / VIIa in the milk of said mammal. rabbit.
  • a method for producing a recombinant or transgenic FVII / VIIa in the milk of a transgenic animal may comprise the following steps: a DNA molecule comprising a gene coding for the modified human FVII / VIIa according to the invention, this gene being under the control of a promoter of a protein secreted naturally in milk (such as the casein promoter, beta-casein, lactalbumin, beta-lactoglobulin or the WAP promoter) is integrated into a embryo of a non-human mammal. The embryo is then placed in a female mammal of the same species. Once the mammal from the embryo has grown sufficiently, the lactation of the mammal is induced, then the milk collected. The milk then contains said recombinant or transgenic FVII / VIIa.
  • a promoter of a protein secreted naturally in milk such as the casein promoter, beta-casein, lactalbumin, beta-lactoglobulin or the WAP promoter
  • a plasmid containing the WAP (Whey Acidic Protein) promoter is manufactured by introducing a sequence comprising the promoter of the WAP gene, this plasmid being made in such a way as to be able to receive a foreign gene placed under the control of the WAP promoter.
  • the plasmid containing the promoter and the gene coding for the protein of the invention are used to obtain transgenic rabbits by microinjection into the male pronucleus of rabbit embryos. Embryos are then transferred in the oviduct of hormonally prepared females.
  • transgenes The presence of the transgenes is revealed by the Southern technique from the DNA extracted from the transgenic rabbits obtained. Concentrations in animal milk are evaluated using specific radioimmunoassays. Other documents describe methods for preparing proteins in milk of a female mammal other than man. These include, but are not limited to, US 7,045,676 (transgenic mouse) and EP 1,739,170 (production of von Willebrand factor in a transgenic mammal). These methods of preparation are applicable to the invention using the modified FVII / VIIa DNA according to the present invention.
  • the genetically modified organism is an insect, for example a mosquito, a fly, etc.
  • recombinant or transgenic FVII / VIIa any FVII / VIIa obtained from a transformed cell or from a genetically modified organism, that is to say from a microorganism, an animal or a a plant.
  • the FVII / VIIa of the invention is not a plasma FVII / VIIa, i.e. it is not a purified product from human or animal plasma.
  • the FVII / VIIa of the invention is derived from the transcription and then the translation of a DNA molecule coding for a modified FVII according to the invention and produced by a transgenic cell, a microorganism, a animal or a transgenic plant.
  • the recombinant or transgenic FVII / VIIa of the invention can be obtained using standard techniques, well known to those skilled in the art, allowing the expression of a protein in a biological system.
  • the present invention also relates to a method of manufacturing a modified human FVII / VIIa according to the present invention comprising the following steps: a) transforming a cell with a nucleic acid encoding a modified human FVII / VIIa as defined in b) culturing the cell obtained in step a) so that the cell expresses said factor VII / VIIa; and c) purifying the modified human factor VII / VIIa expressed by the transformed cell culture in step b).
  • the transformed cell is cultured in a suitable medium to express FVII / VIIa.
  • the culture media used are chosen on purpose by the skilled person depending on the cultured cells. Suitable media for cell culture include rIMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), RPMI 1640 or others. These culture media consist mainly of inorganic salts, amino acids, vitamins and other components, including glucose for its energy supply and HEPES for its buffering capacity, basic supplements such as in particular acids amino, minerals, trace elements, specific molecular complements of growth and metabolic activities for each cultured cell type etc.
  • the present invention also relates to a method for producing a modified human FVII / VIIa according to the present invention in the milk of a transgenic mammal, comprising the steps of: a) obtaining a transgenic mammal which expresses in its mammary glands a nucleic acid coding for a human factor VIII / VIIa modified according to the present invention, b) collecting the milk of the transgenic mammal which contains the factor VII / VIIa, c) purifying the modified human factor VII / VIIa from said collected milk.
  • the transgenic mammal may be a mouse, a spleen, a rabbit or a goat.
  • the transgenic mammal is a rabbit.
  • the transgenic mammal can be obtained by conventional methods, for example by microinjecting an embryo from a mammal with a DNA sequence coding for a modified human FVII / VIIa according to the present invention, placing said microinjected embryo in the light of the oviduct of a female mammal of the same species, wait for the birth of small mammals from the microinjected embryo, check if the transgenic animal expresses the modified human FVII / VIIa in its milk.
  • the FVII / VIIa of the present invention can be purified by purification methods well known to those skilled in the art, including, but not limited to, chromatography (ion exchange, affinity, hydrophobic, size exclusion), electrophoretic techniques such as preparative isoelectric focusing (IEF), solubility difference (amonium sulphate precipitation) or extraction (Protein Purification J.-C.Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York (1989)).
  • the FVII / VIIa of the invention can be purified by affinity chromatography on a column containing anti-FVII antibodies or on a column containing anti-FVII aptamers.
  • Additional purification can be achieved by conventional techniques of chemical purification, such as HPLC (High Performance Liquid Chromatography).
  • HPLC High Performance Liquid Chromatography
  • Other purification methods, including barium citrate precipitation, are well known to those skilled in the art and can be used for purification of the FVII / VIIa of the invention.
  • antibody refers to an immunoglobulin or an immunologically active portion thereof, e.g., the antigen-binding region.
  • An antibody therefore refers to a protein comprising at least one, and preferably two, heavy chain and at least one, preferably two light chains.
  • Aptamer refers to a nucleic acid molecule (DNA or RNA) having a tertiary structure that allows it to specifically bind a protein (Osborne, et al (1997), Curr Opin Chem Biol 1: 5-9; and Patel, DJ (1997) Curr Opin Chem Biol 1: 32-46)
  • Another object of the present invention is a modified human FVII / VIIa composition according to the present invention.
  • the subject of the present invention is also a pharmaceutical composition containing a modified human FVII / VIIa according to the present invention and an excipient and / or a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used for parenteral, topical or local administration and prophylactically and / or therapeutically.
  • the modified human FVII / VIIa according to the present invention is prepared in a form adapted to the chosen type of administration, for example in liquid form or in freeze-dried form.
  • the modified human FVII / VIIa pharmaceutical compositions according to the present invention may contain an excipient and / or a pharmaceutically acceptable carrier, preferably an aqueous vehicle.
  • compositions for example, water, buffered water, saline solution, glycine solution and their derivatives as well as agents necessary to reproduce physiological conditions such as buffering agents and pH adjusters, surfactants such as sodium acetate, sodium lactate, sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, this list not being limiting.
  • the pharmaceutical composition can be sterilized by sterilization techniques well known to those skilled in the art.
  • modified human FVII / VIIa according to the present invention and the pharmaceutical compositions thereof are particularly useful for the manufacture of a medicament.
  • modified human FVII / VIIa according to the present invention and pharmaceutical compositions thereof are useful for the manufacture of a medicament for the treatment of coagulation disorders in a patient.
  • disorder of the coagulation treated with a pharmaceutical composition according to the present invention may be mentioned in a non-exhaustive manner multiple bleeding trauma, such as hemophilia A and B or hemorrhages caused by overdosage of anticoagulant.
  • modified human FVII / VIIa according to the invention may be used alone or in combination with one or more other pharmaceutically active molecules.
  • the three-dimensional model of human FVII was constructed from an exhaustive study of all the crystallized structures available within the Protein Data Bank (pdb). There are 27 FVII structures that have been analyzed with respect to various parameters such as the expression system, the heavy and light chain integrity, the presence of tissue factor, the resolution, the presence of O- and N-glycosylations. , the presence of ⁇ -carboxylation and the date of publication at the protein data bank (pdb). From this study, the protein structure was constructed after corrections, assembly and minimization of structures.
  • the software suite used is Sybyl v7.2 (Tripos, Inc.). Sybyl is a modeling software based on the minimization of the total energy thus making it possible to define the most stable structure and thus the most probable.
  • the overall minimization step comprising fixing the "BackBone" of the protein by simulating the presence of tissue factor, has been performed under the following conditions:
  • a surface lipid phase cream
  • a clear non-lipidic aqueous phase enriched in FVII major phase
  • a solid white phase in pellet precipitates of insoluble caseins and calcium compounds
  • the non-lipidic aqueous phase FVII was collected at the peristaltic pump until the creamy phase.
  • the creamy phase was collected separately.
  • the solid phase (precipitate) was removed.
  • the non-lipidic aqueous phase was filtered on a filter sequence (PaII SLK7002U010ZP - 1 ⁇ m pore size glass fiber pre-filter - then PaII SLK7002NXP - nylon 66 0.45 ⁇ m pores).
  • a filter sequence PaII SLK7002U010ZP - 1 ⁇ m pore size glass fiber pre-filter - then PaII SLK7002NXP - nylon 66 0.45 ⁇ m pores.
  • the lipid phase was passed on this filtration sequence which completely retains the lipid globules of the milk, and the filtrate is clear.
  • the filtered non-lipidic aqueous phase was then dialyzed on an ultrafiltration membrane (Millipore Biomax 50 kDa - 0.1 m 2 ) to make it compatible with the chromatography phase.
  • the molecular weight FVII of about 50 kDa does not filter through the membrane, unlike the milk salts, sugars and peptides.
  • the solution about 5000 ml
  • the dialysis buffer is a 0.025M sodium phosphate buffer, pH 8.2.
  • This non-lipidic aqueous phase comprising FVII can be assimilated to whey enriched in FVII-tg.
  • This preparation is stored at -30 ° C before continuing the process.
  • the non-lipidic aqueous phase comprising FVII at the end of this step is perfectly clear and is compatible with the chromatographic steps that follow.
  • the gel was equilibrated in buffer A consisting of a mixture of 0.025 M sodium phosphate and 0.04 M sodium chloride, pH 8.0.
  • buffer A consisting of a mixture of 0.025 M sodium phosphate and 0.04 M sodium chloride, pH 8.0.
  • the entire preparation stored at -30 ° C is thawed in a water bath at 37 ° C until complete dissolution of the ice cube and then was injected on the gel (linear flow 100 cm / h, or 105 ml / min).
  • the unbound fraction was removed by passing a buffer consisting of 0.025 M sodium phosphate and 0.04 M sodium chloride, pH 8.2, until baseline return (RLB).
  • Elution of the fraction containing FVII was made by buffer B consisting of 0.25 M sodium phosphate and 0.4 M sodium chloride, pH 8.0. The eluted fraction was collected until the return to baseline.
  • the filtered fraction was then concentrated to about 500 ml and dialyzed on the 50 kDa ultrafilter already described in Example 1.
  • the dialysis buffer was 0.15 M sodium chloride.
  • the product is stored at -30 ° C. before passing through ion exchange chromatography.
  • This step made it possible to reduce the protein load of molecular weight greater than 100 kDa and in particular proenzymes.
  • the 100 kDa membrane treatment retains about 50% of proteins including high molecular weight proteins, while filtering 95% of FVII, or 82,000 IU of FVII. This treatment makes it possible to reduce the risks of proteolytic hydrolysis during the downstream stages.
  • QSFF Q-Sepharose® Fast Flow
  • the gel was equilibrated in 0.05 M Tris buffer, pH 7.5.
  • a first low FVII protein fraction was eluted at 9 ml / min (100 cm / hr) with a buffer of 0.05 M Tris and 0.15 M sodium chloride, pH 7.5, and was then eliminated.
  • a second protein fraction rich in FVII was eluted at 9 ml / min (ie 100 cm / h) with a buffer of 0.05 M Tris, 0.05 M sodium chloride and 0.05 M calcium chloride. pH 7.5.
  • This second fraction was dialyzed on the 50 kDa ultrafilter already described in Example 1.
  • the dialysis buffer is 0.15 M sodium chloride. was stored at + 4 ° C overnight before the 2 ⁇ m ⁇ pass through anion exchange chromatography. This step makes it possible to recover 73% of the FVII (ie 60000 IU of FVII), while eliminating 80% of the accompanying proteins. It also allows the activation of FVII in FVIIa.
  • a 2.5 cm diameter column (4.9 cm 2 section) was filled with 30 ml of Q-Sepharose® FF gel (GE Healthcare).
  • the gel was equilibrated in 0.05 M Tris buffer, pH 7.5.
  • the previous eluted fraction (second fraction), stored at + 4 ° C., was diluted before injection on the gel (flow rate 9 ml / min, ie linear flow rate of 100 cm / h).
  • a fraction containing very high purity FVII was eluted at 4.5 ml / min (ie 50 cm / h) in buffer of 0.05 M Tris, 0.05 M sodium chloride and 0.005 M calcium chloride. pH 7.5. Approximately 23,000 IU of FVII were purified, ie, 12 mg of FVII.
  • This eluate of greater than 90% purity, has structural and functional characteristics close to that of native human FVII. It was concentrated and formulated by the third pass in ion exchange chromatography.
  • a 2.5 cm diameter column (4.9 cm 2 section) was filled with 10 ml of Q-Sepharose® FF gel (GE Healthcare). The gel was equilibrated in 0.05 M Tris buffer, pH 7.5.
  • the purified eluted fraction of the previous step was diluted five times with purified water for injection (PPI) before injection on the gel (flow rate 4.5 ml / min, ie linear flow of 50 cm / h).
  • FVII was then eluted at a rate of 3 ml / min (36 cm / h) with 0.02 M Tris buffer and 0.28 M sodium chloride, pH 7.0.
  • a composition of FVII in the form of a concentrate was prepared with purity greater than 95%.
  • the product is compatible with intravenous injection.
  • the process has a cumulative yield of 22%, which makes it possible to purify at least 20 mg of FVII per liter of milk used.
  • FVII can then be subjected to different structural analyzes, as developed in the examples that follow.
  • Example 3 Identification of Atypical Cleavages of FVII by MALDI-TOFMS
  • MALDI-TOF MS Melt-Assisted Laser Desorption / lonization Time of Flight Mass Spectrometry
  • the proteins to be analyzed were mixed with a matrix that absorbs at the wavelength of the laser used.
  • the main matrices are D-cyano-4-hydroxycinnamic acid (HCCA) for peptide analysis, sinapinic acid (SA) for proteins and 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB) for oligosaccharides.
  • the method involves irradiating matrix / analyte co-chstals with a laser, resulting in joint desorption of the template and analyte molecules. After ionization in the gas phase, the analyte molecules reach a time of flight detector. Mass and flight time being directly related, the measurement of the latter allows the determination of the mass of the analyte.
  • the identification of each protein or peptide can be carried out by measuring its mass observed in mass spectrometry, compared with the theoretical mass deduced from the FVII sequence.
  • the instrument used is a Bruker Autoflex II operating in the TOF and TOF / TOF modes.
  • the MALDI-TOF spectrum of FVII shows a 14.7 kDa form (FIG. 1, polypeptide IV) which corresponds to the C-terminal peptide [Gly 2 9i-Pro 40 6] of the heavy chain containing Asn 3 22 glycosylated predominantly by a oligosaccharide of monosialylated biantenene type (A1) and other glycans (A1 F, A2, ).
  • the presence of the complementary form (FIG. 1, polypeptide IV), N terminal of FVII, at 34.6 kDa ending with arginine 290 is also observed on the spectrum.
  • Another atypical cleavage is also present at 44.8 kDa (FIG. polypeptide II) which corresponds to the cleavage of the light chain after lysine 38, that is to say to a form of FVII amputated from the GIa domain and thus whose affinity for tissue factor is decreased.
  • N-terminal sequence LC ANAFLEELRPGSLERECKEEQCSF (SEQ ID NO: 3)
  • LC sequence LFWISYSDGDQ (SEQ ID No. 5) (atypical cleavage after lysine 38).
  • HC sequence ATALELM VLN VP RLMTQ (SEQ ID NO: 6) (atypical cleavage after arginine 290).
  • HC sequence KVGDSP ⁇ / ITEYMFCAGYSDGS (SEQ ID No. 7) (atypical cleavage after arginine 315).
  • amino acids represented in bold and italic indicate sequence holes, that is to say unidentified amino acids in Edman sequencing because of the presence of post-translational modifications such as D-carboxylation, N- or O -glycosylation.
  • a quantitative evaluation was performed to estimate the proportion of different atypical cuts as a function of FVII. The results are shown in Table 1 below:
  • FVII-pd human plasma FVII
  • FVII-Tg transgenic non-mutated human FVII
  • FVII-rec non-mutated commercial recombinant human FVII
  • the light chain of FVII has an atypical cleavage rate between amino acids K38 and L39 varying between 4.5 and 26% depending on the origin of the product.
  • the heavy chain of FVII has an atypical cleavage between R315 and K316 (varying between 9 and 52% depending on the origin of the product) and is also cleaved between R290 and G291 (varying between 4 and 13% depending on the origin of the product).

Abstract

L'invention est relative à des facteurs Vll/Vlla modifiés possédant une haute stabilité, à des acides nucléiques codant pour de tels FVII/Vlla modifiés et à des procédés pour leur production.

Description

TITRE DE L'INVENTION
Facteur Vll/Vlla humain modifié et composition pharmaceutique contenant celui- ci.
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention se rapporte au domaine de la fabrication de facteurs VII
( FVI l)/f acteurs VII activés (FVIIa) humains utilisables comme principes actifs de médicaments. L'invention est en particulier relative à des facteurs Vll/Vlla modifiés possédant une haute stabilité, à des acides nucléiques codant pour de tels FVII/Vlla modifiés et à des procédés pour leur production.
ART ANTERIEUR
Le facteur VII (FVII) est une glycoprotéine vitamine K-dépendante qui, sous sa forme activée (FVIIa), participe au processus de coagulation en activant le facteur X et le facteur IX en présence de calcium et de facteur tissulaire. Le FVII est sécrété sous la forme d'une chaîne peptidique unique de 406 résidus d'acides aminés, dont la masse moléculaire est d'environ 50 kDa. Le FVII comporte quatre domaines structuraux distincts : le domaine γ-carboxylique (GIa) N-terminal, deux domaines "epidermal growth factor like" (EGF-like), ainsi qu'un domaine serine protéase. L'activation du FVII en FVIIa est caractérisée par la coupure de la liaison Arg152-lle153 (Arginine 152- Isoleucine 153). Le FVIIa est donc composé d'une chaîne légère de 152 acides aminés de masse moléculaire d'environ 20 kDa et d'une chaîne lourde de 254 acides aminés de masse moléculaire d'environ 30 kDa liées entre elles par un seul pont disulfure (Cystéine 135-Cystéine 262). Le FVII/Vlla est utilisé dans le traitement des patients atteints d'hémophilie, présentant un déficit en facteur VIII (hémophilie de type A) ou en facteur IX (hémophilie de type B), ainsi que des patients présentant d'autres déficiences des facteurs de coagulation, par exemple un déficit héréditaire en FVII. Le FVII/Vlla est également préconisé dans le traitement d'accidents vasculaires cérébraux. La méthode la plus ancienne d'obtention de concentrés de FVIIa a consisté en la purification du FVIIa à partir de protéines plasmatiques issues du fractionnement.
Le document EP 0 346 241 décrit à cet effet la préparation d'une fraction enrichie en FVIIa, obtenue après absorption puis élution d'un sous-produit du fractionnement de protéines plasmatiques contenant le FVII et le FVIIa et d'autres protéines telles que les facteurs IX, X et II, notamment le prééluat du PPSB (P = prothrombine ou FII, P = proconvertine ou FVII, S = facteur de Stuart ou FX et B = facteur antihémophilique B ou FIX).
De même, le document EP 0 547 932 décrit un procédé de fabrication d'un concentré de FVIIa de haute pureté essentiellement dépourvu des facteurs vitamine K dépendants et du FVIII. L'un des inconvénients majeurs de ces procédés d'obtention du FVII/Vlla à partir du plasma sanguin est qu'il ne permet d'obtenir que de faibles quantités de produit. Par ailleurs, un inconvénient majeur réside dans la fragilité des produits obtenus qui présentent systématiquement des formes tronquées et donc moins actives et susceptibles d'entraîner des effets secondaires non souhaitables. De plus, l'approvisionnement en plasma collecté auprès des donneurs de sang reste limité.
C'est pourquoi, dés les années 1980, l'ADN codant pour le facteur VII humain a été isolé (Hagen et al. (1986) ; Proc. Natl. Acad. Sci. USA ; Apr 83(8):2412-6) et la protéine correspondante exprimée dans les cellules de mammifères BHK (Baby Hamster Kidney) (document EP 0 200 421 ). La demande FR 06 04872 déposée par la Demanderesse décrit également la production de FVIIa dans un animal transgénique.
Ces méthodes de production permettent d'obtenir des protéines sécurisées en terme de contamination par des virus ou d'autres agents pathogènes. De tels procédés permettent d'obtenir des protéines dont la séquence primaire est identique à la séquence primaire humaine.
Les préparations commerciales de FVIIa recombinant humain sont actuellement disponibles sous l'appellation NovoSeven® (NovoNordisk™). Des doses relativement élevées, ainsi que des administrations fréquentes par voie intraveineuse, sont nécessaires pour atteindre et conserver l'effet thérapeutique ou prophylactique désiré. Ce traitement reste donc à la fois contraignant pour les patients et très onéreux.
Il a par ailleurs été montré que le FVII/Vlla est une protéine sensible au clivage protéolytique entraînant la formation de nombreux produits de dégradations dépourvus d'activité coagulante (clivages atypiques). Les clivages atypiques peuvent intervenir à différentes étapes du procédé d'obtention mais également pendant le stockage du FVII/Vlla. Les produits de dégradation ont été observés à la fois pour le FVII/Vlla dérivé du plasma, mais également pour le FVII/Vlla produit par recombinaison génétique. Les clivages atypiques peuvent intervenir avant l'activation du FVII en FVIIa, par exemple pendant la production et la purification du FVII, pendant l'étape d'activation en elle- même ou pendant la purification et/ou le stockage du produit activé (FVIIa). Le brevet EP 0 370 036 concerne un FVII/Vlla modifié sur des résidus lysine, arginine, isoleucine et/ou tyrosine impliqués dans le clivage atypique du FVII/Vlla afin de diminuer les clivages atypiques du FVII/Vlla et obtenir ainsi un FVII/Vlla plus stable. Néanmoins ce brevet ne résout que partiellement le problème de l'obtention d'un FVII/Vlla plus stable puisqu'il n'aborde pas le problème de l'altération de la conformation du FVII/Vlla lié à la modification des acides aminés impliqués dans le clivage atypique. Ce brevet ne décrit ni ne suggère l'obtention d'un FVII/Vlla modifié au niveau de sites de clivage atypique dont la conformation n'est pas ou peu altérée par la modification de la séquence en acides aminés. En dépit de l'existence de documents relatifs à des FVII/Vlla humains modifiés, notamment au niveau de sites de clivage atypique, il existe encore un grand besoin de nouveaux FVII/Vlla humains aux propriétés améliorées.
RESUME DE L'INVENTION
L'invention a pour objet des facteurs FVII/Vlla possédant une haute stabilité, modifiés sur au moins deux résidus d'acides aminés choisis parmi la lysine 38, l'arginine 290 et l'arginine 315, lesdits résidus d'acides aminés étant (i) substitués par un résidu d'acide aminé distinct ou (ii) supprimés. L'invention a aussi pour objet des acides nucléiques codant les facteurs
FVII/FVIIa modifiés ci-dessus, des vecteurs recombinants dans lesquels sont insérés lesdits acides nucléiques, des cellules hôtes transformées avec lesdits acides nucléiques ou lesdits vecteurs recombinants et des organismes génétiquement modifiés exprimant lesdits facteurs FVII/Vlla modifiés. L'invention est également relative à un procédé pour la production d'un facteur
FVII/FVIIa modifié défini ci-dessus.
L'invention a également trait à l'utilisation des facteurs FVII/Vlla modifiés ci- dessus pour la fabrication de médicaments, ainsi qu'à des compositions pharmaceutiques comprenant lesdits facteurs FVII/Vlla modifiés.
DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1 : Spectre de masse MALDI-TOF en conditions natives montrant les séquences d'acides aminés résultant du clivage atypique du FVII.
Figure 2 : Spectre de masse MALDI-TOF en conditions réductrices montrant les séquences d'acides aminés résultant du clivage atypique du FVII.
Figure 3 : Modélisation moléculaire représentant la superposition des structures du FVII humain natif contenant la lysine 38 (en blanc) et du FVII humain modifié contenant une glutamine en position 38 (en noir) à l'aide du logiciel Sybyl 7.2 (Tripos).
Figure 4 : Modélisation moléculaire représentant la superposition des structures du FVII humain natif contenant l'arginine 290 (en blanc) et du FVII humain modifié contenant une glutamine en position 290 (en noir) à l'aide du logiciel Sybyl 7.2 (Tripos).
Figure 5 : Modélisation moléculaire représentant la superposition des structures du FVII humain natif contenant l'arginine 315 (en blanc) et du FVII humain modifié contenant une glutamine en position 315 (en noir) à l'aide du logiciel Sybyl 7.2 (Tripos).
DESCRIPTION DE L'INVENTION
Des nouveaux facteurs FVII/Vlla modifiés sont fournis par la présente invention, qui possèdent une haute stabilité, à la fois (i) au cours de la durée de stockage et (ii) in vivo après leur administration aux patients. La Demanderesse a montré que, de manière surprenante, certaines mutations des résidus d'acides aminés lysine 38 (Lys 38, K38), arginine 290 (Arg290, R290) et arginine 315 (Arg315, R315) dans la séquence d'acides aminés du FVII/FVIIa humain naturel n'altèrent pas ou peu la conformation du FVII/Vlla humain ainsi modifié, par rapport à un FVII/Vlla humain naturel.
De plus, la Demanderesse a montré qu'un FVII/Vlla modifié selon l'invention, dont la conformation tridimensionnelle est très proche, et parfois identique, à la conformation tridimensionnelle du FVII/FVIIa humain naturel, possède des propriétés améliorées, y compris un taux de clivage atypique diminué, de meilleurs rendements de production, une clairance diminuée et une stabilité accrue comparativement à un de FVII/Vlla humain naturel, tout en conservant une conformation proche de celle du FVII/Vlla humain naturel.
Par clivages atypiques, on désigne toutes coupures de liaisons peptidiques, hors clivage du site d'activation (coupure de la liaison ATg152-IIeI53), intervenant sur la molécule de FVII ou FVIIa. Ces coupures atypiques concernent en particulier les acides aminés lysine 38 (liaison Iysine38-leucine39), arginine 290 (liaison arginine290- glycine291 ) et arginine 315 (liaison arginine315-lysine316) et provoquent des modifications de structures se traduisant par une altération des propriétés pharmacocinétiques du FVII/Vlla. Par rendement de production, on désigne la quantité de FVII/Vlla structurellement conforme et actif produit par volume de fermenteur (ou bio-réacteur) ou par volume de lait issu d'animaux transgéniques ou par masse d'une quelconque biomasse (cellules animales, végétales, bactériennes ou d'insectes). Le coût de production d'un FVII/Vlla muté de la sorte est donc significativement plus faible qu'un FVII/Vlla dont la séquence primaire est identique à la séquence du FVII/Vlla humain natif.
Par clairance, on désigne la fraction d'un volume théorique totalement épuré, c'est-à-dire ne contenant plus le FVII/Vlla par unité de temps. La clairance d'un FVII/FVIIa représente un coefficient d'épuration plasmatique. Cela correspond à la capacité d'un organe à éliminer totalement le FVII/FVIIa d'un volume donné de plasma artériel par unité de temps. La clairance du FVII/FVIIa est le volume apparent (virtuel) de plasma artériel totalement débarrassé du FVII/FVIIa donnée par unité de temps.
Par stabilité, on désigne l'aptitude du FVII/Vlla à conserver ses propriétés chimiques, physiques, structurales, conformationnelles et/ou biopharmaceutiques pendant toute sa durée de validité. Par conformation, on désigne la structure tertiaire d'une protéine, c'est à dire le repliement de la chaîne polypeptidique dans l'espace. On parle également de structure tridimensionnelle, ou structure 3D. La conformation d'une protéine est intimement liée à son activité biologique, ainsi lorsque cette structure est altérée la protéine perd son activité biologique, elle est dénaturée. Par altération de la conformation, on désigne donc toute modification de la structure tridimensionnelle d'une protéine entraînant une perte de l'activité biologique de ladite protéine.
L'activité biologique du FVII/Vlla de l'invention peut être quantifiée en mesurant la capacité du FVII/Vlla à induire la coagulation sanguine au moyen d'un plasma déficient en FVII et de la thromboplastine, comme par exemple décrit dans le brevet US 5,997,864. Dans le test décrit dans le brevet US 5,997,864, l'activité biologique est exprimée par une réduction du temps de coagulation par rapport à l'échantillon contrôle, et est convertie en « unités de FVII/Vlla» par comparaison avec un standard de sérum humain contenant 1 unité/ml d'activité de FVII/Vlla. Le FVII/Vlla de l'invention possède des caractéristiques de modifications post- traductionnelles similaires à celle du FVII/Vlla humain natif mais peut également posséder des modifications post-traductionnelles différentes de celles du FVII/Vlla humain natif plasmatique de manière à améliorer ses propriétés chimiques, physiques, structurales, conformationnelles et/ou biopharmaceutiques. Dans son aspect le plus large, l'invention a pour objet un FVII/Vlla humain modifié par rapport à la séquence peptidique du FVII/Vlla humain natif dont au moins deux acides aminés sélectionnés parmi la lysine 38, l'arginine 290 et l'arginine 315 sont substitués ou délétés, caractérisé en ce que :
(i) la lysine 38 est substituée par un acide aminé choisi parmi la glutamine, l'alanine, l'acide glutamique, la glycine, l'isoleucine, la leucine, la méthionine, l'histidine, la phénylalanine, la proline, la serine, la thréonine, le tryptophane, la tyrosine ou la valine, de préférence la glutamine, l'histidine ou l'acide glutamique ; (ii) l'arginine 290 est substituée par un acide aminé choisi parmi la glutamine, l'alanine, l'acide glutamique, l'asparagine, la glycine, l'isoleucine, la leucine, la méthionine, l'histidine, la phénylalanine, la proline, la serine, la thréonine, le tryptophane, la tyrosine ou la valine, de préférence la glutamine, l'histidine, l'asparagine ou l'acide glutamique, et/ou
(iii) l'arginine 315 est substituée par un acide aminé choisi parmi la glutamine, l'alanine, l'acide glutamique, l'asparagine, la glycine, l'isoleucine, la leucine, la méthionine, l'histidine, la phénylalanine, la proline, la serine, la thréonine, le tryptophane, la tyrosine ou la valine, de préférence la glutamine, l'histidine, l'asparagine ou l'acide glutamique.
Dans un mode de réalisation préféré de la présente invention, le FVII/Vlla contient au moins deux substitutions choisies parmi la lysine 38 substituée par une glutamine, l'arginine 290 substituée par une glutamine et l'arginine 315 substituée par une glutamine.
Dans un premier mode de réalisation particulier de la présente invention, le FVII/Vlla contient une mutation sur la lysine 38 et l'arginine 290.
Dans un deuxième mode de réalisation particulier de la présente invention, le FVII/Vlla contient une mutation sur la lysine 38 et l'arginine 315. Dans un troisième autre mode de réalisation particulier de la présente invention, le FVII/Vlla contient une mutation sur la l'arginine 290 et l'arginine 315.
Dans un quatrième mode de réalisation particulier de la présente invention, le FVII/Vlla contient une mutation sur la lysine 38, l'arginine 290 et l'arginine 315. Dans un mode de réalisation particulier de la présente invention, la lysine 38 est substituée par une glutamine, l'arginine 290 est substitué par une glutamine et l'arginine 315 est substitué par une glutamine.
Le FVII/Vlla de la présente invention peut être produit en utilisant les technologies de l'ADN recombinant (ou de recombinaison génétique). En règle générale, la séquence nucléique d'un acide nucléique (ADN ou ARN) codant un FVII/Vlla humain natif est modifiée afin de coder la protéine désirée, en particulier un FVII/FVIIa modifié selon l'invention. L'acide nucléique ainsi modifié peut être ensuite inséré dans un vecteur d'expression, lequel vecteur d'expression est ensuite utilisé pour transformer ou transfecter une cellule hôte. Un acide nucléique codant un FVII/Vlla humain natif ou naturel est illustré par l'acide nucléique de séquence SEQ ID N° 1 .
Ainsi, un autre objet de la présente invention concerne un acide nucléique codant pour un FVII/Vlla humain modifié selon la présente invention, ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire.. Un acide nucléique codant un FVII/Vlla humain modifié selon l'invention peut être produit ou synthétisé en utilisant l'une quelconque des techniques conventionnelles faisant partie des connaissances générales de l'homme du métier. A titre illustratif, un acide nucléique codant un FVII/Vlla humain modifié conforme à l'invention peut être fabriqué par recombinaison génétique à partir de l'acide nucléique codant le FVII/Vlla humain natif. De préférence, l'acide nucléique codant le FVII/Vlla humain modifié est obtenu par mutagenèse dirigée à partir de l'acide nucléique codant pour le FVII/Vlla humain natif. Des techniques de mutagenèse dirigée sont bien connues de l'homme du métier et permettent d'obtenir un ADN codant pour le FVII/Vlla humain modifié désiré. On peut notamment mettre en oeuvre des techniques de mutagenèse dirigée qui sont identiques ou dérivées de la technique de mutagenèse dirigée décrite par Michael Smith en 1978 (Smith et al. ; « Mutagenesis at a spécifie position in a DNA séquence » ; J Biol Chem. (1978) Sep 25;253(18):6551 -60).
Avantageusement, le FVII/Vlla de l'invention est un polypeptide dont au moins deux résidus d'acides aminés choisis parmi les acides aminés lysine 38, arginine 290 et arginine 315 du FVII humain natif de séquence SEQ ID N° 2 sont mutés par des acides aminés choisis à dessein, ou bien sont délétés.
Dans un mode de réalisation particulier, le FVII/Vlla modifié de l'invention peut être obtenu à partir d'un variant du FVII/Vlla humain natif, dans la mesure où ce variant n'est pas plus immunogène que le FVII/Vlla humain natif. Ainsi, la séquence peptidique de ce variant peut posséder au moins 70% d'identité, et de manière avantageuse au moins 80% ou 90%, et de manière encore plus avantageuse au moins 99% d'identité en acides aminés avec la séquence peptidique du FVII humain natif et comprenant dont au moins deux résidus d'acides aminés choisis parmi les acides aminés lysine 38, arginine 290 et arginine 315, selon la numérotation en acides aminés du FVII humain natif de séquence SEQ ID N° 2 sont mutés par des acides aminés choisis à dessein, ou bien sont délétés.. Un tel variant possède essentiellement la même ou une meilleure activité biologique que le FVII/Vlla humain natif.
Aux fins de la présente description, l'expression " séquence nucléotidique " peut être employée pour désigner indifféremment un polynucléotide ou un acide nucléique. L'expression " séquence nucléotidique " englobe le matériel génétique lui-même et n'est donc pas restreinte à l'information concernant sa séquence.
Les termes " acide nucléique ", " polynucléotide ", " oligonucléotide " ou encore " séquence nucléotidique " englobent des séquences d'ARN, d'ADN, d'ADNc ou encore des séquences hybrides ARN/ADN de plus d'un nucléotide, indifféremment sous la forme simple brin ou sous la forme de duplex. Le terme " nucléotide " désigne les nucléotides naturels [Adénine (A), Thymine (T), Guanine (G), Cytosine (C) et Uracile (U)].
Aux fins de la présente invention, un premier polynucléotide est considéré comme étant " complémentaire " d'un second polynucléotide lorsque chaque base du premier nucléotide est appariée à la base complémentaire du second polynucléotide dont l'orientation est inversée. Les « bases », complémentaires sont A avec T (ou A avec U), et C avec G.
Selon l'invention, un premier acide nucléique ayant au moins 90 % d'identité avec un second acide nucléique de référence, possédera au moins 90 %, de préférence au moins 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 97,5%, 98%, 98,3% 98,6%, 99%, 99,6% d'identité en nucléotides avec ledit second acide nucléique de référence. Selon l'invention, un premier polypeptide ayant au moins 90 % d'identité avec un second polypeptide de référence, possédera au moins 90 %, de préférence au moins 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 97,5%, 98%, 98,3% 98,6%, 99%, 99,6% d'identité en acides aminés avec ledit second polypeptide de référence. Le « pourcentage d'identité » entre deux séquences d'acides nucléiques, ou entre deux séquences d'acides aminés, au sens de la présente invention, est déterminé en comparant les deux séquences alignées de manière optimale, à travers une fenêtre de comparaison.
La partie de la séquence nucléotidique, ou de la séquence d'acides aminés, dans la fenêtre de comparaison peut ainsi comprendre des additions ou des délétions (par exemple des « gaps ») par rapport à la séquence de référence (qui ne comprend pas ces additions ou ces délétions) de manière à obtenir un alignement optimal entre les deux séquences.
Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions auxquelles une base nucléique identique, ou un acide aminé identique, est observé pour les deux séquences comparées, puis en divisant le nombre de positions auxquelles il y a identité entre les deux bases nucléiques, ou entre les deux acides aminés, par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat par cent afin d'obtenir le pourcentage d'identité en nucléotides, ou en acides aminés, des deux séquences entre elles.
L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus.
De manière tout à fait préférée, le pourcentage d'identité de séquence est déterminé à l'aide du logiciel CLUSTAL W (version 1.82) les paramètres étant fixés comme suit : (1 ) CPU MODE = ClustalW mp ; (2) ALIGNMENT = « full » ; (3) OUTPUT FORMAT = « aln w/numbers » ; (4) OUTPUT ORDER = « aligned » ; (5) COLOR ALIGNMENT = « no » ; (6) KTUP (word size) = « default » ; (7) WINDOW LENGTH = « default » ; (8) SCORE TYPE = « percent » ; (9) TOPDIAG = « default » ; (10) PAIRGAP = « default » ; (1 1 ) PHYLOGENETIC TREE/TREE TYPE = « none » ; (12) MATRIX = « default » ; (13) GAP OPEN = « default » ; (14) END GAPS = « default » ; (15) GAP EXTENSION = « default » ; (16) GAP DISTANCES = « default » ; (17) TREE TYPE = « cladogram » et (18) TREE GRAP DISTANCES = « hide ».
La présente invention a également pour objet un vecteur d'expression dans lequel a été inséré un acide nucléique codant un FVII/Vlla humain modifié selon la présente invention.
Le vecteur d'expression utilisé dans la présente invention peut contenir un promoteur capable de diriger la transcription de l'acide nucléique codant le FVII/Vlla de l'invention. Des promoteurs largement utilisés dans le cadre de cultures de cellules de mammifère comprennent des promoteurs viraux et des promoteurs cellulaires bien connus dans l'état de la technique. Le vecteur d'expression peut également contenir des sites d'épissage situés en aval du promoteur et en amont du site d'insertion de la séquence ADN codant pour un FVII/Vlla de la présente invention. Le vecteur d'expression peut également contenir une séquence de polyadénylation située en aval du site d'insertion de la séquence ADN codant pour le FVII/Vlla de la présente invention. Le vecteur d'expression peut également contenir tout type de séquence ADN utile pour l'expression, la sélection et/ou l'insertion du FVII/Vlla, de la séquence ADN codant pour le FVII/Vlla de la présente invention et/ou du vecteur d'expression contenant la séquence ADN codant pour le FVII/Vlla de la présente invention.
Un objet supplémentaire de la présente invention concerne une cellule transformée pour produire un FVII/Vlla humain modifié selon la présente invention. Ces cellules transformées sont fabriquées en transférant un acide nucléique codant un FVII/Vlla humain modifié selon la présente invention dans le génome d'une cellule hôte, de préférence afin de faire exprimer cette séquence ADN par la cellule ainsi transformée. Des techniques appropriées pour la transformation de cellules sont bien connues de l'homme du métier. Ces techniques comprennent et sans s'y limiter l'utilisation de liposomes, l'utilisation du polyéthylène glycol (PEG), l'utilisation de DEAE-dextran, l'utilisation du phosphate de calcium, l'utilisation de virus (principalement les rétrovirus), l'utilisation d'un canon à ADN, la fusion cellulaire, la microinjection, l'électroporation etc. L'invention concerne donc également une cellule transformée par un acide nucléique codant un FVII/Vlla humain modifié défini ci-dessus et exprimant ledit facteur Vll/Vlla humain modifié. Préférentiellement, ladite cellule transformée consiste en une cellule transformée de mammifère, et en particulier une cellule transformée d'un rongeur, d'un bovin, d'un caprin, d'un porcin, d'un primate non humain ou encore d'une cellule humaine. Le FVII/Vlla humain modifié selon la présente invention peut être obtenu à partir d'une cellule transformée selon la présente invention et mise en culture. A titre d'exemple, on peut citer les cellules suivantes : BHK (Baby Hamster Kidney) et notamment BHK tk"ts13 (CRL 10314, Waechter and Baserga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:1 106-1 110, 1982), CHO (ATCC CCL 61 ), COS- 1 (ATCC CRL 1650), HEK293 (ATCC CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977), Rat Hep I (Rat hepatoma; ATCC CRL 1600), Rat Hep II (Rat hepatoma; ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), Human lung (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1 ) and DUKX cells (CHO cell line) (Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216- 4220, 1980), cellules YB2/0, cellules 3T3, cellules Namalwa, ou des cellules BHK adaptées à la culture sans sérum (Document US 6,903,069).
La présente invention concerne également un organisme génétiquement modifié pour produire un facteur Vll/Vlla humain modifié selon la présente invention. Selon la définition donnée par l'Union Européenne, un organisme génétiquement modifié est un organisme (à l'exception des êtres humains) dont le matériel génétique a été modifié d'une manière qui ne peut s'effectuer naturellement par multiplication et/ou par recombinaison. En ce qui concerne la présente invention, un organisme génétiquement modifié intègre la séquence ADN codant pour un FVII/Vlla de la présente invention et exprime ladite séquence ADN du FVII humain modifié de manière à produire ledit FVII/Vlla humain modifié de la présente invention. L'organisme génétiquement modifié est un microorganisme, un animal ou un végétal. L'invention concerne donc aussi un organisme génétiquement modifié comprenant dans son génome un acide nucléique codant un facteur Vll/Vlla humain modifié tel que défini dans la présente description, et exprimant ledit facteur Vll/Vlla humain modifié.
Un microorganisme est un organisme microscopique, il peut s'agir d'une bactérie, d'une levure ou d'un virus. La bactérie peut être, par exemple, Bacillus subtilis (Palva et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5582 ; EP 0 036 259 et EP 0 063 953; WO 84/04541 ) ; Escherichia coli (Shimatake et al. (1981 ) Nature 292:128; Amann et al. (1985) Gène 40:183; Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189:1 13; EP 0 036 776, EP 0 136 829 et EP 0 136 907) ; Streptococcus cremoris (Powell et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655] ; Streptococcus lividans [Powell et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655) ; Streptomyces lividans (US 4,745,056). La levure peut être, par exemple, Candida (Kurtz et al. (1986) Mol. CeII. Biol. 6:142; Kunze et al. (1985) J. Basic Microbiol. 25:141 ) ; Hansenula (Gleeson et al. (1986) J. Gen. Microbiol. 132:3459; Roggenkamp et al. (1986) Mol. Gen. Genêt. 202:302) ; Kluyveromyces (Das et al. (1984) J. Bacteriol. 158:1 165; De Louvencourt et al. (1983) J. Bacterial. 154:1 165; Van den Berg et al. (1990) Bio/Technology 8:135) ; Pichia (Cregg et al. (1985) Mol. CeII. Biol. 5:3376; Kunze et al. (1985) J. Basic Microbiol. 25:141 ; U.S. Pat. Nos. 4,837,148 and 4,929,555) ; Saccharomyces (Hinnen et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75;1929; Ito et al. (1983) J. Bacteriol. 153:163) ; Schizosaccharomyces (Beach and Nurse (1981 ) Nature 300:706) ; Yarrowia (Davidow et al. (1985) Curr. Genêt. 10:39; Gaillardin et al. (1985) Curr. Genêt. 10:49). Le virus utilisé peut être, par exemple, un rétrovirus comme Avian Leukosis Virus, Bovine Leukemia Virus, Murine Leukemia Virus, Mink-Cell Focus-lnducing Virus, Murine Sarcoma Virus, Reticuloendotheliosis Virus et Rous Sarcoma Virus. Un animal selon la présente invention est un organisme vivant pluricellulaire, eucaryote, dépourvus de chloroplastes et non humain. Dans un mode de réalisation préféré, l'organisme génétiquement modifié utilisé dans la présente invention est un mammifère, de préférence une lapine. Avantageusement, le FVII/Vlla humain modifié de la présente invention peut être produit dans les glandes mammaires d'un mammifère, de préférence une lapine, sous le contrôle d'un promoteur spécifique permettant l'expression dudit FVII/Vlla dans le lait de ladite lapine.
Une méthode de production d'un FVII/Vlla recombinant ou transgénique dans le lait d'un animal transgénique peut comporter les étapes suivantes : une molécule d'ADN comprenant un gène codant pour le FVII/Vlla humain modifié selon l'invention, ce gène étant sous le contrôle d'un promoteur d'une protéine sécrétée naturellement dans le lait (tels que le promoteur de la caséine, de la béta-caséine, de la lactalbumine, de la béta-lactoglobuline ou le promoteur WAP)est intégrée dans un embryon d'un mammifère non humain. L'embryon est ensuite placé dans une femelle de mammifère de la même espèce. Une fois que le mammifère issu de l'embryon s'est suffisamment développé, la lactation du mammifère est induite, puis le lait collecté. Le lait contient alors ledit FVII/Vlla recombinant ou transgénique.
Un exemple de procédé de préparation de protéine dans le lait d'une femelle de mammifère autre que l'être humain est donné dans le document EP 0 527 063, dont l'enseignement peut être repris pour la production de la protéine de l'invention. Un plasmide contenant le promoteur WAP (Whey Acidic Protein) est fabriqué par introduction d'une séquence comportant le promoteur du gène WAP, ce plasmide étant réalisé de manière à pouvoir recevoir un gène étranger placé sous la dépendance du promoteur WAP. Le plasmide contenant le promoteur et le gène codant pour la protéine de l'invention sont utilisés pour obtenir des lapines transgéniques, par microinjection dans le pronucléus mâle d'embryons de lapines. Les embryons sont ensuite transférés dans l'oviducte de femelles hormonalement préparées. La présence des transgènes est révélée par la technique de Southern à partir de l'ADN extrait des lapereaux transgéniques obtenus. Les concentrations dans le lait des animaux sont évaluées à l'aide de tests radioimmunologiques spécifiques. D'autres documents décrivent des procédés de préparation de protéines dans le lait d'une femelle de mammifère autre que l'homme. On peut citer, sans s'y limiter les documents US 7,045,676 (souris transgénique) et EP 1 739 170. (production de facteur von Willebrand dans un mammifère transgénique). Ces procédés de préparations sont applicables à l'invention en utilisant l'ADN du FVII/Vlla modifié selon la présente invention.
Dans un mode de réalisation particulier, l'organisme génétiquement modifié est un insecte, par exemple un moustique, une mouche etc.
Par « FVII/Vlla recombinant ou transgénique », on désigne tout FVII/Vlla obtenu à partir d'une cellule transformée ou d'un organisme génétiquement modifié, c'est à dire à partir d'un microorganisme, d'un animal ou d'un végétal. Par opposition, le FVII/Vlla de l'invention n'est pas un FVII/Vlla plasmatique, c'est-à-dire qu'il n'est pas un produit purifié à partir de plasma humain ou animal.
Ainsi, le FVII/Vlla de l'invention est issu de la transcription puis de la traduction d'une molécule d'ADN codant pour un FVII modifié selon l'invention et produit par une cellule, un microorganisme, un animal ou un végétal transgénique. Ainsi le FVII/Vlla recombinant ou transgénique de l'invention peut être obtenu au moyen de techniques standard, bien connues de l'homme du métier, permettant l'expression d'une protéine dans un système biologique.
La présente invention concerne également un procédé de fabrication d'un FVII/Vlla humain modifié selon la présente invention comprenant les étapes suivantes : a) transformation d'une cellule avec un acide nucléique codant pour un FVII/Vlla humain modifié tel que défini dans la présente description, b) mise en culture de la cellule obtenue à l'étape a) de manière à ce que la cellule exprime ledit facteur Vll/Vlla, et c) purification du facteur Vll/Vlla humain modifié exprimé par la cellule transformée mise en culture à l'étape b).
La cellule transformée est mise en culture dans un milieu approprié lui permettant d'exprimer le FVII/Vlla. Les milieux de cultures utilisés sont choisi à dessein par l'homme du métier en fonction des cellules cultivées. Des milieux appropriés pour la culture cellulaire comprennent riMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Médium), le DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Médium), le RPMI 1640 ou autres. Ces milieux de culture sont composées pour l'essentiel de sels inorganiques, d'acides aminés, de vitamines et d'autres composants, notamment le glucose pour son apport énergétique et l'HEPES pour son pouvoir tampon, des compléments de base tels que notamment des acides aminés, des minéraux, des éléments traces, des compléments moléculaires spécifiques de la croissance et des activités métaboliques pour chaque type cellulaire cultivé etc.
La présente invention concerne également un procédé de fabrication d'un FVII/Vlla humain modifié selon la présente invention dans le lait d'un mammifère transgénique, comprenant les étapes suivantes : a) obtenir un mammifère transgénique qui exprime dans ses glandes mammaires un acide nucléique codant un facteur Vll/Vlla humain modifié selon la présente invention, b) collecter le lait du mammifère transgénique qui contient le facteur Vll/Vlla, c) purifier le facteur Vll/Vlla humain modifié à partir dudit lait collecté.
Avantageusement, le mammifère transgénique peut être une souris, une rate, une lapine ou une chèvre. De préférence le mammifère transgénique est une lapine.
L'obtention d'un mammifère transgénique peut se faire par des méthodes classiques, comme par exemple microinjecter un embryon d'un mammifère avec une séquence ADN codant pour un FVII/Vlla humain modifié selon la présente invention, placer ledit embryon microinjecté dans la lumière de l'oviducte d'une femelle de mammifère de la même espèce, attendre la naissance des petits mammifères issus de l'embryon microinjecté, vérifier si l'animal transgénique exprime bien le FVII/Vlla humain modifié dans son lait. Le FVII/Vlla de la présente invention peut être purifié par des procédés de purification bien connus de l'homme du métier, comprenant, mais sans s'en limiter, la chromatographie (échangeuse d'ion, d'affinité, hydrophobe, d'exclusion par la taille), les techniques électrophorétiques comme le preparative isoelectric focusing (IEF), la différence de solubilité (précipitation au sulfate d'amonium) ou l'extraction (Protein Purification J. -C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York (1989)). De préférence, le FVII/Vlla de l'invention peut être purifié par chromatographie d'affinité sur une colonne contenant des anticorps anti-FVII ou sur une colonne contenant des aptamères anti-FVII. Une purification additionnelle peut être réalisée par des techniques conventionnelles de purification chimique, comme l'HPLC (High performance liquid chromatography). D'autres procédés de purification, dont la précipitation au citrate de barium, sont bien connus de l'homme du métier et peuvent être utilisés pour la purification du FVII/Vlla de l'invention.
Le terme "anticorps" tel qu'utilisé ici se réfère à une immunoglobuline ou une portion immunologiquement active de celle-ci, par exemple la région liant un antigène. Un anticorps fait donc référence à une protéine comprenant au moins une, et de préférence deux, chaîne lourde et au moins une, de préférence deux chaines légères.
Par aptamère, on désigne une molécule d'acide nucléique (ADN ou ARN) ayant une structure tertiaire qui lui permet de lier spécifiquement une protéine (Osborne, et al. (1997) Curr. Opin. Chem Biol. 1 : 5-9; and Patel, D. J. (1997) Curr Opin Chem Biol 1 :32- 46) Un autre objet de la présente invention concerne une composition de FVII/Vlla humain modifié selon la présente invention.
La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique contenant un FVII/Vlla humain modifié selon la présente invention et un excipient et/ou un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
La composition pharmaceutique de la présente invention peut être utilisée pour une administration parentérale, topique ou locale et de manière prophylactique et/ou thérapeutique. Ainsi le FVII/Vlla humain modifié selon la présente invention est préparé sous une forme adaptée au type d'administration choisi, par exemple sous forme liquide ou sous forme lyophilisée. Les compositions pharmaceutiques de FVII/Vlla humain modifié selon la présente invention peuvent contenir un excipient et/ou un véhicule pharmaceutiquement acceptable, de préférence aqueux. De nombreux excipients et/ou véhicules pharmaceutiquement acceptables peuvent être utilisés, par exemple, l'eau, l'eau tamponnée, une solution saline, une solution de glycine et leurs dérivés ainsi que des agents nécessaires pour reproduire les conditions physiologiques comme par exemple des agents tampons et ajusteurs de pH, des surfactants comme l'acétate de sodium, le lactate de sodium, le chlorure de sodium, le chlorure de potassium, le chlorure de calcium, cette liste n'étant pas limitative. De plus, la composition pharmaceutique peut être stérilisée par des techniques de stérilisation bien connues de l'homme du métier. De manière générale, pour fabriquer une composition pharmaceutique conforme à l'invention, l'homme du métier peut avantageusement se référer à la dernière édition de la Pharmacopée Européenne, par exemple à la 5è édition de la Pharmacopée Européenne publiée en janvier 2005, ou bien encore à la 6è édition de la Pharmacopée Européenne, disponible au public en juin 2007. Le FVII/Vlla humain modifié selon la présente invention et les compositions pharmaceutiques de celui-ci sont particulièrement utiles pour la fabrication d'un médicament. En particulier le FVII/Vlla humain modifié selon la présente invention et les compositions pharmaceutiques de celui-ci sont utiles pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des désordres de la coagulation chez un patient. Comme désordre de la coagulation traité par une composition pharmaceutique selon la présente invention on peut citer de manière non exhaustive les traumatismes hémorragiques multiples, comme par exemple l'hémophilie A et B ou les hémorragies causées par un surdosage d'anticoagulant.
Le FVII/Vlla humain modifié selon l'invention peut être utilisé seul ou en combinaison avec une ou plusieurs autres molécules pharmaceutiquement actives.
EXEMPLES
Exemple 1 : Etablissement du modèle tridimensionnel du FVII humain
Le modèle tridimensionnel du FVII humain a été construit à partir d'une étude exhaustive de l'ensemble des structures cristallisées disponibles au sein de la Protein Data Bank (pdb). Ce sont 27 structures de FVII qui ont été analysées vis à vis de divers paramètres comme le système d'expression, l'intégrité des chaînes lourde et légère, la présence du facteur tissulaire, la résolution, la présence des O- et N-glycosylations, la présence des γ-carboxylation et la date de publication à la banque de donnée protéique (pdb). A partir de cette étude, la structure protéique a été construite après corrections, assemblage et minimisation des structures. La suite logicielle utilisée est Sybyl v7.2 (Tripos, Inc.). Sybyl est un logiciel de modélisation basé sur la minimisation de l'énergie totale permettant ainsi de définir la structure la plus stable et donc la plus probable. L'étape de minimisation globale comprenant la fixation du « BackBone » de la protéine en simulant la présence de facteur tissulaire, a été réalisée dans les conditions suivantes :
- paramètre d'arrêt : gradient d'énergie < 0,5 kCal/mol ou nombre d'itérations maximum atteint = 10000
- méthode de minimisation : Powell - champ de force : Amber7FF99
- méthode de calcul des charges pour la glycoprotéine : Amber7FF99,
- méthode de calcul des charges pour les ions et l'inhibiteur du site actif : Gasteiger- Hϋckel
- non-bonded cut-off : 8 A.
Exemple 2 : Extraction et purification du FVII obtenu dans du lait de lapine transgénique a) Extraction du FVII
Un volume de 500 ml de lait brut non écrémé a été dilué par 9 volumes de tampon phosphate de sodium 0,25 M, pH 8,2. Après 30 minutes d'agitation à température ambiante, la phase aqueuse enrichie en FVII a été centrifugée à 10 000g durant 1 heure à 15°C (centrifugeuse Sorvall Evolution RC - 6700 tours/min - rotor
SLC-6000). 6 pots d'environ 835 ml sont nécessaires.
Après centrifugation, trois phases sont présentes : une phase lipidique en surface (crème), une phase aqueuse non lipidique claire enrichie en FVII (phase majoritaire) et une phase blanche solide en culot (précipités de caséines non solubles et de composés de calcium).
La phase aqueuse non lipidique FVII a été collectée à la pompe péristaltique jusqu'à la phase crémeuse. La phase crémeuse a été collectée à part. La phase solide (précipité) a été éliminée.
La phase aqueuse non lipidique, comprenant toutefois encore de très faibles quantités de lipides, a été filtrée sur une séquence de filtres (PaII SLK7002U010ZP - préfiltre en fibres de verre de taille de pores de 1 μm - puis PaII SLK7002NXP - Nylon 66 de taille de pores de 0,45 μm). En fin de filtration, la phase lipidique a été passée sur cette séquence de filtration qui retient complètement les globules lipidiques du lait, et le filtrat est clair.
La phase aqueuse non lipidique filtrée a ensuite été dialysée sur membrane d'ultrafiltration (Millipore Biomax 50 kDa - 0,1 m2) pour la rendre compatible avec la phase de chromatographie. Le FVII de poids moléculaire d'environ 50 kDa ne filtre pas à travers la membrane, contrairement aux sels, sucres et peptides du lait. Dans un premier temps, la solution (environ 5 000 ml) est concentrée à 500 ml, puis une dialyse par ultrafiltration en maintenant le volume constant permet d'éliminer les électrolytes et de conditionner la matière biologique pour l'étape de chromatographie. Le tampon de dialyse est un tampon phosphate de sodium 0,025M, pH 8,2.
On peut assimiler cette phase aqueuse non lipidique comprenant le FVII à du lactosérum enrichi en FVII-tg. Cette préparation est stockée à -30 °C avant la poursuite du procédé.
La phase aqueuse non lipidique comprenant le FVII à l'issue de cette étape est parfaitement limpide et est compatible avec les étapes chromatographiques qui font suite.
Environ 93 000 Ul de FVII-tg sont extraites à ce stade. La pureté en FVII de cette préparation est de l'ordre de 0,2%.
b) Purification du FVII
1. Chromatoαraphie sur gel d'hvdroxyapatite
Une colonne Amicon 90 (9 cm de diamètre - 64 cm2 de section) a été remplie avec du gel BioRad Ceramic Hydroxyapatite type I (CHT-I).
Le gel a été équilibré en tampon A constitué d'un mélange de phosphate de sodium 0,025 M et de chlorure de sodium 0,04 M, pH 8,0. La totalité de la préparation conservée à -30 °C est décongelée au bain-marie à 37°C jusqu'à dissolution complète du glaçon puis a été injectée sur le gel (débit linéaire 100 cm/h, soit 105 ml/min). La fraction non-retenue a été éliminée par passage d'un tampon constitué de phosphate de sodium 0,025 M et de chlorure de sodium 0,04 M, pH 8,2, jusqu'au retour à la ligne de base (RLB).
L'élution de la fraction contenant le FVII a été faite par le tampon B constitué de phosphate de sodium 0,25 M et de chlorure de sodium 0,4 M, pH 8,0. La fraction éluée a été collectée jusqu'au retour à la ligne de base.
Cette chromatographie permet de récupérer plus de 90% du FVII, tout en éliminant plus de 95% des protéines lactiques. L'activité spécifique (A. S.) est multipliée par 25. Environ 85 000 Ul de FVII de pureté de 4% sont disponibles à ce stade. 2. Filtration tanαentielle 100 kDa et concentration/dialyse 50 kDa La totalité de l'éluat de l'étape précédente a été filtrée en mode tangentiel sur une membrane d'ultrafiltration 100 kDa (PaII OMEGA SC 100K - 0,1 m2). Le FVII a été filtré à travers la membrane 100 kDa, alors que les protéines de poids moléculaire supérieur à 100 kDa ne sont pas filtrables.
La fraction filtrée a été ensuite concentrée à environ 500 ml, puis dialysée sur l'ultrafiltre 50 kDa déjà décrit à l'Exemple 1. Le tampon de dialyse est du chlorure de sodium 0,15 M.
A ce stade du procédé, le produit est stocké à -30 °C avant passage en chromatographie d'échange d'ions.
Cette étape a permis de réduire la charge en protéines de poids moléculaire supérieur à 100 kDa et en particulier des pro-enzymes. Le traitement membranaire 100 kDa permet de retenir environ 50% des protéines dont les protéines de haut poids moléculaire, tout en filtrant 95% du FVII, soit 82 000 Ul de FVII. Ce traitement permet de réduire les risques d'hydrolyse protéolytique lors des étapes avales.
3.Chromatoqraphies sur gel Q-Sepharose® FF
Ces trois chromatographies successives sur gel échangeur d'ions Q- Sepharose® Fast Flow (QSFF) ont été réalisées pour purifier le principe actif, permettre l'activation du FVII en FVII activé (FVIIa) et finalement concentrer et formuler la composition en FVII.
3.1 Etape Q-Sepharose® FF 1 - élution « High Calcium » Une colonne de 2,6 cm de diamètre (5,3 cm2 de section) a été remplie de 100 ml de gel Q-Sepharose® FF (GE Healthcare).
Le gel a été équilibré en tampon Tris 0,05 M, pH 7,5.
La totalité de fraction conservée à -30 °C a été décongelée au bain-marie à
37°C jusqu'à dissolution complète du glaçon. La fraction a été diluée au λh [v/v] avec le tampon d'équilibrage avant injection sur le gel (débit 13 ml/min, soit débit linéaire de
150 cm/h), puis la fraction non retenue a été éliminée par passage du tampon jusqu'au
RLB.
Une première fraction protéique à faible teneur en FVII a été éluée à 9 ml/min (soit 100 cm/h) par un tampon de Tris 0,05 M et de chlorure de sodium 0,15 M, pH 7,5, et a été ensuite éliminée.
Une deuxième fraction protéique riche en FVII a été éluée à 9 ml/min (soit 100 cm/h) par un tampon de Tris 0,05 M, de chlorure de sodium 0,05 M et de chlorure de calcium 0,05 M, pH 7,5.
Cette deuxième fraction a été dialysée sur l'ultrafiltre 50 kDa déjà décrit à l'Exemple 1. Le tampon de dialyse est du chlorure de sodium 0,15 M. Cette fraction a été conservée à +4°C durant une nuit avant le 2θmθ passage en chromatographie d'échange d'anions. Cette étape permet de récupérer 73% du FVII (soit 60000 Ul de FVII), tout en éliminant 80% des protéines accompagnantes. Elle permet également l'activation du FVII en FVIIa.
3.2 Etape Q-Sepharose® FF 2 - élution « Low Calcium »
Une colonne de 2,5 cm de diamètre (4,9 cm2 de section) a été remplie de 30 ml de gel Q-Sepharose® FF (GE Healthcare).
Le gel a été équilibré en tampon Tris 0,05 M, pH 7,5. La fraction éluée précédente (deuxième fraction), conservée à +4°C, a été diluée avant injection sur le gel (débit 9 ml/min, soit débit linéaire de 100 cm/h).
Une fraction contenant du FVII de très haute pureté a été éluée à 4,5 ml/min (soit 50 cm/h) en tampon de Tris 0,05 M, de chlorure de sodium 0,05 M et de chlorure de calcium 0,005 M, pH 7,5. Environ 23 000 Ul de FVII ont été purifiées, soit 1 2 mg de FVII.
Cette étape permet d'éliminer plus de 95% des protéines accompagnantes (protéines du lait de lapine).
Cet éluat, de pureté supérieure à 90%, présente des caractéristiques structurales et fonctionnelles proches de celle du FVII humain natif. Il a été concentré et formulé par le troisième passage en chromatographie d'échanges d'ions.
3.3 Etape Q-Sepharose® FF 3 - élution « Sodium »
Une colonne de 2,5 cm de diamètre (4,9 cm2 de section) a été remplie de 10 ml de gel Q-Sepharose® FF (GE Healthcare). Le gel a été équilibré en tampon Tris 0,05 M, pH 7,5.
La fraction éluée purifiée de l'étape précédente a été diluée cinq fois avec de l'eau purifiée pour injection (PPI) avant injection sur le gel (débit 4,5 ml/min, soit débit linéaire de 50 cm/h).
Le FVII a été ensuite élue à un débit de 3 ml/min (soit 36 cm/h) par le tampon de Tris 0,02 M et de chlorure de sodium 0,28 M, pH 7,0.
Une composition de FVII sous forme de concentré a été préparée dont la pureté est supérieure à 95%. Le produit est compatible avec une injection par voie intraveineuse. Le procédé a un rendement cumulé de 22%, ce qui permet de purifier au moins 20 mg de FVII par litre de lait mis en œuvre. Les FVII peuvent ensuite être soumis à différentes analyses structurales, telles que développées dans les exemples qui suivent. Exemple 3 : identification des clivages atypiques du FVII par MALDI-TOFMS
La spectrométrie de masse MALDI-TOF MS (Matrix-Assisted Laser Desorption/lonisation Time of Flight Mass Spectrometry) est une technique permettant de mesurer la masse moléculaire des molécules avec une grande précision. Les protéines à analyser ont été mélangés à une matrice qui absorbe à la longueur d'onde du laser utilisé. Les principales matrices sont l'acide D-cyano-4- hydroxycinnamique (HCCA) pour l'analyse des peptides, l'acide sinapinique (SA) pour les protéines et l'acide 2,5-dihydroxybenzoïque (DHB) pour les oligosaccharides.
La méthode consiste à irradier les co-chstaux matrice/analyte à l'aide d'un laser, ceci entraînant la désorption conjointe des molécules de matrice et d'analyte. Après ionisation en phase gazeuse, les molécules d'analyte atteignent un détecteur de temps de vol. Masse et temps de vol étant directement liés, la mesure de ce dernier permet la détermination de la masse de l'analyte. L'identification de chaque protéine ou peptide peut être réalisée par mesure de sa masse observée en spectrométrie de masse, par comparaison avec la masse théorique déduite de la séquence du FVII. L'instrument utilisé est un Bruker Autoflex II fonctionnant dans les modes TOF et TOF/TOF.
Le spectre MALDI-TOF du FVII montre une forme à 14.7 kDa (figure 1 , polypeptide IV) qui correspond au peptide [Gly29i-Pro406] C-terminal de la chaîne lourde contenant l'Asn322 glycosylée majoritairement par un oligosaccharide de type bianténné monosialylé (A1 ) et d'autres glycannes (A1 F, A2, ...). On observe également sur le spectre la présence de la forme complémentaire (figure 1 , polypeptide IV), N terminale du FVII, à 34.6 kDa se terminant par l'arginine 290. Un autre clivage atypique est également présente à 44.8 kDa (figure 1 , polypeptide II) qui correspond à la coupure de la chaîne légère après la lysine 38, c'est-à-dire à une forme de FVII amputée du domaine GIa et donc dont l'affinité pour le facteur tissulaire est diminuée.
En conditions réductrices (figure 2) on note la présence des chaînes lourde et légère du FVIIa à 29.9 et 19.3 kDa (polypeptide I), respectivement. Une autre forme est observée à 1 1.9 kDa correspondant au peptide [LyS3-I6- Pro406] contenant rAsn322 glycosylée. A l'état natif, ce peptide est lié à la partie N-terminale de la protéine par un pont disulfure (Cys3io-Cys329).
Tous les échantillons de FVII analysés présentent une ou plusieurs de ces formes tronquées. L'ensemble des formes identifiées résultent de coupures de type "serine protéase". Ces différents clivages peuvent donc être d'origine autocatalytique.
Exemple 4 : Quantification des clivages atypiques par séquencaqe d'Edman
Le séquençage N-terminal du FVII a été réalisé sur microséquenceur (Procise
491 HT ; Applied Biosystem) selon le principe de la dégradation chimique d'Edman qui consiste en trois étapes : couplage - clivage et conversion puis séparation des acides aminés générés sur colonne en phase inverse. Les acides aminés N-terminaux ainsi générés sont ensuite analysés et identifiés par l'intermédiaire d'acides aminés standards et comparés à la séquence théorique de la protéine étudiée. L'exploitation des résultats a été effectuée après acquisition des données et analyse par comparaison avec un chromatogramme d'acides aminés standards (SequencePro Applied Biosystems). La séquence de FVII analysée a été comparée à la séquence théorique en acides aminés.
2 séquences majoritaires ont été identifiées systématiquement :
- séquence N terminale LC : ANAFLEELRPGSLERECKEEQCSF (SEQ ID N°3)
- séquence N terminale HC : IVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCG (SEQ ID N°4)
3 autres séquences, présentes selon les produits, ont été identifiées :
- séquence LC : LFWISYSDGDQ (SEQ ID N°5) (clivage atypique après la lysine 38).
- séquence HC : G ATALELM VLN VP RLMTQ (SEQ ID N^Ô) (clivage atypique après l'arginine 290).
- séquence HC : KVGDSPΛ/ITEYMFCAGYSDGS (SEQ ID N°7) (clivage atypique après l'arginine 315).
Les acides aminés représentés en gras et italique indiquent des trous de séquence, c'est à dire des acides aminés non identifiés en séquençage d'Edman du fait de la présence de modifications post-traductionnelles telles que les D-carboxylation, N- ou O-glycosylation. Une évaluation quantitative a été réalisée afin d'estimer la proportion des différentes coupures atypiques en fonction des FVII. Les résultats sont présentés dans le tableau 1 ci-dessous :
Tableau 1. Pourcentages des différentes coupures atypiques comparativement à la totalité du produit, en fonction des origines du FVII. FVII-pd : FVII humain plasmatique ;
FVII-Tg : FVII humain non muté transgénique ; FVII-rec : FVII humain recombinant commercial non muté
Figure imgf000020_0001
La chaîne légère du FVII présente un taux de clivage atypique entre les acides aminés K38 et L39 variant entre 4,5 et 26% suivant l'origine du produit. La chaîne lourde du FVII présente une coupure atypique entre R315 et K316 (variant entre 9 et 52% suivant l'origine du produit) et est également clivée entre R290 et G291 (variant entre 4 et 13% suivant l'origine du produit) .

Claims

REVENDICATIONS
1 . Facteur Vll/Vlla humain modifié par rapport à la séquence peptidique du facteur Vll/Vlla humain natif dont au moins deux acides aminés sélectionnés parmi la lysine 38, l'arginine 290 et l'arginine 315 sont substitués ou délétés, caractérisé en ce que :
- ladite lysine 38 est substituée par un acide aminé choisi parmi la glutamine, l'alanine, l'acide glutamique, la glycine, lïsoleucine, la leucine, la méthionine, l'histidine, la phénylalanine, la praline, la serine, la thréonine, le tryptophane, la tyrosine ou la valine ;
- ladite arginine 290 est substituée par un acide aminé choisi parmi la glutamine, l'alanine, l'acide glutamique, l'asparagine, la glycine, lïsoleucine, la leucine, la méthionine, l'histidine, la phénylalanine, la praline, la serine, la thréonine, le tryptophane, la tyrosine ou la valine et/ou
- ladite arginine 315 est substituée par un acide aminé choisi parmi la glutamine, l'alanine, l'acide glutamique, l'asparagine, la glycine, lïsoleucine, la leucine, la méthionine, l'histidine, la phénylalanine, la praline, la serine, la thréonine, le tryptophane, la tyrosine ou la valine.
2. Facteur Vll/Vlla humain modifié selon la revendication 1 , caractérisé en ce que la lysine 38 est substitué par un acide aminé choisi parmi la glutamine, l'histidine ou l'acide glutamique.
3. Facteur Vll/Vlla humain modifié selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'arginine 290 est substitué par un acide aminé choisi parmi la glutamine, l'histidine, l'asparagine ou l'acide glutamique.
4. Facteur Vll/Vlla humain modifié selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'arginine 315 est substitué par un acide aminé choisi parmi la glutamine, l'histidine, l'asparagine ou l'acide glutamique.
5. Facteur Vll/Vlla humain modifié selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la lysine 38 est substituée par une glutamine.
6. Facteur Vll/Vlla humain modifié selon l'une quelconque des revendications 1 à
5, caractérisé en ce que l'arginine 290 est substituée par une glutamine.
7. Facteur Vll/Vlla humain modifié selon l'une quelconque des revendications 1 à
6, caractérisé en ce que l'arginine 315 est substituée par une glutamine.
8. Acide nucléique codant un facteur Vll/Vlla humain modifié défini par l'une quelconque des revendications 1 à 7.
9. Vecteur d'expression dans lequel est inséré un acide nucléique selon la revendication 8.
10. Cellule transformée par un acide nucléique selon la revendication 8 exprimant un facteur Vll/Vlla humain modifié.
1 1. Organisme non humain génétiquement modifié comprenant dans son génome un acide nucléique codant un facteur Vll/Vlla humain modifié selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, et exprimant ledit facteur Vll/Vlla humain modifié.
12. Organisme génétiquement modifié selon la revendication 1 1 , caractérisé en ce que ledit organisme génétiquement modifié est un microorganisme, un animal ou un végétal.
13. Organisme génétiquement modifié selon l'une des revendications 1 1 ou 12, caractérisé en ce que ledit organisme génétiquement modifié est un mammifère.
14. Organisme génétiquement modifié selon la revendication 13, caractérisé en ce que ledit mammifère est une lapine.
15. Organisme génétiquement modifié selon la revendication 1 1 ou 12, caractérisé en ce que ledit organisme génétiquement modifié est un insecte.
16. Procédé de fabrication d'un facteur Vll/Vlla défini par l'une quelconque des revendications 1 à 7 comprenant les étapes suivantes : a) transformation in vitro d'une cellule avec un acide nucléique codant pour un
FVII/Vlla humain modifié selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, b) mise en culture de la cellule obtenue à l'étape a) de manière à ce que la cellule exprime ledit facteur Vll/Vlla, et c) purification du facteur Vll/Vlla humain modifié exprimé par la cellule transformée mise en culture à l'étape b).
17. Procédé de fabrication d'un facteur Vll/Vlla humain modifié selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 dans le lait d'un mammifère non humain transgénique, comprenant les étapes suivantes : a) obtenir un mammifère transgénique qui exprime dans ses glandes mammaires un acide nucléique codant un facteur Vll/Vlla humain modifié selon l'une des revendicatins 1 à 7, b) collecter le lait du mammifère transgénique qui contient le facteur Vll/Vlla, c) purifier le facteur Vll/Vlla humain modifié à partir dudit lait collecté.
18. Procédé de fabrication selon la revendication 17, caractérisé en ce que l'animal transgénique est choisi parmi une souris, une rate, une chèvre et une lapine.
19. Procédé de fabrication selon la revendication 18, caractérisé en ce que l'animal transgénique est une lapine.
20. Composition de facteur Vll/Vlla, caractérisée en ce que ladite composition contient un facteur Vll/Vlla humain modifié défini par l'une quelconque des revendications 1 à 7.
21. Composition pharmaceutique comprenant un facteur Vll/Vlla humain modifié tel que défini par l'une quelconque des revendications 1 à 7, et un excipient et/ou un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
22. Utilisation d'un facteur Vll/Vlla selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 pour la fabrication d'un médicament.
23. Utilisation d'un facteur Vll/Vlla selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des désordres de la coagulation.
24. Utilisation d'un facteur Vll/Vlla selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des traumatismes hémorragiques multiples.
25. Utilisation d'un facteur Vll/Vlla d'une quelconque des revendications 1 à 7 pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement de l'hémophilie.
26. Utilisation d'un facteur Vll/Vlla d'une quelconque des revendications 1 à 7 pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des hémorragies causées par un surdosage d'anticoagulant.
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