WO2008136451A1

WO2008136451A1 - スフィンゴミエリナーゼ

Info

Publication number: WO2008136451A1
Application number: PCT/JP2008/058159
Authority: WO
Inventors: Hitomi Yamaguchi; Akiko Sakoda; Misa Shiihara; Yugo Iwasaki
Original assignee: Nagase & Co., Ltd.; Nagase Chemtex Corporation; National University Corporation Nagoya University
Priority date: 2007-04-27
Filing date: 2008-04-21
Publication date: 2008-11-13
Also published as: JP5302189B2; JPWO2008136451A1

Abstract

本発明によれば、新規なスフィンゴミエリナーゼおよびその製造方法が提供される。本発明のスフィンゴミエリナーゼは、（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ該加水分解活性を示すポリペプチド；または（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも75％の相同性を有し、かつ該加水分解活性を示すポリペプチドからなる。１つの実施態様では、本発明の酵素は、スフィンゴミエリンを基質としたときのpH10で37℃にて10分間の加水分解活性を100％とした場合に、pH8からpH12の範囲内で50％以上の加水分解活性を示す。

Description

スフインゴミエリナーゼ

技術分野

本努明は、新規なスフインゴミエリナーゼおよびその製造方法に関する。

明背景技術田

スフインゴミエリナーゼは、スフインゴミエリンに作用し、セラミドとホスホリルコリンとを生成する酵素であり、酵素番号 E. C. 3. 1. 4. 12として知られている。近年、ノチルス 'セレウス（Bacillus cereus) 由来のスフィンゴミエリナーゼの立体構造が解明され、その触媒メカニズムの研究は、動物細胞のスフインゴミエリナ一ゼが闋与するといわれる細胞の分化、老化、アポトーシスの解明にも重要であると考えられている（ヒデォァゴゥ（Hi deo Ago) ら，ジャーナル.ォブ 'バイオロジカル 'ケミストリー（J. Biol.

Chem. ) , 2006年， 281卷（23号）， pp. 16157-16167) 。また、スフインゴミエリンからスフインゴミエリナーゼによって生成されるセラミドは、皮膚の角質層にある脂質で、肌の保湿に重要な成分であり、化粧品の基材としても知られている。また、セラミドはアトピー性皮膚炎との関連も注目されており、その治療薬としての開発も期待される。

スフインゴミエリナーゼは、種々の動物組織、脳、肺、肝、腎、副腎、脾、精巣、胎盤などに存在する。

細菌由来では、バチルス 'セレウス（Bacillus cereus) (ヒロオィケザヮ (HIROH IKEZAWA) ら，バイオキミ力 ·ェ ·パイオフイジ力 .ァクタ (B iochim. Biophys. Acta. ) ， 1978年， 528卷， pp. 247-256) 、スタフイロコッカス 'ォーレウス (Staphylococcus aureus) (ヘイゼノレェム. ドウリ一 (HAZEL M. DOERY) ら，ジャーナル ·ォブ ·ジェネラル ·マイクロバイオロジー（J. Gen. Microbiol. ) ， 1965年， 40卷， pp. 283- 296) 、リステリァ ·イワノヴィ (Listeria ivanovii) (ブルーノゴンザレスーゾルン（B runo Gonzalez - Zorn) ら，モレキュラー ·マイクロノィォロシー (Mol. Mic robiol. ) , 1999年， 33卷， pp. 510-523) 、レプトスビラ ·インテロガンス (Leptospira interrogans) (ノレウドピー. エイ. ェム. セガース (RUUD P. A. M. SEGERS) ら，インフエクシヨン 'アンド 'イミュ-ティー（Infect. Immune. ) ， 1990年， 58卷， pp. 2177— 2185) 、へリコパクター ' ピロリ（He licobacter pylori; (づノレ一チュンチャン (Err— Cheng Chan) ら，ノづオケミストリー（Biochemistry) , 2000年， 39卷， pp. 4838-4845) 、シユー rモナス属 (Pseudomonas sp. ) 、ノリユキスェヨン (Noriyuki Sueyosh i) ら，ジャーナル ·ォブ ·バクテリォロジ一 (J. Bacteriol. ) ， 2002年， 184卷（2号）， pp. 540-546) 、ストレプトマイセス属（Streptomyces sp. ) (ケイタロウスズキ (Keitarou SUZUKI) ら，バイオサイエンス ·バイオテクノロジー . アンド 'バイオケミストリー (Biosci. Biotech. Bioche m. ) ， 1995年， 59卷（11号）， pp. 2081- 2086、特開昭 5 8— 4 3 7 8 6号公報）などに見出されている。このうち、バチルス 'セレウス（Bacillus cer eus) (アキヒロヤマダ（Akihiro YAMADA) ら，ョ一口ピアン 'ジャーナル ·ォプ ·バイオケミストリー（Eur. J. Biochem. ) ， 1988年， 175卷， p. 213-220) 、スタフイロコッカス -オーレウス (Staphylococcus aureus)

(デイビッドシー. コーノレマン（David Coleman) ら，マイクロバイァル'パソジヱネシス（Microb. Pathog. ) , 1986年， 1卷， pp. 549-564) 、リステリア 'イワノヴィ（Listeria ivanovii) (ブゾレーノゴンザレスーゾルン (Bruno Gonzalez - Zom) ら，モレキュラー ·マイクロバイォロジー (M ol. Microbiol. ) , 1999年， 33卷， pp. 510- 523) 、レプトスピラ 'インテロガンス (Lentospira interrogans) (ノレウドピー. エイ. ェム. セガース (RUUD P. A. M. SEGERS) ら，インフエクシヨン 'アンド -イミュニティー (Infect. Immune. ) , 1990年， 58卷， pp. 2177- 2185) 、およびシユードモナス属 (Pseudomonas sp. ) (ノリユキスェヨシ (Noriyuki Sueyos i) らジャーナル ·ォブ 'パクテリォロジ一（J. Bacterid. ) ， 2002年， 184卷 (2号）， pp. 540-546) 由来のスフインゴミエリナーゼは、それらの遺伝子がクローニングされており、アミノ酸配列も解明されている。

また、クロストリジゥム ·ぺ /レフリンゲンス（Clostridium perfringen s) (ヨシオャマカヮ (Yoshio YAMAKAWA) ら，ジャーナル'ォブ 'バイオケミストリー（J. Biochem. ) , 1977年， 81卷， pp. 115-126) 、クロストリジゥム ·ノヴィ（Clostridium novyi) (リヨウタグチ（RY0 TAGUCHI) らバイォキミカ ·ェ ·バイオフィジカ 'ァクタ（Biochim. Biop ys. Acta. ) 1975年， 409卷， pp. 75- 85およぴリヨウタグチ（Ryo TAGUCHI) ら，ジャーナル ·ォブ ·パイオケミストリー (J. Biochem. ) , 1977年， 82卷， pp. 12 17-1223) 、ストレプトマイセス ·ノヽチジョゥェンシス (Streptomyces hach ijoensis) (現ストレプトマイセス . シンナモネウス (Streptomyces cinna moneus) ) (ヨシオォォカヮ（Yoshio 0KAWA) ら，ジャーナル ·ォブ ·バィォケミストリー（J. Biochem. ) ， 1975年， 78卷， pp. 537- 545) 由来のホスホリパーゼ Cが、スフインゴミエリナーゼ活性を有することが知られている。

さらに、サリニスポラ ' トロピカ（Salinispora tropica) およぴサリニスポラ ·ァレニコラ (Salinispora arenicola) のスフインゴミエリナーゼの遺伝子が報告されているが、その性質は明らかではない。

スフインゴミエリナーゼを産業上利用するにあたっては、動物,袓織由来ではスフインゴミエリナーゼを大量生産することは困難であり、細菌由来が望ましいと考えられる。しかし、スフインゴミエリ^ "一ゼを生成する細菌のなかには、病原性が指摘されているものが多く、その応用範囲が限定されかねなレ、。発明の開示

本発明は、新規なスフインゴミエリナーゼおよびその製造方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、新規なスフインゴミエリナーゼを得ることを目的として、該酵素を生産する微生物を検索した結果、ストレプトマイセス（Streptomyc es) 属に属する微生物から新規な性質を有するスフインゴミエリナ一ゼを見出した。

さらに本発明者らは、該酵素をコードする遺伝子をクローエングし、その構造を明らかにして、この遺伝子が新規な遺伝子であることを確認した。また、この遺伝子を用いて発現プラスミドを構築し、ストレプトマイセス（St reptomyces) 属に属する微生物を形質転換することにより、該酵素を効率よく生産する微生物を得た。

本発明は、スフインゴミエリンに作用し、該スフインゴミエリンを加水分解してセラミドおよびホスホリルコリンを生成する酵素を提供し、この酵素は、以下の（a ) から（c ) のいずれかに記載のポリペプチドからなる： ( a ) 配列番号 2に記載のァミノ酸配列を有するポリぺプチド；

( ) 配列番号 2に記載のァミノ酸配列において、 1もしくは複数個のァミノ酸が置換、挿入、欠失および Zまたは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ該加水分解作用を示すポリべプチド；または

( c ) 配列番号 2に記載のァミノ酸配列と少なくとも 75%の相同性を有し、かつ該加水分解作用を示すポリぺプチド。

1つの実施態様では、上記酵素は、スフインゴミエリンを基質としたときの pHIOで 37°Cにて 10分間の加水分解活性を 100%とした場合に、 pH8から pH12 の範囲内で 50%以上の加水分解活性を示す。別の実施態様では、上記酵素は、 pHIOで 37。Cにて 10分間のスフインゴミエリンに対する加水分解活性を 100%とした場合にホスファチジルコリン（P C) 、ホスファチジルイノシトール（PI) 、ホスファチジン酸（PA) 、ホスファチジルェタノールァミン（PE) 、ホスファチジルグリセ口ール（PG) 、およぴホスファチジルセリン (PS) に対する活性が 5 %未満である基質特異性を有する。

別の実施態様では、上記酵素は、等電点が 6. 1である。

さらに別の実施態様では、上記酵素は、 SDS-PAGEで測定した場合の分子量力 ¾5, 000であり、そしてァミノ酸組成より分析した場合の分子量が 32, 000である。

なお別の実施態様では、上記酵素は、ストレプトマイセス (Streptomyce s) 属に属する微生物に由来する。

本発明はまた、上記酵素をコードするポリヌクレオチドを提供する。

1つの実施態様では、上記ポリヌクレオチドは、以下の（a ) から（c ) のいずれかに記載のポリヌクレオチドである：

( a ) 配列番号 1に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；

( ) 配列番号 1に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジヱントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド；または

( c ) 配列番号 1に記載の塩基配列と少なくとも 80%の配列同一性を有するポリヌクレオチド。

別の実施態様では、上記ポリヌクレオチドは、ストレブトマイセス（Stre ptomyces) 属に属する微生物に由来する。

本発明はさらに、上記ポリヌクレオチドを含むべクタ一を提供する。

本発明はさらに、上記ポリヌクレオチドまたは上記ベクターが導入され、スフインゴミエリンからセラミドとホスホリルコリンを生成する酵素を産生する能力を保有する形質転換体を提供する。 1つの実施態様では、上記形質転換体の宿主は、ストレプトマイセス（St reptomyces) 属に属する微生物である。

本発明はさらに、スフインゴミエリンに作用し、該スフインゴミエリンを加水分解してセラミドおよびホスホリルコリンを生成する酵素を製造する方法を提供し、この方法は、

上記ポリヌクレオチドまたは上記べクタ一を宿主に導入して、該酵素を産生する形質転換体を得る工程；および該形質転換体を培養して該酵素を産生させる工程を含む。

1つの実施態様では、上記宿主は、ストレブトマイセス（Streptomyces) 属に属する微生物である。

本発明によれば、新規なスフインゴミエリナーゼが提供される。さらに、該酵素を微生物によって効率よく生産する方法が提供される。図面の簡単な説明

図 1は、ス卜レプ卜マイセス · シンナモネウス (Streptomyces cinnamone us) 培養液からの精製画分の SDS- PAGE解析の結果を示す電気泳動写真である。図 2は、 pHが 10である場合の酵素活性を基準とした、種々の pHでのストレプトマイセス ' シンナモネウス（Streptomyces cinnamoneus) 由来精製酵素のスフインゴミエリナーゼ活性を示すグラフである。

図 3は、反応温度が 37°Cである場合の酵素活性を基準とした、種々の温度でのストレプトマイセス · シンナモネウス (Streptomyces cinnamoneus) 由来精製酵素のスフインゴミエリナーゼ活性を示すグラフである。

図 4は、種々の温度での処理後のストレプトマイセス · シンナモネウス (Streptomyces cinnamoneus) 由来精製酵素の残存活性を示すグラフである。図 5は、ストレプトマイセス · シンナモネウス (Streptomyces cinnamone us) からクロー-ングしたスフインゴミエリナーゼ遺伝子のコア領域の塩基配列を示す図である。

図 6は、ストレプトマイセス · シンナモネウス（Streptomyces cinnamone us) 由来スフインゴミエリナーゼ遺伝子を含む領域の塩基配列および構造遺伝子についての推定アミノ酸配列を示す図である。

発明を実施するための最良の形態

本発明において、酵素とは、精製酵素に限定されず、粗精製物、固定化物なども含む。酵素の精製は、例えば、微生物の培養液を用いて、硫安沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィーなどの、当業者に周知の方法を用いて行われ、種々の精製度の酵素（ほぼ単一までに精製された酵素を含む）が得られ得る。

本発明において、微生物とは、野性株、変異株（例えば、紫外線照射などにより誘導される）、あるいは細胞融合もしくは遺伝子組換え法などの遺伝子工学的手法により誘導される組換え体などのレ、ずれの株であってもよい。組換え体などの遺伝子操作された微生物は、例えば、 Molecular Cloning A Laboratory Manual, 第 2版 (Sambrook, J.ら編、 Cold Spring Harbor Labo ratory Press, 1989) に記載されるような、当業者に公知な技術を用いて容易に作成され得る。微生物の培養液とは、微生物菌体を含む培養液、および遠心分離などにより微生物菌体を除いた培養液の両方を意味する。

(スフインゴミエリナーゼ）

本発明は、スフインゴミエリンに作用し、該スフインゴミエリンを加水分解してセラミドおよびホスホリルコリンを生成する酵素（スフインゴミエリナーゼ）を提供する。

本発明のスフインゴミエリナーゼの活性は、例えば、以下のようにして確認され得るが、確認方法はこれに限定されない。酵素を、まず 2mg/mlの卵黄由来スフインゴミエリン（Sigma製）を含む 20m M グリシン一水酸化ナトリウム緩衝液（ρΗΙΟ. Ο) に添加し、これを 37°Cで 10 分間インキュベートして、スフインゴミエリンを加水分解する。次いで、沸騰水中で 5分間加熱することにより上記酵素を失活させ、その上清の 1/50量を分取する。分取した上清に、 50mM グリシン一水酸化ナトリウム緩衝液 (p H9. 6) 、 ImM塩化マグネシウム、および 0. 1ユニット/ mlの子ゥシ腸由来アルカリホスファターゼ（タカラバイオ社製）からなる溶液を 4倍量で加え、 3 7°Cで 30分間ィンキュベートし、生成したホスホリルコリンからリン酸を遊離させる。さらに、その遊離リン酸を定量するために、 9倍量の BI0MOL GREE N Reagent for Phosphate Detection (BI0M0L Research Laboratories, Inc 製）を添加し、室温で 30分間放置後、波長 620nmの吸光度を測定する。この場合、スフインゴミエリナーゼの酵素量は、リン酸を標準試料として比色定量し、上記条件において 1分間に l / molのリン酸を生成する酵素量を 1ュニットとする。

本酵素は、例えば、緩衝液としてトリスー塩酸緩衝液（pH7〜9) およびグリシン一水酸化ナトリウム緩衝液（pH9〜： L3) を用いて上記のスフインゴミエリンと酵素との反応条件下におくと、その pH範囲内（pH7〜13) でスフィンゴミエリ > ~一ゼ活性を示し得る。至適 pHは pH8〜： 12. 5の範囲内にあり得る。好ましくは至適 pHが 9〜12の範囲内にあり、より好ましくは 10〜11の範囲内にあり、さらに好ましくは 10付近である。本発明の酵素は、例えば、上記のようにスフインゴミエリンと酵素とを 37°Cにて 10分間反応させた条件下で pH 10における加水分解活性を 100%とした場合、 pH8から pH12の範囲内で 50%以上の活性を示し得る。

本酵素は、例えば、上記のスフインゴミエリンと酵素との反応条件下では、約 20〜40°Cで作用し得る。至適温度は、この範囲内にあり得る。好ましくは約 30〜40°Cの範囲内にあり、より好ましくは 35〜40°Cの範囲内にあり、さらにより好ましくは約 37°Cである。

本酵素は、例えば、 50raM トリスーマレイン酸緩衝液 (pH7. 0) で 30分間処理した場合、 4°Cから 45°Cまででは、ほぼ活性の低下が見られず安定であり得、そして 50°Cでも 70%程度の活性が残存している。

本酵素は、例えば、緩衝液としてトリスー塩酸緩衝液（pH8. 0) を用いて上記のスフインゴミエリンと酵素溶液との反応条件下におくと、 ImMの M g ² +、 M n ^{2 +}、および C o ^{2 +}で活性が促進され得るが、 ImMの Z n ^{2 +}、 F e ^{3 +}、 A 1 ^{3 +}、および EDTAで活性が阻害され得る。

本酵素は、 pHIOの条件下で該酵素と基質とを 37°Cにて 10分間反応させた場合、スフインゴミエリンが基質である場合に対する加水分解活性を 100%とすると、ホスファチジルコリン（PC) 、ホスファチジルイノシトール（PI) 、ホスファチジン酸 (PA) 、ホスファチジノレエタノーノレアミン（PE) 、ホスファチジルグリセロール（PG) 、またはホスファチジルセリン（PS) を基質とした場合に対する活性が 5 %未満である基質特異性を有し得る。

本酵素は、電気泳動条件などにより若干変化し得るが、例えば、ストレブ卜マイセス · シンナモネウス (Streptomyces cinnamoneus) NBRC12782由来の天然の酵素は、 SDS - PAGEにおける分子量が約 35, 000ダルトンを示す。このス卜レプ卜マイセス - シンナモネウス (Streptomyces cinnamoneus) NBRC12 782由来の天然の酵素は、そのアミノ酸組成から計算した分子量は約 32, 000 ダルトンである。

本酵素は、泳動条件などにより若干変化し得るが、例えば、ストレブトマイセス · シンナモネウス (Streptomyces cinnamoneus) NBRC12782由来の天然の酵素は、 Phastgel IEF3- 10 (GEヘルスケアバイオサイエンス社製) を用いた等電点電気泳動法により、 6. 1の等電点を示す。

本発明のスフインゴミエリナーゼは、好ましくは配列番号 2の 1位から 33

3位までのアミノ酸配列（本明細書では、「配列番号 2に記載のァミノ酸配列」ともいう）を有する。本酵素は、スフインゴミエリナーゼ活性（例えば、スフインゴミエリンを加水分解する活性；以下も同様である）を有する限り、配列番号 2に記載のァミノ酸配列に対して 1または複数のァミノ酸が、置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列を有する酵素であっても良い。当業者であれば、例えば、部位特異的変異導入法（Nucleic Acid Re s. , 1982年， 10卷， pp. 6487 ; Methods in Enzymol. , 1983年， 100卷， pp. 44 8 ; Molecular Cloning ： A Laboratory Manual, 第 2版, Cold Spring Harbo r Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. 1989年； PCR ： A Practical Appr oach, IRL Press, 1991年， pp. 200) などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および Zまたは付加変異を導入することにより、タンパク質の構造を改変することができる。本発明において、置換、欠失、挿入、および zまたは付加することができるアミノ酸残基数は、通常 50以下、例えば 30以下、あるいは 20以下、好ましくは 16以下、より好ましくは 5以下、さらに好ましくは 0〜3 である。また、アミノ酸の変異は、人工的に変異させた酵素のみならず、自然界において変異した酵素も、スフインゴミエリナーゼ活性を有する限り、本発明のスフインゴミエリナーゼに含まれる。

配列番号 2に記載のァミノ酸配列に対して相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質も、スフインゴミエリナーゼ活性を有する限り、本発明のスフインゴミエリナーゼに含まれる。本発明のスフインゴミエリナーゼは、好ましくは、配列番号 2に記載のァミノ酸配列と少なくとも 75%、好ましくは少なくとも 80%、より好ましくは少なくとも 85%、なおより好ましくは少なくとも 90%、さらにより好ましくは少なくとも 95%、さらにより好ましくは少なくとも 99%の相同性を有するァミノ酸配列を有するタンパク質であり得る。タンパク質の相同性の（ホモロジ一）検索は、例えば SWISS - PR0T、 PI R、 DADなどのタンパク質のアミノ酸配列に関するデータベース、または DDBJ、 EMBL、あるいは Gene- Bankなどの DNAデータベースなどを対象に、 BLAST、 FAS TAなどのプログラムを利用して、例えば、インターネットを通じて行うことができる。タンパク質の活性の確認は、上記に記載の手順を利用して行い得る。

本発明のスフインゴミエリナーゼの供給源は特に限定されないが、微生物などの生体細胞から得ることができる。そのような微生物としては、ストレプトマイセス（Streptomyces) 属に属する微生物が挙げられる。好ましくはス卜レプ卜マイセス · シンナモネウス (Streptomyces cinnamoneus) NBRC12 782が挙げられる。

例えば、上記ストレプトマイセス · シンナモネウス（Streptomyces cinna moneus) NBRC12782は適当な栄養培地で液体培養することにより該酵素を菌体外に分泌するので、その培養上清を凍結乾燥、塩析、有機溶媒などにより処理したものをスフインゴミエリナーゼ酵素製剤として製造することができる。

スフインゴミエリナーゼ酵素製剤の製造に用い得る微生物は、ストレプトマイセス · シンナモネウス（Streptomyces cinnamoneus) NBRC12782に限られるものではなく、ストレプトマイセス属に属しかつ本発明のスフィンゴミエリナーゼを生産し得る微生物であればよい。また、それらの生物種の天然または人為的変異株や、スフインゴミエリナーゼ活性の発現に必要な遺伝子断片を人為的に取り出し、それを組み入れた他の生物種であっても本発明に用いることができる。

ストレプトマイセス · シンナモネウス（Streptomyces cinnamoneus) NBRC 12782を用いたスフインゴミエリナーゼ酵素製剤を例に挙げて、その製造について説明する。本菌は栄養培地で液体培養することにより該酵素を菌体外に分泌するので、その培養上淸を凍結乾燥、塩析、有機溶媒などにより処理する、あるいはこの処理物を固定化するなどして酵素製剤を製造することができる。さらに具体的に説明すると、本菌を適当な培地、例えば適当な炭素源、窒素源、無機塩類を含む培地中で培養し、該酵素を分泌させる。ここで炭素源としては、澱粉および澱粉加水分解物、グルコース、シユークロースなどの糠類、グリセロールなどのアルコール類、および有機酸（例えば、酢酸おょぴクェン酸）またはその塩（例えば、ナトリウム塩）などが挙げられる。窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスチープリカー、大豆粉などの有機窒素源および硫酸アンモニゥム、硝酸アンモニゥム、尿素などの無機窒素化合物挙げられる。無機塩類としては、塩化ナトリウム、リン酸 1カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガン、塩化カルシウム、硫酸第 1鉄などが挙げられる。炭素源の濃度は、例えば 1〜20% (w/v) 、好ましくは 1〜： L0% (w/v) の範囲である。窒素源の濃度は、例えば 1〜20% (w/ V) 、好ましくは 1〜10% (w/v) の範囲である。培養温度は、上記の酵素が安定であり、そして培養される微生物が十分に生育できる温度であり、好ましくは 20〜37°Cである。培養時間は、上記酵素が十分に生産される時間であり、好ましくは 1〜 7日間程度である。培養は、好ましくは、好気的な条件下で、例えば、通気攪拌または振とうしながら行うことができる。

本発明のスフインゴミエリナーゼは、タンパク質の溶解度による分画（有機溶媒による沈殿や硫安などによる塩析など）；陽イオン交換、陰イオン交換、ゲルろ過、疎水性クロマトグラフィー；キレート、色素、抗体などを用いたァフィ二ティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適当に組み合わせることにより精製することができる。例えば、上記微生物の培養上清を回収した後、硫安沈殿、さらに陰イオン交換クロマトグラフィーを繰り返し行うことによりポリアクリルァミド電気泳動（SDS - PAGE) において、ほぼ単一パンドにまで精製することができる。 (スフインゴミエリナーゼをコードするポリヌクレオチド）

上記スフインゴミエリナ一ゼをコ一ドするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。本発明のポリヌクレオチドは、 DNA、 RNAなどの天然のポリヌクレオチドに加え、人工的なヌクレオチド誘導体を含む人工的な分子であり得る。また、本発明のポリヌクレオチドは、 DNA - RNAのキメラ分子であり得る。本発明のスフインゴミエリ"^ "一ゼをコードするポリヌクレオチドは、例えば、配列番号 1の 1位から 999位までの塩基配列（本明細書では、「配列番号 1に記載の塩基配列」ともいう）を有する。配列番号 1に記載の塩基配列は、配列番号 2に記載のァミノ酸配列を含むタンパク質をコードしており、このアミノ酸配列を含むタンパク質は、本発明のスフインゴミエリナーゼの好ましい形態を構成する。

本発明のスフインゴミエリナ一ゼをコ一ドするポリヌクレオチドとしては、上記のような配列番号 2に記載のァミノ酸配列に 1または複数のァミノ酸が置換、欠失、揷入、および Zまたは付加したアミノ酸を含み、かつスフインゴミエリナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドもまた挙げられる。当業者であれば、配列番号 1に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドに部位特異的変異導入法（上述）などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および Zまたは付加変異を導入することによりポリヌクレオチドのホモログを得ることが可能である。

本発明のスフインゴミエリナ一ゼをコ一ドするポリヌクレオチドとしてはまた、配列番号 1に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジヱントな条件でハイブリダイズでき、かつスフインゴミエリナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドもまた挙げられる。

本発明のポリヌクレオチドは、本明細書中に記載した塩基配列情報に基づいて、目的とする遺伝子を、上記微生物（例えば、ストレプトマイセス（St reptomyces) 属に属する微生物、好ましくは、ストレプトマイセス · シンナモネウス (Streptomyces cinnamoneus) NBRC12782) カら取得することカできる。遺伝子の取得には、 PCRやハイブリダィズスクリーニングが用いられる。また、 DNA合成によって遺伝子の全長を化学的に合成することもできる。上記塩基配列情報に基づいて、上記以外の生物に由来する上記スフィンゴミェリナーゼをコードするポリヌクレオチドを取得することもできる。例えば、上記塩基配列もしくはその一部の塩基配列を用いてプローブを設計し、他の生物から調製した DNAに対してストリンジェントな条件下でハイブリダィゼーションを行うことにより、種々の生物由来のスフインゴミエリ"^ "一ゼをコードするポリヌクレオチドを単離することができる。上記塩基配列情報に基づいて、 DNA Databank of Japan (DDB J)、 EMBL_N Gene - Bankなどの腿に関するデータベースに登録されている配列情報を用いてホモロジ一の高い領域から PCR用のプライマーを設計することもできる。このようなプライマーを用レ、、染色体 DNAもしくは cDNAを铸型として PCRを行うことにより、上記スフィンゴミエリナ一ゼをコ一ドするポリヌクレオチドを種々の生物から単離することもできる。

ストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドとは、配列番号 1に記載の塩基配列中の少なくとも 20個、好ましくは少なくとも 30 個、例えば、 40個、 60個、または 100個の連続した配列を 1つまたは複数選択してプローブを設計し、例えば ECL direct nucleic acid labeling and d etection system (GE Healthcare社製）を用いて、マニュアルに記載の条件 (例えば、洗浄条件： 42°C、 0. 5 X SSCを含む primary wash buffer) におレヽて、ハイプリダイズするポリヌクレオチドを指す。

より具体的には、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、通常、 42°C、 2 X SSC、 0. 1% SDSの条件であり、好ましくは 50°C、 2 X SSC、 0. 1% SDSの条件であり、さらに好ましくは 65。C、 0. 1 X SSCおよび 0. 1% SDSの条件である力これらの条件に特に制限されるものではない。ハイブリダィゼーシヨンのストリンジヱンシ一に影響する要素としては、温度や塩濃度など複数の要素があり、当業者であればこれら要素を適宜選択することで最適なストリンジエンシーを実現することが可能である。

さらに、本発明のスフインゴミエリナ一ゼをコ一ドするポリヌクレオチドとしては、配列番号 2に記載のァミノ酸配列と少なくとも 75%、好ましくは少なくとも 80%、より好ましくは少なくとも 85%、なおより好ましくは少なくとも 90%、さらにより好ましくは少なくとも 95%、さらにより好ましくは少なくとも 99%の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつスフインゴミエリナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。タンパク質の相同性（ホモロジ一）検索は、上で説明したとおりである。また、本発明のスフインゴミエリナ一ゼをコ一ドするポリヌクレオチドとしては、配列番号 1に記載の塩基配列と少なくとも 80%、好ましくは少なくとも 85%、より好ましくは少なくとも 90%、なおより好ましくは少なくとも 95%、さらにより好ましくは少なくとも 99%の配列同一性を有する塩基配列を有し、力つスフインゴミエリナーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチドもまた挙げられる。塩基配列の配列同一性の決定おょぴ検索についても、上で説明したとおりである。

上記スフインゴミエリナーゼをコードするポリヌクレオチドは、遺伝子組換え技術を用いて、同種もしくは異種の宿主中で発現され得る。 (ベクタ一および形質転換体）

本発明によれば、上記ポリヌクレオチドを含むベクターも提供される。また、上記ポリヌクレオチドまたは上記ベクターを宿主に導入することにより、スフインゴミエリンからセラミドおよびホスホリルコリンを生成する酵素を産生する能力を保有する形質転換体を作製することもできる。

形質転換体の作製のための手順および宿主に適合した組換えベクターの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、 Sambrookら、 Molecular Cloning ： A Laboratory Manual第 2版、 Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989年参照）。特に放線菌に関しては、「PMCTICAL STREPT0 MYCES GENETICS (Kieserら、 John Innes Foundation, 2000年）」を参照して行うことができる。微生物中で、本発明のスフインゴミエリ^ ^一ゼをコ一ドするポリヌクレオチドを発現させるためには、まず微生物中で安定に存在するプラスミドベクターやファージベクターにこの DNAを導入し、その遺伝情報を転写 ·翻訳させる。そのために、転写 ·翻訳を制御するュニットにあたるプロモーターを本発明の DNA鎖の 5'側上流に、より好ましくはターミネ一ターを 3'側下流に、それぞれ組み込めばよい。このプロモーターおよぴタ一ミネ一ターとしては、宿主として利用される微生物中において機能することが知られているプロモーターおよびターミネータ一が用いられる。これらの各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネータ一などに関しては、「微生物学基礎講座 8 遺伝子工学、共立出版」、特に放線菌に関しては、「PRACTICAL STREPT0MYCES GENETICS (Kieserら、 John In nes Foundation, 2000年) J などに詳細に記述されている。

形質転換の対象となる宿主は、上記スフインゴミエリナーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターにより形質転換されて、スフインゴミエリ i "一ゼ活性を発現することができる生物であれば特に制限はない。例えば、ェシエリヒア（Escherichia) 属、パチノレス（Bacillus) 属、シユードモナス（Pseudomonas) 属、セラチア（Serratia) 属、ブレビバタテリゥム（Bre vibacterium) 属、コリ不ノクテリゥム (Corynebacterium) 属、ストレプトコッカス (Streptococcus) 属、ラク卜バチルス (Lactobacillus) 属など宿主ベクター系の開発されている細菌；ロドコッカス（Rhodococcus) 属、ストレプトマイセス（Streptomyces) 属など宿主ベクター系の開発されている放線菌；サッカロマイセス（Saccharomyces) 属、クライべロマイセス（Klu yveromyces) 属、シゾサッカロマイセス (Schizosaccharomyces) 属、チゴサッカロマイセス (Zygosaccharomyces) 、ャロウィァ (Yarrowia) 属、卜ジ =tスポ t3ン (Trichosporon) 属、口ド、スポジジクム (Rhodosporidium; 属、ピキア（Pichia)属、キャンディダ（Candida)属などの宿主ベクター系の開発されている酵母；ノイロスポラ（Neurospora) 属、ァスペルギルス（As pergillus) 属、セファロスポリゥム（Cephalosporium) 属、トリコデノレマ (Trichoderma) 属などの宿主ベクター系の開発されているカビなどが挙げられる。遺伝子組換えの操作の容易性からは大腸菌が好ましく、遺伝子の発現の容易性からは放線菌が好ましい。

また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主'ベクター系が開発されており、例えば、蚕などの昆虫（Nature 315, 592 594 (1985) ) や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種蛋白質を発現させる系が開発されており、これらを利用してもよい。

得られた形質転換体は、上記のように酵素製剤の製造に用いることができる。具体的には、形質転換体を適当な栄養培地で液体培養して、発現したスフインゴミエリナーゼを細胞外に分泌させ、その培養上清を凍結乾燥、塩析、有機溶媒などにより処理してスフインゴミエリナーゼ酵素製剤を製造することができる。宿主細胞に依存して培養条件は変動し得るが、培養は、同業者が通常用いる条件下で行われ得る。例えば、ストレプトマイセス（Streptom yces) 属のような放線菌を宿主として用いる場合、チォストレプトンを含むトリプチックソィ培地（例えば、べクトン 'ディッキンソン社製）が用いられ得る。形質転換体により産生された酵素は、上述のようにしてさらに精製され得る。

実施例

以下の実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

(スフインゴミエリナーゼの酵素活性の測定方法）

本実施例において、酵素活性の測定は、基本的には、以下のように行つた：

まず 2mg/naの卵黄由来スフインゴミエリン（Sigma製）および酵素溶液を含む 20mM グリシン〜水酸化ナトリウム緩衝液 (ρΗΙΟ. 0) を、 37°Cで 10分間インキュベー卜して、スフインゴミエリンを加水分解した。次いで、沸騰水中で 5分間加熱することにより上記酵素を失活させ、その上清の 1/50量を分取した。分取した上清に、 50mM グリシン一水酸化ナトリウム緩衝液（pH9.

6) 、 ImM塩化マグネシウム、および 0. 1ユニット/ mlの子ゥシ腸由来アル力リホスファターゼ（タカラバイオ社製）からなる溶液を 4倍量で加え、 37°C で 30分間インキュベートし、生成したホスホリルコリンからリン酸を遊離させた。さらに、その遊離リン酸を定量するために、 9倍量の BIOMOL GREEN Re agent for Phosphate Detection (B丄 0M0L Research Laboratories, Inc^) を添加し、室温で 30分間放置後、波長 620nmの吸光度を測定した。なお、本実施例のスフインゴミエリナーゼについては、リン酸を標準試料として比色定量し、上記条件において 1分間に l w molのリン酸を生成する酵素量を 1ュ- ットとした。

(実施例 1 ：ストレプトマイセス · シンナモネウス（Streptomyces cinna moneus) 由来酵素の精製）

( a ) 培養

ポリペプトン（日本製薬製） 1% / 、肉エキス（鰹由来、和光純薬製） 1 % (w/v)、グルコース 1 % (w/v)、および塩化ナトリウム 0. 3 % (w/v)からなる培地 4Lを調製し、 3L容バッフル付き三角フラスコに 500mlずつ分注して、 12 1°Cで 20分間蒸気殺菌を行った。予め「Genetic Manipulation of Streptomy ces. A Laboratory Manual.」 DA Hop ood, MJ Bibb, KF Chater, T Kieser, CJ Bruton, HM Kieser, DJ Lydiate, CP Smith, JM Wardおよび H Schrempf, 出版元 The John Innes Foundation, 1985年の方法で調製しておいたストレプ卜マイセス · シンナモネウス (Streptomyces cinnamoneus) NBRC12782

(独立行政法人製品評価技術基盤機構より入手）の胞子懸濁液を 0. 1mlずつ接種し、 30°Cで 60時間振とう培養した。この培養液を ADVANTEC製 No2濾紙を用いて濾過することにより、上清を回収した。 ( b ) 硫安分画

( a ) で回収した培養上清に 30% (w/v)飽和となるように硫酸アンモニゥムを添加し、生じた沈殿を遠心分離（7500rpm、 30分、 4°C) により除去した。さらに、該溶液に 60% (w/v)飽和となるように硫酸ァンモニゥムを添加し、生じた沈殿を遠心分離（7500r_Pm、 30分、 4°C) により集めた。この沈殿を 20 mM トリスー塩酸緩衝液（pH8. 0) 60mlに溶解し、同一緩衝液で透析し、粗酵素液を得た。

( c ) DEAE- Toyopearl力ラムクロマトグラフィー

( b ) で得られた粗酵素液を、 20πιΜ トリスー塩酸緩衝液 (ρΗ8. 0) で予め平衡化した DEAE- Toyopearl 650Mカラム（内径 26mm、高さ 200mm、東ソ一社製）にアプライした。同緩衝液でカラムを洗浄した後、塩化ナトリウム（0M から 0. 8Mまで）のリニアグラジヱントにより、活性画分を溶出させた。

( d ) RESOURCE Qカラムクロマトグラフィー

( c ) で得られた活性画分を集め、 20mMトリスー塩酸緩衝液 (_PH8. 0)に対して透析し脱塩した。これを、 20mM トリスー塩酸緩衝液 (pH8. 0) で予め平衡化した RESOURCE Q (6ml) カラム（GEヘルスケアバイオサイエンス社製）にアプライし、同緩衝液でカラムを洗浄した後、塩化ナトリウム（0Mから 0. 8Mまで）のリニアグラジェントにより、活性画分を溶出させた。溶出した活性画分を集めて SDS - PAGE (12. 5% (w/v)ポリアクリルァミドゲル）により解析した。図 1は、この溶出画分の SDS- PAGEによる解析の結果を示す電気泳動写真である。レーン 1は、分子量マーカーであり、レーン 2は、溶出画分のバンドを示す。その結果、単一のバンドが観察された（図 1 ) 。このようにして、ストレプトマイセス · シンナモネウス（Streptomyces c innamoneus) NBRC12782より、電気泳動的に単一に精製された酵素を得た。

(実施例 2 ：ストレプトマイセス · シンナモネウス（Streptomyces cinna moneus) 由来酵素の性質の測定）

上記の実施例 1で得た精製酵素のスフインゴミエリナーゼ活性を上記方法で測定し、スフインゴミエリ^ "一ゼ活性を有することを確認した。この精製酵素の酵素学的性質について検討した。

( 1 ) 作用 pH：緩衝液としてトリスー塩酸緩衝液（pH7〜9) およびグリシン一水酸化ナトリウム緩衝液（pH9〜； 13) を用いて pHを変化させたこと以外は、上記方法に従って、スフインゴミエリナーゼ活性を測定した。その結果、この酵素は、反応の至適 pHが 10であることが分かった。図 2は、種々の反応 pHでの酵素活性を、反応 pHが 10である場合の酵素活性を基準とする相対活性として示したグラフである。図 2から分かるように、この酵素は、 pH8から p H12のアル力リ性の広い範囲で最大活性の 50%以上の活性を示した。

( 2 ) 作用温度：酵素とスフインゴミエリンとの反応温度を変化させたこと以外は、上記方法に従って、スフインゴミエリナーゼ活性を測定した。図 3は、種々の反応温度での酵素活性を、反応温度が 37°Cである場合の活性を基準とする相対活性として示したグラフである。図 3に示されるように、この酵素は、 20〜40°Cで活性を発揮し得、そして反応の至適温度は 37°C付近であつに。

( 3 ) 温度安定性：精製酵素を 50mMトリスーマレイン酸緩衝液（ρΗ7· 0) 中で、種々の温度で 30分間処理した後の残存活性を、上記方法に従って測定した。温度処理前の酵素活性を基準として、各温度処理後の酵素活性の残存割合として示した。図 4は、種々の温度での処理後の酵素の残存活性を示すグラフである。図 4に示されるように、この酵素は、 4°Cから 45°Cまでの温度での処理後では、処理前の 90%以上の活性が残存していた。 50°Cの処理後では、処理前の 70%程度の活性が残存していた。

( 4 ) 各種金属塩およぴ EDTAの影響：酵素とスフインゴミエリンとの反応の際に各種金属ィオンまたは EDTAを添加して、スフインゴミエリナーゼ活性を測定した。この際に、金属塩の沈殿を防ぐために、グリシン一水酸化ナトリウム緩衝液（ρΗΙΟ. Ο) をトリス一塩酸緩衝液（pH8. 0) に変更した。その結果を、金属塩を添加しない条件を 100とした相対活性で表 1に示す。この酵素は、 Z n ^{2 +}、 F e ^{3 +}、 A l ^{3 +}、および EDTAによって阻害を受けた。

化合物（1 mM) 相対活性（％)

― 100

KCI 116

NaCI 1 10

MgCI₂ 202

CaCI₂ 46

BaCI₂ 103

MnCI₂ 303

CuCI₂ 135

CoCI₂ 260

FeS0₄ 54

ZnS0₄ 1

FeCI₃ 9

AICI₃ 3

EDTA 0

( 5 ) 基質特異性：スフインゴミエリンの代わりに各種リン脂質を基質として用いたこと以外は、上記方法に従って、スフインゴミエリナーゼ活性を測定した。その結果を、スフインゴミエリンを基質とした場合を 100とした相対活性で表 2に示す。この酵素は、表 2に示すような基質特異性を示した。表 2

基質（2mg/mD 相対活性（％)

スフインゴミエリン 100 ホスファチジルコリン 2 ホスファチジルイノシ! ル 0 ホスファチジン酸 0 ホスファチジルエタノールァミン 0 ホスファチジルグリセロール 0 ホスファチジルセリン 0

( 6 ) 分子量： SDS- PAGE法（12. 5% (w/v)ポリアクリルァミドゲル）に従つて、精製酵素の分子量を測定した結果、精製酵素の分子量は約 35, 000であつた（図 1 ) 。

( 7 ) 等電点： Phastgel IEF3- 10 (GEヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いた等電点電気泳動法により、精製酵素の等電点を測定した結果、精製酵素の等電点は 6. 1であった。

(実施例 3 ：ストレプトマイセス · シンナモネウス (Streptomyces cmna moneus) 由来酵素の N末端ァミノ酸配列の解析）

上記実施例 1で得た精製酵素を用いて、プロティンシーケンサーによりァミノ酸配列の解析を行った。上記精製酵素の N末端ァミノ酸配列は配列番号 3に示すとおりであった。 (実施例 4 ：ストレプトマイセス · シンナモネウス（Streptomyces cinna moneus) NBRC12782の染色体 DNAの分離）

ス卜レプ卜マイセス · シンナモネウス (Streptomyces cinnamoneus) NBRC 12782を、トリプチックソィ培地（べクトン ·ディッキンソン社製） 5mlを用いて 28°Cで 4日間培養し、集菌した。次いで、この菌体を、 0. 15M NaCl、 0. 1 M EDTA (pH8. 0) 、および 8mg/ml リゾチームからなる溶液 800 μ 1に懸濁し、 37°Cで 45分間処理した後、さらに- 80°Cで 10分間処理した。次に、これに 1% (w/v) SDS、 0. lM NaCl、および 0. 1M トリスー塩酸緩衝液（pH9. 0) からなる溶液 6mlを添加し、 60°Cで 20分間処理した後、氷冷した。この溶液 4. 5mlにフェノール Zクロ口ホルム混合液 4mlを加えて攪拌し、遠心分離により水相を 3 ml分取した。この水相に 6mlのエタノールを添加混合して DNAを回収し、 10mM トリス一塩酸緩衝液 (pH8. 0) および ImM EDTAからなる溶液 900 μ 1に溶解した。これに、 RNaseAを SO g/mlとなるように加え、 37°Cで 1時間処理した後、フヱノール /ク口口ホルム混合液 900 μ 1を加えて攪拌し、遠心分離により、水相を 600 μ ΐ分取した。この水相に 3Μ 酢酸ナトリウム（ρΗ5. 2) 60 /_ι 1およびエタノール 1. 2mlを添加混合し、 DNAを回収した。この DNAを 70% (v/_v)エタノールに 10分間浸漬した後、 10mMトリス一塩酸緩衝液 (pH8. 0) および ImM E DTAからなる溶液 600 μ 1に溶解した。 (実施例 5 ：ストレプトマイセス · シンナモネウス (Streptomyces cinna moneus) 由来スフインゴミエリナーゼ遺伝子のコア領域のクローニング）スフィンゴミエリナーゼの N末端アミノ酸配列おょぴストレプトマイセス属の使用コドンに基づいて、 PCR用の縮重オリゴヌクレオチドプライマー S1 センスプライマー（配列番号 4 ) を設計した。

また、細菌由来スフインゴミエリナーゼのアミノ酸配列が、ゥシ DNaselのアミノ酸配列と高い相同性を示すことがわかり、バチルス 'セレウス (Baci llus cereus) 、スタフイロコッカス ·才一レウス (Staphylococcus aureu s) 、レプトスピラ 'インテロガンス (Leptospira interrogans) 由来のスフインゴミエリナーゼおよびゥシ DNaselのァミノ酸配列を比較した結果、 C 末端に近い領域で SDHYPからなるアミノ酸配列を共有していた（ヨウマツォ（Y0 MATSU0) ら，プロテイン 'サイエンス（Protein Science) , 1996年，

5巻， pp. 2459- 2467) 。このアミノ酸配列 SDHYPおよびストレブトマイセス属の使用コドンに基づいて、 PCR用の縮重オリゴヌクレオチドプライマ一 A1 アンチセンスプライマー（配列番号 5 ) を設計した。ここで、配列中の Sは C または Gを表す。

PCRの反応液組成は次のとおりである。上記実施例 4で得た鎵型染色体 DNA

168ng、 10 X PCR Buffer for KOD-plus- δ μ ΐ, プライマー各 300nM、 dNTP 混合物各 0. 2niM、 MgS0₄ 1 、 DMS0 3%、および K0D- plus- DNA Polymerase 1. 0ユニットに、蒸留水を全量 50 となるように添加した。 PCR反応条件は次のとおりである。ステップ 1 ; 94°C、 2分；ステップ 2； 94°C、 15秒；ステツプ 3 ； 55°C (サイクルごとに 1°Cずつ低く設定する）、 30秒；ステップ 4； 6 8°C、 1分；ステップ 2からステップ 4を 20サイクル繰り返す；ステップ 5； 9 4°C、 15秒；ステップ 6； 40°C、 30秒；ステップ 7； 68°C、 1分；ステップ 5からステップ 7を 30サイクル繰り返す；ステップ 8； 68°C、 3分。 PCRによって、約 800bpの特異的な増幅産物を得た。

この PCR反応液についてァガロース電気泳動を行い、目的の 800bpのバンド部分を切り出し、 T0P0 Blunt Cloning Kit for Sequencing (Invitrogen 製）を用いて、 pCR4- T0P0ベクターに結合させ、大腸菌 J1109を形質転換した。形質転換株をカナマイシン 50 / g/mlを含む LB培地（ペプトン 1%、酵母ェキス 0. 5%、塩ィ匕ナトリゥム 1%、 pH7. 0) で培養し、 QIAprep Spin Miniprep K it (Qiagen製）を用いて DNAシーケンス用のプラスミドを抽出 '精製した。続いて、 pCR4 - T0P0ベクターに由来する T7プライマーおょぴ M13 reverseプライマ一を用いて自動シークェンサ一によつて、挿入断片の塩基配列を決定した。この塩基配列を図 5およぴ配列番号 1 2に示す。

(実施例 6 ：ストレプトマイセス · シンナモネウス（Streptomyces cmna moneus) 由来スフインゴミエリナーゼ遺伝子のコア領域周辺のクローニング）

上記の実施例 5で決定した遺伝子配列の周辺領域の配列を明らかにするために、その上流側と下流側とに分けて、それぞれを PCRにより増幅した。 ( a ) 上流側のクローニング

上記実施例 4で得た染色体 DNAを Sau3AIで完全消化し、 TaKaRa LA PCR in vitro Cloning Kit (タカラバイオ社製）に付属の Sau3AI Cassetteを連結させてライブラリーを作製した。これを铸型にして、キットに付属の Cassette Primer CIとスフインゴミエリナーゼの部分遺伝子配列に基づいて作製したアンチセンスプライマー AN1 (配列番号 6 ) とを用いて、 1回目の PCR増幅を行った。 PCRの反応液組成は次のとおりである。铸型染色体 DNA 500ng、 10 X EX Taq Buffer 5 μ 1、プライマー各 2 μ M、 dNTP混合物各 0. 2mM、 DMS0 3%、および TaKaRa EX Taq HS Polymerase 2. 5ュニットに、蒸留水を全量 50 /z lとなるように添加した。 PCR反応条件は次のとおりである。ステップ 1； 94°C、 2分；ステップ 2； 94°C、 30秒；ステップ 3； 55°C、 30秒；ステップ 4； 72°C、

1分 30秒；ステップ 2からステップ 4を 30サイクル繰り返す；ステップ 5； 72°C、 2分。次いで、この PCR反応液を錶型として、キットに付属の Cassette Prime r C2とスフインゴミエリナーゼの部分遺伝子配列に基づいて作製したアンチセンスプライマー AN2 (配列番号 7 ) とを用いて、 2回目の PCR增幅を行った。約 400b_Pの特異的な増幅産物が得られ、これを pCR4- T0P0ベクターにサブクロ一ユングし、塩基配列を決定した。 ( b ) 下流側のクローニング

上記実施例 4で得た染色体 DNAlOOngを Naelで完全消化し、 DNA Ligation K it (タカラバイオ社製) を用いてセルフライゲーシヨンさせて、ライブラリ一を作製した。これを鎵型にして、スフインゴミエリナーゼの部分遺伝子配列に基づいて作製したセンスプライマー SC1 (配列番号 8 ) およびアンチセンスプライマー AC2 (配列番号 9 ) を用いて、いわゆるインバース PCR増幅を行った。 PCRの反応液組成は次のとおりである。鎵型染色体 DNA 100ng、 10 X PCR Buffer for KOD- plus - 5 /z l、プライマー各 300nM、 dNTP混合物各 0. 2m M、 MgS0₄ lmM、 DMSO 3%、および KOD- plus- DNA Polymerase 1. 0ュニットに、蒸留水を全量 50 μ 1となるように添カ卩した。 PCR反応条件は次のとおりである。ステップ 1； 94°C、 3分；ステップ 2； 94°C、 15秒；ステップ 3； 68°C、 1分；ステップ 2からステップ 3を 35サイクル繰り返す；ステップ 4； 68°C、 3分。 PC Rによって、約 400bpの特異的な増幅産物が得られ、これを _PCR4- T0P0ベクタ一にサブクローユングし、塩基配列を決定した。上記実施例 5で決定した塩基配列と併せて上記（a ) および（b ) で決定した塩基配列に基づいて、ストレプトマイセス .シンナモネウス（Streptom yces cinnamoneus) 由来スフインゴミエリナーゼ遣伝子を含む領域の塩基配列を決定し（配列番号 1 3 ) 、さらに構造遺伝子部分についてその塩基配列からアミノ酸配列を推定した（配列番号 1 4 ) 。図 6は、この決定したスフィンゴミエリナーゼ遺伝子を含む領域の塩基配列、およびこの塩基配列の下段に、構造遺伝子の推定ァミノ酸配列を示す。図 6に示す配列解析の結果から、スフインゴミエリナ一ゼをコ一ドする構造遺伝子は 999bpのヌクレオチドカらなり、 333残基のアミノ酸をコードしていることが明らかとなった。上記実施例 3にて決定したストレプトマイセス · シンナモネウス（Streptom yces cinnamoneus) 由来精製酵素の N末端アミノ酸配列が、上記推定アミノ酸配列中に存在し、完全に一致した（図 6中に下線で示す）。

配列類似性検索プログラム BLASTおよび FASTAを用レ、ることにより、上記推定アミノ酸配列を 4種類のタンパク質配列データベース（PTR、 PRF、 UNI - PRO Tおよび SWISS-PR0T) 内の配列と比較した。その結果、上記推定アミノ酸配歹 [|は、 Salinispora tropica CNB— 440株のスフィンゴミエリン .ホスホジェステラーゼ（スフインゴミエリナーゼ）と 52%の類似性を示した。

また、ストレプ卜マイセス · シンナモネウス (Streptomyces cinnamoneu s) 由来精製酵素（すなわちスフインゴミエリナーゼ）は、この推定アミノ酸配列のアミノ酸組成に基づいて計算したところ、約 32000ダルトンの分子量を有すると推定された。

(実施例 7 ：ストレプトマイセス · シンナモネウス（Streptomyces cinna moneus) 由来スフインゴミエリナーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドの作製）

放線菌においてストレプトマイセス · シンナモネウス（Streptomyces cin namoneus) 由来スフインゴミエリナーゼを発現させるために、形質転換に用いる組換えプラスミドを作製した。

まず、ス卜レプ卜マイセス · シンナモネウス (Streptomyces cinnamoneu s) 由来スフインゴミエリナーゼの構造遺伝子の上流域配列に Bglll部位を付加したセンスプライマー S2 (配列番号 1 0 ) 、および該構造遺伝子の下流域配列に Bglll部位を付加したアンチセンスプライマー A2 (配列番号 1 1 ) を設計した。次いで、これらのプライマーを用いて、上記実施例 4で得た染色体 DNAを铸型として PCRを行つた。 PCRの反応液組成は次のとおりである。鎵型染色体 DNA 168ng、 10 X PCR Buffer for K0D- plus- 5 μ 1、プライマー各 3 00nM、 dNTP混合物各 0. 2mM、 MgS0₄ lmM、 DMS0 5%、および K0D- plus- DNA Pol ymerase 1. 0ユニットに、蒸留水を全量 50 1となるように添加した。 PCR反応条件は次のとおりである。ステップ 1 ; 94°C、 2分；ステップ 2； 94°C、 15 秒；ステップ 3； 68°C、 1分；ステップ 2からステップ 3を 30サイクル繰り返す；ステップ 4； 68°C、 2分。この PCRにより約 1200bpの特異的な増幅産物が得られた。この増幅された断片を Bglllで消化し、放線菌プラスミド pIJ702 (ATCC35287、 American Type Culture Collectionより入手）の Bglll部位に揷入して、組換えプラスミド pIJ70²- SMaseを得た。

(実施例 8 ：ストレプトマイセス · シンナモネウス（Streptomyces cinna moneus) 由来スフインゴミエリナ一ゼ遣伝子を発現する組換え放線菌の作製）

実施例 7で得た組換えプラスミド pIJ702 - SMaseを用いて、「PRACTICAL ST REPT0MYCES GENETICS (Kieserら、 John Innes Foundationヽ 2000年）」に記載の方法に従い、プロトプラスト化された放線菌ストレプトマイセス ' リビダンス（Streptomyces lividans) 1326を形質転換し、組換え放線菌ストレプトマイセス . リビダンス（Streptomyces lividans) 1326 (pIJ702-SMas e) を得た。

(実施例 9 ：ストレプトマイセス · シンナモネウス (Streptomyces cinna moneus) 由来スフインゴミエリナーゼ遺伝子を発現する組換え放線菌の酵素活性測定）

実施例 8で得た組換え放線菌を、 20 g/mlのチォストレプトンを含む 100m 1のトリプチックソィ培地（ベタトン 'ディッキンソン社製）で培養した。得られた培養液から遠心分離（15000rpm、 5分、 4°C) にて上清を回収し、 6 0% (w/v)飽和となるように硫酸アンモニゥムを加えた。 4°Cで 16時間放置し、遠心分離にて（15000rpm、 15分、 4°C) 沈殿を回収した。回収した沈殿を 500 μ ΐの 20mM トリス一塩酸緩衝液 (pH7. 0) に溶解し、 20mM トリスー塩酸緩衝液（pH7. 0) を外液として透析を行い、 0. 9mlの酵素溶液を得た。この酵素溶液中の酵素活性を、上記スフインゴミエリナーゼの酵素活性の測定方法に従つて測定した。その結果、酵素溶液の酵素活性は 10. 2ユニット /mlであった。なお、ベクターであるプラスミド pi J702を用いて形質転換した放線菌ストレプトマイセス . リビダンス（Streptomyces lividans) 1326 (pIJ702) では、スフインゴミエリナーゼ活性は検出されなかった。産業上の利用可能性

本発明によれば、新規なスフインゴミエリナーゼおよぴその製造方法が提供される。スフインゴミエリナーゼをスフインゴミエリンに作用させて生成されるセラミドは、化粧品の基材などとして有用である。

Claims

請求の範囲

1 . スフインゴミエリンに作用し、該スフインゴミエリンを加水分解してセラミドおよびホスホリルコリンを生成する酵素であって、以下の（a ) から ( c ) のいずれかに記載のポリペプチドからなる、酵素：

( a ) 配列番号 2に記載のァミノ酸配列を有するポリぺプチド；

( b ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列において、 1もしくは複数個のァミノ酸が置換、揷入、欠失および Zまたは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ該加水分解活性を示すポリぺプチド；または

( c ) 配列番号 2に記載のァミノ酸配列と少なくとも 75%の相同性を有し、かつ該加水分解活性を示すポリぺプチド。

2 . スフインゴミエリンを基質としたときの pHIOで 37°Cにて 10分間の加水分解活性を 100%とした場合に、 pH8から _PH12の範囲内で 50%以上の加水分解活性を示す、請求項 1に記載の酵素。

3 . pHIOで 37°Cにて 10分間のスフインゴミエリンに対する加水分解活性を 10 0%とした場合にホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールァミン、ホスファチジルグリセロール、およぴホスファチジルセリンに対する活性が 5 %未満である基質特異性を有する、請求項 1または 2に記載の酵素。

4 . 等電点が 6. 1である、請求項 1から 3のいずれかに記載の酵素。

5 . SDS- PAGEで測定した場合の分子量が 35， 000であり、そしてアミノ酸組成より分析した場合の分子量が 32， 000である、請求項 1から 4のいずれかに記載の酵素。

6 . ストレプトマイセス（Streptomyces) 属に属する微生物に由来する、請求項 1から 5のいずれかに記載の酵素。

7 . 請求項 1から 6のいずれかの項に記載の酵素をコードするポリヌクレオチド。

8 . 以下の（a ) から（c ) のいずれかに記載のポリヌクレオチドである、請求項 7に記載のポリヌクレオチド：

( b ) 配列番号 1に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイプリダイズするポリヌクレオチド；または

9 . ストレプトマイセス（Streptomyces) 属に属する微生物に由来する、請求項 7または 8に記載のポリヌクレオチド。

1 0 . 請求項 7から 9のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。

1 1 . 請求項 7から 9のいずれかに記載のポリヌクレオチドまたは請求項 1 0に記載のベクターが導入され、スフインゴミエリンからセラミドおよびホスホリルコリンを生成する酵素を産生する能力を保有する形質転換体。

1 2 . 前記形質転換体の宿主が、ストレプトマイセス（Streptomyces) 属に属する微生物である、請求項 1 1に記載の形質転換体。

1 3 . スフインゴミエリンに作用し、該スフインゴミエリンを加水分解してセラミドおよびホスホリルコリンを生成する酵素を製造する方法であって、請求項 7カゝら 9のいずれかに記載のポリヌクレオチドまたは請求項 1 0に記載のベクターを宿主に導入して、該酵素を産生する形質転換体を得るェ程；および

該形質転換体を培養して該酵素を産生させる工程

を含む、方法。

1 4 . 前記宿主が、ストレプトマイセス（Streptomyces) 属に属する微生物である、請求項 1 3に記載の製造方法。